1972L0199 — ET — 27.08.1999 — 005.001

Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest

►B KOMISJONI KOLMAS DIREKTIIV, 27. aprill 1972, millega kehtestatakse loomasööda ametlikuks kontrolliks vajalikud ühenduse analüüsimeetodid (72/199/EMÜ) (EÜT L 123, 29.5.1972, p.6)

Muudetud:









▼B

KOMISJONI KOLMAS DIREKTIIV,

27. aprill 1972,

millega kehtestatakse loomasööda ametlikuks kontrolliks vajalikud ühenduse analüüsimeetodid

(72/199/EMÜ)







EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 20. juuli 1970. aasta direktiivi sööda ametlikuks kontrolliks vajalike ühenduse proovivõtu- ja analüüsimeetodite kehtestamise kohta ( 1 ), eriti selle artiklit 2, ning arvestades, et: ning arvestades, et: kõnealune direktiiv nõuab, et loomasööda kvaliteeti ja koostist reguleerivate õigusnormide nõuetele vastavuse ametlik kontrollimine toimuks ühenduses kehtestatud proovivõtu- ja analüüsimeetodite abil; komisjoni 15. juuni 1971. aasta direktiivis 71/250/EMÜ ( 2 ) ja 18. novembri 1971. aasta direktiivis 71/393/EMÜ ( 3 ) on juba kehtestatud rida ühenduse analüüsimeetodeid; võttes arvesse edusamme pärast kõnealuse direktiivi vastuvõtmist tehtud töös, on soovitav võtta vastu kolmas rühm meetodeid; käesolevas direktiivis ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise söödakomitee arvamusega, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:







Artikkel 1

Liikmesriigid nõuavad, et sööda tärklisesisalduse ja valgu üldsisalduse, pepsiinis ja soolhappes lahustuva valgu üldsisalduse, vaba gossüpoli sisalduse ja gossüpoli üldsisalduse ning pepsiini aktiivsuse ametliku kontrollimise analüüsid tehtaks vastavalt käesoleva direktiivi I lisas kirjeldatud meetoditele.

▼M1 —————

▼B

Artikkel 2

Liikmesriigid nõuavad, et sööda ►M4 ————— ◄ sisalduse ametliku kontrollimise ja identifitseerimise ning ►M4 ————— ◄ tülosiini ja virgiiniamütsiini kontsentratsiooni määramise analüüsid tehtaks vastavalt käesoleva direktiivi II lisas kirjeldatud meetoditele.

▼M1 —————

▼B

Artikkel 3

Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi täitmiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 1. juulil 1973. Liikmesriigid teatavad sellest viivitamata komisjonile.

Artikkel 4

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.









I LISA

▼M5

1. TÄRKLISE MÄÄRAMINE

POLARIMEETRILINE MEETOD

1. Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodi abil saab kindlaks määrata tärklise ja suure molekulmassiga tärklise lagunemisproduktide taseme loomasöötades, kontrollimaks komisjoni direktiivi 86/174/EMÜ ja nõukogu direktiivi 96/25/EÜ järgimist.

2. Põhimõte

Antud meetod hõlmab kahte määramist. Esimese puhul töödeldakse kuuma proovi lahjendatud soolhappega. Pärast selitamist ja filtreerimist mõõdetakse polarimeetrilisel teel lahuse polarisatsioonitasandi pööre.

Teise määramise puhul ekstraheeritakse proovi 40 %lise etanooliga. Pärast filtraadi hapestamist soolhappega, selitamist ja filtreerimist mõõdetakse polarisatsioonitasandi pööre esimese määramisega analoogsel viisil.

Proovi tärklisesisaldus saadakse nimetatud kahe määramise vahe korrutamisel teadaoleva koefitsiendiga.

3. Reaktiivid

3.1. 25 %line (massiprotsent) soolhape, tihedus 1,126 g/ml.

3.2. 1,128 %line (mass/maht) soolhape. Kontsentratsiooni tuleb kontrollida tiitrimise teel, kasutades 0,1 M naatriumhüdroksiidi lahust koos 0,1 % (mass/maht) metüülpunasega 94 %-lises (mahuprotsent) etanoolis. 10 ml = 30,94 ml 0,1 M NaOH.

3.3. Carrez’ I lahus: lahustada vees 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3COO)2· 2H2O ja 3 g jää-äädikhapet. Lisada vett kuni 100 ml lahuse saamiseni.

3.4. Carrez’ II lahus: lahustada vees 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4Fe(CN)6· 3H2O. Lisada vett kuni 100 ml lahuse saamiseni.

3.5. 40 %line (mahuprotsent) etanool, tihedus 20 °C juures 0,948 g/ml.

4. Seadmed

4.1. Standardse lihvühenduse ja püstjahutiga 250 ml Erlenmeyeri kolb.

4.2. Polarimeeter või sahharimeeter.

5. Analüüsi käik

5.1. Proovi ettevalmistamine

Peenestada proov nii, et see läbib täielikult 0,5 mm ümaravadega sõela.

5.2. Polarisatsioonitasandi kogupöörde (P või S) määramine (vt märkus 7.1)

Kaaluda 25 g peenestatud proovi 1 mg täpsusega ning panna see 100 ml mõõtekolbi. Lisada 25 ml soolhapet (3.2), loksutada proovi ühtlase jaotumise saavutamiseks ning lisada veel 25 ml soolhapet (3.2). Asetada kolb keeva vee vanni, loksutades seda esimesed kolm minutit tugevasti ja ühtlaselt, vältimaks klompide teket. Vannis peab olema piisavalt vett, et vesi säilitaks kolvi vanni asetamisel keemistemperatuuri. Kolbi ei tohi loksutamise ajal vannist välja võtta. Täpselt 15 minuti möödudes võtta kolb vannist välja, lisada 30 ml külma vett ja jahutada otsekohe temperatuurini 20 °C.

Lisada 5 ml Carrez’ I lahust (3.3) ja loksutada üks minut. Seejärel lisada 5 ml Carrez’ II lahust (3.4) ja jätkata loksutamist veel ühe minuti jooksul. Täita kolb veega, segada ja filtreerida. Kui filtraat ei ole täiesti selge (seda juhtub harva), korrata määramist, kasutades rohkem Carrez’ I ja II lahust (näiteks 10 ml).

Mõõta lahuse polarisatsioonitasandi pööre 200 mm torus polarimeetri või sahharimeetri abil.

5.3. 40 %lises etanoolis lahustuvate ainete polarisatsioonitasandi pöörde (P’ või S’) määramine

Kaaluda 5 g proovi 1 mg täpsusega, panna see 100 ml mõõtekolbi ning lisada ligikaudu 80 ml etanooli (3.5) (vt märkus 7.2). Jätta kolb üheks tunniks toatemperatuurile seisma; selle aja jooksul loksutada kolbi kuus korda tugevasti, nii et proov etanooliga põhjalikult seguneb. Täita kolb etanooliga (3.5), segada ja filtreerida. Pipeteerida 50 ml filtraati (= 2,5 g proovi) 250 ml Erlenmeyeri kolbi, lisada 2,1 ml soolhapet (3.1) ja loksutada tugevasti. Ühendada püstjahuti Erlenmeyeri kolviga ja asetada kolb keeva vee vanni. Täpselt 15 minuti möödudes eemaldada Erlenmeyeri kolb vannist, viia selle sisu 100 ml mahuga mõõtekolbi, loputada vähese külma veega ja jahutada temperatuurini 20 °C. Selitada Carrez’ I (3.3) ja II (3.4) lahuse abil, täita kolb veega, segada, filtreerida ja mõõta polarisatsioonitasandi pööre punkti 5.2 teises ja kolmandas lõigus kirjeldatud viisil.

6. Tulemuste arvutamine

Tärklisesisaldus ( %) arvutatakse järgmiselt:

6.1. Mõõtmine polarimeetriga

P = polarisatsioonitasandi kogupööre kraadides;

P’ = 40 %lises (mahuprotsent) etanoolis lahustuvate ainete polarisatsioonitasandi pööre kraadides;

= puhta tärklise polarisatsioonitasandi eripööre. Tavaliselt aktsepteeritakse antud koefitsiendina järgmisi arvväärtusi: + 185,9° : riisitärklis; + 185,4° : kartulitärklis; + 184,6° : maisitärklis; + 182,7° : nisutärklis; + 181,5° : odratärklis; + 181,3° : kaeratärklis; + 184,0° : muud tärkliseliigid ja tärklisesegud segasöötades.

6.2. Mõõtmine sahharimeetriga

S = polarisatsioonitasandi kogupööre sahharimeetri kraadides;

S’ = 40 %lises (mahuprotsent) etanoolis lahustuvate ainete polarisatsioonitasandi pööre sahharimeetri kraadides;

N = sahharoosi mass (grammides) 100 ml vees, mis annab polarisatsioonitasandi pöördeks 100 sahharimeetri kraadi, kui mõõtmisel kasutatakse 200 mm toru: 16,29 g prantsuse sahharimeetrite puhul; 26,00 g saksa sahharimeetrite puhul; 20,00 g muude sahharimeetrite puhul;

= puhta tärklise polarisatsioonitasandi eripööre (vt punkt 6.1).

6.3 Korratavus

Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevuse absoluutväärtus ei tohi alla 40 %lise tärklisesisalduse puhul ületada 0,4 ning suhteline erinevus 40 %-lise või suurema tärklisesisalduse puhul 1,1 %.

7. Märkused

7.1. Kui proov sisaldab üle 6 % karbonaate, arvutatuna kaltsiumkarbonaadi alusel, tuleb need enne polarisatsioonitasandi kogupöörde määramist täpselt sobiva koguse lahjendatud väävelhappega töödeldes lagundada.

7.2. Suure laktoosisisaldusega toodete, näiteks pulbrilise piimavadaku või lõssipulbri puhul, tuleb pärast 80 ml etanooli (3.5) lisamist toimida järgmiselt: ühendada kolviga püstjahuti ning asetada kolb 30 minutiks 50 °C veevanni. Lasta maha jahtuda ja jätkata analüüsi punktis 5.3 kirjeldatud viisil.

7.3. Järgmised söödatoorained võivad juhul, kui neid sisaldub loomasöödas märkimisväärses koguses, polarimeetrilise meetodiga tärklisesisalduse määramisel esile kutsuda häireid, mis võivad viia ebaõigetele tulemustele: — (suhkru)peedisaadused, nagu näiteks (suhkru)peedipulp, (suhkru)peedimelass, melasseeritud (suhkru)peedipulp, (suhkru)peedi destilleerimisjäägid, (peedi)suhkur; — tsitruspulp; — linaseemned; linakook; linasrott; — rapsiseemned; rapsikook; rapsisrott; rapsiseemnekestad; — päevalilleseemned; päevalillesrott; päevalillesrott osaliselt kooritud päevalilleseemnetest; — koprakook; koprasrott; — kartulipulp; — veetustatud pärm; — inuliinirikkad tooted (nt maapirniliistakud või -jahu); — kõrned.

▼M3

2. TOORVALGUSISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab määrata toorvalgusisaldust söötades lämmastikusisalduse alusel, mis määratakse Kjeldahli meetodiga.

2. Põhimõte

Proov lagundatakse väävelhappega katalüsaatori manulusel. Happelahus leelistatakse naatriumhüdroksiidi lahusega. Ammoniaak destilleeritakse ja kogutakse mõõdetud väävelhappekogusesse, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi standardlahusega.

3. Reaktiivid

3.1. Kaaliumsulfaat

3.2. Katalüsaator: vask(II)oksiid CuO või vask(II)sulfaadi pentahüdraat, CuSO4 · 5H2O

3.3. Granuleeritud tsink

3.4. Väävelhape, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5. Väävelhape c(½H2SO4) = 0,5 mol/l

3.6. Väävelhape c(½H2SO4) = 0,1 mol/l

3.7. Metüülpunane indikaator: 300 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml-s etanoolis, σ = 95–96 % (v/v)

3.8. Naatriumhüdroksiidi lahus (võib kasutada tehnilise puhtusega reaktiivi), kontsentratsioon 40 g/100 ml (m/v: 40 %)

3.9. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 0,25 mol/l

3.10. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 0,1 mol/l

3.11. Soolhappes pestud ja läbikuumutatud pimsskivigraanulid

3.12. Atseetaniliid (sulamistemperatuur = 114 °C; N = 10,36 %)

3.13. Sahharoos (lämmastikuvaba)

4. Seadmed

Seadmed, mis sobivad Kjeldahli meetodis ettenähtud lagundamise, destilleerimise ja tiitrimise läbiviimiseks.

5. Analüüsi käik

5.1. Lagundamine

Kaalutakse 1 g proovi 0,001 g täpsusega ja pannakse see mineraliseerimisaparaadi kolbi. Lisatakse 15 g kaaliumsulfaati (3.1), sobiv kogus katalüsaatorit (3.2) (0,3–0,4 g vask(II)oksiidi või 0,9–1,2 g vask(II)sulfaadi pentahüdraati), 25 ml väävelhapet (3.4) ja mõned pimsskivigraanulid (3.11) ning segatakse. Kolbi kuumutatakse esialgu mõõdukalt, aeg-ajalt loksutades, kuni mass on söestunud ja vaht kadunud; seejärel kuumutatakse intensiivsemalt vedeliku püsiva keemiseni. Kuumutamine on küllaldane, kui keev hape kondenseerub kolvi seinale. Tuleb vältida seinte liigset kuumutamist ja orgaanilise aine kleepumist seintele. Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkatakse keetmist veel kahe tunni jooksul, seejärel jäetakse jahtuma.

5.2. Destilleerimine

Lisatakse ettevaatlikult piisav kogus vett, et tagada sulfaatide täielik lahustumine. Lastakse jahtuda ja seejärel lisatakse mõned graanulid tsinki (3.3).

Destilleerimisaparaadi kogumiskolbi pannakse täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet (3.5) või (3.6), sõltuvalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisatakse mõni tilk metüülpunast indikaatorit (3.7).

Mineraliseerimiskolb ühendatakse destilleerimisaparaadi jahutiga ja jahuti ots viiakse kogumiskolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vt märkus 8.3). Mineraliseerimiskolbi valatakse aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.8), vältides ammoniaagi kadu (vt märkus 8.1).

Kolbi kuumutatakse, kuni ammoniaak on üle destilleeritud.

5.3. Tiitrimine

Väävelhappe ülejääk tiitritakse kogumiskolvis naatriumhüdroksiidi lahusega (3.9) või (3.10), sõltuvalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt.

5.4. Pimekatse

Kontrollimaks, et reaktiivid on lämmastikuvabad, viiakse läbi pimekatse (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine), kasutades proovi asemel 1 g sahharoosi (3.13).

6. Tulemuste arvutamine

Toorvalgusisaldus arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

V0 = pimekatses kasutatud NaOH (3.9 või 3.10) maht (ml);

V1 = proovi tiitrimisel kasutatud NaOH (3.9 või 3.10) maht (ml);

c = naatriumhüdroksiidi (3.9 või 3.10) kontsentratsioon (mol/l);

m = proovi mass (g).

7. Meetodi kontrollimine

7.1. Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

absoluutväärtusena väljendatult 0,2 %, kui toorvalgusisaldus on vähem kui 20 %;

1,0 % suurimast väärtusest, kui toorvalgusisaldus on 20–40 %;

absoluutväärtusena väljendatult 0,4 %, kui toorvalgusisaldus on suurem kui 40 %.

7.2. Täpsus

Analüüs (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine) viiakse läbi 1,5–2,0 g atseetaniliidiga (3.12) 1 g sahharoosi (3.13) manulusel; 1 g atseetaniliidile kulub 14,80 ml väävelhapet (3.5). Saagis peab olema vähemalt 99 %.

8. Märkused

8.1. Seade võib olla manuaalset, poolautomaatset või automaatset tüüpi. Kui seade nõuab proovi ülekandmist lagundamise ja destilleerimise vahel, tuleb see ülekandmine teostada ilma kadudeta. Kui destillatsiooniaparaadi kolb ei ole varustatud tilklehtriga, lisatakse naatriumhüdroksiid vahetult enne kolvi ühendamist jahutiga, valades vedelikku aeglaselt mööda kolvi külge.

8.2. Kui proov lagundamisel tahkestub, alustatakse määramist uuesti, kasutades eespool näidatust suuremat kogust väävelhapet (3.4).

8.3. Madala lämmastikusisaldusega toodete puhul võib kogumiskolbi viidava väävelhappe (3.6) mahtu vajadusel vähendada 10–15 ml-ni ja täiendada veega 25 ml-ni.

▼B

3. PEPSIINIS JA SOOLHAPPES LAHUSTUVA VALGU ÜLDSISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kasutamisala

Meetod võimaldab määrata valgu seda osa, mis määratletud tingimustes on lahustatav pepsiini ja soolhappega. Meetod sobib kõikide söötade jaoks.

2. Põhimõte

Proovi hoitakse 48 tundi 40 °C juures pepsiini soolhappelises lahuses. Suspensioon filtritakse ja filtraadi lämmastikusisaldus määratakse vastavalt valgu üldsisalduse määramise meetodile.

3. Reaktiivid

3.1. Soolhape, tihedus: 1,125.

3.2. Soolhape, 0,075 N.

3.3. Pepsiin aktiivsusega 2,0 ühikut mg kohta; pepsiini aktiivsus on määratletud käesoleva lisa 4. osas kirjeldatud meetodis ja seda tuleb kontrollida tolle meetodiga.

3.4. Umbes 0,2(massi/mahu)protsendiline värskelt valmistatud pepsiini lahus soolhappes (3.2); aktiivsus: 400 ühikut/l.

3.5. Vahutamisvastane emulsioon (nt silikoon).

3.6. Kõik valgu üldsisalduse määramise meetodi 3. punktis loetletud reaktiivid.

4. Seadmed

4.1. Veevann või inkubaator temperatuuriga 40 ± 1 °C.

4.2. Kjeldahli märgtuhastus- ja destillatsiooniseade.

5. Töö käik

5.1. Lahuse valmistamine (vt märkus 7.2)

Kaalutakse 1 mg täpsusega 2 g proovi ja pannakse 500milliliitrisesse mõõtekolbi. Lisatakse 450 ml eelnevalt temperatuurini 40 °C soojendatud pepsiini lahust soolhappes (3.4) ja loksutatakse, et vältida kämpude tekkimist. Kontrollitakse, et pH oleks alla 1,7. Kolb asetatakse veevanni või inkubaatorisse (4.1) ja jäetakse sinna 48 tunniks. Loksutatakse 8, 24 ja 32 tunni möödudes. 48 tunni möödudes lisatakse 15 ml soolhapet (3.1), jahutatakse temperatuurini 20 °C, täiendatakse veega märgini ja filtritakse.

5.2. Märgtuhastamine

250 ml filtraati pannakse destilleerimisseadme (4.2) kolbi. Lisatakse valgu üldsisalduse määramise meetodi punkti 5.1 teises lauses nimetatud märgtuhastamiseks vajalikud reaktiivid. Segatakse ja kuumutatakse keemiseni. Vahu tekkimisel lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast emulsiooni (3.5). Jätkatakse intensiivset keetmist, kuni vesi on peaaegu täielikult aurustunud. Vähendatakse kuumust ja kõrvaldatakse ettevaatlikult viimased vee jäljed.

Kui lahus muutub selgeks ja värvusetuks (või heleroheliseks, kui kasutatakse vasel põhinevat katalüsaatorit), siis jätkatakse keetmist veel tund aega. Jäetakse jahtuma.

5.3. Destilleerimine ja tiitrimine

Toimitakse, nagu on kirjeldatud valgu üldsisalduse määramise meetodi punktides 5.2 ja 5.3.

5.4. Pimekatse

Samal viisil viiakse läbi pimekatse, jättes analüüsitava proovi lisamata.

6. Tulemuste arvutamine

Pimekatsele kulunud väävelhappe maht lahutatakse sellest mahust, mis kulus analüüsitavale proovile. 1 ml 0,1-normaalset väävelhapet vastab 1,4 mg lämmastikule.

Lämmastiku kogus korrutatakse teguriga 6,25. Tulemus väljendatakse proovi protsentuaalse sisaldusena.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

— 0,4 (absoluutväärtuses) valgu üldsisalduste puhul alla 20 %,

— 2,0 % (suhtelises väärtuses) valgu üldsisalduste puhul 20–40 %,

— 0,8 (absoluutväärtuses) valgu üldsisalduste puhul üle 40 %.

7. Märkused

7.1. Selle meetodiga saadud väärtused ei ole otseses seoses seeduvusega in vivo.

7.2. Üle 10 % õli või rasva sisaldavad produktid tuleb kõigepealt rasvatustada, ekstraheerides proovi petrooleetriga (keemistemperatuuri vahemik 40–60 °C).

4. PEPSIINI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kasutamisala

Meetod võimaldab kindlaks teha pepsiinis ja soolhappes lahustuvate valkude sisalduse määramisel kasutatava pepsiini aktiivsuse.

2. Põhimõte

Määratletud tingimustes töödeldakse soolhappe keskkonnas pepsiiniga hemoglobiini. Proteiini hüdrolüüsumata osa sadestatakse trikloroäädikhappega. Filtraadile lisatakse naatriumhüdroksiidi ja Folin-Ciocalteu reaktiivi. Mõõdetakse lahuse optiline tihedus lainepikkusel 750 nm ning kalibreerimisgraafikult loetakse sellele vastav türosiini kogus.

Määratlus: Pepsiini ühik määratletakse nimetatud ensüümi kogusena, mis antud meetodi tingimustes vabastab ühes minutis sellise koguse hüdroksüarüülrühmi, et nende optiline tihedus pärast värvimist Folin-Ciocalteu reaktiiviga vastab ühele μmoolile samal viisil värvitud türosiinile.

3. Reaktiivid

3.1. Soolhape, 0,2 N.

3.2. Soolhape, 0,06 N.

3.3. Soolhape, 0,025 N.

3.4. Trikloroäädikhappe 5(massi/mahu)protsendiline lahus.

3.5. Naatriumhüdroksiidi lahus, 0,5 N.

3.6. Folin-Ciocalteu reaktiiv. 2liitrisesse standardse klaaslihviga ümarkolbi pannakse 100 g naatriumvolframaati (Na2WO4 · 2H2O), 25 g naatriummolübdaati (Na2MoO4· 2H2O) ja 700 ml vett. Lisatakse 50 ml fosforhapet (tihedus 1,71) ja 100 ml kontsentreeritud soolhapet (tihedus 1,19); kolb ühendatakse püstjahutiga, lahus kuumutatakse keemiseni ja hoitakse tasasel keemisel 10 tundi. Jäetakse jahtuma, eemaldatakse püstjahuti, lisatakse 175 g liitiumsulfaati (Li2SO4 · 2H2O), 50 ml vett ja 1 ml broomi. Keedetakse 15 minutit, et eemaldada liigne broom. Jäetakse jahtuma, lahus kantakse 1liitrilisse mõõtekolbi, täiendatakse kolb veega märgini, segatakse ja filtritakse. Rohekat värvust ei tohi jääda. Enne kasutamist lahjendatakse 1 mahuosa reaktiivi 2 mahuosa veega.

3.7. Hemoglobiini lahus: Kaalutakse hemoglobiini kogus (ligikaudu 2 g proteiinsubstraati, määratud Ansoni järgi), mis vastab 354 mg lämmastikule, ( 4 ) ning pannakse see 200milliliitrisesse standardse klaaslihviga kolbi. Lisatakse mõni ml soolhapet (3.2), ühendatakse kolb vaakumpumbaga ja loksutatakse, kuni hemoglobiin on täielikult lahustunud. Kolvis taastatakse normaalne rõhk ja lisatakse loksutades soolhapet (3.2), kuni lahuse maht on 100 ml. Valmistatakse vahetult enne kasutamist.

3.8. Türosiini standardlahus: Soolhappes (3.1) lahustatakse 181,2 mg türosiini ja täiendatakse sama happelahuse lisamisega 1 liitrini (varulahus). Võetakse 20 ml saadud lahust ja lahjendatakse soolhappega (3.1) 100 milliliitrini. 1 ml saadud lahust sisaldab 0,2 μmooli türosiini.

4. Seadmed

4.1. Veevann, mis on ultratermostaadi abil seatud temperatuurile 25 ± 0,1 °C.

4.2. Spektrofotomeeter.

4.3. Stopper täpsusega 1 sekund.

4.4. pH-meeter.

5. Töö käik

5.1. Lahuse valmistamine (vt märkus 7.1)

100 ml soolhappes (3.2) lahustatakse 150 mg pepsiini. 2 ml lahust viiakse pipetiga 50milliliitrisesse mõõtekolbi ja täiendatakse soolhappega (3.3) märgini. pH-meetri abil kontrollitud pH väärtus peab olema 1,6 ± 0,1. Kolb asetatakse veevanni.

5.2. Hüdrolüüs

Katseklaasi viiakse pipetiga 5,0 ml hemoglobiini lahust (3.7), soojendatakse veevannis (4.1) temperatuurini 25 °C, lisatakse 1,0 ml pepsiini lahust (mis on saadud vastavalt punktile 5.1) ja segatakse, liigutades ühest otsast jämedamat klaaspulka umbes kümme korda edasi-tagasi. Katseklaas jäetakse veevanni temperatuuriga 25 °C täpselt 10 minutiks, arvestades pepsiini lahuse lisamisest (reaktsiooni kestust ja temperatuuri tuleb rangelt järgida). Seejärel lisatakse 10,0 ml trikloroäädikhappe lahust (3.4), mis on eelnevalt soojendatud temperatuurini 25 °C, segatakse ja filtritakse läbi kuiva filtri.

5.3. Värvuse teke ja optilise tiheduse mõõtmine

5,0 ml filtraati viiakse pipetiga 50milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi, lisatakse 10,0 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.5) ja pidevalt loksutades 3,0 ml lahjendatud Folin-Ciocalteu reaktiivi (3.6). 5–10 minuti pärast määratakse spektrofotomeetriga 1sentimeetristes küvettides lahuse optiline tihedus lainepikkusel 750 nm vee suhtes.

5.4. Pimekatse

Igal määramisel viiakse järgmisel viisil läbi pimekatse:

Katseklaasi viiakse pipetiga 5,0 ml hemoglobiinilahust (3.7), soojendatakse veevannis (4.1) temperatuurini 25 °C, lisatakse 10,0 ml trikloroäädikhappe lahust (3.4), mis on eelnevalt soojendatud temperatuurini 25 °C, segatakse, seejärel lisatakse 1,0 ml pepsiini lahust, mis on saadud vastavalt punktile 5.1. Segatakse klaaspulgaga ning jäetakse katseklaas täpselt 10 minutiks veevanni (4.1) temperatuuriga 25 °C. Segatakse ja filtritakse läbi kuiva filtri. Jätkatakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.

5.5. Kalibreerimisgraafik

50milliliitristesse Erlenmeyeri kolbidesse mõõdetakse türosiini standardlahuse (3.8) alikvootsed osad 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ja 5,0 ml, mis vastavad 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 ja 1,0 μmoolile türosiinile. Seeria lõpetatakse türosiinivaba kontroll-lahusega. Lahuse maht kolbides viiakse soolhappe (3.1) lisamisega 5,0 milliliitrini. Lisatakse 10,0 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.5) ja pideval loksutamisel 3,0 ml lahjendatud Folin-Ciocalteu reaktiivi (3.6). Mõõdetakse optiline tihedus, nagu on kirjeldatud punkti 5.3 viimases lauses. Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes sellele türosiini kogused ja neile vastavad optilised tihedused.

6. Tulemuste arvutamine

Kalibreerimisgraafikult leitakse türosiini kogus μmoolides, mis vastab värvilise lahuse optilisele tihedusele, mida on korrigeeritud pimekatse tulemuse alusel.

Pepsiini aktiivsus (mg kohta minutis) türosiini μmoolides 25 °C juures arvutatakse järgmise valemi järgi:

milles:

a = on türosiini kogus μmoolides, leitud kalibreerimisgraafikult;

p = on pepsiini kogus milligrammides, mis on lisatud punktis 5.2.

7. Märkused

7.1. Lahustatava pepsiini kogus peab olema selline, et lõpus fotomeetrilisel mõõtmisel saadaks optiline tihedus vahemikus 0,35 ± 0,035.

7.2. Selle meetodiga saadud 2 ühikut mg kohta vastavad: 3,64 Ansoni milliühikule/mg (μmooli türosiini/mg · min temperatuuril 35,5 °C), või 36 400 kaubanduslikule ühikule/g (μmooli türosiini/g 10 minutiga temperatuuril 35,5 °C).

5. VABA GOSSÜPOLI JA GOSSÜPOLI ÜLDSISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja kasutamisala

See meetod võimaldab määrata vaba gossüpoli sisalduse, gossüpoli üldsisalduse ja gossüpolile keemiliselt sarnaste ainete sisalduse puuvillaseemnetes, puuvillaseemnejahus ja puuvillakoogis ning neid aineid sisaldavates segasöötades, kui neid aineid on seal üle 20 mg/kg.

2. Põhimõte

Gossüpol ekstraheeritakse 3-aminopropan-1-ooli manulusel kas propan-2-ooli ja heksaani seguga, et määrata vaba gossüpoli sisaldus, või dimetüülformamiidiga, et määrata gossüpoli üldsisaldus. Gossüpol viiakse aniliini abil üle gossüpol-dianiliiniks, mille optiline tihedus mõõdetakse lainepikkusel 440 nm.

3. Reaktiivid

3.1. Propan-2-ooli ja heksaani segu: segatakse 60 mahuosa analüütiliselt puhast propan-2-ooli 40 mahuosa n-heksaaniga.

3.2. Lahusti A: 1liitrisesse mõõtekolbi pannakse ligikaudu 500 ml propan-2-ooli ja heksaani segu, 2 ml 3-aminopropan-1-ooli, 8 ml jää-äädikhapet ja 50 ml vett. Kolb täiendatakse propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Saadud reaktiiv püsib ühe nädala.

3.3. Lahusti B: 100milliliitrisesse mõõtekolbi pannakse pipetiga 2 ml 3-aminopropan-1-ooli ja 10 ml jää-äädikhapet. Jahutatakse toatemperatuurini ning täiendatakse kolb N,N-dimetüülformamiidiga märgini. Saadud reaktiiv püsib ühe nädala.

3.4. Aniliin, analüütiliselt puhas: Kui pimekatses saadud optiline tihedus ületab 0,022, lisatakse aniliinile tsingitolmu ja destilleeritakse aniliin, visates ära esimese ja viimase kümnendiku destillaadist. Külmkapis säilib reaktiiv pruunis korgiga suletud klaaspudelis mitu kuud.

3.5. Gossüpoli standardlahus A: 250milliliitrisesse mõõtekolbi pannakse 27,9 mg gossüpolatsetaati. See lahustatakse lahustis A (3.2) ja kolb täiendatakse sama lahustiga märgini. 50 ml seda lahust viiakse pipetiga 250milliliitrisesse mõõtekolbi ning täiendatakse kolb lahustiga A märgini. Saadud lahuse gossüpoli kontsentratsioon on 0,02 mg/ml. Enne kasutamist lastakse üks tund toatemperatuuril seista.

3.6. Gossüpoli standardlahus B: 50milliliitrisesse mõõtekolbi pannakse 27,9 mg gossüpolatsetaati. See lahustatakse lahustis B (3.3) ja kolb täiendatakse sama lahustiga märgini. Saadud lahuse gossüpoli kontsentratsioon on 0,5 mg/ml.

Valguse eest kaitstult püsivad gossüpoli standardlahused A ja B 24 tundi.

4. Seadmed

4.1. Segisti (trummel), umbes 35 p/min.

4.2. Spektrofotomeeter.

5. Töö käik

5.1. Analüüsitav proov

Proovi kasutatav kogus sõltub analüüsitava materjali eeldatavast gossüpolisisaldusest. Eelistatav on töötada väikese prooviga ja filtraadi suhteliselt suure alikvootse osaga, et saada piisavalt gossüpoli täpseks fotomeetriliseks mõõtmiseks. Vaba gossüpoli määramiseks puuvillaseemnetes, puuvillaseemnejahus ja puuvillakoogis ei tohi proov olla suurem kui 1 g, segasööda puhul võib see olla 5 g. Enamikul juhtudest sobib filtraadi alikvootne osa mahuga 10 ml; see peab sisaldama 50–100 μg gossüpoli. Gossüpoli üldsisalduse määramiseks peab proovi suurus olema 0,5–5 g, et filtraadi alikvootne osa 2 ml sisaldaks 40–200 μg gossüpoli.

Analüüs tuleb läbi viia toatemperatuuril umbes 20 °C juures.

5.2. Vaba gossüpoli määramine

Proov pannakse lihvitud kaelaga kolbi, mille maht on 250 ml ja mille põhi on kaetud purustatud klaasiga. Lisatakse pipeti abil 50 ml lahustit A (3.2), kolb suletakse korgiga ja segatakse segistis üks tund. Filtritakse läbi kuiva filtri ja kogutakse filtraat väiksesse lihvitud kaelaga kolbi. Filtrimise ajal kaetakse lehter uuriklaasiga. Pipetiga viiakse kahte 25milliliitrisesse mõõtekolbi (A ja B) filtraadi ühesugused alikvootsed osad, mis sisaldavad 50–100 μg gossüpoli. Vajadusel viiakse filtraadi maht lahusti A (3.2) lisamisega 10 milliliitrini. Seejärel täidetakse kolb A propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Saadud lahust kasutatakse võrdluslahusena, mille suhtes mõõdetakse proovi lahust.

Kahte teise 25milliliitrisesse mõõtekolbi (C ja D) viiakse pipetiga á 10 ml lahustit A (3.2). Kolb C täidetakse propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Saadud lahust kasutatakse võrdluslahusena, mille suhtes mõõdetakse pimekatse lahust.

Kolbidesse D ja B lisatakse á 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Kolvid jahutatakse toatemperatuurini, täiendatakse propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista.

Spektrofotomeetriga määratakse 1sentimeetristes klaasküvettides lainepikkusel 440 nm pimekatse lahuse (D) optiline tihedus võrdluslahuse (C) suhtes ning proovi lahuse (B) optiline tihedus võrdluslahuse (A) suhtes.

Proovilahuse optilisest tihedusest lahutatakse pimekatse lahuse optiline tihedus (= korrigeeritud optiline tihedus). Selle väärtuse põhjal arvutatakse vaba gossüpoli sisaldus, nagu on näidatud punktis 6.

5.3. Gossüpoli üldsisalduse määramine

1–5 mg gossüpoli sisaldav proov pannakse 50milliliitrisesse mõõtekolbi ja lisatakse 10 ml lahustit B (3.3). Samal ajal valmistatakse ette pimekatse, pannes teise 50milliliitrisesse mõõtekolbi 10 ml lahustit B (3.3). Neid kahte kolbi kuumutatakse keeval veevannil 30 minutit. Jahutatakse toatemperatuurini ning täiendatakse mõlemad kolvid propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Segatakse ja jäetakse 10–15 minutiks selginema, seejärel filtritakse ja kogutakse filtraadid lihvitud kaelaga kolbidesse.

Kahte 25milliliitrisesse mõõtekolbi viiakse pipetiga á 2 ml proovi filtraati ning kahte teise 25milliliitrisesse mõõtekolbi á 2 ml pimekatse filtraati. Täiendatakse kummagi seeria üks kolb propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) 25 milliliitrini. Saadud lahuseid kasutatakse võrdluslahustena.

Kahte teise kolbi lisatakse á 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, täidetakse kolvid propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) 25 milliliitrini, segatakse ja lastakse üks tund seista.

Määratakse optiline tihedus, nagu on kirjeldatud vaba gossüpoli määramise eeskirja punktis 5.2. Saadud väärtusest arvutatakse gossüpoli üldsisaldus vastavalt punktile 6.

6. Tulemuste arvutamine

Tulemused võib arvutada kas optilise eritiheduse (6.1) või kalibreerimisgraafiku (6.2) järgi.

6.1. Optilise eritiheduse järgi:

Eespool kirjeldatud tingimustes on optilised eritihedused järgmised:







Vaba gossüpoli sisaldus: Gossüpoli üldsisaldus:

Vaba gossüpoli sisaldus või gossüpoli üldsisaldus proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

milles:

E = on korrigeeritud optiline tihedus, mis on määratud vastavalt punktile 5.2;

p = on proovi mass (g);

a = on filtraadi alikvootse osa ruumala (ml).

6.2. Kalibreerimisgraafiku järgi

6.2.1. Vaba gossüpoli sisaldus

Valmistatakse ette kaks seeriat mõõtekolbe, kummaski viis 25milliliitrist kolbi. Mõlema seeria kolbidesse viiakse pipetiga gossüpoli standardlahuse A (3.5) alikvootsed osad 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 ja 10,0 ml. Lahuse maht viiakse kolbides lahusti A (3.5) lisamisega 10 milliliitrini. Mõlemad seeriad lõpetatakse 25milliliitrise mõõtekolviga, mis sisaldab üksnes lahustit A (3.2) (pimekatse).

Esimese seeria kolvid (kaasa arvatud kolb pimekatsega) täiendatakse märgini propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) (võrdlusseeria).

Teise seeria igasse kolbi (kaasa arvatud kolb pimekatsega) lisatakse 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, täiendatakse kolvid propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista (standardseeria).

Vastavalt punktile 5.2 määratakse standardseeria lahuste optiline tihedus võrdlusseeria vastavate lahuste suhtes. Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes sellele gossüpoli kogused μg-des ja neile vastavad optilised tihedused.

6.2.2. Gossüpoli üldsisaldus

Võetakse kuus 50milliliitrist mõõtekolbi. Esimesse kolbi viiakse 10 ml lahustit B (3.3) ja teistesse vastavalt 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 ja 10,0 ml gossüpoli standardlahust B (3.6). Lahuse maht igas kolvis viiakse lahusti B (3.3) lisamisega 10 milliliitrini. Kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, täiendatakse kolvid propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini ja segatakse.

2,0 ml neid lahuseid pannakse kahe kuuest 25milliliitrisest mõõtekolvist koosneva seeria igasse kolbi. Esimese seeria kolvid täiendatakse märgini propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) (võrdlusseeria).

Teise seeria igasse kolbi lisatakse 2 ml aniliini (3.4). Kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, täiendatakse kolvid propan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista (standardseeria).

Vastavalt punktile 5.2 määratakse standardseeria lahuste optiline tihedus vastavate võrdlusseerias lahuste suhtes. Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes sellele gossüpoli kogused μg-des ja neile vastavad optilised tihedused.

6.3. Korratavus

Ühe ja sama prooviga läbiviidud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

— 15 % suhtelises väärtuses gossüpoli sisalduse puhul alla 500 mg/kg,

— 75 mg/kg absoluutväärtuses sisalduse puhul 500–750 mg/kg,

— 10 % suhtelises väärtuses sisalduse puhul üle 750 mg/kg.









II LISA

▼M4 —————

▼B

4. TÜLOSIINI MÄÄRAMINE

— difusiooni järgi agarsöötmel —

1. Eesmärk ja kasutamisala

Meetod võimaldab määrata söötade, kontsentraatide ja eelsegude tülosiinisisalduse, kui see on üle 2 mg/kg.

2. Põhimõte

Proovi töödeldakse temperatuurini 80 °C kuumutatud fosfaatpuhverlahusega, pH 8, ja ekstraheeritakse seejärel metanooliga. Pärast tsentrifuugimist lahjendatakse ekstrakt ja tehakse kindlaks selle antibiootiline aktiivsus, mõõtes tülosiini difusiooni agarsöötmel, millele on külvatud Sarcina lutea. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibeerimistsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt on võrdeline antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga.

3. Mikroorganism: Sarcina lutea ATCC nr 9341

3.1. Tüvikultuuri säilitamine

Sarcina lutea inokuleeritakse längagariga katseklaasi, millesse on pandud sööde (4.1) ja mille pH on viidud väärtuseni 7,0. Inkubeeritakse järgmise hommikuni temperatuuril umbes 35 °C. Kultuuri hoitakse külmkapis ja inokuleeritakse sellega agarit uuesti iga kuu.

3.2. Bakterisuspensiooni valmistamine

Hiljuti valmistatud längagariga katseklaasist (3.1) kogutakse bakterid, kasutades 2–3 ml füsioloogilist lahust (4.4). Suspensioon külvatakse Roux’ pudelisse, milles on 250 ml põhisöödet (4.1), mille pH on viidud väärtuseni 7,0. Inkubeeritakse 24 tundi temperatuuril 35 °C, seejärel kogutakse bakterid 25 ml füsioloogilisse lahusesse (4.4). Suspensioon segatakse ja lahjendatakse, et saada lainepikkusel 650 nm valguse läbilaskvuseks umbes 75 %.

Külmkapis säilitamisel võib seda suspensiooni kasutada ühe nädala.

Eelkatsetega plaatidel, kus on analüüsi põhisööde (4.1), tehakse kindlaks inokulumi kogus, mis annab tülosiini erinevate kasutatud kontsentratsioonide puhul suurimad võimalikud inhibeerimistsoonid, mis on veel selged. Sööde inokuleeritakse temperatuuril 48–50 °C.

4. Söötmed ja reaktiivid

4.1. Analüüsi põhisööde: ( 5 )







Glükoos 1 g Trüptiline peptoon 10 g Lihapuljong 1,5 g Pärmiekstrakt 3 g Agar, olenevalt kvaliteedist 10–20 g Destilleeritud vesi kuni 1 000 ml

Tüvikultuuri säilitamiseks ja bakterisuspensiooni valmistamiseks reguleeritakse pH vahetult enne kasutamist väärtuseni 7,0 ja määramiseks – väärtuseni 8,0.

4.2. Fosfaatpuhverlahus, pH 8







Kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4, analüütiliselt puhas 0,523 g Dikaaliumvesinikfosfaat, K2HPO4, analüütiliselt puhas 16,730 g Destilleeritud vesi kuni 1 000 ml

4.3. Fosfaatpuhverlahus, pH 7







Kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4, analüütiliselt puhas 5,5 g Dikaaliumvesinikfosfaat K2HPO4, analüütiliselt puhas 13,6 g Destilleeritud vesi kuni 1 000 ml

4.4. Steriilne füsioloogiline lahus.

4.5. Puhas metanool.

4.6. 40mahuprotsendiline metanool.

4.7. Fosfaatpuhverlahuse (4.2) ja puhta metanooli segu mahuvahekorras 60/40.

4.8. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega tülosiin.

5. Standardlahused

Standardainet (4.8) kuivatatakse vaakumkuivatuskapis (rõhk 5 mmHg) kolm tundi temperatuuril 60 °C. Kaalutakse mõõtekolbi 10–50 mg, lahustatakse 5 ml metanooliga (4.5) ja lahjendatakse lahus fosfaatpuhverlahusega pH 7 (4.3), et saada tülosiinaluse varulahus kontsentratsiooniga 1 000 μg/ml.

Sellest varulahusest valmistatakse 2 μg tülosiinalust milliliitris sisaldav standardtöölahus S8, lahjendades punktis 4.7 toodud seguga.

Seejärel valmistatakse punktis 4.7 toodud seguga järjest lahjendades (1 + 1) järgmiste kontsentratsioonidega lahused:







S4 1 μg/ml S2 0,5 μg/ml S1 0,25 μg/ml

6. Ekstraheerimine

Kontsentraatide analüüsiks võetakse 10grammine proov, eelsegude ja söötade puhul 20grammine proov. Lisatakse 60 ml temperatuurini 80 °C kuumutatud fosfaatpuhverlahust pH 8 (4.2) ja homogeniseeritakse 2 minutit (kodumikser, Ultra-Turrax vms).

Jäetakse 10 minutiks seisma, lisatakse 40 ml metanooli (4.5) ja homogeniseeritakse 5 minutit. Ekstrakt tsentrifuugitakse ja selle alikvootne osa lahjendatakse punktis 4.7 toodud seguga, et saada eeldatavaks tülosiini kontsentratsiooniks 2 μg/ml (= U8). Seejärel valmistatakse punktis 4.7 toodud seguga järjest lahjendades (1 + 1) kontsentratsioonid U4, U2 ja U1.

Kui tülosiini sisaldus on alla 10 mg/kg, siis aurutatakse ekstrakt rootoraurutis temperatuuril 35 °C kuivaks ja jääk lahustatakse 40protsendilises metanoolis (4.6).

7. Analüüsi käik

7.1. Söötme inokuleerimine

Temperatuuril 48–50 °C inokuleeritakse bakterisuspensioon (3.2) analüüsi põhisöötmesse (4.1), pH viiakse väärtuseni 8,0.

7.2. Plaatide ettevalmistamine

Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel, kasutades nelja kontsentratsiooniga standardlahuseid (S8, S4, S2, S1) ja nelja kontsentratsiooniga ekstrakte (U8, U4, U2, U1). Need neli ekstrakti ja neli standardlahuse kontsentratsiooni tuleb panna igale plaadile.

Valitakse plaadid, mis on piisavalt suured, et teha nendele paigutatud agarsöötmesse vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10–13 mm. Plaatidele valatakse selline arvutatud kogus inokuleeritud söödet (7.1), et saada ühtlane umbes 2 mm paksune kiht. Eelistatavalt tuleb katse läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaastahvlist, millele on pandud täiesti sile alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja paksusega 20 mm.

Söötmesse tehakse augud ja neisse viiakse pipetiga täpselt mõõdetud kogused antibiootikumi lahust (0,10–0,15 ml augu kohta, olenevalt augu läbimõõdust).

Iga proovi lahusega korratakse difusiooni vähemalt neli korda igal kontsentratsioonil, nii et iga määramine põhineks 32 inhibeerimistsooni hindamisel.

7.3. Inkubeerimine

Plaate inkubeeritakse järgmise hommikuni temperatuuril 35–37 °C.

8. Tulemuste arvutamine

Mõõdetakse inhibeerimistsoonide läbimõõt, eelistatavalt projektsiooni abil. Mõõtmistulemused kantakse poollogaritmilisele paberile, seades kontsentratsioonide logaritmid vastavusse nende inhibeerimistsoonide läbimõõdust. Läbi standardlahuse punktide ja ekstrakti punktide pannakse graafikul jooned. Segavate tegurite puudumise korral on need kaks joont paralleelsed.

Suhtelise aktiivsuse logaritm arvutatakse järgmise valemi abil:

Tegelik aktiivsus = eeldatav aktiivsus × suhteline aktiivsus.

9. Korratavus

Ühe ja sama prooviga läbiviidud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10 % (suhteline väärtus).

▼M2

5. VIRGINIAMÜTSIINI MÄÄRAMINE

— agarsöötmel difusiooni teel —

1. Eesmärk ja kasutusala

Käesolev meetod on virginiamütsiini määramiseks söötades ja eelsegudes. Määramise alampiir on 2 mg/kg (2 miljondikku). ( 6 )

2. Põhimõte

Proovi ekstraheeritakse Tween 80 metanoolilahusega. Ekstrakt dekanteeritakse või tsentrifuugitakse ja lahjendatakse. Antibiootilise aktiivsuse määramiseks mõõdetakse virginiamütsiini difusiooni agarsöötmes, millesse on inokuleeritud bakterit Micrococcus luteus. Difusiooni näitab mikroorganismi kasvu inhibeerimise tsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt loetakse võrdeliseks antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga kasutatud kontsentratsioonide vahemikus.

3. Mikroorganism: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Tüvikultuuri säilitamine

Längagari söötmele (4.1) katseklaasis külvatakse bakterit Micrococcus luteus ning inkubeeritakse 24 tundi 30 °C juures. Kultuuri hoitakse külmkapis temperatuuril umbes 4 °C. Külvamist korratakse iga kahe nädala tagant.

3.2. Bakterisuspensiooni valmistamine ( 7 )

Hiljuti valmistatud längagarilt (3.1) kogutakse kasv 2-3 ml naatriumkloriidi lahuse (4.3) abil. Seda suspensiooni kasutatakse Roux’ pudelis oleva 250 ml söötme (4.1) inokuleerimiseks. Inkubeeritakse 18–20 tundi temperatuuril 30 °C. Kasv kogutakse 25 ml naatriumkloriidi lahusesse (4.3) ning segatakse. Suspensioon lahjendatakse vahekorras 1: 10 naatriumkloriidi lahusega (4.3). Suspensiooni läbilaskvus peab olema ligikaudu 75 %, mõõdetuna lainepikkusel 650 nm 1-sentimeetrises küvetis naatriumkloriidi lahuse (4.3) suhtes. See suspensioon säilib temperatuuril 4 °C ühe nädala.

4. Söötmed ja reaktiivid

4.1. Sööde ja määramissööde ( 8 )







Lihapeptoon 6,0 g Trüptoon 4,0 g Pärmiekstrakt 3,0 g Lihaekstrakt 1,5 g Glükoos 1,0 g Agar 10,0–20,0 g Vesi 1 000 ml pH 6,5 (pärast steriliseerimist).

4.2. Fosfaatpuhver, pH 6







Dikaaliumvesinikfosfaat, K2HPO4 2,0 g Kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4 8,0 g Vesi 1 000 ml-ni

4.3. 0,8(massi/mahu)protsendiline naatriumkloriidi lahus: 8 g naatriumkloriidi lahustatakse vees ja lahjendatakse 1 000 milliliitrini; steriliseeritakse.

4.4. Metanool.

4.5. Fosfaatpuhvri (4.2) ja metanooli (4.4) segu mahuvahekorras 80/20.

4.6. Tween 80 0,5(massi/mahu)protsendiline lahus metanoolis: lahustada 5 g Tween 80 metanoolis (4.4) ja lahjendada metanooliga 1 000 milliliitrini.

4.7. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega virginiamütsiin.

5. Standardlahused

Standardaine (4.7) täpne kaalutis lahustatakse metanoolis (4.4) ja lahjendatakse metanooliga (4.4), et saada põhilahus, mis sisaldab 1 000 μg virginiamütsiini ml kohta.

See lahus säilib suletud kolvis 4 °C juures kuni viis päeva.

Kõnealusest põhilahusest valmistatakse seguga (4.5) järjest lahjendades järgmised lahused:







s8 1 μg/ml s4 0,5 μg/ml s2 0,25 μg/ml s1 0,125 μg/ml

6. Ekstrakti ja määramislahuste valmistamine

6.1. Ekstraheerimine

6.1.1. Tooted virginiamütsiini sisaldusega kuni 100 mg/kg

Kaalutakse 50 g proovi, lisatakse 200 ml lahust (4.6) ja loksutatakse 30 minutit. Jäetakse selginema või tsentrifuugitakse, võetakse 20 ml supernatantlahust ja aurutatakse rootoraurutis temperatuuril kuni 40 °C kokku umbes 5 ml-ni. Jääki lahjendatakse seguga (4.5), et saada virginiamütsiini eeldatavaks sisalduseks 1 μg/ml (= u8).

6.1.2. Tooted virginiamütsiini sisaldusega üle 100 mg/kg

Kaalutakse kuni 10,0 g proovi, nii et selles sisalduks 1–50 mg virginiamütsiini, lisatakse 100 ml lahust (4.6) ja loksutatakse 30 minutit. Jäetakse selginema või tsentrifuugitakse, seejärel lahjendatakse supernatantlahust seguga (4.5), et saada virginiamütsiini eeldatavaks sisalduseks 1 μg/ml (= u8).

6.2. Määramislahused

Lahusest u8 valmistatakse seguga (4.5) järjest lahjendades (1: 1) lahused u4 (eeldatav sisaldus 0,5 μg/ml), u2 (eeldatav sisaldus 0,25 μg/ml) ja u1 (eeldatav sisaldus 0,125 μg/ml).

7. Määramise käik

7.1. Määramissöötme inokuleerimine

Määramissöötmesse (4.1) inokuleeritakse bakterisuspensioon (3.2) temperatuuril umbes 50 °C. Söötme (4.1) plaatidel tehtavate eelkatsetega määratakse kindlaks bakterisuspensiooni kogus, mis on vajalik suurimate ja selgeimate inhibeerimistsoonide saamiseks virginiamütsiini eri kontsentratsioonide juures.

7.2. Plaatide ettevalmistamine

Difusiooni läbi agari uuritakse plaatidel standardlahuse nelja kontsentratsiooni juures (s8, s4, s2 ja s1) ja määramislahuse nelja kontsentratsiooni juures (u8, u4, u2 ja u1). Need neli ekstrakti ja standardlahuse kontsentratsiooni tuleb tingimata panna igale plaadile. Selleks valitakse plaadid, mis on piisavalt suured, et agarsöötmesse saaks teha vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10–13 mm, mille keskpunktid on üksteisest vähemalt 30 mm kaugusel. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaasitahvlist, millele on pandud sileda küljega alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm.

Plaatidele valatakse teatav kogus söödet (4.1), mis on inokuleeritud vastavalt punktile 7.1, nii et tekiks ligikaudu 2 mm paksune kiht (200 millimeetrise läbimõõduga plaadi puhul 60 ml). Söötmel lastakse horisontaalasendis tarduda, tardunud söötmesse tehakse augud ning pannakse nendesse täpselt mõõdetud määramis- ja standardlahuste kogused (0,10–0,15 ml augu kohta, sõltuvalt läbimõõdust). Igal kontsentratsioonil tehakse vähemalt neli katset, nii et iga määramine põhineks vähemalt 32 inhibeerimistsooni hindamisel.

7.3. Inkubeerimine

Plaate inkubeeritakse 30 ± 2 °C juures 16–18 tundi.

8. Hindamine

Inhibeerimistsoonide läbimõõt mõõdetakse 0,1 mm täpsusega. Iga kontsentratsiooni jaoks saadud keskmised väärtused kantakse poollogaritmilisele millimeetripaberile, et leida kontsentratsiooni logaritmi ja inhibeerimistsooni läbimõõdu vaheline seos. Nii standardlahuse kui ka ekstrakti puhul tõmmatakse läbi punktide “kõige sobivamad” jooned, näiteks nagu on kirjeldatud allpool:

Standardlahuse madalaima kontsentratsiooni (SL) jaoks määratakse “kõige sobivam” punkt, kasutades järgmist valemit:

a)

Standardlahuse kõrgeima kontsentratsiooni (SH) jaoks määratakse “kõige sobivam” punkt, kasutades järgmist valemit:

b)

Samamoodi arvutatakse “kõige sobivamad” punktid ekstrakti madalaima kontsentratsiooni (UL) ja ekstrakti kõrgeima kontsentratsiooni (UH) jaoks, asendades s1, s2, s4 ja s8 eespool toodud valemites väärtustega u1, u2, u4 ja u8.

Arvutatud SL ja SH väärtused märgitakse samale millimeetripaberile ja nende ühendamisel saadakse standardlahuse “kõige sobivam” joon. Samamoodi märgitakse graafikule UL ja UH ning nende ühendamisel saadakse ekstrakti “kõige sobivam” joon.

Segavate mõjude puudumisel peaksid saadud jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni lugeda paralleelseks, kui väärtused (SH–SL) ja (UH–UL) ei erine rohkem kui 10 % võrra nende keskväärtusest.

Kui jooned ei ole paralleelsed, võib visata välja kas u1 ja s1 või u8 ja s8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH järgmiste valemite abil, et saada alternatiivsed “kõige sobivamad” jooned:







(a′) SL = or (b′) SH = or

ning samamoodi UL ja UH puhul. Need peaksid vastama samadele paralleelsuse kriteeriumidele. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme kontsentratsiooni põhjal, tuleb märkida lõpp-protokolli.

Kui jooned loetakse paralleelseks, siis arvutatakse suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) ühe alljärgneva valemi abil sõltuvalt sellest, kas paralleelsuse hindamiseks on kasutatud kolme või nelja kontsentratsiooni.

Nelja kontsentratsiooni puhul:

c)

Kolme kontsentratsiooni puhul:

d)

või

(d ′)

Proovi ekstrakti aktiivsus = vastava standardi aktiivsus × A

(u8 = s8 × A)

Kui suhteline aktiivsus jääb väljapoole vahemikku 0,5-2,0, siis korratakse määramist, kohandades vastavalt vajadusele ekstrakti kontsentratsiooni või, kui see ei ole võimalik, standardlahuste kontsentratsiooni. Kui suhtelist aktiivsust ei ole võimalik reguleerida nõutud vahemikku, siis tuleb kõiki saadud tulemusi käsitada ligikaudsetena ning see tuleb märkida lõpp-protokolli.

Kui jooni ei saa lugeda paralleelseks, siis korratakse määramist. Kui ka siis ei saada paralleelseid jooni, tuleb määramine lugeda mitterahuldavaks.

Tulemus väljendatakse virginiamütsiini milligrammides sööda kilogrammi kohta.

9. Korratavus

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

— absoluutväärtusena väljendatult 2 mg/kg, kui virginiamütsiini sisaldus on kuni 10 mg/kg,

— 20 % suurimast väärtusest, kui virginiamütsiini sisaldus on 10–25 mg/kg,

— absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui virginiamütsiini sisaldus on 25–50 mg/kg,

— 10 % suurimast väärtusest, kui virginiamütsiini sisaldus on suurem kui 50 mg/kg.