A.

Tehakse blokeeriv või võistlev ELISA test vastavalt järgmisele protokollile: Monoklonaalseid antikehasid 3-17-A3 kasutav võistlev ELISA suudab tuvastada kõik lammaste katarraalse palaviku tuntud serotüübid. Testi põhimõte on BTV antigeeni ja grupispetsiifilise monoklonaalse antikeha (3-17-A3) vahelise reaktsiooni katkemine uuritavate seerumite lahjendatud lahuste lisamisel. Uuritavates seerumites olevad BTV antikehad blokeerivad monoklonaalse antikeha (MAK) seondumise ning selle tulemusena väheneb ensüümiga märgistatud hiirevastase antikeha ja kromogeeni/substraadi lisamise järel tekkiva värvusreaktsiooni intensiivsus. Seerumit võib testida ühekordselt lahjendatud lahuses 1:5 (tilktest — lisa 1) või tiitrimise teel (seerumi tiitrimine — lisa 2), et saada lahuse lõpptiiter. 50 % ületavaid inhibitsiooniväärtusi võib pidada positiivseks. 1. Asjakohased ELISA mikrotiiterplaadid. 2. Antigeen: tarnitakse rakust ekstraheeritud kontsentraadina, valmistatakse vastavalt allpool toodud kirjeldusele ja säilitatakse temperatuuril -20 °C või -70 °C. 3. Blokeeriv puhver: fosfaadiga puhverdatud keedusoolalahus, mis sisaldab 0,3 % BTV-negatiivset täiskasvanud veise seerumit ja 0,1 % (v/v) Tween-20 (polüoksüetüleensorbitoonmonolauraatsiirupina) fosfaadiga puhverdatud soolalahuses. 4. Monoklonaalne antikeha: 3-17-A3 (hübridoomi rakukultuuri supernatandina), säilitatakse -20 °C juures või külmkuivatatakse, enne kasutamist lahjendatakse blokeeriva puhvriga vahekorras 1:100, suunatakse grupispetsiifilise polüpeptiidi VP7 vastu. 5. Konjugaat: küüliku hiirevastane globuliin (absorbeeritud ja elueeritud), mida on konjugeeritud mädarõika peroksüdaasiga ja hoitud pimedas 4 °C juures. 6. Kromogeen ja substraat: ortofenüleendiamiin (OPD-kromogeen) lõplikul kontsentratsioonil 0,4 mg/ml steriilses destilleeritud vees. Vahetult enne kasutamist lisatakse vesinikperoksiid (30 % w/v-substraat) 0,05 mahu % (5 μl H2O2 10 ml OPD kohta). (Ettevaatust OPD-ga töötamisel — kanda kummikindaid — oletatav mutageen.) 7. 1 M väävelhape: 26,6 ml hapet on lisatud 473,4 ml destilleeritud veele. (Pidada meeles — alati lisatakse hapet veele, mitte kunagi vett happele.) 8. Orbitaalsegisti. 9. ELISA plaadilugeja (testi tulemusi võib lugeda ka visuaalselt). Cc: konjugaadi kontroll (ilma seerumita/ilma monoklonaalse antikehata); C++: kange positiivne kontrollseerum; C+: lahja positiivne kontrollseerum; C-: negatiivne kontrollseerum; Cm: monoklonaalse antikeha kontroll (ilma seerumita).



Liide 1: tilklahjendus (1:5) (40 seerumit plaadil) Kontrollid Uuritavad seerumid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C + C + F C + C + G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



Liide 2: seerumi tiitrimine (10 seerumit plaadil) Kontrollid Uuritavad seerumid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1:5 1:5 B Cc C– 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Konjugaadi kontroll (Cc) augud 1 A ja 1B on pimekontrolli lahtrid, mis sisaldavad BTV antigeeni ja konjugaati. Seda rida võib kasutada pimereana ELISA plaadilugeja jaoks. Monoklonaalse antikeha (MAK) kontroll (Cm) veerud 1 ja 2, read G ja H on monoklonaalse antikeha kontrollimiseks ning need sisaldavad BTV antigeeni, monoklonaalset antikeha ja konjugaati. Nende aukude värvus on maksimaalne. Selle kontrollrea optilise tiheduse näitude keskmine väärtus vastab 0 % inhibitsiooniväärtusele. Positiivne kontroll (C++, C-) veerud 1 ja 2, read C-D-E-F. Nendes aukudes on BTV antigeen, vastavalt BTV kange ja lahja positiivne antiseerum, MAK ja konjugaat. Negatiivne kontroll (C-) augud 2 A ja 2B on negatiivse kontrolli lahtrid, mis sisaldavad BTV antigeeni, BTV negatiivset antiseerumit, monoklonaalset antikeha ja konjugaati. Uuritavad seerumid suuremahuliste seroloogiliste uuringute ja kiirseire puhul võib seerumit testida ühekordselt lahjendatud lahuses 1:5 (lisa 1). Alternatiivina saab uurida 10 seerumit lahjendustes 1:5 kuni 1:640 (lisa 2). See annab teatava ettekujutuse uuritavate seerumite antikeha-tiitrist. 1. BTV antigeen lahjendatakse PBS-is varem tiitritud kontsentratsioonini, töödeldakse lühidalt ultraheliga agregeerunud viiruse hajutamiseks (sonikaatori puudumisel pipetitakse tugevalt) ning lisatakse 50 μl kυikidesse ELISA plaadi aukudesse. Antigeeni ühtlaseks jaotumiseks koputatakse plaadi servadele. 2. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 60 minutit. Plaadid pestakse, täites ja tühjendades auke kolm korda mittesteriilse PBS-iga, ning kuivatatakse kuivatuspaberiga. 3. Kontrollaugud: Cc aukudesse lisatakse 100 μl blokeerivat puhverlahust. Lisatakse 50 μl positiivset ja negatiivset kontrollseerumit lahjendusastmel 1:5 (10 μl seerumit + 40 μl blokeerivat puhverlahust) vastavatesse aukudesse C-, C + ja C++. MAKi kontrollaukudesse lisatakse 50 μl blokeerivat puhverlahust. Tilktiitrimise meetod: veergude 3–12 topeltaukudesse lisatakse iga uuritavat seerumit, mis on lahjendatud blokeerivas puhverlahuses vahekorras 1:5 (10 μl seerumit + 40 μl blokeerivat puhverlahust) või Seerumi tiitrimise meetod: blokeerivas puhverlahuses valmistatakse iga uuritava proovi kahekordsete lahjenduste rida, (lahjendusastmelt 1:5 astmeni 1:640), iga veeru 3–12 kaheksas augus. 4. Kohe pärast uuritavate seerumite lisamist lahjendatakse MAK blokeerivas puhvris vahekorras 1:100 ja lisatakse 50 μl plaadi igasse auku, välja arvatud pimekontrolli augud. 5. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 60 minutit. Pestakse kolm korda PBSga ja kuivatatakse kuivatuspaberiga. 6. Küüliku hiirevastase globuliini kontsentraat lahjendatakse 1/5000 blokeerivas puhvris ja lisatakse 50 μl plaadi igasse auku. 7. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 60 minutit. Pestakse kolm korda PBSga ja kuivatatakse kuivatuspaberiga. 8. OPD sulatatakse ja vahetult enne kasutamist lisatakse sellele 5 μl 30 % vesinikperoksiidi iga 10 ml OPD kohta. Lisatakse plaadi igasse auku 50 μl. Lastakse värvusel tekkida umbes 10 minutit ja peatatakse reaktsioon 1 M väävelhappega (50 μl augu kohta). Värvumine peaks toimuma MAKi kontrollaukudes ja selliste seerumitega täidetud aukudes, mis ei sisalda BTV antikehi. 9. Plaate uuritakse ja tulemused protokollitakse visuaalselt või spektrofotomeetri abil. Arvutiprogrammi abil prinditakse välja uuritava ja kontrollseerumi optilise tiheduse (OD) väärtused ja inhibitsiooni protsent (PI) lähtuvalt neljas augus registreeritud antigeeni kontrollseerumi keskmisest väärtusest. OD ja PI väärtusi kasutatakse testi usaldatavuse üle otsustamiseks. Monoklonaalse antikeha kontrolli (antigeen pluss monoklonaalne antikeha uuritava seerumi puudumisel) ülemised (ÜPV) ja alumised piirväärtused (APV) on OD väärtuste vahemikus 0,4–1,4. Plaadid, mis ei vasta nimetatud kriteeriumidele, tunnistatakse mitterahuldavaks. Arvutiprogrammi puudumisel prinditakse OD väärtused välja ELISA printeriga. Arvutatakse antigeeni kontrollaukude keskmine OD väärtus, mis on samaväärne 100 % väärtusega. Määratakse kindlaks 50 % OD väärtus ja arvutatakse välja iga proovi positiivsus ja negatiivsus. Inhibitsiooni protsendimäära (PI) väärtus = 100 — (iga uuritava kontrolli OD/Cm keskmine OD) × 100. Dubleeritud negatiivse kontrollseerumi augud ja dubleeritud tühikatse augud peaksid andma PI väärtuse vahemikus vastavalt + 25 % ja -25 % ning + 95 % ja + 105 %. Kui tulemus jääb väljapoole nimetatud väärtusi, ei tähenda see, et plaat tunnistataks kehtetuks, vaid seda, et taustavärvus veel muutub. Kange ja lahja positiivne kontrollseerum peaksid andma PI väärtuse vahemikus vastavalt + 81 % ja + 100 % ning + 51 % ja + 80 %. Uuritava seerumi diagnostikalävi on 50 % (PI 50 % või OD 50 %). Proovid, mille PI väärtused on > 50 %, registreeritakse negatiivsetena. Proove, mille PI väärtused on dubleeritud aukude künnisväärtusest ülal- või allpool, tuleb lugeda kahtlasteks; selliseid proove võib uuesti testida tilktestmeetodil ja/või tiitrimise teel. Positiivseid proove võib samuti tiitrida positiivsuse astme kindlaksmääramiseks. Tulemuse visuaalne lugemine: positiivsed ja negatiivsed proovid on palja silmaga kergesti eristatavad; nõrgalt positiivsete või kangete negatiivsete proovide palja silmaga tõlgendamine võib olla raskem. 1. 40-60 ühtlaselt BHK-21 rakkudega täitunud Roux' anumat pestakse kolm korda seerumivaba Eagle'i söötmega ja nakatatakse BTV serotüüp 1-ga seerumivabas Eagle'i söötmes. 2. Inkubeeritakse 37 °C juures ja jälgitakse iga päev tsütopaatilise efekti (TPE) teket. 3. Kui TPE on hõlmanud 90–100 % iga Roux' anuma rakukihist, kogutakse viirus kokku, raputades veel kinnitunud rakud klaasi küljest lahti. 4. Tsentrifuugitakse kiirusel 2000–3000 pööret minutis rakkude sadestamiseks. 5. Supernatant kõrvaldatakse ja rakud resuspendeeritakse umbes 30 ml PBS-is, mis sisaldab 1 % sarkosüüli ja 2 ml fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi (lüüsipuhver). Selle tulemusena võivad rakud moodustada geeli, efekti vähendamiseks võib lisada lüüsipuhvrit. (NB: fenüülmetüülsulfonüülfluoriid on ohtlik — käsitseda äärmiselt ettevaatlikult.) 6. Rakke lõhustatakse 60 sekundit, kasutades ultrahelisondi amplituudil 30 mikronit. 7. Tsentrifuugitakse 10 minutit kiirusel 10000 pööret minutis. 8. Supernatant säilitatakse + 4 °C juures ja järelejäänud rakukogum resuspendeeritakse 10–20 ml lüüsipuhvris. 9. Töödeldakse ultraheliga ja selitatakse kolm korda, säilitades iga etapi supernatandi. 10. Supernatandid pannakse kokku ja tsentrifuugitakse 120 minutit kiirusel 24000 pööret minutis (100 000 g) +4 °C juures 5 ml 40 % sahharoosi padjal (w/v PBS-is), kasutades Beckmanni 30 ml tsentrifuugitopse ja SW 28 rootorit. 11. Supernatant kõrvaldatakse, vedelik eemaldatakse topsidest täielikult ning sade resuspendeeritakse PBS-is ultrahelitöötlusega. Antigeen säilitatakse alikvootides -20 °C juures. Lammaste katarraalse palaviku ELISA antigeen tiitritakse kaudse ELISAga. Antigeeni kahekordsed lahjendused tiitritakse, kasutades monoklonaalse antikeha 3-17-A3 konstantset lahjendust (1:100). Protokoll on järgmine: 1. Vahekorras 1:20 lahjendatud BTV antigeen tiitritakse mikrotiiterplaadil kahekordsete lahjendustena (50 μl augu kohta), kasutades mitmekanalilist pipetti. 2. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund. 3. Plaadid pestakse kolm korda PBS-ga. 4. Mikrotiiterplaadi igasse auku lisatakse 50 μl monoklonaalset antikeha 3-17-A3 (lahjenduses 1:100). 5. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund. 6. Plaadid pestakse kolm korda PBS-ga. 7. Mikrotiiterplaadi igasse auku lisatakse 50 μl küüliku hiirevastast globuliini, mis on konjugeeritud mädarυika peroksüdaasiga ja lahjendatud varem tiitritud optimaalse kontsentratsioonini. 8. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund. 9. Lisatakse substraat ja kromogeen, nagu eespool kirjeldatud. Reaktsioon peatatakse 10 minuti pärast, lisades 1 M väävelhapet (50 μl augu kohta). Võistleva testi puhul tuleb monoklonaalset antikeha võtta liiaga, seetõttu valitakse antigeeni lahjendus, mis langeb tiitrimiskõverale (mitte platoole) ning mis annab 10 minuti jooksul OD väärtuseks umbes 0,8.