1976L0372 — ET — 03.05.1994 — 003.001

Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest

►B SEITSMES KOMISJONI DIREKTIIV, 1. märts 1976, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks (76/372/EMÜ) (EÜT L 102, 15.4.1976, p.8)

Muudetud:









▼B

SEITSMES KOMISJONI DIREKTIIV,

1. märts 1976,

millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid söötade ametlikuks kontrollimiseks

(76/372/EMÜ)







EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 20. juuli 1970. aasta direktiivi 70/373/EMÜ söötade ametlikuks kontrollimiseks ettenähtud ühenduse proovivõtu- ja analüüsimeetodite kehtestamise kohta, ( 1 ) viimati muudetud ühinemisaktiga, ( 2 ) eriti selle artiklit 2, ning arvestades, et: ning arvestades, et: kõnealuse direktiiviga nähakse ette, et söötade ametlik kontrollimine söötade kvaliteeti ja koostist reguleerivate õigusaktide nõuetele vastavuse kindlakstegemiseks peab toimuma ühenduse proovivõtu- ja analüüsimeetodite abil; komisjoni 15. juuni 1971. aasta direktiivis 71/250/EMÜ, ( 3 )18. novembri 1971. aasta direktiivis 71/393/EMÜ, ( 4 )27. aprilli 1972. aasta direktiivis 72/199/EMÜ, ( 5 )5. detsembri 1972. aasta direktiivis 73/46/EMÜ, ( 6 )25. märtsi 1974. aasta direktiivis 74/203/EMÜ ( 7 ) ja 20. detsembri 1974. aasta direktiivis 75/84/EMÜ ( 8 ) on juba kehtestatud hulk ühenduse analüüsimeetodeid; silmas pidades edusamme pärast kõnealuse direktiivi vastuvõtmist tehtud töös, on soovitatav võtta vastu seitsmes rühm meetodeid; käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise söödakomitee arvamusega, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:







Artikkel 1

Liikmesriigid sätestavad, et söötade ametliku kontrolli raames ettenähtud analüüsid aflatoksiin B1 sisalduse määramiseks tehakse käesoleva direktiivi lisas kirjeldatud meetodite kohaselt.

▼M1 —————

▼B

Artikkel 2

Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 1. oktoobril 1976. Nad teatavad sellest viivitamata komisjonile.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.









LISA

AFLATOKSIIN B1 MÄÄRAMINE

A. ÜHEMÕÕTMELINE PLANAARKROMATOGRAAFILINE MEETOD

▼M2

1. Eesmärk ja rakendusala

Meetod võimaldab määrata aflatoksiin B1 taset toormaterjalides ja lihtsöötades. Käesolevat meetodit ei saa rakendada tsitruspulbi esinemisel. Määramise alampiir on 0,01 mg/kg (10 miljardikku).

Segavate ainete esinemisel tuleb analüüsi korrata kasutades meetodit B (kõrgrõhuvedelikkromatograafia).

▼B

2. Põhimõte

Proov ekstraheeritakse kloroformiga. Ekstrakt filtreeritakse ja võetakse alikvoot, mis puhastatakse silikageeli kolonnkromatograafia abil. Eluaat aurutatakse ja jääk lahustatakse kindlaksmääratud kloroformikoguses või benseeni ja atsetonitriili segus. Selle lahuse alikvoodile tehakse planaarkromatograafia (TLC). Aflatoksiin B1 kogus määratakse kromatogrammi UV-kiirguses visuaalselt või fluorodensitomeetriliselt, teadaolevate standardaflatoksiin B1 kogustega võrdlemise teel. Söödast ekstraheeritud aflatoksiin B1 identsus tuleb määrata osutatud korras.

3. Reaktiivid

NB:

Kui ei ole sätestatud teisiti, peab kõikide reaktiivide kvaliteeditähistus olema “analüütiliselt puhas reaktiiv”.

3.1. Atsetoon.

3.2. Kloroform, stabiliseeritud 0,5–1,0 protsendiga 96 % etanoolist (V/V).

3.3. N-heksaan.

3.4. Metanool.

3.5. Veevaba dietüüleeter, peroksiidivaba.

3.6. Benseeni ja atsetonitriili segu: 98/2 (V/V).

3.7. Kloroformi (3.2) ja metanooli (3.4) segu: 97/3 (V/V).

3.8. Silikageel, kolonnkromatograafia jaoks, osakeste suurus 0,05–0,20 mm.

3.9. Absorbeeriv vatt, eelnevalt kloroformiga rasvatustatud, või klaasvatt.

3.10. Naatriumsulfaat, veevaba, graanulites.

3.11. Inertgaas, näiteks lämmastik.

3.12. 1 N soolhape.

3.13. 50 % (V/V) väävelhape.

3.14. Kobediatomiit, happes pestud.

3.15. Silikageel G-HR või samaväärne TLC jaoks.

3.16. Standardlahus, milles on umbes 0,1 μg aflatoksiin B1 ml kohta kloroformis (3.2) või benseeni/atsetonitriili segu (3.6) ja mis on valmistatud ja kontrollitud vastavalt 7. osale.

3.17. Standardlahus kvalitatiivsete testide läbiviimiseks, mis sisaldab 0,1 μg aflatoksiin B1 ml kohta ja B2 kloroformis (3.2) või benseeni/atsetonitriili segu (3.6). Need kontsentratsioonid on antud juhistena. Neid tuleb mõlema aflatoksiini puhul sama fluorestsentsi intensiivsuse saamiseks kohandada.

3.18. Ilmutuslahused: 3.18.1. Kloroform (3.2)/atsetoon (3.1): 9/1 (V/V), küllastamata ilmutusnõu; 3.18.2. Dietüüleeter (3.5)/metanool (3.4)/vesi: 96/3/1 (V/V/V), küllastamata ilmutusnõu; 3.18.3. Dietüüleeter (3.5)/metanool (3.4)/vesi: 94/4,5/1,5 (V/V/V), küllastatud ilmutusnõu; 3.18.4. Kloroform (3.2)/metanool (3.4): 94/6 (V/V), küllastatud ilmutusnõu; 3.18.5. Kloroform (3.2)/metanool (3.4): 97/3 (V/V), küllastatud ilmutusnõu.

4. Seadmed

4.1. Jahvatusmasin.

4.2. Loksuti või magnetsegur.

4.3. Kurdfilterpaberid Schleicher ja Schüll nr 588 või samaväärsed, läbimõõt: 24 cm.

4.4. Klaastoru kromatograafia jaoks (siseläbimõõt: 22 mm, pikkus: 300 mm), teflonkraani ja 250 ml reservuaariga.

4.5. Vaakumpöördaurusti 500 ml ümarkolviga.

4.6. 500 ml lihvkorgiga Erlenmeyeri kolvid.

4.7. TLC-seadmed.

4.8. Klaasplaadid TLC jaoks, 200 × 200 mm, järgmiselt ette valmistatud (esitatud kogused katavad 5 plaati). 30 g silikageeli G-HR (3.15) pannakse Erlenmeyeri kolbi. Lisatakse 60 ml vett, suletakse korgiga ja loksutatakse üks minut. Suspensioon kantakse plaatidele ühtlase 0,25 mm kihina. Jäetakse õhu kätte kuivama ja seejärel hoitakse silikageeli sisaldavas eksikaatoris. Kasutamisel plaadid aktiveeritakse, hoides neid kuivatuskapis 110 °C juures tund aega. Valmis plaadid on sobivad, kui nad annavad samasuguseid tulemusi kui eespool osutatud ettevalmistatud plaadid.

4.9. Pikklaine (360 nm) UV-lamp. Kiirituse intensiivsus peab võimaldama 1 ng aflatoksiin B1 täpi selget eraldamist TLC-plaadil lambist 10 cm kaugusel.

4.10. 10 ml büretid polüetüleenkorkidega.

4.11. UV-spektrofotomeeter.

4.12. Fluorodensitomeeter (ei ole kohustuslik).

5. Menetlus

5.1. Proovi ettevalmistamine (vt “Märkused”, C osa punkt 1).

Proov jahvatatakse nii, et kõik selle osakesed mahuvad läbi 1 mm avadega sõela (kooskõlas soovitusega ISO R 565).

5.2. Ekstraheerimine

50 g jahvatatud homogeenitud proovi pannakse 500 ml Erlenmeyeri kolbi. Lisatakse 25 g kobediatomiiti (3.14), 25 ml vett ja 250 ml kloroformi (3.2). Kolb suletakse, loksutatakse või segatakse 30 minutit seadme (4.2) abil ja filtreeritakse läbi kurdfilterpaberi (4.3). Filtraadi esimesed 10 ml praagitakse välja ja võetakse järgmised 50 ml.

5.3. Kolonni puhastamine

Kromatograafiatoru (4.4) madalamasse otsa pannakse vati- või klaasvillatropid (3.9), kaks kolmandikku torust täidetakse kloroformiga (3.2) ja lisatakse 5 g naatriumsulfaati (3.10).

Kontrollitakse, kas naatriumsulfaadikihi pind on tasane, siis lisatakse väikeste koguste kaupa 10 g silikageeli (3.8). Pärast iga koguse lisamist segatakse, et eemaldada õhumullid. Jäetakse 15 minutiks seisma ja siis lisatakse ettevaatlikult 15 g naatriumsulfaati (3.10). Vedelikul lastakse alla vajuda, kuni see on vahetult naatriumsulfaadikihi pinna kohal.

50 ml punktis 5.2 kogutud ekstrakti segatakse 100 ml N-heksaaniga (3.3) ja segu kantakse kvantitatiivselt kolonni. Vedelikul lastakse alla vajuda, kuni see on vahetult naatriumsulfaadikihi pinna kohal. See segu visatakse minema. Siis lisatakse 100 ml dietüüleetrit (3.5) ja lastakse sellel vajuda naatriumsulfaadikihi pinnale. Nende toimingute ajal tuleks jälgida, et voolukiirus on 8–12 ml/min ja et kolonn ei jookse tühjaks. Väljatulnud vedelik visatakse ära. Siis elueeritakse 150 ml kloroformi/metanooli seguga (3.7) ja kogutakse kogu eluaat.

Eluaat aurustatakse temperatuuril kuni 50 °C inertgaasi (3.11) all vaakumpöördaurustis (4.5) peaaegu kuivaks. Jääk kantakse kvantitatiivselt kloroformi (3.2) või benseeni ja atsetonitriili segu (3.6) kasutades 10 ml büretti (4.10). Lahus kontsentreeritakse inertgaasi (3.11) abil ja siis kohandatakse kloroformi (3.2) või benseeni/atsetonitriili segu (3.6) kasutades selle maht 2 milliliitrini.

5.4. Planaarkromatograafia

TLC-plaadile (4.8) kantakse 2 cm alumisest servast ja 2 cm intervallidega standardlahuse ja ekstrakti allpool toodud mahuga tilgad:

— 10, 15, 20, 30 ja 40 μl aflatoksiin B1-standardlahust (3.16);

— 10 μl punktis 5.3 saadud ekstrakti ja samasse kohta 20 μl standardlahust (3.16);

— 10 ja 20 μl punktis 5.3 saadud ekstrakti.

Kromatogramm ilmutatakse pimedas ühega ilmutuslahustest (3.18). Ilmutuslahus tuleb valida varem, pannes 25 μl kvalitatiivset standardlahust (3.17) plaadile ja kontrollides, kas aflatoksiin B1 ja B2 on pärast ilmutamist täielikult eraldunud.

Lahustil lastakse pimedas aurustuda ja siis kiiritatakse seda UV-valgusega, asetades plaadi lambist (4.9) 10 cm kaugusele. Aflatoksiin B1 täpid annavad sinise fluorestsentsi.

5.5. Kvantitatiivsed määramised

Määratakse kas visuaalselt või fluorodensitomeetriliselt allpool esitatud viisil.

5.5.1. Visuaalsed mõõtmised

Ekstraktis aflatoksiin B1 koguse määramiseks otsitakse standardlahuse tilkadest see, millel on ekstrakti tilkadega võrdne fluorestsentsi intensiivsus. Vajadusel see interpoleeritakse. Ekstrakti lisatud standardlahuse fluorestsents peab olema intensiivsem kui 10 μl ekstraktil ja selles tohib olla ainult üks nähtav täpp. Kui 10 μl ekstrakti fluorestsentsi intensiivsus on suurem kui 40 μl standardlahusel, lahjendatakse ekstrakti enne uut planaarkromatograafiat 10 või 100 korda kloroformi (3.2) või benseeni/atsetonitriili seguga (3.6).

5.5.2. Fluorodensitomeetrilised mõõtmised

Aflatoksiin B1 tilkade fluorestsentsi intensiivsust mõõdetakse fluorodensitomeetriga (4.12) kiirguslainepikkusel 365 nm ja ergastuslainepikkusel 443 nm. Aflatoksiin B1 koguse mõõtmiseks ekstrakti tilkades võrreldakse nende fluorestsentsi intensiivsust aflatoksiin B1 standardlahuse tilkade omaga.

5.6. Aflatoksiin B1 määramise kinnitus

Aflatoksiin B1 määramist ekstraktis kinnitatakse allpool esitatud menetluste abil.

5.6.1. Töötlemine väävelhappega

Väävelhapet (3.13) pritsitakse punktis 5.4 saadud kromatogrammile. Aflatoksiin B1 tilkade fluorestsents peab UV-kiirguses muutuma sinisest kollaseks.

5.6.2. Kahemõõtmeline planaarkromatograafia, mis hõlmab aflatoksiin B1-poolatsetaali (aflatoksiin B2a) moodustumist

NB: Alljärgnevate toimingute puhul tuleb täpselt järgida joonisel 3 toodud skeemi.

5.6.2.1. Lahuste plaadile kandmine Plaadile (4.8) tõmmatakse selle kahe kõrvutise küljega paralleelselt lahusti frondi liikumise piiramiseks kaks sirget joont (6 cm mõlemast küljest). Kapillaarpipeti või mikrosüstlaga kantakse plaadile järgmiste lahuste tilgad: — punkti A: proovi puhastatud ekstrakti, mis on saadud 5.3 läbiviimisel ja mis sisaldab umbes 2,5 nm aflatoksiin B1, — punktidesse B ja C: 25 μl standardlahust (3.16).

5.6.2.2. Ilmutamine Kromatogramm ilmutatakse pimedas suunas I, kasutades selleks ilmutuslahust (3.18.1) (1 cm kiht küllastamata ilmutusnõus) kuni see jõuab lahust piirava jooneni. Plaat võetakse ilmutusnõust ja sellel lastakse pimedas ümbritseva õhu temperatuuril viis minutit kuivada. Ülejäänud plaati klaasplaadiga kattes pihustatakse soolhappega (3.12) 2,5 cm laiust punkte A ja B katvat riba (joonisel tähistatud viirutatud joonega), kuni see tumeneb. Lastakse 10 minutit pimedas reageerida ja kuivatatakse õhuvooluga ümbritseva õhu temperatuuril. Järgmisena ilmutatakse pimedas kromatogrammi suunas II, kasutades selleks ilmutuslahust (3.18.1) (1 cm kiht küllastamata ilmutusnõus), kuni see jõuab lahust piirava jooneni. Plaat võetakse ilmutusnõust ja sellel lastakse ümbritseva õhu temperatuuril kuivada.

5.6.2.3. Kromatogrammi tõlgendus Kromatogrammi vaadeldakse UV-valguses (4.9) ja kontrollitakse järgmiseid omadusi: a) Aflatoksiin B1 sinise fluorestsentsiga tilga esinemine punktis C plaadile kantud standardlahuses (liikumine suunas I). b) Aflatoksiin B1 (soolhappega) reageerimata sinise fluorestsentsiga tilga ja veelgi intensiivsema aflatoksiin B1-poolatsetaali sinise fluorestsentsiga tilga esinemine punktis B plaadile kantud standardlahuses (liikumine suunas II). c) Punktis b kirjeldatud tilkadega samaväärsete tilkade esinemine punktis A plaadile kantud prooviekstraktis. Nende tilkade asukoht määratakse kõigepealt aflatoksiin B1 liikumisvahemaa põhjal punktist A liikumissuunaga I (sama mis punktis C standardlahuse liikumine) ja siis aflatoksiin B1-poolatsetaali liikumisvahemaa põhjal liikumissuunaga II (sama mis punktis B standardlahuse liikumine). Ekstraktist pärineva ja punktis B plaadile kantud standardlahuse poolatsetaali täppide fluorestsentsi intensiivsus peaksid olema võrdsed.

6. Tulemuste arvutamine

6.1. Visuaalsete mõõtmiste põhjal

Aflatoksiin B1 sisaldus mikrogrammides ühe kg proovi kohta (miljardik osadena) on väljendatud valemiga:

kus:

Y on aflatoksiin B1 standardlahuse (3.16) ja X samaväärse fluorestsentsi intensiivsusega ekstrakti maht mikroliitrites;

S = aflatoksiin B1 kontsentratsioon standardlahuses (3.16) mikrogrammides ml kohta;

V = ekstrakti lõppmaht mikroliitrites kõiki vajalikke lahjendamisi arvesse võttes;

W = proovi mass grammides, mis vastab kolonnis puhastatud ekstrakti massile.

6.2. Fluorodensitomeetriliste mõõtmiste põhjal

Aflatoksiin B1 sisaldus mikrogrammides kg kohta on väljendatud valemiga:

kus:

Y = plaadile kantud ekstrakti mass mikroliitrites (10 või 20 μl);

S = mõõtmistel saadud aflatoksiin B1 kogus nanogrammides ekstrakti tilgas (võrdeline võetud Y väärtusega);

V = ekstrakti lõppmaht mikroliitrites kõiki vajalikke lahjendamisi arvesse võttes;

W = proovi mass grammides, mis vastab kollonnis puhastatud ekstrakti massile.

7. Standardlahuse (3.16) valmistamine ja kontrollimine

7.1 Aflatoksiin B1 konsentratsiooni määramine

Aflatoksiin B1 standardlahus kontsentratsiooniga 8–10 μg/ml valmistatakse kloroformi (3.2) või benseeni/atsetonitriili segus (3.6). Imendumisspekter 330 ja 370 nm vahel määratakse spektrofotomeetriga (4.11).

Optiline tihedus (A) mõõdetakse kloroformilahuse puhul 363 nm juures või benseeni/atsetonitriili segu lahuse puhul 348 nm juures.

Aflatoksiin B1 kontsentratsioon mikrogrammides ml lahuse kohta arvutatakse alljärgneva valemiga:

kloroformilahuse puhul;

benseeni/atsetonitriilisegu lahuse puhul.

Lahjendatakse vastavalt vajadusele, mitte päevavalguses, et saada kasutusvalmis standardlahus aflatoksiin B1 kontsentratsiooniga umbes 0,1 μg ml kohta. Külmikus temperatuuril 4 °C hoidmise korral on see lahus stabiilne kaks nädalat.

7.2 Kromatograafilise puhtuse kontrollimine

Plaadile (4.8) kantakse 5 μl aflatoksiin B1 standardlahust kontsentratsiooniga 8–10 μg/ml (7.1). Kromatogramm ilmutatakse punktis 5.4 kirjeldatud viisil. UV-valguses peaks kromatogramm näitama ainult ühte tilka ja algses settepiirkonnas ei tohi olla fluorestsentsi.

8. Korratavus

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohiks ületada:

— 25 % kõrgeimast tulemusest, kui aflatoksiin B1 sisaldus on 10–20 μg/kg,

— 5 μg absoluutväärtusest, kui sisaldus on 20–50 μg/kg,

— 10 % suurimast väärtusest, kui aflatoksiin B1 sisaldus on üle 50 μg/kg.

9. Reprodutseeritavus

Vt “Märkused”, C osa punkt 2.

▼M2

B. AFLATOKSIIN B1 MÄÄRAMINE. KÕRGRÕHUVEDELIKKROMATOGRAAFIA

1. Eesmärk ja rakendusala

Meetod võimaldab määrata aflatoksiin B1 loomasöötades, sealhulgas nendes, mis sisaldavad tsitruspulpi. Määramise alampiir on 0,001 mg/kg (1 miljardik).

2. Põhimõte

Proovi ekstraheeritakse kloroformiga. Ekstrakt filtreeritakse ja alikvoot puhastatakse Florisil-padrunil ning seejärel C18-padrunil. Lõplik eraldamine ja määramine sooritatakse kõrgrõhuvedelikkromatograafiaga (HPLC) pöördfaasilise C18-kolonni kasutades, millele järgneb kolonnijärgne derivatsioon joodiga vees ja fluorestsentsavastamine.

Märkus:

mükotoksiinid on äärmiselt mürgised ained. Materjali tuleb käsitseda asjakohases tõmbekapis. Toksiinid esinemisel kuivas vormis tuleb võtta erilisi ettevaatusmeetmeid nende elektrostaatilise iseloomu tõttu ning sellest tuleneva kalduvuse tõttu tööruumides hajuda.

3. Reaktiivid

3.1. Kloroform, stabiliseeritud 0,5–1,0 massi- % etanooliga. Vt märkus 10.2.

3.2. Metanool, HPLC-puhas, 3.6 segu valmistamiseks.

3.3. Atsetoon.

3.4. Atsetonitriil, HPLC-puhas.

3.5. Eluendid: Valmistada kasutamisele eelneval päeval või eemaldada õhk eluendist ultraheli abil. 3.5.1. Atsetooni (3.3) ja vee segu, 98 + 2 (V + V). 3.5.2. Vee ja metanooli (3.2) segu, 80 + 20 (V + V). 3.5.3. Vee ja atsetooni (3.3) segu, 85 + 15 (V + V).

3.6. HPLC liikuv faas. Vee, metanooli (3.2) ja atsetonitriili (3.4) segu, 130 + 70 + 40 (V + V + V). NB: liikuva faasi lahusti koostis võib vajada korrigeerimist sõltuvalt kasutatava HPLC-kolonni omadustest.

3.7. Küllastatud joodilahus: lisada 2 g joodi 400 ml vette. Segada vähemalt 90 minutit ning filtreerida läbi membraanfiltri (4.15). Kaitsta küllastatud lahust valguse eest, et vältida valguslagunemist.

3.8. Happega pestud Celite 545 või samaväärne toode.

3.9. Florisil-padrun (Waters SEP-PAK) või samaväärne toode.

3.10. C18-padrun (Waters SEP-PAK) või samaväärne toode.

3.11. Inertgaas, nt lämmastik.

3.12. Aflatoksiin B1 standardlahus kloroformis, kontsentratsioon 10 μg/ml. Lahuse kontsentratsiooni kontrollitakse järgmiselt: määrata lahuse neeldumisspekter vahemikus 330–370 nm kasutades spektrofotomeetrit (4.23). Määrake absorptsioon (A) 363 nm lähedal oleva suurima väärtuse järgi. Aflatoksiin B1 kontsentratsioon mikrogrammides milliliitri lahuse kohta arvutatakse järgmise valemiga: 3.12.1. Aflatoksiin B1 lähtestandardlahus kloroformis. Viia kvantitatiivselt 2,5 ml aflatoksiin B1 standardlahust (3.12) 50 ml mõõtekolbi ja täita kolb märgini kloroformiga (3.1). Hoida lahust jahedas (4 °C) ja pimedas, hermeetiliselt suletuna ning mähituna alumiiniumfooliumi.

3.13. Aflatoksiin B1 HPLC-kaliibrimislahused. NB: Nende lahuste valmistamiseks kasutada happega pestud klaastarvikuid (vt 4. Seadmed). 3.13.1. Kaliibrimislahus 4 ng/ml. Lasta lähtestandardlahust (3.12.1) sisaldaval mõõtekolvil soojeneda toatemperatuurini alumiiniumfooliumis (mõni tund). Viia 400 μl lähtestandardlahust (200 ng aflatoksiin B1) 50 ml mõõtekolbi ning aurustada lahus inertgaasi (3.11) voolus kuivaks. Lahustada saadud jääk ligikaudu 20 ml vee-atsetooni segus (3.5.3), täita kolb märgini vee-atsetooni seguga ja segada korralikult. 3.13.2. Kaliibrimislahus 3 ng/ml. Viia kvantitatiivselt 7,5 ml kaliibrimislahust (3.13.1) 10 ml mõõtekolbi, täita kolb märgini vee-atsetooni seguga (3.5.3) ja segada korralikult. 3.13.3. Kaliibrimislahus 2 ng/ml. Viia kvantitatiivselt 25 ml kaliibrimislahust (3.13.1) 50 ml mõõtekolbi, täita kolb märgini vee-atsetooni seguga (3.5.3) ja segada korralikult. Seda lahust nimetatakse ka võrdlusstandardiks HPLC (5.5) aegsel korduvsüstimisel. 3.13.4. Kaliibrimislahus 1 ng/ml. Viia kvantitatiivselt 2,5 ml kaliibrimislahust (3.13.1) 10 ml mõõtekolbi, täita kolb märgini vee-atsetooni seguga (3.5.3) ja segada korralikult.

3.14. Ampull, mis sisaldab aflatoksiinide B1, B2, G1 ja G2 segu 1 ml kloroformis kontsentratsiooniga vastavalt ligikaudu 1, 0,5, 1 and 0,5 μg/ml. 3.14.1. Kromatograafia proovilahus. Viia ampulli (3.14) lahus lihvkorgiga katsutisse või väikesesse keeratava korgiga pudelisse. Viia 40 μl kõnealust lahust lihvkorgiga katsutisse (happega loputatud) (4.22). Aurustada kloroform inertgaasi (3.11) voolus ning lahustada uuesti 10 ml vee-atsetooni segus (3.5.3).

3.15. Kinnituskatse reagendid (6). 3.15.1. Naatriumkloriidi küllastatud lahus. 3.15.2. Naatriumsulfaat, veevaba, graanulites.

4. Seadmed

Ettevaatust: happes pesemata klaastarvikute kasutamine aflatoksiinide vesilahuste jaoks võib põhjustada kadusid. Eriti hoolikas tuleb olla uute klaastarvikute ja ühekordse kasutusega klaastarvikute, nt automaatproovivõtupudelite ning Pasteuri pipettidega. Seepärast tuleb aflatoksiinide vesilahustega kokkupuutuvaid laboriklaastarvikuid leotada mitu tundi lahjendatud happes (nt väävelhappes, 2 mol/l), seejärel destilleeritud veega korralikult loputada, et eemaldada kõik happejäägid (nt kolm korda, kontrollida pH-paberiga). Praktikas on sellist käsitlemist vaja ümarkolvi (4.4), mõõtekolbide, mõõtesilindrite, väikeste pudelite või katsutite puhul, mida kasutatakse kaliibrimislahuste ja lõppekstraktide jaoks (eriti automaatproovivõtupudelid), ning Pasteuri pipettide jaoks, kui neid kasutatakse kaliibrimislahuste või ekstraktide ülekandmiseks.

4.1. Jahvatusmasin-loksuti

4.2. Sõel avasuurusega 1,0 mm (ISO R 565).

4.3. Mehaaniline loksuti

4.4. Vaakumpöördaurusti 150–250 ml ümarkolviga.

4.5. Kõrgrõhuvedelikkromatograaf süstekontuuriga, mis sobib 250 μl süsteks. Vt seadme kasutusjuhendist imitoru osalise või täieliku täitmise kohta.

4.6. HPLC-analüüsikolonn: 3 μm või 5 μm C18-padrunis.

4.7. Pulseerimatu pump kolonnijärgse joodireagendi väljastamiseks.

4.8. Roostevabast terasest (1/16” × 0,75 mm) Valco tühimahuta T-kolmik.

4.9. Spiraalne reaktsioonispiraal, teflonist või roostevabast terasest. Mõõtmetega 3000 × 0,5 mm kuni 5000 × 0,5 mm spiraalid on osutunud sobivateks koos 5 μm või 3 μm HPLC-kolonnidega koos kasutamiseks.

4.10. Temperatuurile 60 °C reguleeritud termostaatveevann, mille temperatuuri saab seada täpsemalt kui 0,1 °C.

4.11. Fluorestsentsdetektor ergastuslainepikkusega 365 nm ja kiirguslainepikkusega 435 nm. (Filtriga seadmetes ergastuslainepikkus > 400 nm.) Peab võimaldama avastada vähemalt 0,05 ng aflatoksiin B1. Teatav vasturõhk võib olla soovitatav läbivooluküvetis moodustuvate õhumullide tekke vältimiseks (nt detektori väljalaskeavaga ühendatud ahendi, teflonist või roostevabast terasest spiraal).

4.12. Lintmeerik.

4.13. Elektrooniline integraator (valikuline).

4.14. Kurdfilterpaber läbimõõduga 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 või samaväärne.

4.15. Membraanfilter avasuurusega 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 või samaväärne.

4.16. Lihvkorgiga 500 ml kooniline kolb.

4.17. Lueri otsakuga klaaskolonn (siseläbimõõt u 1 cm, pikkus u 30 cm).

4.18. Lueri otsakuga kloroformikindel korkkraan (nt Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 või samaväärne).

4.19. Keemiliselt inertne süstal, 10 ml Lueri ühendusega.

4.20. 250 μl HPLC-süsteks sobiv süstal (vt 4.5)

4.21. 100 μl mikrosüstal kaliibrimislahuste ettevalmistamiseks (kontrollida kaalumise teel, et täpsus on 2 % piires).

4.22. Lihvkorgiga 10 ml mõõtekolb.

4.23. Spektrofotomeeter, mis sobib mõõtmisteks spektri ultraviolettpiirkonnas.

4.24. Kinnituskatse seadmed (6). 4.24.1. Happes loputatud 100 ml jaotuslehter, teflonist korkkraaniga. 4.24.2. Soojendusseade, 40–50 °C.

5. Menetlus

5.1. Proovi ettevalmistamine.

Jahvatada proovimaterjal nii, et see läbiks sõela (4.2).

5.2. Katsekogus.

Kaaluda 50 g katseks ettevalmistatud proovi koonilisse kolbi (4.16).

5.3. Ekstraheerimine.

Lisada katsekogusele (5.2) 25 g Celite'i (3.8), 250 ml kloroformi (3.1) ja 25 ml vett. Kinnitada kolvile kork ning raputada 30 minutit kasutades mehaanilist loksutit (4.3). Filtreerida läbi kurdfilterpaberi (4.14). Koguda 50 ml filtraati. Vajaduse korral võtta filtraadi alikvoot ja lahjendada 50 ml kloroformis, et aflatoksiin B1 kontsentratsioon ei ületaks 4 ng/ml.

5.4. Puhastamine (menetlus tuleb läbi viia ilma oluliste katkestusteta).

Ettevaatust:

— kaitsta laborit, kus analüüse tehakse, piisavalt päevavalguse eest. Seda võib saavutada tõhusalt kasutades: — i) ultraviolettkiirgust neelavat fooliumi akendel koos nõrga valgusega (otsese päikesevalguseta); ii) kardinaid või katteid koos tehisvalgusega (päevavalguslambid on lubatud);

— aflatoksiini sisaldavad lahuseid tuleb kaitsta valguse eest nii palju kui võimalik (hoida pimedas, kasutada alumiiniumfooliumi).

5.4.1. Puhastamine Florisil SEP-PAK'i abil

5.4.1.1. Kolonni-padruni koostu ettevalmistamine.

Kinnitada korkkraan (4.18) Florisil-padruni (3.9) lühema varre külge (vt joonis 1). Pesta padrun ning eemaldada õhk võttes 10 ml kloroformi (3.1) ning viies 8 ml korkkraani kaudu kiirelt läbi padruni, kasutades selleks süstalt (4.19). Kinnitada padruni pikem vars klaaskolonni (4.17) külge ja viia allesjäänud 2 ml kloroformi läbi padruni kolonni. Sulgeda korkkraan. Eemaldada süstal.

5.4.1.2. Puhastamine

Lisada punktis 5.3 kogutud filtraat kolonni-padruni koostu ning lasta vabalt valguda. Loputada 5 ml kloroformiga (3.1), seejärel 20 ml metanooliga (3.2).

Kõrvaldada eluaadid. Nende toimingute vältel tagada, et kolonni-padruni koost ei jää kuivaks. Elueerida aflatoksiin B1 40 ml atsetooni-vee seguga (3.5.1) ja koguda kogu eluaat pöördaurusti ümarkolbi (4.4). Kontsentreerida eluaat pöördaurustil temperatuuril 40–50 °C, kuni atsetooni enam ei destilleeru. (NB: Selleks hetkeks on kolbi jäänud u 0,5 ml vedelikku. Katsed on osutanud, et edasine aurustamine ei ole kahjulik ning et 0,5 ml vedeliku allesjäämisel ei sisaldu selles enam olulises koguses atsetooni. Atsetoonijäägid võivad põhjustada aflatoksiin B1 kaod C18-padrunis.) Lisada 1 ml metanooli (3.2), loksutada kolbi, et lahustada aflatoksiin B1 kolbi seintelt, lisada 4 ml vett ja segada. Ühendada padrun lahti ja kõrvaldada. Loputada klaaskolonni veega ja hoida alles C18-puhastamise jaoks.

5.4.2. Puhastamine C18 SEP-PAK'i abil

5.4.2.1. Kolonni-padruni koostu ettevalmistamine.

Kinnitada korkkraan (4.18) C18-padruni (3.9) lühema varre külge (vt joonis 1). Loputada padrun ning eemaldada õhk viies 10 ml metanooli (3.2) korkkraani kaudu kiiresti läbi padruni, kasutades selleks süstalt (4.19). (Õhumullid padrunis on nähtavad heledate täppidena muidu hallikal taustal.) Võtta 10 ml vett ja viia 8 ml läbi padruni. (Minnes metanoolilt üle veele vältida õhu sissepääs padrunisse.) Kinnitada padruni pikem vars klaaskolonni (4.17) külge ja viia allesjäänud 2 ml vett läbi padruni kolonni. Sulgeda korkkraan. Eemaldada süstal.

5.4.2.2. Puhastamine

Viia punktis 5.4.1.2 kogutud ekstrakt kvantitatiivselt klaaskolonni (4.17), loputades kolbi kaks korda 5 ml vee-metanooli seguga (3.5.2) ning lasta sellel vabalt valguda. Nende toimingute vältel tagada, et kolonni-padruni koost ei jää kuivaks. (Kui padruni lähedal kitsendis tekivad õhumullid, peatada vool ning keerata õhumullide eemaldamiseks klaaskolonni ülaosa lahti. Seejärel jätkata.) Elueerida 25 ml vee-metanooli seguga. Kõrvaldada eluaat. Elueerida aflatoksiin B1 50 ml vee-atsetooni segust (3.5.3) ning koguda kogu eluaat 50 ml mõõtekolbi. Täita kolb veega märgini ja segada: tulemuseks saadud katselahust kasutatakse kromatograafial (5.5).

lõppekstrakti filtreerimist enne HPLC-d ei ole tavaliselt vaja. Kui seda peetakse vajalikuks, ei tuleks kasutada tselluloosfiltreid, sest need võivad põhjustada aflatoksiin B1 kadusid. Teflonfiltreid tohib kasutada.

5.5. Kõrgrõhuvedelikkromatograafia

(seadmestiku ehitus: vt joonis 2). Laske seadmetel piisavalt kaua sisekliimatingimustega kohaneda ja stabiliseeruda.

Märkus 1:

liikuva faasi ja kolonnijärgse reagendi voolukiirused on näitlikud. Need võivad sõltuvalt HPLC-kolonni omadustest vajada kohandamist.

Märkus 2:

detektori aflatoksiin B1 avastusvõime sõltub temperatuurist, seepärast tuleb kõrvalekalle kompenseerida (vt joonis 3). Süstides kindlaksmääratud koguse aflatoksiin B1 võrdlusstandardit (3.13.3) regulaarsete vahemike järel (nt igal kolmandal süstel), võib aflatoksiin B1 tippväärtusi nende võrdlusstandardite vahel korrigeerida, kasutades keskmist vastust eeldusel, et üksteisele järgnevate võrdlusstandardite vastuste vaheline erinevus on väga väike (< 10 %). Seepärast tuleb süsted läbi viia ilma katkestusteta. Kui katkestamist on vaja, peab katkestamisele eelnev süste ja sellele järgnev süste olema võrdlusstandard (3.13.3). Et kaliibrimiskõver on lineaarne ning kulgeb läbi koordinaadistiku algpunkti, määratakse aflatoksiin B1 kogused prooviekstraktides neid vahetult võrreldes külgnevate standarditega.

5.5.1. HPLC-pumba seaded

Seadistada HPLC-pump (4.5) nii, et selle tootlikkus oleks 0,5 või 0,3 ml/min vastavalt 5 μm või 3 μm HPLC-kolonni (4.6) korral kasutades liikuvat faasi (3.6).

5.5.2. Kolonnijärgse pumba seaded

Seadistada pump (4.7) nii, et selle joodi küllastatud vesilahuse (3.7) tootlikkus oleks 0,2–0,4 ml/min. Ligikaudne juhis: liikuva faasi (3.6) vooluga 0,5 ja 0,3 ml/min on soovitatav tootlikkus vastavalt u 0,4 või 0,2 ml/min.

5.5.3. Fluorestsentsdetektor

Seadke fluorestsentsdetektori (4.11) ergastuslainepikkuseks 365 nm ja kiirguslainepikkuseks 435 nm (filtriga seadmetes > 400 nm). Seadistada detektori summuti nii, et 1 ng aflatoksiin B1 korral liigub meeriku sulg ligikaudu 80 % asendisse skaala kogu ulatusest.

5.5.4. Süsteseade

Kõigi lahuste puhul süstida 250 μl kogused järgides süsteseadme tootja juhiseid.

5.5.5. Kromatograafilise eraldamise kontroll

Süstida kromatograafi katselahust (3.14.1). Madalpunktid peavad olema alla 5 % külgnevate piikide kõrguste summast.

5.5.6. Süsteemi stabiilsuse kontroll

Enne iga analüüsiseeriat süstida kromatograafi vastavat võrdlusstandardit (3.13.3) kuni püsivate piigipindalade saavutamiseni. (NB: piigivastused aflatoksiin B1 suhtes järjestikuste süstete vahel ei peaks erinema enam kui 6 %.) Jätkata viivitamata lineaarsuse kontrolliga (5.5.7).

5.5.7. Lineaarsuse kontroll

Süstida kromatograafi aflatoksiin B1 kaliibrimislahused (3.13.1–3.13.4). Igal kolmandal süstel kasutada võrdlusstandardit (3.13.3) vastuse kõrvalekalde korrigeerimiseks. (NB: selle võrdlusstandardi piigivastused ei tohi erineda üle 10 % 90 minuti jooksul.) Korrigeerida kõrvalekalded vastavalt punktis 7 esitatud valemile. Kalibreerimisgraafik peab olema lineaarne ja kulgema läbi koordinaadistiku algpunkti, kahekordse Y-hinnangu standardvea piires. Leitud väärtused ei tohi erineda üle 3 % nimiväärtustest. Kui need tingimused on täidetud, jätkata viivitamata. Vastasel korral teha kindlaks ja korrigeerida probleemi põhjused enne jätkamist.

5.5.8. Prooviekstraktide süstimine kromatograafi

Süstida kromatograafi puhastatud prooviekstraktid (5.4.2.2). Pärast iga kahte prooviekstrakti korrata võrdlusstandardi süstet (3.13.3) vastavalt järgmisele järjestusele: võrdlusstandard, ekstrakt, ekstrakt, võrdlusstandard, ekstrakt, ekstrakt, võrdlusstandard jne.

6. Kinnitav katse

6.1. Ekstrakti (5.4.2.2) edasine töötlemine

Lisada 5 ml naatriumkloriidi lahust (3.15.1) punktis 5.4.2.2 saadud lõppekstrakti. Ekstraheerida kolm korda jaotuslehtris (4.24.1), iga kord 2 ml kloroformiga (3.1) ühe minuti jooksul. Kallata kloroformiekstraktid u 1 g naatriumsulfaadile (3.15.2) 10 ml katsutisse. Võib kasutada väikest lehtrit (läbimõõduga 4 cm), mille kitsendis on u 1 g naatriumsulfaadiga kaetud vatitükk.

Pesta naatriumsulfaadi kiht mõne ml kloroformiga ning koguda samasse katsutisse. Aurustada kloroformiekstrakt kuivamiseni samas katsutis kasutades soojendusseadet (4.24.2) ning lahjendada uuesti 1 ml kloroformis.

6.2. Saaduse ettevalmistamine ning õhekihikromatograafia (planaarkromatograafia):

vt nõukogu direktiivi 76/372/EMÜ lisa meetod A, punkt 5.6.2.

7. Tulemuste arvutamine

Arvutada proovis oleva aflatoksiin B1 sisaldus (μm/kg) järgmise valemiga:

kus:

m = aflatoksiin B1 kogus (ng), mida esindab B1 proovi piik, mida arvutatakse järgmiselt:

P (proov) = aflatoksiin B1 piigi pindala kõnealuses proovis;

P (st1) = aflatoksiin B1 piigi pindala, mis tuleneb eelnevast võrdlusstandardi (3.13.3) süstest;

P (st2) = aflatoksiin B1 piigi pindala, mis tuleneb järgnevast võrdlusstandardi (3.13.3) süstest;

r (st) = süstitud aflatoksiin B1 kogus võrdlusstandardis (3.13.3), ng;

Vm = süstitud prooviekstrakti maht, ml;

Vext = prooviekstrakti lõplik maht (ml), mis võtab arvesse mis tahes lahjendamist (5.3);

M = proovi mass, g;

Vf = Florisil-padrunisse kantud filtraadi maht (5.4.1.2), ml;

Vc = proovi ekstraheerimiseks kasutatud kloroformi maht, ml.

Käesolevas protokollis esitatud menetluse järgimise korral saab valemi taandada järgmisele kujule:

aflatoksiin B1 sisaldus (μg/kg) = 20 × m.

7.1. Tulemuste arvutusi tohib teha ka piigikõrguse mõõtmise teel.

8. Korduvus:

vt punkt 10.1.

9. Korratavus:

vt punkt 10.1.

10. Märkused

10.1. Kordustäpsus

Rahvusvaheline ühisuuring ( 9 ) segasöötade kohta andis tabelis 1 esitatud tulemused korduvuse ja korratavuse kohta. Korduvus (r) tähendab suurimat suhtarvu, mis on kahe samast proovist samas laboris ja samadel tingimustel saadud kahe tulemuse võrdlusel 95 % tõenäosusega ebaoluline. Korratavus (R) tähendab sarnasel viisil saadud suhtarvu kahe eri laboratooriumi võrdlemisel. Kooskõlas standardiga ISO 3534-1977, 2.35 ( 10 ) ja komisjoni otsusega 89/610/EMÜ ( 11 ) on r ja R väärtused esitatud tabelis 1 variatsioonikordajatena.







Tabel 1 Korduvus (r) ja korratavus (R) väljendatuna suhtarvudena ning neile vastavate variatsioonikordajatena. (15 laborit) Tase r R CVr (1) CVR (µg/kg) (%) (%) 8 & 14 1,4 1,7 11 18 (1) CV = variatsioonikordaja

10.2. Kloroformi (3.1) stabiliseerimine

Florisil-padruni adsorptsiooniomadused võivad muutuda muu stabiliseerija kui etanooli kasutamisel. Seda tuleb kontrollida punkti 10.3 järgi, kui kloroformi ei ole võimalik kasutada.

10.3. Täpsus

Meetodi õige kohaldamise kontrollimiseks teha korduvaid mõõtmisi sertifitseeritud etalonainetega. Kui neid ei ole võimalik kasutada, tuleb meetodi toimivust kontrollida rikastatud tühiproovidega sooritatavate saagisekatsete abil. Keskmise kõrvalekalle tegelikust väärtusest, väljendatuna protsendina tegelikust väärtusest, ei tohiks väljuda vahemikust –20 kuni + 10 %.

Joonis 1: Kolonni-padruni koost

Joonis 2: Vedelikkromatograafisüsteemi vooskeem koos joodi kolonnijärgse derivatiseerimisega.

Joonis 3: Aflatoksiin B1 vastuse kõrvalekalde kompenseerimine regulaarsete vahemike järel võrdlusstandardi (3.13.3) kromatograafi süstimise teel

▼M3

C. MÄRKUSED MEETODITE A JA B KOHTA

1. Rasvatustamine

Üle 5 % rasva sisaldavad proovid tuleb pärast punktis 5.1. osutatud ettevalmistusi petrooleetriga (bp 40-60 °C) rasvatustada.

Sellistel juhtudel tuleb analüüsitulemusi väljendada rasvatustamata proovi kaalu põhjal.

2. Tulemuste reprodutseeritavus meetodi A puhul

Tulemuste reprodutseeritavus, st kahe või enama laboratooriumi poolt saadud proovi tulemuste erinevus on:

± 50 % 10—20 μg/kg aflatoksiin B keskväärtuste keskväärtusest;

± 10 μg/kg keskväärtuste keskväärtusest, mis on 20—50 μg/kg;

± 20 % keskväärtustest üle 50 μg/kg olevate keskväärtuste puhul.

▼B









Lisa liide

Joonis 1

Joonis 2

Joonis 3