1978L0633 — ET — 20.12.1983 — 002.001

Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest

►B KAHEKSAS KOMISJONI DIREKTIIV, 15. juuni 1978, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (78/633/EMÜ) (EÜT L 206, 29.7.1978, p.43)

Muudetud:









▼B

KAHEKSAS KOMISJONI DIREKTIIV,

15. juuni 1978,

millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks

(78/633/EMÜ)







EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 20. juuli 1970. aasta direktiivi 70/373/EMÜ söötade ametlikuks kontrollimiseks ettenähtud ühenduse proovivõtmis- ja analüüsimeetodite kehtestamise kohta, ( 1 ) viimati muudetud ühinemisaktiga, eriti selle artiklit 2, ning arvestades, et: ning arvestades, et: kõnealuses direktiivis on ette nähtud, et söötade ametlik kontrollimine söötade kvaliteeti ja koostist reguleerivate õigus- ja haldusnormide nõuetele vastavuse kindlakstegemiseks peab toimuma ühenduse proovivõtmis- ja analüüsimeetodite abil; komisjoni 15. juuni 1971. aasta direktiiviga 71/250/EMÜ, ( 2 )18. novembri 1971. aasta direktiiviga 71/393/EMÜ, ( 3 )27. aprilli 1972. aasta direktiiviga 72/199/EMÜ, ( 4 )5. detsembri 1972. aasta direktiiviga 73/46/EMÜ, ( 5 )25. märtsi 1974. aasta direktiiviga 74/203/EMÜ, ( 6 )20. detsembri 1974. aasta direktiiviga 75/84/EMÜ ( 7 ) ja 1. märtsi 1976. aasta direktiiviga 76/372/EMÜ ( 8 ) on juba kehtestatud mitmed ühenduse analüüsimeetodid; võttes arvesse edusamme pärast kõnealuste direktiivide vastuvõtmist tehtud töös, on soovitatav võtta vastu kaheksas rühm meetodeid; käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise söödakomitee arvamusega, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:







Artikkel 1

1. Liikmesriigid nõuavad, et söötade ametlikuks kontrolliks ettenähtud analüüsid tsinkbatsitratsiini, flavofosfolipooli, raua, vase, mangaani ja tsingi sisalduse määramiseks tehakse käesoleva direktiivi lisas kirjeldatud meetodite kohaselt.

▼M1 —————

▼B

Artikkel 2

Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid 1. jaanuariks 1979. Nad teatavad sellest viivitamata komisjonile.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.









LISA

▼M2

1. TSINKBATSITRATSIINI MÄÄRAMINE

— agarsöötmel difusiooni teel —

1. EESMÄRK JA KASUTUSALA

Käesolev meetod on tsinkbatsitratsiini määramiseks söötades ja eelsegudes. Määramise alampiir on 5 mg/kg (5 miljondikku) ( 9 ).

2. PÕHIMÕTE

Proovi ekstraheeritakse pH 2 juures metanooli, vee ja soolhappe seguga, millele lisatakse naatriumsulfiidi lahust. Naatriumsulfiidi lisatakse selleks, et sadestada lahustuvad vasesoolad, mis võivad määramist segada. Ekstrakti pH viiakse 6,5 peale, kontsentreeritakse (vajaduse korral) ja lahjendatakse. Ekstrakti antibiootilise aktiivsuse määramiseks mõõdetakse tsinkbatsitratsiini difusiooni agarsöötmes, millesse on inokuleeritud bakterit Micrococcus luteus (flavus). Difusiooni näitab mikroorganismi kasvu inhibeerimise tsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõt loetakse võrdeliseks antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga kasutatud kontsentratsioonide vahemikus.

3. MIKROORGANISM: MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS) ATCC 10240

3.1. Tüvikultuuri säilitamine

Längagari söötmele (4.1) katseklaasis külvatakse bakterit Micrococcus luteus (flavus) ning inkubeeritakse 24 tundi 30 °C juures. Kultuuri hoitakse külmkapis temperatuuril umbes 4 °C. Külvamist korratakse iga kahe nädala tagant.

3.2. Bakterisuspensiooni valmistamine ( 10 )

Hiljuti valmistatud längagarilt (3.1) kogutakse kasv 2-3 ml naatriumkloriidi lahuse (4.3) abil. Seda suspensiooni kasutatakse Roux’ pudelis oleva 250 ml söötme (4.1) inokuleerimiseks. Inkubeeritakse 18-20 tundi temperatuuril 30 °C. Kasv kogutakse 25 ml naatriumkloriidi lahusesse (4.3) ning segatakse. Suspensioon lahjendatakse vahekorras 1: 10 naatriumkloriidi lahusega (4.3). Suspensiooni läbilaskvus peab olema ligikaudu 75 %, mõõdetuna lainepikkusel 650 nm 1-sentimeetrises küvetis naatriumkloriidi lahuse (4.3) suhtes. See suspensioon säilib temperatuuril 4 °C ühe nädala.

4. SÖÖTMED JA REAKTIIVID

4.1. Sööde ( 11 )







Lihapeptoon 6,0 g Trüptoon 4,0 g Pärmiekstrakt 3,0 g Lihaekstrakt 1,5 g Glükoos 1,0 g Agar 10,0-20,0 g Vesi 1 000 ml pH 6,5-6,6 (pärast steriliseerimist).

4.2. Määramissööde (11)







Trüptoon 10,0 g Pärmiekstrakt 3,0 g Lihaekstrakt 1,5 g Glükoos 1,0 g Agar 10,0-20,0 g Tween 80 1 ml Vesi 1 000 ml pH 6,5 (pärast steriliseerimist).

4.3. 0,8(massi/mahu)protsendiline naatriumkloriidi lahus: 8 g naatriumkloriidi lahustatakse vees ja lahjendatakse 1 000 milliliitrini; steriliseeritakse.

4.4. Metanooli, vee ja soolhappe (4.6) segu: mahuvahekorras 80/17,5/2,5.

4.5. Fosfaatpuhver, pH 6,5:



Dikaaliumvesinikfosfaat, K2HPO4 22,15 g Kaaliumdivesinikfosfaat, KH2PO4 27,85 g Vesi 1 000 ml-ni

4.6. Soolhape (tihedus: 1,18-1,19).

4.7. Soolhape (0,1M).

4.8. Naatriumhüdroksiidi 1M lahus.

4.9. Naatriumsulfiidi umbes 0,5M lahus.

4.10. Broomkresoolpurpuri lahus 0,04(massi/mahu)protsenti: 0,1 g broomkresoolpurpurit lahustatakse 18,5 ml 0,01M naatriumhüdroksiidi lahuses. Täiendatakse veega 250 ml-ni ja segatakse.

4.11. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega (rahvusvahelistes ühikutes, RÜ) tsinkbatsitratsiin.

5. STANDARDLAHUSED:

Kaalutakse selline kogus standardainet tsinkbatsitratsiini (4.11), et see sisaldaks 1 050 RÜ (näidatud aktiivsuse järgi). Lisatakse 5 ml 0,1M soolhapet (4.7) ning lastakse 15 minutit seista. Lisatakse 30 ml vett, fosfaatpuhvri (4.5) abil (kulub umbes 4 ml) viiakse pH 4,5 peale, täiendatakse veega 50 milliliitrini ja segatakse hoolikalt (1 ml = 21 RÜ).

Kõnealusest lahusest valmistatakse fosfaatpuhvriga (4.5) järjest lahjendades järgmised lahused:







s8 0,42 RÜ/ml s4 0,21 RÜ/ml s2 0,105 RÜ/ml s1 0,0525 RÜ/ml

6. EKSTRAKTI JA MÄÄRAMISLAHUSTE VALMISTAMINE

6.1. Ekstraheerimine

6.1.1. Eelsegud ja mineraalsöödad

Kaalutakse 2,0-5,0 g proovi, lisatakse 29,0 ml segu (4.4) ja 1,0 ml naatriumsulfiidi lahust (4.9) ning loksutatakse lühikest aega. Kontrollitakse, et pH oleks ligikaudu 2. Loksutatakse 10 minutit, lisatakse 30 ml fosfaatpuhvrit (4.5) ning loksutatakse 15 minutit ja tsentrifuugitakse. Võetakse sobiv alikvootne osa supernatantlahust ja viiakse 1M naatriumhüdroksiidi lahusega (4.8) pH 6,5ni, kasutades pH-meetrit või indikaatorina broomkresoolpurpuri lahust (4.10). Lahjendatakse fosfaatpuhvriga (4.5), et saada tsinkbatsitratsiini eeldatavaks sisalduseks 0,42 RÜ/ml (= u8).

6.1.2. Valgukontsentraadid

Kaalutakse 10,0 g proovi, lisatakse 49,0 ml segu (4.4) ja 1,0 ml naatriumsulfiidi lahust (4.9) ning loksutatakse lühikest aega. Kontrollitakse, et pH oleks ligikaudu 2. Loksutatakse 10 minutit. Lisatakse 50 ml fosfaatpuhvrit (4.5), loksutatakse 15 minutit ja tsentrifuugitakse. Võetakse sobiv kogus supernatantlahust ja viiakse 1M naatriumhüdroksiidi lahusega (4.8) pH 6,5ni, kasutades pH-meetrit või indikaatorina broomkresoolpurpuri lahust (4.10). Aurutatakse rootoraurutis umbes poole mahuni temperatuuril kuni 35 °C.

Lahjendatakse fosfaatpuhvriga (4.5), et saada tsinkbatsitratsiini eeldatavaks sisalduseks 0,42 RÜ/ml (= u8).

6.1.3. Muud söödad

Kaalutakse 10,0 g proovi (20,0 g proovi, kui tsinkbatsitratsiini eeldatav sisaldus on 5 mg/kg). Lisatakse 24,0 ml segu (4.4) ja 1,0 ml naatriumsulfiidi lahust (4.9) ning homogeniseeritakse 10 minutit. Lisatakse 25 ml fosfaatpuhvrit (4.5), loksutatakse 15 minutit ja tsentrifuugitakse. Võetakse 20 ml supernatantlahust ja viiakse 1M naatriumhüdroksiidi lahusega (4.8) pH 6,5ni, kasutades pH-meetrit või indikaatorina broomkresoolpurpuri lahust (4.10). Aurutatakse rootoraurutis umbes 4 ml-ni temperatuuril kuni 35 °C. Jääki lahjendatakse fosfaatpuhvriga (4.5), et saada tsinkbatsitratsiini eeldatavaks sisalduseks 0,42 RÜ/ml (= u8).

6.2. Määramislahused

Lahusest u8 valmistatakse fosfaatpuhvriga (4.5) järjest lahjendades (1: 1) lahused u4 (eeldatav sisaldus 0,21 RÜ/ml), u2 (eeldatav sisaldus 0,105 RÜ/ml) ja u1 (eeldatav sisaldus 0,0525 RÜ/ml).

7. MÄÄRAMISE KÄIK

7.1. Määramissöötme inokuleerimine

Määramissöötmesse (4.2) inokuleeritakse bakterisuspensioon (3.2) temperatuuril umbes 50 °C. Söötme (4.2) plaatidel tehtavate eelkatsetega määratakse kindlaks bakterisuspensiooni kogus, mis on vajalik suurimate ja selgeimate inhibeerimistsoonide saamiseks tsinkbatsitratsiini eri kontsentratsioonide juures.

7.2. Plaatide ettevalmistamine

Difusiooni läbi agari uuritakse plaatidel standardlahuse nelja kontsentratsiooni juures (s8, s4, s2 ja s1) ja määramislahuse nelja kontsentratsiooni juures (u8, u4, u2 ja u1). Need neli ekstrakti ja standardlahuse kontsentratsiooni tuleb tingimata panna igale plaadile. Selleks valitakse plaadid, mis on piisavalt suured, et agarsöötmesse saaks teha vähemalt kaheksa auku läbimõõduga 10-13 mm, mille keskpunktid on üksteisest vähemalt 30 mm kaugusel. Katse võib viia läbi plaatidel, mis koosnevad klaasitahvlist, millele on pandud sileda küljega alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm.

Plaatidele valatakse teatav kogus söödet (4.2), mis on inokuleeritud vastavalt punktile 7.1, nii et tekiks ligikaudu 2 mm paksune kiht (200 millimeetrise läbimõõduga plaadi puhul 60 ml). Söötmel lastakse horisontaalasendis tarduda, tardunud söötmesse tehakse augud ning pannakse nendesse täpselt mõõdetud määramis- ja standardlahuste kogused (0,10-0,15 ml augu kohta, sõltuvalt läbimõõdust). Igal kontsentratsioonil tehakse vähemalt neli katset, nii et iga määramine põhineks vähemalt 32 inhibeerimistsooni hindamisel.

7.3. Inkubeerimine

Plaate inkubeeritakse 30 ± 2 °C juures 16-18 tundi.

8. HINDAMINE

Inhibeerimistsoonide läbimõõt mõõdetakse 0,1 mm täpsusega. Iga kontsentratsiooni jaoks saadud keskmised väärtused kantakse poollogaritmilisele millimeetripaberile, et leida kontsentratsiooni logaritmi ja inhibeerimistsooni läbimõõdu vaheline seos. Nii standardlahuse kui ekstrakti puhul tõmmatakse läbi punktide “kõige sobivamad” jooned, näiteks nagu on kirjeldatud allpool:

Standardlahuse madalaima kontsentratsiooni (SL) jaoks määratakse “kõige sobivam” punkt, kasutades järgmist valemit:

a)

Standardlahuse kõrgeima kontsentratsiooni (SH) jaoks määratakse “kõige sobivam” punkt, kasutades järgmist valemit:

b)

Samamoodi arvutatakse “kõige sobivamad” punktid ekstrakti madalaima kontsentratsiooni (UL) ja ekstrakti kõrgeima kontsentratsiooni (UH) jaoks, asendades s1, s2, s4 ja s8 eespool toodud valemites väärtustega u1, u2, u4 ja u8.

Arvutatud SL ja SH väärtused märgitakse samale millimeetripaberile ja nende ühendamisel saadakse standardlahuse “kõige sobivam” joon. Samamoodi märgitakse graafikule UL ja UH ning nende ühendamisel saadakse ekstrakti “kõige sobivam” joon.

Segavate mõjude puudumisel peaksid saadud jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni lugeda paralleelseks, kui väärtused (SH–SL) ja (UH–UL) ei erine rohkem kui 10 % võrra nende keskväärtusest.

Kui jooned ei ole paralleelsed, siis võib visata välja kas u1 ja s1 või u8 ja s8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH järgmiste valemite abil, et saada alternatiivsed “kõige sobivamad” jooned:







(a′) SL = or (b′) SH = or

ning samamoodi UL ja UH puhul. Need peaksid vastama samadele paralleelsuse kriteeriumidele. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme kontsentratsiooni põhjal, tuleb märkida lõpp-protokolli.

Kui jooned loetakse paralleelseks, siis arvutatakse suhtelise aktiivsuse (A) logaritm (log A) ühe alljärgneva valemi abil sõltuvalt sellest, kas paralleelsuse hindamiseks on kasutatud kolme või nelja kontsentratsiooni.

Nelja kontsentratsiooni puhul:

c)

Kolme kontsentratsiooni puhul:

d)

või

(d ′ )

Proovi ekstrakti aktiivsus = vastava standardi aktiivsus × A

(u8 = s8 × A)

Kui suhteline aktiivsus jääb väljapoole vahemikku 0,5-2,0, siis korratakse määramist, kohandades vastavalt vajadusele ekstrakti kontsentratsiooni või, kui see ei ole võimalik, standardlahuste kontsentratsiooni. Kui suhtelist aktiivsust ei ole võimalik reguleerida nõutud vahemikku, siis tuleb kõiki saadud tulemusi käsitada ligikaudsetena ning see tuleb märkida lõpp-protokolli.

Kui jooni ei saa lugeda paralleelseks, siis korratakse määramist. Kui ka siis ei saada paralleelseid jooni, siis tuleb määramine lugeda mitterahuldavaks.

Tulemus väljendatakse tsinkbatsitratsiini milligrammides sööda kilogrammi kohta.

9. KORRATAVUS

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

— absoluutväärtusena väljendatult 2 mg/kg, kui tsinkbatsitratsiini sisaldus on kuni 10 mg/kg,

— 20 % suurimast väärtusest, kui tsinkbatsitratsiini sisaldus on 10-25 mg/kg,

— absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui tsinkbatsitratsiini sisaldus on 25-50 mg/kg;

— 10 % suurimast väärtusest, kui tsinkbatsitratsiini sisaldus on suurem kui 50 mg/kg.

▼B

2. FLAVOFOSFOLIPOOLI MÄÄRAMINE AGARSÖÖTMEL DIFUSIOONI TEEL

1. EESMÄRK JA RAKENDUSALA

Käesolev meetod on flavofosfolipooli määramiseks söötades, kontsentraatides ja eelsegudes. Alumine määramispiir on 1 mg/kg (1 miljondik).

2. PÕHIMÕTE

Proov ekstraheeritakse lahjendatud metanoolis püstjahutiga kolvis kuumutades. Pärast tsentrifuugimist ekstrakt puhastatakse (vajaduse korral), töödeldes seda ioonivahetusvaikudega, ning lahjendatakse. Antibiootilise aktiivsuse määramiseks mõõdetakse flavofosfolipooli difusioon Staphylococcus aureus’ega nakatatud agarsöötmel. Difusiooni näitab mikroorganismi inhibitsioonitsoonide tekkimine. Nende tsoonide läbimõõtu käsitatakse otseselt võrdelisena antibiootikumi kontsentratsiooni logaritmiga kasutatud antibiootikumikontsentratsioonide vahemikus.

3. MIKROORGANISM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1. Tüvikultuuri säilitamine

Längagari sööde (4.1) nakatatakse Staphylococcus aureus’ega. Inkubeeritakse 24 tundi 37 °C juures, hoitakse külmikus umbes 4 °C juures ning längagar nakatatakse uuesti iga kuu.

3.2. Baktersuspensiooni valmistamine ( 12 )

Kaks katseklaasi tüvikultuuriga (3.1) asetatakse kõrvale ning neid nakatatakse iga nädal uuesti. Inkubeeritakse 24 tundi 37 °C juures, hoitakse külmikus umbes 4 °C juures

24 tundi enne analüüsi nakatatakse kõnealuse kasvuga kaks kuni neli söödet sisaldavat längagariga (4.1) katseklaasi. Inkubeeritakse 16–18 tundi 37 °C juures. Naatriumkloriidi lahuses (4.3) valmistatakse kasvu suspensioon. Suspensiooni valguse läbilaskvus peab olema ligikaudu 40 % naatriumkloriidi lahuse läbilaskvusest, mõõdetuna lainepikkusel 578 nm 1sentimeetrises küvetis (4.3).

4. SÖÖTMED JA REAKTIIVID

4.1. Sööde ( 13 )







Lihapeptoon 6,0 g Trüptoon 4,0 g Pärmiekstrakt 3,0 g Lihaekstrakt 1,5 g Glükoos 1,0 g Agar 15,0 g Vesi 1 000 ml pH 6,5 (pärast steriliseerimist)

4.2. Analüüsi sööde

4.2.1. Aluskiht ( 14 )







Lihapeptoon 6,0 g Pärmiekstrakt 3,0 g Lihaekstrakt 1,5 g Agar 10,0 g Vesi 1 000 ml pH 6,5 (pärast steriliseerimist)

4.2.2. Külvikiht

Punkti 4.1 korral lisatakse 2,0 g vahutamisvastast silikoonemulsiooni ( 15 ).

4.3. 0,4(massi/mahu)protsendiline naatriumkloriidi lahus: 4 g analüütiliselt puhast naatriumkloriidi lahustatakse vees ja lahjendatakse 1 000 milliliitrini; steriliseeritakse.

4.4. Puhas metanool.

4.5. 50(mahu)protsendiline metanool: 500 ml metanooli (4.4) lahjendatakse 500 ml veega.

4.6. 80(mahu)protsendiline metanool: 800 ml metanooli (4.4) lahjendatakse 200 ml veega.

4.7. Analüütiliselt puhas tris(hüdroksümetüül)aminometaan.

4.8. 1,5(massi/mahu)protsendiline kaaliumkloriidi metanoolilahus: 1,5 g analüütiliselt puhast kaaliumkloriidi lahustatakse 20 ml vees, täiendatakse metanooliga (4.4) 100 ml lahuse saamiseni.

4.9. Kationiit: Dowex 50 W × 8, 20 kuni 50 mešši, Na-vorm (kat. Serva nr 41600) või samaväärne.

4.10. Anioniit: Dowex 1 × 2, 50 kuni 100 mešši, Cl-vorm (kat. Serva nr 41010) või samaväärne. Enne kasutamist hoida 12–14 tundi 80protsendilises metanoolis (4.6).

4.11. Klaasvill.

4.12. pH indikaatorpaber (pH 6,6–8,1).

4.13. Askorbiinhape.

4.14. Standardaine: teadaoleva aktiivsusega flavofosfolipool.

5. VAHENDID

5.1. Klaastoru kromatograafia jaoks, siseläbimõõt 9 mm, pikkus 150–200 mm, korkkraaniga alumise otsa kitsenenud osas ja lihvühendusega (lehtriga (5.2) ühendamiseks) ülemises osas.

5.2. Korkkraaniga ja lihvühendusega 250 ml lehter.

5.3. Lihvühendusega 250 ml Erlenmeyeri kolb.

5.4. Lihvühendusega püstjahuti.

6. STANDARDLAHUSED

Standardaine (4.14) täpne kaalutis lahustatakse 50protsendilises metanoolis (4.5) ja lahjendatakse, kuni saadakse põhilahus, mis sisaldab 100 μg flavofosfolipooli milliliitri kohta. See lahus säilib suletud kolvis 4 °C juures kuni kaks kuud.

Kõnealusest põhilahusest valmistatakse 50protsendilise metanooliga (4.5) järjest lahjendades järgmised lahused:







S8 0,2 μg/ml S4 0,1 μg/ml S2 0,05 μg/ml S1 0,025 μg/ml

7. EKSTRAKTI VALMISTAMINE

7.1. Ekstraheerimine

7.1.1. Kontsentraadid, eelsegud ja mineraalsöödad

Võetakse proovi 2,0–5,0 g kaalutis, lisatakse ligikaudu 150 mg askorbiinhapet (4.13). Homogeniseeritakse 150 ml 50protsendilise metanooliga (4.5) Erlenmeyeri kolvis (5.3) ning pH tase reguleeritakse 8,1–8,2ni umbes 400 mg tris(hüdroksümetüül)aminometaaniga (4.7). Indikaatorpaberiga (4.12) kontrollitakse pH taset. Lastakse seista 15 minutit, siis reguleeritakse uuesti tris(hüdroksümetüül)aminometaaniga (4.7) pH tasemeni 8,1–8,2 ning keedetakse 10 minutit püstjahutiga kolvis (5.4) pidevalt segades. Lastakse jahtuda, segu tsentrifuugitakse ja ekstrakt dekanteeritakse.

7.1.2. Muud söödad

Võetakse proovi 5,0–30,0 g kaalutis, mis sisaldab vähemalt 30 μg flavofosfolipooli. Homogeniseeritakse 150 ml 50protsendilise metanooliga (4.5) Erlenmeyeri kolvis (5.3) ning reguleeritakse pH tasemeni 8,1–8,2 umbes 400 mg tris(hüdroksümetüül)aminometaaniga (4.7). Indikaatorpaberiga (4.12) kontrollitakse pH taset. Lastakse seista 15 minutit, siis reguleeritakse uuesti tris(hüdroksümetüül)aminometaaniga (4.7) pH tasemeni 8,1–8,2 ning keedetakse 10 minutit püstjahuti all (5.4) pidevalt segades. Lastakse jahtuda, segu tsentrifuugitakse ja ekstrakt dekanteeritakse.

7.2. Puhastamine (selle etapi võib kontsentraatide, eelsegude ja mineraalsöötade korral ära jätta)

110 ml ekstrakti segatakse 11 g kationiidiga (4.9), keedetakse pidevalt segades üks minut püstjahuti all (5.4). Kationiit eraldatakse tsentrifuugimise või filtreerimisega. 100 ml ekstrakti segatakse 150 ml metanooliga (4.4) ning lahust hoitakse 12–15 tundi 4 °C juures. Helbeline mass filtreeritakse külmana.

Klaasvilla tropp (4.11) asetatakse klaastoru (5.1) alumisse otsa, torusse valatakse 5 ml anioniiti (4.10) ning kolonn pestakse 100 ml 80protsendilise metanooliga (4.6). Lehtrit (5.2) kasutades pannakse kolonni vähemalt 100 ml filtraati, mis eeldatavasti sisaldab 16 μg flavofosfolipooli (200 ml 30 g söödaproovi kohta 1 miljondikuna). Vajaduse korral lahjendatakse filtraati enne kolonni panemist 80protsendilise metanooliga (4.6), et saada soovitud flavofosfolipooli sisaldus 16 μg/100 ml. Voolukiirus reguleeritakse 2 ml/min. Väljavoolanud vedelik visatakse ära. Seejärel pestakse kolonni 50 ml 80protsendilise metanooliga (4.6) ning väljavoolanud vedelik visatakse ära.

Flavofosfolipool elueeritakse kaaliumkloriidi (4.8) metanoolilahusega voolukiirusel 2 ml/min. 50 ml eluaati kogutakse mõõtekolbi, lisatakse 30 ml vett ning segatakse. Saadud lahuse flavofosfolipooli sisaldus peaks olema 0,2 μg/ml (= U8).

7.3. Testlahused

Vajaduse korral (nt kui puhastamine on ära jäetud) lahjendatakse saadud ekstrakti 50protsendilise metanooliga (4.5) vastavalt punktile 7.1.1, et saada soovitud flavofosfolipooli sisaldus 0,2 μg/ml (= U8).

Lahusest U8 valmistatakse lahused U4 (eeldatav sisaldus 0,1 μg/ml), U2 (eeldatav sisaldus 0,05 μg/ml) ja U1 (eeldatav sisaldus 0,025 μg/ml) 50protsendilise metanooliga (4.5) järjest lahjendades (1 : 1).

8. ANALÜÜSI KÄIK

8.1. Analüüsi söötme nakatamine

Analüüsi sööde (4.2.2) nakatatakse baktersuspensiooniga (3.2) ligikaudu 50 °C juures. Analüüsi söötmega (4.2.2) plaatidel määratakse eelkatsete abil kindlaks baktersuspensiooni kogus, mis on vajalik suurimate ja selgeimate inhibitsioonitsoonide saamiseks flavofosfolipooli eri kontsentratsioonide juures (ligikaudu 30 ml/l).

8.2. Plaatide ettevalmistamine

Difusioon agaril viiakse läbi plaatidel nelja kontsentratsiooniga standardlahusega (S8, S4, S2 ja S1) ja nelja kontsentratsiooniga testlahusega (U8, U4, U2 ja U1). Need neli ekstrakti ja standardlahust tuleb tingimata panna igale plaadile. Selleks valitakse plaadid, mis on piisavalt suured, et agarsöötmesse oleks võimalik teha vähemalt kaheksa üksteisest vähemalt 30 mm kaugusel asetsevat auku läbimõõduga 10–13 mm. Katse võib läbi viia plaatidel, mis koosnevad klaaslehest, millele on pandud alumiinium- või plastikrõngas läbimõõduga 200 mm ja kõrgusega 20 mm.

Plaatidele valatakse teatav kogus söödet (4.2.1), nii et tekiks ligikaudu 1,5 mm paksune kiht (45 ml 200 mm läbimõõduga plaadi puhul). Söötmel lastakse tasanduda ning seejärel valatakse üle teatava koguse söötmega (4.2.2), mida on nakatatud vastavalt punktile 8.1, nii et tekiks 1 mm paksune kiht (30 ml 200 mm läbimõõduga plaadi puhul). Söötmel lastakse tasanduda, tehakse sellesse augud ning pannakse nendesse täpselt mõõdetud test- ja standardlahuste kogused (0,10–0,15 ml augu kohta, sõltuvalt läbimõõdust).

Iga kontsentratsiooni kasutatakse vähemalt neli korda, et iga määramisega oleks võimalik hinnata 32 inhibitsioonitsooni.

8.3. Inkubeerimine

Plaate inkubeeritakse 28–30 °C juures 16–18 tundi.

9. HINDAMINE

Inhibitsioonitsoonide läbimõõt mõõdetakse 0,1 mm täpsusega. Iga kontsentratsiooni puhul leitakse keskmised väärtused poollogaritmilisel millimeetripaberil, kus oleks näha kontsentratsioonide logaritmi ja inhibitsioonitsoonide läbimõõdu vaheline seos. Nii standardlahuse kui ekstrakti jaoks visandatakse “kõige sobivamad” jooned, näiteks nagu on kirjeldatud allpool.

Standardlahuse madalaima taseme (SL) jaoks määratakse “kõige sobivam” punkt, kasutades järgmist valemit:

a)

b)

Samamoodi arvutatakse “kõige sobivamad” punktid ekstrakti madalaima taseme (UL) ja ekstrakti kõrgeima taseme (UH) jaoks, asendades S1, S2, S4 ja S8 eespool toodud valemis U1, U2, U4 ja U8-ga.

Arvutatud SL ja SH väärtused märgitakse samale millimeetripaberile ja nende ühendamisel saadakse standardlahuse “kõige sobivam” joon. Samamoodi märgitakse UL ja UH ning nende ühendamisel saadakse ekstrakti “kõige sobivam” joon.

Segavate mõjude puudumisel peaksid saadud jooned olema paralleelsed. Praktiliselt võib jooni käsitada paralleelsetena, kui väärtused (SH–SL) ja (UH–UL) ei erine võrra oma keskmisest väärtusest rohkem kui 10 %.

Kui jooned ei ole paralleelsed, võib ära jätta kas U1 ja S1 või U8 ja S8 ning arvutada SL, SH, UL ja UH järgmiste valemite abil, et saada alternatiivsed “kõige sobivamad” jooned:

a’) või või

b’) või või

ning samamoodi UL ja UH puhul. Sarnaselt eespool kirjeldatule tuleb kontrollida alternatiivsete “kõige sobivamate” joonte paralleelsust. Asjaolu, et tulemus on arvutatud kolme kontsentratsiooni põhjal, tuleb märkida lõpparuandesse.

Kui jooni käsitatakse paralleelsetena, arvutatakse suhtelise aktiivsuse logaritm (log A) ühe järgmise valemi abil.

Nelja kontsentratsiooni puhul:

c)

Kolme kontsentratsiooni puhul:

d)

või

d’)

Tegelik aktiivsus = oletatav aktiivsus × suhteline aktiivsus.

Kui jooni ei saa käsitada paralleelsetena, korratakse määramist. Kui ka siis ei saada paralleelseid jooni, arvutatakse valemiga c suhtelise aktiivsuse logaritm (log A). Saadud tulemust tuleb siiski käsitada ligikaudsena ning see tuleks märkida lõpparuandesse.

10. KORRATAVUS

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

absoluutväärtusena väljendatult 0,5 mg/kg, kui flavofosfolipooli sisaldus on 1–2 mg/kg;

25 % suurimast väärtusest, kui flavofosfolipooli sisaldus on suurem kui 2 ja kuni 10 mg/kg;

20 % suurimast väärtusest, kui flavofosfolipooli sisaldus on suurem kui 10 ja kuni 25 mg/kg;

absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui flavofosfolipooli sisaldus on suurem kui 25 ja kuni 50 mg/kg;

10 % suurimast väärtusest, kui flavofosfolipooli sisaldus on suurem kui 50 mg/kg.

3. MIKROELEMENTIDE RAUA, VASE, MANGAANI JA TSINGI MÄÄRAMINE

1. EESMÄRK JA RAKENDUSALA

Meetodi abil saab kindlaks määrata söötades mikroelemente: rauda, vaske, mangaani ja tsinki. Alumised määramispiirid on:

raud (Fe) 20 mg/kg,

vask (Cu) 10 mg/kg,

mangaan (Mn) 20 mg/kg,

tsink (Zn) 20 mg/kg.

2. PÕHIMÕTE

Proov lahustatakse soolhappes pärast võimaliku orgaanilise aine hävitamist. Elemendid raud, vask, mangaan ja tsink määratakse aatomabsorptsioonispektomeetriaga pärast asjakohast lahjendamist.

3. REAKTIIVID

Sissejuhatus

Reaktiivide ja analüütiliste lahuste ettevalmistamiseks kasutatakse katioonivaba vett, mis on saadud kas bidestilleerimisel borosilikaat- või kvartsklaasist destillaatoris või kahekordsel töötlemisel ioonivahetusvaikudega.

Reaktiivid peavad olema vähemalt analüütiliselt puhtad. Määratava elemendi puudumist tuleb kontrollida pimekatse abil. Vajaduse korral tuleb reaktiive veel puhastada.

Allpool kirjeldatud standardlahuste asemel võib kasutada müügiks ettenähtud standardlahuseid, tingimusel et neil on garantii ning neid on enne kasutamist kontrollitud.

3.1. Soolhape, analüütiliselt puhas (tihedus 1,19).

3.2. Soolhape, analüütiliselt puhas (6 N).

3.3. Soolhape, analüütiliselt puhas (0,5 N).

3.4. 38–40(mahu)protsendiline vesinikfluoriidhape, mille rauasisaldus on alla 1 mg Fe/l ning jääk pärast aurutamist alla 10 mg/l (sulfaadina).

3.5. Väävelhape, analüütiliselt puhas (tihedus 1,84).

3.6. Vesinikperoksiid, analüütiliselt puhas (ligikaudu 100 mahuosa hapnikku (30 massiprotsenti)).

3.7. Raua standardlahus (1 000 μg Fe/ml), mis on valmistatud järgmiselt: 1 g analüütiliselt puhast raudtraati lahustatakse 200 ml 6 N soolhappes (3.2), lisatakse 16 ml vesinikperoksiidi (3.6) ning täiendatakse veega ühe liitrini. 3.7.1. Raua tööstandardlahus (100 μ μg Fe/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.7) veega vahekorras 1 : 9.

3.8. Vase standardlahus (1 000 μg Cu/ml), mis on valmistatud järgmiselt: 1 g vasepulbrit (analüütiliselt puhas) lahustatakse 25 ml 6 N soolhappes (3.2), lisatakse 5 ml vesinikperoksiidi (3.6) ning täiendatakse veega ühe liitrini. 3.8.1. Vase tööstandardlahus (10 μg Cu/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahuse (3.8) veega vahekorras 1 : 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1 : 9.

3.9. Mangaani standardlahus (1 000 μg Mn/ml), mis on valmistatud järgmiselt: 1 g analüütiliselt puhast mangaanipulbrit lahustatakse 25 ml 6 N soolhappes (3.2) ning täiendatakse veega ühe liitrini. 3.9.1. Mangaani tööstandardlahus (10 μg Mn/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.9) veega vahekorras 1 : 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1 : 9.

3.10. Tsingi standardlahus (1 000 μg Zn/ml), mis on valmistatud järgmiselt: 1 g analüütiliselt puhast riba- või lehttsinki lahustatakse 25 ml 6 N soolhappes (3.2) ning täiendatakse veega ühe liitrini. 3.10.1. Tsingi tööstandardlahus (10 μg Zn/ml), mis on valmistatud, lahjendades standardlahust (3.10) veega vahekorras 1 : 9 ning seejärel lahjendades saadud lahust veega vahekorras 1 : 9.

3.11. Lantaankloriidi lahus, mis on valmistatud järgmiselt: 12 g lantaanoksiidi lahustatakse 150 ml vees, lisatakse 100 ml 6 N soolhapet (3.2) ning täiendatakse veega ühe liitrini.

4. VAHENDID

4.1. Temperatuuriregulaatori ja salvestiga muhvelahi.

4.2. Klaasist nõud peavad olema vastupidavast borosilikaatklaasist ning on soovitav kasutada vahendeid, mida kasutatakse üksnes mikroelementide määramiseks.

4.3. Plaatinatiigel ja (vabatahtlik) kvartstiigel.

4.4. Aatomabsorptsioonispektrofotomeeter, mis vastab kasutatava meetodi nõuetele, võttes arvesse tundlikkust ning täpsust nõutud ulatuses.

5. ANALÜÜSI KÄIK

5.1. Orgaanilist ainet sisaldavad proovid

5.1.1. Tuhastamine ja lahuse analüüsiks ettevalmistamine ( 16 )

i) 5–10 g 0,2 mg täpsusega kaalutud proovi kaalutis asetatakse kvarts- või plaatinatiiglisse (4.3) (vaata märkus b), kuivatatakse ahjus 105 °C juures ning tiigel asetatakse külma muhvelahju (4.1). Ahi suletakse (vaata märkus c) ning järk-järgult tõstetakse ligikaudu 90 minuti jooksul temperatuur 450–475 °Cni. Kõnealust temperatuuri hoitakse 4–16 tundi (nt öö jooksul), et eemaldada söeosakesed, ning seejärel ahi avatakse ning lastakse jahtuda (vaata märkus d). Tiigel pestakse ligikaudu 5 ml soolhappega (3.1) ning soolhape lisatakse aeglaselt ja ettevaatlikult keeduklaasi (CO2 moodustumise tõttu võib tekkida tugev reaktsioon). Soolhape (3.1) lisatakse tilkhaaval ja loksutades kuni kihisemise lakkamiseni. Aurutatakse kuivaks, aeg-ajalt klaaspulgaga segades. Järgmisena lisatakse jäägile 15 ml 6 N soolhapet (3.2) ning ligikaudu 120 ml vett. Segatakse klaaspulgaga, mis tuleks jätta keeduklaasi, ning keeduklaas kaetakse klaaskaanega. Segu lastakse aeglaselt keema ning hoitakse keemistemperatuuril, kuni ei eraldu enam tuhka. Filtreeritakse läbi tuhavaba filterpaberi ning filtraat kogutakse 250 ml mõõtekolbi. Keeduklaas pestakse ning filtreeritakse 5 ml kuuma 6 N soolhappega (3.2) ning kaks korda keeva veega. Mõõtekolb täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 N).

ii) Kui filtris olev jääk on must (süsinik), pannakse see tagasi ahju ning tuhastatakse uuesti 450–475 °C juures. Kõnealune tuhastamine, mis võtab aega mõne tunni (3–5 tundi), on lõppenud, kui tuhk on valge või peaaegu valge. Jääk lahustatakse ligikaudu 2 ml soolhappega (3.1), aurutatakse kuivaks ning sellele lisatakse 5 ml 6 N soolhapet (3.2). Segu kuumutatakse, lahus filtreeritakse mõõtekolbi ning täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 N).

Märkused:

a) Mikroelementide määramisel on oluline teada saastamisohtu, eriti tsingi, vase ja raua puhul. Seetõttu ei tohi proovide ettevalmistamisel kasutatavad vahendid sisaldada kõnealuseid metalle. Üldise saastamisohu vähendamiseks tuleb töötada tolmuvabas keskkonnas hoolikalt puhastatud vahendite ja korralikult pestud klaasnõudega. Tsingi määramine on eriti tundlik mitmete saasteallikate suhtes, nt klaasnõud, reaktiivid, tolm jne.

b) Tuhastatava proovi mass arvutatakse sööda ligikaudse mikroelemendisisalduse põhjal vastavalt kasutatava spektrofotomeetri tundlikkusele. Teatavate väikese mikroelementide sisaldusega söötade korral alustatakse 10–20 g proovist, mille lõpplahus täiendatakse vaid kuni 100 ml lahuse saamiseni.

c) Tuhastamine peab toimuma suletud ahjus õhu või hapniku juurdepääsuta.

d) Püromeetri temperatuuri näit ei tohi ületada 475 °C.

5.1.2. Spektrofotomeetriline määramine

5.1.2.1. Kaliibrimislahuste valmistamine Iga määratava elemendi jaoks valmistatakse punktides 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.10.1 osutatud tööstandardlahustest kaliibrimislahused, millest iga lahuse HCl kontsentratsioon on ligikaudu 0,5 N ning (raua, mangaani ja tsingi korral) lantaankloriidi kontsentratsioon on samaväärne 0,1 (massi/mahu) protsendi La-ga. Valitud mikroelementide kontsentratsioonid peavad jääma kasutatava spektrofotomeetri tundlikkuse piiresse. Järgmistes tabelites on näitena esitatud tavapäraste kaliibrimislahuste koostised; kuna koostised sõltuvad siiski kasutatava spektrofotomeetri tundlikkusest, võib osutuda vajalikuks valida muud kontsentratsioonid.



Raud μg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5 ml tööstandardlahust (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11), mida täiendatakse veega 100 ml lahuse saamiseni.



Vask μg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml tööstandardlahust (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6 N HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8 Täiendatakse veega kuni 100 ml lahuse saamiseni.



Mangaan μg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml tööstandardlahust (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11), mida täiendatakse veega 100 ml lahuse saamiseni.



Tsink μg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 ml tööstandardlahust (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantaankloriidi lahust (3.11), mida täiendatakse veega 100 ml lahuse saamiseni.

5.1.2.2. Lahuse analüüsiks ettevalmistamine Vase määramiseks saab vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahust tavaliselt kohe kasutada. Kui lahuse kontsentratsioon on vaja viia kaliibrimislahuste piiresse, võib lahuse alikvoodi pipettida 100 ml mõõtekolbi ning täita märgini 0,5 N soolhappega (3.3). Raua, mangaani ja tsingi määramiseks pipetitakse vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahuse alikvoot 100 ml mõõtekolbi, lisatakse 10 ml lantaankloriidilahust (3.11) ning täidetakse märgini 0,5 N soolhappega (3.3) (vaata ka punkt 8 “Märkus”).

5.1.2.3. Pimekatse Pimekatse peab hõlmama kõiki protseduuri ettenähtud etappe, välja arvatud see, et proovimaterjal jäetakse välja. Pimekatsel ei tohi kasutada kaliibrimislahust 0.

5.1.2.4. Aatomabsorptsiooni mõõtmine Kaliibrimislahuste ja analüüsitava lahuse aatomabsorptsiooni mõõdetakse oksüdeerivat õhk-atsetüleenleeki kasutades järgmistel lainepikkustel: Fe 248,3 nm, Cu 324,8 nm, Mn 279,5 nm, Zn 213,8 nm. Iga mõõtmist tuleb teha neli korda.

5.2. Mineraalsöödad

Kui proov ei sisalda orgaanilist ainet, ei ole eelnev tuhastamine vajalik. Toimitakse vastavalt punkti 5.1.1 alapunktile i, alustades teisest lõigust. Vesinikfluoriidhappega aurutamise võib ära jätta.

6. TULEMUSTE ARVUTAMINE

Mikroelementide kontsentratsioon analüüsitavas lahuses arvutatakse kalibreerimiskõverat kasutades ning tulemus väljendatakse mikroelementide milligrammides ühe kilogrammi proovi kohta (miljondikkudes).

7. KORRATAVUS

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

— absoluutväärtusena väljendatult 5 mg/kg, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on kuni 50 mg/kg,

— 10 % suuremast tulemusest, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on 50–100 mg/kg,

— absoluutväärtusena väljendatult 10 mg/kg, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on 100–200 mg/kg,

— 5 % suuremast tulemusest, kui asjaomase mikroelemendi sisaldus on üle 200 mg/kg.

8. MÄRKUS

Suured fosfaadikogused võivad segada raua, mangaani ja tsingi määramist. Kõnealune olukord tuleb parandada lantaankloriidi lahuse (3.11) lisamisega. Kui proovis on massisuhe

· 2, võib lantaankloriidi lahuse (3.11) jätta analüüsilahusesse ja kaliibrimislahusesse lisamata.