1991R2568 — ET — 16.10.2015 — 028.001

Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest

Muudetud:







(*) Käesolevat akti ei ole eesti keeles avaldatud.









▼B

KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 2568/91,

11. juuli 1991,

oliiviõlide ja pressimisjääkide omaduste ja asjakohaste analüüsimeetodite kohta







EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 22. septembri 1966. aasta määrust nr 136/66/EMÜ õli- ja rasvaturu ühise korralduse kehtestamise kohta, ( 1 ) viimati muudetud määrusega (EMÜ) nr 3577/90, ( 2 ) eriti selle artiklit 35a, ning arvestades, et: ning arvestades, et: määruse nr 136/66/EMÜ lisas on kirjeldatud kõigis liikmesriikides turustatud ning liikmesriikide vahel, ühendusesiseses ja kolmandate riikidega peetava kaubavahetuse objektiks olevate oliiviõlide ja pressjääkoliiviõlide kirjeldused ja määratlused; ilma et see piiraks olemasolevate sätete kohaldamist, tuleks erinevat liiki õlide eristamiseks iga õli füüsikalised ja keemilised omadused ning neitsioliiviõli organoleptilised omadused määratleda asjaomaste toodete puhtuse ja kvaliteedi tagamiseks; erinevat liiki õlide omadused tuleks kogu ühenduses kindlaks määrata ühtsetel alustel; selleks tuleks kehtestada ühenduse keemilise analüüsi ja organoleptilise hindamise meetodid; üleminekuajal tuleks lubada kasutada ka teisi liikmesriikides kohaldatavaid analüüsimeetodeid tingimusel, et erinevate tulemuste korral on otsustavaks ühenduse meetodil saadud tulemused; seoses oliiviõli füüsikaliste ja keemiliste omaduste määratluse ja analüüsimeetoditega tuleb kaupade koondnomenklatuuri grupi 15 lisamärkusi muuta; neitsioliiviõli organoleptiliste omaduste hindamismeetod näeb ette valitud ja koolitatud degustaatorite hindamiskomisjonide loomise; seetõttu tuleks kindlaks määrata sellise struktuuri loomiseks vajalik ajavahemik; võttes arvesse raskusi, millega mõned liikmesriigid degustaatorite hindamiskomisjonide koostamisel kokku puutuvad, tuleks lubada ka teiste liikmesriikide hindamiskomisjonide kasutamist; oliiviõli pressimisjääkide impordi suhtes kohaldatava impordimaksusüsteemi nõuetekohase toimimise tagamiseks tuleks sätestada nende toodete õlisisalduse kindlaksmääramise ühtne meetod; selleks, et vältida kaubandushäireid, tuleks sätestada enne käesoleva määruse jõustumist pakendatud õli müümine teatud aja jooksul; komisjoni määrust (EMÜ) nr 1058/77, ( 3 ) viimati muudetud määrusega (EMÜ) nr 1858/88, ( 4 ) on asjakohane muuta; õli- ja rasvaturu korralduskomitee ei ole oma eesistuja määratud tähtaja jooksul arvamust esitanud, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:







▼M20

Artikkel 1

1. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktides 1 ja 2 sätestatutele, käsitatakse neitsioliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 1 alapunktide a ja b tähenduses.

2. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 3 sätestatutele, käsitatakse lambiõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 1 alapunkti c tähenduses.

3. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 4 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 2 tähenduses.

4. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 5 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliiviõlist ja neitsioliiviõlist koosnevaks oliiviõliks määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 3 tähenduses.

5. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 6 sätestatutele, käsitatakse töötlemata oliivijääkõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 4 tähenduses.

6. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 7 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliivijääk- õlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 5 tähenduses.

7. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 8 sätestatutele, käsitatakse oliivijääkõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 6 tähenduses.

▼M26

Artikkel 2

1. I lisas sätestatud õlide omadused määratakse kindlaks järgmiste analüüsimeetoditega:

a) oleiinhappe protsendina väljendatud vabad rasvhapped määratakse II lisas sätestatud meetodiga;

b) peroksiidarv määratakse kindlaks III lisas sätestatud meetodiga;

c) vahade sisaldus määratakse IV lisas sätestatud meetodiga;

d) steroolide ja triterpeendialkoholide koostis ja sisaldus määratakse gaasikromatograafiliselt kapillaarkolonniga, kasutades V lisas sätestatud meetodit;

e) 2-glütserüülmonopalmitaadi protsendiline sisaldus määratakse VII lisas sätestatud meetodiga;

f) spektrofotomeetriline analüüs tehakse IX lisas sätestatud meetodiga;

▼M28

g) rasvhapete koostis määratakse X lisas sätestatud meetodiga;

▼M26

h) halogeenitud lenduvad lahustid määratakse XI lisas sätestatud meetodiga;

i) neitsioliiviõli organoleptilisi omadusi hinnatakse XII lisas sätestatud meetodiga;

j) stigmastadieene määratakse XVII lisas sätestatud meetodiga;

k) ECN42-triglütseriidide sisaldus määratakse XVIII lisas sätestatud meetodiga;

▼M28

l) alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide sisaldus määratakse XIX lisas sätestatud meetodiga;

▼M26

m) vahade, rasvhapete metüülestrite ja etüülestrite sisaldus määratakse XX lisas sätestatud meetodiga.

▼M28 —————

▼M26

2. Liikmesriikide ametiasutused või nende esindajad kontrollivad neitsioliiviõlide organoleptilisi omadusi liikmesriikide määratud degusteerimiskomisjonide kaudu.

Õli organoleptilised omadused, millele on osutatud esimeses lõigus, loetakse deklareeritud kategooriale vastavaks, kui liikmesriigi määratud degusteerimiskomisjon kinnitab klassifikatsiooni.

Kui degusteerimiskomisjon organoleptiliste omaduste põhjal ei kinnita deklareeritud kategooriat, korraldavad ametiasutused või nende esindajad huvitatud isiku palvel kaks kordushindamist muudes heakskiidetud degusteerimiskomisjonides, millest vähemalt ühe on heaks kiitnud asjaomase tootja liikmesriik. Asjaomaseid omadusi peetakse vastavaks deklareeritud kategooriale, kui vähemalt kahel kontrollhindamisel kinnitatakse deklareeritud kategooria. Vastupidisel juhul kannab huvitatud osaline kontrollhindamise kulud.

3. Kui riigi ametiasutused või nende esindajad kontrollivad õli omadusi, nagu on osutatud lõikes 1, võetakse proovid vastavalt rahvusvahelisele standardile EN ISO 661, mis käsitleb uuritavate proovide ettevalmistamist, ja EN ISO 5555, mis käsitleb proovide võtmist. Ent standardi EN ISO 5555 punktist 6.8 olenemata võetakse proov selliste esmapakendis õlipartiide korral vastavalt käesoleva määruse Ia lisale. Pakendamata õlide puhul, kui proove ei saa võtta vastavalt standardile EN ISO 5555, toimub proovide võtmine vastavalt liikmesriigi pädeva asutuse juhenditele.

Ilma, et see piiraks standardi EN ISO 5555 ja standardi EN ISO 661 6. peatüki kohaldamist, asetatakse võetud proovid võimalikult kiiresti pimedasse kohta ja eemale soojusallikatest ning saadetakse laborisse analüüsimiseks hiljemalt viiendal tööpäeval pärast võtmist; vastupidisel juhul hoitakse proove nii, et need vedamisel ega säilitamisel ei halveneks ega saaks kahjustatud enne laborisse saatmist.

4. Lõikes 3 osutatud kontrollimiste läbiviimisel tehakse pakendatud toodete puhul II, III, IX, XII ja XX lisas osutatud analüüsid ning vajaduse korral kõik siseriiklike seadustega nõutavad kontrollanalüüsid enne minimaalse säilimisaja tähtpäeva. Lahtiste õlide proovide puhul tehakse need analüüsid hiljemalt kuuendal kuul pärast proovi võtmist.

Muude käesolevas määruses sätestatud analüüside puhul ei kohaldata tähtaegu.

Kui analüüside tulemused ei vasta oliiviõli või oliivijääkõli deklareeritud kategooria omadustele, teatatakse huvitatud isikule sellest hiljemalt üks kuu enne esimeses lõigus sätestatud tähtaja lõppu, välja arvatud juhul, kui proov on võetud vähem kui kaks kuud enne minimaalse säilimisaja lõppu.

5. Oliiviõlide omaduste määramisel lõikes 1 ettenähtud meetoditega võrreldakse analüüsi tulemusi otse käesolevas määruses sätestatud piirväärtustega.

▼M25

Artikkel 2a

1. Käesolevas artiklis tähendab asjaomase liikmesriigi „turustatav oliiviõli” oliiviõli ja oliivijääkõli summaarset kogust, mis tarbitakse kõnealuses liikmesriigis või eksporditakse kõnealusest liikmesriigist.

2. Liikmesriik tagab, et vastavuskontrolle tehakse valikuliselt, toetudes riskianalüüsile, ja piisavalt sageli tagamaks, et turustatav oliiviõli vastab deklareeritud kategooriale.

3. Riski hindamise kriteeriumid võivad olla muu hulgas:

a) õli kategooria, tootmise ajavahemik, õli hind muude taimeõlidega võrreldes, segamis- ja pakkimistoimingud, hoidmisvõimalused ja -tingimused, päritoluriik, sihtkohariik, transpordivahend või partii maht;

b) käitaja asukoht turustamisahelas, tema turustatava õli kogus ja/või väärtus, tema turustatavate õlikategooriate sortiment, äritegevuse tüüp, nagu pressimine, säilitamine, rafineerimine, segamine, pakkimine või jaemüük;

c) eelmiste kontrollide tulemused, sealhulgas leitud vigade arv ja liik, turustatavate õlide tavapärane kvaliteet, kasutatavat tehnilist varustust iseloomustavad näitajad;

d) käitajate kasutatava turustamisstandarditele vastavuse alase kvaliteeditagamise süsteemi või enesekontrolli süsteemi usaldusväärsus;

e) kontrolli teostamise koht, eriti kui see on Euroopa Liitu esmase sisenemise koht, Euroopa Liidust väljumise viimane punkt või koht, kus õlisid toodetakse, pakitakse, laaditakse või müüakse lõpptarbijale;

f) mis tahes muu teave, mis võib viidata standarditele mittevastavuse ohule.

4. Liikmesriigid sätestavad eelnevalt järgmist:

a) partiide standarditele mittevastavuse ohu hindamise kriteeriumid;

b) iga riskikategooria riskianalüüsi põhjal minimaalne arv ettevõtjaid või partiisid ja/või koguseid, mille vastavust tuleb kontrollida.

Liikmesriigis turustatava oliiviõli iga tuhande tonni kohta tuleb teha vähemalt üks vastavuse kontroll aastas.

5. Liikmesriik kontrollib vastavust järgmiselt:

a) viies selleks ükskõik millises järjekorras läbi I lisas sätestatud analüüsid või

b) Ib lisa otsustamisskeemil sätestatud järjekorras, kuni saavutatakse mõni otsustamisskeemil nimetatud otsustest.

▼M19 —————

▼M25

Artikkel 3

Kui selgub, et õli ei vasta oma kategooria kirjeldusele, kohaldab asjaomane liikmesriik tõhusaid, proportsionaalseid ja hoiatavaid rahalisi karistusi, mis määratakse kindlaks eeskirjade eiramise raskusastet arvesse võttes, ilma et see piiraks muude karistuste kohaldamist.

Kui kontrolli tulemusel ilmnevad märkimisväärsed eeskirjade eiramised, suurendab liikmesriik turustamisstaadiumi, õli kategooria, päritolu või muude kriteeriumide alusel kontrollimise sagedust.

▼M5

Artikkel 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Kui liikmesriikidel on raskusi degusteerimiskomisjonide loomisega, võivad nad kasutada mõnes teises liikmesriigis heakskiidetud komisjoni.

3. Iga liikmesriik koostab kutseorganisatsioonide või kutsealadevaheliste organisatsioonide loodud degusteerimiskomisjonide loetelu vastavalt lõikes 1 sätestatud tingimustele ning tagab kõnealuste tingimuste järgimise.

▼M19 —————

▼B

Artikkel 6

1. Oliiviõli ekstraheerimisest tulenev õlikoogi ja muude jääkide õlisisaldus (CN-koodid 2306 90 11 ja 2306 90 19 ) määratakse kindlaks XV lisas sätestatud meetodil.

2. Lõikes 1 osutatud õlisisaldus väljendatakse õli massiprotsendina kuivaine massist.

▼M20

Artikkel 7

Kohaldatakse ühenduse sätteid, mis käsitlevad saasteainete olemasolu.

Halogeenitud lahustite puhul on kõikide oliiviõli kategooriate puhul piirmäärad järgmised:

— iga tuvastatud halogeenitud lahusti maksimaalne sisaldus: 0,1 mg/kg,

— iga tuvastatud halogeenitud lahusti maksimaalne üldsisaldus: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artikkel 7a

Füüsilised või juriidilised isikud või isikute rühmad, kes omavad oliiviõli või oliivijääkõli alates eraldamisest pressimiskäitises kuni villimisetapini (kaasa arvatud) mis tahes kutseliseks või äriliseks otstarbeks, on kohustatud pidama iga sellise kategooria õli saamise ja väljaandmise registrit.

Liikmesriik tagab, et esimeses lõigus sätestatud kohustust korralikult täidetaks.

▼M25

Artikkel 8

1. Liikmesriik teatab komisjonile käesoleva määruse rakendamiseks võetud meetmed. Ta teavitab komisjoni kõigist hilisematest muudatustest.

2. Hiljemalt iga aasta 31. mail edastab liikmesriik komisjonile aruande käesoleva määruse rakendamise kohta eelmisel kalendriaastal. Aruanne sisaldab vähemalt oliiviõlide vastavuskontrolli tulemusi vastavalt XXI lisas sätestatud vormidele.

3. Käesolevas määruses osutatud teatised edastatakse vastavalt komisjoni määrusele (EÜ) nr 792/2009 ( 5 ).

▼B

Artikkel 9

Määrus (EMÜ) nr 1058/77 tunnistatakse kehtetuks.

Artikkel 10

1. Käesolev määrus jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas.

XII lisas sätestatud meetodit kohaldatakse siiski ►M1 1. november 1992 ◄ , välja arvatud sekkumissüsteemiga seotud toimingute puhul.

▼M5

Kõnealust meetodit ei kohaldata enne 1. novembrit 1992 pakendatud neitsioliiviõli suhtes.

▼B

2. Käesolevat määrust ei kohaldata enne käesoleva määruse jõustumist pakendatud ja kuni 31. oktoobrini 1992 turustatava oliiviõli ja oliivijääkõli suhtes.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.









LISAD

Kokkuvõte







I. lisa: Oliiviõlide omadused I A lisa: Proovide võtmine oliiviõlist või oliivijääkõlist, mis on tarnitud esmapakendis I B lisa: Otsustamisskeem, mille järgi kontrollitakse, kas oliiviõli proov on kooskõlas deklareeritud kategooriaga II lisa: ►M21 Vabade rasvhapete määramine külmmeetodil ◄ III lisa: Peroksiidarvu määramine IV lisa: ►M6 Vahasisalduse määramine kapillaargaasikromatograafia abil ◄ V lisa: Steroolide ja triterpeendialkoholide koostise ja sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga VII lisa: ►M21 2-glütserüülmonopalmitaadi protsendilise sisalduse määramine ◄ ▼M20 ————— ▼B IX lisa: Spektrofotomeetriline analüüs ultraviolettpiirkonnas ▼M28 X lisa: Metüülestrite rasvhapete gaasikromatograafiline määramine ▼B XI lisa: Oliiviõli halogeenitud lenduvate lahustite määramine XII lisa: Rahvusvahelise oliiviõlinõukogu meetod neitsioliiviõlide organoleptiliseks hindamiseks ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B XV lisa: Oliiviõli pressimisjääkide õlisisaldus XVI lisa: Joodiarvu määramine XVII lisa: Stigmastadieenide määramine taimeõlides XVIII lisa: ECN 42-Triatsüülglütseroolide tegeliku ja teoreetiliselt arvutatud sisalduse vahe määramine Annex XIX: ►M28 Alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide sisalduse kapillaarkolonnkromatograafiline määramine ◄ ▼M23 XX lisa: Meetod vahade, rasvhapete metüülestrite ja etüülestrite sisalduse määramiseks kapillaargaasikromatograafiaga ▼M28 ————— ▼M25 ХХI lisa: Oliiviõlide vastavuse artikli 8 lõikes 2 osutatud kontrollimise tulemused

▼M27









I LISA

OLIIVIÕLI OMADUSED







Kategooria Rasvhapete etüülestrid (FAEEd) (*) Happesus (%) (*) Peroksiidiarv mekv O2/kg (*) Vahad mg/kg (**) 2-glütserüül-monopalmitaat (%) Stigmastadieenid mg/kg (1) Vahe: ECN42 (HPLC) ja ECN42 (teoreetiline arvutus) K232 (*) K268 või K270 (*) Δ-K (*) Organoleptiline hinnang: puuduse mediaan (Md) (*) Organoleptiline hinnang: puuviljalisuse mediaan (Mf) (*) 1. Ekstra-neitsioliiviõli FAEEd ≤ 40 mg/kg (viljelusaasta 2013–2014 (2)) FAEEd ≤ 35 mg/kg (viljelusaasta 2014–2016) FAEEd ≤ 30 mg/kg (viljelusaastad pärast 2016. a) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9, kui palmitiinhappe üldsisaldus ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0, kui palmitiinhappe üldsisaldus > 14 % 2. Neitsioliiviõli — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9, kui palmitiinhappe üldsisaldus ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0, kui palmitiinhappe üldsisaldus > 14 % 3. Lambiõli — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9, kui palmitiinhappe üldsisaldus ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1, kui palmitiinhappe üldsisaldus > 14 % 4. Rafineeritud oliiviõli — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9, kui palmitiinhappe üldsisaldus ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1, kui palmitiinhappe üldsisaldus > 14 % 5. Rafineeritud ja neitsioliiviõlist koosnev oliiviõli — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9, kui palmitiinhappe üldsisaldus ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0, kui palmitiinhappe üldsisaldus > 14 % 6. Töötlemata oliivijääkõli — — — C40 + C42+ C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Rafineeritud oliivijääkõli — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliivijääkõli — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Kokku isomeere, mis õnnestus (mida ei õnnestunud) lahutada kapillaarkolonniga. (2) Piirmäära kohaldatakse oliiviõlidele, mis on toodetud alates 1. märtsist 2014. (3) Õlisid vahasisaldusega 300–350 mg/kg käsitatakse lambiõlidena, kui alifaatsete alkoholide üldsisaldus on kuni 350 mg/kg või kui erütrodiooli ja uvaooli sisaldus on kuni 3,5 %. (4) Puuduse mediaan võib olla kuni 3,5 ning puuviljalisuse mediaan 0. (5) Õlisid vahasisaldusega 300–350 mg/kg käsitatakse töötlemata oliivijääkõlidena, kui alifaatsete alkoholide üldsisaldus on üle 350 mg/kg ning kui erütrodiooli ja uvaooli sisaldus on suurem kui 3,5 %.







Kategooria Rasvhappeline koostis (1) Oleiinhappe trans-isomeeride kogusumma (%) Linool- ja linoleenhappe trans-isomeeride summa (%) Steroolne koostis Steroolid kokku (mg/kg) Erütrodiool ja uvaool (%) (**) Müristiinhape (%) Linoleenhape (%) Arahhiinhape (%) Eikoseenhape (%) Beheenhape (%) Lignotseriinhape (%) Kolesterool (%) Brassikasterool (%) Kampesterool (2) (%) Stigmasterool (%) App. βsitosterool (3) (%) (**) Δ-7-stigmastenool (2) (%) 1. Ekstra-neitsioliiviõli ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Neitsioliiviõli ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lambiõli ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Rafineeritud oliiviõli ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Rafineeritud ja neitsioliiviõlist koosnev oliiviõli ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Töötlemata oliivijääkõli ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Rafineeritud oliivijääkõli ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Oliivijääkõli ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Muude rasvhapete sisaldus (%): palmitiinhape: 7,50–20,00; palmitoleiinhape: 0,30–3,50; heptadekaanhape: ≤ 0,30; heptadetseenhape: ≤ 0,30; steariinhape: 0,50–5,00; oleiinhape: 55,00–83,00; linoolhape: 2,50–21,00. (2) Vt käesoleva lisa liide. (3) App. β-sitosterool: Δ-5,23-stigmastadienool + klerosterool + β-sitosterool + sitostanool + Δ-5-avenasterool + Δ-5,24-stigmastadienool. (4) Õlisid vahasisaldusega 300–350 mg/kg käsitatakse lambiõlidena, kui alifaatsete alkoholide üldsisaldus on kuni 350 mg/kg või kui erütrodiooli ja uvaooli sisaldus on kuni 3,5 %. (5) Õlisid vahasisaldusega 300–350 mg/kg käsitatakse töötlemata oliivijääkõlidena, kui alifaatsete alkoholide üldsisaldus on üle 350 mg/kg või kui erütrodiooli ja uvaooli sisaldus on suurem kui 3,5 %.

Märkused

a) Analüüside tulemused peavad olema väljendatud sama arvu kümnendkohtadega, kui iga omaduse puhul on ette nähtud. Viimast numbrit tuleb suurendada ühe ühiku võrra, kui järgmine number on suurem kui 4.

b) Õli kategooriat võib muuta või deklareerida õli käesoleva määruse kohaselt mittepuhtaks, kui ainult üks omadus ei vasta märgitud väärtusele.

c) Kui omadus on märgistatud tärniga (*), tähendab see õli kvaliteedi puhul järgmist: – lambiõli puhul võivad mõlemad asjakohased piirväärtused samaaegselt erineda deklareeritud väärtustest; – neitsioliiviõlide puhul muudetakse kategooriat, kui kas või ainult üks nendest väärtustest erineb deklareeritud väärtusest, kuigi sellise õli võib ikka veel klassifitseerida ühte neitsioliiviõli kategooriatest.

d) Kui omadus on tähistatud kahe tärniga (**), osutab see, et kõikide oliivijääkõli tüüpide puhul võivad mõlemad asjaomased näitajad korraga erineda märgitud piirmääradest.









Liide

OTSUSTAMISSKEEM

Kampesterooli otsustamisskeem neitsioliiviõli ja ekstra neitsioliiviõli kohta:

Muud näitajad peavad vastama käesoleva määrusega kehtestatud normidele.

Δ-7-stigmastenooli otsustamisskeem:

— Ekstra-neitsioliiviõlid ja neitsioliiviõlid —

Muud näitajad peavad vastama käesoleva määrusega kehtestatud normidele.

— Oliivijääkõlid (toor- ja rafineeritud) —

▼M26









Ia LISA

PROOVIDE VÕTMINE OLIIVIÕLIST VÕI OLIIVIJÄÄKÕLIST, MIS ON TARNITUD ESMAPAKENDIS

Seda proovivõtumeetodit kohaldatakse esmapakendisse pakendatud oliiviõli või oliivijääkõli partiidele. Kasutatakse eri meetodeid sõltuvalt sellest, kas esmapakendi maht ületab 5 liitrit või mitte.

Partii on hulk kaubaüksuseid, mis toodetakse, valmistatakse ja pakitakse sellistes tingimustes, et igas kaubaüksuses olev õli on kõikide analüütiliste omaduste osas homogeenne. Partii tähistus peab vastama Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivile 2011/91/EL ( 6 ).

„Osaproov” – õli kogus, mis on esmapakendis ja mis on võetud partii juhuslikult valitud punktist.

1. ÜKSIKPROOVI SISALDUS

1.1. Esmapakend ei ole suurem kui 5 liitrit

„Üksikproov” esmapakendi puhul, mis ei ole suurem kui 5 liitrit – partiist vastavalt tabelile 1võetud osaproovide arv.







Tabel 1 Üksikproovi maht peab olema vähemalt järgmine Kui esmapakendi maht on Üksikprooviks tuleb võtta õli a) 1 liiter või rohkem a) 1 kontaktpakendist; b) vähem kui 1 liiter b) väikseimast arvust pakenditest, mille kogumaht on vähemalt 1,0 liiter

Tabelis 1 osutatud pakendite arvu, mis moodustavad üksikproovi, võib iga liikmesriik suurendada vastavalt oma vajadustele (nt organoleptiline hindamine muus laboris kui keemilised analüüsid, kontrollanalüüsid jne).

1.2. Esmapakend on suurem kui 5 liitrit

„Üksikproov” esmapakendi puhul, mis on suurem kui 5 liitrit – kogutud osaproove esindav osa, mis on saadud vähendamise meetodiga ja vastavalt tabelile 2. Üksikproov peab koosnema eri näidistest.

„Näidis” – üksikproovi näidis on iga pakkeüksus nendest, mis kokku moodustavad üksikproovi.







Tabel 2 Valitavate osaproovide miinimumarv Pakendite arv partiis Valitavate osaproovide miinimumarv kuni 10 1 alates … 11 kuni 150 2 alates … 151 kuni 500 3 alates … 501 kuni 1 500 4 alates … 1 501 kuni 2 500 5 kui > 2 500 , siis iga 1 000 pakkeüksuse kohta 1 täiendav osaproov

Selleks et vähendada esmapakendite võtmisega saadud mahtu, ühtlustatakse üksikproovi valmistamiseks võetud osaproovide sisu. Eri osaproovide õlikogused valatakse mahutisse, et ühtlustada proov segamisega; seejuures kaitstakse proovi nii hästi kui võimalik kokkupuute eest õhuga.

Üksikproovi sisu tuleb valada pakenditesse mahuga vähemalt 1,0 liiter; igas sellises pakendis on üksikproovi näidis.

Üksikproovi näidiste arvu võib iga liikmesriik suurendada vastavalt oma vajadustele (nt organoleptiline hindamine muus laboris kui keemilised analüüsid, kontrollanalüüsid jne).

Iga pakend peab olema täidetud nii, et õhku oleks selles võimalikult vähe, seejärel sobivalt suletud ja plommitud, et tagada toote võltsimiskindlus.

Need näidised peavad olema märgistatud, et tagada õige tuvastamine.

2. ANALÜÜSID JA TULEMUSED

2.1. Iga üksikproov tuleb jagada laboriproovideks vastavalt standardi EN ISO 5555 punktile 2.5 ja analüüsida vastavalt Ib lisa otsustamisskeemis näidatud järjekorrale või muus juhuslikus järjekorras.

2.2. Kui kõik analüüside tulemused vastavad deklareeritud õlikategooria omadustele, loetakse kogu asjaomane partii vastavaks. Kui kas või üks analüüsitulemus ei vasta deklareeritud õlikategooria omadustele, loetakse kogu asjaomane partii mitte vastavaks.

3. PARTII KATEGOORIA KONTROLLIMINE

3.1. Partii kategooria kontrollimiseks võib pädev asutus suurendada partii eri kohtadest võetavate üksikproovide arvu vastavalt järgmisele tabelile:



Tabel 3 Partii suurusega määratud üksikproovide arv Partii suurus (liitrites) Üksikproovide arv alla 7 500 2 7 500 kuni vähem kui 25 000 3 25 000 kuni vähem kui 75 000 4 75 000 kuni vähem kui 125 000 5 Alates 125 000 st 6 + 1 iga täiendava 50 000 liitri kohta Iga osaproov, millest koosneb üksikproov, tuleb võtta partii jätkuvast kohast; on vaja märkida iga üksikproovi koht ja tähistada see üheselt mõistetavalt. Iga üksikproovi moodustamine toimub punktides 1.1 ja 1.2 osutatud korras. Iga üksikprooviga tehakse seejärel artikli 2 lõikes 1 osutatud analüüsid.

3.2. Kui artikli 2 lõikes 1 osutatud analüüside tulemuste poolest vähemalt üks üksikproov ei vasta õli deklareeritud kategooria omadustele, tunnistatakse kogu proovivõtupartii nõuetele mittevastavaks.









Ib LISA

OTSUSTAMISSKEEM, MILLE JÄRGI KONTROLLITAKSE, KAS OLIIVIÕLI PROOV ON KOOSKÕLAS DEKLAREERITUD KATEGOORIAGA

Tabel 1

Tabel 2

Tabel 3









1. liide







Käesoleva määruse lisade ja otsustamisskeemis osutatud analüüside vastavuse tabel — Happesus II lisa Vabade rasvhapete määramine külmmeetodil — Peroksiidiarv III lisa Peroksiidiarvu määramine — UV-spektromeetria IX lisa Spektrofotomeetriline analüüs — Organoleptiline hindamine XII lisa Neitsioliiviõli organoleptiline hindamine — Etüülestrid XX lisa Meetod vahade, rasvhapete metüülestrite ja etüülestrite sisalduse määramiseks kapillaargaasikromatograafiaga — 3,5-stigmastadieenid XVII lisa Taimeõlides stigmastadieenide määramise meetod ▼M28 — Rasvhapete trans-isomeerid X lisa Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline määramine — Rasvhapete sisaldus X lisa Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline määramine ▼M26 — ΔECN42 XVIII lisa HPLC-meetodiga triglütseriidide koostise määramine ECN42 abil (erinevus HPLC-meetodiga määratud sisalduse ja teoreetilise sisalduse vahel) — Steroolide koostis ja üldsisaldus — Erütrodiool ja uvaool V lisa Steroolide ja triterpeendialkoholide koostise ja sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga — Vahad IV lisa Vahade sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga ▼M28 — Alifaatsed alkoholid ja triterpeenalkoholid XIX lisa Alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide sisalduse kapillaarkolonnkromatograafiline määramine ▼M26 — Küllastunud rasvhapped 2. positsioonis VII lisa 2-glütserüülmonopalmitaadi protsendilise sisalduse määramine

▼B









II LISA

▼M21

VABADE RASVHAPETE MÄÄRAMINE KÜLMMEETODIL

▼B

1. HAPPESUSE MÄÄRAMINE

Vabade rasvhapete määramine oliiviõlis. Vabade rasvhapete sisaldust väljendatakse tavapärasel viisil arvutatud happesusena.

1.1. Põhimõte

Proov lahustatakse lahustite segus ja vabad rasvhapped tiitritakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahuses.

1.2. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peaksid olema tunnustatud analüütilise kvaliteediga ja vesi peaks olema kas destilleeritud või samaväärse puhtusega.

1.2.1. Dietüüleetri ja 95 % etanooli (V/V) segu võrdsetes osades. Märkus: Dietüüleeter on väga kergesti süttiv ning võib moodustada plahvatusohtlikke peroksiide. Selle kasutamisel tuleks olla ettevaatlik. Segu neutraliseeritakse kasutamise hetkel kaaliumhüdroksiidi lahusega (1.2.2) lisades 100 ml segu kohta 0,3 ml fenoolftaleiini lahust (1.2.3). Märkus: Kui dietüüleetrit ei ole võimalik kasutada, võib kasutada etanooli ja tolueeni sisaldavate lahustite segu. Vajaduse korral võib etanooli asendada 2-propanool.

1.2.2. Kaaliumhüdroksiid, tiitritud etanoolilahusena, c(KOH) 0,1 mol/l või vajaduse korral c(KOH) 0,5 mol/l. Kaaliumhüdroksiidi etanoolilahuse täpne kontsentratsioon peab olema teada ning seda tuleb enne kasutamist vahetult kontrollida. Kasutatakse lahust, mis on valmistatud vähemalt viis päeva enne kasutamist, ning see dekanteeritakse kummist punniga tumedasse klaaspudelisse. Lahus peaks olema värvitu või helekollast värvi. Märkus: Kaaliumhüdroksiidi stabiilset värvusetut lahust saab valmistada järgmiselt: 1 000 ml etanooli lastakse koos 8 g kaaliumhüdroksiidi ja 0,5 g alumiiniumilaastudega keema ning keedetakse püstjahutiga kolvis tund aega. Destilleeritakse kohe. Destillaadis lahustatakse vajalik kogus kaaliumhüdroksiidi. Lahus jäetakse mitmeks päevaks seisma ja kaaliumkarbonaadi sademest dekanteeritakse selge supernatant. Lahuse võib valmistada ilma destilleerimiseta järgmiselt: 1 000 ml etanoolile lisatakse 4 ml alumiiniumbutülaati ja segu jäetakse mitmeks päevaks seisma. Supernatant dekanteeritakse ja selles lahustatakse vajalik kogus kaaliumhüdroksiidi. Lahus on kasutamisvalmis.

1.2.3. Fenoolftaleiin, 10 g/l lahus 95–96 % etanoolis (V/V) või alkalisinises, (väga tugeva värviga rasvade puhul) 20 g/l lahus 95–96 % etanoolis (V/V).

1.3. Seadmed

Tavalised laboriseadmed, sealhulgas:

1.3.1. analüütilised kaalud;

1.3.2. 250 ml Erlenmeyeri kolb;

1.3.3. 10 ml bürett, mõõtskaala ühikutega 0,05 ml.

1.4. Menetlus

1.4.1. Proovi ettevalmistamine analüüsiks (Katse tehakse filtreeritud prooviga. Kui niiskus ja lisandid on kokku alla 1 %, kasutatakse proovi ilma täiendava töötlemiseta; kui need on üle 1 %, tuleks proov filtreerida.)

1.4.2. Proovi võtmine Proov võetakse sõltuvalt eeldatavast happearvust järgmise tabeli alusel:



Hinnanguline happearv Proovi mass (g) Kaalumistäpsus (g) < 1 20 0,05 1–4 10 0,02 4–15 2,5 0,01 15–75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Proov kaalutakse Erlenmeyeri kolvis (1.3.2).

1.4.3. Määramine Proov (1.4.2) lahustatakse 50–150 ml dietüüleetri ja etanooli (1.2.1) varem neutraliseeritud segus. Lahus tiitritakse, segades sellesse kaaliumhüdroksiidi 0,1 mol/l lahusega (1.2.2) (vt märkus 2), kuni indikaator muutub (fenoolftaleiini roosa värvus püsib vähemalt 10 sekundit). Märkus 1. Kaaliumhüdroksiidi tiitritud etanoolilahuse (1.2.2) võib asendada kaalium- või naatriumhüdroksiidi vesilahusega tingimusel, et lisatud vee maht ei põhjusta faaside eraldumist. Märkus 2.Kui 0,1 mol/l kaaliumhüdroksiidilahust on vaja rohkem kui 10 ml, kasutatakse 0,5 mol/l lahust. Märkus 3. Kui lahus muutub tiitrimise ajal häguseks, tuleb lisada nii palju lahustit (1.2.1) kui on vaja selge lahuse saamiseks.

1.5. Happesus: väljendatud oleiinhappe protsendina

Happesus massiprotsendina on võrdne:

kus:

V on kasutatud tiitritud kaaliumhüdroksiidi maht milliliitrites;

c on täpne kontsentratsioon moolides kasutatud kaaliumhüdroksiidi tiitritud lahuse liitri kohta;

M on molaarmass grammides tulemuse väljendamiseks (282) kasutatud happe mooli kohta;

m on proovi mass grammides.

Tulemus ►M6 kahe arvutuse ◄ aritmeetiline keskmine.









III LISA

PEROKSIIDARVU MÄÄRAMINE

1. KOHALDAMISALA

Käesolevas standardis kirjeldatakse õlide ja rasvade peroksiidarvu määramise meetodit.

2. KASUTUSVALDKOND

Standardit kohaldatakse loomsete ja taimsete õlide ja rasvade suhtes.

3. MÄÄRATLUS

Peroksiidarv on nende proovis olevate ainete kogus aktiivse hapniku milliekvivalendina kilogrammi kohta, mis kirjeldatud töötamistingimustel kaaliumjodiidi oksüdeerivad.

4. PÕHIMÕTE

Katsekogust töödeldakse äädikhappe ja kloroformi lahuses kaaliumjodiidi lahusega. Eraldunud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi standardlahusega.

5. SEADMED

Seadmetel ei tohi olla redutseerivaid või oksüdeerivaid aineid.

Märkus: Lihvitud pindu ei tohi määrdeainega määrida.

5.1. 3 ml klaasist kühvel.

5.2. Lihvitud kaela ja punniga 250 ml mahuga kolvid, enne kuivatatud ja täidetud puhta kuiva väärisgaasiga (lämmastik või soovitatavalt süsinikdioksiid).

5.3. 25 või 50 ml bürett, jaotatud 0,1 ml ühikuteks.

6. REAKTIIVID

6.1. Analüütiliselt puhta reaktiivi kvaliteediga kloroform, millest hapnik on vabastatud puhta, kuiva inertgaasi barboteerimisel.

6.2. Analüütiliselt puhta kvaliteediga jää-äädikas, millest hapnik on vabastatud puhta, kuiva inertgaasi voolu barboteerimisel.

6.3. Kaaliumjodiidi küllastunud vesilahus, vahetult ette valmistatud ning joodi ja jodaatideta.

6.4. Naatriumtiosulfaat, 0,01 või 0,002 Mol/L täpsusega vahetult enne kasutamist standarditud vesilahust.

6.5. Tärklise lahus, 10 g/l vesilahus, värskelt looduslikust lahustuvast tärklisest valmistatud.

7. PROOV

Tagatakse proovi võtmine ja selle säilitamine varjus, jahedas ja täielikult täidetud klaasmahutites, mis on hermeetiliselt lihvkorgi või korgist punniga suletud.

8. TÖÖ KÄIK

Katsed tehakse hämara päevavalguse või kunstliku valgustusega. Klaasist kühvlisse (5.1) või selle puudumise korral kolbi (5.2) kaalutakse 0,001 g täpsusega järgmisele tabelile vastava massiga proov, mille aluseks on eeldatav peroksiidarv:







Hinnanguline peroksiidarv (meq) Katsekoguse mass (g) 0–12 5,0 –2,0 12–20 2,0 –1,2 20–30 1,2 –0,8 30–50 0,8 –0,5 50–90 0,5 –0,3

Kolvilt (5.2) eemaldatakse punn ning sellesse pannakse klaasist kühvel, millel on katsekogus. Lisatakse 10 ml kloroformi (6.1). Katsekogus lahustatakse kiiresti segamise teel. Lisatakse 15 ml äädikhapet (6.2) ja seejärel 1 ml kaaliumjodiidi lahust (6.3). Kolvile pannakse kiiresti punn, loksutatakse üks minut ja jäetakse siis viieks minutiks temperatuurile 15–25 °C varju seisma.

Lisatakse umbes 75 ml destilleeritud vett. Vabastatud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (6.4) (0,002 Mol/L lahus eeldatava väärtuse < 12 puhul ja 0,01 Mol/L eeldatava väärtuse >12 puhul), loksutatakse kõvasti, kasutades indikaatorina tärklise lahust (6.5).

Ühe ja sama prooviga tehakse 2 määramist.

Samal ajal tuleb teha ka pimekatse. Kui pimekatse tulemus on suurem kui 0,05 ml 0,01 Mol/L naatriumtiosulfaadi lahust (6.4), asendatakse puhastamata reaktiivid.

9. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Peroksiidarv aktiivse hapniku milliekvivalentidena kilogrammi kohta saadakse valemiga:

kus

V on katses kasutatud naatriumtiosulfaadi standardlahuse (6.4) milliliitrite arv, mida on pimekatse arvesse võtmiseks parandatud;

T on kasutatud naatriumtiosulfaadi lahuse (6.4) täpne molaarsus;

m on katsekoguse mass grammides.

Tulemus on kahe määramise aritmeetiline keskmine.

▼M21









IV LISA

VAHADE SISALDUSE MÄÄRAMINE KAPILLAARGAASIKROMATOGRAAFIA ABIL

1. EESMÄRK

Käesoleva meetodiga määratakse vahade sisaldust oliiviõlides. Vahade eraldamine toimub süsinikuaatomite arvu alusel. Meetodit võib eeskätt kasutada pressimisega saadud oliiviõlide eristamiseks ekstraheerimisega saadud õlidest (oliivijääkõlidest).

2. PÕHIMÕTE

Rasvainele lisatakse sobivat sisestandardit, seejärel fraktsioneeritakse kromatograafiliselt, kasutades hüdrateeritud silikageelkolonni; katse tingimustes esimesena elueeritav fraktsioon ainetega, mis on triglütseriididest vähem polaarsed, eraldatakse ning seda analüüsitakse kapillaargaasikromatograafia abil.

3. SEADMED

3.1. 25milliliitrine Erlenmeyeri kolb.

3.2. Klaasist gaasikromatograafiakolonn sisediameeteriga 15,0 mm ja pikkusega 30–40 cm, mis on varustatud kraaniga.

3.3. Sobiv kapillaarkolonniga gaasikromatograaf, mis on varustatud süsteemiga, mis võimaldab otse kolonni süstimist ja koosneb järgmistest osadest: 3.3.1. programmeeritava temperatuuriga termostaatkapp kolonnide jaoks; 3.3.2. külminjektor proovi viimiseks otse kolonni; 3.3.3. leekionisatsioondetektor ja muundurvõimend; 3.3.4. integraatormeerik, mida saab kasutada koos muundurvõimendiga (3.3.3), mille reageerimisaeg on alla 1 sekundi ning mille paberi kiirust saab muuta; (võib kasutada ka infotehnoloogiasüsteeme, milles gaasikromatograafia andmed edastatakse arvuti vahendusel); 3.3.5. klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn pikkusega 8–12 m ja sisediameetriga 0,25–0,32 mm, mis on seestpoolt kaetud jaotusvedelikuga, mille kihi paksus on ühtlaselt 0,10–0,30 mm (võib kasutada müügilolevaid SE 52 või SE 54 tüüpi jaotusvedelikke).

3.4. 10mikroliitrine mikrosüstal otse kolonni süstimiseks, mille nõelal on tugevdatud pinnakiht.

3.5. Elektriline vibraator.

3.6. Pöördaurusti.

3.7. Muhvelahi.

3.8. Analüütiline kaal, kaalumistäpsus ± 0,1 mg.

3.9. Tavalised klaasist laborinõud.

4. REAKTIIVID

4.1. Silikageel, tera suurus 60–200 μm. Geel pannakse vähemalt neljaks tunniks ahju temperatuuriga 500 °C. Lastakse jahtuda, seejärel lisatakse vett koguses, mis vastab 2 %le silikageeli massist. Segatakse korralikult ühtlase massi saamiseni. Hoitakse pimedas vähemalt 12 tundi enne kasutamist.

4.2. n-heksaan, kromatograafias kasutamiseks.

4.3. Etüüleeter, kromatograafias kasutamiseks.

4.4. n-heptaan, kromatograafias kasutamiseks.

4.5. Laurüülarahidaadi 0,1 % (m/V) standardlahus heksaanis (sisestandard) (võib kasutada ka palmitüülpalmitaati või müristüülstearaati). 4.5.1. Sudaan 1 (1-fenüül-aso-2-naftool).

4.6. Kandegaas: puhas vesinik või heelium, gaasikromatograafias kasutamiseks.

4.7. Abigaasid: — puhas vesinik, gaasikromatograafias kasutamiseks; — puhas õhk, gaasikromatograafias kasutamiseks.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Kromatograafiakolonni valmistamine

n-heksaanis (4.2) suspendeeritakse 15 g silikageeli (4.1) ning viiakse kolonni (3.2). Lastakse settida. Homogeensema kromatograafilise kolonni saamiseks töödeldakse settinud kolonni elektrilise vibraatoriga (3.5) ja lisandite eemaldamiseks voolutatakse kolonni 30 ml n-heksaaniga. 25 milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) kaalutakse täpselt kaalu (3.8) abil 500 mg proovi ning lisatakse sobiv kogus sisestandardit (4.5), arvestades eeldatavat vahasisaldust; nt oliiviõli puhul lisatakse 0,1 mg ja oliivijääkõli puhul 0,25–0,5 mg laurüülarahidaati. Eelkirjeldatud viisil ettevalmistatud proov kantakse kromatograafiakolonni, kasutades kahte n-heksaani (4.2) kogust mahuga à 2 ml.

Lahustil lastakse voolata, kuni absorbendi ülemise pinna kohale jääb 1 mm vedelikku, seejärel voolutatakse kolonni veel 70 ml n-heksaaniga, et eemaldada proovis tavaliselt sisalduvad n-alkaanid. Seejärel alustatakse voolutamist; kogutakse 180 ml n-heksaani-etüüleetri segu (vahekorras 99:1) voolukiirusel umbes 15 tilka 10 sekundi jooksul. Proovi elueerimine toimub toatemperatuuril 22 ± 4 °C.

NB:

— n-heksaani-dietüüleetri segu (99:1) tuleb valmistada igal päeval uuesti.

— Vahade nõuetekohase elueerimise visuaalseks kontrollimiseks võib proovi lahusele lisada 100 μl 1 % sudaani lahust elueerimissegus. Värvaine retentsiooniaeg on vahade ja triglütseriidide retentsiooniaegade vahel; kui värvaine jõuab kromatograafiakolonni põhjani, tuleb elueerimine peatada, sest kõik vahad on elueeritud.

Niimoodi saadud fraktsiooni aurustatakse pöördaurustis (3.6), kuni peaaegu kogu lahusti on eemaldatud. Viimased 2 ml lahustit eemaldatakse nõrga lämmastikuvoolu abil, seejärel lisatakse 2–4 ml n-heptaani.

5.2. Gaasikromatograafiline analüüs

5.2.1. Ettevalmistustööd

Kolonn pannakse gaasikromatograafi (3.3); sisselaskekoht ühendatakse on-column-süsteemiga ja väljalaskekoht detektoriga. Kontrollitakse, et gaasikromatograafiaseade oleks töökorras (gaasijuhtmete lekkekindlus, detektori tundlikkus, meerik jne).

Kui kolonni kasutatakse esimest korda, on soovitatav see tasakaalustada. Läbi kolonni hakatakse nõrga joana juhtima gaasi, seejärel lülitatakse gaasikromatograafiaseade sisse. Järk-järgult, 4 tunni jooksul, tõstetakse temperatuur 350 °C-ni. Sellist temperatuuri hoitakse vähemalt kaks tundi, seejärel reguleeritakse seade töörežiimile (reguleeritakse gaasivoolu kiirust, leegi süüdet, ühendatakse elektrilise meerikuga (3.3.4), reguleeritakse kolonni termostaatkapi temperatuuri, detektorit jne). Registreeritakse signaal vähemalt kaks korda suuremal tundlikkusel, kui on vaja analüüsi läbiviimiseks. Saadav nulljoon peaks olema sirge, ilma igasuguste piikideta, ning see ei tohiks kummalegi poole triivida.

Negatiivne sirge triiv näitab, et kolonn ei ole korralikult ühendatud; positiivne triiv osutab kolonni puudulikule tasakaalustamisele.

5.2.2. Töötingimuste valimine

Töötingimused on reeglina järgmised:

— kolonni temperatuur: —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min algul 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektori temperatuur: 350 °C;

— sisestatava aine kogus: 1 μl lahust n-heptaanis (2–4 ml);

— kandegaas: heelium või vesinik asjaomase gaasi optimaalsel voolukiirusel (vt liide);

— seadme tundlikkus peab vastama järgmistele tingimustele:

Olenevalt kolonni ja gaasikromatograafi omadustest võib tingimusi muuta, et saavutada kõikide vahade eraldumine, piikide rahuldav lahutus (vt joonis) ja et C32 sisestandardi retentsiooniaeg oleks 18 ± 3 minutit. Vaha kõige tüüpilisem piik peab olema vähemalt 60 % täisskaalast.

Piigi integreerimisparameetrid määratakse kindlaks nii, et uuritavate piikide pindalasid oleks võimalik õigesti hinnata.

NB:Arvesse võttes kõrget lõpptemperatuuri, on lubatav positiivne triiv, mis ei tohi ületada 10 % skaala ulatusest.

5.3. Analüüsi läbiviimine

10mikroliitrisesse mikrosüstlasse võetakse 1 μl lahust; kolb tõmmatakse tagasi, kuni nõel on tühi. Nõel viiakse injektsioonisüsteemi ning 1–2 sekundi pärast tehakse kiire süst. Umbes 5 sekundi pärast tõmmatakse nõel ettevaatlikult välja.

Detektori signaali registreeritakse seni, kuni vahad on täielikult elueeritud.

Nulljoon peab kogu aeg vastama nõuetele.

5.4. Piikide määramine

Piigid määratakse retentsiooniaja põhjal, võrdlusest samadel tingimustel analüüsitud teadaoleva retentsiooniajaga vahade segudega.

Joonisel on esitatud neitsioliiviõli vahade kromatogramm.

5.5. Kvantitatiivne hindamine

Sisestandardile ja alifaatsetele estritele C40–C46vastavate piikide pindalad arvutatakse integraatori abil.

Iga estri vahasisaldus milligrammides rasvaine kilogrammi kohta arvutatakse järgmiselt:

kus:

Ax = iga estri piigi pindala ruutmillimeetrites;

As = sisestandardi piigi pindala ruutmillimeetrites;

ms = lisatud sisestandardi mass milligrammides;

m = määramisel kasutatud proovi mass grammides.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Märgitakse erinevate C40- kuni C46-vahade sisalduste summa milligrammides rasva kilogrammi kohta (ppm).

NB. Määratavate koostisosade puhul osutatakse vahade piikidele, mis paiknevad paarisarvulise süsinikuaatomite arvuga estrite C40 ja C46 vahel, vastavalt järgneval joonisel esitatud oliiviõli vahade kromatogrammile. Kui ester C46 esineb kahekordsena, on soovitatav selle identifitseerimiseks analüüsida pressimisjääkide õli vahafraktsiooni, kus C46 piiki on kerge ära tunda, sest see on oluliselt suurem.

Tulemused väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

Joonis

Oliiviõli vahade kromatogramm ( 7 )

Tähistused:

I.S. = laurüülarahidaat

1. = diterpeenestrid

2 + 2′ = estrid C40

3 + 3′ = estrid C42

4 + 4′ = estrid C44

5. = estrid C46

6. = steroolestrid ja triterpeenalkoholid.









Liide

Gaasi voolukiiruse määramine

Kui gaasikromatograaf on viidud tavapärasesse töörežiimi, süstitakse kolonni 1–3 μl metaani või propaani ning mõõdetakse stopperiga aeg süstimise hetkest kuni piigi alguseni (tM); selle ajaga läks metaan või propaan läbi kolonni.

Voolukiirus (cm/s) määratakse valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on stopperiga mõõdetud aeg sekundites.

▼M26









V LISA

STEROOLIDE JA TRITERPEENDIALKOHOLIDE KOOSTISE JA SISALDUSE GAASIKROMATOGRAAFILINE MÄÄRAMINE KAPILLAARKOLONNIGA

1. KASUTAMISALA

Meetodis kirjeldatakse üksiksteroolide ja -triterpeendialkoholide ning steroolide ja triterpeendialkoholide üldsisalduse määramist oliiviõlides ja oliivijääkõlides.

2. PÕHIMÕTE

Õli, millele on sisestandardina lisatud α-kolestanooli, seebistatakse kaaliumhüdroksiidiga etanoolilahuses ja seebistumatud komponendid ekstraheeritakse dietüüleetriga.

Steroolide ja triterpeendialkoholide fraktsioon eraldatakse seebistamatust ainest õhukese kihi kromatograafiaga aluselisel silikageelplaadil. Silikageelist saadud fraktsioonid viiakse üle trimetüülsilüüleetriteks ja analüüsitakse gaasikromatograafiliselt kapillaarkolonniga.

3. SEADMED

Kasutatakse tavalisi laboriseadmeid, eelkõige järgmisi:

3.1. Püstjahutiga varustatud lihvühendustega 250 ml kolb.

3.2. 500 ml jaotuslehter.

3.3. 250 ml kolvid.

3.4. Kõik seadmed õhukese kihi kromatograafia tegemiseks 20 × 20 cm klaasplaatidel.

3.5. Ultraviolettlamp lainepikkusega 254 või 366 nm.

3.6. 100 μl ja 500 μl mikrosüstlad.

3.7. Silindriline poorse G3-filtriga (poori läbimõõt 15–40 μm) filterlehter, läbimõõduga ligikaudu 2 cm ja sügavusega 5 cm, mis sobib vaakumfiltrimiseks ja millel on lihvkern.

3.8. 50 ml kooniline vaakuumkolb klaaslihvmuhviga, mille saab ühendada filterlehtriga (punkt 3.7).

3.9. 10 ml katseklaas koonusekujulise põhja ja tihedalt sulguva klaaskorgiga.

3.10. Gaasikromatograaf, millel saab töötada kapillaarkolonniga ja millel on jaotatud vooluga injektorseade, mis koosneb järgmistest seadistest: 3.10.1. termostateeritav kolonnikamber, mis hoiab nõutavat temperatuuri täpsusega ± 1 °C; 3.10.2. reguleeritava temperatuuriga injektorseade persilaniseeritud klaasist aurustiga ja jaotatud voolu süsteemiga; 3.10.3. leekionisatsioondetektor; 3.10.4. Andmekogumissüsteem, mis sobib kasutamiseks koos leekionisatsioondetektoriga (punkt 3.10.3) ja mille abil saab käsitsi integreerida.

3.11. Sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn, mille pikkus on 20–30 m, sisediameeter 0,25–0,32 mm, üleni kaetud ühtlase 0,10–0,30 μm paksuse 5 % difenüül- ja 95 % dimetüülpolüsiloksaani kihiga (statsionaarne faas SE-52 või SE-54 või samaväärne).

3.12. Mikrosüstal, maht 10 μml, gaasikromatograafia jaoks, liimitud nõelaga, mis sobib jaotatud voolu süstideks.

3.13. Kaltsiumdikloriidiga eksikaator

4. REAGENDID

4.1. Kaaliumhüdroksiid, miinimumtiiter 85 %.

4.2. Kaaliumhüdroksiidi umbes 2 N etanoollahus. 130 g kaaliumhüdroksiidi (punkt 4.1) lahustatakse samaaegsel jahutamisel 200 ml destilleeritud vees ning täiendatakse etanooliga (punkt 4.10) kuni 1 liitri märgini. Lahust hoitakse õhukindlalt suletud tumedast klaasist pudelites ja säilitatakse kuni kaks päeva.

4.3. Etüüleeter, analüütiliselt puhas.

4.4. Kaaliumhüdroksiidi umbes 0,2 N etanoollahus. 13 g kaaliumhüdroksiidi (punkt 4.1) lahustatakse samaaegsel jahutamisel 20 ml destilleeritud vees ning täiendatakse etanooliga (punkt 4.10) kuni 1 liitri märgini.

4.5. Veevaba naatriumsulfaat, analüütiliselt puhas.

4.6. Silikageeliga kaetud klaasplaadid (20 × 20 cm), fluorestsentsindikaatorita, paksus 0,25 mm (müügil kasutusvalmina).

4.7. Tolueen, kromatograafia jaoks.

4.8. Atsetoon, kromatograafia jaoks.

4.9. n-heksaan, kromatograafia jaoks.

4.10. Etüüleeter, kromatograafia jaoks.

4.11. Etanool, analüütiliselt puhas.

4.12. Etüülatsetaat, analüütiliselt puhas.

4.13. Võrdluslahus õhukese kihi kromatograafia jaoks: kolesterooli või fütosteroolide ja erütrodiooli 5 % lahus etüülatsetaadis (punkt 4.11).

4.14. 2,7-diklorofluorestseiin, 0,2 % etanoolilahus. Lahus muudetakse kergelt aluseliseks mõne tilga 2 N alkohoolse kaaliumhüdroksiidilahuse (punkt 4.2) lisamisega.

4.15. Veevaba püridiin, kromatograafia jaoks (vt märkus 5).

4.16. Heksametüüldisilasaan, analüütiliselt puhas.

4.17. Trimetüülklorosilaan, analüütiliselt puhas.

4.18. Sterooltrimetüülsilüüleetrite võrdluslahused. Valmistatakse kasutamise ajal steroolidest ja erütrodioolist, mis on saadud neid sisaldavatest õlidest.

4.19. α-kolestanool, puhtus üle 99 % (puhtust tuleb kontrollida gaasikromatograafilise analüüsiga).

4.20. α-kolestanooli sisestandardi lahus, 0,2 % lahus (mass/ruumala) etüülatsetaadis (punkt 4.11).

4.21. Fenoolftaleiini lahus etanoolis (punkt 4.10), 10 g/l.

4.22. Kandegaas: lämmastik või heelium, gaasikromatograafiliselt puhas.

4.23. Abigaasid: vesinik, heelium, lämmastik ja õhk, gaasikromatograafiliselt puhtad.

4.24. n-heksaani (4.9) / dietüüleetri (punkt 4.10) segu 65:35 (maht/maht).

4.25. Silüülimisreaktiiv, mis kujutab endast püridiini-heksametüüldisilasaani-trimetüülklorosilaani segu vahekorras 9:3:1 (maht/maht/maht).

5. MÄÄRAMISE KÄIK

5.1. Seebistumatu aine valmistamine. 5.1.1. 500 μl mikrosüstlaga (punkt 3.6) viiakse 250 ml kolbi (punkt 3.1) selline kogus α-kolestanooli sisestandardi lahust (punkt 4.20), mis sisaldab sellise koguse kolestanooli, mis vastab umbes 10 %-le proovis olevast steroolide kogusest. Näiteks 5 g oliiviõli proovi puhul lisatakse 500 μl α-kolestanooli lahust (punkt 4.20) ja oliivijääkõli puhul 1 500 μl. Aurutatakse nõrga lämmastikuvoolu juures soojal vesivannil kuivaks, pärast kolvi jahutamist kaalutakse samasse kolbi 5 ± 0,01 g kuiva filtritud proovi. Märkus 1: Rohkesti kolesterooli sisaldavate loomsete või taimsete õlide puhul võib ilmuda piik, mille retentsiooniaeg on samasugune kui kolestanooli retentsiooniaeg. Sellisel juhul tuleb steroolifraktsiooni analüüsida kaks korda, sisestandardiga ja ilma. 5.1.2. Lisatakse 50 ml 2 N kaaliumhüdroksiidi etanoolilahust (punkt 4.2) ja veidi pimsitükikesi, paigaldatakse püstjahuti ja kuumutatakse tasasel keemisel kuni seebistumiseni (lahus muutub selgeks). Kuumutatakse veel 20 minutit, seejärel lisatakse kondensaatori ülaosa kaudu 50 ml destilleeritud vett, eemaldatakse püstjahuti ning kolb jahutatakse ligikaudu temperatuurini 30 °C. 5.1.3. Kolvi sisu kantakse kvantitatiivselt 500 ml jaotuslehtrisse (punkt 3.2), kasutades mitut portsjonit destilleeritud vett (50 ml). Lisatakse ligikaudu 80 ml dietüüleetrit (punkt 4.10), loksutatakse tugevasti umbes 60 sekundi jooksul, vähendades tekkivat ülerõhku korrapäraselt jaotuslehtri ümberpööramisega (kraan ülespoole) ja kraani avamisega. Lastakse seista, kuni kaks faasi on täielikult eraldunud (märkus 2). Seejärel lastakse seebilahus võimalikult täielikult teise jaotuslehtrisse. Vee-alkoholi faasi ekstraheeritakse samal viisil veel kaks korda, kasutades selleks mõlemal korral 60–70 ml dietüüleetrit (punkt 4.10). Märkus 2: Võimalikku emulsiooni saab lõhkuda väikse koguse etanooli (punkt 4.11) lisamisega. 5.1.4. Etüüleetri kolm ekstrakti valatakse kokku ühte jaotuslehtrisse, milles on 50 ml vett. Jätkatakse pesemist veega (50 ml), kuni pesuvesi ei muutu enam roosaks, kui sellele lisatakse üks tilk fenoolftaleiini lahust (punkt 4.21). Kui pesuvesi on eemaldatud, filtritakse läbi veevaba naatriumsulfaadi (punkt 4.5) eelnevalt kaalutud 250 ml kolbi, lehtrit ja filtrit pestakse väikeste dietüüleetri (punkt 4.10) kogustega. 5.1.5. Lahusti eemaldatakse vaakumdestillatsiooniga rotaatoril 30 °C juures. Lisatakse 5 ml atsetooni ja kõrvaldatakse lenduv lahusti täielikult nõrga õhuvooluga. Jääki kuivatatakse kuivatuskapis temperatuuril 103 ± 2 °C juures 15 minutit. Jahutatakse eksikaatoris ja kaalutakse 0,1 mg täpsusega.

5.2. Steroolide ja triterpeendialkoholide (erütrodiool + uvaool) eraldamine 5.2.1. Aluseliste õhukese kihi kromatograafia plaatide valmistamine Silikageeliplaadid (punkt 4.6) kastetakse umbes 4 cm ulatuses 10 sekundiks 0,2 N kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusesse (punkt 4.5), lastakse kaks tundi tõmbekapis kuivada ning lõpuks asetatakse üheks tunniks kuivatuskappi temperatuurile 100 °C. Silikageeliplaadid võetakse kuivatuskapist välja ja hoitakse kuni kasutamiseni kaltsiumkloriidi kohal eksikaatoris (punkt 3.1.3; selliselt töödeldud plaatide kõlblikkusaeg on 15 päeva). Märkus 3: Kui aluselisi silikageeliplaate kasutatakse steroolifraktsiooni eraldamiseks, ei ole mitteseebistatavat fraktsiooni vaja alumiiniumoksiidiga töödelda. Selliselt jäävad kõik happelised ühendid (rasvhapped ja muud) lähtejoonele ja steroolivöönd eraldub selgelt alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide vööndist. 5.2.2. Heksaani-dietüüleetri segu (punkt 4.24) (märkus 4) pannakse ilmutusnõusse, nii et kihi sügavus oleks ligikaudu 1 cm. Nõu suletakse sobiva kaanega ning jäetakse umbes pooleks tunniks seisma jahedas kohas, et tekiks vedeliku ja auru tasakaal; ilmutuskambri siseseintele võib riputada filterpaberiribad, mis ulatuvad otsaga eluendi sisse. See vähendab ilmutusaega ligikaudu kolmandiku võrra ning komponentide elueerumine on ühtlasem ja korrapärasem. Märkus 4: ilmutussegu on iga katse puhul vaja asendada, et saavutada täielikult korratavad elueerimistingimused; alternatiivse lahustina võib kasutada n-heksaani-dietüüleetri segu 50:50 (maht/maht). 5.2.3. Valmistatakse seebistumatute ainete (punkt 5.1.5) ligikaudu 5 % lahus etüülatsetaadis (punkt 4.12) ja kantakse 100-mikroliitrise mikrosüstlaga 0,3 ml seda lahust kitsa ja ühtlase ribana kromatograafiaplaadile (punkt 5.2.1) alumisest servast 2 cm kõrgemale. Selle ribaga samale joonele kantakse 2–3 μl materjali võrdluslahust (4.13), et sterooli ja triterpeendialkoholide vööndit oleks võimalik pärast ilmutamist identifitseerida. 5.2.4. Plaat pannakse punkti 5.2.2 kohaselt ettevalmistatud ilmutusnõusse. Ruumitemperatuur tuleks hoida 15 ja 20 °C vahel (märkus 5). Ilmutusnõu suletakse kohe kaanega ning plaadil lastakse elueeruda, kuni lahusti jõuab umbes 1 cm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse ilmutusnõust välja ning lahusti aurustatakse kuuma õhu voolus või jättes selle lühikeseks ajaks tõmbekapi alla. Märkus 5: Kõrgem temperatuur võib eraldumist halvendada. 5.2.5. Plaadile pihustatakse kergelt ja ühtlaselt 2,7-diklorofluorestseiini lahust (punkt 4.14) ja lastakse kuivada. Kui plaati vaadeldakse ultraviolettvalguses, on steroolide ja triterpeenide vööndid võimalik ära tunda nende asukoha võrdlemisest võrdluslahuse (punkt 4.13) puhul saadud laikudega. Vööndite piirid märgitakse musta pliiatsiga mööda fluorestsentsi servi (vt joonis 3, õhukese kihi kromatograafia plaat). 5.2.6. Metallspaatliga kraabitakse märgistatud alalt maha silikageel. Eemaldamisel saadav hästi peenestatud materjal pannakse filterlehtrisse (punkt 3.7). Lisatakse 10 ml kuuma etüülatsetaati (punkt 4.12), segatakse hoolikalt metallspaatliga ja filtritakse vaakumiga, seejärel kogutakse filtraat filterlehtriga ühendatud koonilisse kolbi (punkt 3.8). Jääki pestakse kolm korda dietüüleetriga (punkt 4.3) (iga kord umbes 10 ml) ning filtraat kogutakse samasse lehtriga ühendatud kolbi; filtraat aurustatakse kokku ligikaudu 4–5 ml-ni; jääklahus kantakse eelnevalt kaalutud 10 ml katseklaasi (punkt 3.9), aurustatakse ettevaatliku soojendamisega nõrga lämmastikuvoolu all kuivaks, lahustatakse uuesti mõne tilga atsetooniga (punkt 4.8), aurustatakse uuesti kuivaks. Katseklaasis olev jääk koosneb steroolide ja triterpeendialkoholide fraktsioonist.

5.3. Trimetüülsilüüleetrite valmistamine. 5.3.1. Katseklaasi, mis sisaldab steroolide ja triterpeenide fraktsiooni, lisatakse silüülimisreaktiiv (punkt 4.25) (märkus 6) vahekorras 50 μl iga steroolide ja triterpeendialkoholide milligrammi kohta, vältides niiskuse neeldumist (märkus 7). Märkus 6: kasutusvalmis lahused on kaubanduslikult kättesaadavad. Müügil on ka muud silüülivad reagendid, näiteks bistrimetüülsilüültrifluoratsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaani, mida tuleb lahjendada sama mahu veevaba püridiiniga. Püridiini võib asendada sama koguse atsetonitriiliga. 5.3.2. Katseklaas suletakse korgiga, loksutatakse ettevaatlikult (ilma ümber pööramata), kuni ühendid on täielikult lahustunud. Lastakse toatemperatuuril seista vähemalt 15 minutit ning seejärel tsentrifuugitakse paar minutit. Selge lahus on valmis gaasikromatograafiliseks analüüsiks. Märkus 7: Tekkida võiv kerge opalestents on normaalne ja ei sega määramist. Valge helbe tekkimine või roosa värvuse ilmumine näitab niiskuse esinemist või reagendi riknemist. Kui see juhtub, tuleb katset korrata (ainult juhul, kui kasutatakse heksametüüldisilasaan/trimetüülklorosilaani).

5.4. Gaasikromatograafiline analüüs. 5.4.1. Ettevalmistused, kapillaarkolonni konditsioneerimine. 5.4.1.1. Gaasikromatograafi kolonni (punkt 3.11) algus ühendatakse jaotatud vooluga injektorseadmega ja lõpp detektoriga. Tehakse gaasikromatograafi üldine kontroll (lekked gaasiliidetes, detektori, jaotussüsteemi ja registreerimissüsteemi toimimine jne). 5.4.1.2. Kui kolonni kasutatakse esimest korda, soovitatakse see eelnevalt konditsioneerida: kolonni ennast voolutatakse nõrga gaasivooluga, siis lülitatakse sisse gaasikromatograafia plokk ja hakatakse järk-järgult tõstma temperatuuri, kuni see on vähemalt 20 üle töötemperatuuri (märkus 8). Seda temperatuuri hoitakse vähemalt kaks tundi, seejärel pannakse terve seade töörežiimi (gaasi juurdevoolu ja jaotuse reguleerimine, leegi süütamine, arvutussüsteemiga ühendamine, kolonni, detektori ja injektori temperatuuri kohandamine jne) ning signaali tundlikkus reguleeritakse vähemalt kaks korda suuremaks, kui analüüsi tegemiseks kavandatud. Nulljoon peab olema lineaarne, ilma igasuguste piikideta, ja see ei tohi triivida. Nulljoone sirge negatiivne triiv näitab, et kolonni ühendused lekivad; positiivne triiv näitab kolonni ebapiisavat konditsioneerimist. Märkus 8: Kolonni konditsioneerimisel on temperatuur kasutatava vedelfaasi maksimaalsest temperatuurist vähemalt 20 °C madalam. 5.4.2. Töötingimuste valimine 5.4.2.1. Töötingimused on järgmised: — kolonni temperatuur: 260 ± 5 °C; — injektori temperatuur: 280–300 °C; — detektori temperatuur: 280–300 °C; — kandegaasi lineaarkiirus: heelium 20–35 cm/s, vesinik 30-50 cm/s, — jaotussuhe: 1:50 kuni 1:100; — seadme tundlikkus: 4–16-kordne minimaalne sumbumine, — registreerimise tundlikkus: 1–2 mV täisskaala; — sissesüstitava aine kogus: 0,5 kuni 1 μl trimetüülsilüüleetrite lahust. Olenevalt kolonni ja gaasikromatograafi omadustest võib neid tingimusi muuta, nii et kromatogrammid vastaksid järgmistele nõuetele: — ß-sitosterooli piigi retentsiooniaeg peaks olema 20 ± 5 minutit; — kampesterooli piik peaks olema: oliiviõli puhul (keskmine sisaldus 3 %) 20 ± 5 % täisskaalast; sojaõli puhul (keskmine sisaldus 20 %) 80 ± 10 % täisskaalast; — kõik proovis sisalduvad steroolid peavad olema eraldatud. Lisaks sellele peavad piigid olema ka täielikult lahutunud, see tähendab, et isekirjutaja joon peab enne järgmise piigi saabumist minema tagasi nulljoonele. Puudulik lahutus on siiski lubatud tingimusel, et piiki suhtelise retentsiooniaja 1,02 juures (sitostanool) on võimalik mõõta risti. 5.4.3. Analüüsi käik 5.4.3.1. 10 μl mikrosüstlasse tõmmatakse 1 μl heksaani, seejärel 0,5 μl õhku ning lõpuks 0,5–1 μl proovilahust. Süstla kolbi tõmmatakse tagasi, nii et nõel oleks tühi. Nõel surutakse läbi injektorseadme membraani ning ühe või kahe sekundi pärast süstitakse kiiresti, seejärel tõmmatakse nõel umbes viie sekundi pärast aeglaselt välja. Võib kasutada ka automaatset injektorit. 5.4.3.2. Registreerimist jätkatakse, kuni kõik proovis sisalduvad triterpeendialkoholide trimetüülsilüüleetrid on täielikult elueeritud. Nulljoon peab kogu aeg vastama nõuetele (punkt 5.4.1.2). 5.4.4. Piikide määramine Piigid määratakse retentsiooniaja põhjal ning samadel tingimusel analüüsitud steroolide ja triterpeendialkoholide trimetüülsilüüleetrite segu piikidega võrdlemise teel. Steroolid ja triterpeendialkoholid väljuvad kolonnist järgmises järjekorras: kolesterool, brassikasterool, ergosterool, 24-metüleen-kolesterool, kampesterool, kampestanool, stigmasterool, Δ7-kampesterool, Δ5,23-stigmastadienool, klerosterool, ß-sitosterool, sitostanool, Δ5-avenasterool, Δ5,24-stigmastadienool, Δ7-stigmastenool, Δ7-avenasterool, erütrodiool ja uvaool. Sitosterooli retentsiooniajad kolonnide SE-52 ja SE-54 puhul on esitatud tabelis 1. Joonistel 1 ja 2 on näidatud mõnede õlide tüüpilised kromatogrammid. 5.4.5. Kvantitatiivne hindamine. 5.4.5.1. Arvutatakse α-kolestanooli ja sterooli ning triterpeendialkoholide piikide pindalad, kasutades arvutussüsteemi. Arvestamata jäetakse nende ühendite piigid, mida ei ole tabelis 1 loetletud (ergosterooli ei tohi arvestada). α-kolestanooli kalibreerimistegur võetakse võrdseks 1-ga. 5.4.5.2. Iga sterooli kontsentratsioon milligrammides kg rasvaine kohta arvutatakse järgmiselt: kus: Ax = sterooli x piigi pindala, arvutamissüsteemi ühikutes; As = α-kolestanooli piigi pindala, arvutamissüsteemi ühikutes; ms = lisatud α-kolestanooli mass milligrammides; m = määramisel kasutatud proovi mass grammides.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

6.1. Esitatakse iga sterooli kontsentratsioon milligrammides kg rasvaine kohta ning nende summa (steroolide üldsisaldus). Iga sterooli, erütrodiooli ja uvaooli sisaldus väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega. Steroolide summaarne sisaldus väljendatakse ilma komakohtadeta.

▼M28

6.2. Iga sterooli protsent arvutatakse vastava piigi pindala ja steroolide piikide kogupindala suhtena: kus: Ax = x'i piigi pindala; ΣA = steroolide piikide kogupindala.

▼M26

6.3. Näiline β-sitosterool: Δ5-23-stigmastadienool + klerosterool + β-sitosterool + sitostanool + Δ5-avenasterool + Δ5-24-stigmastadienool.

6.4. Arvutatakse erütrodiooli ja uvaooli protsendiline sisaldus: kus: ΣA = steroolide piikide kogupindala arvutamissüsteemi ühikutes; Er = erütrodiooli piigi pindala arvutamissüsteemi ühikutes; Uv = uvaooli piigi pindala arvutamissüsteemi ühikutes.









Liide

Gaasi lineaarse voolukiiruse määramine

Normaalsetel töötingimustel töötavasse gaasikromatograafi süstitakse 1–3 μl metaani (või propaani) ja mõõdetakse aeg, mis kulub gaasi voolamiseks läbi kolonni alates süstimisest kuni piigi ilmumiseni (tM).

Lineaarne voolukiirus cm/s on esitatud valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on mõõdetud aeg sekundites.







Tabel 1 Steroolide suhtelised retentsiooniajad Piik Identifitseerimisandmed Suhteline retentsiooni-aeg SE 54 kolonn SE 52 kolonn 1 Kolesterool Δ-5-kolesteen-3ß-ool 0,67 0,63 2 Kolestanool 5α-kolestaan-3ß-ool 0,68 0,64 3 Brassikasterool [24S]-24-metüül-Δ-5,22-kolestadieen-3ß-ool 0,73 0,71 * Ergosterool [24S]-24-metüül-Δ5-7-22 kolestatrieen-3β-ool 0,78 0,76 4 24-metüleen-kolesterool 24-metüleen-Δ-5,24-kolestadieen-3ß-oo1 0,82 0,80 5 Kampesterool (24R)-24-metüül-Δ-5-kolesteen-3ß-ool 0,83 0,81 6 Kampestanool (24R)-24-metüül-kolestaan-3ß-ool 0,85 0,82 7 Stigmasterool (24S)-24-etüül-Δ-5,22-kolestadieen-3ß-ool 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterool (24R)-24-metüül-Δ-7-kolesteen-3ß-ool 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienool (24R,S)-24-etüül-Δ-5,23-koIestadieen-3ß-ool 0,95 0,95 10 Klerosterool (24S)-24-etüül-Δ-5,25-kolestadieen-3ß-ool 0,96 0,96 11 ß-sitosterool (24R)-24-etüül-Δ-5-kolesteen-3ß-ool 1,00 1,00 12 Sitostanool 24-etüül-kolestaan-3ß-ool 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterool (24Z)-24-etülideen-Δ-kolesteen-3ß-ool 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienool (24R,S)-24-etüül-Δ-5,24-kolestadieen-3ß-ool 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenool (24R,S)-24-etüül-Δ-7-kolesteen-3ß-ool 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterool (24Z)-24-etülideen-Δ-7-kolesteen-3ß-ool 1,16 1,16 17 Erütrodiool 5α-oleaan-12een-3β28-diool 1,41 1,41 18 Uvaool Δ12-urseen-3β28-diool 1,52 1,52

Joonis 1

Lambiõli steroolide ja triterpeendialkoholide fraktsiooni gaasikromatogramm (lisatud on sisestandard)

Joonis 2

Rafineeritud oliiviõli steroolide ja triterpeendialkoholide fraktsiooni gaasikromatogramm (lisatud on sisestandard)

Joonis 3

Oliivijääkõli õhukese kihi kromatograafia plaat vööndiga, mis tuleb maha kraapida steroolide ja triterpeendialkoholide määramiseks

1 – skvaleen

2 – triterpeen ja alifaatsed alkoholid

3 – steroolid ja triterpeendialkoholid

4 – stardijoon ja vabad rasvhapped

▼M26 —————

▼M21









VII LISA

2-GLÜTSERÜÜLMONOPALMITAADI PROTSENDILISE SISALDUSE MÄÄRAMINE

1. EESMÄRK JA RAKENDAMISALA

Käesoleva meetodiga määratakse triglütseriidide 2. positsioonis oleva palmitiinhappe protsendilist sisaldust 2-glütserüülmonopalmitaadi hindamise abil.

Seda meetodit saab kasutada toatemperatuuril (20 °C) vedelate taimeõlide puhul.

2. PÕHIMÕTE

Pärast õliproovi ettevalmistamist lastakse proovil reageerida pankrease lipaasiga – toimub triglütseriidi molekuli spetsiifiline osaline hüdrolüüs 1. ja 3. positsioonis, mille tulemusena tekivad 2-monoglütseriidid. 2-glütserüülmonopalmitaadi sisaldus monoglütseriidi fraktsioonis määratakse pärast silaanimist kapillaarkolonn-gaasikromatograafia abil.

3. KASUTATAVAD SEADMED JA MATERJALID

3.1. 25milliliitrine Erlenmeyeri kolb

3.2. 100-, 250- ja 300milliliitrised keeduklaasid

3.3. Klaasist kromatograafiakolonn sisediameetriga 21–23 mm ja pikkusega 400 mm, mis on varustatud klaasfilterketta ja kraaniga

3.4. Gradueeritud 10-, 50-, 100- ja 200milliliitrised mõõtesilindrid

3.5. 100- ja 250milliliitrised ümarkolvid

3.6. Pöördaurusti

3.7. 10milliliitrised lihvkorgiga tsentrifuugitopsid, millel on kooniline põhi

3.8. Tsentrifuug tööks 10- ja 100milliliitriste tsentrifuugitopsidega

3.9. Termostaat, mis võimaldab hoida temperatuuri 40 ± 0,5 °C

3.10. Gradueeritud 1- ja 2milliliitrised pipetid

3.11. 1milliliitrine hüpodermiline süstal

3.12. 100mikroliitrine mikrosüstal

3.13. 1 000 milliliitrine jaotuslehter

3.14. Kapillaarkolonniga gaasikromatograaf, mis on varustatud süsteemiga, mis võimaldab proovi otse külmalt kolonni süstimist, ja ahjuga, mis hoiab soovitud temperatuuri 1 °C täpsusega

3.15. Külminjektor proovi viimiseks otse kolonni

3.16. Leekionisatsioondetektor ja elektromeeter

3.17. Koos elektromeetriga kasutatav integraatormeerik, mille reageerimisaeg on kuni 1 sekund ning mille paberi kiirust saab muuta

3.18. Klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn pikkusega 8–12 m ja sisediameetriga 0,25–0,32 mm, mis sobib tööks kuni 370 °C juures ja mis on seestpoolt kaetud 5 % metüülpolüsiloksaani või fenüül-metüülpolüsiloksaani kihiga, mille paksus on 0,10–0,30 μm

3.19. Vähemalt 7,5 cm pikkune 10mikroliitrine mikrosüstal otse kolonni süstimiseks, mille nõelal on tugevdatud pinnakiht

4. REAKTIIVID

4.1. Silikageel tera suurusega 0,063–0,200 mm (sõelaava 70–280), mis on ette valmistatud järgmisel viisil. Silikageel pannakse portselankaussi, kuivatatakse kuivatuskapis 160 °C juures 4 tundi, lastakse eksikaatoris jahtuda toatemperatuurini. Lisatakse vett koguses, mis vastab 5 % le silikageeli massist, tehes seda järgmisel viisil: 500milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi kaalutakse 152 g silikageeli ja lisatakse 8 g destilleeritud vett, suletakse korgiga ja segatakse ettevaatlikult, et tagada vee ühtlane jaotumine. Enne kasutamist lastakse seista vähemalt 12 tundi.

4.2. n-heksaan, kromatograafias kasutamiseks

4.3. Isopropanool

4.4. Isopropanooli vesilahus (mahusuhe 1:1)

4.5. Pankrease lipaas. Kasutatava lipaasi aktiivsus peab olema vahemikus 2,0–10 lipaasiühikut mg kohta (müügilolevate lipaaside aktiivsus on 2–10 ühikut ensüümi mg kohta)

4.6. Puhverlahus: 1 M tris-hüdroksümetüülaminometaani lahuse pH reguleeritakse potentsiomeetriga kontrollides väärtusele 8, lisades selleks kontsentreeritud soolhapet (mahusuhe 1:1)

4.7. Naatriumkolaat, ensüümikvaliteediga, 0,1 % vesilahus (lahus tuleb ära kasutada 15 päeva jooksul pärast valmistamist)

4.8. Kaltsiumkloriid, 22 % vesilahus

4.9. Dietüüleeter, kromatograafias kasutamiseks

4.10. Elueerimislahus: n-heksaani ja dietüüleetri segu (mahusuhe 87:13)

4.11. Naatriumhüdroksiid, 12massiprotsendiline lahus

4.12. Fenoolftaleiin, 1 % lahus etanoolis

4.13. Kandegaas: vesinik või heelium gaasikromatograafias kasutamiseks

4.14. Abigaasid: kuiv vesinik, vähemalt 99 % puhtusega, ei tohi sisaldada orgaanilisi aineid; õhk kromatograafias kasutamiseks, sama puhtusastmega

4.15. Silaanimisreaktiiv: püridiini, heksametüüldisilasaani ja trimetüülklorosilaani segu (mahusuhe 9:3:1). (Müügil on vastavad valmissegud. Kasutada võib ka muid silaanimisreaktiive, näiteks bistrimetüülsilüültrifluoroatsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaani, mis on lahustatud samas koguses veevabas püridiinis.)

4.16. Standardproovid: puhtad monoglütseriidid või proovile sarnaste mahusuhetega monoglütseriidide segud, mille teadaolevad mahusuhted on samad kui proovil.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Proovi ettevalmistamine

5.1.1. Õlisid, milles vabade hapete sisaldus on alla 3 %, ei ole vaja neutraliseerida enne kromatografeerimist silikageelkolonnis. Õlid, mille vabade hapete sisaldus on suurem kui 3 %, tuleb neutraliseerida vastavalt punktile 5.1.1.1. 5.1.1.1. 1 000 milliliitrisesse jaotuslehtrisse (3.13) kallatakse 50 g õli ja 200 ml n-heksaani. Lisatakse 100 ml isopropanooli ja selline kogus 12 % naatriumhüdroksiidi (4.11), mis on 5 % suurem kui vabade hapete kogus õlis. Loksutatakse tugevasti 1 minuti jooksul. Lisatakse 100 ml destilleeritud vett, loksutatakse uuesti ja lastakse seista. Pärast kihistumist eemaldatakse alumine kiht, mis sisaldab seepe. Eemaldatakse ka võimalikud vahepealsed kihid (lima ja mittelahustuvad ained). Neutraliseeritud õli lahust heksaanis pestakse järjestikuste 50–60milliliitriste isopropanooli vesilahuse (mahusuhe 1:1) (4.4) kogustega kuni fenoolftaleiini roosa värvuse kadumiseni. Vaakumdestilleerimisega (näiteks pöördaurusti abil) eemaldatakse suurem osa heksaanist ja õli kantakse üle 100milliliitrisesse ümarkolbi (3.5). Õli kuivatatakse vaakumis kuni lahusti täieliku eemaldamiseni. Selle toimingu tulemusena peab õli happelisus jääma alla 0,5 %.

5.1.2. 1,0 g eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud õli pannakse 25milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) ja lahustatakse 10 ml elueerimislahuses (4.10). Enne kromatografeerimist silikageelkolonnis lastakse lahusel vähemalt 15 minutit seista. Kui lahus on hägune, tsentrifuugitakse see, et luua optimaalsed tingimused kromatograafia jaoks. (On lubatud kasutada müügilolevaid valmis SPE silikageelipadruneid (500 mg)).

5.1.3. Kromatograafiakolonni valmistamine Kolonni (3.3) kallatakse ligikaudu 30 ml elueerimislahust (4.10), kolonni alumisse otsa viiakse klaaspulga abil vatitükk ja pressitakse seda õhu eemaldamiseks. Keeduklaasis valmistatakse suspensioon 25 g silikageelist (4.1) ja ligikaudu 80 ml elueerimislahusest; suspensioon kallatakse lehtri abil kolonni. Kontrollitakse, et kogu silikageel oleks viidud kolonni, loputatakse seda elueerimislahusega (4.10), avatakse kraan ja lastakse vedelikul voolata, kuni silikageeli kohale jääb ligikaudu 2 mm vedelikku.

5.1.4. Kolonnkromatograafia 25 milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) kaalutakse täpselt 1,0 g punkti 5.1 kohaselt ettevalmistatud proovi. Proov lahustatakse 10 ml elueerimislahuses (4.10). Lahus kantakse üle punkti 5.1.3 kohaselt valmistatud kromatograafiakolonni. Tuleb vältida kolonnitäidise pinna liigutamist. Avatakse kraan ja proovi lahusel lastakse välja voolata seni, kuni tase jõuab silikageeli tasemeni. Elueeritakse 150 ml elueerimislahusega. Elueerimislahust lisatakse kiirusega 2 ml/min (150 ml lisamine kolonni võtab aega ligikaudu 60–70 min). Eluaat kogutakse eelnevalt kaalutud 250milliliitrisesse ümarkolbi. Lahusti aurustatakse vaakumis, viimased lahusti jäljed eemaldatakse lämmastikuvoolus. Ümarkolb kaalutakse ja arvutatakse eraldatud aine kogus. (Juhul kui kasutatakse müügilolevaid valmis SPE silikageelipadruneid, toimitakse järgmiselt: 1 ml lahust (5.1.2) viiakse padrunitesse, mis on eelnevalt ette valmistatud 3 ml n-heksaaniga. Pärast lahuse nõrgumist kolonni elueeritakse 4 ml n-heksaani-dietüüleetri lahusega (mahusuhe 9:1). Eluaat kogutakse 10milliliitrisesse katseklaasi ja aurustatakse lämmastikuvoolus kuivaks. Kuivaine hüdrolüüsitakse pankrease lipaasiga (5.2). Oluline on kontrollida rasvainete sisaldust enne ja pärast SPE-padruni kasutamist).

5.2. Hüdrolüüs pankrease lipaasiga

5.2.1. Tsentrifuugitopsi kaalutakse 0,1 g punkti 5.1 kohaselt ettevalmistatud proovi. Lisatakse 2 ml puhverlahust (4.6), 0,5 ml naatriumkolaadi lahust (4.7) ja 0,2 ml kaltsiumkloriidi lahust; pärast iga lahuse lisamist segatakse hoolikalt. Tops suletakse lihvkorgiga ja asetatakse termostaati temperatuuriga 40 + 0,5 °C.

5.2.2. Lisatakse 20 mg lipaasi, segatakse hoolikalt (vältides korgi kokkupuutumist lahusega) ning asetatakse tops täpselt 2 minutiks termostaati, seejärel võetakse see termostaadist välja, loksutatakse tugevasti täpselt ühe minuti jooksul ning lastakse jahtuda.

5.2.3. Lisatakse 1 ml dietüüleetrit, suletakse tops korgiga ja loksutatakse tugevasti, seejärel segu tsentrifuugitakse ning eetrilahus kantakse mikrosüstla abil puhtasse ja kuiva topsi.

5.3. Silaanitud ühendite valmistamine ja gaasikromatograafia

5.3.1. Mikrosüstla abil viiakse 100 μl lahust (5.2.3) 10milliliitrisesse koonilise põhjaga topsi.

5.3.2. Lahusti eemaldatakse nõrga lämmastikuvoolu all, lisatakse 200 μl silaanimisreaktiivi (4.15), tops suletakse korgiga ja lastakse seista 20 minuti jooksul.

5.3.3. 20 minuti pärast lisatakse 1–5 ml n-heksaani (sõltuvalt kromatograafia läbiviimise tingimustest) – saadav lahus on valmis gaasikromatograafia läbiviimiseks.

5.4. Gaasikromatograafia

Töö põhitingimused on järgmised:

— injektori (on-column-injektor) temperatuur on madalam lahusti keemistemperatuurist (68 °C);

— detektori temperatuur: 350 °C;

— kolonni temperatuur: ahju temperatuuri muudetakse järgmise programmi kohaselt: 60 °C 1 minuti jooksul, temperatuuri tõstetakse 15 °C minutis kuni temperatuurini 180 °C, seejärel 5 °C minutis kuni temperatuurini 340 °C, 340 °C 13 minuti jooksul;

— kandegaas: vesinik või heelium, mille lineaarkiirust reguleeritakse nii, et saada joonisel 1 kujutatud lahutus; triglütseriidi C54 retentsiooniaeg peab olema 40 + 5 minutit (vt joonis 2); (Need töö põhitingimused on ligikaudsed. Töö teostaja peab neid soovitud tulemuste saamiseks kohandama. 2-glütserüülmonopalmitaadi piigi kõrgus peab olema vähemalt 10 % registreerimisseadme skaala ulatusest.);

— kolonni süstitava aine kogus on 0,5–1 μl n-heksaani lahust (5 ml) (5.3.3).

5.4.1. Piikide määramine

Piigid määratakse retentsiooniaja põhjal, võrdlusest samadel tingimusel analüüsitud monoglütseriidide standardsegude puhul saadud tulemustega.

5.4.2. Kvantitatiivne hindamine

Elektroonilise integraatori abil leitakse iga piigi pindala.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Glütserüülmonopalmitaadi protsendiline sisaldus arvutatakse vastava piigi pindala ja monoglütseriidide piikide kogupindala suhtena (vt joonis 2) vastavalt järgmisele valemile:

Gycéril monopalmitate (%):

kus:

Ax = glütserüülmonopalmitaadi piigi pindala;

ΣA = monoglütseriidide piikide kogupindala.

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

7. ANALÜÜSI PROTOKOLL

Analüüsi protokollis tuleb esitada järgmine teave:

— viide käesolevale meetodile;

— kogu teave, mis on vajalik proovi täielikuks identifitseerimiseks;

— analüüsi tulemus;

— kõik kõrvalekaldumised käesolevast meetodist, kas asjaomaste poolte kokkuleppe tõttu või muudel põhjustel;

— andmed laboratooriumi kohta, analüüsi läbiviimise kuupäev ja analüüsi läbiviimise eest vastutavate isikute allkirjad.

Joonis 1

Silaanimisreaktsiooni saaduste kromatogramm (rafineeritud oliiviõlile on lisatud 20 % täielikult esterdatud õli, segu on töödeldud lipaasiga ja reaktsioonisaadused on silaanitud)

Kirjad joonisel: Acides gras libres = vabad rasvhapped Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = rafineeritud oliiviõli + 20 % esterdatud õli 1–2 monopalmitoléine = 1–2 monopalmitoleiin 1–2 monopalmitine = 1–2 monopalmitiin 1–2 monoC18 insat. = 1–2 monoC18 küllastamata Squalene = skvaleen]

Joonis 2

Kromatogramm:

A) esterdamata oliiviõli pärast lipaasiga töötlemist; pärast silüülimist; kõnealuste tingimuste juures (kapillaarkolonni pikkus 8–12 m) elueeritakse vahafraktsioon samaaegselt diglütseriidi fraktsiooniga või veidi hiljem. Pärast lipaasiga töötlemist ei tohi triglütseriidide sisaldus ületada 15 %. Tähistused: 1 = vabad rasvhapped 2 = monoglütseriidid 3 = diglütseriidid 4 = triglütseriidid * = 2-monopalmitiin ** = triglütseriid C54

Kromatogramm:

B) esterdatud õli pärast lipaasiga töötlemist; pärast silaanimist; kõnealuste tingimuste juures (kapillaarkolonni pikkus 8–12 m) elueeritakse vahafraktsioon samaaegselt diglütseriidi fraktsiooniga või veidi hiljem. Pärast lipaasiga töötlemist ei tohi triglütseriidide sisaldus ületada 15 %. Tähistused: 1 = vabad rasvhapped 2 = monoglütseriidid 3 = diglütseriidid 4 = triglütseriidid * = 2-monopalmitiin ** = triglütseriid C54

8. MÄRKUSED

LIPAASI VALMISTAMINE

Müügil on rahuldava aktiivsusega lipaase. Lipaasi saab valmistada ka laboris järgmisel viisil:

5 kg värsket seapankreast jahutatakse temperatuurini 0 °C. Eemaldatakse tahke rasvkude ja seda ümbritsev sidekude ning pankreas peenestatakse lõikenugadega peenestajas kuni ühtlase vedela massi saamiseni. Saadud massi segatakse 4–6 tunni jooksul 2,5 liitri veevaba atsetooniga, seejärel tsentrifuugitakse. Saadud jääki ekstraheeritakse veel kolm korda sama koguse veevaba atsetooniga, seejärel kaks korda sama koguse atsetooni/dietüüleetri seguga (mahusuhe 1:1) ning veel kaks korda dietüüleetriga.

Saadud jääki kuivatatakse 48 tunni jooksul vaakumis; tulemusena saadakse stabiilne pulber, mida on võimalik külmkapis kuivas pikemaajaliselt hoida.

LIPAASI AKTIIVSUSE KONTROLLIMINE

Valmistatakse oliiviõli emulsioon järgmisel viisil:

Mikseris segatakse 10 minuti jooksul järgmist segu: 165 ml kummiaraabiku lahust kontsentratsiooniga 100 g/l, 15 g purustatud jääd ja 20 ml eelnevalt neutraliseeritud oliiviõli.

50milliliitrisesse keeduklaasi viiakse 10 ml saadud emulsiooni, seejärel 0,3 ml naatriumkolaadi lahust kontsentratsiooniga 0,2 g/ml ja 20 ml destilleeritud vett.

Keeduklaas asetatakse termostaati temperatuuriga 37 °C, lahusesse viiakse pH-meetri elektroodid ja spiraalsegaja.

Büreti abil lisatakse tilkhaaval naatriumhüdroksiidi 0,1 N lahust, kuni pH saavutab väärtuse 8,3.

Lisatakse teatav kogus lipaasi suspensiooni vees (0,1 g/ml lipaasi). Kui pH-meeter näitab pH väärtust 8,3, käivitatakse stopper ja hakatakse tilkhaaval lisama naatriumhüdroksiidi lahust sellise kiirusega, et hoida pH-d väärtusel 8,3. Iga minuti möödudes märgitakse üles selleks kulunud lahuse kogus.

Andmed kantakse graafikule, võttes abstsissteljeks ajatelje ja kandes ordinaatteljele 0,1 N leelise lahuse kogused milliliitrites, mis on kulunud pH väärtuse hoidmiseks konstantsena. Graafik peab olema lineaarne.

Lipaasi aktiivsus, mida väljendatakse lipaasi ühikutes mg kohta, arvutatakse järgmise valemi abil:

kus:

A aktiivsus lipaasi ühikutes mg kohta;

V 0,1 N naatriumhüdroksiidi lahuse kulu milliliitrites minuti kohta (arvutatud graafiku alusel);

N naatriumhüdroksiidi lahuse normaalsus;

m prooviks võetud lipaasi mass, mg.

Lipaasi ühik on määratletud kui ensüümi kogus, mis vabastab 10 mikroekvivalenti hapet ühe minuti jooksul.

▼M20 —————

▼M28









IX LISA

SPEKTROFOTOMEETRILINE ANALÜÜS ULTRAVIOLETTPIIRKONNAS

EESSÕNA

Spektrofotomeetriline analüüs ultraviolettpiirkonnas võib anda teavet rasva kvaliteedi, säilivusseisundi ja tehnoloogilistest protsessidest tulenenud muutuste kohta. Käesolevas meetodis osutatud lainepikkustel esinev neeldumine on tingitud konjugeeritud dieen- ja trieensüsteemide olemasolust olenevalt oksüdeerumisprotsessist ja/või rafineerimisviisist. Valguse neeldumine väljendatakse eriekstinktsioonina

(1-protsendilise (w/v) rasvalahuse ekstinktsioon teatavas lahustis 10 mm läbimõõduga küvetis), mida tavaliselt tähistatakse K-ga ja nimetatakse ka ekstinktsioonikoefitsiendiks.

1. KOHALDAMISALA

Käesolevas lisas kirjeldatakse oliiviõli spektrofotomeetrilist analüüsi ultraviolettpiirkonnas.

2. MEETODI PÕHIMÕTE

Proov lahustatakse ettenähtud lahustis ja lahuse neeldumist mõõdetakse teatavatel lainepikkustel, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit.

Arvutatakse eriekstinktsioon 232 nm ja 268 nm juures isooktaanis või 232 nm ja 270 nm juures tsükloheksaanis kontsentratsioonil 1 % (mass/maht) küvetis läbimõõduga 10 mm.

3. SEADMED

3.1. Spektrofotomeeter, mis sobib mõõtmiseks ultraviolettkiirguse lainepikkustel (220–360 nm) ja mis võimaldab tulemusi lugeda ühe nanomeetri täpsusega. Neeldumise ja lainepikkuse skaala täpsust ja korratavust ning hajuvat valgust soovitatakse korrapäraselt kontrollida. 3.1.1. Lainepikkuse skaala. Selle kontrollimiseks võib kasutada võrdlusmaterjali, milleks on optilisest klaasist filter, mis sisaldab holmiumoksiidi, või holmiumoksiidi lahus (kinnijoodetud ampullis või lahtiselt), millel on selged neeldumisribad. Võrdlusmaterjal on ette nähtud selliste nähtava ja ultraviolettvalguse spektrofotomeetrite lainepikkuse skaala kontrollimiseks ja kaliibrimiseks, mille spektririba nimilaius on 5 nm või väiksem. Vastavalt viitematerjalides lisatud juhenditele tehakse mõõtmised lainepikkuse vahemikus 640–240 nm, kasutades võrdluseks õhku. Tehakse nulljoone parandi leidmise katse iga pilulaiuse juures; selleks jäetakse valguskiire tee tühjaks. Standardlainepikkused on loetletud võrdlusmaterjali sertifikaadis. 3.1.2. Neelduvuse skaala. Kontrollimiseks võib kasutada müügilolevat kinnijoodetud ampullis võrdlusmaterjali, milleks on kaaliumdikromaadi lahused (neli kaaliumdikromaadi lahust perkloorhappes, mis on pandud nelja UV-piirkonnas töötamiseks ettenähtud kvartsküvetti; küvetid on suletud ja nendega mõõdetakse UV-piirkonnas skaala lineaarsust ja määramise fotomeetrilist täpsust), mis on teataval kontsentratsiooniastmel ja sertifikaadile vastava neeldumisväärtusega selle maksimaalsel lainepikkusel (λmax). Mõõdetakse kaaliumdikromaadi lahuseid, võrreldes tühikatsega (tühikatseks on kasutatav happelahus), ja võetakse arvesse nulljoone parandit, nagu on kirjeldatud juhendites, mis on lisatud võrdlusmaterjalile. Neelduvuse väärtused on loetletud võrdlusmaterjali sertifikaadis. Muud võimalused fotoelemendi ja fotokordisti tulemuste kontrollimiseks on järgmised: 1 000 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,2000 g puhast kaaliumkromaati, see lahustatakse 0,05 N kaaliumhüdroksiidi lahuses ning täidetakse kuni 1 000 ml märgini. Seejärel võetakse 25 ml saadud lahust, kantakse 500 ml mõõtekolbi ning täidetakse sama kaaliumhüdroksiidi lahusega märgini. Saadud lahuse ekstinktsioon mõõdetakse 275 nm juures, kasutades võrdluslahusena kaaliumhüdroksiidi lahust. 1 cm küvetiga mõõtmisel peaks ekstinktsioon olema 0,200 ± 0,005.

3.2. 10 mm optilise teepikkusega risttahukakujulised korgiga kvartsküvetid, mis sobivad mõõtmiseks ultraviolettkiirguse lainepikkusel (220–360 nm). Vee või mõne muu sobiva lahustiga täidetuna ei tohiks küvettide tulemuste erinevus olla suurem kui 0,01 ekstinktsiooniühikut.

3.3. Sama kaubamärgi alla kuuluvad A-klassi mõõtekolvid mahuga 25 ml.

3.4. Analüütiline kaal, millelt saab andmeid lugeda täpsusega 0,0001 g.

4. REAGENDID

Kui ei ole öeldud teisiti, kasutatakse analüüsi käigus ainult tunnustatud analüütiliselt puhtaid reagente ja demineraliseeritud või destilleeritud või samaväärse puhtusastmega vett.

Lahusti: isooktaan (2,2,4-trimetüülpentaan) mõõtmiseks 232 nm ja 268 nm juures või tsükloheksaan mõõtmiseks 232 nm ja 270 nm juures, mille neelduvus 10 mm küvetis 232 nm juures on väiksem kui 0,12 ja neelduvus 270 nm juures destilleeritud vee puhul mõõtmisel on väiksem kui 0,05.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Proov peab olema täiesti homogeenne ja hõljuvate lisanditeta. Kui see nii ei ole, tuleb proov filtreerida läbi paberi temperatuuril ligikaudu 30 °C.

5.2. 25 ml mõõtekolbi kaalutakse ligikaudu 0,25 g (täpsusega 1 mg) eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud proovi, täidetakse ettenähtud lahustiga kuni märgini ning homogeenitakse. Tekkiv lahus peab olema täiesti selge. Opalestsentsi või hägususe korral tuleb proov kiiresti läbi paberi filtreerida. MÄRKUS: üldiselt on kaal 0,25–0,30 g piisav neitsioliiviõli ja ekstra-neitsioliiviõli neelduvuse mõõtmiseks 268 nm ja 270 nm juures. Mõõtmiseks 232 nm juures on proovi nõutav kaal üldiselt 0,05 g, seega valmistatakse tavaliselt ette kaks eri lahust. Oliivijääkõli, rafineeritud oliiviõli ja võltsitud oliiviõli neelduvuse mõõtmiseks on nende suurema neeldumise tõttu vaja üldjuhul väiksemat proovi (kaaluga 0,1 g).

5.3. Vajaduse korral korrigeeritakse nulljoont (220–290 nm) lahustiga mõlemas kvartsküvetis (proov ja võrdlusmaterjal), seejärel täidetakse proovi kvartsküvett testlahusega ja mõõdetakse ekstinktsioonid vahemikus 232, 268 või 270 nm, võttes võrdluseks kasutatud lahusti. Registreeritud ekstinktsiooniväärtused peavad jääma vahemikku 0,1–0,8 või spektrofotomeetri lineaarsusvahemikku, mida tuleks kontrollida. Vastasel korral tuleb mõõtmisi korrata ja kasutada vajaduse korral vähem või rohkem lahjendatud lahuseid.

5.4. Pärast neelduvuse mõõtmist lainepikkusel 268 või 270 nm mõõdetakse neelduvus λmax, λmax + 4 ja λmax – 4. Neelduvuse väärtusi kasutatakse selleks, et määrata kindlaks eriekstinktsiooni variatsioon (ΔΚ). MÄRKUS: lahustina kasutatava isooktaani neelduvus (λmax) peab olema 268 nm ja tsükloheksaani neelduvus 270 nm.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

6.1. Registreeritakse eriekstinktsioonid (ekstinktsioonikoefitsiendid) eri lainepikkustel, mis arvutatakse järgmise võrrandi alusel: kus: Kλ on eriekstinktsioon lainepikkusel λ; Eλ on ekstinktsioon lainepikkusel λ; c on lahuse kontsentratsioon g/100 ml; s on kvartsküveti teepikkus sentimeetrites; väljendatud kahe kümnendkoha täpsusega.

6.2. Eriekstinktsiooni (ΔΚ) variatsioon Ekstinktsiooni (ΔΚ) absoluutväärtuse variatsioon on esitatud olukorras, kus Km on eriekstinktsioon maksimaalse neeldumise lainepikkusel 270 nm ja 268 nm, sõltuvalt kasutatud lahustist, väljendatud kahe kümnendkoha täpsusega.









X LISA

RASVHAPETE METÜÜLESTRITE GAASIKROMATOGRAAFILINE MÄÄRAMINE

1. KOHALDAMISALA

Käesolevas lisas antakse juhised, kuidas määrata gaasikromatograafiliselt vabu ja seotud rasvhappeid taimses rasvas ja õlis pärast nende teisendamist rasvhapete metüülestriteks (FAME).

Triatsüülglütseroolide (TAG) seotud rasvhapped ning sõltuvalt esterdusmeetodist vabad rasvhapped (FFA) teisendatakse rasvhapete metüülestriteks, mis määratakse kapillaarkolonnkromatograafiaga.

Käesolevas lisas kirjeldatud meetod võimaldab määrata rasvhapete metüülestreid vahemikus C12–C24, sealhulgas küllastunud, cis- ja trans-monoküllastumata ning cis- ja trans-polüküllastumata rasvhapete metüülestrid.

2. PÕHIMÕTE

Gaasikromatograafiat kasutatakse rasvhapete metüülestrite kvantitatiivseks analüüsiks. Rasvhapete metüülestrid valmistatakse vastavalt A osale. Seejärel süstitakse need gaasikromatograafi ja aurustatakse injektoris. Rasvhapete metüülestrid eraldatakse konkreetse polaarsuse ja pikkusega analüüsikolonnide abil. Rasvhapete metüülestrite kindlaksmääramiseks kasutatakse leekionisatsioonidetektorit. Analüüsi tingimused on esitatud B osas.

Rasvhapete metüülestrite kindlaksmääramisel leekionisatsioonidetektoris kasutatav kandegaas (liikuv faas) võib olla vesinik või heelium. Vesinik kiirendab eraldamist ja annab teravamad piigid. Statsionaarne faas on mikroskoopiliselt õhuke kiht tihedat vedelikku kvartsklaasist inertsel tahkel pinnal.

Kapillaarkolonni läbimisel analüüsitakse lenduvate ühendite ja kolonni sisepinda katva statsionaarse faasi omavahelist suhet. Eri ühendite erineva koosmõju tõttu on nende elueerumisaeg erinev ning seda nimetatakse ühendi peetumisajaks konkreetsetel analüüsiparameetritel. Eri ühendid identifitseeritakse peetumisaegade võrdlemise teel.

A OSA

RASVHAPETE METÜÜLESTRITE VALMISTAMINE OLIIVIÕLIST JA OLIIVIJÄÄKÕLIST

1. RAKENDUSALA

Käesolevas osas esitatakse üksikasjalikult rasvhapete metüülestrite valmistamisviis. Osa sisaldab meetodeid rasvhapete metüülestrite valmistamiseks oliiviõlist ja oliivijääkõlist.

2. KOHALDAMISALA

Rasvhapete metüülestrite valmistamiseks oliiviõlist ja oliivijääkõlist ümberesterdatakse kaaliumhüdroksiid metanoolilahusega toatemperatuuril. Vajadus proovi enne ümberesterdamist puhastada sõltub proovi vabade rasvhapete sisaldusest ja kindlaksmääratavatest analüütilistest parameetritest, vajaduse üle võib otsustada vastavalt järgmisele tabelile:







Õli kategooria Meetod Neitsioliiviõli happesusega ≤ 2,0 % 1. Rasvhapped 2. Trans-rasvhapped 3. ΔECN42 (pärast puhastamist tahkefaasekstraktsiooni meetodil SPE silikageeliga) Rafineeritud oliiviõli Rafineeritud õlist ja neitsioliiviõlist koosnev oliiviõli Rafineeritud oliivijääkõli Oliivijääkõli Neitsioliiviõli happesusega > 2,0 % Töötlemata oliivijääkõli 1. Rasvhapped (pärast puhastamist SPE silikageeliga) 2. Rasvhapped (pärast puhastamist SPE silikageeliga) 3. ΔECN42 (pärast puhastamist SPE silikageeliga)

3. METOODIKA

3.1. Ümberesterdus kaaliumhüdroksiidi metanoolilahusega toatemperatuuril

3.1.1. Põhimõte

Metüülestrid tekivad ümberesterdusel kaaliumhüdroksiidi lahusega metanoolis, estrite teke on vaheetapp enne seebistumist.

3.1.2. Reagendid

3.1.2.1. Metanool, mille veesisaldus on kuni 0,5 massiprotsenti.

3.1.2.2. Heksaan, kromatograafias kasutamiseks.

3.1.2.3. Heptaan, kromatograafias kasutamiseks.

3.1.2.4. Dietüüleeter, analüüsiks stabiliseeritud.

3.1.2.5. Atsetoon, kromatograafias kasutamiseks.

3.1.2.6. Elueerimislahusti õli puhastamiseks kolonnkromatograafia/SPE-kromatograafia abil: heksaani ja etüüleetri segu komponentide suhtega 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Kaaliumhüdroksiid, ligikaudu 2M metanoolilahus: 100 ml metanoolis lahustatakse 11,2 g kaaliumhüdroksiidi.

3.1.2.8. Silikageelpadrunid, 1 g (6 ml), tahkefaasekstraktsiooni jaoks.

3.1.3. Seadmed

3.1.3.1. Keeratava korgiga 5 ml katseklaasid, mille korgid on varustatud teflontihendiga.

3.1.3.2. Mõõtpipetid või automaatpipetid, 2 ml ja 0,2 ml.

3.1.4. Õliproovide puhastamine

Vajaduse korral puhastatakse proove õli juhtimisega läbi tahkefaasiekstraktsiooni silikageeli padruni. Silikageeli padrun (3.1.2.8) pannakse vaakumvoolutusseadmesse ja pestakse 6 ml heksaaniga (3.1.2.2); pesemine toimub ilma vaakumita. Seejärel kantakse õlilahus (ligikaudu 0,12 g) 0,5 ml heksaanis (3.1.2.2) kolonnile. Lahus imetakse kolonni sisse ja eludeeritakse siis vaakumit kasutades 10 ml heksaani-dietüüleetri seguga vahekorras 87:13 mahuosa (3.1.2.6). Ühendatud eluaadid homogeniseeritakse ja jagatakse võrdselt kaheks. Üks alikvoot aurutatakse rotaatoril vaakumis toatemperatuuril kuivaks. Jääk lahustatakse 1 ml heptaanis ja saadakse valmis lahus rasvhapete määramiseks gaasikromatograafia meetodil. Teine alikvoot aurutatakse kuivaks ja jääk lahustatakse 1 ml atsetoonis triglütseriidide määramiseks HPLC abil, kui see on vajalik.

3.1.5. Töö käik

5 ml keeratava korgiga katseklaasis (3.1.3.1) kaalutakse umbes 0,1 g õliproovi. Lisatakse 2 ml heptaani (3.1.2.2) ja loksutatakse. Lisatakse 0,2 ml kaaliumhüdroksiidi lahust metanoolis (3.1.2.7), suletakse teflontihendiga varustatud keeratava korgiga, keeratakse kork tugevasti kinni ja loksutatakse tugevalt 30 sekundit. Jäetakse kihistuma, kuni ülemine lahus muutub selgeks. Ülemine, metüülestreid sisaldav kiht kallatakse pealt ära. Heptaanilahus on valmis gaasikromatograafi süstimiseks. Kuni gaasikromatograafilise analüüsi tegemiseni soovitatakse lahust hoida külmkapis. Lahust ei ole soovitatav hoida kauem kui 12 tundi.

B OSA

RASVHAPETE METÜÜLESTRITE GAASIKROMATOGRAAFILINE ANALÜÜS

1. RAKENDUSALA

Käesolevas osas antakse üldjuhised kapillaarkolonnkromatograafia kohaldamiseks A osas kehtestatud meetodil saadud rasvhapete metüülestrite segu kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise kindlakstegemisel.

Käesolevat osa ei kohaldata polümeriseeritud rasvhapete suhtes.

2. REAGENDID

2.1. Kandegaas

Inertgaas (heelium või vesinik), põhjalikult kuivatatud ja hapnikusisaldusega kuni 10 mg/kg.

Märkus 1: vesinik võib analüüsi kiirust kahekordistada, kuid on ohtlik. Saadaval on ohutusseadmed.

2.2. Abigaasid

2.2.1. Vesinik (puhtus ≥ 99,9 %), orgaaniliste lisanditeta.

2.2.2. Õhk või hapnik, orgaaniliste lisanditeta.

2.2.3. Lämmastik (puhtus > 99 %).

2.3. Võrdlusstandard

Puhaste rasvhapete metüülestrite segu või teadaoleva, eelistatult analüüsitava rasvainega samaväärse koostisega rasva metüülestrid. Oktadekeenhappe, oktadekadieenhappe ja oktadekatrieenhappe metüülestrite cis- ja trans-isomeerid aitavad kindlaks teha küllastumata hapete trans-isomeere.

Tuleks tagada, et polüküllastumata rasvhapped ei oksüdeeruks.

3. SEADMED

Käesolevad juhendid hõlmavad tavapäraseid gaasikromatograafia seadmeid, kus kasutatakse kapillaarkolonne ja leekionisatsioonidetektorit.

3.1. Gaasikromatograaf

Gaasikromatograaf koosneb järgmistest osadest.

3.1.1. Injektorseade

Kasutada tuleb kapillaarkolonnidega injektorseadet, mis peab olema spetsiaalselt ette nähtud selliste kolonnide kasutamiseks. See võib olla jaotatud või jaotamata vooluga injektor.

3.1.2. Ahi

Kapillaarkolonni peab olema võimalik ahjus kuumutada vähemalt temperatuurini 260 °C ning ahi peab soovitud temperatuuri hoidma 0,1 °C täpsusega. Viimane nõue on eriti oluline juhul, kui kasutatakse kvartsklaasist kolonni.

Temperatuuriregulaatoriga kuumutamine on kõikidel juhtudel soovitav, eelkõige rasvhapete puhul, millel on vähem kui 16 süsinikuaatomit.

3.1.3. Kapillaarkolonn

3.1.3.1. Katseklaas, mis on valmistatud analüüsitava ainega inertsest materjalist (tavaliselt klaas või kvartsklaas). Sisediameeter on 0,20–0,32 mm. Sisekülge tuleb enne statsionaarse faasi kihiga katmist nõuetekohaselt töödelda (nt pinna ettevalmistamine, inaktiveerimine). Pikkus 60 m on rasvhapete ja rasvhapete trans-isomeeride jaoks piisav.

3.1.3.2. Statsionaarne faas, sobivad polaar-polüsiloksaani (tsüanopropüülsilikoon) seotud (võrkstruktuuriga) kolonnid. Märkus 2: polaar-polüsiloksaanid võivad raskendada linoleenhappe ja C20 hapete identifitseerimist ja eraldamist. Kiht peab olema õhuke, st 0,1–0,2 μm.

3.1.3.3. Kolonni monteerimine ja tasakaalustamine Järgitakse kapillaarkolonnide tavapäraseid ettevaatusabinõusid: kolonni asetus ahjus (tugirajatised), liitekohtade valik ja paigaldus (lekkekindlus), kolonni otste asetus injektoris ja detektoris (võimalikult vähe tühja ruumi). Läbi kolonni juhitakse kandegaas (nt 0,3 baari (30 kPa) läbi 25 m pikkuse ja 0,3 mm sisediameetriga kolonni). Kolonn tasakaalustatakse ahju reguleerides selliselt, et temperatuur tõuseb ümbritseva õhu temperatuurilt 3 °C minutis, saavutades sellise temperatuuri, mis on 10 °C madalam kui statsionaarse faasi hajumistemperatuur. Ahju hoitakse sellisel temperatuuril tund aega, kuni nulljoon stabiliseerub. Temperatuuri alandatakse taas tagasi 180 °C-le ja katset jätkatakse isotermilistel tingimustel. Märkus 3: nõuetekohaselt tasakaalustatud kolonnid on kaubandusvõrgus müügil.

3.1.4. Leekionisatsioondetektor ja muundurvõimendi

3.2. Süstal

Süstla ülemine mõõtepiir on 10 μl ning mõõtskaala on jagatud 0,1-mikroliitristeks ühikuteks.

3.3. Andmekogumissüsteem

Andmekogumissüsteem on internetipõhiselt ühendatud detektoritega ja seda kasutatakse piikide integreerimiseks ja normaliseerimiseks sobiva tarkvaraprogrammiga.

4. TÖÖ KÄIK

Punktides 4.1–4.3 kirjeldatud toimingud eeldavad leekionisatsioonidetektori kasutamist.

4.1. Katsetingimused

4.1.1. Kapillaarkolonni jaoks vajalike optimaalsete töötingimuste valik

Kapillaarkolonni tõhusus- ja täituvusomadused tingivad selle, et koostisosade eraldamine ja analüüsi kestus sõltuvad suuresti kandegaasi voolukiirusest kolonnis. Seetõttu on vaja töötingimusi optimeerida, muutes seda parameetrit (ehk lihtsalt kolonnipead vähendades) sõltuvalt sellest, kas soovitakse tõhustada eraldamist või kiirendada analüüsi.

Rasvhapete metüülestrite (C4–C26) eraldamiseks on osutunud sobivaks järgmised tingimused. Kromatogrammide näidised on esitatud B liites.







Injektori temperatuur: 250 °C Detektori temperatuur: 250 °C Ahju temperatuur: 165 °C (8 min) kuni 210 °C temperatuuri tõusuga 2 °C/min Kandegaas vesinik: kolonnipea rõhk: 179 kPa Koguvool: 154,0 ml/min; Jaotatud voolu suhe: 1:100 Sissesüstitav ruumala: 1 μl

4.1.2. Resolutsiooni määramine (vt A liide)

Kahe külgneva piigi (I ja II) resolutsioon (R) arvutatakse järgmise valemi abil:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) või R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (USA farmakopöa)

või

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Jaapani farmakopöa), EP (Euroopa farmakopöa), BP (Briti farmakopöa))

kus:

d r(I) I piigi peetumisdistants;

d r(II) II piigi peetumisdistants;

t r(I) I piigi peetumisaeg;

t r(II) II piigi peetumisaeg;

ω(I) I piigi laius nulljoonel;

ω(II) II piigi laius nulljoonel;

ω0,5 konkreetse ühendi piigi laius, piigi poolel kõrgusel;

kui ω(I) ≈ ω(II), arvutatakse R järgmiste valemite abil:

R = (dr ( II ) – d r(I))/ω = (dr ( II ) – d r(I))/4σ

kus:

σ on standardhälve (vt A liide joonis 1).

Kui kahe piigi vaheline distants d r(II) – d r(I) võrdub 4σ, siis resolutsioonfaktor R = 1.

Kui kaks piiki ei ole täiesti eraldi, lõikuvad kahe piigi käänupunkti tõmmatud puutujad punktis C. Selleks et kahte piiki täielikult eraldada, peab kahe piigi vaheline kaugus olema järgmine:

d r(II) – d r(I) = 6 σ millest R = 1,5 (vt A liide joonis 3).

5. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

5.1. Kvalitatiivne analüüs

B liite joonise 1 kohase kromatogrammiga saadud proovi metüülestripiigid määratakse vajaduse korral interpolatsiooni abil või nende võrdlemise teel punktis 2.3 osutatud metüülestrite võrdlussegude piikidega.

5.2. Kvantitatiivne analüüs

5.2.1. Koostise määramine

Arvutada järgmisel viisil üksikute rasvhapete metüülestrite massiosa wi väljendatuna metüülestrite massiprotsendina.

5.2.2. Arvutusmeetod

5.2.2.1. Üldiselt

Teatava komponendi i sisaldus väljendatuna metüülestrite massiprotsendina arvutatakse selliselt, et määratakse piigipindala suhteline osa kõikide piikide pindalast järgmise valemi alusel.

wi = (Ai/ΣA) × 100

kus:

Ai on üksikute rasvhapete metüülestrite i piigipindala;

ΣA on kõikide üksikute rasvhapete metüülestrite piigipindalade summa.

Tulemused väljendatakse kahe kümnendkoha täpsusega.

Märkus 4: rasvade ja õlide puhul võrdub rasvhapete metüülestrite massiosa triatsüülglütseroolide massiosaga grammides 100 g kohta. Kui seda üldistust ei saa kohaldada, vt punkti 5.2.2.2.

5.2.2.2. Parandustegurite kasutamine

Teatavatel juhtudel, näiteks kui rasvhapetes on vähem kui kaheksa süsinikuaatomit või kui happes on sekundaarsed rühmad, tuleks piigipindalad korrigeerida kindla parandusteguriga (Fci). Parandustegur tuleb iga üksikjuhu puhul kindlaks määrata. Selleks tuleks kasutada sobivaid võrdlusmaterjale, mille vastavate vahemike rasvhapete koostis on sertifitseeritud.

Märkus 5: need parandustegurid ei ole samad mis teoreetilised leekionisatsioonidetektori parandustegurid, mis on esitatud A liites, vaid hõlmavad ka injektorseadme toimimist jne. Suuremate erinevuste esinemisel tuleb siiski kontrollida kogu süsteemi toimimist.

Selle võrdlussegu puhul määratakse rasvhapete metüülestrite massiprotsent i järgmise valemiga:

wi = (mi /Σm) × 100

kus:

m i on rasvhapete metüülestrite mass i võrdlussegus;

Σm on erinevate komponentide üldmass kui rasvhapete metüülestrite võrdlussegu.

Võrdlussegu kromatogrammi alusel arvutatakse rasvhapete metüülestrite pindala protsent i järgmiselt:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kus:

Ai on rasvhapete metüülestrite pindala i võrdlussegus;

ΣA on kõikide rasvhapete metüülestrite pindalade summa võrdlussegus.

Parandustegur Fc on seega

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Proovi iga rasvhappe metüülestri massiprotsent i on:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Tulemused väljendatakse kahe kümnendkoha täpsusega.

Märkus 6: arvutatud väärtus vastab iga üksiku rasvhappe massiprotsendile, mis on arvutatud kui triatsüülglütseroolid 100 grammi rasva kohta.

5.2.2.3. Sisestandardi kasutamine

Teatavate analüüside puhul (nt kui kõikide rasvhapete määr ei ole teada, juhul kui nelja ja kuue süsinikuaatomiga hapete kõrval esinevad ka 16 ja 18 süsinikuaatomiga happed, või kui on vaja määrata proovis olevate rasvhapete absoluutsumma) on vaja kasutada sisestandardit. Sageli kasutatakse 5, 15 või 17 süsinikuaatomiga rasvhappeid. Tuleks kindlaks määrata sisestandardi parandustegur (juhul kui see on vajalik).

Komponendi i massiprotsent väljendatuna metüülestritena arvutatakse valemiga:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

kus:

A i on rasvhapete metüülestrite pindala i;

A IS on sisestandardi pindala;

F i on rasvhapete parandustegur i, väljendatud rasvhapete metüülestritena;

F IS on sisestandardi parandustegur;

m on katsekoguse mass milligrammides;

m IS sisestandardi mass milligrammides.

Tulemused väljendatakse kahe kümnendkoha täpsusega.

6. KATSEARUANNE

Katsearuandesse märgitakse metüülestrite valmistamisel ja gaasikromatograafilisel analüüsimisel kasutatud meetodid. Selles märgitakse samuti kõik üksikasjad, mida ei ole nimetatud käesolevas standardmeetodis või mis on valikulised, samuti üksikasjad tulemust mõjutada võinud asjaolude kohta.

Katsearuandes peavad olema kõik proov