2009R0152 — ET — 17.07.2014 — 004.001

Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest

►B KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 152/2009, 27. jaanuar 2009, milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks (EMPs kohaldatav tekst) (EÜT L 054, 26.2.2009, p.1)

Muudetud:









▼B

KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 152/2009,

27. jaanuar 2009,

milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks

(EMPs kohaldatav tekst)







EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 29. aprilli 2004. aasta määrust (EÜ) nr 882/2004 ametlike kontrollide kohta, mida tehakse sööda- ja toidualaste õigusnormide ning loomatervishoidu ja loomade heaolu käsitlevate eeskirjade täitmise kontrollimise tagamiseks, ( 1 ) eriti selle artikli 11 lõike 4 punkte a, b ja c, ning arvestades järgmist: (1) Direktiivi 70/373/EMÜ rakendamiseks on võetud vastu järgmised õigusaktid, mis jäävad jõusse kooskõlas määruse (EÜ) nr 882/2004 artikli 61 lõikega 2: — komisjoni 15. juuni 1971. aasta esimene direktiiv 71/250/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 2 ); — komisjoni 18. novembri 1971. aasta teine direktiiv 71/393/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 3 ); — komisjoni 27. aprilli 1972. aasta kolmas direktiiv 72/199/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 4 ); — komisjoni 5. detsembri 1972. aasta neljas direktiiv 73/46/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 5 ); — komisjoni 1. märtsi 1976. aasta esimene direktiiv 76/371/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse proovivõtumeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 6 ); — komisjoni 1. märtsi 1976. aasta seitsmes direktiiv 76/372/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 7 ); — komisjoni 15. juuni 1978. aasta kaheksas direktiiv 78/633/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 8 ); — komisjoni 31. juuli 1981. aasta üheksas direktiiv 81/715/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 9 ); — komisjoni 25. juuli 1984. aasta kümnes direktiiv 84/425/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 10 ); — komisjoni 9. aprilli 1986. aasta direktiiv 86/174/EMÜ, millega määratakse kindlaks kodulindude segasööda energiasisalduse arvutamise meetod ( 11 ); — komisjoni 28. juuli 1993. aasta üheteistkümnes direktiiv 93/70/EMÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 12 ); — komisjoni 17. detsembri 1993. aasta kaheteistkümnes direktiiv 93/117/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks ( 13 ); — komisjoni 3. septembri 1998. aasta direktiiv 98/64/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid aminohapete, toorõli ja -rasva ja olakvindoksi määramiseks söödas ning muudetakse direktiivi 71/393/EMÜ ( 14 ); — komisjoni 20. aprilli 1999. aasta direktiiv 1999/27/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid amprooliumi, diklasuriili ja karbadoksi määramiseks söötades ning muudetakse direktiive 71/250/EMÜ ja 73/46/EMÜ ja tunnistatakse kehtetuks direktiiv 74/203/EMÜ ( 15 ); — komisjoni 23. juuli 1999. aasta direktiiv 1999/76/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetod naatriumlasalotsiidi määramiseks söötades ( 16 ); — komisjoni 6. juuli 2000. aasta direktiiv 2000/45/EÜ, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid A-vitamiini, E-vitamiini ja trüptofaani sisalduse määramiseks loomasöödas ( 17 ); — komisjoni 26. juuli 2002. aasta direktiiv 2002/70/EÜ, millega kehtestatakse nõuded dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde taseme määramiseks söödas ( 18 ); — komisjoni 23. detsembri 2003. aasta direktiiv 2003/126/EÜ loomse päritoluga osiste määramise analüüsimeetodi kohta söötade ametlikul kontrollimisel ( 19 ). (2) Et direktiiv 70/373/EMÜ asendati määrusega (EÜ) nr 882/2004, on asjakohane asendada kõnealuse direktiivi rakendusaktid ühe määrusega. Samas tuleks ka kohandada meetodeid, võttes arvesse arenguid teadus- ja tehnikaalaste teadmiste vallas. Kavandatud eesmärkide saavutamiseks enam mitte sobivad meetodid tuleks välja jätta. Proovivõtu sätteid kavatsetakse õigeaegselt ajakohastada, et võtta arvesse viimaseid arenguid sööda tootmise, ladustamise, transportimise ja turustamise vallas, kuid siiski on asjakohane jätta seniks jõusse kehtivad proovivõtu sätted. (3) Direktiivid 71/250/EMÜ, 71/393/EMÜ, 72/199/EMÜ, 73/46/EMÜ, 76/371/EMÜ, 76/372/EMÜ, 78/633/EMÜ, 81/715/EMÜ, 84/425/EMÜ, 86/174/EMÜ, 93/70/EMÜ, 93/117/EÜ, 98/64/EÜ, 1999/27/EÜ, 1999/76/EÜ, 2000/45/EÜ, 2002/70/EÜ ja 2003/126/EÜ tuleks seetõttu kehtetuks tunnistada. (4) Käesoleva määrusega ette nähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega, ning arvestades järgmist: ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:







▼M3

Artikkel 1

Proovide võtmine sööda ametlikuks kontrollimiseks, eriti sööda koostisosade määramiseks, sealhulgas geneetiliselt muundatud organisme (GMO) sisaldavate või neist toodetud koostisosade, Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruses (EÜ) nr 1831/2003 ( 20 ) määratletud söödalisandite ning Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivis 2002/32/EÜ ( 21 ) määratletud soovimatute ainete määramiseks tuleb teha I lisas sätestatud meetoditega.

I lisas sätestatud proovivõtumeetodit kasutatakse sööda kontrollimiseks, et määrata Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruses (EÜ) nr 396/2005 ( 22 ) määratletud pestitsiidijääke ning kontrollida sööda vastavust määrusele (EL) nr 619/2011.

▼B

Artikkel 2

Proovide analüüsiks ettevalmistamine ja tulemuste esitamine toimub kooskõlas II lisas sätestatud meetoditega.

Artikkel 3

Analüüse sööda ametlikuks kontrolliks tehakse vastavalt III lisas (Analüüsimeetodid söödatooraine ja segajõusööda koostise kontrollimiseks), IV lisas (Analüüsimeetodid lubatud söödalisandite taseme kontrollimiseks söödas), V lisas (Analüüsimeetodid soovimatute ainete sisalduse kontrollimiseks söödas) ja VI lisas (Analüüsimeetodid loomse päritoluga komponentide määramiseks sööda ametlikul kontrollimisel) sätestatud meetoditele.

Artikkel 4

Kodulindude segasööda energiasisaldus arvutatakse vastavalt VII lisale.

Artikkel 5

Analüüsimeetodeid selliste VIII lisas sätestatud lisandite ebaseadusliku sisalduse kontrollimiseks, mida ei ole enam lubatud söödas kasutada, kasutatakse kinnituse saamiseks.

Artikkel 6

Direktiivid 71/250/EMÜ, 71/393/EMÜ, 72/199/EMÜ, 73/46/EMÜ, 76/371/EMÜ, 76/372/EMÜ, 78/633/EMÜ, 81/715/EMÜ, 84/425/EMÜ, 86/174/EMÜ, 93/70/EMÜ, 93/117/EÜ, 98/64/EÜ, 1999/27/EÜ, 1999/76/EÜ, 2000/45/EÜ, 2002/70/EÜ ja 2003/126/EÜ tunnistatakse kehtetuks.

Viiteid kehtetuks tunnistatud direktiividele käsitatakse viidetena käesolevale määrusele ja loetakse vastavalt XI lisa vastavustabelitele.

Artikkel 7

Käesolev määrus jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolevat määrust kohaldatakse alates 26. augustist 2009.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.

▼M3









I LISA

PROOVIVÕTUMEETODID

1. EESMÄRK JA REGULEERIMISALA

Sööda ametlikuks kontrolliks ettenähtud proovid võetakse allpool kirjeldatud meetodite kohaselt. Selliselt saadud proove käsitatakse proovipartii esindusliku proovina.

Esindusliku proovi võtmise eesmärk saada partiist väike osa nii, et iga selle osa konkreetne näitaja kujutaks endast partii näitajate keskmist väärtust. Partii eri kohtadest võetakse korduvalt üksikproove. Üksikproovide kokkusegamisega saadakse koondproov, millest võetakse esindusliku jagamise teel esinduslikud lõpp-proovid.

Kui vaatlusel ilmneb, et osa samast söödapartiist on erineva kvaliteediga, eraldatakse sellised osad ja neid käsitletakse kui alampartiisid. Kui söödapartiid ei ole võimalik jagada alampartiideks, tuleb seda käsitada ühe partiina, kuid selle kohta tuleb teha märkus proovivõtuaruandesse.

Kui tehakse kindlaks, et käesoleva määruse sätete kohaselt võetud söödaproov ei vasta ELi nõuetele ja kui tegemist on sama tooteklassi või -liigi söödapartii osaga, siis tuleb eeldada, et kogu selle partii sööt ei vasta nõuetele, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

2. MÕISTED

— Partii : identifitseeritav söödakogus, millel on ühised tunnused näiteks päritolu, sort, pakendi tüüp, pakendaja, kaubasaatja või märgistus; tootmisprotsessi kontekstis on partii toodanguühik, mida toodetakse samas ettevõttes ühesuguseid tootmisparameetreid järgides, või mitu sellist ühikut, kui need on toodetud järjest ja koos ladustatud.

— Proovipartii : partii või identifitseeritav osa partiist või alampartiist.

— Pitseeritud proov : proov, mis on pitseeritud niimoodi, et on välistatud juurdepääs proovile ilma pitserit purustamata või eemaldamata.

— Üksikproov : proovipartii ühest punktist võetud kogus.

— Koondproov : ühe ja sama proovipartii üksikproovidest kogutud proov.

— Vähendatud proov : koondproovi osa, mis on saadud koondproovi esindusliku vähendamise teel.

— Lõpp-proov : vähendatud proovi või homogeenitud koondproovi osa.

— Laboratoorne proov : laboratooriumis kasutamiseks ettenähtud proov (mis on toimetatud laboratooriumi), mis võib olla lõpp-proov, vähendatud proov või koondproov.

3. ÜLDSÄTTED

— Proovivõtupersonal: proove peavad võtma isikud, keda on selleks volitanud pädev asutus.

— Proov tuleb pitseerida niimoodi, et oleks välistatud juurdepääs proovile ilma pitserit purustamata või eemaldamata. Pitser peab olema selgelt identifitseeritav ja hästi nähtav. Teine võimalus on, et pitser pannakse sellisesse anumasse või mahutisse, mille saab sulgeda nii, et seda ei ole võimalik purustamata avada, ja millega välditakse mahuti/anuma korduvat kasutamist.

— Proovi tunnusandmed: proov tuleb kustumatult märgistada ja niimoodi identifitseerida, et see oleks selgelt seostatav proovivõtuaruandega.

— Igast koondproovist tuleb võtta vähemalt kaks lõpp-proovi: vähemalt üks proov kontrollimiseks (täitemenetluseks) ja üks söödakäitlejale (apellatsiooniks). Ühe lõpp-proovi võib võtta võrdlusprooviks. Kui kogu koondproov homogeenitakse, võetakse lõpp-proovid homogeenitud koondproovist, välja arvatud juhul, kui see on vastuolus liikmesriikides söödakäitleja õiguste kohta kehtivate eeskirjadega.

4. SEADMED

4.1. Proovivõtuseadmed peavad olema materjalist, mis ei saasta tooteid, millest proove võetakse. Korduvaks kasutamiseks ettenähtud seadmed peavad olema kergesti puhastatavad, et hoida ära ristsaastumist.

4.2. Soovitatavad seadmed proovide võtmiseks tahkest söödast 4.2.1. Käsitsi proovivõtmine 4.2.1.1. Lamedapõhjaline püstiste servadega kühvel. 4.2.1.2. Proovivõtupuur pika ava või lahtritega. Proovivõtupuuri mõõtmed peavad vastama proovipartii näitajatele (mahuti sügavus, koti mõõtmed jms) ja söödaosakeste suurusele. Kui proovivõtupuur on mitme avaga, et proovi saaks võtta mitmest kohast puurimise teekonnal, peavad avad olema lahtrite kaupa või astmeliste vaheseintega eraldatud. 4.2.2. Mehaaniline proovivõtmine Laaditavast söödast proovide võtmiseks võib kasutada asjakohaseid mehaanilisi proovivõtuseadmeid. Asjakohane tähendab seda, et proove võetakse kogu söödavoo läbilõikest. Suure kiirusega liikuvast söödast võib proove võtta automaatse seadmega. 4.2.3. Jagaja Esinduslikult vähendatud proovide valmistamiseks tuleks võimaluse ja vajaduse korral kasutada seadet, millega jagatakse proov ligikaudu võrdseteks osadeks.

5. ÜKSIKPROOVIDE ARVU NÕUDED

— Punktides 5.1 ja 5.2 üksikproovide arvu kohta kehtestatud nõudeid kohaldatakse selliste kuni 500-tonniste proovipartiide suhtes, millest on võimalik võtta esinduslikke proove. Kirjeldatud proovivõtumenetlus kehtib ka osutatud suurimast proovipartiist suuremate koguste puhul, kui ei järgita järgmises tabelis esitatud suurimat üksikproovide arvu, vaid üksikproovide arv määratakse ruutjuurevalemiga, mis on esitatud menetluse kirjelduse asjaomases kohas (vt punkti 5.3), ning vähima koondproovi suurust suurendatakse võrdeliselt. See ei takista suurte partiide jagamist väiksemateks alampartiideks, nii et igast alampartiist võetakse proove punktides 5.1 ja 5.2 kirjeldatud menetluse kohaselt.

— Proovipartii suurus peab olema selline, et proove oleks võimalik võtta kõikidest proovipartii osadest.

— Väga suurte partiide ja alampartiide korral (> 500 tonni) ja partiide korral, mida transporditakse või ladustatakse nii, et proove ei ole võimalik võtta käesoleva peatüki punktides 5.1 ja 5.2 kirjeldatud viisil, tuleb proove võtta punktis 5.3 kirjeldatud viisil.

— Kui söödakäitleja peab kehtivate õigusaktide kohaselt täitma käesoleva määruse nõudeid seoses kohustusliku seirega, võib ta kalduda kõrvale käesolevas peatükis esitatud koguselistest nõuetest, et võtta arvesse tegevuse iseloomulikke näitajaid, tingimusel et söödakäitleja on pädevale asutusele rahuldavalt tõendanud, et kõnealune proovivõtumenetlus on sama esinduslik, ja kui ta on saanud pädevalt asutuselt sellekohase loa.

— Kui koguselisi nõudeid silmas pidades ei ole võimalik kasutada kirjeldatud proovivõtumeetodit, kuna partii kahjustamise tõttu kaasneksid sellega vastuvõetamatud kaubanduslikud tagajärjed (seoses pakkimisviisiga, veovahendiga, ladustamisviisiga vms), võib erandjuhul kohaldada teistsugust proovivõtumeetodit, kui see on sama esinduslik ning kui kogu menetlust täpselt kirjeldatakse ja dokumenteeritakse.

5.1. Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimiseks võetavate üksikproovide arvu nõuded

5.1.1. Lahtine tahke sööt







Proovipartii suurus Vähim üksikproovide arv ≤ 2,5 tonni 7 > 2,5 tonni √ 20 korda proovipartii suurus tonnides (1), kuid kuni 40 üksikproovi (1) Kui saadud arv on murdarv, ümardatakse see järgmise täisarvuni.

5.1.2. Lahtine vedel sööt







Proovipartii suurus Vähim üksikproovide arv ≤ 2,5 tonni või ≤ 2 500 liitrit 4 (1) > 2,5 tonni või > 2 500 liitrit 7 (1) (1) Kui vedelikku ei saa homogeenida, tuleb võtta rohkem üksikproove.

5.1.3. Pakendatud sööt

Sööt (tahke ja vedel) võib olla pakendatud kottidesse, kanistritesse, mahutitesse jne, millele tabelis viidatakse kui pakkeühikutele. Suurtest pakkeühikutest (≥ 500 kg või liitrit) tuleb võtta proove lahtise sööda kohta kehtivate sätete kohaselt (vt punktid 5.1.1. ja 5.1.2.)







Proovipartii suurus Vähim pakkeühikute arv, millest tuleb võtta (vähemalt) üks üksikproov (1) 1–20 pakkeühikut 1 pakkeühik (2) 21–150 pakkeühikut 3 pakkeühikut (2) 151–400 pakkeühikut 5 pakkeühikut (2) > 400 pakkeühikut ¼ korda √ proovipartii moodustavate pakkeühikute arv (3), kuid kuni 40 pakkeühikut (1) Kui pakkeühiku avamine võib analüüsi tulemust mõjutada (nt riknevad vedelad söödad), loetakse avamata ühik üheks üksikprooviks. (2) Kui pakkeühiku netomass on kuni 1 kg või 1 liiter, loetakse üksikprooviks ühe originaalühiku sisu. (3) Kui saadud arv on murdarv, ümardatakse see täisarvuni.

5.1.4. Söödabriketid ja lakukivid

Proov võetakse vähemalt ühest briketist või kivist 25 pakkeühikust koosneva proovipartii kohta, kuid mitte rohkem kui neljast briketist või kivist.

Kui iga briketi või lakukivi kaal on kuni 1 kg, loetakse üksikprooviks ühe kivi või briketi sisu.

5.1.5. Koresööt







Proovipartii suurus Vähim üksikproovide arv (1) ≤ 5 tonni 5 > 5 tonni √ 5 korda proovipartii mass tonnides (2), kuid kuni 40 üksikproovi (1) Märgitakse, et teatavatel juhtudel (nt silo korral) ei ole võimalik võtta nõutavat arvu üksikproove, ilma et sellega ei tekitataks partiile vastuvõetamatut kahju. Sel juhul võib kasutada muud proovivõtumeetodit ning proovivõtujuhised sellisteks juhtudeks töötatakse välja enne käesoleva määruse jõustumist. (2) Kui saadud arv on murdarv, ümardatakse see täisarvuni.

5.2. Üksikproovide arvu nõuded juhul, kui kontrollitavad koostisosad või ained on söödas tõenäoliselt ebaühtlaselt jaotunud

Kõnealused üksikproovide proovide arvu nõuded kehtivad järgmistel kontrollijuhtudel:

— aflatoksiinide, hariliku tungaltera ning muude mükotoksiinide ja ohtlike botaaniliste lisandite sisaldus söödamaterjalis;

— ristsaastumine, mille on põhjustanud koostisosa, sealhulgas geneetiliselt muundatud materjal, või aine, mis eeldatavasti võib olla söödas ebaühtlaselt jaotunud.

Kui kontrollival asutusel on tugev kahtlus, et selline ebaühtlane jaotumine esineb segasööda koostisosa või aine ristsaastumise korral, võib võtta proove järgmises tabelis esitatud arvul.







Proovipartii suurus Vähim üksikproovide arv < 80 tonni Vt arvulised nõuded punktis 5.1. Üksikproovide arv tuleb korrutada 2,5-ga. ≥ 80 tonni 100

5.3. Proovide arvu nõuded väga suurte partiide üksikproovide korral

Väga suurte proovipartiide korral (proovipartii > 500 tonni) on võetavate üksikproovide arv 40 üksikproovi + √ tonnide arv, kui ained või tooted on ühtlaselt jaotunud kogu söödas, või 100 üksikproovi + √ tonnide arv, kui koostisosad või ained on ebaühtlaselt jaotunud kogu söödamaterjalis.

6. KOONDPROOVI KOGUSELISED NÕUDED







Nõutav on üks koondproov proovipartii kohta. Sööda liik Koondproovi vähim kogus (1) (2) 6.1. Lahtine sööt 4 kg; 6.2. Pakendatud sööt: 4 kg (3) 6.3. Vedel või poolvedel sööt: 4 liitrit 6.4. Söödabriketid või lakukivid: 6.4.1. igaüks kaaluga üle 1 kg 4 kg 6.4.2. igaüks kaaluga kuni 1 kg Nelja originaalbriketi või -kivi kaal 6.5. Koresööt/kuivsööt 4 kg (4) (1) Kui sööt, millest võetakse proove, on väga väärtuslik, võib võtta väiksema arvu koondproove, tingimusel, et see on proovivõtuaruandes kirjeldatud ja dokumenteeritud. (2) Vastavalt komisjoni 24. juuni 2011. aasta määrusele (EL) nr 619/2011, milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks sätetele seoses sellise geneetiliselt muundatud materjali olemasoluga, mille loa taotlemine on menetlemisel või mille luba on aegunud (ELT L 166, 25.6.2011, lk 9), peab geneetiliselt muundatud materjali leidumise kontrollimise koondproovis sisalduma vähemalt 35 000 seemet/tera. Seega peab maisi puhul olema koondproov vähemalt 10,5 kg ja sojaoa puhul 7 kg. Teiste seemnete ja terade puhul, nagu oder, hirss, kaer, riis, nisu ja raps, on koondproov 4 kg ja sisaldab rohkem kui 35 000 seemet. (3) Pakendatud sööda puhul, sõltuvalt pakkeühikute suurusest, ei tarvitse olla võimalik saada 4 kg suurust koondproovi. (4) Kerge koresööda (nt hein, põhk) puhul ei tohi koondproov olla väiksem kui 1 kg.

7. LÕPP-PROOVI KOGUSELISED NÕUDED

Lõpp-proovid

Analüüsida tuleb vähemalt üht lõpp-proovi. Analüüsitavas lõpp-proovis sisalduv kogus ei tohi olla väiksem järgmistest näitajatest:







Tahke sööt 500 g (1) (2) (3) Vedel või poolvedel sööt 500 ml (1) (1) Vastavalt määrusele (EL) nr 619/2011 peab geneetiliselt muundatud materjali olemasolu kontrollimiseks võetav lõpp-proov sisaldama vähemalt 10 000 seemet/tera. Seega peab maisi puhul olema lõpp-proov vähemalt 3 000 g ja sojaoa puhul 2 000 g. Teiste seemnete ja terade puhul, nagu oder, hirss, kaer, riis, nisu ja raps, sisaldab 500 g lõpp-proov rohkem kui 10 000 seemet. (2) Kui koondproov on märksa väiksem kui 4 kg või liitrit (vt punkti 6 allmärkus), võib võtta ka väiksema lõpp-proovi, tingimusel, et seda kirjeldatakse ja see dokumenteeritakse proovivõtuaruandes. (3) Pestitsiidijääkide määramiseks kaunviljas, teraviljas ja pähklipuu viljades peab lõpp-proovi miinimumkogus olema komisjoni direktiivi 2002/63/EÜ (ELT L 187, 16.7.2002, lk 30) sätete kohaselt 1 kg.

8. PROOVIVÕTUMEETOD VÄGA SUURTE PARTIIDE JAOKS JA SELLISTE PARTIIDE JAOKS, MIDA LADUSTATAKSE VÕI TRANSPODITAKSE NII, ET KOGU PARTII ULATUSES EI OLE VÕIMALIK PROOVE VÕTTA

8.1. Üldpõhimõtted

Kui partii ladustamine või transportimine ei võimalda võtta üksikproove kogu partiist, tuleks eelistatult võtta sellisest partiist proove laadimise ajal.

Suurtesse sööda hoidmiseks ettenähtud ladudesse tuleks soovitada söödakäitlejatel paigaldada (automaatsed) proovivõtuseadmed, millega on võimalik võtta proove kogu ladustatud partiist.

Kui proove võetakse 8. peatükis sätestatud viisil, tuleb söödakäitlejat või tema esindajat teavitada proovivõtumenetlusest. Kui söödakäitleja või tema esindaja seab kahtluse alla kõnealuse proovivõtumeetodi, peab söödakäitleja või tema esindaja lubama pädeval asutusel võtta proove kogu partiist ja katma kulud.

8.2. Laevaga transporditavad suured partiid

8.2.1. Laevaga transporditavast partiist liikuvast tootest proovide võtmine

Suurtest partiidest, mida transporditakse laevaga, võetakse eelistatult proove laadimise ajal (kui toode on liikuv).

Proove võetakse igast lastiruumiosast (osast, mida on võimalik füüsiliselt eraldada) Kuna lastiruumi osi tühjendatakse eraldi, kaob lattu laadimise käigus osade füüsiline eraldatus. Proove võib võtta kas algse füüsilise eraldatuse olukorras või pärast lattu viimist.

Laeva lossimine võib kesta mitu päeva. Proove tuleks tavaliselt võtta korrapäraste ajavahemike järel kogu lossimise ajal. Alati ei ole aga mõistlik ega asjakohane, et ametlik inspektor on proovivõtuks kohal kogu lossimise ajal. Seepärast on lubatud proove võtta kogu partii ühest osast (proovipartiist). Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele.

Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu selle partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

Ka siis, kui ametlikud proovid võetakse automaatselt, on inspektori kohalolek vajalik. Kui proovid võetakse automaatselt ja vastavalt eelnevalt kindlaks määratud näitajatele, mida ei saa muuta proovide võtmise ajal, ning kui üksikproovid kogutakse pitseeritavasse anumasse, nii et sedasi hoitakse ära igasugused pettused, peab inspektor olema kohal ainult proovivõtu alguses, iga kord, kui proovianumat vahetatakse, ja proovivõtu lõpus.

8.2.2. Laevaga transporditavast partiist liikumatust tootest proovide võtmine

Kui proove võetakse liikumatust tootest, tuleb kasutada sama menetlust, mis on ette nähtud ülalt ligipääsetavatest ladudest (sööda tornhoidlatest) proovide võtmiseks (vt punkti 8.4.1).

Proove tuleb võtta partii (lastiruumi) ligipääsetavast osast (ülalt). Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.3. Proovide võtmine laos hoitavast suurest partiist

Proove tuleb võtta partii ligipääsetavast osast. Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.4. Proovide võtmine hoidlatest (sööda tornhoidlatest)

8.4.1. Proovide võtmine ülalt (kergesti) ligipääsetavatest mahutitest

Proove tuleb võtta partii ligipääsetavast osast. Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.4.2. Proovide võtmine hoidlatest, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid)

8.4.2.1. Hoidlad, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid), mahuga > 100 tonni

Sellistest mahutitest ei ole võimalik paigalseisvast söödast proove võtta. Kui on vaja proove võtta mahutis olevast söödast, mida ei saa liigutada, tuleb käitlejaga kokku leppida, et ta teatab, kui mahutist hakatakse sööta välja laadima, et siis söödast proove võtta.

8.4.2.2. Hoidlad, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid), mahuga < 100 tonni

Proovivõtuks tuleb anumasse võtta 50–100 kg toodet ja proove tuleb võtta sellest kogusest. Koondproovi suurus sõltub kogu partii suurusest ning üksikproovide arv sõltub proovivõtuks anumasse võetud toote kogusest. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.5. Proovide võtmine suurtes suletud mahutites olevast lahtisest söödast

Sellistest partiidest saab sageli proove võtta alles siis, kui toode on välja laaditud. Mõnikord ei ole võimalik toodet välja laadida impordi- või kontrollipunktis ja proove tuleb võtta väljalaadimiskohas.

9. PROOVIDE VÕTMISE, ETTEVALMISTAMISE JA PAKENDAMISE JUHISED

9.1. Üldkirjeldus

Proovid tuleb võtta ja ette valmistada liigse viivituseta ning võtta toote muutumise ja saastumise vältimiseks vajalikud ettevaatusabinõud. Töövahendid ja -pinnad ning proovide hoidmiseks ettenähtud anumad peavad olema puhtad ja kuivad.

9.2. Üksikproovid

Üksikproove võetakse pisteliselt kogu proovipartii ulatuses ja need peavad olema ligikaudu võrdse suurusega.

Üksikproov peab olema vähemalt 100 g või kerge koresööda puhul 25 g.

Kui punktis 8 sätestatud proovivõtueeskirjade kohaselt tuleb võtta vähem kui 40 üksikproovi, määratakse üksikproovi suurus vastavalt nõutava koondproovi suurusele (vt punkti 6).

Kui proove võetakse väikestest pakendatud sööda partiidest, mille puhul on vaja võtta väike arv üksikproove, peab üksikproov olema ühe originaalpakkeühiku sisu, kui pakkeühik ei ole suurem kui 1 kg või 1 l.

Kui söödapakendid on väikesed (nt < 250 g), sõltub üksikproovi suurus pakendi suurusest.

9.2.1. Lahtine sööt

Vajaduse korral võib proove võtta partii liikumise (peale- või mahalaadimise) ajal.

9.2.2. Pakendatud sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv pakendeid välja valitud, võetakse puuri või kühvli abil osa iga pakendi sisust. Vajaduse korral võetakse proovid pärast seda, kui pakendid on ükshaaval tühjendatud.

9.2.3. Homogeenne või homogeenitav vedel või poolvedel sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on punkti 5. peatüki kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, homogeenitakse vajaduse korral nende sisu ja võetakse vajalik kogus igast mahutist.

Üksikproove võib võtta mahutite tühjendamise ajal.

9.2.4. Mittehomogeenitav vedel või poolvedel sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, võetakse proovid eri tasemetelt.

Proove võib võtta ka mahutite tühjendamise ajal, kuid mitte esimestest kihtidest.

Mõlemal juhul peab võetav kogus olema vähemalt 10 liitrit.

9.2.5. Söödabriketid ja lakukivid

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv brikette või kive välja valitud, võetakse osa igast briketist või kivist. Kui on kahtlusi, et kivi või brikett ei ole ühtlase koostisega, võetakse prooviks kogu brikett või kivi.

Kui iga briketi või lakukivi kaal on kuni 1 kg, loetakse üksikprooviks ühe kivi või briketi sisu.

9.3. Koondproovide ettevalmistamine

Ühtne koondproov saadakse üksikproovide kokkusegamise abil.

9.4. Lõpp-proovide ettevalmistamine

Koondproovi materjal segatakse hoolega ( 23 ).

— Iga proov pannakse sobivasse mahutisse/anumasse. Tuleb võtta kõik vajalikud ettevaatusabinõud, et vältida muutusi proovi koostises, saastumist või võltsimist, mis võivad tekkida transportimise või ladustamise ajal.

— Kui kontrollitakse sööta, milles koostisosad või ained on ühtlaselt jaotunud, võib koguda esindusliku vähendatud koondproovi, mille suurus on vähemalt 2,0 kg või 2,0 l (vähendatud proov), ( 24 ) kasutades eelistatult mehaanilist või automaatset jagajat. Et kontrollida pestitsiidide jääke kaunviljades, teravilja terades ja pähklipuu viljades, peab vähendatud proovi suurus olema vähemalt 3 kg. Kui sööda olemus ei võimalda kasutada jagajat või kui jagajat ei ole, tuleb proovi vähendada kvarteerimismeetodil. Vähendatud proovidest valmistatakse enam-vähem ühesuurused ja 7. peatüki koguselistele nõuetele vastavad lõpp-proovid (kontrollproov, apellatsiooniproov ja võrdlusproov). Kui kontrollitakse koostisosi, sealhulgas geneetiliselt muundatud materjali, või aineid, mis võivad tõenäoliselt olla ebaühtlaselt jaotunud söödamaterjalis, peab koondproov olema: — — täiesti homogeenitud ja seejärel lõpp-proovideks jagatud või — vähendatud suuruseni vähemalt 2 kg või 2 l ( 25 ) mehaanilise või automaatse jagajaga; kui sööda olemuse tõttu ei ole võimalik jagajat kasutada, võib proovi vähendada ka kvarteerimismeetodil. Et kindlaks teha geneetiliselt muundatud materjali olemasolu vastavalt määrusele (EL) nr 619/2011, peab vähendatud proovis olema vähemalt 35 000 seemet/terist, et sellest saaks vähemalt 10 000 seemet sisaldava kontrollproovi, apellatsiooniproovi ja võrdlusproovi (vt 6. peatüki allmärkus (**) ja 7. peatüki allmärkus (*)).

9.5. Proovi pakendamine

Mahutid ja pakendid peavad olema pitseeritud niimoodi, et ilma pitserit lõhkumata ei oleks võimalik neid avada. Pitser peab hõlmama kogu märgist.

9.6. Proovide saatmine laboratooriumi

Proov koos analüüsiks vajaliku teabega tuleb viivitamata saata kindlaksmääratud laboratooriumi analüüsimiseks.

10. PROOVIVÕTUARUANNE

Iga proovivõtu kohta tuleb teha aruanne, mis võimaldab iga proovipartiid ja selle suurust üheselt kindlaks teha.

Aruandesse tuleb kanda ka kõik kõrvalekalded käesolevas määruses sätestatud proovivõtumenetlusest.

Aruanne tuleb teha kättesaadavaks nii ametlikule kontrollilaboratooriumile kui ka söödakäitlejale ja/või söödakäitleja määratud laboratooriumile.









II LISA

SÖÖDA ANALÜÜSIMEETODITE ÜLDSÄTTED

A. PROOVIDE ETTEVALMISTAMINE ANALÜÜSIKS

1. Eesmärk

Allpool kirjeldatud menetlused on ette nähtud kontrollilaboratooriumidesse saadetud proovide ettevalmistamiseks analüüsiks pärast proovi võtmist I lisa sätete kohaselt.

Laboratoorsed proovid tuleb ette valmistada nii, et analüüsimeetodites sätestatud viisil kaalutud kogused oleksid ühtlased ja esindaksid lõpp-proove.

2. Ettevaatusabinõud

Proovide ettevalmistamine sõltub kasutatavatest analüüsimeetoditest ning koostisosadest ja ainetest, mida on vaja uurida. Seepärast on väga oluline tagada, et proov valmistataks ette vastavalt kasutatavale analüüsimeetodile ning koostisosadele ja ainetele, mida on vaja uurida.

Kõik vajalikud toimingud tuleb teha nii, et vältida proovi saastumist ja selle koostise muutumist.

Jahvatada, segada ja sõeluda tuleb viivitamata, et proovi kokkupuude õhu ja valgusega oleks minimaalne. Kasutada ei tohi veskeid ega jahvatajaid, mis proovi märgatavalt kuumendavad.

Kuumuse suhtes eriti tundlikku sööta soovitatakse jahvatada käsitsi. Samuti tuleb tagada, et seadmed ise ei oleks saastumisallikaks.

Kui proovi ei ole võimalik ette valmistada nii, et selle niiskusesisalduses oluliselt ei muutu, määratakse niiskusesisaldus enne ja pärast ettevalmistamist III lisa A osas sätestatud meetodil.

3. Menetlus

3.1. Üldmenetlus

Uuritav kogus võetakse lõpp-proovist. Jagamiseks ei soovitata koonusekujulist proovijagajat ega nn jagamisristi, s o neljaks jagamise (kvarteerimise) meetodit, sest sellega võib kaasneda alamproovide jaotuses suur viga.

3.1.1. Sööt, mida saab kohe jahvatada

— Sõelutud lõpp-proov segatakse ja kogutakse sobivasse puhtasse ja kuiva õhukindlalt suletavasse nõusse. Täielikuks homogeenimiseks tuleb proovi vahetult enne analüüsikoguse väljakaalumist veel kord segada (uuritav kaalutis).

3.1.2. Sööt, mida saab jahvatada pärast kuivatamist

— Kui analüüsimeetodites ei ole teisiti ette nähtud, tuleb lõpp-proovi kuivatada vastavalt III lisa A osas nimetatud niiskusmääramismeetodi punktis 4.3 kirjeldatud eelkuivatamisele niiskusesisalduseni 8–12 %. Jätkatakse punktis 3.1.1 kirjeldatud viisil.

3.1.3. Vedel või poolvedel sööt

— Lõpp-proov kogutakse sobivasse puhtasse ja kuiva õhukindlalt suletavasse nõusse. Täielikuks homogeenimiseks tuleb proovi vahetult enne analüüsikoguse väljakaalumist põhjalikult segada (uuritav kaalutis).

3.1.4. Muu sööt

— Selliseid lõpp-proove, mida ei saa ette valmistada mõnel eespool nimetatud viisil, tuleb töödelda mis tahes muul viisil, mis tagab, et analüüsiks kaalutud kogused (uuritav kaalutis) on homogeensed ja esindavad lõpp-proove.

3.2. Erimenetlus uurimiseks vaatluse teel või mikroskoobiga või juhul, kui kogu koondproov on homogeenitud

— Vaatluse teel (kui ei kasutata mikroskoopi) uuritakse kogu laboratoorset proovi.

— Mikroskoobiga uurimiseks võib laboratoorium vähendada koondproovi või vähendatud proovi. Lõpp-proovid apellatsiooniks ja vajaduse korral võrdluseks võetakse sama menetlusega kui lõpp-proov kontrollimiseks.

— Kui homogeenitakse kogu koondproov, võetakse lõpp-proovid homogeenitud koondproovist.

4. Proovide hoidmine

Proove tuleb hoida temperatuuril, mis ei muuda nende koostist. Vitamiinide või eriti valgustundlike ainete analüüsiks ettenähtud proove tuleb hoida nii, et valgus proove ei kahjustaks.

B. SÄTTED ANALÜÜSIMEETODITES KASUTATAVATE REAKTIIVIDE JA SEADMETE KOHTA

1. Kui analüüsimeetodites ei ole teisiti sätestatud, peavad kõik analüütilised reaktiivid olema analüütilise puhtusega (a.p.). Mikroelementide määramisel tuleb reaktiivide puhtust kontrollida pimekatsega. Sõltuvalt saadud tulemustest võib olla vaja reaktiive täiendavalt puhastada.

2. Iga lahuste valmistamise, lahjendamise, loputamise või pesemise toiming, mida on analüüsimeetodites nimetatud ilma kasutatava lahusti või lahjendi laadile viitamata, eeldab vee kasutamist. Üldjuhul peab vesi olema demineraliseeritud või destilleeritud. Teatavatel juhtudel, millele analüüsimeetodites viidatakse, tuleb veega teha erilised puhastusprotseduurid.

3. Kontrollilaboratooriumides tavaliselt leiduvaid seadmeid silmas pidades viidatakse analüüsimeetodites ainult nendele instrumentidele ja vahenditele, mis on erilised või nõuavad erilist kasutamisviisi. Seadmed peavad olema puhtad, eriti väga väikeste ainekoguste määramisel.

C. ANALÜÜSIMEETODITE KASUTAMINE JA TULEMUSTE ESITAMINE

1. Ekstraktsioonimenetlus

Mitmete meetodite puhul on määratud eraldi ekstraktsioonimenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi ekstraktsioonimenetlusi kasutada juhul, kui on tõendatud, et kasutatav ekstraktsioonimenetlus on põhiaine analüüsiks sama tõhus kui meetodis nimetatud menetlus.

2. Puhastusmenetlus

Mitme meetodi puhul on määratud eraldi puhastusmenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi puhastusmenetlusi kasutada juhul, kui on tõendatud, et kasutatav puhastusmenetlus annab uuritava aine analüüsimisel meetodis nimetatud menetlusega samaväärsed analüüsitulemused.

3. Määramiste arv

Kui soovimatute ainete analüüsimisel on esimese määramise tulemus oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitavas tootekirjelduses, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi. Muudel juhtudel on vajalik kordusanalüüs (teistkordne määramine), et välistada sisemise ristsaastumise ja juhusliku proovide segunemise võimalust. Mõõtemääramatust arvesse võttes kasutatakse nõuetele vastavuse hindamisel kahe analüüsi keskmist.

Kui aine või koostisosa deklareeritud sisalduse kontrollimisel kinnitab esimese määramise tulemus deklareeritud sisaldust, st analüüsitulemus jääb deklareeritud sisalduse lubatud kõrvalekalde piiresse, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi. Muudel juhtudel on vajalik kordusanalüüs (teistkordne määramine), et välistada sisemise ristsaastumise ja juhusliku proovide segunemise võimalust. Mõõtemääramatust arvesse võttes kasutatakse nõuetele vastavuse hindamisel kahe analüüsi keskmist.

Teatavatel juhtudel on lubatud kõrvalekalde vahemik kindlaks määratud õigusaktis, näiteks Euroopa Parlamendi ja nõukogu 13. juuli 2009. aasta määruses (EÜ) nr 767/2009 sööda turuleviimise ja kasutamise kohta, millega muudetakse Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrust (EÜ) nr 1831/2003 ning tunnistatakse kehtetuks nõukogu direktiivid 79/373/EMÜ, 82/471/EMÜ, 83/228/EMÜ, 93/74/EMÜ, 93/113/EÜ ja 96/25/EÜ, komisjoni direktiiv 80/511/EMÜ ning komisjoni otsus 2004/217/EÜ ( 26 ).

4. Kasutatavast analüüsimeetodist teatamine

Analüüsiaruandes peab olema nimetatud, millist analüüsimeetodit kasutatakse.

5. Aruandlus analüüsitulemuste kohta

Analüüsitulemused esitatakse analüüsimeetodis kehtestatud viisil sobiva arvu tüvenumbritega ja vajaduse korral parandatakse seda vastavalt lõpp-proovi niiskusesisaldusele enne ettevalmistamist.

6. Mõõtemääramatus ja saagis soovimatute ainete analüüsil

Silmas pidades Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivi 2002/32/EÜ tähenduses soovimatuid aineid, loetakse söödaks ettenähtud tooted kehtestatud piirnormile mittevastavaks, kui niiskusesisaldusele 12 % vastav analüüsitulemus ületab piirmäära, võttes arvesse laiendmääramatust ja saagise parandit. Vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud ja saagise parandiga parandatud sisaldust, millest on lahutatud laiendmääramatus. Seda menetlust võib kasutada vaid juhul, kui analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagise parandit (nt ei ole see võimalik mikroskoopilise analüüsi puhul).

Analüüsitulemus esitatakse järgmiselt (kuivõrd kasutatud analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagist):

a) saagisega parandatult, saagis peab olema märgitud. Saagise parandit ei ole vaja, kui saagis on 90–110 %;

b) kujul „x ± U”, kus x on analüüsitulemus ja U on laiendmääramatus, kui kasutatakse kattetegurit 2, millele vastab usaldusväärsuse tase 95 %.

Kui analüüsi tulemus on oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitava näitaja väärtus ja kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi ning analüüsi eesmärk on vaid kontrollida vastavust õigusnormidele, ei ole analüüsitulemuses vaja esitada saagise parandit ning saagise ja mõõtemääramatuse võib sel juhul ära jätta.

▼B









III LISA

SÖÖDATOORAINE JA SEGAJÕUSÖÖDA KOOSTISE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A. NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata sööda niiskusesisaldust. Lenduvaid aineid, näiteks orgaanilisi happeid sisaldava sööda puhul tuleb jälgida, et koos niiskusesisaldusega määrataks ka oluline osa lenduvatest ainetest.

See ei hõlma piimatoodete kui söödatooraine analüüsi, mineraalainete ja peamiselt mineraalainetest koosnevate segude analüüsi, loomsete ja taimsete rasvade ja õlide analüüsi ega õliseemnete ja õliviljade analüüsi.

2. Põhimõte

Proov kuivatatakse kindlaksmääratud tingimustel, mis varieeruvad sõltuvalt sööda laadist. Massikadu määratakse kaalumise teel. Suure niiskusesisaldusega tahket sööta tuleb eelnevalt kuivatada.

3. Seadmed

3.1. Niiskust mitteneelavast materjalist purusti, mis vastab punktides 4.1.1 ja 4.1.2 sätestatud nõuetele, mida on lihtne puhastada ning millega on võimalik kiiresti ja ühtlaselt purustada nii, et ei tekiks märgatavat kuumenemist ja et proov puutuks võimalikult vähe kokku väliskeskkonnaga (nt vasarpurustaja või vesijahutusega mikropurustaja, kokkupandav koonusveski, aeglustatud liikumisega purustaja või hammasratastega purustaja).

3.2. Analüütilised kaalud täpsusega 1 mg.

3.3. Õhukindlalt suletavad roostevabast metallist või klaasist kuivad anumad põhjaga, millele saab analüüsitavat proovi laotada tihedusega 0,3 g/cm2.

3.4. Reguleeritava temperatuuriga (± 2 oC) elektriline kuivatuskapp, mis on nõuetekohaselt ventileeritav ja võimaldab temperatuuri kiiresti reguleerida ( 27 ).

3.5. Reguleeritava temperatuuriga elektriline vaakumkuivatuskapp, mis on varustatud õlipumbaga ning kuhu saab juhtida kuuma ja kuiva õhku või kuhu pannakse kuivatusainet (nt kaltsiumoksiidi).

3.6. Eksikaator, millel on paks avadega metall- või portselanalus ning mis sisaldab tõhusat kuivatusainet.

4. Töö käik

NB ! Käesolevas punktis kirjeldatud toimingud tuleb teha kohe pärast proovi sisaldavate pakendite avamist. Tuleb teha vähemalt kaks analüüsi.

4.1. Ettevalmistus

4.1.1. Muu sööt kui punktides 4.1.2 ja 4.1.3 nimetatud sööt

Võetakse vähemalt 50 g proovi. Vajaduse korral proov purustatakse või tehakse tükkideks, et vältida niiskusesisalduse kõikumist (vt punkt 6).

4.1.2. Teravili ja tangud

Võetakse vähemalt 50 g proovi. Proov jahvatatakse osakesteks, millest vähemalt 50 % pudeneb läbi sõela, mille avade suurus on 0,5 mm, ja sõelale, mille ümmarguste avade suurus on 1 mm, ei jää rohkem kui 10 %.

4.1.3. Vedel või pastataoline sööt, peamiselt õlidest ja rasvadest koosnev sööt

Võetakse umbes 25 g proovi, kaalutakse see 10 mg täpsusega, lisatakse vajalik kogus 10 mg täpsusega kaalutud veevaba liiva ja segatakse kuni ühtlase toote saamiseni.

4.2. Kuivatamine

4.2.1. Muu sööt kui punktides 4.2.2 ja 4.2.3 nimetatud sööt

Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 1 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 103 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada neli tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 103 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega.

Peamiselt õlidest ja rasvadest koosneva sööda puhul kuivatatakse proovi kuivatuskapis temperatuuril 130 oC täiendavalt 30 minutit. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust.

4.2.2. Teravili, jahu, tangud ja manna

Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g peenestatud proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 130 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada kaks tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 130 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega.

4.2.3. Segajõusööt, mis sisaldab üle 4 % sahharoosi või laktoosi: söödatooraine, nt jaanikaunad, hüdrolüüsitud teraviljasaadused, linnaseseemned, kuivatatud peediliistakud, kalast ja suhkrust valmistatud lahustuvsööt; segajõusööt, mis sisaldab rohkem kui 25 % mineraalsooli, sh kristallisatsioonivesi. Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 80–85 oC kuumutatud vaakumkuivatuskappi (3.5). Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Rõhk tõstetakse 100 torrini ja proovil lastakse sellise rõhu all kas kuuma ja kuiva õhu voolus või kuivatusaine juuresolekul (umbes 300 g 20 proovi kohta) umbes neli tundi kuivada. Kui kasutatakse kuivatusainet, ühendatakse vaakumpump pärast ettenähtud rõhu saavutamist lahti. Kuivamisaega arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 80–85 oC. Ettevaatlikult taastatakse kuivatuskapis atmosfäärirõhk. Kuivatuskapp avatakse, kaas asetatakse kohe anumale, anum võetakse kapist välja, lastakse jahtuda eksikaatoris (3.6) 30–45 minutit ja kaalutakse 1 mg täpsusega. Kuivatatakse veel 30 minutit vaakumkuivatuskapis temperatuuril 80–85 oC ning kaalutakse uuesti. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust.

4.3. Eelkuivatamine

4.3.1. Muu sööt kui punktis 4.3.2 nimetatud sööt

Tahket sööta, mille purustamist suur niiskusesisaldus raskendab, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada:

50 g purustamata proovi (pressitud või aglomeeritud sööda võib vajaduse korral tükkideks teha) kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5 cm serv). Lastakse kuivatuskapis temperatuuril 60–70 oC kuivada, kuni niiskusesisaldus on 8–12 %. Anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis üks tund ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Purustatakse viivitamata punkti 4.1.1 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.1 või 4.2.3 kohaselt vastavalt sööda laadile.

4.3.2. Teravili

Terasid, mille niiskusesisaldus on üle 17 %, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada:

50 g jahvatamata teri kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5 cm serv). Lastakse 5–7 minutit kuivatuskapis temperatuuril 130 oC kuivada. Võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis kaks tundi ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Jahvatatakse viivitamata punkti 4.1.2 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.2 kohaselt.

5. Tulemuste arvutamine

Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmiste valemite abil.

5.1. Kuivatamine ilma eelkuivatamiseta

kus:

m = analüüsitava proovi esialgne mass grammides,

m0 = kuiva analüüsitava proovi mass grammides.

5.2. Kuivatamine koos eelkuivatamisega

kus:

m = analüüsitava proovi esialgne mass grammides,

m1 = analüüsitava proovi mass grammides pärast eelkuivatamist,

m2 = analüüsitava proovi mass grammides pärast purustamist või jahvatamist,

m0 = kuiva analüüsitava proovi mass grammides.

5.3. Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2 % niiskuse absoluutväärtusest.

6. Tähelepanek

Kui purustamine osutub vajalikuks ja kui sellega muutub toote niiskusesisaldus, tuleb sööda koostisosade analüüside tulemusi korrigeerida esialgsel kujul proovi niiskusesisalduse põhjal.

B. LOOMSETE JA TAIMSETE RASVADE JA ÕLIDE NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata loomsete ja taimsete rasvade ja õlide veesisaldust ja lenduvate ainete sisaldust.

2. Põhimõte

Proov kuivatatakse temperatuuril 103 oC püsimassini (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle). Massikadu määratakse kaalumise teel.

3. Seadmed

3.1. Korrosioonikindlast materjalist lamedapõhjaline anum, mille diameeter on 8–9 cm ja kõrgus umbes 3 cm.

3.2. Tugevdatud kolviga termomeeter, mille ülaosas on paisumistoru, mis on gradueeritud vahemikus umbes 80 oC kuni vähemalt 110 oC ja mis on umbes 10 cm pikkune.

3.3. Liivavann või elektriline kuumutusplaat.

3.4. Tõhusat kuivatusainet sisaldav eksikaator.

3.5. Analüütilised kaalud.

4. Töö käik

1 mg täpsusega kaalutud umbes 20 g homogeenitud proovi pannakse kuiva kaalutud anumasse (3.1), milles on termomeeter (3.2). Kuumutatakse liivavannil või kuumutusplaadil (3.3) termomeetriga pidevalt segades, nii et temperatuur tõuseb umbes 7 minutiga 90 oC-ni.

Kuumust vähendatakse, jälgides anuma põhjast kerkivate mullide sagedust. Temperatuur ei tohi tõusta üle 105 oC. Segamist jätkatakse anuma põhja kaapides, kuni mullide tekkimine lõpeb.

Niiskuse täielikuks kõrvaldamiseks kuumutatakse proovi mitu korda temperatuurini 103 ± 2 oC, jahutades kuumutamiste vahel proovi temperatuurini 93 oC. Lastakse jahtuda eksikaatoris (3.4) toatemperatuurini ja kaalutakse. Protseduuri korratakse, kuni massikadu kahel järjestikusel kaalumisel ei ole üle 2 mg.

NB ! Proovi massi suurenemine pärast korduvat kuumutamist viitab rasva oksüdeerumisele, sel juhul arvutatakse tulemus enne massi suurenemist tehtud kaalumisel.

5. Tulemuste arvutamine

Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

kus:

m = analüüsitava proovi mass grammides;

m1 = anuma ja selle sisu mass grammides enne kuumutamist;

m2 = anuma ja selle sisu mass grammides pärast kuumutamist.

Tulemused, mis on väiksemad kui 0,05 %, tuleb registreerida kujul „alla 0,05 %”.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahel paralleelsel määramisel saadud niiskusesisalduste erinevus ei tohi ületada absoluutväärtuses 0,05 %.

C. TOORVALGUSISALDUSE MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab määrata toorvalgusisaldust söödas lämmastikusisalduse alusel, mis määratakse Kjeldahli meetodiga.

2. Põhimõte

Proov lagundatakse väävelhappega katalüsaatori manulusel. Happelahus leelistatakse naatriumhüdroksiidi lahusega. Ammoniaak destilleeritakse ja kogutakse mõõdetud väävelhappekogusesse, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi standardlahusega.

Teise võimalusena destilleeritakse vabanenud ammoniaak boorhappe lahuse ülejääki, millele järgneb tiitrimine soolhappe või väävelhappe lahusega.

3. Reaktiivid

3.1. Kaaliumsulfaat.

3.2. Katalüsaator: vask(II)oksiid CuO või vask(II)sulfaatpentahüdraat CuSO4 5H2O.

3.3. Granuleeritud tsink.

3.4. Väävelhape, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Väävelhape, standardne tiitrimislahus, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Metüülpunane indikaator: 300 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml etanoolis, σ = 95–96 % (v/v).

3.9. Naatriumhüdroksiidi lahus (võib kasutada tehnilise puhtusega reaktiivi) β = 40 g / 100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Naatriumhüdroksiid, standardne tiitrimislahus, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Naatriumhüdroksiid, standardne tiitrimislahus, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Soolhappes pestud ja läbikuumutatud pimsskivigraanulid.

3.13. Atseetaniliid (sulamistemperatuur = 114 oC; N = 10,36 %).

3.14. Sahharoos (lämmastikuvaba).

3.15. Boorhape (H3BO3).

3.16. Metüülpunase indikaatorlahus: 100 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml etanoolis või metanoolis.

3.17. Bromokresoolrohelise lahus: 100 mg bromokresoolrohelist lahustatakse 100 ml etanoolis või metanoolis.

3.18. Boorhappe lahus (10 g/l kuni 40 g/l olenevalt kasutatavatest vahenditest). Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, tuleb metüülpunase ja bromokresoolrohelise indikaatorid lisada boorhappe lahustesse. Kui 1 liiter boorhappe lahust on ette valmistatud, tuleb enne vajaliku mahuni korrigeerimist lisada 7 ml metüülpunase indikaatorlahust (3.16) ja 10 ml bromokresoolrohelise lahust (3.17). Olenevalt sellest, millist vett kasutatakse, võib boorhappe lahuse pH-tase olla eri partiides erinev. Sageli on positiivse tulemuse saamiseks vaja korrigeerida väikse leelisekogusega. MÄRKUS : umbes 3–4 ml NaOH (3.11) lisamine 1 liitrisse 10 g/l boorhappesse annab tavaliselt häid tulemusi. Lahust tuleb hoida toatemperatuuril ja kaitsta valguse ning ammoniaagiaurude eest.

3.19. Soolhape, standardne tiitrimislahus c(HCl) = 0,10 mol/l. MÄRKUS : kasutada võib ka teisi tiitrimislahuste (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, ja 3.19) kontsentratsioone, kui arvutustes tehakse vastavad parandused. Kontsentratsioonid tuleb alati esitada nelja kümnendkoha täpsusega.

4. Seadmed

Seadmed, mis sobivad Kjeldahli meetodis ettenähtud lagundamise, destilleerimise ja tiitrimise läbiviimiseks.

5. Töö käik

5.1. Lagundamine

1 g proovi kaalutakse 0,001 g täpsusega ja pannakse see mineraliseerimisaparaadi kolbi. Lisatakse 15 g kaaliumsulfaati (3.1), sobiv kogus katalüsaatorit (3.2) (0,3–0,4 g vask(II)oksiidi või 0,9–1,2 g vask(II)sulfaadi pentahüdraati), 25 ml väävelhapet (3.4) ja vajadusel mõned pimsskivigraanulid (3.12) ning segatakse.

Kolbi kuumutatakse esialgu mõõdukalt, aeg-ajalt loksutades, kuni mass on söestunud ja vaht kadunud; seejärel kuumutatakse intensiivsemalt vedeliku püsiva keemiseni. Kuumutamine on küllaldane, kui keev hape kondenseerub kolvi seinale. Tuleb vältida seinte liigset kuumutamist ja orgaanilise aine kleepumist seintele.

Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkatakse keetmist veel kahe tunni jooksul, seejärel jahutatakse.

5.2. Destilleerimine

Lisatakse ettevaatlikult piisav kogus vett, et tagada sulfaatide täielik lahustumine. Lastakse jahtuda ja seejärel lisatakse vajadusel mõned graanulid tsinki (3.3). Edasi toimida vastavalt punktile 5.2.1 või 5.2.2.

5.2.1. Destilleerimine väävelhappeks

Destilleerimisaparaadi kogumiskolbi pannakse täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet (3.5) või (3.7), sõltuvalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisatakse mõni tilk metüülpunast indikaatorit (3.8).

Mineraliseerimiskolb ühendatakse destilleerimisaparaadi jahutiga ja jahuti ots viiakse kogumiskolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vt tähelepanek 8.3). Mineraliseerimiskolbi valatakse aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.9), vältides ammoniaagi kadu (vt tähelepanek 8.1). Kolbi kuumutatakse, kuni ammoniaak on üle destilleeritud.

5.2.2. Destilleerimine boorhappeks

Kui destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimine toimub käsitsi, siis rakendatakse allpool nimetatud menetlust. Kui destilleerimisseade on täisautomaatne ning hõlmab ka destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimist, siis järgitakse tootja koostatud destilleerimisseadme kasutusjuhendit.

Kogumiskolb, mis sisaldab 25–30 ml boorhappe lahust (3.18), pannakse jahuti väljalaskeava alla selliselt, et sissevoolutoru jääb allapoole boorhappe lahuse ülejäägi pinda. Destilleerimisseade korrigeeritakse 50 ml naatriumhüdroksiidi lahuse (3.9) väljastamiseks. Destilleerimisseadet kasutatakse vastavalt tootja kasutusjuhendile ja destilleeritakse naatriumhüdroksiidi lahuse lisamisel vabanenud ammoniaak välja. Destillaat kogutakse boorhappe vastuvõtulahusesse. Destillaadi kogus (veeaurdestillatsiooni aeg) sõltub proovis sisalduva lämmastiku hulgast. Järgitakse tootja kasutusjuhendit.

MÄRKUS : poolautomaatses destilleerimisseadmes toimuvad naatriumhüdroksiidi ülejäägi lisamine ja veeaurdestillatsioon automaatselt.

5.3. Tiitrimine

Toimida vastavalt punktile 5.3.1 või 5.3.2.

5.3.1. Väävelhape

Väävelhappe ülejääk tiitritakse kogumiskolvis naatriumhüdroksiidi lahusega (3.10 või 3.11), sõltuvalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt.

5.3.2. Boorhape

Kogumiskolvi sisu tiitritakse soolhappe standardse tiitrimislahusega (3.19) või väävelhappe standardse tiitrimislahusega (3.6), kasutades büretti, ning loetakse kokku kasutatud titrandi kogus.

Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, on lõpp-punkt saavutatud, kui ainesse ilmuvad esimesed roosa värvi jäljed. Büreti näitu hinnatakse 0,05 ml täpsusega. Lõpp-punkti nähtavust võib parandada valgustatud magnetseguri plaadi või valgusmõõturi abil.

Seda võib teha automaatselt, kasutades automaatselt tiitrivat veeaurdestillaatorit.

Eri destillaatori või destillaatori/titraatori kasutamisel järgitakse tootja kasutusjuhendeid.

MÄRKUS : kui kasutatakse automaatset tiitrimissüsteemi, algab tiitrimine vahetult pärast destilleerimise algust ja kasutatakse 1 % boorhappe lahust (3.18). Kui kasutatakse täisautomaatset destilleerimisseadet, võib ammoniaagi automaatset tiitrimist läbi viia ka lõpp-punkti määramisega, kasutades potentsiomeetrilist pH-süsteemi. Sel juhul kasutatakse pH mõõtjaga automaatset titraatorit. PH-meeter tuleb korralikult kalibreerida vahemikus pH 4 kuni pH 7, järgides tavapärast laboratoorset pH kalibreerimise menetlust. Tiitrimise pH lõpp-punkt saavutatakse pH 4,6 juures, mis on titreerimiskõvera kõige järsem punkt (murdepunkt).

5.4. Pimekatse

Et kontrollida, kas reaktiivid on lämmastikuvabad, viiakse läbi pimekatse (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine), kasutades proovi asemel 1 g sahharoosi (3.14).

6. Tulemuste arvutamine

Arvutused tehakse vastavalt punktile 6.1 või 6.2.

6.1. Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.1

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

Vo = pimekatses kasutatud NaOH (3.10 või 3.11) maht (ml),

V1 = proovi tiitrimisel kasutatud NaOH (3.10 või 3.11) maht (ml),

c = naatriumhüdroksiidi (3.10 või 3.11) kontsentratsioon (mol/l),

m = proovi mass (g).

6.2. Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.2

6.2.1. Tiitrimine soolhappega

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

m = kaalutise mass grammides,

c = soolhappe (3.19) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l),

V0 = pimekatses kasutatud soolhappe maht (ml),

V1 = kaalutises kasutatud soolhappe maht (ml).

6.2.2. Tiitrimine väävelhappega

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

m = kaalutise mass grammides,

c = väävelhappe (3.6) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l),

V0 = pimekatses kasutatud väävelhappe (3.6) maht (ml),

V1 = kaalutises kasutatud väävelhappe (3.6) maht (ml).

7. Meetodi kontrollimine

7.1. Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

— absoluutväärtusena väljendatult 0,2 %, kui toorvalgusisaldus on väiksem kui 20 %;

— 1,0 % suuremast väärtusest, kui toorvalgusisaldus on 20–40 %;

— absoluutväärtusena väljendatult 0,4 %, kui toorvalgusisaldus on suurem kui 40 %.

7.2. Täpsus

Analüüs (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine) viiakse läbi 1,5–2,0 g atseetaniliidiga (3.13) 1 g sahharoosi (3.14) manulusel; 1 g atseetaniliidi tarbib 14,80 ml väävelhapet (3.5). Saagis peab olema vähemalt 99 %.

8. Tähelepanekud

8.1. Seade võib olla manuaalset, poolautomaatset või automaatset tüüpi. Kui seade nõuab proovi ülekandmist lagundamise ja destilleerimise vahel, tuleb see ülekandmine teostada ilma kadudeta. Kui destillatsiooniaparaadi kolb ei ole varustatud tilklehtriga, lisatakse naatriumhüdroksiid vahetult enne kolvi ühendamist jahutiga, valades vedelikku aeglaselt mööda kolvi külge.

8.2. Kui proov lagundamisel tahkestub, alustatakse määramist uuesti, kasutades eespool näidatust suuremat kogust väävelhapet (3.4).

8.3. Väikese lämmastikusisaldusega toodete puhul võib kogumiskolbi viidava väävelhappe (3.7) mahtu vajadusel vähendada 10–15 ml-ni ja täiendada veega 25 ml-ni.

8.4. Tavapäraste analüüside käigus võib toorvalgu määramiseks kasutada alternatiivseid analüüsimeetodeid, kuid standardmeetodiks on käesoleva lisa C osas kirjeldatud Kjeldahli meetod. Alternatiivmeetodi (nt DUMAS) abil saadud tulemuste samaväärsust standardmeetodiga võrreldes tuleb tõestada iga põhiaine kohta eraldi. Et alternatiivmeetodiga saadud tulemused võivad isegi pärast samaväärsuse kontrolli veidi erineda standardmeetodiga saadud tulemustest, tuleb analüüsiaruandes märkida, millist analüüsimeetodit on toorvalgu määramiseks kasutatud.

D. KARBAMIIDI MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata karbamiidi taset söödas.

2. Põhimõte

Proov suspendeeritakse vees selitava ainega. Suspensioon filtreeritakse. Filtraadi karbamiidisisaldus määratakse pärast 4-dimetüülaminobensaldehüüdi (4-DMAB) lisamist optilise tiheduse mõõtmise teel lainepikkusel 420 nm.

3. Reaktiivid

3.1. 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahus: 1,6 g 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahustatakse 100 ml 96 % etanoolis ja lisatakse 10 ml soolhapet (ρ20 = 1,19 g/ml). See reaktiiv säilib maksimaalselt kaks nädalat.

3.2. Carrezi lahus I: vees lahustatakse 21,9 g tsinkatsetaati Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jää-äädikat. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.3. Carrezi lahus II: vees lahustatakse 10,6 g kaaliumferrotsüaniidi K4 Fe (CN)6 3H2O. Täidetakse veega 100 milliliitrini.

3.4. Karbamiidi mitte absorbeeriv aktiivsüsi (kontrollida).

3.5. Karbamiidi 0,1 % lahus (w/v).

4. Seadmed

4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min.

4.2. Lihvkorgiga katseklaasid: 160 × 16 mm.

4.3. Spektrofotomeeter.

5. Töö käik

5.1. Proovi analüüs

1 mg täpsusega kaalutud 2 g proovi pannakse 1 g aktiivsöega (3.4) 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett ja 5 ml Carrezi lahust I (3.2), segatakse umbes 30 sekundit ja lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.3). Segatakse trumlis 30 minutit. Täidetakse veega kuni märgini, loksutatakse ja filtreeritakse.

Eemaldatakse 5 ml läbipaistvat värvitut filtraati, pannakse see lihvkorgiga katseklaasidesse, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1) ja segatakse. Katseklaasid asetatakse 20 oC (+/- 4 oC) veetemperatuuriga veevanni. Viieteistkümne minuti pärast mõõdetakse proovilahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga lainepikkusel 420 nm. Võrreldakse reaktiivide kontroll-lahustega.

5.2. Kalibreerimiskõver

Võetakse 1, 2, 4, 5 ja 10 ml kogused karbamiidilahust (3.5), pannakse 100 ml mõõtekolbidesse ja täidetakse veega kuni märgini. Igast lahusest võetakse ära 5 ml, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1), homogeenitakse ja mõõdetakse eespool kirjeldatud viisil optiline tihedus võrrelduna kontroll-lahusega, mis sisaldab 5 ml 4-DMAB lahust ja 5 ml karbamiidivaba vett. Koostatakse kalibreerimiskõver.

6. Tulemuste arvutamine

Proovis sisalduv karbamiidikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7. Tähelepanekud

7.1. Üle 3 % karbamiidisisalduse puhul vähendatakse proovi 1 grammini või lahjendatakse esialgset lahust, nii et 500 ml-s ei oleks karbamiidi üle 50 mg.

7.2. Väikese karbamiidisisalduse puhul võetakse suurem proov, tingimusel et filtraat jääb läbipaistvaks ja värvituks.

7.3. Kui proov sisaldab lihtsaid lämmastikuühendeid, nagu näiteks aminohappeid, tuleb optilist tihedust mõõta lainepikkusel 435 nm.

E. LENDUVATE LÄMMASTIKALUSTE MÄÄRAMINE

I. MIKRODIFUSIOON

1. Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust söödas.

2. Põhimõte

Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse kaaliumkarbonaadi lahust kasutades mikrodifusiooni abil, kogutakse boorhappe lahusesse ja tiitritakse väävelhappega.

3. Reaktiivid

3.1. Trikloroäädikhappe 20 % lahus (w/v).

3.2. Indikaator: 33 mg bromokresoolrohelist ja 65 mg metüülpunast lahustatakse 100 ml 95–96 % etanoolis (v/v).

3.3. Boorhappe lahus: üheliitrises mõõtekolvis lahustatakse 200 ml 95–96 % etanoolis (v/v) ja 700 ml vees 10 g boorhapet. Lisatakse 10 ml indikaatorit (3.2). Segatakse ja vajaduse korral muudetakse lahuse värv helepunaseks, lisades naatriumhüdroksiidi lahust. 1 ml lahust seob kuni 300 μg NH3.

3.4. Kaaliumkarbonaadi küllastunud lahus: 100 g kaaliumkarbonaati lahustatakse 100 ml keevas vees. Lastakse jahtuda, filtreeritakse.

3.5. Väävelhape, 0,01 mol/l

4. Seadmed

4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min.

4.2. Klaasist või plastist Conway anumad (vt joonis).

4.3. 1/100 ml gradeeritud mikrobüretid.

5. Töö käik

10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri.

Pipetti kasutades viiakse 1 ml boorhappe lahust (3.3) Conway anuma keskmisse ossa ja 1 ml filtraati anuma välimisse ossa. Kaetakse osaliselt rasvatatud kaanega. Välimisse osasse tilgutatakse kiiresti 1 ml kaaliumkarbonaadi küllastunud lahust (3.4) ja kaas suletakse õhukindlalt. Anumat pööratakse hoolikalt horisontaaltasandis nii, et kaks reaktiivi segunevad. Lastakse haududa kas vähemalt neli tundi toatemperatuuril või üks tund temperatuuril 40 oC.

Mikrobüretti (4.3) kasutades tiitritakse lenduvad lämmastikalused boorhappe lahuses väävelhappe (3.5) abil.

Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita.

6. Tulemuste arvutamine

1 ml H2SO40,01 mol/l vastab 0,34 mg ammoniaagile.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

— suhtelise väärtusena väljendatult 10 % ammoniaagisisalduse puhul, mis on väiksem kui 1,0 %;

— absoluutväärtusena väljendatult 0,1 % ammoniaagisisalduse puhul, mis on vähemalt 1,0 %.

7. Tähelepanek

Kui proovi ammoniaagisisaldus on suurem kui 0,6 %, lahjendatakse esialgset lahust.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. DESTILLEERIMINE

1. Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust peaaegu karbamiidivabas kalajahus. Meetodit kohaldatakse üksnes juhul, kui ammoniaagisisaldus on väiksem kui 0,25 %.

2. Põhimõte

Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse keemistemperatuuril magneesiumoksiidi lisamise teel ja kogutakse teatava koguse väävelhappega, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi lahuse abil tagasi.

3. Reaktiivid

3.1. Trikloroäädikhappe 20 % lahus (w/v)

3.2. Magneesiumoksiid

3.3. Vahutamisvastane emulsioon (nt silikoon)

3.4. Väävelhape, 0,05 mol/l

3.5. Naatriumhüdroksiidi lahus, 0,1 mol/l

3.6. Metüülpunase 0,3 % lahus 95–96 % etanoolis (v/v)

4. Seadmed

4.1. Segisti (trummel): umbes 35–40 p/min

4.2. Kjeldahli destilleerimisaparaat

5. Töö käik

10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri.

Vastavalt lenduvate lämmastikaluste eeldatavale sisaldusele võetakse vajalik kogus selget filtraati (tavaliselt 100 ml). Lahjendatakse 200 milliliitrini ning lisatakse 2 g magneesiumoksiidi (3.2) ja mõned tilgad vahutamisvastast emulsiooni (3.3). Lahus peaks olema lakmuspaberi abil määratuna aluseline, vastasel korral lisatakse veidi magneesiumoksiidi (3.2). Edasi toimitakse vastavalt toorvalgu sisalduse määramise analüüsi meetodi punktidele 5.2 ja 5.3 (käesoleva lisa C osa).

Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita.

6. Tulemuste arvutamine

1 ml H2SO40,05 mol/l vastab 1,7 mg ammoniaagile.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 10 % ammoniaagi massist suhtelise väärtusena väljendatult.

F. AMINOHAPETE (VÄLJA ARVATUD TRIPTOFAANI) MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab aminohappeanalüsaatoriga määrata söödas vabu aminohappeid (sünteetilisi ja looduslikke) ning üldaminohappeid (peptiidsidemetega ja vabu). Meetodit saab kasutada järgmiste aminohapete puhul: tsüst(e)iin, metioniin, lüsiin, treoniin, alaniin, arginiin, asparagiinhape, glutamiinhape, glütsiin, histidiin, isoleutsiin, leutsiin, fenüülalaniin, proliin, seriin, türosiin ja valiin.

Meetod ei erista aminohapete sooli ega aminohapete D- ja L-vorme. See ei sobi trüptofaani ega aminohapete hüdroksüanaloogide määramiseks.

2. Põhimõte

2.1. Vabad aminohapped

Vabad aminohapped ekstraheeritakse lahjendatud soolhappega. Kaasa ekstraheerunud lämmastikku sisaldavad makromolekulid sadestatakse sulfosalitsüülhappega ning eemaldatakse filtreerides. Filtreeritud lahuse pH korrigeeritakse 2,20-le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetrilise määramise teel reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm.

2.2. Üldaminohapped

Valitav protseduur sõltub uuritavatest aminohapetest. Tsüst(e)iin ja metioniin tuleb enne hüdrolüüsi oksüdeerida vastavalt tsüsteiinhappeks ja metioniinsulfooniks. Türosiin tuleb määrata oksüdeerimata proovide hüdrolüsaatides. Kõiki teisi punktis 1 osutatud aminohappeid saab määrata kas oksüdeeritud või oksüdeerimata proovides.

Oksüdeerimine viiakse läbi persipelghappe ja fenooli seguga 0 oC juures. Ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse naatriumdisulfitiga. Oksüdeeritud või oksüdeerimata proovi hüdrolüüsitakse soolhappega (3.20) 23 tundi. Hüdrolüsaadi pH korrigeeritakse 2,20-le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetriliselt reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm (proliini puhul 440 nm).

3. Reaktiivid

Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS).

3.1. Vesinikperoksiid, w (w/w) = 30 %

3.2. Äädikhape, w (w/w) = 98–100 %

3.3. Fenool

3.4. Naatriumdisulfit

3.5. Naatriumhüdroksiid

3.6. 5-sulfosalitsüülhappe dihüdraat

3.7. Soolhape (tihedus umbes 1,18 g/ml)

3.8. Trinaatriumtsitraadi dihüdraat

3.9. 2,2'- tiodietanool (tiodiglükool)

3.10. Naatriumkloriid

3.11. Ninhüdriin

3.12. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC

3.13. Norleutsiin või muu sisestandardina kasutamiseks sobiv ühend

3.14. Gaasiline lämmastik (< 10 ppm hapnikku)

3.15. 1-oktanool

3.16. Aminohapped:

3.16.1. Punktis 1 loetletud standardained. Kristallisatsioonivett mitte sisaldavad puhtad ühendid. Kuivatakse vaakumis P2O5 või H2SO4 kohal ühe nädala jooksul enne kasutamist.

3.16.2. Tsüsteiinhape

3.16.3. Metioniinsulfoon

3.17. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.18. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.19. Sipelghappe-fenoolilahus: 889 g sipelghapet (3.2) segatakse 111 g veega ja lisatakse 4,73 g fenooli (3.3).

3.20. Hüdrolüüsisegu, c = 6 mol HCl/l, mis sisaldab 1 g fenooli/l: 1 g fenooli (3.3) lisatakse 492 milliliitrile HCl-le (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.21. Ekstraheerimissegu, c = 0,1 mol HCl/l, mis sisaldab 2 % tiodiglükooli. Võetakse 8,2 ml HCl (3.,7), lahjendatakse umbes 900 ml veega, lisatakse 20 ml tiodiglükooli (3.9) ja täidetakse veega 1 liitrini (3.7 ja 3.9 mitte segada otse omavahel).

3.22. 5-sulfosalitsüülhape, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalitsüülhapet (3.6) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.23. Oksüdatsioonisegu (persipelghape – fenool): 0,5 ml vesinikperoksiidi (3.1) segatakse 4,5 ml sipelghappe ja fenooli lahusega (3.19) väikses keeduklaasis. Inkubeeritakse 20–30 oC juures ühe tunni jooksul, et moodustuks persipelghape, seejärel jahutatakse jääveevanni kohal (15 min) enne proovile lisamist. Ettevaatust: vältida kokkupuudet nahaga ja kanda kaitserõivaid.

3.24. Tsitraatpuhver, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: 19,61 g naatriumtsitraati (3.8), 5 ml tiodiglükooli (3.9), 1 g fenooli (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) lahustatakse umbes 800 ml vees. pH korrigeeritakse 2,20-le. Täidetakse veega 1 liitrini.

3.25. Elutsioonipuhvrid, mis on valmistatud vastavalt kasutatud analüsaatori tingimustele (4.9).

3.26. Ninhüdriini reaktiiv, mis on valmistatud vastavalt kasutatud analüsaatori tingimustele (4.9).

3.27. Aminohapete standardlahused. Neid lahuseid tuleks hoida temperatuuril alla 5 oC.

3.27.1. Aminohapete põhistandardlahus (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml iga lahuse kohta soolhappes. On võimalik osta.

3.27.2. Tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni põhistandardlahus, c = 1,25 μmol/ml. 0,2115 g tsüsteiinhapet (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinsulfooni (3.16.3) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) üheliitrises mõõtekolbis ning täidetakse kolb tsitraatpuhvriga märgini. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 12 kuu. Seda lahust ei kasutata, kui põhistandardlahus (3.27.1) sisaldab tsüsteiinhapet ja metioniinsulfooni.

3.27.3. Sisetandardi põhistandardlahus, nt norleutsiin, c = 20 μmol/ml. 0,6560 g norleutsiini (3.13) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) mõõtekolbis ning kolb täidetakse tsitraatpuhvriga 250 ml-ni. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle kuue kuu.

3.27.4. Standardaminohapete kalibreerimislahus, mis on mõeldud kasutamiseks hüdrolüsaatidega, tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni c = 5 nmol/50 μl ja teiste aminohapete c = 10 nmol/50 μl. 2,2 g naatriumkloriidi (3.10) lahustatakse 100 ml keeduklaasis 30 ml tsitraatpuhvriga (3.24). Lisatakse 4,00 ml aminohapete põhistandardlahust (3.27.1), 4,00 ml tsüsteiinhappe ja metioniinsulfooni põhistandardlahust (3.27.2) ja 0,50 ml sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3), kui seda kasutatakse. Naatriumhüdroksiidi (3.18) abil korrigeeritakse pH 2,20-le. Kallatakse kvantitatiivselt 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) kuni märgini ja segatakse. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu. Vaata ka punkti 9.1 tähelepanekut.

3.27.5. Standardaminohapete kalibreerimislahus, mis on mõeldud kasutamiseks vastavalt punktile 5.3.3.1 valmistatud hüdrolüsaatidega ja ekstraktidega (5.2). Kalibreerimislahus valmistatakse vastavalt punktile 3.27.4, jättes välja naatriumkloriidi. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu.

4. Seadmed

4.1. 100 või 250 ml ümarapõhjaline püstjahutiga varustatud kolb

4.2. 100 ml boorsilikaatklaasist pudel kummist/teflonist tihendiga keermestatud korgiga (nt Duran, Schott) kuivatuskapis kasutamiseks

4.3. Sundventilatsiooniga ja termoregulaatoriga kuivatuskapp, mille täpsus on parem kui ± 2 oC

4.4. pH-meeter (kolme kümnendkoha täpsusega)

4.5. Membraanfilter (0,22 μm)

4.6. Tsentrifuug

4.7. Vaakumpöördaurusti

4.8. Mehaaniline loksuti või magnetsegur

4.9. Aminohappe analüsaator või HPLC-seade ioonvahetuskolonni, ninhüdriini kolonnijärgse derivatiseerimise seadme ja valgusmõõturiga. Kolonn täidetakse sulfoneeritud polüstüreenvaikudega, mis on võimelised eraldama aminohappeid üksteisest ja teistest ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Puhvri ja ninhüdriini jadas tekitatakse vool pumpadega, mille vooluühtlus on ±0,5 % nii standardkalibreerimise kui proovi analüüsi ajal. Mõnede aminohapete analüsaatoritega võib kasutada hüdrolüüsimenetlusi, mille puhul on hüdrolüsaadi naatriumikontsentratsioon c = 0,8 mol/l ja mis sisaldab oksüdatsioonietapi kõiki sipelghappe jääke. Teised analüsaatorid ei võimalda teatavaid aminohappeid rahuldaval määral eraldada, kui hüdrolüsaat sisaldab liigselt sipelghapet ja/või kui naatriumioonide kontsentratsioon on kõrge. Sellisel juhul vähendatakse pärast hüdrolüüsi ja enne pH korrigeerimist happe mahtu aurustamisega kuni umbes 5 milliliitrini. Aurustamine peab toimuma vaakumitingimustes temperatuuril kuni 40 oC.

5. Töö käik

5.1. Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.12).

5.2. Vabade aminohapete määramine söödas ja eelsegudes

Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 0,2 mg täpsusega koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml ekstraheerimissegu (3.21). Segu raputatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.8). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle 100 ml keeduklaasi.

Lisatakse loksutades 5,0 ml sulfosalitsüülhappe lahust (3.22) ning jätkatakse loksutamist 5 min vältel, kasutades magnetsegurit. Supernatant filtreeritakse või tsentrifuugitakse sademe eemaldamiseks. 10,0 ml saadud lahust pannakse 100 ml keeduklaasi ja korrigeeritakse pH-taset 2,20-ni, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.18), sobiv kogus valatakse tsitraatpuhvri (3.24) abil mõõtekolbi ja kolb täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini.

Kui kasutatakse sisestandardit, lisatakse 1,00 ml sisestandardit (3.27.3) igasse 100 ml valmis lahusesse ja täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini.

Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Kui ekstrakte ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC.

5.3. Üldaminohapete määramine

5.3.1. Oksüdeerimine

0,2 mg täpsusega kaalutakse 0,1–1 g ettevalmistatud proovi (5.1):

— 100 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1) lahtise hüdrolüüsi (5.3.2.3) puhul või

— 250 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1), kui on nõutav madal naatriumikontsentratsioon (5.3.3.1), või

— 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (4.2) (suletud hüdrolüüsi 5.3.2.4 puhul).

Kaalutud proovi lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg ja niiskusesisaldus kuni 100 mg.

Kolb/pudel asetatakse jääveevanni ja jahutatakse kuni temperatuurini 0 oC, lisatakse 5 ml oksüdatsiooniegu (3.23) ning segatakse painutatud otsaga klaasspaatli abil. Spaatlit sisaldav kolb/pudel pitseeritakse õhukindla kilega, pitseeritud nõud sisaldav jääveevann asetatakse 16 tunniks külmikusse temperatuuril 0 oC. 16 tunni möödudes võetakse see külmikust välja ja ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse, lisades 0,84 g naatriumdisulfitit (3.4).

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.1.

5.3.2. Hüdrolüüs

5.3.2.1. Oksüdeeritud proovide hüdrolüüs

Vastavalt punktile 5.3.1 valmistatud oksüdeeritud proovile lisatakse 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20), pestes hoolikalt maha anuma ja spaatli külge kleepunud proovijäägid.

Olenevalt sellest, millist hüdrolüüsimenetlust kasutatakse, jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.

5.3.2.2. Oksüdeerimata proovide hüdrolüüs

100 ml või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1) või 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (4.2) kaalutakse 0,2 mg täpsusega 0,1–1 g ettevalmistatud proovi (5.1). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse hoolikalt 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20) ja segatakse prooviga. Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.

5.3.2.3. Lahtine hüdrolüüs

Kolbis olevale segule (mis on valmistatud vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2) lisatakse 3 klaashelmest ja keedetakse püstjahutiga kolvis 23 tundi pideval mullidega keemisel. Pärast hüdrolüüsi teostamist pestakse jahuti maha 5 ml tsitraatpuhvriga (3.24). Kolb võetakse lahti ja jahutatakse jäävannis.

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.

5.3.2.4. Kinnine hüdrolüüs

Vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2 valmistatud segu sisaldav pudel asetatakse kuivatuskappi (4.3) temperatuuril 110 oC. Et vältida rõhu suurenemist (gaasiliste ainete tekkimise tõttu) ja ära hoida plahvatust, asetatakse esimeseks tunniks surveanuma peale keermestatud kork. Surveanumat ei tohi korgiga sulgeda. Ühe tunni möödudes suletakse surveanum korgiga ja jäetakse 23 tunniks kuivatuskappi (4.3). Pärast hüdrolüüsi lõpuleviimist võetakse pudel kuivatuskapist välja, avatakse ettevaatlikult pudelikork ja asetatakse pudel jääveevanni. Jahutatakse.

Olenevalt sellest, millist pH korrigeerimise menetlust (5.3.3) kasutatakse, valatakse pudeli sisu kvantitatiivselt 250 ml keeduklaasi või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi, kasutades tsitraatpuhvrit (3.24).

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.

5.3.3. pH korrigeerimine

Olenevalt aminohappe analüsaatori (4.9) naatriumitaluvusest toimitakse pH korrigeerimisel vastavalt punktile 5.3.3.1 või 5.3.3.2.

5.3.3.1. Kromatograafilised süsteemid (4.9), mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus

Soovitatav on kasutada sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3), juhul kui kasutatakse aminohappe analüsaatorit, mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus (kui happe kogust tuleb vähendada).

Sellisel juhul lisatakse enne aurustamist hüdrolüsaadile 2,00 ml sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3).

Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadile lisatakse 2 tilka 1-oktanooli (3.15).

Hüdrolüsaadi kogust vähendatakse vaakumpöördaurusti (4.7) abil 5–10 milliliitrini vaakumitingimustes temperatuuril 40 oC. Kui kogust vähendatakse kogemata vähem kui 5 milliliitrini, tuleb hüdrolüsaat välja praakida ja analüüsi tuleb uuesti alustada.

pH-taset korrigeeritakse 2,20-ni naatriumhüdroksiidi lahusega (3.18) ja jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.

5.3.3.2. Kõik teised aminohappe analüsaatorid (4.9)

Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadid neutraliseeritakse osaliselt, lisades hoolikalt loksutades 17 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.17), jälgides, et temperatuur püsiks allpool 40 oC.

pH korrigeeritakse 2,20-ni toatemperatuuril, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.17) ja lõpuks naatriumhüdroksiidi lahust (3.18). Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.

5.3.4. Proovilahus kromatograafia jaoks

Korrigeeritud pH-tasemega hüdrolüsaat (5.3.3.1 või 5.3.3.2) kallatakse kvantitatiivselt koos tsitraatpuhvriga (3.24) 200 ml mõõtekolbi ja täidetakse puhvriga (3.24) märgini.

Kui sisestandardit ei ole veel kasutatud, lisatakse 2,00 ml sisestandardit (3.27.3) ja täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) märgini. Segatakse hoolikalt.

Seejärel alustatakse kromotograafiat (5.4).

Kui proovilahuseid ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC.

5.4. Kromatograafia

Enne kromotograafiat viiakse ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3.4) toatemperatuurile. Segu loksutatakse ja filtreeritakse sobiv kogus läbi 0,22 μm membraanfiltri (4.5). Saadud selge lahusega tehakse ioonvahetuskromatograafia, kasutades aminohappe analüsaatorit (4.9).

Sissesüstimist võib teostada käsitsi või automaatselt. On oluline, et standardite ja proovide analüüsiks lisataks kolonni sama kogus lahust ± 0,5 %, välja arvatud sisestandardi kasutamisel, ning et naatriumi ja aminohapete vahekord standard- ja proovilahustes oleks võimalikult sarnane.

Üldiselt sõltub kalibreerimiskatsete sagedus ninhüdriini reaktiivi stabiilsusest ja analüütilisest süsteemist. Standard või proov lahjendatakse tsitraapuhvriga (3.24), et saavutada standardi piigipindalaks 30–200 % proovi aminohappe piigipindalast.

Aminohapete kromatograafia varieerub kergelt vastavalt sellele, millist tüüpi analüsaatorit ja millist vaiku kasutatakse. Valitud süsteem peab suutma eraldada aminohapped üksteisest ja ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma lineaarselt kolonni lisatud aminohapete muutustest.

Kromatograafia etapil kehtivad (määratavate aminohapete) ekvimolaarlahuse analüüsimisel allpool esitatud miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekorrad. Ekvimolaarlahus peab sisaldama vähemalt 30 % iga aminohappe maksimumkogusest, mida on võimalik täpselt mõõta aminohappe analüüsisüsteemi (4.9) abil.

Treoniini-seriini eraldamiseks ei tohi kahest kattuvast aminohappest madalama aminohappe miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekord kromatogrammil ületada suhet 2:10. (Kui määratakse vaid tsüst(e)iini, metioniini, treoniini ja lüsiini, kahjustab nende määramist ebapiisav eraldamine külgnevatest piikidest.). Kõigi teiste aminohapete puhul peab eraldatus olema parem kui suhe 1:10.

Süsteem peab tagama lüsiini eraldamise „lüsiini artefaktidest” ja ornitiinist.

6. Tulemuste arvutamine

Proovi ja standardi piikide pindala mõõdetakse iga üksiku aminohappe kohta ning arvutatakse kogus (X) ühes grammis aminohappes proovi kilo kohta.

Kui kasutatakse sisestandardit, korrutatakse tulemus liikmega

A = piigipindala, hüdrolüsaat või ekstrakt

B = piigipindala, kalibreerimisstandardlahus

C = piigipindala, sisestandard hüdrolüsaadis või ekstraktis

D = piigipindala, sisestandard, kalibreerimisstandardlahus

M = määratava aminohappe molaarmass

c = standardi kontsentratsioon μmol/ml

m = proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud)

V = hüdrolüsaat (5.3.4) kokku milliliitrites või ekstrakti (6.1) lahjenduse koguruumala milliliitrites

Tsüstiin ja tsüsteiin määratakse mõlemad tsüsteiinhappena oksüdeeritud proovide hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse tsüstiiniks (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), kasutades M väärtust 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metioniin määratakse metioniinsulfoonina oksüdeeritud proovi hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse metioniinina, kasutades metioniini M väärtust: 149,21 g/mol.

Lisatud vaba metioniin määratakse pärast ekstraheerimist metioniinina, arvutamisel kasutatakse sama M väärtust.

6.1. Ekstraktide lahjenduse koguruumala (F) vabade aminohapete (5.2) määramiseks arvutatakse järgmiselt: V = lõppekstrakti ruumala

7. Meetodi hindamine

Meetodit on katsetatud rahvusvahelises võrdluskatses 1990. aastal, kasutades nelja erinevat sööta (sigade segasööt, broilerite segasööt, valgukontsentraat, eelsegu). Tulemuste keskväärtused ja standardhälbed pärast võõrväärtuste elimineerimist on esitatud käesoleva punkti tabelis.







Keskväärtused g/kg Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 N = 17 9,55 n = 13 Broilerite segasööt 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 N = 18 13,93 n = 16 Valgukontsentraat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 N = 17 47,74 n = 15 Eelsegu 58,42 n = 16 — 90,21 N = 16 98,03 n = 16 n = osalenud laborite arv

7.1. Korratavus

Eespool nimetatud võrdluskatse korratavus on väljendatud laborisisese standardhälbena ja esitatud järgmistes tabelites.







Laborisisesed standardhälbed (Sr) g/kg Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Broilerite segasööt 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Valgukontsentraat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Eelsegu 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = osalenud laborite arv







Laborisisese standardhälbe (Sr) variatsioonikordaja (%) Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Broilerite segasööt 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Valgukontsentraat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Eelsegu 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = osalenud laborite arv

7.2. Reprodutseeritavus

Eespool nimetatud võrdluskatse laboritevahelise standardhälbe tulemused on esitatud järgmises tabelis:







Laboritevaheline standardhälve (SR) g/kg Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Broilerite segasööt 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Valgukontsentraat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Eelsegu 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = osalenud laborite arv







Laboritevahelise standardhälbe (SR) variatsioonikordaja (%) Etalonaine Aminohape Treoniin Tsüst(e)iin Metioniin Lüsiin Sigade segasööt 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Broilerite segasööt 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Valgukontsentraat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Eelsegu 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = osalenud laborite arv

8. Etalonainete kasutamine

Meetodi õige rakendamise kontrollimiseks tehakse korduvaid mõõtmisi sertifitseeritud etalonainetega, kui need ained on kättesaadavad. Soovitatav on kalibreerida aminohapete sertifitseeritud kalibreerimislahusega.

9. Tähelepanekud

9.1. Aminohappeanalüsaatorite erinevustest tingituna tuleb standardaminohapete kalibreerimislahuste (vt 3.27.4 ja 3.27.5) ja hüdrolüsaadi (vt 5.3.4) lõppkontsentratsioone vaadelda suunistena. Kõigi aminohapete puhul tuleb kontrollida aparatuuri lineaarse ala vahemikku. Standardlahus lahjendatakse tsitraatpuhvriga, et piigialad oleksid vahemiku keskel.

9.2. Kui hüdrolüsaatide analüüsiks kasutatakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia aparatuuri, tuleb katsetingimused optimeerida vastavalt tootja soovitustele.

9.3. Meetodi rakendamisel sööda suhtes, mille kloriidisisaldus on suurem kui 1 % (kontsentraadid, mineraalsöödad, täiendsöödad), võib analüüs näidata tegelikust väiksemat metioniinisisaldust ning tuleb kasutada erimeetodit.

G. TRÜPTOFAANI MÄÄRAMINE

1. Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata trüptofaani üldsisaldust ja vaba trüptofaani sisaldust söödas. Meetod ei erista D- ja L-vormi.

2. Põhimõte

Trüptofaani üldsisalduse määramiseks hüdrolüüsitakse proovi leeliselises keskkonnas küllastunud baariumhüdroksiidi lahusega ja kuumutatakse 110 oC juures 20 tundi. Pärast hüdrolüüsimist lisatakse sisestandard.

Vaba trüptofaani määramiseks ekstraheeritakse proovi nõrgalt happelistes tingimustes sisestandardi juuresolekul.

Trüptofaan ja sisestandard määratakse hüdrolüsaadis või ekstraktis HPLC-ga fluorestsentsdetektori abil.

3. Reaktiivid

3.1. Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS/cm).

3.2. Standardaine: trüptofaan (puhtus/sisaldus ≥ 99 %), mis on kuivatatud vaakumis fosforpentoksiidi kohal.

3.3. Sisestandardaine: α-metüültrüptofaan (puhtus/sisaldus ≥ 99 %), mis on kuivatatud vaakumis fosforpentoksiidi kohal.

3.4. Baariumhüdroksiidi oktahüdraat (vältida Ba(OH)2 .8 H2O ülemäärast kontakti õhuga, kuna see võib viia BaCO3 moodustumiseni, mis võib määramist segada) (vt tähelepanek 9.3).

3.5. Naatriumhüdroksiid

3.6. Ortofosforhape, w (w/w) = 85 %

3.7. Soolhape, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8. Metanool, samaväärne kui HPLC-puhas.

3.9. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 oC

3.10. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini.

3.11. Soolhape, c = 6 mol/l: Võetakse 492 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.12. Soolhape, c = 1 mol/l: Võetakse 82 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.13. Soolhape, c = 0,1 mol/l: Võetakse 8,2 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

3.14. Ortofosforhape, c = 0,5 mol/l: Võetakse 34 ml ortofosforhapet (3.6) ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini.

3.15. Trüptofaani (3.2) kontsentreeritud lahus, c = 2,50μmol/ml: 500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2553 g trüptofaani (3.2) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat.

3.16. Sisestandardi kontsentreeritud lahus, c = 2,50 μmol/ml: 500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2728 g α-metüültrüptofaani (3.3) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat.

3.17. Trüptofaani ja sisestandardi kalibreerimisstandardlahus: Võetakse 2,00 ml trüptofaani kontsentreeritud lahust (3.15) ja 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Lahjendatakse veega (3.1) ja metanooliga (3.8) umbes sama ruumalani ja umbes sama metanooli kontsentratsioonini (10–30 %), nagu on valmis hüdrolüsaadil. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist. Valmistamise ajal vältida otsest päikesevalgust.

3.18. Äädikhape

3.19. 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanool

3.20. Etanoolamiin w (w/w) > 98 %

3.21. 1 grammi 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahus 100 ml metanoolis (3.8).

3.22. HPLC liikuv faas: 3,00 g äädikhapet (3.18) + 900 ml vett (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahust (3.21) 1g/100 ml metanoolis (3.8). Etanoolamiini (3.20) abil korrigeeritakse pH 5,00-le. Täidetakse veega (3.1) 1 000 ml-ni.

4. Seadmed

4.1. HPLC-seadmed spektrofluorimeetrilise detektoriga

4.2. Vedelikkromatograafia kolonn, 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm, või samaväärne

4.3. pH-meeter

4.4. Laia kaela ja keeratava korgiga polüpropüleenkolb, maht 125 ml

4.5. Membraanfilter (0,45 μm)

4.6. Autoklaav, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1) bar

4.7. Mehaaniline loksuti või magnetsegur

4.8. Pöörissegaja

5. Töö käik

5.1. Proovide ettevalmistamine

Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.9).

5.2. Vaba trüptofaani määramine (ekstrakt)

Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml soolhapet (3.13), c = 0,1 mol/l, ja 5,00 ml kontsentreeritud sisestandardlahust (3.16). Raputatakse või segatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.7). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle keeduklaasi. Lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Naatriumhüdroksiidi (3.10) abil korrigeeritakse pH 3-le. Lisatakse piisavalt metanooli (3.8), et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 protsendini. Lahus viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kuni kromatograafiaks sobiva koguseni (umbes sama kogus kui kalibreerimisstandardlahusel (3.17)).

Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Standardlahust ja ekstrakte tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui ekstrakte ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva.

5.3. Trüptofaani üldsisalduse määramine (hüdrolüsaat).

0,1–1 g ettevalmistatud proovi (5.1) kaalutakse 0,2 mg täpsusega polüropüleenkolbi (4.4). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse 8,4 g baariumhüdroksiidi oktahüdraati (3.4) ja 10 ml vett. Segatakse pöörissegajaga (4.8) või magnetseguriga (4.7). Tefloniga kaetud magnet jäetakse segusse. Nõu seinad loputatakse üle 4 ml veega. Keeratav kork pannakse peale ja kolb suletakse lõdvalt. Kolb pannakse autoklaavi (4.6) ja kuumutatakse keevas vees ja aurus 30–60 minutit. Autoklaav suletakse ja kuumutatakse 20 tundi 110 (±2) oC juures.

Enne autoklaavi avamist langetatakse temperatuur natuke alla 100 oC kraadi. Ba(OH)2 .8 H2O kristalliseerumise vältimiseks lisatakse soojale segule 30 ml toatemperatuuril olevat vett. Raputatakse või segatakse kergelt. Lisatakse 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Nõusid jahutatakse vee-/jäävannis 15 minutit.

Seejärel lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Nõu hoitakse jahutusvannis ja neutraliseeritakse segamisel HCl-iga (3.11) ning pH korrigeeritakse 3,0-ni HCl (3.12) abil. Lisatakse piisavalt metanooli, et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 %ni. Viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kindla, kromatograafiaks sobiva ruumalani (näiteks 100 ml). Metanooli lisamine ei tohi tekitada sadenemist.

Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Standardlahust ja hüdrolüsaate tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui hüdrolüsaate ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva.

5.4. HPLC määramine

Soovitatakse juhinduda järgmistest isokraatilise elueerimise tingimustest. Muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused (vt ka tähelepanekuid 9.1 ja 9.2):







Vedelikkromatograafia kolonn (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm või samaväärne Kolonni temperatuur: Ruumitemperatuur Liikuv faas (3.22): 3,00 g äädikhapet (3.18) + 900 ml vett (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahust metanoolis (3.8) (1g/100ml). pH korrigeeritakse 5,00-le etanoolamiini (3.20) abil. Täidetakse veega (3.1) 1 000 ml-ni. Voolukiirus: 1 ml/min Summaarne voolutamisaeg: umbes 34 min Avastamise lainepikkus: ergastamine: 280 nm, emissioon: 356 nm. Sissesüstitav ruumala 20 μl

6. Tulemuste arvutamine

Arvutatakse trüptofaani (X) kogus grammides 100 g proovi kohta.

A = sisestandardi piipindala, kalibreerimisstandardlahus (3.17)

B = trüptofaani piigipindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3)

V1 = kalibreerimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kogus milliliitrites (2 ml)

c = kalibreerimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kontsentratsioon, μmol/ml (= 2,50)

V2 = kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites, mis on lisatud ekstraheerimisel (5.2) (= 5,00 ml) või hüdrolüsaadile (5.3) (= 2,00 ml)

C = sisestandardi piigipindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3)

D = trüptofaani piigipindala, kalibreerimisstandardlahus (3.17)

V3 = kalibreerimisstandardlahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites (= 2,00 ml)

m = proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud)

M = trüptofaani molaarmass (= 204,23 g/mol)

7. Korratavus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10 % suuremast tulemusest.

8. Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühendusesisene ühisuurimine (neljas võrdlusuuring), mille käigus kuni 12 laborit analüüsisid hüdrolüüsimeetodi sertifitseerimiseks kolme proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:







Proov 1 Seasööt Proov 2 L-trüptofaaniga rikastatud seasööt Proov 3 Seasöödakontsentraat L 12 12 12 n 50 55 50 Keskmine g/kg 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = tulemused esitanud laborite arv

n = üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr = korratavust iseloomustav standardhälve

SR = reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

r = korratavus

R = reprodutseeritavus

CVr = korratavuse variatsioonikordaja, %

CVR = reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

Teise ühendusesisese ühisuurimise (kolmanda võrdlusuuringu) käigus analüüsisid kuni 13 laborit vaba trüptofaani ekstraheerimise meetodi sertifitseerimiseks kahte proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:







Proov 4 Nisu ja soja segu Proov 5 Nisu ja soja segu (= proov 4), millele on lisatud trüptofaani (0,457g/kg) L 12 12 n 55 60 Keskväärtus g/kg 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = tulemused esitanud laborite arv

n = üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr = korratavust iseloomustav standardhälve

SR = reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

r = korratavus

R = reprodutseeritavus

CVr = korratavuse variatsioonikordaja, %

CVR = reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

Veel ühe ühendusesisese võrdlusuuringu käigus analüüsisid kuni seitse laborit trüptofaani hüdrolüüsi sertifitseerimise eesmärgiga nelja proovi. Tulemused on esitatud allpool. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5).







Proov 1 Sigade söödasegu (CRM 117) Proov 2 Väikese rasvasisaldusega kalajahu (CRM 118) Proov 3 Sojajahu (CRM 119) Proov 4 Lõssipulber (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Keskväärtus g/kg 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = tulemused esitanud laborite arv

n = üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr = korratavust iseloomustav standardhälve

SR = reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

r = korratavus

R = reprodutseeritavus

CVr = korratavuse variatsioonikordaja, %

CVR = reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

9. Tähelepanekud

9.1. Järgmised kromatograafia eritingimused võivad tagada trüptofaani ja α-metüültrüptofaani parema eraldumise teineteisest. Isokraatiline elueerimine, millele järgneb kolonni gradientpuhastus:



Vedelikkromatograafia kolonn: 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 μm või samaväärne Kolonni temperatuur: 32 oC Liikuv faas: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanool, 95+5 (V+V). B: Metanool Gradientprogramm: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Voolukiirus: 1,2 ml/min Summaarne voolutamisaeg: umbes 33 min

9.2. Kromatograafiline määramine oleneb HPLC tüübist ja kasutatavast kolonnitäidisest. Valitud süsteem peab tagama trüptofaani ja sisestandardi piikide täieliku eraldumise (kuni alusjooneni). Lisaks sellele on oluline, et lagunemisproduktid eralduksid hästi trüptofaanist ja sisestandardist. Kolonni tuleb süstida hüdrolüsaate ilma sisestandardita, kontrollimaks, et sisestandardi piigi kohal ei moonutaks alusjoont lisandite väljumine. On oluline, et voolutamisaeg oleks piisavalt pikk kõigi lagunemisproduktide elueerimiseks, vastasel juhul võivad hiljem elueeruvad piigid segada järgnevaid kromatograafilisi määramisi. Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kr