Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest  
►B KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 440/2008,  
30. mai 2008,  
millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) 
nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja 
piiramist (REACH)  
(EMPs kohaldatav tekst)  
(ELT L 142, 31.5.2008, lk 1)  
Muudetud:  
Euroopa Liidu Teataja  
nr lehekülg  kuupäev  
►M1 Komisjoni määrus (EÜ) nr 761/2009, 23. juuli 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Komisjoni määrus (EL) nr 1152/2010, 8. detsember 2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Komisjoni määrus (EL) nr 640/2012, 6. juuli 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Komisjoni määrus (EL) nr 260/2014, 24. jaanuar 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Komisjoni määrus (EL) nr 900/2014, 15. juuli 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1
KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 440/2008,  
30. mai 2008,  
millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi 
ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide 
registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)  
(EMPs kohaldatav tekst)  
EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,  
võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,  
võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. 
aasta määrust (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreeri ­
mist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega 
asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ 
ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komis ­
joni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ, (
 1 ) eriti selle artikli 13 lõiget 3,  
ning arvestades järgmist:  
(1) Määruse (EÜ) nr 1907/2006 kohaselt tuleb katsemeetodid, mida 
kasutatakse teabe saamiseks aine omaduste kohta, võtta vastu ühenduse tasandil.
 
(2) Nõukogu 27. juuni 1967. aasta direktiivi nr 67/548/EMÜ (ohtlike 
ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta) (
 2 ) V lisas on esitatud meetodid 
ainete ja valmististe füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramiseks. Direktiivi 67/584/EMÜ V lisa on Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiviga 2006/121/EÜ jäetud välja alates 1. juunist 2008.
 
(3) Direktiivi 67/548/EMÜ V lisas esitatud katsemeetodid tuleks 
võtta üle käesolevasse määrusesse.  
(4) Käesoleva määrusega ei välistata muude katsemeetodite kasuta ­
mist, kui see on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 13 lõikega 3.  ▼
B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) ELT L 396, 30.12.2006, lk 1. Parandatud väljaandes ELT L 136, 29.5.2007, 
lk 3. 
( 2 ) EÜT 196, 16.8.1967, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud Euroopa Parla ­
mendi ja nõukogu direktiiviga 2006/121/EÜ (ELT L 396, 30.12.2006, lk 850), parandatud väljaandes ELT L 136, 29.5.2007, lk 281.
 (5) Katsemeetodite kavandamisel tuleks võtta täielikult arvesse loom ­
katsete asendamise, vähendamise ja täiustamise põhimõtteid, eriti kui sobivad valideeritud meetodid loomkatsete asendamiseks, vähendamiseks ja täiustamiseks on muutunud kättesaadavaks.
 
(6) Käesoleva määruse sätted on kooskõlas määruse (EÜ) 
nr 1907/2006 artikli 133 kohaselt asutatud komitee arvamusega,  
ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:  
Artikkel 1  
Määruse (EÜ) nr 1907/2006 rakendamisel kasutatavad katsemeetodid on 
esitatud käesoleva määruse lisas.  
Artikkel 2  
Komisjon vaatab käesolevas määruses esitatud katsemeetodeid vajaduse 
korral läbi, et asendada, vähendada ja täiustada selgroogsetega tehtavaid 
katseid.  
Artikkel 3  
Viiteid direktiivi 67/548/EMÜ V lisale tõlgendatakse viidetena käesole ­
vale määrusele.  
Artikkel 4  
Käesolev määrus jõustub järgmisel päeval pärast selle avaldamist  
Euroopa Liidu Teatajas . 
Käesolevat määrust kohaldatakse alates 1. juunist 2008.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
LISA  
A OSA: FÜÜSIKALIS-KEEMILISTE OMADUSTE MÄÄRAMISE 
MEETODID  
SISUKORD 
A.1. SULAMIS-/KÜLMUMISTEMPERATUUR 
A.2. KEEMISTEMPERATUUR 
A.3. SUHTELINE TIHEDUS A.4. AURURÕHK 
A.5. PINDPINEVUS 
A.6. LAHUSTUVUS VEES A.8. JAOTUSTEGUR 
A.9. LEEKPUNKT 
A.10. SÜTTIVUS (TAHKED AINED) A.11. SÜTTIVUS (GAASID) A.12. SÜTTIVUS (KOKKUPUUTEL VEEGA) 
A.13. TAHKETE AINETE JA VEDELIKE ISESÜTTIVUS 
A.14. PLAHVATUSOHTLIKKUS A.15. ISESÜTTIMISTEMPERATUUR (VEDELIKUD JA GAASID) 
A.16. TAHKETE AINETE SUHTELINE ISESÜTTIMISTEMPERA ­
TUUR 
A.17. OKSÜDEERIVAD OMADUSED (TAHKED AINED) 
A.18. POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA 
MOLEKULMASSIDE JAOTUS 
A.19. MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS POLÜ ­
MEERIS 
A.20. POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITU ­
MINE VEES 
A.21. OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD) A.22. KIUDUDE PIKKUSE JÄRGI KAALUTUD GEOMEETRILINE 
KESKMINE DIAMEETER
 
▼M4 
A.23. JAOTUSKOEFITSIENT (SÜSTEEMIS 1-OKTANOOL-VESI): 
AEGLASE SEGAMISE MEETOD  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. SULAMIS-/KÜLMUMISTEMPERATUUR  
1. MEETOD  
Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). 
Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kirjeldatud meetodid ja seadmed on ette nähtud ainete sulamistem ­
peratuuri määramiseks olenemata nende puhtusastmest.  
Meetodi valik sõltub analüüsitava aine iseloomust. Määravaks 
teguriks on see, kas aine on kergesti või raskesti või üldse mitte 
peenestatav.  
Mõnede ainete puhul on kohasem määrata külmumis- või tahkumis ­
temperatuur ning meetod sisaldab ka nende määramise standardeid.  
Kui aine teatavate omaduste tõttu ei ole otstarbekohane määrata 
ühtki eespool toodud parameetrit, võib otstarbekas olla määrata hangumistemperatuur.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Sulamistemperatuuri defineeritakse temperatuurina, mille juures aine 
läheb tahkest olekust vedelasse, ja ideaalis vastab see temperatuur külmumistemperatuurile.
 
Kuna paljude ainete puhul toimub faasisiire mingis temperatuuriva ­
hemikus, nimetatakse seda sageli sulamisvahemikuks.  
Ühikute teisendamine (K  o C-ks)  
t = T – 273,15  
t: temperatuur Celsiuse skaalal, Celsiuse kraadides (  o C) 
T: termodünaamiline temperatuur, kelvinites (K)  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks 
kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimalda ­
maks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.  
Mõned kaliibrimisained on loetletud viites 4.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Määratakse temperatuur (temperatuurivahemik), mille juures toimub 
faasisiire tahkest olekust vedelasse või vedelast olekust tahkesse. Praktikas määratakse testaine proovi atmosfäärirõhul kuumutamisel/ ­
jahutamisel sulamise/külmumise alg- ja lõppfaasi temperatuurid. 
Kirjeldatud viit tüüpi meetodeid, nimelt kapillaartorumeetodit, kuum ­
laua meetodeid, külmumistemperatuuri määramisi, termoanalüüsi ­
meetodeid ja (naftaõlide jaoks välja töötatud) hangumistemperatuuri 
määramist.
 
Teatud juhtudel võib olla otstarbekas määrata külmumistemperatuuri 
asemel sulamistemperatuur.  
1.4.1.  Kapillaartorumeetod  
1.4.1.1.  Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks  
Väike kogus peenestatud ainet viiakse kapillaartorusse ja surutakse 
tihedalt kokku. Kapillaartoru kuumutatakse koos termomeetriga, 
reguleerides temperatuuri tõusu nii, et tegeliku sulamisprotsessi ajal 
tõuseb temperatuur kiirusega umbes alla 1 K/min. Määratakse sula ­
mise alg- ja lõpptemperatuur.  
1.4.1.2.  Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks  
Põhimõttelt analoogsed punktis 1.4.1.1 kirjeldatuga, kuid kapillaar ­
toru ja termomeeter asuvad kuumutatavas metallplokis ning on 
vaadeldavad plokis olevate vaatlusavade kaudu.  
1.4.1.3.  Määramine fotoraku abil  
Kapillaartorus asuvat proovi kuumutatakse automaatrežiimil metall ­
silindris. Silindris oleva ava kaudu juhitakse läbi aine täppiskalii ­
britud fotorakule suunatud valguskiir. Enamiku ainete optilised omadused muutuvad sulades läbipaistmatust läbipaistvaks. Fotora ­
kuni jõudva valguse intensiivsus suureneb ja saadab kuumkambris 
asuva plaatina-takistustermomeetri temperatuuri digitaalnäidikule 
stoppsignaali. Mõnede tugeva värvusega ainete jaoks see meetod ei sobi.
 
1.4.2.  Kuumlauad  
1.4.2.1  Kofleri sulavuslaud  
Kofleri sulavuslaud koosneb kahest erineva soojusjuhtivusega elek ­
triliselt kuumutatavast metallosast, kusjuures laud on valmistatud selliselt, et temperatuurigradient on kogu selle pikkuses peaaegu lineaarne. Sulavuslaua temperatuur võib varieeruda piirides 
283–573 K ning sellel on spetsiaalne temperatuurinäidik antud lauale 
kohandatud skaala, osuti ja jooksikuga. Sulamistemperatuuri määra ­
miseks kantakse aine õhukese kihina otse sulavuslaua pinnale. Mõne sekundi jooksul kujuneb välja terav eraldusjoon vedela ja tahke faasi 
vahel. Temperatuuri eraldusjoonel loetakse osuti viimisega eraldus ­
joonele.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Sulavusmikroskoop  
Väga väikeste materjalikoguste sulamistemperatuuri määramisel 
kasutatakse mitmesuguste kuumlaudadega mikroskoope. Enamiku kuumlaudade puhul mõõdetakse temperatuuri tundliku termopaari 
abil, vahel kasutatakse aga elavhõbetermomeetrit. Tüüpilises sulavus ­
mikroskoobi kuumlauas on kuumkamber, milles olevale metallalu ­
sele asetatakse objektiklaasil olev proov. Metallaluse keskel on ava, mille kaudu siseneb mikroskoobi valguspeeglist lähtuv valgus. Kasu ­
tamise ajal suletakse kamber klaasplaadiga, mis takistab õhu juurde ­
pääsu proovile.
 
Proovi kuumutamist reguleeritakse reostaadiga. Väga täpseteks mõõt ­
misteks optiliselt anisotroopsete ainetega võib kasutada polariseeritud valgust.
 
1.4.2.3.  Meniskimeetod  
Seda meetodit kasutatakse eelkõige polüamiidide puhul.  
Temperatuur, mille juures kuumlaua ja polüamiid-katseobjektile 
toetuva katteklaasi vahele paigutatud silikoonõli menisk nihkub, määratakse visuaalselt.
 
1.4.3.  Külmumistemperatuuri määramise meetod  
Proov asetatakse spetsiaalsesse katseklaasi ja paigutatakse külmumis ­
temperatuuri määramiseks seadmesse. Jahutamise ajal segatakse proovi pidevalt kergelt ja mõõdetakse sobivate vaheaegade tagant temperatuuri. Niipea, kui temperatuur paari mõõtmise kestel püsima 
jääb, registreeritakse see temperatuur külmumistemperatuurina 
(arvestades ka termomeetri viga).
 
Vältida tuleb allajahutamist, säilitades tahke ja vedela faasi vahel 
tasakaalu.  
1.4.4.  Termoanalüüs  
1.4.4.1  Diferentsiaaltermoanalüüs (DTA)  
Registreeritakse ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogram ­
mile allutatud uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride erinevuse sõltuvus temperatuurist. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endotermilise (sula ­
mine) või eksotermilise (külmumine) kõrvalekaldena temperatuu ­
rikõvera nulljoonest.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2  Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria (SDK)  
Registreeritakse neelduva energia koguse sõltuvus temperatuurist 
ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuri ­
tavas aines ja võrdlusmaterjalis. Neelduv energia kulutatakse uuritava 
aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride ühtlustamisele. Kui proovis 
toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endoter ­
milise (sulamine) või eksotermilise (külmumine) kõrvalekaldena soojusbilansi kõvera nulljoonest.
 
1.4.5.  Hangumistemperatuur  
Meetod on välja töötatud naftaõlide jaoks ja sobib kasutamiseks 
madala sulamistemperatuuriga õlitaoliste ainete puhul.  
Pärast algset kuumutamist jahutatakse proovi kindla kiirusega ja 
jälgitakse iga 3 K tagant selle voolavust. Madalaim temperatuur, mille juures aine liikumist täheldatakse, registreeritakse hangumis ­
temperatuurina.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Erinevate sulamistemperatuuri/sulamisvahemiku määramise meeto ­
dite kohaldatavust ja täpsust kirjeldatakse järgmises tabelis.  
TABEL: MEETODITE KOHALDATAVUS  
A. Kapillaartorumeetodid  
Mõõtmismeetod Peenestatavad 
ained Raskesti 
peenestatavad 
ained Temperatuuriva ­
hemik Hinnanguline 
täpsus (  1 ) Olemasolev 
standard  
Vedelikuvanniga 
seadmed sulamis ­
temperatuuri 
määramiseks jah Ainult mõnede 
puhul 273–573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Metallplokiga 
seadmed sulamis ­
temperatuuri määramiseks jah Ainult mõnede 
puhul 293 kuni > 
573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Määramine foto ­
raku abil jah Lisaseadmete 
abil paljude 
puhul 253–573 K ± 0,5 K
 
( 1 ) Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Kuumlauad ja külmutamismeetodid  
Mõõtmismeetod Peenestatavad 
ained Raskesti 
peenestatavad 
ained Temperatuuriva ­
hemik Hinnanguline 
täpsus (  1 ) Olemasolev 
standard  
Kofleri sulavus ­
laud jah ei 283 kuni > 
573 K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
3451-76 
Sulavusmikro ­
skoop jah Ainult mõnede 
puhul 273 kuni > 
573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Meniskimeetod ei Eelkõige polüa ­
miidide puhul 293 kuni > 
573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Külmumistempe ­
ratuuri meetodid jah jah 223–573 K ± 0,5 K nt BS 4695  
( 1 ) Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.  
C. Termoanalüüs  
Mõõtmismeetod Peenestatavad 
ained Raskesti 
peenestatavad 
ained Temperatuuriva ­
hemik Hinnanguline 
täpsus (  1 ) Olemasolev 
standard  
Diferentsiaalter ­
moanalüüs jah jah 173 – 1 273 
K kuni 
600 K ± 0,5 
K kuni 
1 273 K ± 
2,0 K ASTM E 537-76 
Skaneeriv dife ­
rentsiaalkalori ­
meetria jah jah 173 – 1 273 
K kuni 
600 K±0,5Kk ­
uni 
1 273 K ± 2,0 
K ASTM E 537-76  
( 1 ) Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.  
D. Hangumistemperatuur  
Mõõtmismeetod Peenestatavad 
ained Raskesti 
peenestatavad 
ained Temperatuuriva ­
hemik Hinnanguline 
täpsus (  1 ) Olemasolev 
standard  
Hangumistempera ­
tuur Naftaõlide ja 
õlitaoliste 
ainete jaoks Naftaõlide ja 
õlitaoliste 
ainete jaoks 223–323 K ± 3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Sõltub seadme tüübist ja toimeaine puhtusastmest.  
1.6. MEETODITE KIRJELDUS  
Peaaegu kõigi katsemeetodite kirjeldus on ära toodud rahvusvahe ­
listes ja siseriiklikes standardites (vt liidet 1).  
1.6.1.  Kapillaartorumeetodid  
Temperatuuri aeglasel tõstmisel ilmnevad peenestatud ainete puhul 
tavaliselt joonisel 1 näidatud sulamisetapid.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Joonis 1
  
Sulamistemperatuuri määramisel registreeritakse temperatuur nii sula ­
mise alg- kui ka lõppfaasis.  
1.6.1.1.  Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks  
Joonisel 2 on näidatud standarditud klaasist sulamistemperatuuri 
määramise seadet (JIS K 0064); kõik mõõdud on millimeetrites.  
Joonis 2
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Vedelikuvannis kuumutamisel kasutatav vedelik  
Valida tuleks sobiv vedelik. Vedeliku valik sõltub määratavast sula ­
mistemperatuurist, nt sobib parafiinõli sulamistemperatuuridele kuni 
473 K, silikoonõli sulamistemperatuuridele kuni 573 K.  
523 K ületavate sulamistemperatuuride puhul võib kasutada segu 
kolmest osast väävelhappest ja kahest osast (massisuhtes) kaalium ­
sulfaadist. Seesuguste segude kasutamisel tuleb rakendada kohaseid ettevaatusabinõusid.
 
Termomeeter  
Kasutada tuleks ainult järgmiste või nendega võrdväärsete standar ­
dite nõuetele vastavaid termomeetreid:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Katse käik  
Kuiv aine peenestatakse uhmris ja viiakse ühest otsast kinnisesse 
kapillaartorusse nii, et pärast kokkusurumist täidab aine kapillaartoru 
3 mm ulatuses. Ühtlaselt tihendatud proovi saamiseks tuleks kapil ­
laartorul lasta klaastorus umbes 700 mm kõrguselt vertikaalselt vastu kellaklaasi kukkuda.
 
Täidetud kapillaartoru paigutatakse vanni nii, et termomeetri elavhõ ­
bedareservuaari keskosa puutub kapillaartoruga kokku kohas, kus asub proov. Tavaliselt asetatakse kapillaartoru seadmesse tempera ­
tuuril umbes 10 K alla sulamistemperatuuri.
 
Vannivedelikku soojendatakse nii, et temperatuur tõuseb umbes 3 
K/min. Soovitatav on vedelikku segada. Umbes 10 K enne eeldatava sulamistemperatuurini jõudmist vähendatakse temperatuuri tõusu 
kiiruseni mitte üle 1 K/min.
 
Arvutamine  
Sulamistemperatuur arvutatakse järgmiselt:  
T = T  D + 0,00016(T  D – T  E ) n 
kus: 
T = parandatud sulamistemperatuur (K)  
T D = termomeetri D temperatuurinäit (K)  
T E = termomeetri E temperatuurinäit (K)  
n = skaalajaotuste arv termomeetri D elavhõbedasamba väljaula ­
tuval osal  
1.6.1.2.  Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks  
Seade  
Koosneb:  
— silindrilisest metallplokist, mille ülaosa on õõnes ja moodustab 
kambri (vt joonist 3);  
— metallkorgist ühe või kahe avaga, mis võimaldavad metallplokki 
torusid paigaldada;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— metallploki kütteseadmest, mis võib olla lahendatud näiteks elek ­
tritakistusena plokis;  
— reostaadist võimsuse reguleerimiseks juhul, kui kasutatakse elek ­
trilist kütteseadet;  
— neljast üksteise suhtes täisnurga all paiknevast kuumuskindla 
klaasiga aknast kambri külgseintel. Ühe sellise akna ette on paigaldatud okulaar kapillaartoru jälgimiseks. Kolme ülejäänud 
akent kasutatakse sisemuse valgustamiseks lampide abil;
 
— ühest otsast kinnisest kuumuskindlast klaasist kapillaartorust 
(vt 1.6.1.1).  
Vt punktis 1.6.1.1 nimetatud standardeid. Sobivad ka võrreldava 
täpsusega termoelektrilised mõõteseadmed.  
Joonis 3
  
1.6.1.3.  Määramine fotoraku abil  
Seade ja katse käik  
Seade koosneb automaatse küttesüsteemiga metallkambrist. 
Kolm kapillaartoru täidetakse vastavalt punktile 1.6.1.1 ja 
paigutatakse ahju.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Seadme kaliibrimiseks on võimalik kasutada mitmesuguseid lineaar ­
seid temperatuuritõuse; sobivat temperatuuritõusu reguleeritakse 
elektriliselt vastavalt seadistatud konstantsele lineaarsele tõusukiiru ­
sele. Meerikud näitavad ahju tegelikku temperatuuri ja kapillaartorus oleva aine temperatuuri.
 
1.6.2.  Kuumlauad  
1.6.2.1.  Kofleri sulavuslaud  
Vt liidet.  
1.6.2.2.  Sulavusmikroskoop  
Vt liidet.  
1.6.2.3.  Meniskimeetod (polüamiididele)  
Vt liidet.  
Sulamistemperatuuri vahemikus ei tohiks temperatuur tõusta kiire ­
mini kui 1 K/min.  
1.6.3.  Külmumistemperatuuri määramise meetodid  
Vt liidet.  
1.6.4.  Termoanalüüs  
1.6.4.1.  Diferentsiaaltermoanalüüs  
Vt liidet.  
1.6.4.2.  Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria  
Vt liidet.  
1.6.5.  Hangumistemperatuuri määramine  
Vt liidet.  
2. ANDMED  
Mõningatel juhtudel on termomeetri näitusid vaja korrigeerida.  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— kasutatud meetodit;  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva 
puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);  
— hinnangulist täpsust.  
Sulamistemperatuurina registreeritakse vähemalt kahe hinnangulise 
täpsuse piiridesse (vt tabeleid) jääva mõõtetulemuse keskmine.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Kui sulamise alg- ja lõppfaasi temperatuuride vahe jääb meetodi 
hinnangulise täpsuse piiridesse, registreeritakse sulamistemperatuu ­
rina sulamise lõppfaasi temperatuur; vastasel juhul registreeritakse mõlemad väärtused.
 
Kui aine enne sulamistemperatuurini jõudmist laguneb või subli ­
meerub, registreeritakse temperatuur, mille juures see aset leiab.  
Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti 
lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.  
4. VIITED  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council 
C(81) 30 final.  
2. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.  
3. R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., 
New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.  
4. IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Liide  
Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda 
järgmiste standarditega.  
1. Kapillaartoru meetodid  
1.1. Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products
 
1.2. Metallplokiga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunsts ­
toffen 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”  
2. Kuumlauad  
2.1. Kofleri sulavuslaud 
ANSI/ASTM D 3451 76 Standard recommended practices 
for testing polymeric powder coatings  
2.2. Sulavusmikroskoop 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunsts ­
toffen  
2.3. Meniskimeetod (polüamiididele) 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion mate ­
rials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Determination 
du „point de fusion” Methode du 
ménisque  
3. Külmumistemperatuuri määramise meetodid  
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling 
Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Termoanalüüs  
4.1. Diferentsiaaltermoanalüüs 
ASTM E 537-76 Standard method for asseying the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe  
4.2. Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria 
ASTM E 537-76 Standard method for asseying the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe
 
5. Hangumistemperatuuri määramine  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des 
produits du pétrole: Point de trouble 
et point d'écoulement limite – Mons ­
terneming en ontleding van aardolie ­
producten: Troebelingspunt en vloei ­
punt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour 
point.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. KEEMISTEMPERATUUR  
1. MEETOD  
Enamik kirjeldatud meetoditest põhineb OECD katsesuunisel (1). 
Meetodite tööpõhimõtted on ära toodud viidetes 2 ja 3.  
1.1. SISSEJUHATUS  
Siin kirjeldatud meetodeid ja seadmeid saab kasutada vedelate ja 
madala sulamistemperatuuriga ainete korral eeldusel, et nendega ei 
toimu allpool keemistemperatuuri mingeid keemilisi reaktsioone (näiteks autooksüdatsiooni, ümberasetust, lagunemist jne). Meetodid sobivad kohaldamiseks nii puhastele kui ka lisanditega vedelikele.
 
Põhirõhk on pandud fotorakk-detektorit või termoanalüüsi kasutava ­
tele meetoditele, kuna need sobivad nii sulamis- kui ka keemistem ­
peratuuri määramiseks. Lisaks on mõõtmised automatiseeritavad.  
„Dünaamilise meetodi” eelis on sobivus ka aururõhu määramiseks 
ning puudub vajadus parandada keemistemperatuuri normaalrõhule (101,325 kPa), kuna rõhku on mõõtmise käigus võimalik manostaadi abil normaalrõhule reguleerida.
 
Märkused  
Lisandite mõju keemistemperatuuri määramisele sõltub olulisel 
määral lisandi iseloomust. Kui proov sisaldab tulemust mõjutada 
võivaid lenduvaid lisandeid, võib seda puhastada.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Keemistemperatuur normaalrõhul defineeritakse temperatuurina, 
mille juures vedeliku aururõhk on 101,325 kPa.  
Kui keemistemperatuuri ei määrata normaalrõhul, kirjeldab aururõhu 
sõltuvust temperatuurist Clausiuse-Clapeyroni võrrand:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ const : 
kus: 
P = aine aururõhk paskalites  
ΔH V = aine aurustumissoojus (J mol  -1 ) 
R = universaalne gaasikonstant = 8,314 (J mol  -1 K -1 ) 
T = termodünaamiline temperatuur (K)  
Keemistemperatuur registreeritakse mõõtmisaegse õhurõhu suhtes.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Teisendused  
Rõhk (ühikud: kPa)  
100 kPa = 1bar = 0,1 MPa 
(ühik „bar” on lubatud, kuid ei ole soovitatav)  
133 Pa = 1mm Hg=1 Torr 
(ühikud „mm Hg” ja „Torr” ei ole lubatud)  
1 atm = normaalatmosfäär = 101 325 Pa 
(ühik „atm” ei ole lubatud)  
Temperatuur (ühikud: K)  
t = T - 273,15  
t: temperatuur Celsiuse skaalal, Celsiuse kraadides (  o C) 
T: termodünaamiline temperatuur, kelvinites (K)  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks 
kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimalda ­
maks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.  
Mõned kaliibrimisained on ära toodud liites loetletud meetodites.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Viis meetodit keemistemperatuuri (keemistemperatuuri vahemiku) 
määramiseks põhinevad keemistemperatuuri mõõtmisel, ülejäänud 
kaks termoanalüüsil.  
1.4.1.  Määramine ebulliomeetri abil  
Ebulliomeetrid töötati algselt välja molaarmassi määramiseks keemis ­
temperatuuri tõusu järgi, kuid nad sobivad ka keemistemperatuuri 
täpseks mõõtmiseks. Väga lihtsat seadet kirjeldatakse ASTM D 1120-72 (vt liidet). Selles seadmes kuumutatakse vedelikku atmos ­
fäärirõhul tasakaalutingimustes kuni keemiseni.
 
1.4.2.  Dünaamiline meetod  
Selle meetodi kohaselt mõõdetakse keemise ajal tagasijooksus sobiva 
termomeetri abil auru kondensatsioonitemperatuur. Meetod 
võimaldab rõhku varieerida.  
1.4.3.  Destillatsioonimeetod keemistemperatuuri määramiseks  
Selle meetodi kohaselt mõõdetakse vedeliku destillatsioonil auru 
kondensatsioonitemperatuur ja destillaadi kogus.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Siwoloboffi meetod  
Proovi kuumutatakse katseklaasis vedelikuvannil. Katseklaasi paigu ­
tatakse alt kinni joodetud kapillaartoru, mille alumises osas on õhumull.
 
1.4.5.  Määramine fotoraku abil  
Mõõtmine tehakse eralduvate mullide põhjal automaatselt ja foto ­
elektriliselt, järgides Siwoloboffi meetodit.  
1.4.6.  Diferentsiaaltermoanalüüs  
Registreeritakse ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile 
allutatud uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride erinevuse sõltuvus temperatuurist. Kui proovis toimub entalpia muutusega 
seotud üleminek, väljendub see endotermilise (keemine) kõrvalekal ­
dena temperatuurikõvera nulljoonest.
 
1.4.7.  Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria  
Registreeritakse neelduva energia koguse sõltuvus temperatuurist 
ühele ja samale juhitavale temperatuuriprogrammile allutatud uuri ­
tavas aines ja võrdlusmaterjalis. Neelduv energia kulutatakse uuritava aine ja võrdlusmaterjali temperatuuride ühtlustamisele. Kui proovis toimub entalpia muutusega seotud üleminek, väljendub see endoter ­
milise (keemine) kõrvalekaldena soojusbilansi kõvera nulljoonest.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Erinevate keemistemperatuuri/keemistemperatuuri vahemiku määra ­
mise meetodite kohaldatavust ja täpsust kirjeldatakse tabelis 1.  
Tabel 1.  
Meetodite võrdlus  
Mõõtmismeetod Hinnanguline täpsus Olemasolev standard  
Ebulliomeeter ± 1,4 K (kuni 373 K) (  1 ), (  2 ) 
± 2,5 K (kuni 600 K) (  1 ), (  2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Dünaamiline meetod ± 0,5 K (kuni 600 K) (  2 ) 
Destillatsioonimeetod (keemistem ­
peratuuri vahemik) ± 0,5 K (kuni 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Siwoloboffi meetod ± 2 K (kuni 600 K) (  2 ) 
Määramine fotoraku abil ± 0,3 K (373 K juures) (  2 ) 
Diferentsiaaltermoanalüüs ± 0,5 K (kuni 600 K) 
± 2,0 K (kuni 1 273 K) ASTM E 537-76 
Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria ± 0,5 K (kuni 600 K) 
± 2,0 K (kuni 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) See täpsus kehtib ainult lihtsa, näiteks ASTM D 1120-72 kirjeldusele vastava seadme puhul; keerukamate ebullio ­
meetrite abil on täpsust võimalik suurendada. 
( 2 ) Kehtib ainult puhaste ainete puhul. Muudel juhtudel kasutamist tuleb põhjendada.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. MEETODITE KIRJELDUS  
Osade katsemeetodite kirjeldus on ära toodud rahvusvahelistes ja 
siseriiklikes standardites (vt liidet).  
1.6.1.  Ebulliomeeter  
Vt liidet.  
1.6.2.  Dünaamiline meetod  
Vt katsemeetodit A.4 aururõhu määramiseks.  
Registreeritakse 101 325 kPA avaldatavale rõhule vastav keemistem ­
peratuur.  
1.6.3.  Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik)  
Vt liidet.  
1.6.4.  Siwoloboffi meetod  
Ligikaudu 5 mm läbimõõduga katseklaasis olevat proovi kuumuta ­
takse sulamistemperatuuri määramise seadmes (joonis 1).  
Joonisel 1 on näidatud standarditud klaasist sulamis- ja keemis ­
temperatuuri määramise seade (JIS K 0064) (kõik mõõdud on 
millimeetrites).  
Joonis 1
  
Katseklaasi paigutatakse alumisest otsast ligikaudu 1 cm kauguselt 
kinni joodetud kapillaartoru (keedukapillaar). Lisatava testaine kogus valitakse selline, et kapillaartoru kinnijoodetud osa jääb allapoole 
vedeliku pinda. Keedukapillaariga katseklaas seotakse kas kummi ­
paelaga termomeetri külge või kinnitatakse külgtoega (vt joonist 2).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Joonis 2  
Siwoloboffi meetod  Joonis 3  
Muudetud meetod
  
Vedelikuvannis kuumutamisel kasutatav vedelik valitakse keemis ­
temperatuuri järgi. Temperatuuridel kuni 573 K võib kasutada sili ­
koonõli. Parafiinõli võib kasutada maksimaalselt temperatuurini 473 K. Vannivedelikku soojendatakse nii, et temperatuur tõuseb umbes 3 
K/min. Vannivedelikku tuleb segada. Umbes 10 K enne eeldatava 
keemistemperatuurini jõudmist vähendatakse soojendamist nii, et temperatuur tõuseb kiirusega alla 1 K/min. Keemistemperatuuri lähe ­
nedes hakkab keedukapillaarist kiiresti mulle eralduma.
 
Keemistemperatuur on selline temperatuur, mille juures mullide 
voog kiirel jahutamisel katkeb ning vedelikunivoo kapillaartorus 
hakkab järsult tõusma. Termomeetri vastav näit ongi aine keemistemperatuur.
 
Muudetud meetodi (joonis 3) kohaselt määratakse keemistemperatuur 
sulamistemperatuuri määramisel kasutatavas kapillaartorus. Selle ots tõmmatakse umbes 2 cm pikkuses peeneks (a) ja kapillaartorusse 
imetakse väike kogus proovi. Kapillaartoru avatud ots joodetakse 
kinni, nii et tippu jääb väike õhumull. Kuumutamisel sulamistempe ­
ratuuri määramise seadmes (b) õhumull paisub. Keemistemperatuur vastab temperatuurile, mille juures ainekork tõuseb vannivedeliku 
pinna tasemeni (c).
 
1.6.5.  Määramine fotoraku abil  
Kapillaartorus olevat proovi kuumutatakse soojendatavas metall ­
plokis.  
Plokis olevate vastavate avade kaudu juhitakse läbi aine täppiskalii ­
britud fotorakule suunatud valguskiir.  
Proovi temperatuuri tõusmisel hakkab keedukapillaarist üksikuid 
mulle eralduma. Keemistemperatuurile lähenedes kasvab eralduvate 
mullide arv märgatavalt. Selle tulemusel fotorakus registreeritava valguse intensiivsus suureneb ja saadab plokis asuva plaatinatakis ­
tustermomeetri temperatuuri näidikule stoppsignaali.
 
Meetod on väga mugav, kuna võimaldab ilma seadet muutmata 
mõõta keemistemperatuuri ka allpool toatemperatuuri kuni 
253,15 K (–20  o C). Selleks tuleb seade lihtsalt jahutusvanni 
paigutada.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Termoanalüüs  
1.6.6.1.  Diferentsiaaltermoanalüüs  
Vt liidet.  
1.6.6.2.  Skaneeriv diferentsiaalkalorimeetria  
Vt liidet.  
2. ANDMED  
Väikestel lahknevustel normaalrõhust (kuni ± 5 kPa) normaliseeri ­
takse keemistemperatuuri väärtused keemistemperatuurile normaal ­
rõhul (T  n ) järgmise Sidney Youngi arvväärtus-võrrandi abil:  
T n = T + (f  T × Δp) 
kus: 
Δp = (101,325 – p) (vt märki)  
p = mõõdetud rõhk (kPa)  
f T = keemistemperatuuri muutuse sõltuvus rõhust (K/kPa)  
T = mõõdetud keemistemperatuur (K)  
T n = normaalrõhule parandatud keemistemperatuur (K)  
Paljude ainete temperatuuriparandustegurid (f  T ) ning valemid nende 
ligikaudseks arvutamiseks on ära toodud eespool nimetatud rahvus ­
vahelistes ja siseriiklikes standardites.  
Näiteks toob DIN 53171 ära järgmised ligikaudsed parandustegurid 
värvides kasutatavatele lahustitele:  
Tabel 2.  
Temperatuuriparandustegurid f  T 
Temperatuur T (K) Parandustegur f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 
373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,4 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— kasutatud meetodit;  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva 
puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud);  
— hinnangulist täpsust.  
Keemistemperatuurina registreeritakse vähemalt kahe hinnangulise 
täpsuse piiridesse (vt tabel 1) jääva mõõtetulemuse keskmine.  
Ära tuuakse nii mõõdetud keemistemperatuurid kui ka nende kesk ­
mine; rõhud, mille juures mõõtmised tehti, registreeritakse kilopas ­
kalites (kPa). Eelistatavalt peaks rõhk olema lähedane normaalrõhule.  
Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti 
lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.  
4. VIITED  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council 
C (81) 30 final.  
2. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London 1975, volume II.  
3. R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publi ­
cations, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Liide  
Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda 
järgmiste standarditega.  
1. Ebulliomeeter  
1.1. Vedelikuvanniga seadmed sulamistemperatuuri määramiseks 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Destillatsioonimeetod (keemistemperatuuri vahemik)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Diferentsiaaltermoanalüüs ja skaneeriv diferentsiaalkalori ­
meetria  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of diffe ­
rential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. SUHTELINE TIHEDUS  
1. MEETOD  
Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1). Meetodite 
tööpõhimõte on ära toodud viites (2).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kirjeldatud suhtelise tiheduse määramise meetodid sobivad kohalda ­
miseks nii tahketele kui vedelatele ainetele, olenemata nende puhtu ­
sastmest. Tabelis 1 on ära toodud mitmesugused meetodid.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Tahkete ainete ja vedelike suhteline tihedus D  20 4 on 20  o C juures 
määratud kindla mahuga aine massi ja 4  o C juures määratud sama 
mahuga veekoguse massi suhe. Suhtelisel tihedusel puudub ühik.  
Aine tihedus (p) on tema massi (m) ja mahu (v) suhe.  
Tihedus (p) esitatakse SI-ühikutes (kg/m  3 ). 
1.3. VÕRDLUSAINED (1, 3)  
Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks 
kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimalda ­
maks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Kasutatakse nelja tüüpi meetodeid.  
1.4.1.  Ujuvusmeetodid  
1.4.1.1.  Hüdromeeter  (vedelike jaoks)  
Küllalt täpselt ja kiiresti saab tihedust määrata ujukhüdromeetrite 
abil, mille skaalajaotised võimaldavad vedeliku tiheduse määrata 
sukeldunud osa pikkuse põhjal.  
1.4.1.2.  Hüdrostaatilised kaalud  (vedelike ja tahkete ainete jaoks)  
Proovi tihedust on võimalik määrata selle õhus ja sobivas vedelikus 
(nt vees) mõõdetud masside vahe põhjal.  
Tahkete ainete puhul iseloomustab leitud tihedus ainult konkreetset 
proovi. Vedelike tiheduse määramiseks kaalutakse teadaoleva ruuma ­
laga (v) keha kõigepealt õhus ja siis vedelikus.  
1.4.1.3.  Sukeldatud keha meetod  (vedelike jaoks) (4)  
Selle meetodi kohaselt määratakse vedeliku tihedus vedeliku kaalu ­
misel enne ja pärast teadaoleva ruumalaga keha sukeldamist uurita ­
vasse vedelikku saadud masside vahe põhjal.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Püknomeetrit rakendavad meetodid  
Meetodid sobivad nii tahketele ainetele kui ka vedelikele, võimalik 
on kasutada erineva kujuga ja kindla ruumalaga püknomeetreid. Tihedus arvutatakse täis ja tühja püknomeetri masside vahe ja 
püknomeetri teadaoleva ruumala põhjal.
 
1.4.3.  Õhkvõrdluspüknomeeter  (tahkete ainete jaoks)  
Gaasvõrdluspüknomeetri abil on toatemperatuuril võimalik määrata 
mis tahes kujul oleva tahke aine tihedust. Aine ruumala mõõdetakse 
õhu või inertgaasiga täidetud muutuva kaliibritud mahuga silindris. Tiheduse arvutamiseks määratakse pärast ruumala mõõtmist aine mass.
 
1.4.4.  Resonantstihedusmõõtur  (5, 6, 7)  
Vedeliku tihedust on võimalik määrata resonantstihedusmõõturi abil. 
U-toruna konstrueeritud mehaaniline ostsillaator pannakse vibreerima ostsillaatori massist sõltuval resonantssagedusel. Proovi viimine U- 
torru muudab ostsillaatori resonantssagedust. Seade tuleb kaliibrida 
kahe vedelikuga, mille tihedus on teada. Vedelike valimisel tuleks eelistada selliseid, mille tihedused hõlmavad mõõdetavat vahemikku.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Erinevate suhtelise tiheduse määramise meetodite kohaldatavust 
kirjeldatakse allpool olevas tabelis.  
1.6. MEETODITE KIRJELDUS  
Liites on täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks esitatud 
näidetena standardeid.  
Katsed tuleb läbi viia 20  o C juures ja teha tuleb vähemalt kaks 
mõõtmist.  
2. ANDMED  
Vt standardeid.  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— kasutatud meetodit;  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmed ja lisandid) ja eelneva 
puhastusetapi kirjeldust (kui seda on rakendatud).  
Suhteline tihedus  D 20 
4 registreeritakse vastavalt punkti 1.2 definit ­
sioonile koos analüüsitava aine füüsikalise olekuga.  
Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti 
lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabel.  
Meetodite rakendatavus  
Mõõtmismeetod Tihedus Maksimaalne 
võimalik 
dünaamiline 
viskoossus Olemasolevad standardid 
tahke aine vedelik  
1.4.1.1. Hüdromeeter jah 5 Pa · s ISO 387 
ISO 649-2 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Hüdrostaatilised kaalud a) tahked ained jah ISO 1183 (A) b) vedelikud jah 5 Pa · s ISO 901 ja 758 
1.4.1.3. Sukeldatud keha meetod jah 20 Pa · s DIN 53217 
1.4.2. Püknomeeter ISO 3507 a) tahked ained jah ISO1183(B) 
NF T 20-053 
b) vedelikud jah 500 Pa · s ISO 758 
1.4.3. Õhkvõrdluspüknomeeter jah DIN 55990 Teil 3, 
DIN 53243 
1.4.4. Resonantstihedusmõõtur jah 5 Pa · s
 
4. VIITED  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council 
C(81) 30 final.  
2. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.
 
3. IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, 
vol. 48, 508.  
4. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11,427–430.
 
5. Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 
1970, vol. 19, 297-302.  
6. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische 
Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.
 
7. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Liide  
Täiendavate tehniliste üksikasjadega tutvumiseks võib näidetena tutvuda 
järgmiste standarditega.  
1. Ujuvusmeetodid  
1.1. Hüdromeeter 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – 
Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2. Hüdrostaatilised kaalud  
Tahkete ainete jaoks  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Vedelike jaoks  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ja ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method  
1.3. Sukeldatud keha meetod 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of density; immersed body method
 
2. Püknomeetrit rakendavad meetodid  
2.1. Vedelike jaoks 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a 
kinematic viscosity of less than l00.10- 6 m2 s-1 at 15
 o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a 
kinematic viscosity of less than l00 . 10- 
6 m  2 s-1 at 20  o C, applicable in particular 
also to hydrocarbons and aqueous solu ­
tions as well as to liquids with higher 
vapour pressure, approximately 1 bar at 
90 o C) ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high a 
vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by 
pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic 
compounds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer 
method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products 
by the capillary- stoppered pycnometer 
method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric 
method
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Tahkete ainete jaoks 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use 
-Determination of density of solids in 
powder and liquids -Pyknometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Õhkvõrdluspüknomeeter  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. AURURÕHK  
1. METOODIKA  
Käesolev metoodika on samaväärne standardiga OECD TG 104 
(2004).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolevas metoodika A.4(1) uuesti läbi vaadatud versioonis on 
esitatud üks täiendav mõõtemeetod, „Efusioonmeetod: isotermiline 
termogravimeetria”; see on välja töötatud väga madala aururõhuga (kuni 10
 –10 Pa) ainete jaoks. Arvestades vajadust meetodite järele, 
mis võimaldavad mõõta eeskätt madala aururõhuga ainete aururõhku, 
on ümber hinnatud ka käesoleva metoodika muude mõõtemeetodite 
rakenduspiirid.  
Termodünaamilise tasakaalu tingimustes sõltub puhta aine aururõhk 
ainult temperatuurist. Asjaomased põhimõtted on esitatud mujal (2, 3).  
Ükski mõõtmismeetod ei ole rakendatav kogu aururõhkude vahe ­
mikus – vähem kui 10  –10 Pa kuni 10  5 Pa. Sellepärast esitatakse 
käesolevas kirjelduses kaheksa aururõhu mõõtmise meetodit, mis 
on rakendatavad erinevates aururõhu vahemikes. Tabelis 1 on 
võrreldud nende meetodite rakendatavust ja mõõtevahemikke. Neid meetodeid saab kasutada üksnes ainete puhul, mis mõõtmistingi ­
mustes ei lagune. Juhul kui tehnilistel põhjustel eksperimentaalseid 
meetodeid ei saa kasutada, võib aururõhku ka hinnata; soovitatav 
hindamismeetod on esitatud liites.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Aine aururõhk on tema küllastatud auru rõhk vedelas või tahkes 
faasis oleva aine kohal.  
Tuleb kasutada rahvusvahelise mõõtühikute süsteemi (SI) rõhuü ­
hikut, milleks on paskal (Pa). Varem kasutusel olnud rõhuühikud ja nende teisendustegurid on järgmised: 
1 torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10
 2 Pa 
1 atmosfäär = 1,013 × 10  5 Pa 
1 baar = 10  5 Pa 
SI temperatuuriühik on kelvin (K). Celsiuse kraadid teisendatakse 
kelviniteks järgmise valemi abil:  
T = t + 273,15  
kus T on kelvinites väljendatud termodünaamiline temperatuur ja t 
on temperatuur Celsiuse kraadides.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabel 1  
Mõõtmismeetod Aine Hinnanguline 
korratavus Hinnanguline 
reprodutseeri ­
tavus Soovitatav 
mõõtevahemik Tahke Vedelik  
Dünaamiline 
meetod Kergsulav Jah kuni 25 % 
1–5 % kuni 25 % 
1–5 % 10 3 Pa kuni 2 × 
10 3 Pa, 
2 × 10  3 Pa kuni 
10 5 Pa 
Staatiline meetod Jah Jah 5–10 % 5–10 % 10 Pa kuni 10  5 Pa, 
10 –2 Pa kuni 10  5 
Pa (  1 ) 
Isoteniskoopiline 
meetod Jah Jah 5–10 % 5–10 % 10  2 Pa kuni10  5 Pa 
Efusioonmeetod: 
aururõhukaalud Jah Jah 5–20 % kuni 50 % 10  –3 kuni 1 Pa 
Efusioonmeetod: 
Knudseni rakk Jah Jah 10–30 % — 10  –10 kuni 1 Pa 
Efusioonmeetod: 
isotermiline termo ­
gravimeetria Jah Jah 5–30 % kuni 50 % 10  –10 kuni 1 Pa 
Gaasiküllastus ­
meetod Jah Jah 10–30 % kuni 50 % 10  –10 kuni 10  3 Pa 
Pöörleva kuuli 
meetod Jah Jah 10–20 % — 10  –4 kuni 0,5 Pa  
( 1 ) Mahtuvusmanomeetri kasutamise korral.  
1.3. MÕÕTMISE PÕHIMÕTE  
Üldiselt määratakse aururõhku erinevatel temperatuuridel. Kitsas 
temperatuurivahemikus sõltub puhta aine aururõhu logaritm lineaar ­
selt termodünaamilisest temperatuurist vastavalt lihtsustatud Clapeyron-Clausiuse võrrandile:
 
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ constant  
kus: 
p = aururõhk, Pa,  
ΔHv = aurustumissoojus, Jmol  –1 , 
R = universaalne gaasikonstant, 8,314 Jmol  –1 K –1 , 
T = temperatuur, K.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. STANDARDAINED  
Standardaineid ei ole tingimata vaja kasutada. Neid on vaja eeskätt 
selleks, et aeg-ajalt kontrollida meetodi suutlikkust ja võrrelda eri meetodite abil saadud tulemusi.
 
1.5. MEETODITE KIRJELDUS  
1.5.1.  Dünaamiline meetod (Cottrelli meetod)  
1.5.1.1.  Põhimõte  
Aururõhu määramiseks mõõdetakse aine keemistemperatuur erine ­
vatel teadaolevatel rõhkudel ligikaudu 10  3 –10  5 Pa vahemikus. Seda 
meetodit soovitatakse ka keemistemperatuuri määramiseks. Selleks 
saab kõnesolevat meetodit kasutada kuni temperatuurini 600 K. Vedelikusamba hüdrostaatilise rõhu tõttu on vedeliku keemistempe ­
ratuur 3–4 cm sügavusel ligikaudu 0,1 °C kõrgem kui vedeliku 
pinnal. Cottrelli meetodi (4) puhul asetatakse termomeeter aurudesse 
vedeliku pinna kohal ja keeval vedelikul lastakse pidevalt voolata üle termomeetri reservuaari. Termomeetri reservuaar on pidevalt kaetud õhukese vedelikukihiga, mis on tasakaalus atmosfäärirõhul oleva 
auruga. Seega vastab termomeetri näit tõelisele keemistemperatuurile, 
kusjuures mõõtmistulemus ei sisalda ülekuumenemisest või hüdros ­
taatilisest rõhust tingitud viga. Cottrelli poolt algselt kasutatud pump on kujutatud joonisel 1. Katseklaasis A on keev vedelik. Põhja külge 
joodetud plaatinatraat soodustab ühtlast keemist. Külgtoru C on 
ühendatud püstjahutiga; pritsmekaitse D ei lase termomeetril E puutuda kokku külma kondensaadiga. Kui vedelik katseklaasis A keeb, tõusevad lehtrisse sattunud mullid ja vedelik üles ning suuna ­
takse pumba F kahte haru pidi termomeetri reservuaarile.  
Joonis 1
 Joonis 2
  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrelli pump (4)  
A: termopaar  
B: anum vaakumi stabiliseerimiseks  
C: manomeeter  
D: vaakumpump  
E: mõõtmispunkt  
F: kütteelement, ligikaudu 150 W  
1.5.1.2.  Mõõteseade  
Joonisel 2 on kujutatud suurt täpsust võimaldav mõõteseade, milles 
on kasutatud Cottrelli põhimõtet. See kujutab endast toru, mille 
alumises osas keeb vedelik, keskmine osa kujutab endast jahutit 
ning ülemises osas on väljumisava ja äärik. Cottrelli pump asub keemissektsioonis, mida kütab elektriline padrunkuumuti. Tempera ­
tuuri mõõdetakse kaetud termopaari või takistustermomeetri abil, mis 
on viidud torusse ülevalt läbi äärikliite. Väljumisava on ühendatud 
rõhu reguleerimise süsteemiga. See hõlmab vaakumpumpa, anumat vaakumi stabiliseerimiseks, manostaati, millest lastakse seadmesse rõhu reguleerimiseks vajalikku lämmastikku, ja manomeetrit.
 
1.5.1.3.  Mõõtmise käik  
Aine viiakse keemissektsiooni. Kui tahke aine ei ole pulbri kujul, 
võib seejuures esineda raskusi, mille puhul mõnikord aitab jahutus ­
särgi kuumutamine. Seade suletakse äärikliitega ja ainest eemalda ­
takse gaasid. Vahutavate ainete aururõhku ei saa selle meetodiga 
mõõta.  
Seade reguleeritakse kõige madalamale vajalikule rõhule ja lülita ­
takse sisse küte. Samal ajal ühendatakse temperatuuriandur registree ­
rimisseadmega.  
Kui püsival rõhul registreeritakse püsiv keemistemperatuur, on 
saavutatud tasakaal. Eriti tuleb jälgida, et keemine ei oleks tõukeline. Lisaks sellele peab jälgima, et kondenseerumine jahutis oleks täielik. Kui määratakse kergsulava tahke aine aururõhku, tuleb jälgida, et 
jahuti ei ummistuks.
 
Pärast tasakaalupunkti registreerimist reguleeritakse seade kõrgemale 
rõhule. Mõõtmisi jätkatakse samal viisil, kuni saavutatakse rõhk 10  5 
Pa (aururõhk mõõdetakse kokku ligikaudu 5–10 tasakaalupunktis). 
Kontrolliks korratakse mõõtmist tasakaalupunktides alaneva rõhu järjekorras.
 
1.5.2.  Staatiline meetod  
1.5.2.1.  Põhimõte  
Staatilise meetodi (5) puhul määratakse termodünaamilisele tasakaa ­
lule vastav aururõhk kindlaksmääratud temperatuuril. See meetod sobib individuaalsete ainete ning mitmekomponendiliste vedelike ja 
tahkete ainete segude puhul rõhuvahemikus 10
 –1 kuni 10  5 Pa ja, kui 
rakendatakse ettevaatusabinõusid, ka rõhuvahemikus 1–10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Mõõteseade  
Mõõteseade koosneb termostateeritud vannist (täpsus ± 0,2 K), 
vaakumsüsteemiga ühendatud proovinõust, manomeetrist ja rõhu reguleerimise süsteemist. Proovinõu (joonis 3a) ühendatakse kraani 
ja nullindikaatorina kasutatava diferentsiaalmanomeetri (sobiva 
manomeetrivedelikuga U-toru) kaudu vaakumsüsteemiga. Olenevalt rõhuvahemikust ja uuritava aine keemilistest omadustest võib dife ­
rentsiaalmanomeetris kasutada elavhõbedat, silikoonõlisid või 
ftalaate. Keskkonnakaitse kaalutlustel tuleks elavhõbeda kasutamisest 
võimaluse korral hoiduda. Uuritav aine ei tohi U-torus olevas vede ­
likus märgatavalt lahustuda või sellega reageerida. U-toru asemel 
võib kasutada ka mõnda muud rõhumõõturit (joonis 3b). Normaal ­
rõhust kuni rõhuni 10
 2 Pa võib manomeetrivedelikuna kasutada elav ­
hõbedat; kui rõhk on vahemikus 10–10  2 Pa, võib kasutada silikoo ­
nõlisid ja ftalaate. Rõhul alla 10  2 Pa võib kasutada ka muid rõhu ­
mõõtureid; kuumutatava membraaniga mahtuvusmanomeetrit võib 
kasutada isegi rõhul alla 10  –1 Pa. Temperatuuri mõõdetakse kas 
proovinõu seina välisküljel või proovinõus.  
1.5.2.3.  Mõõtmise käik  
Kui kasutatakse joonisel 3a kujutatud mõõteseadet, täidetakse U-toru 
selleks valitud vedelikuga, mis tuleb enne näidu registreerimist gaasi ­
dest kõrgendatud temperatuuri abil vabastada. Uuritav aine viiakse mõõteseadmesse ja vabastatakse gaasidest madalal temperatuuril. Kui tegemist on mitmekomponendilise prooviga, peab temperatuur olema 
piisavalt madal, et seejuures ei muutuks materjali koostis. Tasakaalu 
kiiremaks saavutamiseks võib proovi segada. Proovi võib jahutada vedela lämmastiku või kuiva jääga, kuid seejuures tuleb jälgida, et õhk ja väljapumbatav gaas ei kondenseeruks. Proovinõu kohal oleva 
kraani avamisega ühendatakse nõu mõneks minutiks vaakuumsüstee ­
miga, et eemaldada õhk. Vajaduse puhul korratakse gaaside eemal ­
damist mitu korda.  
Joonis 3a
 Joonis 3b
  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Kui proovi kuumutamise ajal on kraan suletud, siis aururõhk tõuseb. 
See muudab U-torus oleva vedeliku tasakaaluasendit. Selle kompen ­
seerimiseks lastakse seadmesse lämmastikku või õhku, kuni diferent ­
siaalrõhu indikaator on uuesti nullasendis. Selleks vajalik rõhk loetakse manomeetrilt või suurema täpsusega mõõteriistalt. See 
rõhk vastab aine aururõhule mõõtmistemperatuuril. Kui kasutatakse 
joonisel 3b kujutatud mõõteseadet, võib aururõhu näidu lugeda otse seadmelt.
 
Aururõhk määratakse piisavalt väikeste temperatuurivahemike tagant 
kuni vajaliku kõrgeima temperatuurini (aururõhk mõõdetakse kokku umbes 5–10 tasakaalupunktis).
 
Kontrolliks korratakse näitude registreerimist madalal temperatuuril. 
Kui kordamisel saadud väärtused ei lange kokku temperatuuri tõst ­
misel saadud kõveraga, võib põhjuseks olla üks järgmistest asja ­
oludest:  
i) proov sisaldab ikka veel õhku (nt suure viskoossusega materjalide 
puhul) või kuumutamisel eraldunud madala keemistemperatuuriga aineid;
 
ii) uuritavas temperatuurivahemikus toimub ainega keemiline reakt ­
sioon (nt lagunemine või polümerisatsioon).  
1.5.3.  Isoteniskoopiline meetod  
1.5.3.1.  Põhimõte  
Isoteniskoop (6) töötab staatilise meetodi põhimõttel. Proov viiakse 
termostateeritud kolbi, mis on ühendatud manomeetri ja vaakum ­
pumbaga. Uuritavast ainest kergemini lenduvad lisandid 
eemaldatakse degaseerimisega alarõhul. Proovi aururõhk valitud 
temperatuuril tasakaalustatakse inertse gaasi rõhuga, mille väärtus on teada. Isoteniskoop töötati välja teatavate vedelate süsivesinike aururõhu määramiseks, kuid ta sobib ka tahkete ainete uurimiseks. 
Harilikult ei sobi kõnesolev meetod mitmekomponendiliste süstee ­
mide puhul kasutamiseks. Mittelenduvaid lisandeid sisaldavate proo ­
vide korral on mõõtmistulemuste viga väike. Soovitatav määramis ­
vahemik on 10
 2 –10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Mõõteseade  
Mõõteseadme näidis on esitatud joonisel 4. Seadme täielik kirjeldus 
on standardis ASTM D 2879–86 (6).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Mõõtmise käik  
Vedelate ainete puhul on diferentsiaalmanomeetri vedelikuks uuritav 
aine ise. Isoteniskoopi viiakse vedelikukogus, mis on küllaldane reservuaari ja manomeetri lühikese haru täitmiseks. Isoteniskoop ühendatakse vaakumsüsteemiga, sellest eemaldatakse õhk ning see 
täidetakse seejärel lämmastikuga. Süsteemist gaasi väljapumpamist 
ja süsteemi täitmist lämmastikuga korratakse kaks korda, et eemal ­
dada kogu hapnik. Täidetud isoteniskoop asetatakse horisontaalselt, nii et proov valgub õhukese kihina reservuaaris ja manomeetris laiali. 
Rõhk süsteemis langetatakse 133 paskalini ja proovi kuumutatakse 
ettevaatlikult, kuni see hakkab keema (seda tehakse lahustunud gaaside kõrvaldamiseks). Isoteniskoop asetatakse seejärel nii, et proov voolab tagasi reservuaari ja täidab manomeetri lühikese 
haru. Rõhku hoitakse 133 Pa juures. Proovireservuaari väljavenitatud 
tippu kuumutatakse väikesel leegil, kuni proovi aurud küllaldaselt paisuvad ning suruvad osa proovist reservuaari ülaosast ja mano ­
meetri lühikesest harust manomeetri ülejäänud ossa, nii et tekib 
auruga täidetud lämmastikuvaba ruum. Isoteniskoop paigutatakse 
seejärel termostateeritud vanni ja lämmastiku rõhk võrdsustatakse proovipoolse ruumi rõhuga. Tasakaaluolekus on lämmastiku rõhk võrdne aine aururõhuga.
 
Joonis 4
  
Tahkete ainete puhul kasutatakse rõhust ja temperatuurivahemikust 
olenevalt selliseid manomeetrivedelikke, nagu silikoonõlid ja 
ftalaadid. Gaasidest vabastatud manomeetrivedelik viiakse isotenis ­
koobi pikal harul olevasse laiemasse ossa. Uuritav tahke aine pannakse proovikolbi ja vabastatakse gaasidest kõrgendatud tempe ­
ratuuril. Seejärel kallutatakse isoteniskoopi nii, et manomeetrivedelik 
voolab U-torusse.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Efusioonmeetod: aururõhukaalud  (7) 
1.5.4.1.  Põhimõte  
Uuritava aine proovi kuumutatakse väikeses ahjus ja asetatakse 
vakumeeritud klaaskupli alla. Ahi on kaetud kaanega, milles on 
väikesed teadaoleva läbimõõduga avad. Ühest avast väljuv aine aur 
juhitakse sama vakumeeritud klaaskupli all asuva kõrgtundliku kaalu kausile. Mõne seadmetüübi puhul asub kaalukauss külmkambris, mis tagab soojuse hajumise väljapoole soojusjuhtivuse teel; kaalukauss 
jahtub soojuskiirguse arvel ja avast väljuv aur kondenseerub kaalu ­
kausil. Aurujoa impulss toimib kaalukausile mõjuva jõuna. Aururõhu võib arvutada kahel viisil: kas otse kaalukausile mõjuva jõu põhjal 
või aurustumiskiiruse alusel, kasutades Hertz-Knudseni valemit (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
kus: 
G = aurustumiskiirus (kgs  –1 m –2 ), 
M = molaarmass (gmol  –1 ), 
T = temperatuur (K),  
R = universaalne gaasikonstant (Jmol  –1 K –1 ), 
p = aururõhk (Pa).  
Soovitatav määramisvahemik on 10  –3 kuni 1 Pa.  
1.5.4.2.  Mõõteseade  
Seadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 5.  
Joonis 5
  
A: alusplaat F: külmkamber ja jahutuslatt 
B: magnetelektriline seade G aurustusahi 
C: klaaskuppel H: Dewari anum vedela lämmastikuga D: kaalud ja kaalukauss I: proovi temperatuuri mõõtur 
E: vaakumimõõtur J: uuritav proov
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Efusioonmeetod: Knudseni rakk  
1.5.5.1.  Põhimõte  
Meetodi aluseks on kõrgvaakumi tingimustes Knudseni raku (8) 
mikroavast ajaühikus auruna väljuva uuritava aine massi määramine. 
Väljavoolanud auru massi võib leida kas raku massi vähenemise 
määramise kaudu või auru madalal temperatuuril kondenseerimise ja lendunud ainekoguse kromatograafilise määramisega. Aururõhk arvutatakse Hertz-Knudseni võrrandi abil (vt punkt 1.5.4.1), kasu ­
tades seadme parameetritest sõltuvat parandustegurit (9). Soovitatav 
aururõhu vahemik on 10
 –10 kuni 1 Pa (10, 11, 12, 13, 14).  
1.5.5.2.  Mõõteseade  
Seadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 6.  
Joonis 6
  
1: ühendus vaakumsüsteemiga 7: keermega kaas 
2: pesad plaatina-takistustermomeetri või 
temperatuuri mõõtmise ja reguleerimise seadme jaoks 8: liblikmutrid 
3: vaakummahuti kaas 9: poldid 
4: O-rõngas 10: roostevabast terasest efusioonirakud 
5: alumiiniumist vaakummahuti 11: padrunkuumuti 6: efusioonirakkude paigaldamise ja eemal ­
damise seade
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Efusioonmeetod: isotermiline termogravimeetria  
1.5.6.1.  Põhimõte  
Meetod põhineb uuritava aine kiirenenud aurustumise määramisel 
kõrgendatud temperatuuril ja normaalrõhul termogravimeetria abil 
(10, 15, 16, 17, 18, 19, (20). Aurustumiskiiruse v  T määramiseks 
hoitakse uuritavat ainet aeglaselt voolava inertgaasi atmosfääris kind ­
laksmääratud isotermilisel temperatuuril T (kelvinites) ja jälgitakse vajaliku ajavahemiku jooksul, kuidas väheneb ainekoguse mass. 
Aururõhud p
 T arvutatakse v  T väärtuste põhjal, kasutades aururõhu 
logaritmi ja aurustumiskiiruse logaritmi lineaarset seost. Vajaduse korral võib tulemused ekstrapoleerida temperatuuridele 20 ja 
25 °C, rakendades regressioonanalüüsi koordinaatides log p
 T vs. 
1/T. See meetod sobib ainete puhul, mille aururõhk on 10  –10 Pa 
(10 –12 mbar) ja puhtusaste on võimalikult lähedane 100 protsendile, 
et vältida mõõdetava massi vähenemise ekslikku tõlgendamist.  
1.5.6.2.  Mõõteseade  
Mõõteseadme üldpõhimõte on esitatud joonisel 7.  
Joonis 7
  
Proov kandeplaadil, mis ripub mikrokaalul reguleeritava temperatuu ­
riga kambris, asub kuiva lämmastiku voolus, mis kannab uuritava 
aine aurustunud molekulid ära. Kambrist väljuv gaas puhastatakse 
sorptsiooniseadmes.  
1.5.6.3.  Mõõtmise käik  
Uuritav aine kantakse ühtlase kihina karestatud klaasplaadi pinnale. 
Tahke aine puhul niisutatakse plaat ühtlaselt aine lahusega sobivas lahustis ja kuivatatakse inertgaasi atmosfääris. Ainekihiga klaasplaat 
riputatakse mõõtmiste tegemiseks termogravimeetrilisse analüsaato ­
risse ja mõõdetakse pidevalt klaasplaadi massi vähenemist ajas.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Aurustumiskiirus v  T kindlaksmääratud temperatuuril arvutatakse 
proovi massi vähenemise Δm alusel järgmise valemi abil:  
v T ¼ Δm 
F Ö t gcm  –2 h –1 Ê Ì  
kus F on klaasplaati katva aine pindala (tavaliselt võrdne klaasplaadi 
pindalaga) ja t on aeg, mille jooksul mass vähenes.  
Aururõhk p  T arvutatakse aurustumiskiirust v  T väljendava funktsiooni 
alusel:  
log p  T = C + D log v  T 
kus C ja D on katseseadet iseloomustavad konstandid, mis olenevad 
mõõtekambri läbimõõdust ja gaasivoo kiirusest. Need konstandid määratakse üks kord, mõõtes teadaoleva aururõhuga ainete seeria aurustumiskiirused ja kasutades regressioonanalüüsi log p
 T vs. log 
v T (11, 21, 22).  
Aururõhu p  T ja kelvinites väljendatud temperatuuri T vahelist seost 
kajastab võrrand  
log p  T = A + B 1/T  
kus A ja B on regressioonseosest log p  T vs. 1/T saadud konstandid. 
Selle võrrandi alusel saab arvutada aururõhu mis tahes muu tempe ­
ratuuri juures ekstrapoleerimise teel.  
1.5.7.  Gaasiküllastusmeetod  (23)  
1.5.7.1.  Põhimõte  
Üle või läbi uuritava aine proovi voolutatakse toatemperatuuril inert ­
gaasi teadaoleva piisavalt väikese kiirusega, mis tagab gaasi küllas ­
tumise. Gaasifaasi küllastamine on väga tähtis. Kaasa kandunud aine kogutakse, kasutades püüdurina enamasti sorbenti, ja määratakse selle kogus. Auru püüdmise ja edasise analüüsi alternatiivina võib 
kaasa kandunud materjali koguse määramiseks kasutada ka järjes ­
tikku ühendatud analüüsiseadet, näiteks gaasikromatograafi. Auru ­
rõhu arvutamisel eeldatakse, et süsteem järgib ideaalse gaasi oleku ­
võrrandit ja gaasisegu üldrõhk on võrdne komponentgaaside rõhkude 
summaga. Uuritava aine partsiaalrõhu ehk aururõhu arvutamisel 
lähtutakse teadaolevast gaasi ruumalast ja kaasa kantud materjali massist.
 
Gaasiküllastusmeetod on rakendatav nii tahkete kui ka vedelate 
ainete korral. Seda võib kasutada ka madalal rõhul kuni 10  –10 Pa 
(10, 11, 12, 13, 14). Kõnesolev meetod on kõige usaldusväärsem aururõhul alla 10
 3 Pa. Aururõhul üle 10  3 Pa saadakse tavaliselt õige ­
test suuremad väärtused, mis on tõenäoliselt tingitud aerosooli tekki ­
misest. Kuna aururõhu mõõtmised tehakse toatemperatuuril, ei ole 
vaja ekstrapoleerida kõrgetel temperatuuridel saadud andmeid; sellega välditakse sageli tõsiseid vigu põhjustavat ekstrapoleerimist kõrgetelt temperatuuridelt.
 
1.5.7.2.  Mõõteseade  
Mõõtmiseks on vaja konstantse temperatuuriga kambrit. Joonisel 8 
oleval skeemil on kamber, milles on kolm hoidlit tahketele proovi ­
dele ja kolm hoidlit vedelatele proovidele; see võimaldab teha tahke 
või vedela prooviga kolm analüüsi. Temperatuuri reguleeritakse 
± 0,5 °C või suurema täpsusega.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Joonis 8
  
Üldiselt kasutatakse inertse kandegaasina lämmastikku, kuid mõni ­
kord on vaja kasutada ka muid gaase (24). Kandegaas peab olema kuiv. Gaasivoog jaotatakse kuueks vooks, mida reguleeritakse nõel ­
ventiilide abil (ava läbimõõt ligikaudu 0,79 mm); need vood juhi ­
takse 3,8 mm siseläbimõõduga vasktorude kaudu kambrisse. Pärast temperatuuri tasakaalustumist läbib gaas proovi ja sorbentpüünise ning väljub kambrist.
 
Tahke proov asetatakse 5-millimeetrise siseläbimõõduga klaastorusse 
klaasvillast korkide vahele (vt joonis 9). Joonisel 10 on näidatud vedela proovi hoidel ja sorptsioonisõlm. Vedeliku aururõhu mõõt ­
mised on kõige paremini reprodutseeritavad, kui vedelik kantakse 
klaashelmestele või mõnele muule inertsele sorbendile, nagu räni ­
dioksiid, ning hoidel täidetakse selliselt kaetud helmestega. Alterna ­
tiivina võib kandegaasi voolutada läbi jämeda friti või barboteerida uuritava vedelikuga täidetud kolonni kandegaasiga.  
Joonis 9
 Joonis 10
  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Sorptsioonisõlmes on eel- ja järeladsorptsiooni sektsioon. Väga 
madala aururõhu puhul võib olla tõsiseks probleemiks adsorptsioon 
proovi ning adsorbendi vahel oleval klaasvillal ja klaastorudel, kusjuures sorbendile jääb ainult väike kogus uuritavat ainet.
 
Tõhus viis aurustunud materjali kogumiseks on kasutada süsihappe ­
lumega jahutatavat püüdurit. Selline püüdur ei avalda vasturõhku 
küllastuskolonnile ja sellest on kerge püütud materjali kvantitatiivselt eemaldada.
 
1.5.7.3.  Mõõtmise käik  
Kandegaasi voolukiirust mõõdetakse toatemperatuuril. Voolukiirust 
kontrollitakse katse ajal sageli, et tagada kandegaasi üldmahu õige 
määramine. Parem on seda massivoolumõõturi abil pidevalt mõõta. Gaasifaasi küllastumiseks peab kokkupuuteaeg olema küllalt pikk ja gaasivoolu kiirus väike (25).
 
Katse lõpus analüüsitakse eel- ja järeladsorptsiooni sektsiooni eraldi. 
Kummastki sektsioonist desorbeeritakse uuritav aine lahusti abil. Saadud lahuseid analüüsitakse kvantitatiivselt kummastki sektsioonist desorbeeritud massi määramiseks. Analüüsimeetodi (ja ka sorbendi ja 
desorbeeriva lahusti) valik oleneb uuritavast ainest. Desorptsiooni 
täielikkuse määramiseks kantakse teadaolev kogus uuritavat proovi sorbendile, desorbeeritakse, ja määratakse aine saagis. Desorptsiooni tõhusust on vaja kontrollida samal või ligikaudu samal uuritava 
proovi kontsentratsioonil, mis esineb mõõtmise puhul.
 
Tagamaks, et kandegaas on uuritava ainega küllastunud, kasutatakse 
kolme erinevat gaasivoolu kiirust. Kui arvutatud aururõhk ei olene voolukiirusest, peetakse kandegaasi küllastunuks.
 
Aururõhk arvutatakse järgmise valemi abil:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
kus: 
p = aururõhk (Pa),  
W = aurustunud uuritava aine mass (g),  
V = küllastunud kandegaasi maht (m  3 ), 
R = universaalne gaasikonstant, 8,314 (Jmol  –1 K –1 ), 
T = temperatuur (K),  
M = uuritava aine molaarmass (gmol  –1 ). 
Mõõdetud mahu väärtusi on vaja parandada, et arvestada rõhu ja 
temperatuuri erinevusi voolumõõturis ja küllastuskolonnis.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Pöörleva kuuli meetod  
1.5.8.1.  Põhimõte  
Selle meetodi puhul kasutatakse pöörleva kuuli põhimõttel töötavat 
viskoossusmõõturit, mille mõõteelement on magnetväljas hõljuv 
väike teraskuul, mis pannakse pöörlevate magnetväljade abil pöör ­
lema (26, 27, 28). Kuuli pöörlemiskiirust saab mõõta andurmähiste abil. Kui kuul on jõudnud ettenähtud pöörlemiskiiruseni (tavaliselt umbes 400 pööret sekundis), lõpetatakse edasine kiirendamine ja 
kuuli pöörlemine hakkab hõõrdumise tõttu gaasikeskkonnas aeglus ­
tuma. Mõõdetakse pöörlemiskiiruse vähenemise sõltuvust ajast. Aururõhk tuletatakse teraskuulikese pöörlemiskiiruse vähenemisest, 
mis oleneb rõhust. Soovitatav määramisvahemik on 10
 –4 kuni 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Mõõteseade  
Katseseadme skeem on esitatud joonisel 11. Mõõtepea asetatakse 
0,1 °C täpsusega termostateeritavasse kambrisse. Proovinõu paiguta ­
takse 0,1 °C täpsusega termostateeritud eraldi kambrisse ning seadme 
kõiki ülejäänud osi hoitakse kondensatsiooni vältimiseks kõrgemal 
temperatuuril. Kogu seade on ühendatud kõrgvaakumsüsteemiga.  
Joonis 11
  
2. MÕÕTMISANDMED JA MÕÕTMISPROTOKOLLI KOOSTA ­
MINE  
2.1. MÕÕTMISANDMED  
Mis tahes eespool kirjeldatud meetodi kasutamise puhul määratakse 
aururõhk vähemalt kahel temperatuuril. Aururõhu sõltuvuse lineaar ­
suse kontrollimiseks tuleks eelistada aururõhu määramist kolmel või 
enamal temperatuuril vahemikus 0–50 °C. Efusioonmeetodite (Knud ­
seni rakk ja isotermiline termogravimeetria) ning gaasiküllastusmee ­
todi korral on temperatuurivahemiku 0–50 °C asemel soovitatav mõõta aururõhud vahemikus 120–150 °C.
 
2.2. MÕÕTMISPROTOKOLL  
Mõõtmisprotokollis esitatakse järgmine teave:  
— kasutatud meetod;  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— aine täpne iseloomustus (identifitseerimiseks vajalikud andmed, 
lisandid) ja eelneva puhastusetapi kirjeldus (kui ainet puhastati);  
— vähemalt kaks, parem aga kolm või enam aururõhu ja tempera ­
tuuri väärtust vahemikus 0–50 °C (või 120–150 °C);  
— kui see valitud meetodi puhul on tehniliselt võimalik, peaks 
vähemalt üks temperatuur olema 25 °C või madalam;  
— kõik originaalandmed;  
— kõver log p  versus  1/T;  
— hinnanguline aururõhu väärtus 20 või 25 °C juures.  
Kui esineb aine oleku muutusi (agregaatoleku muutumine, lagune ­
mine), märgitakse järgmine teave:  
— muutuse laad;  
— atmosfäärirõhule vastav temperatuur, mille juures muutus toimub;  
— aururõhk 10 ja 20 °C allpool olekumuutuse temperatuuri ning 10 
ja 20 °C ülalpool seda temperatuuri (välja arvatud juhtum, kui agregaatolek muutub tahkest gaasiliseks).
 
Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad andmed 
ja tähelepanekud, eriti sellised, mis käsitlevad lisandeid ja aine füüsi ­
kalist olekut.  
3. KIRJANDUS  
1) Official Journal of the European Communities L 383 A, 26–47 
(1992).  
2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.
 
4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa – Static 
method.  
6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope.  
7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use –Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521–532.  
11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000).  
12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22–28.  
13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269–278.  
14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122.  
15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147.
 
16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393–400.
 
17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Rela ­
tionship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesti ­
cide Science 13 (1982) 161–168.  
18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995) 27–31.
 
19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310.
 
20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 
87(12) (1998) 1512–20.
 
21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range –25 °C to 150 °C.
 
22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 
(2002).  
23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal 
Register, Washington DC  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642.  
28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Liide  
Hindamismeetod  
SISSEJUHATUS  
Hinnangulisi aururõhu väärtusi võib kasutada järgmistel juhtudel:  
— sobiva katsemeetodi valimiseks;  
— hinnangu või piirväärtuse andmiseks juhtudel, kui tehnilistel põhjustel ei saa 
mõõtmismeetodeid rakendada.  
HINDAMISMEETOD  
Vedelike ja tahkete ainete aururõhu hindamiseks võib kasutada teisendatud 
Watsoni korrelatsiooni (a). Ainus selleks vajalik eksperimentaalselt määratav 
väärtus on keemistemperatuur normaalrõhul. Meetod on rakendatav rõhuvahe ­
mikus 10  5 kuni 10  –5 Pa. 
Meetodi üksikasjalik kirjeldus on esitatud väljaandes „Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods” (b). Vt ka OECD Environmental Monograph No. 67 (c).
 
ARVUTUSKÄIK  
Aururõhk arvutatakse järgmise valemi abil:  
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
kus: 
T = aururõhu hindamise temperatuur,  
T b = keemistemperatuur normaalrõhul,  
P vp = aururõhk temperatuuril T,  
ΔH vb = aurustumissoojus,  
ΔZ b = kokkusurutavustegur (hinnanguliselt 0,97),  
m = empiiriline konstant, mis oleneb aine füüsikalisest olekust aururõhu 
hindamise temperatuuril.  
Kasutatakse ka valemit  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
kus K  F on aine polaarsust arvestav empiiriline tegur. Rea ühendiklasside K  F - 
tegurid on esitatud publikatsioonis (b).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Sageli on olemas andmed keemistemperatuuri kohta madalamal rõhul. Sellisel 
juhul arvutatakse aururõhk järgmiselt:  
lnP vp ≈ lnP 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 " 
1– Í 
3 – 2  T 
T 1 Î m T 1 
T – 2m Í 
3 – 2  T 
T 1 Î m–1 
ln T 
T 1 # 
kus T  1 on keemistemperatuur madalamal rõhul P  1 . 
PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Kui kasutatakse hindamismeetodit, tuleb protokollis esitada täielik arvutuskäik.  
KIRJANDUS  
a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. PINDPINEVUS  
1. MEETOD  
Kirjeldatud meetodid põhinevad OECD katsesuunisel (1). Meetodite 
tööpõhimõtted on ära toodud viites 2.  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kirjeldatud meetodid on ette nähtud vesilahuste pindpinevuse mõõt ­
miseks.  
Katse tegemiseks on kasulik teada aine lahustuvust vees, selle struk ­
tuuri, hüdrolüüsuvust ja mitsellitekke lävikontsentratsiooni.  
Järgmised meetodid sobivad kohaldamiseks enamikule keemilistele 
ainetele, olenemata nende puhtusastmest.  
Pindpinevust saab mõõta rõnga lahtirebimise meetodi abil ainult 
vesilahuste puhul, mille dünaamiline viskoossus on alla ca. 
200 mPa s.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Pindpinevusena käsitatakse pinna vabaentalpiat pinnaühiku kohta.  
Pindpinevust väljendatakse järgmistes ühikutes:  
N/m (SI ühik) või  
mN/m (SI alamühik)  
1N/m = 103 dyn/cm  
1 mN/m = 1 dyn/cm (aegunud CGS-süsteemis)  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks 
kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimalda ­
maks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.  
Viidetes 1 ja 3 on ära toodud laia pindpinevuste vahemikku 
hõlmavad võrdlusained.  
1.4. KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE  
Meetodite kohaselt mõõdetakse maksimaalne jõud, mida on vaja 
püstsuunas rakendada mõõtenõus oleva uuritava vedeliku pinnaga 
kokkupuutes olevale loogale või rõngale selle lahtirebimiseks pinnalt 
või pinnaga kokkupuutes oleva plaadi servale tekkinud kile ülestõm ­
bamiseks.  
Aineid, mille lahustuvus vees on vähemalt 1 mg/l, analüüsitakse 
vesilahuses ainult ühel kontsentratsioonil.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Nende meetodite täpsus ületab tõenäolised vajadused keskkonnaoht ­
likkuse hindamisel.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. MEETODITE KIRJELDUS  
Valmistatakse aine lahus destilleeritud vees. Lahuse kontsentratsioon 
peaks olema 90 % aine küllastuskontsentratsioonist vees; kui kont ­
sentratsioon ületab 1 g/l, kasutatakse katses kontsentratsiooni 1 g/l. 
Aineid, mille lahustuvus vees on alla 1 mg/l, pole vaja testida.  
1.6.1.  Plaadimeetod  
Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.2.  Loogameetod  
Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.3.  Rõngameetod  
Vt ISO 304 ja NF T 73-060 (Surface active agents – determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.4.  OECD ühtlustatud rõngameetod  
1.6.4.1.  Seade  
Mõõtmiseks sobivad müügil olevad tensiomeetrid. Need koosnevad 
järgmistest osadest:  
— liikuvast proovialusest;  
— dünamomeetrist;  
— mõõtekehast (rõngast);  
— mõõtmisnõust.  
1.6.4.1.1. L i i k u v p r o o v i a l u s  
Liikuvale proovialusele asetatakse uuritavat vedelikku sisaldav 
termostateeritud mõõtmisnõu. Alus kinnitatakse koos dünamomee ­
triga statiivile.  
1.6.4.1.2. D ü n a m o m e e t e r  
Dünamomeeter (vt joonist) paikneb proovialuse kohal. Viga jõu 
mõõtmisel ei tohi ületada ± 10  -6 N, mis vastab veapiirile ± 0,1 mg 
massi mõõtmisel. Enamikul juhtudel on müügil olevate tensiomee ­
trite mõõteskaala kaliibritud mN/m skaalas, nii et pindpinevuse saab 
skaalalt lugeda otse millinjuutonites meetri kohta täpsusega 0,1 
mN/m.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. M õ õ t e k e h a ( r õ n g a s )  
Rõngas on tavaliselt valmistatud 0,4 mm jämedusest plaatina-irii ­
diumtraadist ja selle keskmine ümbermõõt on 60 mm. Rõngas 
ripub horisontaalselt metallvarda ja looga otsas, mille kaudu ta on ühendatud dünamomeetriga (vt joonist).
 
Joonis  
Mõõtekeha  
(Kõik mõõdud on millimeetrites)
  
1.6.4.1.4. M õ õ t m i s n õ u  
Katselahust sisaldava mõõtmisnõuna kasutatakse termostateeritud 
klaasnõud. Nõu ehitus peab olema selline, et katselahuse ja selle kohal oleva gaasifaasi temperatuurid jäävad katse kestel konstantseks 
ning proov ei aurustu. Mõõtmisnõuks sobivad silindrilised klaasnõud 
sisediameetriga vähemalt 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Seadme ettevalmistamine  
1.6.4.2.1. P u h a s t a m i n e  
Klaasnõud puhastatakse hoolikalt. Vajaduse korral pestakse neid 
kuuma kroomseguga ja seejärel kontsentreeritud fosforhappega (83–98 % H
 3 PO 4 (massi järgi)), loputatakse põhjalikult kraaniveega, 
pestakse lõpuks bidestilleeritud veega neutraalse reaktsiooni saavuta ­
miseni ja seejärel kuivatatakse või loputatakse osaga mõõdetavast 
vedelikuproovist.  
Rõngast loputatakse kõigepealt põhjalikult veega, et eemaldada vees 
lahustuvad ained, kastetakse seejärel lühikeseks ajaks kroomsegusse, 
pestakse siis bidestilleeritud veega neutraalse reaktsiooni saavutami ­
seni ja kuumutatakse lõpuks lühikest aega metanoolileegi kohal.  
Märkus  
Kroomsegus ja fosforhappes mittelahustuvad saasteained, nt sili ­
koonid, eemaldatakse sobiva orgaanilise lahustiga.  
1.6.4.2.2. S e a d m e k a l i i b r i m i n e  
Seadme kontrollimiseks kontrollitakse nullpunkti ja reguleeritakse 
seda nii, et seade võimaldab täpset mõõtmist mN/m skaalas.  
Kinnitus  
Seade looditakse tensiomeetri aluse reguleerimiskruvide abil (näiteks 
alusel oleva loodinäidiku järgi).  
Nullpunkti reguleerimine  
Pärast rõnga kinnitamist aparaadile ja enne selle vedelikku kastmist 
reguleeritakse tensiomeetri näit nulli ja kontrollitakse, kas rõngas on 
vedeliku pinnaga paralleelne. Selleks võib vedelikupinda kasutada peeglina.
 
Kaliibrimised  
Seadme kaliibrimiseks võib kasutada üht kahest järgmisest meetodist.  
a) Raskuste abil: kasutatakse rõngale asetatavaid kindla massiga 
(0,1–1,0 g) raskusi. Kaliibrimistegur Φ a , millega kõiki seadme 
näitusid tuleb korrutada, leitakse võrrandi 1 abil:  
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
kus: 
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = raskuse mass (g)  
g = raskuskiirendus (merepinnal 981 cm s  –2 ) 
b = rõnga keskmine ümbermõõt (cm)  
σ a = tensiomeetri näit pärast raskuse asetamist rõngale (mN/m).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) Vee abil: kasutatakse puhast vett, mille pindpinevus on 
näiteks 23  o C juures 72,3 mN/m.  
Selle meetodi kohaselt toimub kaliibrimine kiiremini kui massi 
abil, kuid alati eksisteerib oht, et vee pindpinevust mõjutavad pindaktiivsed lisandid. Kaliibrimistegur Φ
 b , millega kõiki seadme 
näitusid tuleb korrutada, leitakse võrrandi 2 abil:  
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
kus: 
σ o = vee pindpinevus (mN/m) kirjanduse andmetel  
σ g = mõõtmisel leitud vee pindpinevus (mN/m) mõlemad samal 
temperatuuril.  
1.6.4.3.  Proovide ettevalmistamine  
Uuritavatest ainetest valmistatakse vajaliku kontsentratsiooniga vesi ­
lahused, kuhu ei tohi jääda lahustumatut jääki.  
Lahust hoitakse püsival temperatuuril (± 0,5  o C). Kuna mõõtmisnõus 
oleva lahuse pindpinevus muutub aja jooksul, tehakse erinevatel 
aegadel mitu mõõtmist ja koostatakse kõver pindpinevuse muutumise kohta ajas. Kui pindpinevus enam ei muutu, on saavutatud tasakaal.
 
Mõõtmistulemusi mõjutavad tolm ja gaasilised lisandid. Seetõttu 
tuleb katsed teha suletud kambris.  
1.6.5.  Katsetingimused  
Mõõtmised tehakse ligikaudu 20  o C juures ja temperatuuri regulee ­
ritakse ± 0,5  o C täpsusega.  
1.6.6.  Katse tegemine  
Mõõdetavad lahused viiakse põhjalikult puhastatud mõõtmisnõusse, 
vältides hoolikalt vahutamist, ja mõõtmisnõu paigutatakse katsesead ­
messe proovialusele. Proovialust mõõtmisnõuga tõstetakse, kuni 
rõngas on allpool mõõdetava lahuse pinda. Seejärel lastakse proovia ­
lust järk-järgult ühtlaselt allapoole (kiirusega ligikaudu 0,5 cm/min), eemaldades rõngast pinnast kuni maksimaalse tõmbejõu saavutami ­
seni. Rõnga külge kinnitunud vedelikukiht ei tohi sellest eralduda. 
Pärast mõõtmiste lõppu viiakse rõngas jälle allapoole vedeliku pinda ja korratakse mõõtmisi, kuni jõutakse konstantsete pindpinevuse väärtusteni. Iga mõõtmise juures registreeritakse lahuse mõõtmis ­
nõusse viimisest möödunud aeg. Näidud võetakse rõnga vedelikupin ­
nast lahtirebimiseks vajaliku maksimaalse jõu juures.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. ANDMED  
Pindpinevuse arvutamiseks tuleb seadme näit (mN/m) korrutada 
kaliibrimisteguriga Φ a või Φ b (sõltuvalt kasutatud kaliibrimismeeto ­
dist). Nii saadakse väärtus, mis on ainult ligikaudne ja vajab seega 
korrigeerimist.  
Harkins ja Jordan (4) on empiiriliselt kindlaks määranud rõngamee ­
todi abil määratud pindpinevuse väärtuste parandustegurid, mis 
sõltuvad rõnga mõõtmetest, vedeliku tihedusest ja pindpinevusest.  
Kuna Harkinsi ja Jordani tabelitest iga mõõtmise jaoks eraldi paran ­
dustegurite leidmine vesilahuste pindpinevuse arvutamiseks on väga töömahukas, võib kasutada lihtsustatud meetodit, kus parandatud 
pindpinevuse väärtused loetakse otse tabelist. (Tabeliväärtuste vahele 
jäävate näitude puhul kasutatakse interpolatsiooni).
 
Tabel:  
mõõdetud pindpinevuste parandused  
Ainult vesilahuste jaoks, ρ = 1 g/cm  3 
R = 9,55 mm (rõnga keskmine raadius) 
r = 0,185 mm (rõngatraadi raadius)  
Katseliselt mõõdetud väärtus (mN/m) Parandatud väärtus (mN/m) 
Kaliibrimine raskustega (vt 1.6.4.2.2a) Kaliibrimine veega (vt 1.6.4.2.2b)  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 
30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 
42 37,6 40,3 
44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Katseliselt mõõdetud väärtus (mN/m) Parandatud väärtus (mN/m) 
Kaliibrimine raskustega (vt 1.6.4.2.2a) Kaliibrimine veega (vt 1.6.4.2.2b)  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 
62 57,2 61,3 
64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 —
 
Tabel on koostatud Harkinsi-Jordani paranduste põhjal. Tabel on 
sarnane DIN standardi (DIN 53914) tabeliga vee ja vesilahuste 
jaoks (tihedus ρ = 1 g/cm  3 ja kehtib müügil olevate rõngaste kohta 
mõõtmetega R = 9,55 mm (rõnga keskmine raadius) ja r = 0,185 mm (rõngatraadi raadius). Tabelis on esitatud pärast raskuste või veega 
kaliibrimist mõõdetud pindpinevuse väärtuste ka parandatud väär ­
tused.
 
Pindpinevuse võib arvutada ka ilma eelneva kaliibrimiseta, kasutades 
järgmist valemit:  
σ ¼ f ÜF 
4πR 
kus: 
F = dünamomeetriga kile katkemisel mõõdetud jõud  
R = rõnga raadius  
f = parandustegur (1)  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— kasutatud meetodit;  
— kasutatud vee või lahuse iseloomu;  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);  
— mõõtmistulemusi: pindpinevuse väärtused, sh kõik üksiktule ­
mused ja nende aritmeetiline keskmine ning parandatud kesk ­
mine (mis arvestab nii seadmetest tulenevat parandustegurit kui 
ka parandustabelit);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— lahuse kontsentratsiooni;  
— katsetemperatuuri;  
— lahuse vanust, st aega lahuse valmistamise ja mõõtmise vahel;  
— pindpinevuse sõltuvust lahuse mõõtmisnõusse viimisest 
möödunud ajast;  
— registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti 
lisandeid ja aine füüsikalist olekut käsitlevad andmed ja märkused.
 
3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Arvestades, et destilleeritud vee pindpinevus on 20  o C juures 72,75 
mN/m, tuleks ained, mille pindpinevus käesoleva meetodi abil 
mõõtes on alla 60 mN/m, lugeda pindaktiivseteks aineteks.  
4. VIITED  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council 
C(81) 30 final.  
2. R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.  
3. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
4. Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 
1751.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. LAHUSTUVUS VEES  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test 
Guideline , TG) 105 (1995). Käesolev katsemeetod on 1981. aastal vastu 
võetud esialgse meetodi TG 105 läbivaadatud versioon. Käesoleva versiooni 
ja 1981. aasta versiooni vahel ei ole sisulist erinevust, muudetud on peami ­
selt vormi. Läbivaadatud versioon põhineb ELi katsemeetodil „Lahustuvus vees” (
 1 ). 
LÄHTEKAALUTLUSED  
2. Uuritava aine lahustuvus vees võib lisandite mõjul oluliselt muutuda. Käes ­
olevas katsemeetodis kirjeldatakse, kuidas määrata sellise aine lahustuvust 
vees, mis on praktiliselt puhas, vees püsiv ja ei lendu. Enne vees lahustu ­
vuse määramist on kasulik omada uuritava aine kohta mõningast eelteavet, nagu struktuurvalem, aururõhk, dissotsiatsioonikonstant ja hüdrolüüs sõltu ­
valt pH väärtusest.
 
3. Käesolevas katsemeetodis on kirjeldatud kahte meetodit: 
kolonn-elueerimismeetod ja kolvimeetod, millega on kaetud lahustuvuse vahemikud vastavalt kuni 10
 –2 g/l ja alates kontsentratsioonist 10  –2 g/l. 
Kirjeldatud on ka lihtsat eeluuringut. Eeluuringuga saab määrata uuritava 
proovi ligikaudse sobiva koguse, mida tuleb kasutada lõplikus katses, samuti küllastumise saavutamiseks vajaliku aja.
 
MÕISTED JA ÜHIKUD  
4. Aine lahustuvus vees on selle küllastav massikontsentratsioon vees antud 
temperatuuril.  
5. Lahustuvust vees väljendatakse lahustunud aine massina lahuse ruumala 
kohta. Lahustuvuse SI-ühik on kg/m  3 ; võib kasutada ka ühikut g/l.  
VÕRDLUSKEMIKAALID  
6. Uuritava aine lahustuvuse määramisel ei ole vaja kasutada võrdluskemi ­
kaale.  
MEETODITE KIRJELDUS  
Katsetingimused  
7. Eelistatav katsetemperatuur on 20 ± 0,5 °C. Valitud temperatuur tuleks 
seadme kõigis olulistes osades hoida konstantsena.  
Eeluuring  
8. Astmelise meetodi kasutamisel lisatakse toatemperatuuril 10-milliliitrises 
klaaskorgiga mõõtesilindris üha suuremaid veekoguseid umbes 0,1 grammile 
uuritavale ainele (tahke uuritav aine peab olema peenestatud). Pärast iga veekoguse lisamist loksutatakse segu kümme minutit ja kontrollitakse visuaalselt lahustumata proovijääkide olemasolu. Kui proov või osa sellest 
jääb pärast 10 ml vee lisamist lahustumata, jätkatakse katset 100 ml mõõte ­
silindris. Ligikaudne lahustuvus on esitatud tabelis 1 lisatud vee mahulise
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
koguse all, mille juures proov täielikult lahustub. Kui lahustuvus on väike, 
võib uuritava aine lahustamiseks kuluda palju aega ja katseks tuleb ette näha 
vähemalt 24 tundi. Kui 24 tunni möödumisel on osa uuritavast ainest ikka veel lahustumata, tuleb lahustamiseks näha ette rohkem aega (kuni 96 tundi) või kasutada suuremat lahjendust, et teha kindlaks, kas tuleb kasutada 
kolonn-elueerimis- või kolvimeetodit.
 
Tabel 1  
Vee milliliitreid 0,1 g soluudi 
kohta 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
Ligikaudne lahustuvus (g/l) > 1 000 1 000 – 
200 200–100 100–50 50–10 10–1 < 1  
Kolonn-elueerimismeetod  
Põhimõte  
9. Meetodi aluseks on uuritava aine veega elueerimine mikrokolonnist, mis on 
täidetud inertse tugimaterjaliga, mis on eelnevalt kaetud uuritava aine liiaga (
 2 ). Lahustuvus vees leitakse eluaadi massikontsentratsioonist, kui 
eluaadi kontsentratsioon jõuab teatava aja järel platoole.  
Seadmed  
10. Seadmestik koosneb mikrokolonnist (joonis 1), mida hoitakse konstantse 
temperatuuri juures. Mikrokolonn on ühendatud kas tsirkulatsioonpumbaga (joonis 2) või ühtlustava anumaga (joonis 3). Mikrokolonn sisaldab inertset kandjat, mida hoiab paigal väike klaasvatikork, mis toimib ühtlasi ka 
osakeste filtrina. Võimalikud inertse kandjana kasutatavad materjalid on 
klaashelmed, diatomiit või muud inertsed materjalid.
 
11. Joonisel 1 kujutatud mikrokolonn sobib töötamiseks koos tsirkulatsioonpum ­
baga. Kolonnil on tühi ülaosa, mille maht on viis statsionaarse faasi mahtu 
(mis visatakse ära eksperimendi alguses) ja viis proovi ruumala (mis 
võetakse analüüsimiseks katse käigus). Seda vaba ruumi võib ka vähendada, kui lisandite kõrvaldamiseks kasutatava viie statsionaarse faasi mahu eluaadi 
asemele saab katse ajal lisada süsteemi vett. Kolonn on inertsest materjalist 
toru abil ühendatud tsirkulatsioonpumbaga, mille pumpamiskiirus on ligi ­
kaudu 25 ml/h. Tsirkulatsioonpump võib olla näiteks peristaltiline või membraanpump. Tuleb jälgida, et toru materjal ei põhjustaks saastumist 
ega adsorptsiooni.
 
12. Joonisel 3 on skemaatiliselt kujutatud tüüpiline ühtlustava anumaga süsteem. 
Selles süsteemis on mikrokolonn varustatud ühekäigukraaniga. Ühendami ­
seks ühtlustava anumaga on kasutatud klaaslihvühendust ja inertsest mater ­
jalist valmistatud voolikut. Lahuse ühtlustavast anumast välja voolamise 
kiirus peaks olema ligikaudu 25 ml/h.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Joonis 1
  
Mõõtmed millimeetrites  
A. Lihvmuhv lihvühenduse jaoks  
B. Vaba ruum kolonni peas  
C. Sisediameeter 5 mm  
D. Välisdiameeter 19 mm  
E. Klaasvatist kork  
F. Kraan  
Joonis 2
  
A. Tasakaalustamine atmosfäärirõhuga  
B. Voolumõõtur  
C. Mikrokolonn  
D. Termostateeritud tsirkulatsioonpump  
E. Tsirkulatsioonpump  
F. Kahekäigukraan proovide võtmiseks  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Joonis 3
  
A. Ühtlustav anum (nt 2,5 l kolb)  
B. Kolonn  
C. Fraktsioonikoguja  
D. Termostaat  
E. Teflonvoolik  
F. Klaaslihvühendus  
G. Veevoolik termostaadi ja kolonni vahel (sisediameeter ligikaudu 8 mm)  
13. Ligikaudu 600 mg tugimaterjali kantakse 50 ml ümarkolbi. Sobiv kogus 
uuritavat ainet lahustatakse kergesti lenduvas analüüsireaktiivi puhtusklas ­
siga lahustis ja sobiv kogus seda lahust lisatakse tugimaterjalile. Selleks et vältida jaotumist tugiaine pinnal ja saavutada elueerimisetapil tugiaine küll ­
astumine veega, eemaldatakse lahusti täielikult, näiteks pöördaurusti kasuta ­
misega. Kaetud tugimaterjali lastakse kaks tundi seista ligikaudu 5 ml vees ja seejärel viiakse suspensioon mikrokolonni. Teise võimalusena võib kuiva kaetud tugimaterjali kallata veega täidetud mikrokolonni ja lasta sel kaks 
tundi tasakaalustuda.
 
14. Tugimaterjali katmine uuritava ainega võib tekitada probleeme, mille tõttu 
saadakse valed tulemused, näiteks kui uuritav aine sadestub tugiainele õlina. Selliseid probleeme tuleks uurida ja katseprotokollis tuleks esitada üksikas ­
jad.
 
Mõõtmine tsirkulatsioonpumba kasutamisega  
15. Kolonni hakatakse voolutama. Soovitatav on kasutada ligikaudset voolukii ­
rust 25 ml/h, mis kirjeldatud kolonni puhul tähendab kümmet kolonni stat ­
sionaarse faasi mahtu tunnis. Vähemalt esimesed viis statsionaarse faasi mahtu visatakse ära, et eemaldada voolutamisega vees lahustuvad lisandid. Seejärel lastakse tsirkulatsioonpumbal töötada tasakaalu saabumiseni, st 
senikaua, kuni viie järjestikuse proovi kontsentratsioonide erinevused on 
juhuslikud ega ületa ±30 %. Nende proovide vahelised ajavahemikud peaksid vastama ajale, mis kulub vähemalt kümne statsionaarse faasi mahu eluendi voolamiseks läbi kolonni. Analüüsimeetodist olenevalt võib 
olla parem koostada graafik kontsentratsiooni sõltuvuse kohta ajast, millelt 
on näha tasakaalu saabumist.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Määramine ühtlustava anuma kasutamisega  
16. Tuleks koguda järjestikuseid eluaadifraktsioone ja analüüsida neid valitud 
meetodi abil. Aine lahustuvus vees määratakse eluaadi keskjooksust nende fraktsioonide põhjal, mille kontsentratsioonid jäävad vähemalt viie järjesti ­
kuse proovi kestel konstantseks ((±30 %).
 
17. Eelistatud voolutuskeskkond on bidestilleeritud vesi. Kasutada võib ka deio ­
niseeritud vett, mille takistus on üle 10 megaoomi/cm ja orgaanilise süsiniku sisaldus alla 0,01 %.
 
18. Kummagi meetodi puhul tehakse teine voolutamine poole väiksema voolu ­
kiirusega kui esimene. Kui kahe voolutamise tulemused on kooskõlas, on katse tehtud rahuldavalt. Kui väiksema voolukiiruse juures on mõõdetud 
lahustuvus suurem, tuleb voolukiiruse poole võrra vähendamist jätkata 
seni, kui kahe järjestikuse voolutamisega saadakse ühesugune lahustuvus.
 
19. Mõlema meetodi puhul tuleb Tyndalli efekti kasutamisega kontrollida, et 
fraktsioonid ei sisaldaks kolloidset ainet. Kolloidosakeste olemasolu korral katse tulemusi ei arvestata ja katset korratakse kolonniga, mille filtrivad omadused on paremad.
 
20. Tuleb mõõta iga proovi pH, eelistatult spetsiaalse indikaatorpabeririba abil.  
Kolvimeetod  
Põhimõte  
21. Aine (tahke aine peab olema peenestatud) lahustatakse vees katsetempera ­
tuurist mõnevõrra kõrgemal temperatuuril. Küllastumise saavutamisel segu jahutatakse ja hoitakse katsetemperatuuril. Mõõtmist võib alustada ka kohe katsetemperatuuril, kui sobivate proovide võtmisega on näidatud, et küllas ­
tustasakaal on saavutatud. Seejärel määratakse sobiva analüüsimeetodi (3) 
abil aine massikontsentratsioon vesilahuses, mis ei tohi sisaldada lahustu ­
mata osakesi.
 
Seadmed  
22. Vaja on järgmisi materjale:  
— tavalised labori klaasnõud ja seadmed;  
— seade lahuse segamiseks konstantsel termostaaditemperatuuril;  
— emulsiooni korral võib vaja minna tsentrifuugi (eelistatult termostatee ­
ritud), ning  
— analüüsiseadmed.  
Katse läbiviimise kord  
23. Soovitud ruumala vee küllastamiseks vajalik uuritava aine kogus hinnatakse 
eeluuringu abil. Võetakse kolm klaaskorgiga klaasnõu (nt tsentrifuugiklaasid või kolvid) ja kaalutakse igaühte umbes viiekordne eespool osutatud aine ­
kogus. Igasse nõusse lisatakse teatav kogus vett; veekogus valitakse vasta ­
valt analüüsimeetodile ja lahustuvuse vahemikule. Nõud suletakse tihedalt 
korgiga ja seejärel segatakse temperatuuril 30 °C. Kasutada tuleks kons ­
tantsel temperatuuril töötavat loksutit või segajat, nt magnetsegajat termo ­
stateeritud veevanniga. Ühe päeva pärast võetakse üks nõu ja tasakaalusta ­
takse seda 24 h katsetemperatuuril aeg-ajalt loksutades. Nõu sisu tsentrifuu ­
gitakse seejärel katsetemperatuuril ja määratakse siis sobiva analüüsimeetodi
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
abil uuritava aine kontsentratsioon selges veefaasis. Sama korratakse 
ülejäänud kahe nõuga vastavalt kahe- ja kolmepäevase 30 °C juures eelneva 
tasakaalustamise järel. Kui vähemalt kahes viimases nõus määratud kontsen ­
tratsioonid ei erine rohkem kui 15 %, on katse tehtud rahuldavalt. Kui esimese, teise ja kolmanda nõu mõõtmisel saadud tulemustes ilmneb kasvu ­
tendents, tuleb katset korrata pikemate tasakaalustamisaegadega.
 
24. Katse võib teha ka ilma eelneva inkubeerimiseta 30 °C juures. Küllastumis ­
tasakaalu saavutamise kiiruse hindamiseks võetakse proove senikaua, kuni 
mõõdetav kontsentratsioon enam ei sõltu segamise ajast.  
25. Tuleb mõõta iga proovi pH, eelistatult spetsiaalse indikaatorpabeririba abil.  
Analüütilised määramised  
26. Määramisel eelistatakse spetsiifilisi uuritava aine määramise meetodeid, 
kuna juba väike lisandikogus võib mõõdetud lahustuvuse väärtuses põhjus ­
tada suure vea. Sellised meetodid on näiteks gaas- või vedelikkromato ­
graafia, tiitrimine, fotomeetria, voltameetria.  
ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
Kolonn-elueerimismeetod  
27. Iga katse puhul tuleks välja arvutada vähemalt viie järjestikuse küllastuspla ­
tool võetud proovi keskmine väärtus ja standardhälve. Eri voolukiiruste 
juures tehtud kahe katse keskmised väärtused ei tohiks erineda rohkem 
kui 30 %.  
Kolvimeetod  
28. Kolme kolvi määramisel saadud üksiktulemused, mis ei tohiks erineda üle 
15 %, keskmistatakse.  
Katseprotokoll  
Kolonn-elueerimismeetod  
29. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave:  
— eeluuringu tulemused;  
— aine keemiline määratlus ja lisandid (eelnevad puhastamisetapid, kui 
ainet puhastati);  
— iga proovi kontsentratsioon, voolukiirus ja pH;  
— iga katse kohta vähemalt viie küllastusplatool võetud proovi keskväärtus 
ja standardhälve;  
— vähemalt kahe järjestikuse katse keskmine väärtus;  
— vee temperatuur küllastamise ajal;  
— analüüsimeetod;  
— kasutatud tugimaterjal;  
— tugimaterjali katmisega seotud andmed;  
— kasutatud lahusti;  
— andmed aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse tingimustes;  
— kogu muu asjakohane teave, eriti lisandite ja aine füüsikalise oleku 
kohta, mis võib mõjutada tulemuste tõlgendamist.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Kolvimeetod  
30. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave:  
— eeluuringu tulemused;  
— aine keemiline määratlus ja lisandid (eelnevad puhastamisetapid, kui 
ainet puhastati);  
— iga üksiku analüüsi tulemus ja tulemuste keskmine, kui ühe kolvi kohta 
tehti mitu mõõtmist;  
— iga proovi pH väärtus;  
— eri kolbidega saadud kooskõlaliste tulemuste keskväärtused;  
— katsetemperatuur;  
— analüüsimeetod;  
— andmed aine mis tahes keemilise ebastabiilsuse kohta katse tingimustes;  
— kogu muu asjakohane teave, eriti lisandite ja aine füüsikalise oleku 
kohta, mis võib mõjutada tulemuste tõlgendamist.  
KIRJANDUS  
1) Komisjoni direktiiv 92/69/EMÜ, 31. juuli 1992, millega seitsmeteistküm ­
nendat korda kohandatakse tehnika arenguga nõukogu direktiivi 
67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitle ­
vate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta (EÜT L 383, 29.12.1992, lk 113).
 
2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility – Column elution method.  
3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solu ­
bility – Flask method.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. JAOTUSTEGUR  
1. MEETOD  
Kirjeldatud „loksutamismeetod” põhineb OECD katsesuunisel (1).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Katse tegemiseks on kasulik teada aine struktuuri ja dissotsiatsioo ­
nikonstanti, lahustuvust vees, hüdrolüüsuvust, lahustuvust oktanoolis 
ja pindpinevust.  
Sooli moodustavate ainete puhul tuleks mõõtmisi teha ainult vabas 
olekus ainega (vabal happel või vabal alusel), mis saadakse sobiva puhverlahuse kasutamisel pH-ga vähemalt ühe ühiku võrra alla (vaba happe saamiseks) või üle (vaba aluse saamiseks) vastava pK.
 
Katsemeetod sisaldab kaht eraldi protseduuri: loksutamismeetodit ja 
kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafiat (HPLC). Esimest meetodit kasutatakse ainetel log P
 ow (mõisteid vt allpool) väärtusega 
vahemikus –2 kuni 4, viimast ainetel log P  ow väärtusega vahemikus 
0 kuni 6. Enne kummagi katseprotseduuri rakendamist tuleks varem 
kindlaks teha jaotusteguri hinnanguline väärtus.  
Loksutamismeetodit saab kasutada ainult puhaste, vees ja oktanoolis 
lahustuvate ainete puhul. Seda ei saa kasutada pindaktiivsete ainete korral (viimaste puhul tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või 
hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal 
oktanoolis ja vees).
 
HPLC meetodit ei saa kasutada tugevate hapete ega aluste, metalli ­
komplekside, pindaktiivsete ainete ega eluendiga reageerivate ainete puhul. Nende ainete korral tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus 
või hinnanguline väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal 
oktanoolis ja vees).
 
HPLC meetod on katseühendis olevate lisandite suhtes vähem 
tundlik kui loksutamismeetod. Sellele vaatamata võivad lisandid tule ­
muste tõlgendamise keeruliseks muuta, kuna piike ei saa enam kind ­
lalt identifitseerida. Eristamatute piikidega segude puhul tuleks esitada log P ülemine ja alumine piir.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Jaotustegur (P) on määratletud lahustunud aine tasakaalukontsentrat ­
sioonide (c  i ) suhtena kahest praktiliselt segunematust lahustist koos ­
nevas kahefaasilises süsteemis. Oktanooli ja vee puhul:  
P ow ¼ c n Ä oktanool 
c wessi 
Jaotustegur (P) on seega kahe kontsentratsiooni suhe ja seda väljen ­
datakse harilikult kümnendlogaritmina (log P).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Loksutamismeetod  
Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks 
kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimalda ­
maks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.  
HPLC meetod  
Ühendi HPLC mõõtmistulemuste ja tema P väärtuse vastavuse leid ­
miseks tuleb koostada vähemalt kuue punktiga kaliibrimiskõver telgedes log P  vs. HPLC mõõtmistulemused. Sobivad võrdlusained 
peab valima analüüsi sooritaja. Võimaluse korral peaks üks võrdlu ­
sühend olema testainest kõrgema ja üks madalama P
 OW väärtusega. 
Log P väärtustel alla 4 piisab kaliibrimiseks loksutamismeetodil saadud andmetest. Log P väärtustel üle 4 võib kaliibrimiseks kasu ­
tada kirjanduses esitatud andmeid, kui need on kooskõlas arvutusli ­
kult leitud väärtustega. Suurema täpsuse huvides on eelistatav kasu ­
tada testainele struktuuriliselt lähedasi võrdlusühendeid.
 
Kirjandusest on paljude ainerühmade kohta võimalik leida ulatus ­
likke andmekogumeid log P  OW väärtustega (2, 3). Kui samalaadse 
struktuuriga ühendite jaotustegurite kohta andmed puuduvad, võib 
kasutada vähem spetsiifilist kaliibrimist muude võrdlusühenditega.  
Liites 2 esitatakse soovitatavate võrdlusainete ja nende P  OW väärtuste 
nimekiri.  
1.4. KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE  
1.4.1.  Loksutamismeetod  
Jaotusteguri määramiseks tuleb saavutada kõigi süsteemi vastastik ­
toimes olevate komponentide tasakaal ja määrata siis kummaski 
faasis lahustunud ainete kontsentratsioonid. Selleteemalise kirjanduse põhjal on selleks võimalik kasutada mitmeid erinevaid meetodeid; nt kaks faasi segatakse põhjalikult ja eraldatakse seejärel uuritava aine 
tasakaalukontsentratsiooni määramiseks.
 
1.4.2.  HPLC meetod  
HPLC jaoks kasutatakse müügil olevaid analüütilisi kolonne, mille 
täidiseks on pikkade (nt C  8 , C 18 ) silikageeliga seotud süsivesinika ­
helatega tahke faas. Seesugusesse kolonni süstitud kemikaalid liiguvad selles erinevate kiirustega, kuna jaotuvad liikuva faasi ja statsionaarse süsivesinikfaasi vahel erinevalt. Kemikaalide segud 
elueeruvad oma hüdrofoobsuse järjekorras – vees lahustuvad kemi ­
kaalid elueeruvad esimesena ja rasvlahustuvad viimasena, olenevalt oma süsivesiniku-vee jaotustegurist. Nii on retentsiooniaega sellises (pöördfaasilises) kolonnis võimalik seostada oktanooli/vee jaotuste ­
guriga. Jaotustegur leitakse mahtuvustegurist k, mille valem on järg ­
mine:
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
kus t  r = testaine retentsiooniaeg ja t  0 = keskmine aeg, mille jooksul 
lahustimolekul läbib kolonni (surnud aeg).  
Kvantitatiivne analüüs pole vajalik, määrata tuleb ainult retentsioo ­
niajad.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
1.5.1.  Korratavus  
Loksutamismeetod  
Leitava jaotusteguri täpsuse tagamiseks tehakse kordusmõõtmised 
kolmedel erinevatel katsetingimustel, erineva ainekoguse ja erineva lahustite mahu suhtega. Korduskatsetel määratud jaotusteguri väär ­
tused peaksid logaritmina väljendatuna ± 0,3 ühiku täpsusega kokku 
langema.
 
HPLC meetod  
Mõõtmistulemuste usaldusväärsuse parandamiseks tuleks teha 
kordusmõõtmised. Üksikutel mõõtmistel määratud log P väärtused peaksid ± 0,1 ühiku täpsusega kokku langema.
 
1.5.2.  Tundlikkus  
Loksutamismeetod  
Meetodi mõõtepiirkonna määrab kasutatava analüüsimeetodi avasta ­
mispiir. See peaks võimaldama määrata log P  OW väärtused vahe ­
mikus –2 kuni 4 (mõningatel tingimustel võib ülemist piiri nihutada 
kuni log P  OW väärtuseni 5) eeldusel, et lahustunud aine kontsentrat ­
sioon kummaski faasis ei ületa 0,01 mooli liitris.  
HPLC meetod  
HPLC meetod võimaldab määrata jaotusteguri log P  OW 
vahemikus 0–6.  
Üldjuhul langeb selle meetodi abil määratud jaotusteguri logaritmi ­
line väärtus ± 1 ühiku täpsusega kokku loksutamismeetodi abil leitud väärtusega. Tüüpilisi vastavusi võib leida kirjandusest (4, 5, 6, 7, 8). 
Suurem täpsus on tavaliselt saavutatav samalaadse struktuuriga võrd ­
lusühendite kasutamisel (9).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Spetsiifilisus  
Loksutamismeetod  
Nernsti jaotusseadus kehtib ainult konstantsel temperatuuril, rõhul ja 
pH-l ning ainult lahjendatud lahustes. See kehtib ainult puhta, kahe puhta lahusti vahel dispergeeritud aine puhul. Kui ühes või mõlemas 
faasis on samal ajal mitu lahustunud ainet, võib see tulemusi mõju ­
tada.
 
Lahustunud molekulide dissotsieerumise või assotsieerumisega kaas ­
nevad samuti kõrvalekalded Nernsti jaotusseadusest. Kõrvalekalded 
väljenduvad sõltuvuse tekkes jaotusteguri ja lahuse kontsentratsiooni vahel.
 
Paljude tulemust mõjutavate tasakaalude tõttu ei tohiks seda katse ­
meetodit dissotsieeruvatel ühenditel vastava paranduseta kasutada. Selliste ühendite puhul tuleks kaaluda puhverlahuse kasutamist vee asemel; puhvri pH peaks vähemalt ühe ühiku võrra erinema aine pKa 
väärtusest ja arvesse tuleks võtta selle pH mõju antud keskkonnale.
 
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Jaotusteguri esialgne hindamine  
Jaotustegurit on eelistatav hinnata arvutuslikult (vt liidet 1) või test ­
aine lahustuvuse suhte põhjal puhastes lahustites (10).  
1.6.2.  Loksutamismeetod  
1.6.2.1.  Lahustite ettevalmistamine  
Oktanool: jaotusteguri määramisel tuleks kasutada analüüsipuhast 
lahustit.  
Vesi: kasutada tuleks vett, mis on bidestilleeritud klaas- või kvarts ­
seadmes. Dissotsieeruvate ühendite puhul tuleks vee asemel kasutada 
puhverlahuseid, juhul kui see on õigustatud.  
Märkus  
Otse ioonvahetist pärinevat vett kasutada ei tohi.  
1.6.2.1.1. L a h u s t i t e e e l k ü l l a s t a m i n e  
Enne jaotustegur määramist tuleks lahustitesüsteemi faasid katsetem ­
peratuuril loksutades üksteise suhtes küllastada. Praktiline lahendus selleks on panna analüüsipuhas oktanool ja vesi kumbki suures pudelis 
piisava koguse teise lahustiga 24 tunniks mehaanilisele loksutile ja 
lasta neil seejärel seista faaside eraldumise ja küllastumiseni.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. K a t s e k s v a l m i s t u m i n e  
Kahefaasilise süsteemi kogumaht peaks katseanuma peaaegu täieli ­
kult täitma. See aitab vältida kadusid lendumise kaudu. Kasutatavate 
mahtude suhe ja ainekogused sõltuvad järgmistest asjaoludest:  
— esialgsest hinnangulisest jaotusteguri väärtusest (vt eespool);  
— analüüsiks vajalikust minimaalsest testaine kogusest ning  
— kontsentratsioonipiirangust 0,01 mol/l kummaski faasis.  
Sooritatakse kolm katset. Esimeses kasutatakse arvutatud oktanooli- 
vee suhet, teises jagatakse see suhe kahega ja kolmandas korruta ­
takse see suhe kahega (nt 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. T e s t a i n e  
Valmistatakse põhilahus veega eelküllastatud oktanoolis. Põhilahuse 
kontsentratsioon tuleks enne selle jaotusteguri mõõtmisel kasutamist 
täpselt kindlaks määrata. Lahust tuleks säilitada tingimustes, mis 
tagavad selle stabiilsuse.  
1.6.2.2.  Katsetingimused  
Katsetemperatuuri tuleks hoida konstantsena (± 1  o C) ja see peaks 
jääma vahemikku 20–25  o C. 
1.6.2.3.  Mõõtmisprotseduur  
1.6.2.3.1. J a o t u s t a s a k a a l u s a a v u t a m i n e  
Kõigi katsetingimuste jaoks tuleks kahes eksemplaris ette valmistada 
vajalikud mõlema lahusti kaalutised koos vajaliku koguse põhilahu ­
sega.  
Oktanoolifaase tuleks mõõta mahu järgi. Katseanumaid tuleks loksu ­
tada kas sobival loksutil või käsitsi. Tsentrifuugiklaasi kasutamisel 
on seda soovitatav kiiresti 180  o ümber oma risttelje pöörata, nii et 
sissejäänud õhk tõuseb läbi mõlema faasi. Kogemused on näidanud, et tavaliselt piisab jaotustasakaalu saavutamiseks 50 sellisest pöör ­
dest. Kindluse mõttes on soovitatav rakendada 100 pööret viie minuti 
jooksul.
 
1.6.2.3.2. F a a s i d e e r a l d a m i n e  
Vajaduse korral tuleks segu faaside eraldamiseks tsentrifuugida. Seda 
tuleks teha toatemperatuuril hoitavas laboritsentrifuugis; mittetermos ­
tateeritava tsentrifuugi kasutamisel tuleks tsentrifuugiküvette enne 
analüüsi vähemalt tund aega tasakaalustada.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analüüs  
Jaotusteguri määramiseks tuleb määrata testaine kontsentratsioonid 
mõlemas faasis. Selleks võib võtta kindla koguse lahust iga katsenõu mõlemast faasist ja analüüsida neid vastavalt valitud meetodile. 
Arvutada tuleks mõlemas faasis oleva aine koguhulka ja võrrelda 
seda alguses süsteemi viidud kogusega.
 
Proovide võtmisel veefaasist tuleks kasutada meetodit, mille puhul 
oktanoolifaasi jälgede proovi sattumise oht on minimaalne, näiteks klaassüstlalt eemaldatava nõelaga. Süstal peaks algul olema osaliselt õhuga täidetud. Nõela viimisel läbi oktanoolikihi tuleks õhk õrnalt 
välja suruda. Küllaldane kogus veefaasi tõmmatakse süstlasse. Süstal 
tõmmatakse kiirelt lahusest välja ja nõel eemaldatakse. Süstla sisu võib seejärel veefaasi proovina kasutada. Kontsentratsioonid eral ­
datud faasides tuleks eelistatavalt määrata spetsiifiliste määramismee ­
todite abil. Sobida võivad näiteks järgmised analüüsimeetodid:
 
— fotomeetrilised meetodid;  
— gaaskromatograafia;  
— kõrge eraldusvõimega vedelikkromatograafia.  
1.6.3.  HPLC meetod  
1.6.3.1.  Ettevalmistused  
Seade  
Vajalik on pulseerimisvaba pumba ja sobiva detektoriga vedelikkro ­
matograaf. Soovitatav on kasutada silmusega sisestamisklappi. 
Polaarsete rühmade esinemine statsionaarses faasis võib HPLC 
kolonni efektiivsust oluliselt vähendada. Seetõttu peaks polaarsete rühmade sisaldus statsionaarses faasis olema minimaalne (11). Kasu ­
tada võib müügil olevaid mikrogranulaarseid pöördfaasilisi täidiseid 
või valmiskolonne. Sisestamissüsteemi ja analüüsikolonni vahel võib 
olla kaitsekolonn.
 
Liikuvfaas  
Elueerimislahusti valmistatakse HPLC-puhtast metanoolist ja HPLC- 
puhtast veest ning see degaseeritakse enne kasutamist. Kasutada tuleks isokraatilist elueerimist. Veesisaldus metanooli-vee liikuvfaa ­
sides peaks olema vähemalt 25 %. Tavaliselt piisab ühendite, mille 
log P = 6, elueerimiseks ühe tunni jooksul 1 ml/min voolukiiruse juures metanooli-vee suhtest 3:1 (mahu järgi). Kõrge log P-ga ühen ­
dite (ja võrdlusühendite) puhul võib olla vaja retentsiooniaega lühen ­
dada, vähendades selleks liikuva faasi polaarsust või kolonni pikkust.
 
Oktanoolis väga madala lahustuvusega ühenditel kaldub HPLC 
meetodi kohaselt leitud log P  OW väärtus olema ebaharilikult madal; 
selliste ühendite piigid elueeruvad vahel koos lahusti frondiga. See 
on tõenäoliselt tingitud asjaolust, et jaotumisprotsess on liiga aeglane, saavutamaks normaalse kestusega HPLC eraldamise jooksul tasakaalu. Usaldusväärse väärtuse saamiseks võib sellisel juhul abi 
olla voolukiiruse vähendamisest ja/või metanooli-vee suhte alanda ­
misest.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Katse- ja võrdlusühendite lahustuvus liikuvas faasis peab olema 
küllaldane nende tuvastamiseks. Metanooli-vee segus võib lisandeid 
kasutada ainult erandjuhtudel, kuna lisandid muudavad kolonni omadusi. Lisanditega kromatogrammide tegemisel tuleb kasutada teist sama tüüpi kolonni. Kui metanooli-vee eluent ei sobi, võib 
kasutada muid orgaanilise lahusti ja vee segusid, nt etanooli-vee 
või atsetonitriili-vee segu.
 
Dissotsieeruvate ühendite puhul on eluendi pH kriitilise tähtsusega. 
See peaks jääma kolonni töövahemikku, mis on tavaliselt 2–8. Soovi ­
tatav on kasutada puhverlahust. Hoolikalt tuleks vältida soolade 
sadestumist ja kolonni omaduste halvenemist, mida tuleb ette mõnin ­
gate orgaanilise faasi/puhverlahuse segude puhul. HPLC määramisi ei ole silikageelil põhinevate statsionaarsete faasidega pH väärtustel 
üle 8 soovitatav teha, kuna aluseline liikuv faas võib kolonni 
omadusi järsult halvendada.
 
Lahustunud ained  
Võrdlusühendid peaksid olema võimalikult kõrge puhtusastmega. 
Uuritavad ja kaliibrimisel kasutatavad ühendid lahustatakse võima ­
luse korral liikuvas faasis.  
Katsetingimused  
Temperatuur ei tohiks mõõtmiste käigus kõikuda rohkem kui ± 2 K.  
1.6.3.2.  Mõõtmine  
Surnud aja t  0 arvutamine  
Surnud aega t  0 võib määrata kas homoloogilise rea (nt alküülmetüül ­
ketoonid) või kolonnis mittepeetuvate orgaaniliste ühendite (nt 
tiouurea, formamiid) abil. Surnud aja arvutamiseks homoloogilise 
rea abil süstitakse kolonni vähemalt seitse homoloogilise rea liiget ja määratakse vastavad retentsiooniajad. Töötlemata retentsiooniaja väärtused t
 r (n c + 1)  esitatakse t  r (n c)  funktsioonina ja leitakse järgmise 
regressioonivõrrandi lõikepunkt a ja tõus b:  
t r(nc + 1) = a + b t  r(nc) 
(n c = süsinikuaatomite arv). Surnud aeg t  0 leitakse seejärel järgmisest 
valemist:  
t 0 = a/(1-b)  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Kaliibrimisgraafik  
Järgmise etapina koostatakse sobivate võrdlusühendite log k  versus  
log P korrelatsioonikõver. Praktikas süstitakse ühel ajal 5–10 võrd ­
lusühendit, mille log P jääb eeldatavasse log P vahemikku, ja määra ­
takse retentsiooniajad, eelistatavalt detektorsüsteemiga ühendatud 
meerikuga integraatori abil. Arvutatakse vastavad logaritmilised 
mahtuvustegurite väärtused log k ja esitatakse graafiliselt nende sõltuvus loksutamismeetodil leitud log P väärtustest. Kaliibrimine tehakse regulaarsete ajavahemike tagant, vähemalt kord päevas, et 
võtta arvesse võimalikke kolonni efektiivsuse muutusi.
 
Testaine mahtuvusteguri määramine  
Testaine süstitakse võimalikult väikese liikuvfaasi kogusega. Määra ­
takse retentsiooniaeg (soovitatavalt kahe paralleelmääramisena), 
võimaldades nii arvutada mahtuvustegurit k. Seejärel saab võrdlusü ­
hendite korrelatsioonigraafiku põhjal interpoleerida testaine jaotuste ­
guri. Väga kõrgete ja väga madalate jaotustegurite korral tuleb väärtus ekstrapoleerida. Sellisel juhul tuleb hoolikalt silmas pidada 
regressioonisirge usalduspiiri.
 
2. ANDMED  
Loksutamismeetod  
Määratud log P väärtuste usaldatavust saab kontrollida topeltmäära ­
miste tulemuste keskmise võrdlemisel üldise keskmisega.  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);  
— kui kumbki meetod ei ole kohaldatav (nt pindaktiivsete ainete 
puhul), tuleks esitada arvutuslikult leitud väärtus või hinnangu ­
line väärtus, mis on leitud üksikute lahustuvuste põhjal okta ­
noolis ja vees);  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid, eriti lisandeid ja aine 
füüsikalist olekut käsitlevad andmeid ja märkusi.  
Loksutamismeetodi puhul:  
— esialgse hinnangulise määramise tulemust, kui see leiti;  
— määramistemperatuuri;  
— kontsentratsioonide määramisel kasutatud analüüsiprotseduuride 
andmeid;  
— tsentrifuugimise kestust ja kiirust, kui seda kasutati;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— mõlemas faasis igal määramisel leitud kontsentratsioone (st 
kokku 12 kontsentratsiooni väärtust);  
— testaine massi, mõlema faasi mahtu igas katseanumas ja pärast 
tasakaalustamist kummaski faasis oleva testaine summaarset 
arvutuslikku kogust;  
— iga katsetingimuste kogumi kohta tuleks esitada jaotusteguri (P) 
arvutuslikult leitud väärtused ning nende keskmine, samuti kõigi määramiste keskmine. Kui on märke jaotusteguri kontsentratsioo ­
nisõltuvusest, tuleks see aruandes ära märkida;
 
— esitada tuleks üksikute P väärtuste standardhälve nende keskväär ­
tusest;  
— kõigi määramiste keskmine P väärtus tuleks esitada ka kümnend ­
logaritmina;  
— arvutuslikku teoreetilist P  OW väärtust, kui selline väärtus määrati 
või kui mõõdetud väärtus on suurem kui 10  4 ; 
— katses kasutatud vee ja veefaasi pH-d;  
— puhvrite kasutamisel nende vee asemel kasutamise põhjendust, 
nende koostist, kontsentratsiooni ja pH väärtust ning veefaasi 
pH väärtust enne ja pärast katset.  
HPLC meetodi puhul:  
— esialgse hinnangulise määramise tulemust, kui see leiti;  
— test- ja võrdlusaineid ja nende puhtust;  
— määramiste temperatuurivahemikku;  
— pH-d, mille juures määramised tehti;  
— andmeid analüüsi- ja kaitsekolonni, liikuva faasi ja kasutatud 
detektori kohta;  
— kaliibrimisel kasutatud võrdlusühendite retentsiooniandmeid ja 
kirjanduses esitatud log P väärtusi;  
— sobitatud regressioonisirge (log k  versus  log P) andmeid;  
— katseühendi keskmisi retentsiooniandmeid ja interpoleeritud log P 
väärtust;  
— seadmete ja töötingimuste kirjeldust;  
— elueerimisprofiile;  
— kolonni viidud test- ja võrdlusainete koguseid;  
— surnud aega ja selle määramise meetodit.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. VIITED  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
2. C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.
 
3. Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
4. L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosp ­
here, 1980, vol. 80, 683.  
5. H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 219 (1981).  
6. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
7. W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  
8. J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, 
vol. 7, 675.  
9. S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, 
vol. 15, 787.  
10. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, 223-339.  
11. R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
12. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
13. R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
14. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.
 
15. C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, 
vol. 12, 1 459.  
16. A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, 
vol. 71, 525.  
17. C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16,1 207.  
18. W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. 
Technol., 1974, vol. 8, 1 113.  
19. D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, 
vol. 10, 382.  
20. J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologi ­
sche Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York 1979.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
21. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984,  
22. Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel 1978.  
23. N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
1. liide  
Arvutus-/hindamismeetodid  
SISSEJUHATUS  
Üldise arvutusmeetodite tutvustuse, vastavaid andmeid ja näiteid võib leida 
raamatust „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (a).  
Arvutuslikke P  OW väärtusi saab kasutada  
— sobiva katsemeetodi valikul (loksutamismeetod: log P  OW vahemikus –2 kuni 
4, HPLC meetod: log P  OW vahemikus 0–6);  
— sobivate katsetingimuste valikul (näiteks võrdlusainete valikul HPLC protse ­
duurideks, oktanooli/vee suhte valikul loksutamismeetodi puhul);  
— labori sisekontrollimeetodina võimalike katsevigade avastamiseks;  
— hinnangulise P  OW väärtuse saamiseks juhtudel, mille puhul katsemeetodeid 
tehnilistel põhjustel rakendada ei saa.  
HINDAMISMEETOD  
Jaotusteguri esialgne hindamine Jaotusteguri hinnangulise väärtuse võib leida 
testaine lahustuvuse põhjal puhastes lahustites.  
Selleks:  
P estimate ¼ saturation c  nÄoctanol  
saturation c  water 
ARVUTUSMEETODID  
Arvutusmeetodite põhimõte  
Kõigi arvutusmeetodite kohaselt jagatakse molekul sobivateks alamstruktuuri ­
deks, mille kohta on olemas usaldusväärsed log P  OW osaväärtused. Seejärel 
arvutatakse terve molekuli log P  OW , liites kokku funktsionaalrühmadele vastavad 
osaväärtused ja sisemolekulaarseid vastasmõjusid arvestavad parandusliikmed.  
Rühmakonstantide ja parandusliikmete väärtusi võib leida toodud allikatest (b, c, 
d, e). Mõnda allikat ajakohastatakse regulaarselt (b).  
Kvaliteedinõuded  
Üldjuhul arvutusmeetodi usaldusväärsus väheneb uuritava ühendi keerukuse 
kasvades. Madala molaarmassiga lihtsate, ühe või kahe funktsionaalrühmaga molekulide puhul on eeldatav vahe erinevate, funktsionaalrühmade osaväärtusi arvestavate meetodite abil leitud ning mõõdetavate log P
 OW väärtuste vahel 
0,1–0,3 ühikut. Keerukamate molekulide puhul võib veapiir olla suurem. See 
sõltub nii saadaval olevate rühmakonstantide usaldusväärsusest kui ka oskusest hinnata sisemolekulaarseid vastasmõjusid (nt vesiniksidemeid) ja kasutada vasta ­
vaid parandusliikmeid (viimane probleem ei ole arvutitarkvara CLOGP-3 kasu ­
tamisel eriti oluline) (b). Dissotsieeruvate ühendite puhul on oluline arvestada 
õigesti dissotsiatsiooniastet ja vastava iooni laengut.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Arvutuskäik  
Hanschi π-meetod  
Algne hüdrofoobse asendaja konstant π, mille võtsid kasutusele Fujita jt (f), 
määratletakse järgmiselt:  
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH)  
kus P  OW (PhX) on aromaatse derivaadi jaotustegur ja P  OW (PhH) lähteaine 
jaotustegur.  
(e.g. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71).  
Vastavalt määratlusele on π-meetod kohaldatav peamiselt aromaatsetele asendus ­
saadustele. Paljude asendajate π-väärtused on esitatud koondtabelitena (b, c, d). 
Neid kasutatakse aromaatsete molekulide või alamstruktuuride log P  OW arvuta­
misel.  
Rekkeri meetod  
Rekkeri (g) järgi arvutatakse log P  OW väärtus järgmiselt:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j 
kus f  i tähistab erinevaid rühmakonstante ja a  i nende esinemissagedust uuritavas 
molekulis. Parandusliikmed võib väljendada summaarselt konstandi C  m (nn 
maagilise konstandi) korrutisena. Rühmakonstandid f  i ja C  m leiti mitme muutu ­
jaga regressioonianalüüsi abil 825 ühendi 1 054 eksperimentaalse P  OW väärtuse 
põhjal (c, h). Vastasmõju arvestavad liikmed määratakse vastavalt kirjanduses 
toodud eeskirjadele (e, h, i).  
Hanschi-Leo meetod  
Hanschi ja Leo (c) järgi arvutatakse log P  OW väärtus järgmiselt:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
kus f  i tähistab erinevaid rühmakonstante, F  j parandusliikmeid ja a  i , b j vastavaid 
esinemissagedusi. Paljude eksperimentaalsete P  OW väärtuste põhjal koostati 
katse-eksituse meetodil aatomite ja funktsionaalrühmade osaväärtuste ning paran ­
dusliikmete F  j (nn faktorite) nimekiri. Parandusliikmed on jagatud mitmesse eri 
klassi (a, c). Kõigi reeglite ja parandusliikmete arvestamine on suhteliselt keerukas ja aeganõudev. Selleks otstarbeks on välja töötatud vastavad tarkvara ­
paketid (b).
 
Kombineeritud meetod  
Keerukate molekulide log P  OW arvutamise täpsust on oluliselt võimalik suuren ­
dada, kui jagada molekul suuremateks alamstruktuurideks, mille kohta on olemas 
usaldusväärsed log P  OW väärtused kas tabelites (b), (c) või on need saadud 
isiklikel mõõtmistel. Selliseid fragmente (nt heterotsükleid, antrakinooni, asoben ­
seeni) võib seejärel kombineerida Hanschi π-väärtuste või Rekkeri või Leo 
rühmakonstantidega.  
Märkused  
i) Osaliselt või täielikult dissotsieerunud ühenditele saab arvutusmeetodeid 
kohaldada ainult juhul, kui on võimalik arvestada vajalikke parandustegureid.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Kui võib eeldada sisemolekulaarsete vesiniksidemete olemasolu, tuleb 
vastavad parandusliikmed liita (ligikaudu + 0,6 kuni + 1,0 log P  OW ühikut) 
(a). Viiteid selliste sidemete olemasolu kohta võib leida molekuli ruumilistest mudelitest või spektroskoopilistest andmetest.
 
iii) Kui võimalik on mitu tautomeerset vormi, kasutatakse arvutustes kõige 
suurema tõenäosusega vormi.  
iv) Hoolikalt tuleks jälgida muudatusi rühmakonstantide tabelites.  
Aruanne  
Arvutus-/hindamismeetodite kasutamisel peaks katsearuanne võimaluse korral 
sisaldama järgmisi andmeid:  
— aine kirjeldust (segu, lisandid jne);  
— märkeid võimalike sisemolekulaarsete vesiniksidemete, dissotsiatsiooni, 
laengu ja mis tahes muude ebaharilike nähtuste kohta (nt tautomeeria);  
— arvutusmeetodi kirjeldust;  
— märget kasutatud andmebaasi kohta või andmebaasi ennast;  
— lahknevusi tavapärasest fragmentide valikust;  
— põhjalikku arvutusdokumentatsiooni.  
KIRJANDUS  
a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 1979, 
vol. 14,479.  
f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.  
g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.  
h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.  
i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
2.liide  
Soovitatavad võrdlusained HPLC meetodi puhul  
Nr Võrdlusaine log P  OW pKa 
1 2-butanoon 0,3 
2 4-atsetüülpüridiin 0,5 3 Aniliin 0,9 4 Atseetaniliid 1,0 
5 Bensüülalkohol 1,1 
6 p-metoksüfenool 1,3 pKa = 10,26 7 Fenoksüäädikhape 1,4 pKa = 3,12 8 Fenool 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenool 1,5 pKa = 3,96 
10 Bensonitriil 1,6 11 Fenüülatsetonitriil 1,6 12 4-metüülbensüülalkohol 1,6 13 Atsetofenoon 1,7 14 2-nitrofenool 1,8 pKa = 7,17 
15 3-nitrobensoehape 1,8 pKa = 3,47 
16 4-kloroaniliin 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenseen 1,9 18 Kaneelalkohol 1,9 19 Bensoehape 1,9 pKa = 4,19 20 p-kresool 1,9 pKa = 10,17 21 Kaneelhape 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anisool 2,1 23 Metüülbensoaat 2,1 24 Benseen 2,1 
25 3-metüülbensoehape 2,4 pKa = 4,27 
26 4-klorofenool 2,4 pKa = 9,1 27 Trikloroetüleen 2,4 28 Atrasiin 2,6 29 Etüülbensoaat 2,6 30 2,6-diklorobensonitriil 2,6 31 3-klorobensoehape 2,7 pKa = 3,82 32 Tolueen 2,7 33 1-naftool 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dikloroaniliin 2,8 
35 Klorobenseen 2,8 
36 Allüülfenüüleeter 2,9 37 Bromobenseen 3,0
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Nr Võrdlusaine log P  OW pKa 
38 Etüülbenseen 3,2 
39 Bensofenoon 3,2 
40 4-fenüülfenool 3,2 pKa = 9,54 
41 Tümool 3,3 
42 1,4-diklorobenseen 3,4 43 Difenüülamiin 3,4 pKa = 0,79 44 Naftaleen 3,6 45 Fenüülbensoaat 3,6 46 Isopropüülbenseen 3,7 47 2,4,6-triklorofenool 3,7 pKa = 6 48 Bifenüül 4,0 49 Bensüülbensoaat 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec-butüülfenool 4,1 
51 1,2,4-triklorobenseen 4,2 
S2 Dodekaanhape 4,2 
53 Difenüüleeter 4,2 54 Butüülbenseen 4,5 55 Fenantreen 4,5 56 Fluoranteen 4,7 57 Dibensüül 4,8 58 2,6-difenüülpüridiin 4,9 59 Trifenüülamiin 5,7 60 DDT 6,2 
Muud madala log P
 OW väärtusega võrdlusained 
1 Nikotiinhape - 0,07  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. LEEKPUNKT  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Katse tegemiseks on kasulik teada aine süttivust. Katsemeetod sobib 
vedelikele, mille aurud võivad süüteallika abil süttida. Siintoodud 
katsemeetodid annavad usaldusväärseid tulemusi ainult iga meetodi puhul märgitud leekpunkti vahemikus.
 
Kasutatava meetodi valikul tuleks arvestada keemiliste reaktsioonide 
võimalusega aine ja proovianuma vahel.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Leekpunkt on madalaim, normaalrõhule 101,325 kPa normaliseeritud 
temperatuur, mille juures eraldub vedelikust katsemeetodis määrat ­
letud tingimustel aure sellises koguses, et katseanumas tekib süttiv 
auru/õhu segu.  
Ühikud:  o C 
t = T – 273,15  
(t ( o C) ja T (K))  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks 
kasutada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimalda ­
maks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Aine viiakse katseanumasse ja soojendatakse või jahutatakse iga 
meetodi puhul kirjeldatud protseduuri kohaselt katsetemperatuurini. 
Veendumaks, kas proov katsetemperatuuril süttib või mitte, tehakse 
süütamiskatsed.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
1.5.1.  Korratavus  
Korratavus varieerub vastavalt leekpunkti vahemikule ja kasutatavale 
katsemeetodile; maksimum on 2  o C. 
1.5.2.  Tundlikkus  
Tundlikkus sõltub kasutatavast katsemeetodist.  
1.5.3.  Spetsiifilisus  
Osade katsemeetodite spetsiifilisus piirdub kindlate leekpunkti vahe ­
mikega ja sõltub ainespetsiifilistest omadustest (nt kõrge viskoossus).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistused  
Testaine proov viiakse punktidele 1.6.3.1 ja/või 1.6.3.2 vastavasse 
katseseadmesse.  
Ohutuse huvides on kõrge siseenergiaga või mürgiste ainete puhul 
soovitatav kasutada väikest proovikogust, u 2 cm  3 , kasutavaid 
meetodeid.  
1.6.2.  Katsetingimused  
Kui see ei ole vastuolus ohutusnõuetega, tuleks katseseade paigal ­
dada tõmbevabasse asukohta.  
1.6.3.  Katse tegemine  
1.6.3.1.  Tasakaaluline meetod  
Vt ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Mittetasakaaluline meetod  
Abeli seade  
Vt BS 2000, 170. osa, NF M07-011, NF T66-009.  
Abel-Pensky seade  
Vt EN 57, DIN 51755, 1. osa (temperatuuridele 5–65  o C), DIN 
51755, 2. osa (temperatuuridele alla 5  o C), NF M07-036.  
Tagi seade  
Vt ASTM D 56.  
Pensky-Martensi seade  
Vt ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF 
M07-019.  
Märkused  
Kui mittetasakaalulise meetodiga (1.6.3.2) määratud leekpunkt on 0 
± 2  o C, 21 ± 2  o C või 55 ± 2  o C, tuleb saadud tulemust kinnitada 
sama seadmega ja tasakaalulise meetodi abil.  
Teavitamiseks võib kasutada ainult meetodeid, mille abil saab 
määrata leekpunkti temperatuuri.  
Viskoossete, lahusteid sisaldavate vedelike (värvid, kummid jms) 
leekpunkti määramiseks võib kasutada ainult viskoossete vedelike 
leekpunkti määramiseks ette nähtud seadmeid ja katsemeetodeid.  
Vt ISO 3679, ISO 368O, ISO 1523, DIN 53213, 1. osa.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. ANDMED  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);  
— kasutatud meetodit ja võimalikke kõrvalekaldeid sellest;  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid andmeid ja lisamärkusi.  
4. VIITED  
Puuduvad.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  SÜTTIVUS (TAHKED AINED)  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Katse tegemiseks on kasulik teada aine võimalikku plahvatusohtlik ­
kust.  
Käesolevat katset tuleks kasutada ainult pulbriliste, teraliste või 
pastataoliste ainete puhul.  
Et mitte hõlmata kõiki süttivaid aineid, vaid ainult kiiresti põlevaid 
või eriti ohtlike põlemisomadustega aineid, loetakse väga tuleohtli ­
kuks ainult neid aineid, mille põlemiskiirus ületab teatava piirväär ­
tuse. 
Eriti ohtlik võib olla hõõgumise levik läbi metallipuru, kuna see 
raskendab tule kustutamist. Metallipulbrid tuleks lugeda väga tuleohtlikuks, kui hõõgumisprotsess levib teatava aja jooksul läbi 
kogu pulbri massi.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Põlemisaeg sekundites.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Nimetamata.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Ainest moodustatakse umbes 250 mm pikkune katkestusteta pulbri ­
riba ja tehakse esialgne sõelkatse kontrollimaks, kas gaasileegiga 
süütamisel levib põlemisprotsess leegi või hõõgumisena edasi. Kui 
põlemisprotsess levib kindlaksmääratud aja jooksul läbi 200 mm riba, viiakse põlemiskiiruse määramiseks läbi täiemahuline katsepro ­
gramm.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Täpsustamata.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Esialgne sõelkatse  
Ainest moodustatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojus ­
juhtivusega alusplaadile umbes 250 mm pikkune, 20 mm laiune ja 
10 mm kõrgune katkestusteta pulbririba. Pulbririba ühele otsale 
suunatakse pulbri süttimiseni või kuni kaheks minutiks (metallide või metallisulamite pulbrite puhul viieks minutiks) vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti leek. Tehakse kindlaks, kas põlemisprotsess 
läbib neljaminutilise (metallipulbrite puhul 40minutilise) katseaja 
jooksul 200 mm ribaosa. Kui pulber ei sütti või põlemisprotsess (leek või hõõgumine) ei läbi neljaminutilise (või 40minutilise) 
katseaja jooksul 200 mm pulbririba, ei loeta ainet väga tuleohtlikuks 
ja rohkem katseid sellega ei tehta. Kui põlemisprotsess läbib 200 mm pulbririba vähem kui nelja minutiga või metallipulbrite puhul vähem kui 40 minutiga, viiakse läbi allpool kirjeldatud protseduur (punkt 
1.6.2 ja järgmised punktid).
 
1.6.2.  Põlemiskiiruse katse  
1.6.2.1.  Ettevalmistused  
250 mm pikk, kolmnurkse läbilõikega, 10 mm sisemise kõrguse ja 
20 mm sisemise laiusega vorm täidetakse tihendamata pulbrilise või 
teralise ainega. Vormi kummalegi küljele paigaldatakse pikisuunas 
külgpiiranguteks kaks metallplaati, mis ulatuvad 2 mm üle kolm ­
nurkse vao ülaääre (vt joonist). Vorm kukutatakse seejärel kolm 
korda 2 cm kõrguselt kõvale aluspinnale. Vajaduse korral täidetakse 
vorm seejärel uuesti. Külgmised piirangud eemaldatakse ja liigne aine kaabitakse ära. Vormi peale paigaldatakse seejärel mittesüttiv, mittepoorne ja madala soojusjuhtivusega alusplaat, keeratakse vorm 
koos plaadiga ümber ja eemaldatakse vorm.
 
Pastataolistest ainetest moodustatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja 
madala soojusjuhtivusega alusplaadile 250 mm pikkune, umbes 
1 cm  2 läbilõikepindalaga riba.  
1.6.2.2.  Katsetingimused  
Niiskustundlike ainete puhul tehakse katse võimalikult kiiresti pärast 
aine hoiunõust eemaldamist.  
1.6.2.3.  Katse tegemine  
Riba paigutatakse tõmbekapi alla õhu liikumise suunaga risti.  
Õhu liikumise kiirus peab olema piisav, takistamaks suitsu levikut 
laborisse, ning seda tuleb katse jooksul konstantsena hoida. Seadme 
ümber tuleks paigaldada tõmbevari.  
Riba üks ots süüdatakse vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõleti 
leegi abil. Kui riba on 80 mm ulatuses põlenud, mõõdetakse järgneva 
100 mm kestel põlemiskiirus.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Katset korratakse kuus korda, iga kord puhta jaheda alusplaadiga, 
välja arvatud juhul, kui ühel katsel on juba saadud positiivne 
tulemus.  
2. ANDMED  
Hindamisel on vajalikud esialgse sõelkatse (1.6.1) põlemisaeg ja 
kuni kuuel põhikatsel (1.6.2.3) leitud lühim põlemisaeg.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);  
— katseaine kirjeldust, füüsikalist olekut ja niiskusesisaldust;  
— esialgse sõelkatse ja põlemiskiiruse katse tulemusi (kui see tehti);  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.  
3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Pulbrilised, teralised või pastataolised ained loetakse väga tuleohtli ­
kuks, kui nende põlemisaeg punktis 1.6.2 kirjeldatud mis tahes katse ­
protseduuris on alla 45 sekundi. Metallide või metallisulamite pulbrid loetakse väga tuleohtlikuks juhul, kui need süttivad ja leek 
või reaktsioonivöönd levib kümne minutiga või kiiremini üle kogu 
proovi.
 
4. VIITED  
1. NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Liide  
Joonis  
Põlemisriba valmistamise vorm ja abivahendid  
(Kõik mõõdud on millimeetrites)
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  SÜTTIVUS (GAASID)  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
See meetod võimaldab määrata õhuga segunenud gaaside süttivust 
toatemperatuuril (u 20  o C) ja atmosfäärirõhul ning süttivate gaaside 
puhul kontsentratsioonivahemikku, milles nad süttivad. Järjest suure ­
nevate kontsentratsioonidega katsegaasi-õhu segudes tekitatakse elek ­
trisäde ja jälgitakse, kas gaas süttib.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Süttimispiirkond on kontsentratsioonivahemik alumise ja ülemise 
plahvatuspiiri vahel. Alumine ja ülemine plahvatuspiir on piirkont ­
sentratsioonid, mille puhul leek õhuga segatud gaasis ei levi.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Nimetamata.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Gaasi kontsentratsiooni õhus suurendatakse järk-järgult ja igas etapis 
tekitatakse segus elektrisäde.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Täpsustamata.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Seade  
Katseanumaks on kummuli klaassilinder sisediameetriga vähemalt 
50 mm ja kõrgusega vähemalt 300 mm. 3–5 mm vahekaugusega 
süüteelektroodid paigutatakse 60 mm kõrgusele silindri põhjast. 
Silindril on survepääsuklapiga ava. Plahvatuskahjustuste vältimiseks tuleb seade varjestada.
 
Süüteallikana kasutatakse püsivat 0,5 s kestusega induktsioonsädet, 
mis tekitatakse 10–15 kV väljundpingega kõrgepingetrafo (maksi ­
maalne sisendvõimsus 300 W) abil. Sobivat seadet on näiteks kirjel ­
datud viites 2.  
1.6.2.  Katsetingimused  
Katse viiakse läbi toatemperatuuril (u 20  o C). ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Katse tegemine  
Doseerpumpade abil viiakse klaassilindrisse kindla kontsentratsioo ­
niga gaasi-õhu segu. Segus tekitatakse säde ja jälgitakse, kas süüteal ­
likast eraldub leek ja levib gaasis iseseisvalt. Gaasikontsentratsiooni 
muudetakse 1 % kaupa kuni eespool kirjeldatud süttimise toimumi ­
seni. 
Kui gaasi keemiline struktuur viitab mittesüttivusele ja on võimalik 
välja arvutada stöhhiomeetrilise gaasiõhu segu koostis, siis kontrol ­
litakse selliste 1 % astmetega ainult segusid kontsentratsioonivahe ­
mikus 10 % alla ja 10 % üle stöhhiomeetrilise kontsentratsiooni.  
2. ANDMED  
Ainus selle omaduse määramisel oluline teave on leegi levimine.  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);  
— kasutatud seadme kirjeldust koos mõõtmetega;  
— katsetemperatuuri;  
— katsekontsentratsioone ja saadud tulemusi;  
— katse tulemust: mittesüttiv gaas või väga tuleohtlik gaas;  
— kui järeldatakse, et gaas on mittesüttiv, tuleks ära märkida kont ­
sentratsioonivahemik, milles seda 1 % sammude kaupa testiti;  
— registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamisega seonduvad 
andmed ja märkused.  
4. VIITED  
1. NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases.  
2. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. 
Redeker und H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur 
zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, 
vol 56, 2, 126-127.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  SÜTTIVUS (KOKKUPUUTEL VEEGA)  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Meetodi abil saab kontrollida, kas aine reaktsioonil vee või niiske 
õhuga tekib ohtlikus koguses gaasi või gaase, mis võivad olla väga 
tuleohtlikud.  
Katsemeetod on kohaldatav nii tahketele kui ka vedelatele ainetele. 
Meetod ei ole kohaldatav ainetele, mis kokkupuutel õhuga iseenesli ­
kult süttivad.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Väga tuleohtlik: ained, mis kokkupuutel vee või niiske õhuga eral ­
davad ohtlikus koguses väga tuleohtlikke gaase kiirusega vähemalt 1 
liiter/kg kohta tunnis.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Ainet kontrollitakse vastavalt allpool esitatud etapiviisilisele eeskir ­
jale; kui mis tahes etapis leiab aset süttimine, pole edasine kontrolli ­
mine vajalik. Kui on teada, et aine veega ägedalt ei reageeri, jätka ­
takse 4. etapiga (1.3.4).  
1.3.1.  1. etapp  
Testaine viiakse 20  o C destilleeritud vett sisaldavasse süvendisse ja 
kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib.  
1.3.2.  2. etapp  
Testaine kantakse 20  o C destilleeritud vett sisaldavas tassis ujuvale 
filterpaberile ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib. Filterpaberi ainus ülesanne on ainet koos hoida ja süttimise tõenäosust suuren ­
dada.
 
1.3.3.  3. etapp  
Testainest moodustatakse ligikaudu 2 cm kõrgune ja 3 cm läbi ­
mõõduga kuhi. Kuhjale lisatakse mõned tilgad vett ja kontrollitakse, kas tekkiv gaas süttib.
 
1.3.4.  4. etapp  
Testaine segatakse 20  o C destilleeritud veega ja mõõdetakse seitsme 
tunni jooksul ühetunniste vahedega gaasi eraldumise kiirust. Kui gaas eraldub ebaühtlase kiirusega või kiirus kasvab veel seitsme 
tunni pärast, pikendatakse mõõtmisaega kuni viie päevani. Kui kiirus 
ületab mis tahes ajahetkel 1 liitri/kg kohta tunnis, võib katse peatada.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. VÕRDLUSAINED  
Nimetamata.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Täpsustamata.  
1.6. MEETODITE KIRJELDUS  
1.6.1.  1. etapp  
1.6.1.1.  Katsetingimused  
Katse tehakse toatemperatuuril (u 20  o C). 
1.6.1.2.  Katse tegemine  
Väike (ligikaudu 2 mm läbimõõduga) kogus testainet viiakse destil ­
leeritud vett sisaldavasse süvendisse. Kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse ohtlikuks.
 
1.6.2.  2. etapp  
1.6.2.1.  Seade  
Mis tahes sobivas nõus, näiteks 100 mm läbimõõduga aurustus ­
kausis, asetatakse destilleeritud vee pinnale filterpaber.  
1.6.2.2.  Katsetingimused  
Katse tehakse toatemperatuuril (u 20  o C). 
1.6.2.3.  Katse tegemine  
Väike (ligikaudu 2 mm läbimõõduga) kogus testainet kantakse filter ­
paberi keskkohta. Kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine 
loetakse ohtlikuks.
 
1.6.3.  3. etapp  
1.6.3.1.  Katsetingimused  
Katse tehakse toatemperatuuril (u 20  o C). 
1.6.3.2.  Katse tegemine  
Testainest moodustatakse ligikaudu 2 cm kõrgune ja 3 cm läbi ­
mõõduga kuhi süvendiga tipus. Auku lisatakse mõned tilgad vett ja kontrollitakse, kas i) eraldub gaasi ja ii) kas gaas süttib. Kui 
gaas süttib, pole edasine uurimine vajalik, kuna aine loetakse 
ohtlikuks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  4. etapp  
1.6.4.1.  Seade  
Katseseade valmistatakse vastavalt joonisele.  
1.6.4.2.  Katsetingimused  
Kontrollida, kas testaine hoiuanumas leidub < 500 μm suuruseid 
osakesi sisaldavat pulbrit. Kui sellise pulbri sisaldus koguhulgas on üle 1 % mahu järgi või kui materjal on pude, tuleks kogu aine enne 
katsetusi pulbriks jahvatada, et arvestada osakeste suuruse vähene ­
misega ladustamisel ja käitlemisel; vastasel juhul uuritakse ainet töötlemata kujul. Katse tuleks teha toatemperatuuril (u 20
 o C) ja 
atmosfäärirõhul.  
1.6.4.3.  Katse tegemine  
Seadme tilklehtrisse viiakse 10–20 ml vett ja seadme koonilisse kolbi 
viiakse 10 g ainet. Eralduva gaasi ruumala mõõdetakse mis tahes 
sobiva meetodiga. Tilklehtri kraan avatakse, nii et vesi pääseb kooni ­
lisse kolbi, ja käivitatakse stopper. Gaasi eraldumise kiirust mõõde ­
takse seitsme tunni jooksul ühetunniste vahedega. Kui gaasi eraldu ­
mise kiirus on selle aja kestel ebaühtlane või kasvab veel selle 
ajavahemiku lõpus, pikendatakse mõõtmisaega kuni viie päevani. 
Kui gaasi eraldumise kiirus ületab mis tahes ajahetkel 1 liitri/kg kohta tunnis, võib katse peatada. Tuleks teha kolm paralleelkatset.
 
Kui ei ole teada, mis gaasiga on tegemist, tuleks seda analüüsida. 
Kui gaas sisaldab väga tuleohtlikke komponente ja ei ole teada, kas summaarne segu on väga tuleohtlik, tuleb valmistada sama koosti ­
sega segu ja kontrollida seda vastavalt meetodile A.11.
 
2. ANDMED  
Aine loetakse ohtlikuks kui  
— mis tahes katseetapis leiab aset iseeneslik süttimine  
või 
— eraldub tuleohtlikke gaase kiirusega vähemalt 1 liiter/kg aine 
kohta tunnis.  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);  
— testaine ettevalmistamise andmeid;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— katsete tulemusi (1., 2., 3. ja 4. etapp);  
— eralduva gaasi keemilist koostist;  
— 4. etapi (1.6.4) käigus gaasi eraldumise kiirust;  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.  
4. VIITED  
1. Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York.  
2. NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Liide  
Joonis  
Seade
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13.  TAHKETE AINETE JA VEDELIKE ISESÜTTIVUS  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Katsemeetod on kohaldatav tahketele ja vedelatele ainetele, mis 
väikestes kogustes toatemperatuuril (u 20  o C) õhuga kokku puutudes 
lühikese aja jooksul iseeneslikult süttivad.  
Katsemeetod ei hõlma aineid, mis peavad iseeneslikuks süttimiseks 
toatemperatuuril või kõrgemal temperatuuril õhuga kokku puutuma 
mitu tundi või päeva.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Ained loetakse isesüttivateks, kui need süttivad või söestuvad 
punktis 1.6 kirjeldatud tingimustel.  
Vedelike isesüttivust võib vaja olla kontrollida ka meetodi A.15 
„Isesüttimistemperatuur (vedelikud ja gaasid)” kohaselt.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Nimetamata.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Tahke aine või vedelik kantakse inertsele tugiainele ja viiakse 
toatemperatuuril viieks minutiks kokkupuutesse õhuga. Kui vedelik 
sellistes tingimustes ei sütti, imetakse see filterpaberisse ja viiakse 
toatemperatuuril (u 20  o C) viieks minutiks kokkupuutesse õhuga. 
Kui tahke aine või vedelik süttib või kui vedelik süütab või söestab filterpaberi, loetakse aine isesüttivaks.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Korratavus: kuna ohutus on oluline, loetakse aine isesüttivaks juba 
siis, kui üks tulemus on positiivne.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Seade  
Umbes 10 cm läbimõõduga portselantass täidetakse toatemperatuuril 
(u 20  o C) umbes 5 mm kõrguselt diatomiitmullaga.  
Märkus  
Diatomiitmulla või mis tahes muu saadaval oleva võrreldava inertse 
ainega simuleeritakse mulda, millesse testaine õnnetusjuhtumi korral 
võib voolata.  
Inertsel kandjal õhuga kokku puutudes mittesüttivate vedelike testi ­
miseks on vaja filterpaberit.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Katse tegemine  
a) Pulbrilised tahked ained  
1–2 cm  3 uuritavat pulbrit valatakse u 1 m kõrguselt mittesüttivale 
pinnale ja jälgitakse, kas aine süttib kukkumisel või mahalangemisest 
viie minuti jooksul.  
Katset korratakse kuus korda, kui aine enne ei sütti.  
b) Vedelikud  
U 5 cm  3 uuritavat vedelikku valatakse ette valmistatud portselantassi 
ja jälgitakse, kas aine süttib viie minuti jooksul.  
Kui aine kuue katse jooksul ei sütti, tuleb teha järgmised katsed:  
0,5 ml testaine proov viiakse süstla abil sälgustatud filterpaberile ja 
jälgitakse, kas filterpaber süttib või söestub viie minuti jooksul vede ­
liku lisamisest. Katset korratakse kolm korda, kui paber enne ei sütti 
ega söestu.  
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE KÄSITLEMINE  
Katsed võib peatada kohe pärast positiivse tulemuse saamist mis 
tahes katses.  
2.2. HINDAMINE  
Kui aine süttib viie minuti jooksul pärast inertsele tugiainele kand ­
mist ja õhu kätte viimist või kui vedelik süütab või söestab filterpa ­
beri viie minuti jooksul pärast lisamist ja õhu kätte viimist, loetakse aine isesüttivaks.
 
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— aine täpset kirjeldust (koostist ja lisandeid);  
— katsete tulemusi;  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.  
4. VIITED  
1. NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids.  
2. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  PLAHVATUSOHTLIKKUS  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Meetod näeb ette katseskeemi, mille abil kontrollitakse, kas tahke 
või pastataoline aine on plahvatusohtlik kokkupuutel leegiga (termi ­
line tundlikkus), löögi või hõõrdumise mõjul (mehaaniline tund ­
likkus) ja kas vedelik on leegi või löögi mõjul plahvatusohtlik.  
Meetod koosneb kolmest osast:  
a) termilise tundlikkuse katse (1);  
b) mehaanilise tundlikkuse katse löögi suhtes (1);  
c) mehaanilise tundlikkuse katse hõõrdumise suhtes (1).  
Meetodi abil saadakse andmeid teatavate tavapäraste mõjuritega 
seotud plahvatusohu hindamiseks. Meetod ei ole mõeldud aine plah ­
vatusohtlikkuse kontrollimiseks mis tahes tingimustes.  
Meetod sobib ainega seotud plahvatusohu (termilise ja mehaanilise 
tundlikkuse) määramiseks konkreetsetel direktiivis täpsustatud tingi ­
mustel. Meetodi puhul kasutatakse mitut tüüpi katseseadmeid, mis on laias rahvusvahelises kasutuses (1) ja mis annavad tavaliselt usaldus ­
väärseid tulemusi. On selge, et meetod ei ole ammendav. Kirjeldatud 
seadmete asemel võib kasutada muid seadmeid eeldusel, et need on rahvusvaheliselt tunnustatud ja tulemused on piisavalt sarnased 
kirjeldatud seadmetel saadavate tulemustega.
 
Katseid ei ole vaja teha juhul, kui saadaval olevad termodünaami ­
lised andmed (nt tekkesoojus, lagunemissoojus) ja/või teatavate funktsionaalrühmade (2) puudumine struktuurivalemis tõestavad 
põhjendatud kahtluseta, et toimeaine ei lagune kiirelt gaaside või 
soojuse eraldumisega (st materjal ei ole plahvatusohtlik). Mehaanilise tundlikkuse katse hõõrdumise suhtes ei ole vedelike puhul nõutav.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Lõhkeaine  
Ained, mis võivad leegi mõjul plahvatada või on kirjeldatud seadmes 
löögi- või hõõrdetundlikud (või on muus seadmes suurema mehaa ­
nilise tundlikkusega kui 1,3-dinitrobenseen).  
1.3. VÕRDLUSAINED  
1,3-dinitrobenseen, tehniline kristalne saadus, läbib 0,5 mm sõela, 
hõõrdumis- ja löögimeetoditele.  
Perhüdro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triasiin (RDX, heksogeen, tsükloniit, 
CAS-i nr 121-82-4), kristallitud tsükloheksanooni vesilahusest, märg ­
sõelutud läbi 250 μm sõela ja kinni peetud 150 μm sõelal, kuivatatud 
neli tundi 103 ± 2  o C juures, hõõrdumis- ja löögikatsete teise seeria 
jaoks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Eelkatsed on vajalikud kolme tundlikkuskatse tarvis ohutute tingi ­
muste määramiseks.  
1.4.1.  Käsitlemisohutuse katsed (3)  
Ohutuse huvides rakendatakse väga väikestele proovidele (u 10 mg) 
enne põhikatsete tegemist kuumutamist gaasileegis vabas õhus, lööke 
mis tahes tavapärastes seadmetes ja hõõrdumist vasara ja alasi vahel või mis tahes muus hõõrdumisseadmes. Selle eesmärk on kontrollida, 
kas aine on nii tundlik ja plahvatusohtlik, et ettenähtud tundlikkus ­
katsetel, eriti termilise tundlikkuse katsetel, tuleb katse tegija vigas ­
tamise vältimiseks kasutada erilisi ettevaatusabinõusid.
 
1.4.2.  Termiline tundlikkus  
Meetodi puhul kuumutatakse ainet erinevas läbimõõdus düüsidega 
plaatidega suletud terashülsis, et kontrollida, kas aine võib tugeva 
kuumuse ja piiratud ruumala tingimustes plahvatada.  
1.4.3.  Mehaaniline tundlikkus (löögitundlikkus)  
Meetodi puhul antakse ainele kindlalt kõrguselt kukutatud kindla 
massiga löök.  
1.4.4.  Mehaaniline tundlikkus (hõõrdetundlikkus)  
Meetodi puhul mõjutatakse tahkeid ja pastataolisi aineid standardsel 
pinnal määratud koormuse ja suhtelise liikumise abil tekitatud hõõr ­
dumisega.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Täpsustamata.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Termiline tundlikkus (leegi mõju)  
1.6.1.1.  Seade  
Seade koosneb ühekordselt kasutatavast terashülsist korduvkasuta ­
tava sulguriga (joonis 1), mis on paigutatud kaitsvasse kuumutus ­
seadmesse. Kõik hülsid on valmistatud sügavtõmbamisel lehtterasest 
(vt liidet) ja on 24 mm sisediameetriga, 75 mm pikad ja 0,5 mm paksuse seinaga. Hülssidel on avatud otsas äärik hülsi sulgemiseks düüsiga plaadiga sulgurseadme abil. Sulgur koosneb keskel asuva 
düüsiga survekindlast plaadist, mis kaheosalise keermega liitmiku 
(mutter ja keermega võru) abil kindlalt hülsi külge kinnitatakse. Mutter ja keermega võru on valmistatud kroom-mangaanterasest (vt liidet), mis on sädemevaba kuni temperatuurini 800
 o C. Düüsiga 
plaadid on 6 mm paksud, valmistatud kuumuskindlast terasest (vt 
liidet) ja neid on mitmesuguse avasuurusega.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Katsetingimused  
Tavaliselt uuritakse ainet töötlemata kujul, kuid mõningatel juhtudel, 
nt kui see on kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihen ­
datud, võib olla vaja see enne katsetusi purustada.  
Tahkete ainete puhul määratakse katsetes kasutatav ainekogus kahee ­
tapilisel proovitäitmisel. Kaalutud hülss täidetakse 9 cm  3 ainega ja 
tambitakse kogu hülsi ristlõike ulatuses avaldatava 80 N jõuga kokku. Ohutuse huvides või juhtudel, kus proovi füüsikaline olek võib surve mõjul muutuda, võib kasutada muid täitmismeetodeid; 
nt väga hõõrdetundliku aine puhul ei saa tampimist kasutada. Kui 
ainet on võimalik kokku suruda, lisatakse veel ainet ja jätkatakse tampimist, kuni hülss on täidetud 55 mm kauguseni ülaäärest. 
Määratakse hülsi 55 mm tasemeni täitmiseks vajalik ainekogus ja 
lisatakse veel kaks lisakogust, mis kumbki 80 N jõuga tampimisel tihendatakse. Seejärel ainet vastavalt vajadusele kas lisatakse ja tambitakse või eemaldatakse, nii et hülss täitub 15 mm kõrguseni 
ülaäärest. Järgmiseks tehakse teine proovitäitmine, alustades 
tambitud ainekogusega, mis moodustab kolmandiku esimesel proo ­
vitäitmisel leitud kogumassist. Lisatakse veel kaks lisakogust, mis 80 N jõuga tampimisel tihendatakse, ja ainekogus reguleeritakse lisa ­
misel või eemaldamisel 15 mm kõrguseni ülaäärest. Teisel proovi ­
täitmisel leitud ainekogust kasutatakse edasistes katsetes, täites hülsi kolmes võrdses osas, mis surutakse kokku ruumalani 9 cm
 3 mis 
tahes selleks vajaliku jõuga. (Selleks võib abivahendina kasutada 
vaherõngaid).  
Vedelikud ja geelid viiakse hülssi 60 mm kõrguseni, vältides geelide 
puhul hoolikalt õhuvahede teket. Keermega võru libistatakse altpoolt hülsi peale, paigaldatakse sobiv düüsiga plaat ja keeratakse mutter pärast molübdeendisulfiidmäärde lisamist kinni. Väga oluline on 
kontrollida, et ainet ei jääks ääriku ja plaadi või keermete vahele.
 
Kuumutamisel kasutatakse propaani rõhuregulaatori (60–70 mbar) ja 
voolumõõturiga tööstuslikust balloonist, millest gaas jagatakse jaotustoru kaudu ühtlaselt (kontrollitakse visuaalselt põletite leekide järgi) nelja põleti vahel. Põletid asetsevad ringikujuliselt ümber 
katsekambri, nagu on näidatud joonisel 1. Kolme põleti kogukulu 
on umbes 3,2 liitrit propaani minutis. Kasutada võib muid küttegaase ja põleteid, kuid kuumutamise kiirus peab vastama joonisel 3 täpsus ­
tatule. Kõigi seadmete puhul tuleb kuumutamise kiirust regulaarselt 
kontrollida, kasutades selleks dibutüülftalaadiga täidetud hülsse, nagu 
on näidatud joonisel 3.
 
1.6.1.3.  Katsete tegemine  
Iga katset sooritatakse hülsi purunemiseni või viie minuti möödumi ­
seni kuumutamise algusest. Plahvatusega lõppenuks loetakse katse, mille tulemusel hülss puruneb kolmeks või enamaks tükiks, mis võivad omavahel olla kitsaste metalliribadega ühendatud, nagu on 
näha jooniselt 2. Väiksema arvu tükkidega või purunemiseta 
lõppenud katset plahvatusega lõppenuks ei loeta.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Alguses tehakse kolm katset 6,0 mm düüsiga plaadiga ja kui plah ­
vatust ei toimu, tehakse teine kolmene katseseeria 2,0 mm düüsiga 
plaadiga. Kui kummaski katseseerias plahvatust ei toimu, pole edasised katsed vajalikud.
 
1.6.1.4.  Hindamine  
Katse loetakse positiivseks, kui kummaski eespool nimetatud katse ­
seerias toimub plahvatus.  
1.6.2.  Mehaaniline tundlikkus (löögitundlikkus)  
1.6.2.1.  Seade (joonis 4)  
Tüüpilise kukkuva vasaraga seadme põhiosa on valuterasest plokk 
aluse, alasi, posti, juhtrööbaste, kukkuvate raskuste, päästiku ja proo ­
vianumaga. 100 mm (läbimõõt) × 70 mm (kõrgus) terasalasi on 
kruvitud 230 mm (pikkus) × 250 mm (laius) × 200 mm (kõrgus) terasplokile valatud 450 mm (pikkus) × 450 mm (laius) × 60 mm (kõrgus) alusele. Tõmmatud terastorust liitekohtadeta post on kinni ­
tatud terasploki tagaküljel olevasse fiksaatorisse. Seade on nelja 
kruviga ankurdatud monoliitsele 60 × 60 × 60 cm betoonplokile nii, et juhtrööpad on täiesti püstsuunalised ja kukkuv raskus langeb vabalt. Kasutada saab nii 5 kg kui ka 10 kg monoliitsest terasest 
raskusi. Iga raskuse löökpea on valmistatud karastatud terasest, HRC 
60–63, ja selle miinimumläbimõõt on 25 mm.
 
Uuritav proov on suletud löögiseadmesse, mis koosneb kahest koak ­
siaalsest, üksteise kohal paiknevast monoliitsest terassilindrist õõnsas silindrilises terasjuhtvõrus. Monoliitsed terassilindrid peaksid olema 
läbimõõduga 10 (– 0,003, – 0,005) mm ja kõrgusega 10 mm ning 
poleeritud pinna, ümarate nurkadega (kõverusraadius 0,5 mm) ja kõvadusega HRC 58–65. Õõnessilindril peab olema 16 mm välisdia ­
meeter, poleeritud 10 (+ 0,005, + 0,010) mm sisediameeter ja 13 mm 
kõrgus. Vahealasile (läbimõõt 26 mm ja kõrgus 26 mm) on paigal ­
datud terasest löögiseade, mille keskosas on tekkivaid gaase läbi laskva perforatsiooniga rõngas.
 
1.6.2.2.  Katsetingimused  
Proov peaks olema mahuga 40 mm  3 või muule seadmele sobiva 
mahuga. Tahkeid aineid tuleks uurida kuivana ja need ette valmis ­
tada järgmiselt:  
a) pulbrilised ained sõelutakse (sõela ava 0,5 mm) ja katses kasuta ­
takse kogu sõela läbinud osa;  
b) kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud mater ­
jalid purustatakse väiksemateks tükkideks ja sõelutakse; katses kasutatakse sõelumisel saadud fraktsiooni osakeste läbimõõduga 0,5–1 mm ja see fraktsioon peab esindama töötlemata algainet.
 
Tavaliselt pastadena tarnitavaid materjale tuleks võimaluse korral 
uurida kuivana või vähemalt eemaldada eelnevalt võimalikult suur 
osa lahjendist. Vedelikke testitakse 1 mm vahega alumise ja ülemise 
terassilindri vahel.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Katsete tegemine  
Tehakse kuuest katsest koosnev katseseeria, kukutades 10 kg raskust 
0,40 m kõrguselt (40 J). Kui kuue katse jooksul 40 J juures toimub plahvatus, tuleb teha järgmine kuue katsega katseseeria, kukutades 
5 kg raskust 0,15 m kõrguselt (7,5 J). Muudes seadmetes võrreldakse 
proovi tunnustatud meetodi (nt üles-alla tehnika jne) abil valitud võrdlusainega.
 
1.6.2.4.  Hindamine  
Katse tulemus loetakse positiivseks, kui vähemalt ühel korral toimub 
kirjeldatud katseseadmetega mis tahes katses plahvatus (põlema 
lahvatamine ja/või paugatused on plahvatusega samaväärsed) või 
kui proov osutub muus löögikatses tundlikumaks kui 1,3-dinitroben ­
seen või RDX.  
1.6.3.  Mehaaniline tundlikkus (hõõrdetundlikkus)  
1.6.3.1.  Seade (joonis 5)  
Hõõrdeseade koosneb valatud terasest alusplaadist, millele on paigal ­
datud hõõrdeseade. Viimane koosneb fikseeritud portselanpulgast ja 
liikuvast portselanplaadist. Portselanplaat asub kahel juhtrööpal jooksval kelgul. Kelk on ühendusvarda, ekstsentrilise nuki ja sobiva ülekande abil ühendatud elektrimootoriga nii, et portselanplaati liigu ­
tatakse portselanpulga all ainult üks kord 10 mm ulatuses edasi- 
tagasi. Portselanpulgale rakendatav jõud võib olla 120–360 N.
 
Tasased portselanplaadid on valmistatud valgest tehnilisest portsela ­
nist (jämedusega 9–32 μm) ja nende mõõtmed on 25 mm (pikkus) × 
25 mm (laius) × 5 mm (kõrgus). Silindriline portselanpulk on samuti 
valmistatud valgest tehnilisest portselanist ja on 15 mm pikk, 10 mm läbimõõduga ja karestatud ümarate otsapindadega, mille kõverusraa ­
dius on 10 mm.
 
1.6.3.2.  Katsetingimused  
Proov peaks olema mahuga 10 mm  3 või muule seadmele sobiva 
mahuga.  
Tahkeid aineid uuritakse kuivana ja nad valmistatakse ette järgmiselt:  
a) pulbrilised ained sõelutakse (sõela ava 0,5 mm) ja katses kasuta ­
takse kogu sõela läbinud osa;  
b) kokku pressitud, vormi valatud või muul moel tihendatud mater ­
jalid purustatakse väiksemateks tükkideks ja sõelutakse; katses 
kasutatakse sõelumisel saadud fraktsiooni osakeste läbimõõduga 
< 0,5 mm.  
Tavaliselt pastadena tarnitavaid materjale tuleks võimaluse korral 
uurida kuivana. Kui pastast ei ole kuiva ainet võimalik valmistada, testitakse pastat (eemaldades eelnevalt võimalikult suur osa lahjen ­
dist) 0,5 mm paksuse, 2 mm laiuse ja 10 mm pikkuse, šablooni abil 
tekitatud kihina.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Katsete tegemine  
Portselanpulk viiakse uuritava proovi kohale ja rakendatakse 
koormus. Katse ajal peavad karedad jooned portselanplaadil olema liikumissuunaga risti. Tuleb jälgida, et pulk toetuks proovile, et 
pulga all oleks küllaldane kogus testainet ja et plaat pulga all õigesti 
liiguks. Pastataolised ained kantakse plaadile 0,5 mm paksuse, 2 × 10 mm avaga šablooni abil. Portselanplaat peab portselanpulga all 0,44 sekundi jooksul 10 mm edasi ja tagasi liikuma. Iga plaadi ja 
pulga pinna osa võib kasutada ainult ühe korra; pulga mõlemat otsa 
võib kasutada kaheks katseks ja plaadi kumbagi külge kolmeks katseks.
 
360 N koormusega tehakse kuuest katsest koosnev katseseeria. Kui 
nende kuue katse käigus saadakse positiivne tulemus, tehakse 120 N 
koormusega veel üks kuuest katsest koosnev katseseeria. Muudes 
seadmetes võrreldakse proovi tunnustatud meetodi (nt üles-alla tehnika jne) abil valitud võrdlusainega.
 
1.6.3.4.  Hindamine  
Katse tulemus loetakse positiivseks, kui vähemalt ühel korral toimub 
kirjeldatud katseseadmetega mis tahes katses plahvatus (pragin ja/või paugatused või põlema lahvatamine on plahvatusega samaväärsed) 
või kui proov vastab muus hõõrdekatses võrdväärsetele tingimustele.
 
2. ANDMED  
Aine loetakse direktiivi mõistes plahvatusohtlikuks juhul, kui termi ­
lise, löögi- või hõõrdetundlikkuse katses saadakse positiivne tulemus.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— testaine tunnusandmeid, koostist, puhtusastet, niiskusesisaldust 
jne; 
— proovi füüsikalist olekut ja seda, kas seda on purustatud ja/või 
sõelutud;  
— termilise tundlikkuse katsetes tehtud tähelepanekuid (nt proovi 
massi, kildude arvu jne);  
— mehaanilise tundlikkuse katsetes tehtud tähelepanekuid (nt suure 
suitsukoguse teke või täielik lagunemine ilma paugatuste, 
leekide, sädemete, pragina jne esinemiseta);  
— igat tüüpi katsete tulemusi;  
— kui kasutatud on muid seadmeid, tuleb esitada teaduslik 
põhjendus ning tõendid tulemuste vastavuse kohta kirjeldatud 
seadmetel saadud tulemustega;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid kommentaare, nagu 
viiteid katsetele analoogsete ainetega;  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.  
3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE JA HINDAMINE  
Katsearuandes tuleb ära märkida kõik tulemused, mis loeti valeks, 
anomaalseks või mitterepresentatiivseks. Kui mõnda tulemust ei arvestata, tuleb selle kohta lisada selgitus ja muude või täiendavate katsete tulemused. Kui anomaalsele tulemusele ei leidu seletust, tuleb 
seda arvestada täisväärtusliku tulemusena ja kasutada aine vastaval 
liigitamisel.
 
4. VIITED  
1. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
2. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750- 60103-5,1990.  
3. Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol.3, 6-13 and 30-42.  
4. NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – 
Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Liide  
Näitlik materjalide spetsifikatsioon termilise tundlikkuse katseks (vt DIN 
1623)  
1) Hülss: materjalispetsifikatsioon nr 1.0336 505 g  
2) Düüsiga plaat: materjalispetsifikatsioon nr 1.4873  
3) Keermega võru ja mutter: materjalispetsifikatsioon nr 1.3817  
Joonis 1  
Termilise tundlikkuse katseseade  
(Kõik mõõdud on millimeetrites)
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Joonis 2  
Termilise tundlikkuse katse  
(purunemise näited)
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Joonis 3  
Kuumutamiskiiruse kaliibrimine termilise tundlikkuse katseks
  
Temperatuuri/aja graafik 27 cm3 dibutüülftalaadi kuumutamisel suletud (1,5 mm düüsiga plaa ­
diga) hülsis propaani voolukiirusel 3,2 l/min. Temperatuur määratakse 1 mm läbimõõduga 
roostevabast terasest kattega kromellist/alumellist termopaariga, mis on paigutatud mõõte ­
seadme keskele 43 mm allapoole hülsi serva. Kuumutamise kiirus temperatuurivahemikus 135-285
 o C peats olema 185-215 K/min.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Joonis 4  
Löögikatse seade  
(Kõik mõõdud on millimeetrites)
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Joonis 4  
Jätk
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Joonis 5  
Hõõrdetundlikkuse katseseade
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  ISESÜTTIMISTEMPERATUUR (VEDELIKUD JA GAASID)  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Lõhkeaineid ja tavalisel temperatuuril õhuga kokkupuutel süttivaid 
aineid ei tohiks selles katses uurida. Katsemeetod on kohaldatav 
gaasidele, vedelikele ja aurudele, mis õhu juuresolekul kuuma pinnaga kokku puutudes süttivad.
 
Katalüütilised lisandid, pinnamaterjal või katseanuma suurem maht 
võivad isesüttimistemperatuuri oluliselt alandada.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Isesüttivuse määra väljendatakse isesüttimistemperatuurina. Isesütti ­
mistemperatuur on madalaim temperatuur, mille juures testaine katse ­
meetodis määratletud tingimustel õhuga segatuna süttib.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Võrdlusained on loetletud standardites (vt 1.6.3). Neid tuleks kasu ­
tada peamiselt meetodi toimimise kontrollimiseks ja võimaldamaks võrdlust teiste meetodite abil saadud tulemustega.
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Meetodi kohaselt määratakse kambri siseseina minimaalne tempera ­
tuur, mis põhjustab kambrisse süstitud gaasi, auru või vedeliku sütti ­
mise.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Korratavus varieerub vastavalt isesüttimistemperatuuri vahemikule ja 
kasutatavale katsemeetodile.  
Tundlikkus ja spetsiifilisus sõltuvad kasutatavast katsemeetodist.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Seade  
Katseseadet kirjeldatakse punktis 1.6.3 viidatud meetodis.  
1.6.2.  Katsetingimused  
Testaine proovi uuritakse punktis 1.6.3 viidatud meetodi kohaselt.  
1.6.3.  Katse tegemine  
Vt IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. ANDMED  
Registreerige katsetemperatuur, atmosfäärirõhk, kasutatud proovi ­
kogus ja ajavahemik süttimiseni.  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— aine täpset kirjeldust (tunnusandmeid ja lisandeid);  
— kasutatud proovikogust ja atmosfäärirõhku;  
— kasutatud katseseadet;  
— mõõtmistulemusi (katsetemperatuure, süttimistulemusi ja süttimi ­
seni kulunud ajavahemikke);  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.  
4. VIITED  
Puuduvad.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  TAHKETE AINETE SUHTELINE ISESÜTTIMISTEMPERATUUR  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Lõhkeaineid ja tavalisel temperatuuril õhuga kokkupuutel süttivad 
aineid ei tohiks selles katses uurida.  
Katse annab eelteavet tahkete ainete isesüttivuse kohta kõrgematel 
temperatuuridel.  
Kui aine reaktsioonil hapnikuga või eksotermilisel lagunemisel 
tekkiv soojus ei haju küllalt kiiresti keskkonda, leiab aset isesüttimi ­
seni viiv isekuumenemine. Seega leiab isesüttimine aset siis, kui 
soojuse tekkekiirus ületab soojuskao kiiruse.  
Katse on kasutatav tahkete ainete esialgse sõelkatsena. Arvestades 
tahkete ainete süttimis- ja põlemisprotsesside keerukust, tuleks selle katsemeetodi abil leitud isesüttimistemperatuuri kasutada ainult võrd ­
lemiseks.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Selle meetodi abil leitud isesüttimistemperatuur on madalaim tempe ­
ratuur (  o C), mille juures kindel ainekogus määratletud tingimustel 
süttib.  
1.3. VÕRDLUSAINE  
Puudub.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritava aine kindlaksmääratud kogus viiakse toatemperatuuril ahju ja 
registreeritakse temperatuuri/aja kõver proovi keskosas ahju tempera ­
tuuri tõstmisel kiirusega 0,5  o C/min temperatuurini 400  o C või aine 
sulamistemperatuurini, kui viimane on madalam. Käesoleva katse 
kohaselt loetakse isesüttimistemperatuuriks ahju temperatuur, mille juures proovi temperatuur isekuumenemise tulemusel 400
 o Cni jõuab.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Puuduvad.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Seade  
1.6.1.1.  Ahi  
Juhitava temperatuuriga laboriahi (mahuga umbes 2 liitrit), millel on 
loomulik õhuvahetus ja plahvatuskaitseklapp. Vältimaks võimalikku 
plahvatusohtu, ei tohi eralduvaid lagunemisgaase lasta elektrikütte ­
seadmetega kokku puutuda.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Traatvõrgust kuubik  
Tükk roostevabast terasest traatvõrku 0,045 mm võrgusilmaga lõiga ­
takse välja vastavalt joonisel 1 toodud skeemile. Võrk volditakse kokku ja kinnitatakse traadiga nii, et tekib avatud ülaosaga kuubik.
 
1.6.1.3.  Termopaarid  
Kasutatakse sobivaid termopaare.  
1.6.1.4.  Meerik  
Sobib mis tahes kahe kanaliga meerik, mis on kaliibritud tempera ­
tuurivahemikus 0–600  o C või vastavas pingevahemikus.  
1.6.2.  Katsetingimused  
Aineid uuritakse töötlemata kujul.  
1.6.3.  Katse tegemine  
Kuubik täidetakse uuritava ainega ja koputatakse õrnalt, misjärel 
lisatakse veel ainet, kuni kuubik on täielikult täidetud. Kuubik ripu ­
tatakse seejärel toatemperatuuril oleva ahju keskele. Temperatuuri registreerimiseks paigutatakse üks termopaar kuubiku keskele ning teine kuubiku ja ahjuseina vahele.
 
Ahju ja proovi temperatuur registreeritakse pidevalt ahju tempera ­
tuuri tõstmisel kiirusega 0,5  o C/min temperatuurini 400  o C või aine 
sulamistemperatuurini, kui viimane on madalam.  
Aine süttimisel näitab proovis olev termopaar temperatuuri järsku 
tõusu üle ahju temperatuuri.  
2. ANDMED  
Hindamisel on oluline ahju temperatuur, mille juures jõuab proovi 
temperatuur isekuumenemise tulemusena 400  o Cni (vt joonist 2).  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— uuritava aine kirjeldust;  
— mõõtmistulemusi, sh temperatuuri/aja kõverat;  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid lisamärkusi.  
4. VIITED  
NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Joonis 1  
20 mm katsekuubiku skeem
  
Joonis 2  
Tüüpiline temperatuuri/aja kõver
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  OKSÜDEERIVAD OMADUSED (TAHKED AINED)  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Katse tegemiseks on kasulik teada aine võimalikku plahvatusoht ­
likkust.  
Katset ei saa kasutada vedelike, gaaside, plahvatusohtlike või väga 
tuleohtlike ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul.  
Katset ei ole vaja teha juhul, kui toimeaine struktuurivalemi kont ­
rollimisel ei jää põhjendatud kahtlust, et toimeaine reageerib põleva materjaliga eksotermiliselt.
 
Kontrollimaks, kas katse tegemisel tuleks kasutada erilisi ettevaatu ­
sabinõusid, tuleks teha eelkatse.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Põlemisaeg: reaktsiooniaeg (sekundites), mis kulub reaktsiooni ­
vööndi levikuks piki kuhilat vastavalt punktis 1.6 kirjeldatud protse ­
duurile.  
Põlemiskiirus: väljendatakse millimeetrites sekundi kohta.  
Suurim põlemiskiirus: suurim põlemiskiiruse väärtus, mis on 
mõõdetud 10–90 % oksüdeerijasisaldusega (massi järgi) segudes.  
1.3. VÕRDLUSAINE  
Võrdlusainena kasutatakse nii katses kui ka eelkatses analüüsipuhast 
baariumnitraati.  
Võrdlussegu on selline punkti 1.6 kohaselt valmistatud baarium ­
nitraadi ja pulbertselluloosi segu, millega saavutatakse suurim põlemiskiirus (tavaliselt 60 % baariumnitraadi sisaldusega (massi 
järgi) segu).
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Ohutuse huvides tehakse eelkatse. Kui eelkatse näitab selgelt, et 
testainel on oksüdeerivad omadused, pole edasine kontrollimine vajalik. Vastupidisel juhul tehakse aine kohta täiemahuline katsepro ­
gramm.
 
Täiemahulises katseprogrammis segatakse uuritavast ainest ja kind ­
laksmääratud põlevast ainest mitmesugustes vahekordades segusid. 
Igast segust tehakse seejärel kuhi ja süüdatakse see ühest otsast. 
Leitud suurimat põlemiskiirust võrreldakse võrdlussegu suurima põlemiskiirusega.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Vajaduse korral võib kasutada mis tahes peenestamis- ja segamis ­
meetodeid eeldusel, et kuues eraldi katses määratud suurimad põle ­
miskiirused ei erine aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 10 %.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistused  
1.6.1.1.  Testaine  
Uuritava proovi osakeste suurust vähendatakse järgmisel meetodil 
alla 0,125 mm: testaine sõelutakse, seejärel peenestatakse sõelale 
jäänud osa ja korratakse protseduuri senikaua, kuni kogu proov on sõela läbinud.
 
Kasutada võib kvaliteedinõuetele vastavaid mis tahes peenestamis- ja 
sõelumismeetodeid.  
Enne segu valmistamist kuivatatakse ainet 105  o C juures konstantse 
massi saavutamiseni. Kui uuritava aine lagunemistemperatuur on alla 
105  o C, kuivatatakse aine sobival madalamal temperatuuril.  
1.6.1.2.  Põlevaine  
Põlevainena kasutatakse pulbertselluloosi. Tselluloos peaks olema 
õhukese kihi kromatograafias või kolonnkromatograafias kasutatavat 
tüüpi. Sobivaks on osutunud tselluloositüüp, mille kiupikkused 
jäävad 85 % ulatuses vahemikku 0,020–0,075 mm. Tselluloosipulber sõelutakse läbi 0,125 mm avasuurusega sõela. Kogu katse kestel tuleb kasutada samast partiist pärit tselluloosi.
 
Enne segu valmistamist kuivatatakse pulbertselluloosi 105  o C juures 
konstantse massi saavutamiseni.  
Kui eelkatses kasutatakse puidutolmu, valmistatakse okaspuu 
puidutolm ette järgmiselt: kogutakse fraktsioon, mis läbib 
1,6 mm avasuurusega sõela, segatakse tolm põhjalikult ja kuiva ­
tatakse seda neli tundi 105  o C juures kõige rohkem 25 mm 
paksuses kihis. Tolm jahutatakse ja suletakse kuni kasutamiseni 
õhukindlalt võimalikult täis mahutisse; soovitatav on tolmu kasu ­
tada 24 tunni jooksul kuivatamisest.  
1.6.1.3.  Süüteallikas  
Süüteallikana tuleks kasutada vähemalt 5 mm läbimõõduga gaasipõ ­
leti kuuma leeki. Muu süüteallika kasutamisel (nt katse tegemisel 
inertses atmosfääris) tuleks esitada selle kirjeldus ja kasutamise 
põhjendus.  
1.6.2.  Katse tegemine  
Märkus  
Oksüdeerijate segusid tselluloosi või puidutolmuga tuleb vaadelda 
potentsiaalselt plahvatusohtlikuna ja käsitleda nõutava ettevaatusega.  
1.6.2.1.  Eelkatse  
Kuivatatud aine segatakse hoolikalt kuivatatud tselluloosi või puidu ­
tolmuga vahekorras kaks osa testainet ühe osa tselluloosi või puidu ­
tolmu kohta ja tehakse segust väike koonusekujuline kuhi mõõtudega 
3,5 cm (aluse läbimõõt) × 2,5 cm (kõrgus), täites selleks ilma tampi ­
mata koonusekujulise vormi (nt suletud põhjaga laborilehtri).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Kuhi asetatakse mittesüttivale, mittepoorsele ja madala soojusjuhti ­
vusega alusplaadile. Katse tehakse tõmbekapis vastavalt kirjeldusele 
punktis 1.6.2.2.  
Süüteallikas viiakse vastu kuhilat. Jälgitakse järgneva reaktsiooni 
tugevust ja kestust ning see registreeritakse.  
Kui reaktsioon on tugev, loetakse aine oksüdeerivaks.  
Kui tulemused on kaheldavad, tehakse allpool kirjeldatud täiemahu ­
line katseprogramm põlemisribaga.  
1.6.2.2.  Põlemisribakatse  
Valmistatakse 10 % kaupa kasvava oksüdeerijasisaldusega 
oksüdeerija/tselluloosi segud, mis sisaldavad 10–90 % oksüdeerijat (massi järgi). Piiripealsetel juhtudel tuleks suurima põlemiskiiruse täpsemaks mõõtmiseks kasutada vahepealsete kontsentratsioonidega 
oksüdeerija/tselluloosi segusid.
 
Kuhi tekitatakse vormi abil. Vorm on metallist, 250 mm pikk ja 
kolmnurkse läbilõikega, 10 mm sisemise kõrguse ja 20 mm sisemise laiusega. Vormi kummalegi küljele paigaldatakse pikisuunas külgpii ­
reteks kaks metallplaati, mis ulatuvad 2 mm üle kolmnurkse vao 
ülemise ääre (vt joonist). Seade täidetakse mõningases liias seguga, 
ilma seda tihendamata. Vorm kukutatakse seejärel 2 cm kõrguselt tugevale aluspinnale ja allesjäänud üleliigne aine tõmmatakse viltuse paberilehega pealt ära. Külgmised piirded eemaldatakse ja alles ­
jäänud pulbrit silutakse rulliga. Vormi peale paigaldatakse seejärel 
mittesüttiv, mittepoorne ja madala soojusjuhtivusega alusplaat, keera ­
takse vorm koos plaadiga ümber ja vorm eemaldatakse.
 
Riba paigutatakse tõmbekapi alla õhu liikumise suunaga risti.  
Õhu liikumiskiirus peab olema piisav, et takistada suitsu levikut 
laborisse, ning seda tuleb katse jooksul konstantsena hoida. Seadme ümber tuleks paigaldada tõmbevari.
 
Tselluloosi ja mõnede uuritavate ainete hügroskoopsuse tõttu tuleb 
katse teha võimalikult kiiresti.  
Riba üks ots süüdatakse leegi abil.  
Pärast seda, kui reaktsioonivöönd on levinud esimesed 30 mm, 
mõõdetakse järgneva 200 mm ulatuses reaktsiooni leviku aeg.  
Katse tehakse võrdlusainega ja vähemalt korra kõigi testaine/ ­
tselluloosi segudega.  
Kui leitav suurim põlemiskiirus ületab oluliselt võrdlussegu põlemis ­
kiirust, võib katse peatada; muul juhul korratakse katset viis korda, 
kasutades kolme suurima põlemiskiirusega segu.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Kui arvatakse, et positiivne tulemus on ekslik, korratakse 
katset sama suurte osakestega inertse ainega, näiteks diatomii ­
diga tselluloosi asemel. Katset võib korrata ka kõrgeima põle ­
miskiirusega testaine/tselluloosi seguga inertses atmosfääris (hapnikusisaldus < 2 % mahu järgi).
 
2. ANDMED  
Ohutuse huvides loetakse uuritava aine oksüdeerivaid omadusi 
iseloomustavaks suuruseks suurim põlemiskiirus, mitte selle kesk ­
mine väärtus.  
Hindamise seisukohast on oluline antud seguga kuuest katsest koos ­
nevas seerias saadud suurim põlemiskiiruse väärtus.  
Koostatakse graafik, mis näitab iga segu põlemiskiiruse suurima 
väärtuse sõltuvust oksüdeerija kontsentratsioonist. Graafikult loetakse 
suurim põlemiskiirus.  
Kuus ühes katses suurima põlemiskiirusega segu mõõtmisel saadud 
põlemiskiiruse väärtust ei tohi aritmeetilisest keskmisest erineda 
rohkem kui 10 %, vastasel korral tuleb peenestamis- ja segamismee ­
todeid täiustada.  
Leitud suurimat põlemiskiirust võrreldakse võrdlussegu suurima 
põlemiskiirusega (vt 1.3).  
Kui katse tehakse inertses atmosfääris, võrreldakse suurimat reakt ­
sioonikiirust võrdlussegu vastava näitajaga inertses atmosfääris.  
3. ARUANNE  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— testaine tunnusandmeid, koostist, puhtusastet, niiskusesisaldust 
jne; 
— proovi mis tahes käitlemist (nt peenestamist, kuivatamist jne);  
— katsetes kasutatud süüteallikat;  
— mõõtmiste tulemusi;  
— reaktsiooni tüüpi (nt kiire põlemine pinnal, põlemine kogu 
massis, mis tahes andmeid põlemissaaduste kohta jne);  
— kõiki tulemuste tõlgendamist mõjutavaid märkusi, sh eelkatses 
test- ja võrdlusainega tekkinud reaktsiooni tugevuse kohta (leegiga, sädemetega, suitsuga, hõõgumisega reaktsioon jne) 
ning nii test- kui ka võrdlusaine puhul eelkatses/sõelkatses 
kulunud aega;
 
— inertse ainega tehtud katsete tulemusi, kui neid tehti;  
— inertses atmosfääris tehtud katsete tulemusi, kui neid tehti.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Aine loetakse oksüdeerivaks, kui  
a) eelkatses ilmneb tugev reaktsioon;  
b) uuritavate segude suurim täiemahulises katseprogrammis leitud 
põlemiskiirus on suurem tselluloosist ja baariumnitraadist valmis ­
tatud võrdlussegu suurimast põlemiskiirusest või sellega võrdne.  
Ekslike positiivsete tulemuste vältimiseks tuleks tulemuste tõlgenda ­
misel arvesse võtta ka aine inertse materjaliga segamisel ja/või inertses atmosfääris tehtud katsete tulemusi.
 
4. VIITED  
NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Liide  
Joonis  
Vorm ja abivahendid põlemisriba valmistamiseks  
(Kõik mõõdud on millimeetrites)
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  POLÜMEERIDE ARVKESKMINE MOLEKULMASS JA 
MOLEKULMASSIDE JAOTUS  
1. MEETOD  
Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi 
nr 118 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisateave on 
toodud kirjandusviites 1.  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu 
kirjeldada ühtainust meetodit, mis kirjeldaks täpselt eraldamis- ja analüüsitingimusi, mis kataks kõiki polümeeride eraldamisel esine ­
vaid võimalikke juhtumeid ja olukordi. Eelkõige on keeruliste polü ­
meerisegude lahutamine geelkromatograafia abil sageli võimatu. Kui 
geelkromatograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määra ­
miseks kasutada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.
 
Kirjeldatav meetod põhineb standardil DIN 55672 (1). Üksikasjalik 
teave katsete tegemiseks ja andmete hindamiseks on toodud nime ­
tatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajali ­
kuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Muude standardite kasutamisel peab nende jaoks andma täielikud viited. Kirjeldatava 
meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega 
polüstüreeni proove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsimiseks võib osutuda vajalikuks meetodis muudatuste tegemine.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Arvkeskmise molekulmassi M  n ja masskeskmise molekulmassi M  w 
arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
kus 
H i on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retentsiooni ­
ruumala V  i jaoks,  
M i on retentsiooniruumalale V  i vastava polümeerifraktsiooni mole ­
kulmass ja  
n on mõõtepunktide arv.  
Molekulmassi jaotuse ulatus, mis iseloomustab segu disperssust, 
leitakse M  w /M n suhtest.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kali ­
breerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsiooni ­
lise jaotusega lineaarseid polüstüreenistandardeid, mille keskmised 
molekulmassid M  n ja M  w ning molekulmasside jaotus on teada. 
Kalibreerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasuta ­
tavad tingimused on valitud ühesuguselt.
 
Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid 
konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused 
hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kroma ­
tograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi.  
Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid 
nimetatakse „polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks”. See tähendab, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest 
ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluut ­
setest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasuta ­
takse teisi standardeid, näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüül metakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Geelkromatograafia abil võib määrata nii proovi molekulmassi 
jaotust kui ka keskmisi molekulmasse (M  n , M  w ). Geelkromatograafia 
on spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse 
üksikute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2).  
Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt 
orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad 
tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse poori ­
desse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väik ­
semad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja eluee ­
ruvad viimastena.
 
Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid prak ­
tikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud 
segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem 
omaruumala võivad olukorda halvendada (2).  
Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV- 
absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul 
üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega, näiteks erinevad 
polüstüreenistandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga 
ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises 
skaalas molekulmass.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks 
olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse 
nõutav analüüsikorratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdis ­
perssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistan ­
dardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Polüstüreeni standardlahuste valmistamine  
Polüstüreenistandardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud 
eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootja soovitusi.  
Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest 
teguritest, näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise 
detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geel ­
kromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised 
süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud 
on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni 
tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kont ­
sentratsiooni vaheline optimaalne suhe.
 
1.6.2.  Proovilahuse valmistamine  
Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõudsed ka proovilahuste 
valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetrahü ­
drofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil juhul ei 
tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhasta ­
takse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm.
 
Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus 
aruandes, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühendi ­
test. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasu ­
tama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 tunni jooksul.
 
1.6.3.  Seadmed  
— mahuti lahustile;  
— degaseerija (vajaduse korral);  
— pump;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— pulsatsioonisummuti (vajaduse korral);  
— injektsioonisüsteem;  
— kromatograafilised kolonnid;  
— detektor;  
— kulumõõtja (vajaduse korral);  
— andmesalvesti ja -töötleja;  
— nõu jääkide jaoks.  
Enne peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks 
kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks 
kasutada teraskapillaare).  
1.6.4.  Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem  
Proovilahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või 
käsitsi täpselt kindlaks määratud kolonni piirkonda. Käsitsi injekt ­
siooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabas ­
tamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. 
Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimis ­
vaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on suurusjärgus 1 ml/min.
 
1.6.5.  Kolonn  
Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri analüüsiks kas ühte lihtsat 
kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitemater ­
jalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahuta ­
miseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi 
omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui 
ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, näiteks lahusti, temperatuur ja voolukiirus (1, 2, 3).
 
1.6.6.  Teoreetilised taldrikud  
Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloo ­
mustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasu ­
tamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu 
sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadao ­
leva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järg ­
miste valemite põhjal: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
või N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
kus 
N = teoreetiliste taldrikute arv  
V e = piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = piigi laius baasjoonel  
W 1/2 = piigi laius poolel piigi kõrgusel  
1.6.7.  Lahutamise efektiivsus  
Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis 
ka lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kali ­
breerimiskõvera tõus. Kolonni lahutamisefektiivsus saadakse järg ­
misest valemist:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
kolonni ristlõkepindala ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
kus 
V e, M x = polüstüreeni molekulmassiga M  x elutsiooniruumala  
V e,(10.M x) = kümme korda suurema molekulmassiga polüstüreeni 
elutsiooniruumala  
Süsteemi lahutusvõime defineeritakse tavaliselt järgmiselt:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
kus 
V e1 , V e2 = kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi 
maksimumil  
W 1 , W  2 = piigi laiused baasjoonel  
M 1 , M  2 = piigi maksimumile vastavad molekulmassid (peaksid 
erinema kümme korda)  
Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).  
1.6.8.  Lahustid  
Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetra ­
hüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahusti mahuti (vajaduse korral 
paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et 
võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.
 
1.6.9.  Temperatuurikontroll  
Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, 
detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima 
kasutatavale lahustile.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detektor  
Detektori eesmärk on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni 
kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laiene ­
mist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult 
väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse 
hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detekteerimiseks kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muid detekt ­
sioonimeetodeid, näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid jms.
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. ANDMED  
Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele 
esitatavate üksikasjaliste nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1).  
Iga proovi jaoks peab tegema kaks teineteisest sõltumatut katset. 
Neid katseid peab eraldi analüüsima.  
Iga mõõtmise tulemused peavad hõlmama M  n , M  w , M  w /M n ja M  p 
väärtusi. Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused 
on suhtelised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi 
molekulmassidega.  
Pärast retentsiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida 
võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log M  p väär­
tused (kus M  p on kalibreerimiseks kasutatava standardi piigi 
maksimum) ühe eeltoodud suuruse funktsioonina. Molekulmassi dekaadi (kümnekordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt kahte kali ­
breerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähemalt viit 
mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi molekulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp-punkt määra ­
takse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mittepolaarse 
soluudi abil. Arvkeskmised ja masskeskmised molekulmassid arvu ­
tatakse tavaliselt elektroonilise andmetöötlusega, mis põhineb punktis 1.2 toodud valemitel. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eeskujuks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3).
 
Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne 
sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel 
kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema 
umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.
 
2.2. ARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
2.2.1.  Katsetatav aine  
— Olemasolev teave analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, 
lisandid, ebapuhtused).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— Proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.  
2.2.2.  Seadmed  
— Eluendi mahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi 
koostis, ebapuhtused.  
— Pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem.  
— Lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori 
suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus ja järjekord).
 
— Kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, 
lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime).  
— Andmed piikide sümmeetria kohta.  
— Kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik.  
— Detektor (mõõtmise põhimõte, tüüp, küveti ruumala).  
— Kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõtmispõhimõte).  
— Andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).  
2.2.3.  Süsteemi kalibreerimine  
— Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne 
kirjeldus.  
— Andmed selle meetodi kvaliteedikriteeriumite kohta (näiteks 
korrelatsioonikoefitsient, ruutsumma viga jms).  
— Andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, 
mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus;
 
— Kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad 
olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera 
iga punkti kohta alljärgnevat teavet:  
— proovi nimetus;  
— proovi tootja;  
— tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomus ­
tavad M  p , M  n , M  w ja M  w /M n väärtused koos määramismee ­
todi üksikasjadega;  
— süsteruumala ja -kontsentratsioon;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— kalibreerimisel kasutatud M  p väärtus;  
— piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või 
parandatud retentsiooniaeg;  
— piigi maksimumile arvutatud M  p ; 
— arvutatud M  p protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.  
2.2.4.  Hindamine  
1) Aja põhjal hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks kasuta ­
tavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms).  
2) Teave selle kohta, kas hindamine viidi läbi elutsiooniruumala või 
retentsiooniaja põhjal.  
3) Teave hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüü ­
situd.  
4) Silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati.  
5) Proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid.  
6) Lahustumatute osakeste olemasolu.  
7) Süsteruumala ( μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml).  
8) Tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekal ­
dumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist.  
9) Kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik 
kirjeldus.  
— Veapiiride üksikasjalikud andmed.  
— Mis tahes muu teave ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste 
tõlgendamist.  
3. VIITED  
1. DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
2. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
3. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.
 
4. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Liide  
Näited muudest meetoditest, mida kasutatakse polümeeride arvkeskmise 
molekulmassi (M  n ) määramisel  
Geelkromatograafia (GPC) on eelistatud meetod M  n määramiseks, eriti juhul, kui 
kättesaadav on standardite kogum, mille struktuur on võrreldav uuritava polü ­
meeri struktuuriga. Kui geelkromatograafia kasutamisel on praktilist laadi 
raskused või olemasolevate andmete põhjal võib eeldada, et uuritav aine ei vasta esitatavatele M
 n kriteeriumitele (vajab eelnevalt kinnitamist), siis on 
võimalik kasutada alternatiivseid meetodeid, näiteks järgmisi.  
1. Kolligatiivsete omaduste kasutamine  
1.1. Ebullioskoopia/krüoskoopia  
Hõlmab lahusti keemistemperatuuri tõusu (ebullioskoopia) või 
külmumistemperatuuri alanemise (krüoskoopia) mõõtmist pärast polümeeri lisamist. Meetod põhineb sellel, et lahustunud polümeeri 
mõju keemis- või külmumistemperatuurile sõltub polümeeri molekul ­
massist (1, 2).
 
Rakendatavus: M  n < 20 000.  
1.2. Aururõhu alandamine  
Hõlmab valitud võrdlusvedeliku aururõhu mõõtmist enne ja pärast 
teadaoleva koguse polümeeri lisamist (1, 2).  
Rakendatavus: M  n < 20 000 (teoreetiliselt; praktikas siiski piiratud).  
1.3. Membraanosmomeetria  
Põhineb osmoosi põhimõttel, st tasakaalu saavutamiseks läbivad 
lahusti molekulid poolläbilaskvat membraani lahjemast lahusest kont ­
sentreeritumasse lahusesse. Katses kasutatav lahja lahus on nullkont ­
sentratsiooniga ja kontsentreeritud lahus sisaldab polümeeri. Läbi membraani tungiv lahusti tekitab rõhkude erinevuse, mis sõltub polü ­
meeri kontsentratsioonist ja molekulmassist (1, 3, 4).
 
Rakendatavus: M  n vahemikus 20 000 – 200 000.  
1.4. Aurufaasi osmomeetria  
Hõlmab puhta lahusti aerosooli aurustumiskiiruse võrdlemist vähe ­
malt kolme aerosooliga, mis sisaldavad uuritava polümeeri erinevaid 
kontsentratsioone (1, 2, 4).  
Rakendatavus: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Lõpprühma alüüs  
Selle meetodi kasutamiseks on vajalik teada nii polümeeri üldist 
struktuuri kui ka ahela otsmiste rühmade keemilist koostist (mis peab olema eristatav põhiahelast näiteks NMR või tiitrimise/ ­
derivatiseerimise abil). Polümeeris esinevate otsmiste rühmade mole ­
kulaarse kontsentratsiooni määramise kaudu saab leida molekulmassi 
(7, 8, 9).
 
Rakendatavus: M  n kuni 50 000 (kahaneva usaldusväärsusega).  
3. Viited  
1. Billmeyer, F. W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York.  
2. Glover, C. A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
 
3. ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determinition 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Menbrane 
Osmometry. American Society for Testing and Materials, Phila ­
delphia, Pennsylvania.  
4. Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A. R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 
25 to 52.  
5. ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 
6. Morris, C. E. M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: 
Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
7. Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
8. Garmon, R. G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 
3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
 
9. Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 
62, 2139-2146.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  MADALAMOLEKULAARSETE AINETE SISALDUS 
POLÜMEERIS  
1. MEETOD  
Käesolev geelkromatograafia (GPC) meetod on OECD katsejuhendi 
nr 119 (1996) koopia. Meetodi põhimõte ja tehniline lisateave on 
toodud kirjandusviidetes.  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kuna polümeeride omadused on väga erinevad, siis on võimatu 
kirjeldada ühtainust meetodit, mille lahutamis- ja analüüsitingimused katavad kõiki polümeeride eraldamisel esinevaid võimalikke juhtu ­
meid ja iseärasusi. Sageli ei ole keeruliste polümeerisegude koosti ­
sosadeks lahutamine geelkromatograafiaga võimalik. Kui geelkroma ­
tograafia ei ole kasutatav, siis võib molekulmassi määramiseks kasu ­
tada teisi meetodeid (vt lisa). Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik üksikasjad ja põhjendused.
 
Kirjeldatav meetod põhineb standardil DIN 55672 (1). Üksikasjalik 
teave katsete tegemiseks ja andmete hindamiseks on toodud nime ­
tatud DIN standardis. Kui katse tingimuste muutmine osutub vajali ­
kuks, siis peab vastavaid muudatusi põhjendama. Kasutada võib ka 
muid standardeid, kui neile antakse täielikud viited. Kirjeldatava meetodi kalibreerimiseks kasutatakse teadaoleva polüdisperssusega 
polüstüreenproove ja teatud polümeeride (näiteks vesilahustuvad ja 
pika ahelaga hargnenud polümeerid) analüüsil võib osutuda vajali ­
kuks meetodi muutmine.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Madal molekulmass on kokkuleppeliselt molekulmass, mis on 
väiksem kui 1 000 daltonit.  
Arvkeskmise molekulmassi M  n ja masskeskmise molekulmassi M  w 
arvutamiseks kasutatakse järgmisi valemeid: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
kus 
H i = on detektori signaali kõrgus mõõdetuna baasjoonelt retentsioo ­
nimahu V  i jaoks  
M i = on retentsioonimahule V  i vastava polümeerifraktsiooni mole ­
kulmass ja n on mõõtepunktide arv  
Molekulmassi jaotuse laius, mis iseloomustab segu disperssust, 
saadakse M  w /M n suhtest.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Kuna geelkromatograafia on suhteline meetod, siis peab seda kali ­
breerima. Selleks otstarbeks kasutatakse tavaliselt kitsa fraktsiooni ­
lise jaotusega lineaarseid polüstüreenstandardeid, mille keskmised 
molekulmassid M  n ja M  w ja molekulmasside jaotus on teada. Kali ­
breerimiskõverat võib kasutada tundmatu proovi molekulmassi määramiseks vaid siis, kui proovi ja standardi lahutamiseks kasuta ­
tavad tingimused on valitud ühtviisi.
 
Molekulmassi ja elueerunud ruumala vaheline suhe on õige vaid 
konkreetsele katsele iseloomulikel tingimustel. Nimetatud tingimused 
hõlmavad eelkõige temperatuuri, lahustit (või lahustite segu), kroma ­
tograafilisi tingimusi ja kasutatavat kolonni või kolonnisüsteemi.  
Sellisel viisil proovist määratud molekulmassid on suhtelised ja neid 
nimetatakse „polüstüreeniekvivalendi molekulmassideks”. See tähendab, et sõltuvalt proovi ja standardi vahelistest struktuurilistest 
ja keemilistest erinevustest võivad molekulmassid hälbida absoluut ­
setest väärtustest rohkemal või vähemal määral. Juhul kui kasuta ­
takse teisi standardeid, näiteks polüetüleenglükool, polüetüleenoksiid, polümetüülmetakrülaat, polüakrüülhape, siis peab seda põhjendama.
 
1.4. KATSE MEETODI PÕHIMÕTE  
Geelkromatograafiaga võib määrata nii proovi molekulmassi jaotust 
kui ka keskmisi molekulmasse (M  n , M  w ). Geelkromatograafia on 
spetsiaalne vedelikkromatograafia liik, milles proov lahutatakse üksi ­
kute koostisosade hüdrodünaamiliste ruumalade järgi (2).  
Lahutamiseks juhitakse proov läbi poorse materjaliga, tavaliselt 
orgaanilise geeliga, täidetud kolonni. Väikesed molekulid suudavad 
tungida pooridesse, kuhu suurte molekulide juurdepääs on takistatud. Seetõttu on suurte molekulide teepikkus lühem ja nad elueeruvad kiiremini. Keskmise suurusega molekulid tungivad osadesse poori ­
desse, mistõttu nad elueeruvad mõnevõrra aeglasemalt. Kõige väik ­
semad molekulid, mille keskmine hüdrodünaamiline raadius on väiksem kui geeli poorid, tungivad kõikidesse pooridesse ja eluee ­
ruvad viimastena.
 
Ideaaljuhul mõjutab lahutamist ainult molekulide suurus, kuid prak ­
tikas on raske vältida vähemalt mõningaid adsorptsioonist tingitud 
segavaid mõjusid. Kolonni ebaühtlane täitematerjal ja suurem 
omaruumala võivad olukorda halvendada (2).  
Detekteerimiseks kasutatakse näiteks refraktsiooni indeksit või UV- 
absorptsiooni ja tulemuseks saadakse lihtne jaotuskõver. Selleks, et omistada saadud kõverale tegelikke molekulmassi väärtusi, tuleb kolonni kalibreerida teadaolevate molekulmassidega ja ideaaljuhul 
üldjoontes sarnase struktuuriga polümeeridega, näiteks erinevad 
polüstüreenstandardid. Tüüpiliselt saadakse Gaussi kõver, mis on mõnikord madalate molekulmasside osas väljaveninud sabaga, kusjuures vertikaalsel teljel on elueerunud erinevate molekulmassiga 
ühendite kogus massi järgi ja horisontaalsel teljel on logaritmilises 
skaalas molekulmass.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Nimetatud kõveralt saadakse madalmolekulaarsete ainete sisaldus. 
Arvutused saavad olla täpsed vaid siis, kui madala molekulmassiga 
ühendid annavad massi alusel detektorile samase signaali kui kogu polümeer.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Elutsiooniruumala korratavus (suhteline standardhälve, RSD) peaks 
olema parem kui 0,3 %. Kui kromatogrammi hinnatakse ajalise sõltuvuse põhjal ja see ei vasta ülaltoodud kriteeriumitele, tagatakse analüüsi nõutav korratavus sisestandardi kasutamisega (1). Polüdis ­
perssused sõltuvad standardite molekulmassidest. Polüstüreenistan ­
dardite kasutamisel on tüüpilised väärtused järgmised: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p on piigi maksimumile vastav standardi molekulmass)  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Polüstüreeni standardlahuste valmistamine  
Polüstüreeni standardid lahustatakse ettevaatlikul segamisel valitud 
eluendiga. Lahuste valmistamisel peab arvestama tootja soovitusi.  
Valitud standardi kontsentratsioonid sõltuvad mitmetest erinevatest 
teguritest, näiteks süsteruumala, lahuse viskoossus ja analüütilise 
detektori tundlikkus. Maksimaalset süsteruumala peab kohandama vastavalt kolonni pikkusele, et vältida kolonni ülelaadimist. Geel ­
kromatograafia analüütiliste meetodite korral jäävad tüüpilised 
süsteruumalad vahemikku 40 kuni 100 μl, kui kolonni mõõdud 
on 30 cm × 7,8 mm. Võimalik on kasutada ka suuremaid ruumalasid, kuid need ei tohiks ületada 250 μl. Enne kolonni 
tegelikku kalibreerimist tuleb kindlaks teha süsteruumala ja kont ­
sentratsiooni vaheline optimaalne suhe.
 
1.6.2.  Proovilahuse valmistamine  
Põhimõtteliselt kehtivad ülaltoodud nõuded ka proovilahuste 
valmistamisel. Proov lahustatakse sobivas lahustis, näiteks tetra ­
hüdrofuraanis (THF), ettevaatlikul loksutamisel. Mitte mingil 
juhul ei tohi lahustamiseks kasutada ultrahelivanni. Vajaduse korral puhastatakse proovi lahust membraanfiltriga, mille pooride suurus on 0,2 kuni 2 μm.
 
Lahustumatute osakeste olemasolu peab ära märkima ka lõplikus 
aruandes, kuna see võib olla tingitud kõrge molekulmassiga ühendi ­
test. Lahustunud osakeste massiprotsendi määramiseks peab kasu ­
tama sobivat meetodit. Valmistatud lahuseid peab kasutama 24 
tunni jooksul.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Parandused ebapuhtuste ja lisandite sisalduse jaoks  
Tavaliselt on vajalik molekulmassiga M < 1 000 ühendite sisalduse 
korrigeerimine, mis on tingitud mittepolümeersetest komponentidest (näiteks ebapuhtused ja/või lisandid), välja arvatud juhul, kui nende 
ühendite mõõdetud sisaldus on niigi < 1 %. Selleks analüüsitakse 
otse polümeerilahust või geelkromatograafi eluaati.
 
Kui eluaat on pärast kolonni läbimist liiga lahja edasiseks analüüsiks, 
siis peab seda kontsentreerima. Vajalik võib olla eluaadi kuivaks aurutamine ja saadud jäägi uuesti lahustamine. Eluaati peab kontsen ­
treerima tingimustel, mis ei põhjusta eluaadis muutusi. Geelkroma ­
tograafi eluaadi töötlemine sõltub kvantitatiivseks määramiseks kasu ­
tatavast analüütilisest meetodist.
 
1.6.4.  Seadmed  
Geelkromatograafia seadmed sisaldavad järgmisi komponente:  
— mahuti lahustile;  
— degaseerija (vajaduse korral);  
— pump;  
— pulsatsioonisummuti (vajaduse korral);  
— injektsioonisüsteem;  
— kromatograafilised kolonnid;  
— detektor;  
— kulumõõtja (vajaduse korral);  
— andmesalvesti ja-töötleja;  
— nõu jääkide jaoks.  
Enne peab kindlaks tegema, et geelkromatograafia süsteem oleks 
kasutatavate lahustite suhtes inertne (näiteks tetrahüdrofuraani jaoks 
kasutada teraskapillaare).  
1.6.5.  Injektsiooni ja lahusti etteandmise süsteem  
Proovilahuse etteantud kogus sisestatakse automaatse injektoriga või 
käsitsi täpselt kindlaks määratud kolonni piirkonda. Käsitsi injekt ­
siooni korral võib süstla kolvi liiga kiire tagasitõmbamine või vabas ­
tamine põhjustada muutusi mõõdetava molekulmassi jaotuses. Lahusti etteandmise süsteem peaks olema võimalikult pulseerimis ­
vaba, sisaldades ideaaljuhul pulsatsioonisummutit. Voolukiirus on 
suurusjärgus 1 ml/min.
 
1.6.6.  Kolonn  
Sõltuvalt proovist kasutatakse polümeeri iseloomustamiseks kas ühte 
kolonni või mitut järjestikku ühendatud kolonni. Kolonni täitemater ­
jalidena on kaubanduslikult kättesaadavad paljud poorsed kindlate 
omadustega ained (näiteks poori suurus, eksklusioonipiirid). Lahuta ­
miseks kasutatava geeli või kolonni pikkuse valik sõltub nii proovi omadustest (hüdrodünaamiline ruumala, molekulmasside jaotus) kui 
ka spetsiifilistest lahutamistingimustest, näiteks lahusti, temperatuur 
ja voolukiirus (1, 2, 3).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Teoreetilised taldrikud  
Lahutamiseks kasutatavat kolonni või kolonnide süsteemi iseloo ­
mustatakse teoreetiliste taldrikute arvuga. Tetrahüdrofuraani kasu ­
tamisel eluendina hinnatakse seda etüülbenseeni või mõne muu 
sobiva mittepolaarse lahustunud aine (soluudi) laadimisel teadao ­
leva pikkusega kolonni. Teoreetiliste taldrikute arv saadakse järg ­
miste valemite põhjal: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
või N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
kus 
N = on teoreetiliste taldrikute arv  
V e = on piigi maksimumile vastav elutsiooniruumala  
W = on piigi laius baasjoonel  
W 1/2 = on piigi laius poolel piigi kõrgusel  
1.6.8.  Lahutamise efektiivsus  
Lisaks ribalaiust määravale teoreetiliste taldrikute arvule on tähtis ka 
lahutamise efektiivsus, mis sõltub sellest, kui järsk on kalibreerimis ­
kõvera tõus. Kolonni lahutuse efektiivsus saadakse järgmisest 
seosest:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
kolonni ristlõkepindala ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
kus 
Ve, M  x = on polüstüreeni molekulmassiga M  x elutsiooniruumala  
V e,(10.M x) = on kümme korda suurema molekulmassiga polüstüreeni 
elutsiooniruumala  
Süsteemi lahutusvõimet defineeritakse tavaliselt järgmiselt:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
kus 
Ve1, V  e2 = on kahe polüstüreenistandardi elutsiooniruumalad piigi 
maksimumil  
W 1, W 2 = on piigi laiused baasjoonel  
M 1, M 2 = on piigi maksimumile vastavad molekulmassid 
(peaksid erinema kümme korda)  
Kolonnisüsteemi R-väärtus peaks olema suurem kui 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Lahustid  
Kõik lahustid peavad olema kõrge puhtusastmega (kasutatava tetra ­
hüdrofuraani puhtus on 99,5 %). Lahustimahuti (vajaduse korral paigutatud inertgaasi atmosfääri) peab olema piisavalt suur, et 
võimaldada kolonni kalibreerimist ja proovide analüüsi. Enne 
pumpamist kolonni peab lahustit degaseerima.
 
1.6.10.  Temperatuurikontroll  
Kriitilise tähtsusega komponentide (injektsioonisilmus, kolonnid, 
detektor ja torustik) temperatuur peab olema konstantne ja sobima 
kasutatavale lahustile.  
1.6.11.  Detektor  
Detektori eesmärk on kolonnist elueeruva proovi kontsentratsiooni 
kvantitatiivne mõõtmine. Selleks, et vältida piikide tarbetut laiene ­
mist, peab detektori mõõteraku küveti ruumala olema võimalikult väike. See ei tohiks olla suurem kui 10 μl, välja arvatud valguse 
hajuvust ja viskoossust mõõtvate detektorite korral. Detektorina 
kasutatakse tavaliselt diferentsiaalrefraktomeetriat. Tingituna proovi või eluendi spetsiifilistest omadustest võib kasutada ka muud tüüpi detektsioonimeetodeid, näiteks UV/VIS, IR, viskoossusdetektorid 
jms.
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. ANDMED  
Hindamiskriteeriumitele ning andmete kogumisele ja töötlemisele 
esitatavate üksikasjalike nõuete osas peaks järgima DIN standardit (1).  
Iga proovi jaoks peab tegema kaks teineteisest sõltumatut katset. 
Neid katseid peab eraldi analüüsima. Kõikidel juhtudel on oluline 
arvestada ka pimekatse andmeid, mis on tehtud prooviga samadel 
katsetingimustel.  
Üheselt mõistetavalt peab näitama, et mõõdetud väärtused on suhte ­
lised väärtused, mis on ekvivalentsed kasutatud standardi molekul ­
massidega.  
Pärast retentsiooniruumalade või -aegade kindlaksmääramist (mida 
võib parandada sisestandardite kasutamisega) esitatakse log M  p väär­
tused (kus M  p on kalibratsioonistandardi piigi maksimum) ühe järg ­
nevalt toodud suuruse funktsioonina: M  n , M  w või M  w /M n . Molekul ­
massi dekaadi (kümnekordse vahemiku) kohta on vaja vähemalt 
kahte kalibreerimiskõvera punkti ja terve kõvera jaoks on vaja vähe ­
malt viit mõõtepunkti, mis peaks hinnanguliselt katma proovi mole ­
kulmassi. Kalibreerimiskõvera madala molekulmassiga osa lõpp ­
punkt määratakse kindlaks n-heksüülbenseeni või muu sobiva mitte ­
polaarse soluudi abil. Kõvera osa, mis vastab molekulmassidele alla 1 000, analüüsitakse ja parandatakse ebapuhtuste ja lisandite suhtes. Elutsioonikõveraid analüüsitakse tavaliselt elektrooniliste andmetööt ­
luse vahenditega. Käsitsi digitaliseerimise kasutamisel võib eesku ­
juks võtta standardi ASTM D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Juhul, kui mis tahes lahustumatu polümeer jääb kolonni, siis on selle 
molekulmass tõenäoliselt suurem kui mis tahes komponendi oma 
lahustuvas fraktsioonis ja selle arvesse võtmata jätmisel hinnatakse üle madala molekulmassiga komponentide sisaldust. Madala mole ­
kulmassiga komponentide sisalduse määramise parandusjuhised 
lahustumatu polümeeri jaoks on toodud lisas.
 
Jaotuskõvera peab esitama tabeli või joonise kujul (diferentsiaalne 
sagedus või protsentide summa log M funktsioonina). Graafilisel 
kujutamisel peab üks molekulmassi kümnekordne vahemik olema umbes 4 cm laiune ja piigi maksimum peab olema umbkaudu 8 cm kõrgune. Integraalsete jaotuskõverate korral peab ordinaadi 0 
ja 100 % vahemik olema umbes 10 cm laiune.
 
2.2. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
2.2.1.  Katsetatav aine  
— Olemasolev teave analüüsitava aine kohta (identifitseerimiskood, 
lisandid, ebapuhtused).  
— Proovi eeltöötluse täpne kirjeldus, tähelepanekud, probleemid.  
2.2.2.  Seadmed  
— Eluendimahuti, inertgaas, eluendi degaseerimine, eluendi koostis, 
ebapuhtused.  
— Pump, pulsatsioonisummuti, injektsioonisüsteem.  
— Lahutuskolonnid (tootja, kõik kolonni näitajad, nagu poori 
suurus, täitematerjali liik jms, kasutatavate kolonnide arv, pikkus 
ja järjekord).  
— Kolonni (või nende kombinatsiooni) teoreetiliste taldrikute arv, 
lahutamise efektiivsus (süsteemi lahutusvõime).  
— Andmed piikide sümmeetria kohta.  
— Kolonni temperatuur, temperatuurikontrolli liik.  
— Detektor (mõõtmispõhimõte, tüüp, küveti ruumala).  
— Kulumõõtja, kui kasutati (tootja, mõõtmispõhimõte).  
— Andmete salvestamise ja töötlemise süsteem (riist- ja tarkvara).  
2.2.3.  Süsteemi kalibreerimine  
— Kalibreerimiskõvera koostamiseks kasutatud meetodi täpne 
kirjeldus.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— Andmed selle meetodi kvaliteedinõuete kohta (näiteks korrelat ­
sioonikoefitsient, ruutsumma viga jms).  
— Andmed kõikide ekstrapoleerimiste, oletuste ja lähenduste kohta, 
mis tehti eksperimendi ning andmete hindamise ja töötlemise käigus.
 
— Kõik kalibreerimiskõvera koostamiseks tehtud mõõtmised peavad 
olema dokumenteeritud tabelis, mis sisaldab kalibreerimiskõvera 
iga punkti kohta alljärgnevat teavet:  
— proovi nimetus;  
— proovi tootja;  
— tootjapoolsed või mõõtmistel saadud standardit iseloomus ­
tavad M  p , M  n , M  w ja M  w /M n väärtused, koos määramismee ­
todi üksikasjadega;  
— süsteruumala ja -kontsentratsioon;  
— kalibreerimisel kasutatud M  p väärtus;  
— piigi maksimumile vastav mõõdetud elutsiooniruumala või 
parandatud retentsiooniaeg;  
— piigi maksimumile arvutatud M  p ; 
— arvutatud M  p protsentuaalne viga ja kalibreerimistulemus.  
2.2.4.  Andmed madalamolekulaarse polümeeri sisalduse kohta  
— Analüüsimeetodite kirjeldus ja katsete tegemise viis.  
— Madalamolekulaarsete komponentide protsentuaalne sisaldus 
(massi järgi) võrreldes kogu prooviga.  
— Andmed ebapuhtuste, lisandite ja muude mittepolümeersete 
komponentide kohta massiprotsendina kogu proovist.  
2.2.5.  Hindamine  
— Retentsiooniaja järgi hindamine: nõutava korratavuse tagamiseks 
kasutatavad meetodid (parandusmeetod, sisestandard jms).  
— Teave selle kohta, kas hinnati elutsiooniruumala või retentsioo ­
niaja põhjal.  
— Teave hindamise piiratuse kohta, kui piik ei ole täielikult analüü ­
situd.  
— Silumismeetodite kirjeldus, kui neid kasutati.  
— Proovi ettevalmistamise ja eeltöötluse protseduurid.  
— Lahustumatute osakeste olemasolu.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— Süsteruumala ( μl) ja -kontsentratsioon (mg/ml).  
— Tähelepanekud seikade kohta, mis võivad põhjustada kõrvalekal ­
dumist ideaalsest geelkromatograafia profiilist.  
— Kõikide katseprotseduurides tehtud muudatuste üksikasjalik 
kirjeldus.  
— Veapiiride üksikasjalikud andmed.  
— Mis tahes muu teave ja tähelepanekud, mis puudutavad tulemuste 
tõlgendamist.  
3. VIITED  
1. DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
2. Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
3. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
4. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Liide  
Madala molekulmassiga komponentide sisalduse parandamise juhised 
lahustumatu polümeeri olemasolul  
Proovis sisalduv lahustumatu polümeer põhjustab massikadu geelkromatograafi ­
lises analüüsis. Lahustumatu polümeer jääb pöördumatult kolonni või proovi 
ettevalmistamisel kasutatud filtrile, kuid proovi lahustuv osa läbib kolonni. Kui 
polümeeri refraktsiooniindeksi juurdekasvu (dn/dc) saab hinnata või mõõta, siis on võimalik hinnata proovi massikadu kolonnis. Sellisel juhul kasutatakse paran ­
duse tegemiseks välist kalibreerimist teadaoleva kontsentratsiooniga ja dn/dc 
väärtusega standardainetega, et kalibreerida refraktomeetri signaali. Järgnevas 
näites kasutatakse polü(metüülmetakrülaat) (pMMA) standardit.
 
Akrüülpolümeeride analüüsil välise kalibreerimise saamiseks viiakse geelkroma ­
tograafi teadaoleva kontsentratsiooniga pMMA standardi lahus tetrahüdrofuraanis ja saadud andmeid kasutatakse refraktomeetri konstandi leidmiseks järgmise 
valemi põhjal:
 
K = R/(C×V× dn/dc)  
kus 
K = refraktomeetri konstant (mikrovoltsekund/ml)  
R = pMMA standardi signaal (mikrovolt/sekund)  
C = pMMA standardi kontsentratsioon (mg/ml)  
V = süsteruumala (ml) ja dn/dc pMMA lahuse tetrahüdrofuraanis refrakt ­
siooniindeksi juurdekasv (ml/mg)  
Järgmised andmed on tüüpilised pMMA standardi jaoks:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg  
Saadavat K väärtust, 3,05 × 10, kasutatakse teoreetilise detektori signaali arvu ­
tamiseks, kui 100 % süstitud polümeerist elueerus läbi detektori.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  POLÜMEERIDE LAHUSTUMIS-/EKSTRAHEERUMISKÄITU ­
MINE VEES  
1. MEETOD  
Kirjeldatav meetod on OECD katsejuhendi nr 120 (1997) parandatud 
versiooni koopia. Täpsem tehniline lisateave on toodud kirjandus ­
viites (1).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Osade polümeeride, nagu emulsioonipolümeerid, korral on vajalik 
eeltöötlus enne allkirjeldatud meetodi kasutamist. Meetod ei ole 
kasutatav vedelate polümeeride ja katsetingimustel veega reageeri ­
vate polümeeride jaoks.  
Kui meetod ei ole otstarbekohane või võimalik, siis võib polümeeri 
lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist uurida muude meetodite 
abil. Sellistel juhtudel tuleb kasutatava meetodi kohta esitada kõik 
üksikasjad ja põhjendused.  
1.2. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses 
uuritakse muudatustega kolvimeetodil (vt A.6 „Vees lahustuvus”, „Kolvimeetod”), mida on alljärgnevalt kirjeldatud.
 
1.4. KVALITEEDINÕUDED  
Puuduvad.  
1.5. MEETODI KIRJELDUS  
1.5.1.  Seadmed  
Meetodi jaoks on vajalikud järgmised seadmed:  
— purustamisseade, näiteks jahvatusmasin, kindla suurusega 
osakeste valmistamiseks;  
— seade loksutamiseks, temperatuurikontrolli võimalusega;  
— membraanfiltratsiooni süsteem;  
— asjakohased analüütilised seadmed;  
— standardsed sõelad.  
1.5.2.  Proovi ettevalmistus  
Esindusliku proovi peab esmalt vähendama osakeste suuruseni 0,125 
kuni 0,25 mm, kasutades vastavaid sõelu. Proovi stabiilsuse taga ­
miseks või jahvatamiseks võib vajalik olla jahutamine. Kummilaad ­
seid materjale saab purustada vedela lämmastiku temperatuuril (1).  
Kui osakeste soovitud suurusega fraktsioon ei ole saavutatav, peab 
vähendama osakeste suurust nii palju kui võimalik ja saadud tule ­
mused protokollima. Protokollis peab täpselt ära näitama, mil viisil 
säilitati purustatud proovi enne katset.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Protseduur  
Katsetatava aine kolm proovi (igaüks 10 g) kaalutakse vastavalt 
kolme klaaskorgiga varustatud nõusse ja igaühte lisatakse 1 000 ml vett. Kui polümeeri koguses 10 g ei ole võimalik käsitleda, siis peab 
kasutama suurimat kogust, mille käsitlemine on veel võimalik, ja 
muutma vastavalt sellele ka vee kogust.
 
Nõud suletakse tihedalt ja seejärel loksutatakse temperatuuril 20  o C. 
Kasutada tuleks konstantsel temperatuuril töötavat loksutit või 
segajat. 24 tunni pärast tsentrifuugitakse või filtritakse iga nõu sisu 
ja selges veefaasis määratakse polümeeri kontsentratsioon sobiva analüüsimeetodiga. Kui veefaasi jaoks puudub sobiv analüüsimeetod, siis võib summaarset lahustuvust/ekstraktiivsust hinnata filtril oleva 
jäägi või tsentrifuugimise sademe kuivkaalu põhjal.
 
Tavaliselt on vajalik ebapuhtuste ja lisandite ning madala molekul ­
massiga komponentide kvantitatiivne eristamine. Gravimeetrilise analüüsi korral on tähtis sooritada ka pimekatse ilma testaineta, et 
hinnata katseprotseduurist tingitud jääkide kogust.
 
Polümeeride lahustumis- või ekstraheerumiskäitumist vesilahuses 
temperatuuril 37  o C ning pH 2 ja pH 9 juures võib määrata samal 
viisil, nagu kirjeldati katse tegemist temperatuuril 20  o C. Vastava pH 
väärtuse saavutamiseks võib lisada kas sobivaid puhvreid, happeid 
või aluseid, nagu vesinikkloriidhape, etaanhape, analüütilise puhtu ­
sega naatrium- või kaaliumhüdroksiid või ammoniaak.  
Sõltuvalt analüüsimeetodist peaks tegema ühe või kaks katset. Kui 
polümeeri vesilahuse otsese analüüsi jaoks on olemas piisavalt spet ­
siifilised meetodid, siis piisab ühest eelnevalt kirjeldatud katsest. Kui sellised meetodid ei ole kättesaadavad ja polümeeri lahustumis- või ekstraheerumiskäitumise määramine piirdub vaid kaudse analüüsiga, 
kus määratakse veefaasi kogu orgaanilise süsiniku sisaldus (TOC), 
peab tegema lisakatse. Lisakatse hõlmab samuti kolme paralleel ­
katset, milles kasutatakse kümme korda väiksemat polümeerikogust ja sama veekogust, mida kasutati esimeses katses.
 
1.5.4.  Analüüs  
1.5.4.1.  Ühe proovi suurusega tehtud katse  
Polümeeri komponentide otseseks analüüsiks veefaasis võib olla 
sobivaid meetodeid. Alternatiivina saab kasutada lahustunud või ekstraheerunud polümeeri komponentide kaudset analüüsi, millega 
määratakse lahustuvate komponentide üldine sisaldus ning tehakse 
parandusi polümeerile mittespetsiifiliste komponentide osas.
 
Kõikide polümeeri komponentide analüüs veefaasis on võimalik kas 
piisavalt tundliku meetodiga, näiteks  
kogu orgaanilise süsiniku määramine (TOC), kasutades persulfaadi 
või dikromaadiga lagundamist, tekkiva süsinikdioksiidi koguse 
määramiseks kasutatakse infrapunaspektroskoopiat või keemilisi analüüsimeetodeid;
 
— aatomabsorptsioonspektromeetria (AAS) või induktiivsidestunud 
plasma (ICP) emissioonspektromeetria, kui polümeer sisaldab 
räni või metalle;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— UV-absorptsioon või spektrofluoromeetria arüülpolümeeride 
jaoks;  
— vedelikkromatograafia – mass-spektromeetria (LC-MS) madala 
molekulmassiga proovide jaoks,  
— või aurutades vee ekstrakti kuivjäägini ja analüüsides saadud 
jääki spektroskoopiliselt (IR, UV jms) või AAS/ICP abil.  
Kui veefaasi analüüs ei ole teostatav, siis peaks vesiekstrakti ekstra ­
heerima vees segunematu orgaanilise lahustiga, näiteks klorosüsive ­
sinikega. Lahusti aurutatakse ja saadud jäägis analüüsitakse ülalni ­
metatud polümeeri sisaldust. Selles jäägis sisalduvad ebapuhtusena või lisanditena identifitseeritud komponendid lahutatakse tulemusest, et määrata polümeeri lahustumis- või ekstraheerumisastet.
 
Kui proov sisaldab suhteliselt palju sellist materjali, siis võib jääki 
analüüsida vedelikkromatograafia (HPLC) või gaaskromatograafia (GC) abil, et eraldada ebapuhtused monomeeridest ja monomeeridest pärinevatest komponentidest nii, et saab määrata monomeeride tege ­
liku koguse.
 
Osadel juhtudel on piisav orgaanilise lahusti aurutamine kuivjäägini 
ja saadud jäägi kaalumine.  
1.5.4.2.  Kahe erineva proovi suurusega tehtud katse  
Kõikides vesiekstraktides analüüsitakse kogu orgaanilist süsinikku 
(TOC).  
Proovi lahustumatut või ekstraheerumatut osa analüüsitakse gravi ­
meetriliselt. Kui pärast iga nõu sisu tsentrifuugimist või filtrimist on nõu seintel polümeeri jääke, siis peab nõud loputama filtraadiga, 
kuni selle seintel ei ole jääke näha. Seejärel filtritakse või tsentrifuu ­
gitakse filtraati uuesti. Filtril või tsentrifuugiklaasis olevat jääki kuivatatakse temperatuuril 40
 o C vaakumis ning kaalutakse. Kuiva ­
tamist jätkatakse kuni konstantse kaalu saavutamiseni.  
2. ANDMED  
2.1. ÜHE PROOVI SUURUSEGA TEHTUD KATSE  
Kõigi kolme kolvikatse tulemused ja keskmised väärtused peab 
esitama ja tulemused tuleb väljendada massiühikutes lahuse ruumala kohta (tüüpiliselt mg/l) või massiühikutes polümeeri proovi massi 
kohta (tüüpiliselt mg/g). Lisaks tuleb esitada proovi massikadu (arvu ­
tatakse soluudi massi jagamisel esialgse proovi massiga). Katsete puhul tuleks arvutada ka suhteline standardhälve (RSD). Kogu proovi (polümeer + olulised lisandid jms) ja ainult polümeeri (pärast 
selliste lisandite mõju lahutamist) kohta peab esitama eraldi tule ­
mused.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. KAHE ERINEVA PROOVI SUURUSEGA TEHTUD KATSE  
Kahest kolme paralleelkatsega eksperimendist saadud TOC väärtused 
ja iga eksperimendi keskmine tuleb esitada massiühikuna lahuse ruumala kohta (tavaliselt mgC/l) ja massiühikuna proovi massi 
kohta (tavaliselt mgC/g).
 
Kõrge ja madala proovi/vee suhtega katsetulemuste vahelise 
erinevuse puudumine viitab sellele, et kõik ekstraheeruvad komponendid on ekstraheerunud. Sellistel juhtudel ei ole tavali ­
selt otsene analüüs vajalik.
 
Jääkide massid peab esitama ja tulemused tuleb väljendada protsen ­
dina proovi esialgsest massist. Iga katse jaoks peab arvutama kesk ­
mise. Erinevused 100 % ja leitud protsendi vahel esitavad lahustuva ja ekstraheeruva materjali protsendilist sisaldust esialgses proovis.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. ARUANNE  
Katsetulemused peavad sisaldama järgmist teavet.  
3.1.1.  Katsetatav aine  
— Olemasolev teave analüüsitava ühendi kohta (identifitseerimis ­
kood, lisandid, ebapuhtused, madala molekulmassiga komponen ­
tide sisaldus).  
3.1.2.  Katse tingimused  
— Kasutatud protseduuride kirjeldus ja katse tingimused.  
— Analüütiliste ja määramismeetodite kirjeldus.  
3.1.3.  Tulemused  
— Lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/l); erinevates lahustes 
tehtud ekstraktsioonikatsete üksikud ja keskmised väärtused, 
lagunenud polümeeri sisaldus, ebapuhtused, lisandid jms.  
— Polümeeri lahustuvuse/ekstraktiivsuse tulemused (mg/g).  
— Kui mõõdeti, siis vee ekstraktide TOC tulemused, soluudi mass 
ja arvutatud protsendid.  
— Iga proovi pH väärtus.  
— Pimekatsete tulemused.  
— Kus vajalik, peab viitama katsetatava ühendi keemilisele ebasta ­
biilsusele nii katse kui ka analüütilise protsessi käigus.  
— Kogu teave, mis on oluline tulemuste tõlgendamisel.  
4. VIITED  
1. DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für 
Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  OKSÜDEERIMISVÕIME (VEDELIKUD)  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et mõõta vedeliku 
võimet suurendada põleva materjali põlemiskiirust või põlemisinten ­
siivsust või moodustada segu tuleohtliku ainega, mis süttib iseenes ­
likult juhul, kui need kaks ainet segatakse omavahel põhjalikult. See põhineb oksüdeerivate vedelike (1) ÜRO katsel ja on sellega sama ­
väärne. Kuna käesolev meetod A.21 on algselt ette nähtud vastama 
määruse (EÜ) nr 1907/2006 nõuetele, on vaja teha võrdlus üksnes ühe võrdlusainega. Katsete tegemine ja võrdlemine täiendava võrd ­
lusainega võib olla vajalik juhul, kui eeldatakse, et katse tulemusi 
kasutatakse muudel eesmärkidel (
 1 ). 
Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui struktuurivalemi uuri ­
mine teeb kahtlusteta kindlaks, et aine ei reageeri tuleohtliku mater ­
jaliga eksotermiliselt.  
On kasulik teada enne katsetamist, kas aine võib plahvatada.  
Käesolev katse ei ole kasutatav tahkete ainete, gaaside, plahvatusoht ­
like või kergestisüttivate ainete ega orgaaniliste peroksiidide puhul.  
Käesolevat katset ei ole vaja teha juhul, kui oksüdeerivaid vedelikke 
(1) käsitlevas ÜRO katses on tulemused uuritava katseaine kohta 
juba olemas.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Keskmine rõhutõusuaeg on katse käigus manomeeterrõhu suurene ­
miseks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le kulunud aegade keskmine.  
1.3. VÕRDLUSAINE  
Võrdlusainena kasutatakse 65 %list (massiprotsent) lämmastikhappe 
vesilahust (analüütiliselt puhas) (  2 ). ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Näiteks ÜRO transpordieeskirjade raames. 
( 2 ) Hapet tuleks kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks enne katse tegemist tiitrida.
 Kui katse tegija näeb ette, et katse tulemusi võib lõpuks kasutada 
muudel eesmärkidel, (  1 ) võib soovi korral samuti osutuda vajalikuks 
katse tegemine täiendavate võrdlusainetega (  2 ). 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritav vedelik segatakse kiudtselluloosiga massisuhtes 1:1 ja 
pannakse surveanumasse. Kui segamisel või anuma täitmisel ilmneb 
isesüttimine, ei ole vaja katsete tegemist jätkata.  
Kui isesüttimist ei toimu, tehakse kogu katse. Segu kuumutatakse 
surveanumas ja määratakse kindlaks keskmine aeg, mis kulub mano ­
meeterrõhu suurenemiseks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le. Seda võrreldakse 
sellise keskmise ajaga, mis kulub võrdlusaine(te) ja tselluloosi 1:1 
segu korral rõhu suurenemiseks.  
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Ühe ainega tehtud viiest katsest koosnevas seerias ei tohi ükski 
tulemus erineda aritmeetilisest keskmisest rohkem kui 30 %. Tule ­
mused, mis erinevad keskmisest rohkem kui 30 %, jäetakse kõrvale, 
täiustatakse segamis- ja täitmismenetlust ning korratakse katset.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistus  
1.6.1.1.  Põlev aine  
Põleva ainena kasutatakse kuivatatud kiudtselluloosi, mille kiu 
pikkus on 50–250 μm ja keskmine läbimõõt on 25 μm (  3 ). Seda 
kuivatakse konstantse kaaluni kuni 25 mm paksuses kihis 105  o C 
juures neli tundi ja hoitakse eksikaatoris koos desikandiga kuni 
jahtumise ja kasutamiseni. Kuivatatud tselluloosi niiskusesisaldus 
peaks olema alla 0,5 % kuivmassist (  4 ). Vajaduse korral peaks 
selle tagamiseks kuivatamisaega pikendama (  5 ). Tselluloosi sama 
partiid kasutatakse kogu uuringu vältel.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Näiteks ÜRO transpordieeskirjade raames. 
( 2 ) Nt 50 % (massiprotsent) perkloorhapet ja 40 % (massiprotsent) naatriumkloraati kasuta ­
takse viites 1. 
( 3 ) Nt Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalooginumber 4021 
050. 
( 4 ) Kinnitatakse nt tiitrimisega Karl-Fisheri järgi. 
( 5 ) Nimetatud niiskusesisaldust on võimalik saavutada ka nt kuumutamisel 105  o C juures 
vaakumis 24 tunni jooksul.
 1.6.1.2.  Seadmed  
1.6.1.2.1. S u r v e a n u m  
Vaja läheb surveanumat. Anumaks on silindriline terasest anum, mille 
pikkus on 89 mm ja välisläbimõõt on 60 mm (vt joonist 1). Vastas ­
külgedel paikneb kaks tasapinnalist süvendit (millega on anuma sise ­
mist vaba ruumi vähendatud 50 mm-ni) süüteküünla ja väljalaskeava 
korgi paigaldamise hõlbustamiseks. Anumas oleva 20 mm siseläbi ­
mõõduga kanali mõlemas otsas on 19 mm astmetaoline laiend, mis on keermestatud vastavalt Briti standardsele 1" torukeermele  (British 
Standard Pipe –  BSP) või samaväärsele meeterkeermele. Surveanuma 
kumerasse külgpinda on ühest otsast 35 mm kaugusele kruvitud külg ­
haru, mis paikneb tasapinnaliste süvenditega 90
 o nurga all ning mis on 
ette nähtud ühendamiseks rõhuanduriga. Külgharu pesa moodustab 12 mm sügavune puuritud ava, mis on keermestatud vastavalt külg ­
haru otsas oleva 1/2" BSP keermega (või samaväärse meeterkeer ­
mega). Vajaduse korral paigaldatakse inertne tihend, mis tagab hermeetilise ühenduskoha. Külgharu ulatub 55 mm surveanuma korpusest väljapoole ja sellesse on puuritud kanal siseläbimõõduga 
6 mm. Külgharu otsas on astmetaoline keermestatud süvend, mis on 
ette nähtud ühendamiseks membraani tüüpi rõhuanduriga. Kasutada võib mis tahes rõhumõõturit, tingimusel et seda ei mõjuta kuumad gaasid või lagunemissaadused ning et see on võimeline reageerima 
rõhutõusudele 690 – 2 070 kPa vähem kui 5 ms jooksul.
 
Surveanuma külgharust kaugemal asuv ots on suletud süüteküünlaga, 
milles on kaks elektroodi –üks on isoleeritud küünla korpusest ja 
teine on sellega ühendatud (maandatud). Surveanuma teine ots on suletud puruneva membraaniga (purunemissurve ligikaudu 2 200 kPa), mida hoiab paigal 20 mm läbimõõduga puuritud avaga kork. 
Vajaduse korral kasutatakse ühenduskoha hermeetilisuse tagamiseks 
inertset tihendit. Tugiraam (joonis 2) hoiab komplekti kasutamise ajal õiges asendis. Tugiraam koosneb tavaliselt pehmest rauast alusplaa ­
dist, mille mõõtmed on 235 mm × 184 mm × 6 mm, ja 185 mm 
pikkusest õõnsusega ruudukujulisest sektsioonist (S.H.S.) mõõtme ­
tega 70 mm × 70 mm × 4 mm.
 
Õõnsusega ruudukujulise sektsiooni ühe otsa kaks vastaskülge on 
maha lõigatud selliselt, et moodustub kahest tasapinnalise küljega jalast struktuur, mille otsas paikneb 86 mm pikkune terviklik karbi ­
kujuline osa. Nende tasapinnaliste külgedega jalgade otsad on 
lõigatud horisontaalsuuna suhtes 60
 o all ning on keevitatud alus ­
plaadi külge. Põhisektsiooni ülaosa ühes küljes paikneb pilu laiusega 22 mm ja sügavusega 46 mm nii, et kui rõhuanuma komplekt lastakse allapoole, süüteküünlaga ots ees, siis satub külgharu pilusse. 
Karbikujulise osa alumise sisepinna külge keevitatakse terasest 
30 mm laiune ja 6 mm paksune detail, mis toimib eraldajana. Kaks vastasküljel olevat 7 mm pitskruvi hoiavad surveanumat kind ­
lalt paigal. Kaks 12 mm laiust ja 6 mm paksust terasriba, mis on 
keevitatud karbikujulise sektsiooni põhjale toetuvate külgmiste 
elementide külge, toetavad surveanumat altpoolt.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. S ü ü t e s ü s t e e m  
Süütesüsteem koosneb 25 cm pikkusest Ni/Cr traadist, mille läbimõõt on 
0,6 mm ja takistus on 3,85 oom/m. Traat on keritud spiraalina 5 mm 
läbimõõduga varda abil ja kinnitatud süüteküünla elektroodide külge. Spiraali kuju peaks vastama joonisel 3 toodule. Anuma põhja ja süütes ­
piraali alakülje vaheline kaugus peaks olema 20 mm. Kui elektroode ei 
saa reguleerida, tuleks süütespiraali ja anuma põhja vahel olevad traadi 
otsad isoleerida keraamilise kestaga. Traati kuumutatakse püsivoolutoi ­
teallikaga, mis suudab tagada vähemalt 10 A voolutugevuse.
 
1.6.2.  Katse tegemine  ( 1 ) 
Seade, mis on komplekteeritud rõhuanduri ja kuumutussüsteemiga, 
kuid kuhu ei ole paigaldatud purunevat membraani, toetub altpoolt süüteküünlale. 2,5 g uuritavat vedelikku segatakse keeduklaasis 2,5 g kuivatatud tselluloosiga, kasutades klaasist segamispulka (
 2 ). Ohutuse 
tagamiseks on tegija ja segu vahel segamise ajal kaitseekraan. Kui 
segu süttib segamise või anuma täitmise ajal, ei ole vaja katsetamist jätkata. Segu lisatakse tilkhaaval väikeste portsjonitena surveanu ­
masse, tagades segu paiknemise ümber süütespiraali ja sellega hea 
kontakti. On oluline, et spiraal ei deformeeru anuma täitmise ajal, 
kuna see võib põhjustada väärasid tulemusi (
 3 ). Purunev membraan 
asetatakse kohale ja lukustav kork keeratakse kõvasti kinni. Täidetud anum asetatakse tugiraamile nii, et purunev membraan jääb üles ­
poole. Tugiraam asetatakse sobivasse armeeritud tõmbekappi või 
põlemiskambrisse. Toiteallikas ühendatakse süüteküünla välimiste klemmidega ja lülitatakse sisse 10 A vool. Aeg segamise alustami ­
sest kuni voolu sisselülitamiseni ei tohiks ületada kümmet minutit.
 
Rõhuanduri signaal registreeritakse sobiva süsteemi abil, mis 
võimaldab nii signaali hindamist kui ka rõhu ajalise sõltuvuse 
pidevat registreerimist (nt graafilise isekirjutiga ühendatud siirdeprot ­
sesside registraator). Segu kuumutatakse kuni puruneva membraani rebestumiseni või vähemalt 60 s. Kui purunev membraan ei rebestu, tuleks lasta segul jahtuda enne seadme hoolikat lahtimonteerimist, 
vältides seejuures võimalikku hermeetilisuse kadumist. Uuritava 
aine ja võrdlusaine(te)ga tehakse viis katset. Fikseeritakse aeg, mis kulub manomeeterrõhu tõusuks 690 kPa-lt 2 070 kPa-le. Arvutatakse 
keskmine rõhutõusuaeg.
 
Mõnedel juhtudel võivad ained tekitada rõhutõusu (liiga suurt või 
liiga väikest), mille põhjuseks on keemilised reaktsioonid, mis ei ole 
seotud aine oksüdeerimisvõimega. Neil juhtudel võib osutuda vaja ­
likuks katse kordamine tselluloosi asemel inertse ainega, nt diatomii ­
diga (kobediatomiit), et selgitada reaktsiooni olemust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Oksüdeerijate ja tselluloosi segusid tuleb käsitada plahvatusohtlikena ja käsitleda ette ­
vaatlikult. 
( 2 ) Praktikas saab seda teha, valmistades 1:1 segu uuritavast vedelikust ja tselluloosist 
suuremas koguses, kui katseks vaja, ning pannes 5 ± 0,1 g surveanumasse. Igaks katseks 
tuleb segu värskelt valmistada. 
( 3 ) Eelkõige tuleb vältida spiraali naaberkeerdude vahelist kontakti.
 2. ANDMED  
Rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrdlusaine(te) puhul. Rõhu ­
tõusuajad inertse ainega katsete puhul (kui need on tehtud).  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Arvutatakse keskmised rõhutõusuajad nii uuritava aine kui ka võrd ­
lusaine(te) kohta.  
Arvutatakse keskmine rõhutõusuaeg inertse ainega katsete puhul (kui 
need on tehtud).  
Mõned näited tulemuste kohta on toodud tabelis 1.  
Tabel 1  
Näiteid tulemustest  ( a ) 
Aine (  b ) Keskmine rõhutõusu aeg (ms) 1:1 tselluloosisegu puhul  
Ammooniumdikromaat, küllastunud vesilahus 20 800 
Kaltsiumnitraat, küllastunud vesilahus 6 700 
Raud(III)nitraat, küllastunud vesilahus 4 133 
Liitiumperkloraat, küllastunud vesilahus 1 686 Magneesiumperkloraat, küllastunud vesilahus 777 Nikkelnitraat, küllastunud vesilahus 6 250 
Lämmastikhape, 65 % 4 767 (
 c ) 
Perkloorhape, 50 % 121 (  c ) 
Perkloorhape, 55 % 59 
Kaaliumnitraat, 30 % vesilahus 26 690 
Hõbenitraat, küllastunud vesilahus — (  d ) 
Naatriumkloraat, 40 % vesilahus 2 555 (  c ) 
Naatriumkloraat, 45 % vesilahus 4 133 
Inertne aine Vesi: tselluloos — (
 d ) 
( a ) Vt viidet 1 ÜRO transpordieeskirjade kohase klassifitseerimise kohta. 
( b ) Küllastunud lahused tuleks valmistada 20  o C juures. 
( c ) Laboritevaheliste võrdluskatsete keskmine väärtus. 
( d ) Suurimat rõhku 2 070 kPa ei ole saavutatud.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. ARUANDLUS  
3.1. ARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet:  
— uuritud aine nimetus, koostis, puhtus jne;  
— uuritava aine kontsentratsioon;  
— tselluloosi kuivatusmenetlus;  
— tselluloosi niiskusesisaldus;  
— mõõtetulemused;  
— inertse ainega tehtud katsete tulemused, kui need on olemas;  
— arvutatud keskmised rõhutõusuajad;  
— võimalikud kõrvalekalded nimetatud meetodist ja nende 
põhjused;  
— kogu täiendav teave või märkused, mis on vajalikud tulemuste 
tõlgendamiseks.  
3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE (  1 ) 
Katsetulemusi hinnatakse  
a) selle põhjal, kas uuritava aine ja tselluloosi segu süttib ise, ja  
b) rõhutõusule (690 kPa-lt 2 070 kPa-le) kulunud keskmise aja võrd ­
lemisel võrdlusaine(te) korral selleks kulunud ajaga.  
Vedelikku käsitatakse oksüdeerijana juhul, kui  
a) uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) süttib iseenesli ­
kult või  
b) uuritava aine ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral on kesk ­
mine rõhutõusuaeg väiksem 65 massiprotsendilise lämmastik ­
happe (vesilahus) ja tselluloosi 1:1 segu (massi järgi) korral 
saadud keskmisest rõhutõusuajast või on sellega võrdne.  
Valepositiivse tulemuse vältimiseks tuleks tulemuste tõlgendamisel 
arvesse võtta ka tulemusi, mis on saadud aine katsetamisel koos inertse materjaliga.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Vt viide 1, tulemuste tõlgendamine ÜRO transpordieeskirjade kohaselt mitmeid võrdlu ­
saineid kasutades.
 4. VIITED  
1. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3. täiendatud väljaanne. ÜRO väljaanne nr: ST/SG/AC.10/ll/Rev. 3, 1999, lk 342. Test O.2: 
Test for oxidizing liquids.
 
Joonis 1  
Surveanum
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Joonis 2  
Tugiraam
  
Joonis 3  
Süütesüsteem
  
Märkus: toodud kujutistest võib kasutada emba-kumba.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  KIUDUDE PIKKUSE JÄRGI KAALUTUD GEOMEETRILINE 
KESKMINE DIAMEETER  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
See meetod kirjeldab protseduuri lahtiste keemiliste mineraalkiu ­
dude (MMMF,  Man Made Mineral Fibres ) pikkuse järgi kaalutud 
geomeetrilise keskmise diameetri (LWGMD,  Length Weighted 
Geometric Mean Diameter ) mõõtmiseks. Kuna kogumi LWGMD 
on 95 % tõenäosusega proovi 95 % usalduspiiride vahel (LWGMD 
± kaks standardviga), asub esitatud väärtus (testväärtus) proovi 
madalamal 95 % usalduspiiril (st LWGMD – kaks standardviga). Meetod põhineb 1994. aasta juunis uuendatud HSE tööstusprotse ­
duuri kavandil, mis kooskõlastati ECFIA ja HSE kohtumisel Ches ­
teris 26. septembril 1993 ja mida arendati edasi teise laboriteva ­
helise katse jaoks ja selle põhjal (1, 2). Seda mõõtmismeetodit saab kasutada selliste lahtiste ainete või toodete kiudiameetri iseloomustamiseks, mis sisaldavad MMMFisid, kaasa arvatud tule ­
kindlad keraamilised kiud (RCF,  refractory ceramic fibres ), keemi­
lised klaaskiud (MMVF,  man-made vitreous fibres ), kristallilised ja 
polükristallilised kiud.
 
Pikkuse järgi kaalumine on viis kompenseerida diameetri jaotumist, 
mida põhjustab pikkade kiudude murdumine materjalist proovi võtmisel või materjali käsitsemisel. Geomeetrilist statistikat (geomee ­
trilist keskmist) kasutatakse MMMFide diameetri suuruse järgi jaotu ­
mise mõõtmiseks, kuna nende diameetrite jaotus suuruse järgi on tavaliselt lähedane logaritmilisele normaaljaotusele.
 
Nii pikkuse kui diameetri mõõtmine on tüütu ja aeganõudev, aga kui 
mõõdetakse vaid neid kiudusid, mis puudutavad lõpmatult peenikest 
riba skaneeriva elektronmikroskoobi (SEM) vaateväljas, siis on antud 
kiu valimise tõenäosus võrdeline selle pikkusega. Kuna sellega võetakse arvesse pikkust pikkuse järgi kaalumise arvutustes, on ainus nõutav mõõtmine diameetri mõõtmine ja „LWGMD – kaks 
standardviga” võib arvutada kirjeldatud viisil.
 
1.2. MÕISTED  
Partikkel  – objekt, mille pikkuse-laiuse suhe on vähem kui 3:1.  
Kiud  – objekt, mille pikkuse-laiuse suhe (formaadisuhe) on 
vähemalt 3:1.  
1.3. RAKENDUSALA JA PIIRANGUD  
Meetod on mõeldud vaatlemaks diameetri jaotumisi, keskmise 
diameetriga alates 0,5 μm kuni 6 μm. Suuremaid diameetreid võib 
mõõta, kasutades väiksemaid SEMi suurendusi, kuid meetodi täpsus väheneb peenemate kiudude jaotuste puhul ja kui keskmine 
diameeter on alla 0,5 μm, soovitatakse mõõtmist TEMiga (transmis ­
siooni elektronmikroskoop).
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. Katsemeetodi põhimõte  
Kiu kihist või lahtisest kiumassist võetakse mitu representatiivset 
südamikuproovi. Lahtiste kiudude pikkust vähendatakse purustava protseduuri abil ja representatiivne osaproov hajutatakse vees. Eral ­
datakse alikvoodid ja filtreeritakse need läbi 0,2 μm poorisuurusega 
polükarbonaadifiltri ja valmistatakse ette uurimiseks SEMi tehnikate abil. Kiu diameeter mõõdetakse 10 000-kordse või suurema ekraanisuurendusega, (
 1 ) kasutades erapooletu keskmise diameetri 
hinnangu andmiseks liini katkestamise meetodit. Arvutatakse 
madalam 95 % usaldusvahemik (mis põhineb ühepoolsel testil), et anda hinnang materjali kiudiameetri geomeetrilise keskmise väik ­
seima väärtuse kohta.
 
1.5. Katsemeetodi kirjeldus  
1.5.1.  Turvalisus/ettevaatusabinõud  
Isiklikku kokkupuudet õhus sisalduvate kiududega tuleks minimee ­
rida ja kuivkiudude käsitsemisel tuleks kasutada tõmbekappi või 
laminaarboksi. Kontrollmeetodite tõhususe kindlaksmääramiseks tuleks läbi viia korrapärast isikliku kokkupuute seiret. MMMFide käsitsemisel tuleb nahaärrituse vähendamiseks ja ristsaastumise 
ärahoidmiseks kanda ühekordselt kasutatavaid kindaid.
 
1.5.2.  Seadmed/vahendid  
— Press ja pressvormid (võimelised tekitama 10 MPa).  
— 0,2 μm poorisuurusega polükarbonaat-kapillaarfiltrid (25 mm 
diameetriga).  
— 5 μm poorisuurusega tselluloos-ester membraanifilter tugifiltrina 
kasutamiseks.  
— Klaasist filtreermisseadmed (või ühekordselt kasutatavad filtree ­
rimissüsteemid) 25 mm diameetriga filtritele (nt Millipore’i klaa ­
sist mikroanalüüsikomplekt, tüüp nr XX10 025 00).  
— Värskelt destilleeritud vesi, mis on mikroorganismide eemalda ­
miseks lastud läbi 0,2 μm poorisuurusega filtri.  
— Pihusti kuld- või kuld/pallaadiumotsaga.  
— Skaneeriv elektronmikroskoop lahutamisvõimega kuni 10 nm ja 
10 000-kordse suurendusega.  
— Muu: spaatlid, tüüp 24, skalpellitera, pintsetid, SEMi torud, süsi ­
nikliim või süsinikteip, kolloidhõbe.  
— Ultrahelisond või lauale asetatav ultrahelivann.  
— Südamiku proovivõtuvahend või korgipuur südamikuproovide 
võtmiseks MMMFide kihist.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) See suurendusväärtus kehtib 3 μm kiu puhul, 6 μm kiu puhul võib 5 000-kordne 
suurendus olla sobivam.
 1.5.3.  Katsemenetlus  
1.5.3.1.  Proovivõtmine  
Mineraalvilla ja villaku puhul kasutatakse ristlõikest proovide 
võtmisel 25 mm südamikuproovide võtmise vahendit või korgipuuri. 
Proovid peaksid olema võrdselt jaotatud kihi laiuse ulatuses või 
võetud suvalistest kohtadest, kui käepärast on pikki kihte. Samade vahendite abil on võimalik eraldada juhuslikke proove lahtisest kiust. Võimaluse korral tuleks ruumiliste variatsioonide peegeldamiseks 
lahtises materjalis võtta kuus proovi.
 
Kuus südamikuproovi purustatakse 50 mm läbimõõduga vormis 
10 MPa juures. Materjal segatakse spaatliga ja pressitakse uuesti 
10 MPa juures. Seejärel võetakse materjal vormist välja ja säilita ­
takse seda suletud klaaspudelis.  
1.5.3.2.  Proovi ettevalmistamine  
Orgaanilist sideainet saab vajaduse korral eemaldada, asetades kiu 
umbes tunniks 450 °C sulatusahju.  
Proovi jaotamiseks vormitakse see koonuseks ja lõigatakse see 
neljaks (seda tuleks teha tolmukapis).  
Spaatli abil lisatakse väike hulk (< 0,5 g) proovist 100 ml värskelt 
destilleeritud veele, mis on lastud läbi 0,2 μm membraaniga filtri 
(alternatiivina võib kasutada ultrapuhast vett muudest allikatest, kui need vastavad nõuetele). Proov hajutatakse põhjalikult ultrahelisondi 
abil 100 W võimsuse juures ja seda pööratakse nii, et tekiks 
kavitatsioon. (Kui sondi pole käepärast, kasutada järgmist meetodit: proovi raputatakse ja pööratakse korduvalt ümber 30 sekundi jooksul; hoitakse viis minutit lauale asetatavas ultrahelivannis; 
seejärel raputatakse ja pööratakse korduvalt veel 30 sekundi jooksul).
 
Kohe pärast kiu hajutamist eemaldatakse teatud arv alikvoote (näit 
kolm 3, 6 ja 10 ml alikvooti), kasutades laiasuulist pipetti (2–5 ml 
mahutavusega).  
Iga alikvoot vaakumfiltreeritakse läbi 0,2 μm polükarbonaatfiltri, 
mida toetab 5 μm poorisuurusega MEC-tugifilter, kasutades 
25 mm klaasist filterlehtrit silindrilise mahutiga. Umbkaudu 5 ml filtreeritud destilleeritud veest tuleks asetada lehtrisse ja alikvoot 
aeglaselt vette pipettida, hoides pipetiotsa allpool meniskit. Peale 
pipettimist tuleb pipett ja veemahuti põhjalikult läbi loputada, kuna peenikesed kiud kipuvad jääma pinnale.
 
Filter eemaldatakse hoolikalt ja eraldatakse see tugifiltrist enne 
mahutisse kuivama asetamist.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Filtreeritud osast lõigatakse veerand või pool tüüp 24 skalpelliga 
edasi-tagasi liigutuste abil. Lõigatud osa kinnitatakse ettevaatlikult 
SEMi esemelaua külge süsinikteibi või süsinikliimi abil. Kolloid ­
hõbedat tuleks lisada vähemalt kolme kohta, et parandada elek ­
trilist kontakti filtri ja esemelaua äärtel. Kui liim/kolloidhõbe on 
kuiv, pihustada proovi pinnale umbes 50 nm kulla või kulla/ ­
pallaadiumi kiht.  
1.5.3.3.  SEMi kalibreerimine ja kasutamine  
1.5.3.3.1. K a l i b r e e r i m i n e  
SEMi kalibreerimist tuleks kontrollida vähemalt kord nädalas (ideaal ­
juhul kord päevas), kasutades sertifitseeritud kalibreerimisvõret. Kali ­
breerimist tuleks kontrollida sertifitseeritud standardi alusel ja kui 
mõõdetud väärtus (SEM) ei jää ± 2 % sisse sertifitseeritud väärtusest, 
siis tuleb SEM-kalibreerimist kohandada ja uuesti kontrollida.  
SEM peaks olema võimeline lahendama vähemalt minimaalselt 
nähtava diameetri 0,2 μm, kasutades tegelikku proovimaatriksit, 
2 000-kordse suurendusega.  
1.5.3.3.2. K a s u t a m i n e  
SEM peaks töötama 10 000-kordse suurenduse (  1 ) juures tingimustel, 
mis annavad hea lahutusvõime lubatava kujutise aeglasel skaneeri ­
miskiirusel, näiteks 5 sekundit kaadri kohta. Kuigi erinevate SEMide 
kasutamisnõuded võivad varieeruda, tuleks suhteliselt väikese aatom ­
massiga materjalide korral üldiselt parima nähtavuse ja resolutsiooni saavutamiseks kasutada kiirendavat pinget 5–10 keV, väikest laotus ­
punkti seadistust ja lühikest töökaugust. Lineaarse skaneerimise 
puhul tuleb kasutada 0
 o kallet, et minimeerida refokuseerimine, või 
kui SEMil on võimalik kohaldada kõrgust, tuleks kasutada kohal ­
datud kõrgusega töökaugust. Võib kasutada väiksemat suurendust, kui materjal ei sisalda väikseid (väikese diameetriga) kiude ja 
kiudude diameeter on suur (> 5 μm).
 
1.5.3.4.  Suuruse järgi sorteerimine  
1.5.3.4.1. V ä i k e s e s u u r e n d u s e g a u u r i m i n e p r o o v i h i n d a m i ­
s e k s  
Algselt tuleks proovi uurida väikese suurendusega, et otsida tõendust 
suurte kiudude pundarde kohta ning hinnata kiutihedust. Juhul kui moodustub liiga palju puntraid, on soovitatav ette valmistada uus 
proov.
 
Statistilise täpsuse jaoks on vaja mõõta miinimumarv kiude ja suur 
kiutihedus võib tunduda soovitav, kuna tühjade väljade uurimine on 
aeganõudev ega oma analüüsi jaoks väärtust. Kui aga filter on üle koormatud, muutub kõigi mõõdetavate kiudude mõõtmine siiski raskeks, ja kuna väikesed kiud võivad jääda suuremate varju, võivad 
need jääda kahe silma vahele.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) 3 μm kiudude korral vt eelmist märkust.
 Kalduvus LWGMD ülehindamisele võib tuleneda kiutihedustest 
enam kui 150 kiudu millimeetri kohta lineaarse sammu puhul. 
Teisest küljest pikendab väike kiukontsentratsioon analüüsi aega ja sageli on mõistlikum valmistada ette proov, mille kiutihendus on lähedasem optimaalsele, kui jätkata madala kontsentratsiooniga 
filtrite loendamist. Optimaalne kiutihedus peaks andma keskmiselt 
üks või kaks loendatavat kiudu vaatevälja kohta 5 000-kordse suurendusega. Siiski sõltub optimaalne tihedus kiudude suurusest (diameetrist), nii et on vajalik, et operaator kasutaks teatavat 
eksperdihinnangut otsustamaks, kas kiu tihedus on optimaalse 
lähedane või mitte.
 
1.5.3.4.2. K i u d i a m e e t r i k a a l u m i n e p i k k u s e j ä r g i  
Loendatakse vaid kiude, mis puudutavad (lõpmatult) peenikest SEMi 
ekraanile tõmmatud joont (või lõikuvad sellega). Selleks on ekraani 
keskele tõmmatud horisontaalne (või vertikaalne) joon.  
Alternatiivina võib ekraani keskele asetada üksiku punkti ja alustada 
pidevat skaneeringut ühes suunas üle filtri. Mõõdetakse ja salvesta ­
takse iga sellise kiu diameeter, mille formaadisuhe on suurem kui 3:1 
ja mis puudutab või ületab seda punkti.  
1.5.3.4.3. K i u d u d e s o r t e e r i m i n e s u u r u s e j ä r g i  
Soovitav on mõõta minimaalselt 300 kiudu. Iga kiudu mõõdetakse 
ainult korra ja selles punktis, kus ta lõikub kujutisele paigutatud 
joone või punktiga (või lõikumiskoha lähedal, kui kiu servad on 
hägused). Kui leidub ebaühtlase põiklõikega kiude, tuleks kasutada mõõtmist, mis vastab kiu keskmisele diameetrile. Hoolikas tuleb olla kiuservade määratlemisel ja nendevahelise lühima kauguse mõõt ­
misel. Sorteerimist võib läbi viia  on-line  või  off-line  salvestatud 
kujutistel või fotodel. Soovitatav on kasutada poolautomatiseeritud kujutise mõõtmise süsteeme, mis laadivad andmed otse arvutustabe ­
lisse, kuna need säästavad aega ja välistavad ümberkirjutusvead ning 
arvutusi on võimalik automatiseerida.
 
Pikkade kiudude otsi tuleks kontrollida väikese suurendusega, et 
välistada nende tagasikeerdumine mõõtmise vaatevälja ja tagada, et neid mõõdetakse ainult üks kord.
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Kiudiameetritel ei esine tavaliselt normaaljaotust. Siiski on logaritm ­
teisenduse abil võimalik saavutada normaaljaotusele lähenev jaotus.  
Arvutatakse n kiudiameetri (D) naturaallogaritmide (lnD) aritmeeti ­
line keskmine (keskmine lnD) ja standardhälve (SD  lnD ). 
keskmine lnD ¼ ΣlnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
Σ ðlnD – keskmine lnD Þ 2 
n – 1 s 
(2) 
Standardhälve jagatakse mõõtmiste arvu (n) ruutjuurega, et saada 
standardviga (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Keskmisest lahutatakse kahekordne standardviga ja arvutatakse selle 
väärtuse eksponent (keskmine miinus kaks standardviga), et saada 
geomeetriline keskmine miinus kaks geomeetrilist standardviga. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðkeskmine lnD – 2SElnd Þ (4) 
3. ARUANDMINE  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks sisaldama vähemalt järgmist teavet:  
— avaldise LWGMD – 2SE väärtus;  
— mis tahes hälbed ja eriti need, mis võivad avaldada mõju tule ­
muste täpsusele, koos piisavate põhjendustega.  
4. VIITED  
1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. Veebruar 
1999.  
2) G. Burdett ja G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/ ­
07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research 
and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23  JAOTUSKOEFITSIENT (SÜSTEEMIS 1-OKTANOOL-VESI): 
AEGLASE SEGAMISE MEETOD  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test Guide ­
line, TG) 123 (2006). Aeglase segamise meetodiga saab täpselt määrata 
jaotuskoefitsiente süsteemis 1-oktanool-vesi (P  OW ) kuni log P  OW väärtuseni 
8,2 (1). Sellepärast sobib see meetod väga hüdrofoobsete ainete P  OW otse­
seks katseliseks määramiseks.  
2. Muud meetodid jaotuskoefitsientide määramiseks süsteemis 1-oktanool-vesi 
(P OW ) on loksutatava kolvi meetod (2) ja P  OW määramine pööratud faasi 
kõrgefektiivse vedelikkromatograafia retentsiooniaja andmetest (3). Loksuta ­
tava kolvi meetod võib anda aga vale tulemuse, kuna veefaasi kanduvad üle 
mikroskoopilised oktanooli piisakesed. Mida suurem on P  OW väärtus, seda 
rohkem kiputakse veefaasis olevate oktanooli mikropiiskade tõttu ülehin ­
dama uuritava aine kontsentratsiooni vees. Sellepärast võib loksutatava 
kolvi meetodit kasutada ainult ainete puhul, mille log P  OW < 4. Teine 
meetod põhineb otse määratud usaldusväärsetel P  OW väärtustel, mida kasu ­
tatakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia retentsiooniaja ja mõõdetud 
P OW väärtuste vahelise seose kaliibrimiseks. Mõnda aega oli kättesaadav 
OECD katsejuhendi kavand (4) ioniseeruvate ainete jaotuskoefitsientide määramiseks süsteemis 1-oktanool-vesi, kuid seda meetodit enam ei kasu ­
tata.
 
3. Käesolev katsemeetod on välja töötatud Madalmaades. Siin kirjeldatud 
meetodite täpsust on kontrollitud ja optimeeritud laboritevaheliste võrdlus ­
katsete uuringuga, milles osales 15 laborit (5).  
LÄHTEKAALUTLUSED  
Olulisus ja kasutamine  
4. On kindlaks tehtud, et inertsete orgaaniliste ainete bioakumulatsioon kalades 
korreleerub väga tugevasti nende ainete jaotuskoefitsiendiga süsteemis 1- 
oktanool-vesi (P  OW ). Lisaks on näidatud, et P  OW korreleerub kemikaalide 
toksilise mõjuga kaladele ning seostumisega tahkete ainetega, nagu pinnas ja setted. Ulatuslik ülevaade nendest seostest on esitatud publikatsioonis 6.
 
5. On kindlaks tehtud, et aine 1-oktanool-vee-süsteemi jaotuskoefitsiendi ja 
muude omaduste vahel on palju keskkonnatoksikoloogia ja -keemia seisu ­
kohast olulisi seoseid. Sellepärast on jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool- 
vesi saanud tähtsaks parameetriks, mille abil hinnatakse kemikaalide kesk ­
konnaohtlikkust ja ennustatakse nende käitumist keskkonnas.  
Kasutusala  
6. Aeglane segamine peaks vähendama 1-oktanooli mikropiisakeste moodustu ­
mist veefaasis olevatest 1-oktanooli tilkadest. Sellega välditakse aine kont ­
sentratsiooni ülehindamist veefaasis mikropiiskades leiduvate uuritava aine molekulide tõttu. Seepärast on aeglase segamise meetod eriti sobiv P
 OW 
määramiseks ainetel, mille eeldatav log P  OW väärtus on 5 või suurem ja 
mille puhul loksutatava kolvi meetod (2) võib anda vale tulemuse.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
MÕISTED JA ÜHIKUD  
7. Aine jaotuskoefitsient vee ja lipofiilse lahusti (1-oktanool) vahel iseloo ­
mustab kemikaali tasakaalulist jaotumist kahe faasi vahel. Aine jaotuskoe ­
fitsient vee ja lipofiilse lahusti (1-oktanool) vahel (P  OW ) on suhe, mis 
saadakse veega küllastunud 1-oktanooli faasis oleva uuritava aine tasakaa ­
lulise kontsentratsiooni (C  O ) jagamisel 1-oktanooliga küllastunud veefaasis 
oleva uuritava aine tasakaalulise kontsentratsiooniga (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Kuna jaotustegur on kontsentratsioonide suhe, on see mõõtühikuta suurus. 
Enamasti väljendatakse seda kümnendlogaritmi kujul (log P  OW ). P  OW sõltub 
temperatuurist, sellepärast tuleb andmete esitamisel märkida ka mõõtmistem ­
peratuur.  
MEETODI PÕHIMÕTE  
8. Jaotuskoefitsiendi määramiseks tasakaalustatakse püsival temperatuuril 
omavahel vesi, 1-oktanool ja uuritav aine. Seejärel määratakse uuritava aine kontsentratsioon mõlemas faasis.
 
9. Siin kirjeldatavas aeglase segamise katses on võimalik vähendada eksperi ­
mentaalseid raskusi, mida loksutatava kolvi katses põhjustab mikropiiskade tekkimine. Aeglase segamise katses tasakaalustatakse vesi, 1-oktanool ja 
uuritav aine termostateeritavas ja segajaga varustatud katsenõus. Aine jaotu ­
mist faaside vahel kiirendab segamine. Segamine tekitab piiratud turbulentsi, mis kiirendab jaotumist 1-oktanooli ja vee vahel, kuid seejuures ei teki mikropiisku (1).
 
KATSE RAKENDATAVUS  
10. Kuna lisandid võivad mõjutada uuritava aine aktiivsuskoefitsienti, määra ­
takse jaotuskoefitsient ainult puhta aine jaoks. 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise uurimisel tuleb kasutada müügilolevaid kõrgeima puhtusastmega kemikaale.
 
11. Käesolev meetod on rakendatav puhta aine korral, mis ei dissotsieeru, assot ­
sieeru ega ole märkimisväärselt pindaktiivne. Meetodit võib kasutada selliste 
ainete ja nende segude 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise suhte määrami ­
seks. Kui meetodit kasutatakse segu puhul, on määratav 1-oktanooli ja vee vahel jaotumise suhe tinglik ja oleneb uuritava segu ning veefaasina kasu ­
tatava elektrolüüdi keemilisest koostisest. Täiendavate abinõude rakenda ­
misel võib seda meetodit kasutada ka dissotsieeruvate või assotsieeruvate 
ühendite puhul (vt punkt 12).
 
12. Kuna dissotsieeruvate ainete, nagu orgaanilised happed, fenoolid, orgaani ­
lised alused ja metallorgaanilised ühendid, jaotumisel 1-oktanooli ja vee 
vahel kujuneb vees ja 1-oktanoolis mitmeastmeline tasakaal, on jaotuskoe ­
fitsient süsteemis 1-oktanool-vesi tinglik konstant, mis sõltub tugevasti elek ­
trolüüdi koostisest (7, 8). Seega eeldab jaotuskoefitsiendi määramine 
süsteemis 1-oktanool-vesi, et katse jooksul kontrollitakse pH väärtust ja 
elektrolüüdi koostist ning esitatakse need andmed. Nende jaotuskoefitsien ­
tide hinnangulise väärtuse saamiseks kasutatakse eksperdihindamist. Dissot ­
siatsioonikonstandi (-konstantide) alusel valitakse sobivad pH väärtused, et 
määrata iga ionisatsiooniastme jaotuskoefitsient. Metallorgaaniliste ühendite 
jaotumise uurimisel kasutatakse puhvreid, mis ei moodusta komplekse (8). Arvestades vesilahuste keemia andmeid (komplekside moodustumise tasa ­
kaalukonstandid, dissotsiatsioonikonstandid), valitakse katsetingimused nii, 
et oleks võimalik hinnata, millises vormis on uuritav aine veefaasis. Kõikide 
katsete puhul luuakse taustelektrolüüdi abil ühesugune ioonne jõud.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Vees vähe lahustuvate või suure P  OW väärtusega ainete jaotuskoefitsiendi 
määramist võib raskendada see, et aine väikest kontsentratsiooni vees on 
raske täpselt määrata. Käesolevas metoodikas antakse juhendeid, kuidas seda probleemi lahendada.
 
ANDMED UURITAVA AINE KOHTA  
14. Keemilised reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad või veelgi kõrgema 
puhtusastmega. Uuritava ainena soovitatakse kasutada teadaoleva keemilise koostisega vähemalt 99-protsendilise puhtusastmega radioaktiivse märgiseta aineid või teadaoleva keemilise koostise ja radiokeemilise puhtusastmega 
radioaktiivselt märgistatud aineid. Kui märgise poolestusaeg on lühike, 
tehakse isotoobi lagunemist arvestav parand. Radioaktiivse märgisega uuri ­
tava aine puhul tuleb ainespetsiifilise analüüsimeetodiga tõendada, et mõõdetav radioaktiivsus on otse seotud uuritava ainega.
 
15. log P  OW hinnangu saamiseks võib kasutada müügilolevat log P  OW hindami­
seks ette nähtud tarkvara või kasutada kummaski lahustis lahustuvuste suhet.  
16. Enne aeglase segamise katse korraldamist P  OW määramiseks peaks uuritava 
aine kohta teadma järgmist:  
a) struktuurivalem,  
b) analüüsimeetodid, mis sobivad uuritava aine kontsentratsiooni määrami ­
seks vees ja 1-oktanoolis,  
c) ioniseeruva aine dissotsiatsioonikonstandid (OECD juhis 112 (9)),  
d) lahustuvus vees (10),  
e) abiootiline hüdrolüüs (11),  
f) kiire biolagunduvus (12),  
g) aururõhk (13).  
MEETODI KIRJELDUS  
Seadmed ja aparatuur  
17. Vaja on harilikku laborivarustust, eeskätt järgmisi vahendeid:  
— magnetsegajad ja tefloniga kaetud segamispulgad, mida kasutatakse 
veefaasi segamiseks;  
— analüüsiseadmed, mis võimaldavad määrata uuritava aine eeldatavaid 
kontsentratsiooni väärtusi;  
— katsenõu, mille põhja juures on kraan. Olenevalt log P  OW hinnangulisest 
väärtusest ja uuritava aine avastamise lävest tuleb vajaduse korral kasu ­
tada suuremat kui üheliitrise mahuga, kuid samasuguse kujuga katsenõu, et saaks võtta piisava koguse vett uuritava aine keemiliseks eraldamiseks ja määramiseks. Nii saadakse aine veest eraldamisel suurema sisaldusega 
kontsentraat ja usaldusväärsem analüüsi tulemus. 1. liite tabelis on 
esitatud vajaliku minimaalse mahu hinnangud, uuritava aine avastamise läved, hinnangulised log P
 OW väärtused ja lahustuvused vees. Tabel 
põhineb Pinsuwani jt (14) esitatud seosel ühelt poolt log P  OW ning 
teiselt poolt oktanoolis ja vees lahustuvuse (S) suhte vahel:  
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
kus 
SR ¼ S oct=S w (väljendatud molaarsustes),  
ning Lymani (15) esitatud valemil, mis võimaldab ennustada vesilahus ­
tuvust. 1. liites esitatud valemi abil arvutatud vesilahustuvust tuleb käsi ­
tada esialgse hinnanguna. Tuleb märkida, et käesoleva meetodi kasutaja võib hinnata vesilahustuvust ka mis tahes muu valemi abil, kui ta arvab, 
et see kajastab hüdrofoobsuse ja lahustuvuse seost paremini. Näiteks 
tahkete ühendite puhul on soovitatav lahustuvuse hindamisel arvestada ka sulamistemperatuuri. Kui kasutatakse modifitseeritud valemit, tuleb kontrollida, kas valem lahustuvuse arvutamiseks oktanoolis ikkagi 
kehtib. 2. liites on skemaatiliselt kujutatud klaasist veesärgiga katsenõu 
mahuga umbes üks liiter. 2. liites kujutatud nõu proportsioonid on osutunud sobivaks ja muu mahuga nõu peaks olema samasuguse kujuga;
 
— oluline on sellise seadme olemasolu, mis hoiab aeglase segamise katse 
jooksul püsivat temperatuuri.  
18. Nõud peavad olema valmistatud inertsest materjalist, et adsorptsioon nõu 
pinnale oleks tähtsusetu.  
Katselahuste valmistamine  
19. P  OW määramiseks kasutatakse müügilolevat suurima puhtusastmega (vähe ­
malt üle 99 %) 1-oktanooli. 1-oktanool soovitatakse puhastada happe, aluse ja veega ekstraheerimise abil ning seejärel kuivatada. Lisaks sellele võib 1- 
oktanooli puhastada destilleerimisega. Puhastatud 1-oktanooli kasutatakse 
uuritava aine standardlahuste valmistamiseks. P
 OW määramiseks kasutatav 
vesi peab olema destilleeritud klaas- või kvartsklaasist seadme abil, saadud puhastussüsteemist või olema kõrgefektiivse vedelikkromatograafia puhul 
nõutava puhtusega. Destilleeritud vesi filtritakse läbi filtri, mille poori suurus 
on 0,22 μm, ja tehakse pimekatsed, millega kontrollitakse, et kontsentreeri ­
tud ekstraktis ei oleks uuritava aine käitumist mõjutavaid lisandeid. Klaas ­
kiudfiltri kasutamisel puhastatakse see eelnevalt kuumutamisega vähemalt 
kolme tunni jooksul 400 °C juures.
 
20. Enne katset küllastatakse mõlemad lahustid vastastikku, tasakaalustades neid 
piisavalt suures nõus. Selleks segatakse kahefaasilist süsteemi aeglaselt kahe ööpäeva jooksul.
 
21. Valitakse vajalik uuritava aine kontsentratsioon ja aine lahustatakse veega 
küllastunud 1-oktanoolis. Jaotuskoefitsient süsteemis 1-oktanool-vesi tuleb 
määrata lahja 1-oktanool- ja vesilahuse jaoks. Sellepärast ei tohi uuritava aine kontsentratsioon ületada 70 % selle lahustuvusest kummaski faasis ega olla suurem kui 0,1 (1). Katses kasutatavas 1-oktanooli lahuses ei tohi olla 
uuritava aine hõljuvaid tahkeid osakesi.
 
22. Vajalik kogus uuritavat ainet lahustatakse veega küllastunud 1-oktanoolis. 
Kui võib arvata, et log P  OW väärtus on suurem kui viis, tuleb hoolikalt 
jälgida, et katses kasutatavad 1-oktanooli lahused ei sisaldaks uuritava 
aine hõljuvaid tahkeid osakesi. Nende ainete puhul, mille log P  OW > 5, 
toimitakse seepärast järgmisel viisil:  
— uuritav aine lahustatakse veega küllastunud 1-oktanoolis;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— lahusel lastakse piisavalt kaua seista, et hõljuv aine sadestuks. Sadestu ­
mise ajal jälgitakse uuritava aine kontsentratsiooni;  
— kui 1-oktanooli lahuses mõõdetav kontsentratsioon on saavutanud püsiva 
väärtuse, lahjendatakse põhilahus vajaliku mahu 1-oktanooli lisamisega;  
— mõõdetakse lahjendatud põhilahuse kontsentratsioon. Lahjendatud põhi ­
lahust võib aeglase segamise katses kasutada, kui mõõdetud kontsentrat ­
siooni väärtus vastab lahjendusele.  
Proovide ekstraheerimine ja analüüsimine  
23. Uuritava aine määramiseks kasutatakse valideeritud analüüsimeetodit. Uurija 
peab esitama tõendid, et katses kasutatavad uuritava aine kontsentratsioonid veega küllastunud 1-oktanoolis ja 1-oktanooliga küllastunud vees on 
suuremad kui kasutatava analüüsimeetodi mõõtmislävi. Kui on vaja kasutada 
ekstraheerimismeetodit, tuleb enne katset kindlaks teha vee faasis ja 1-okta ­
nooli faasis oleva uuritava aine analüütilise määramise saagis. Analüüsiks 
kasutatava signaali tugevus peab olema parandatud pimekatses saadud 
signaali arvestamiseks; hoolikalt jälgitakse, et analüüsitavat ainet ei kantaks üle ühest proovist teise.
 
24. Kuna hüdrofoobse uuritava aine kontsentratsioon vee faasis on väike, on vee 
faasi enne analüüsi tõenäoliselt vaja ekstraheerida orgaanilise lahustiga ja 
ekstrakti kontsentreerida. Samal põhjusel on vaja kontsentreerida võimalikke pimekatseid. Selleks tuleb kasutada kõrgpuhtaid lahusteid, eelistatavalt selli ­
seid, mis sobivad kasutamiseks jääkide analüüsis. Töötamine hoolikalt 
puhastatud (lahustiga pestud või kõrgel temperatuuril kuumutatud) klaasnõu ­
dega aitab vältida ühe proovi saastamist teise prooviga.
 
25. log P  OW hinnangulise väärtuse saamiseks võib kasutada hindamisprogrammi 
või eksperdihindamist. Kui hinnangu järgi on väärtus suurem kui kuus, tuleb 
pimekatse parandite arvestamisel ja analüüsitava aine võimaliku ülekande 
vältimisel olla eriti hoolikas. Kui hinnanguline log P  OW on suurem kui kuus, 
tuleb määramise saagist arvestava parandi saamiseks kasutada asendavat standardainet, nii et oleks võimalik saavutada suurt eelkontsentreerimiste ­
gurit. Müügil on mitu P
 OW hindamiseks ette nähtud tarkvaraprogrammi, (  1 ) 
nt Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) ja ACD log P (19). Hinda ­
misviise on kirjeldatud publikatsioonides 20–22.  
26. Tunnustatud meetodite abil tehakse kindlaks uuritava aine mõõtmisläve 
väärtused 1-oktanoolis ja vees. Rusikareeglina võib meetodi mõõtmisläve määratleda kui uuritava aine sellist kontsentratsiooni vees või 1-oktanoolis, mille puhul signaali ja müra taseme suhe on kümme. Valitakse sobiv ekstra ­
heerimise ja eelkontsentreerimise meetod ning leitakse analüütilise määra ­
mise saagis. Analüütiliseks määramiseks vajaliku tugevusega signaali saa ­
miseks valitakse sobiv eelkontsentreerimistegur.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) See teave on ette nähtud üksnes kasutaja abistamiseks. Võib kasutada ka muid sama ­
väärseid arvutiprogramme, kui saab näidata, et need annavad samad tulemused.
 27. Analüüsimeetodi parameetrite ja oodatavate kontsentratsioonide alusel 
määratakse kindlaks ligikaudne proovi maht, mis on vajalik uuritava aine 
täpseks määramiseks. Tuleb vältida liiga väikeste veeproovide kasutamist, mis ei anna piisavalt tugevat analüütilist signaali. Tuleb hoiduda ka ülemäära suurte veeproovide võtmisest, kuna sel juhul võib vett mitte 
jätkuda nõutava minimaalse arvu (n = 5) analüüside tegemiseks. 1. liites 
on esitatud proovi väikseima mahu sõltuvus nõu mahust, uuritava aine avastamise lävest ja lahustuvusest.
 
28. Uuritava aine sisaldus mõõdetakse selle aine kaliibrimiskõveraga võrdlemise 
teel. Standardproovide kontsentratsioonivahemik peab ulatuma uuritava proovi kontsentratsioonist mõlemale poole.
 
29. Kui uuritava aine hinnanguline log P  OW väärtus on suurem kui kuus, tuleb 
enne ekstraheerimist lisada veeproovile asendavat standardainet, et osata 
arvesse võtta kadusid veeproovi ekstraheerimisel ja eelkontsentreerimisel. 
Määramise saagist arvestava parandi õige väärtuse saamiseks peavad asen ­
dava standardaine omadused olema uuritava aine omadustega väga sarnased või identsed. Selleks kasutatakse eelistatavalt (stabiilsete) isotoopidega (nt 
deuteerium või
 13 C) märgistatud uuritava aine analooge. Kui stabiilsete 
isotoopidega (nt deuteerium või  13 C) märgistatud analooge kasutada ei 
saa, tuleb usaldusväärsete kirjandusandmete põhjal näidata, et asendava stan ­
dardaine füüsikalis-keemilised omadused on väga sarnased uuritava aine 
omadustega. Vee faasi ekstraheerimisel lahustiga võib moodustuda emul ­
sioon. Emulsiooni vähendamiseks võib lisada soola ja lasta faasidel eralduda järgmise päevani. Ekstraheerimiseks ja proovide eelkontsentreerimiseks kasutatud meetodid märgitakse katseprotokolli.
 
30. Vajaduse korral võib enne analüüsi 1-oktanooli faasist võetud proovi lahjen ­
dada sobiva lahustiga. Asendava standardaine lisamine saagist arvestava 
parandi saamiseks on soovitatav ka siis, kui uuritava aine saagisekatsete tulemused on väga varieeruvad (suhteline standardhälve > 10 %).
 
31. Analüüsimeetodi üksikasjad märgitakse katseprotokolli. Nende hulka 
kuuluvad ekstraheerimismeetod, eelkontsentreerimis- ja lahjendustegur, analüüsiseadme parameetrid, kaliibrimismeetod, kaliibrimise kontsentratsioo ­
nivahemik, vee faasis oleva uuritava aine määramise saagis, asendava stan ­
dardaine lisamine saagist arvestava parandi saamiseks, fooni tase, avastamis ­
lävi ja mõõtmislävi.
 
Katse läbiviimine  
Optimaalne 1-oktanooli ja vee mahu suhe  
32. Vee ja 1-oktanooli mahtude valimisel tuleb arvestada mõõtmisläve väärtust 
1-oktanoolis ja vees, veeproovide puhul kasutatavaid eelkontsentreerimiste ­
gureid, 1-oktanooli ja vee prooviks võetavaid koguseid ja eeldatavaid kont ­
sentratsioone. Tehnilistel põhjustel valitakse 1-oktanooli maht aeglaselt sega ­
tavas süsteemis selliselt, et 1-oktanooli kiht oleks küllalt paks (üle 0,5 cm), 
nii et 1-oktanooli faasist saaks võtta proovi seda faasi häirimata.  
33. Ühendite puhul, mille log P  OW on 4,5 või suurem, kasutatakse tavaliselt 
järgmist faaside suhet: üheliitrisse nõusse pannakse 950–980 ml vett ja 
20–50 ml 1-oktanooli.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Katsetingimused  
34. Katse ajal termostateeritakse katsenõu nii, et temperatuurikõikumised on 
väiksemad kui 1 °C. Katse tuleb teha 25 °C juures.  
35. Katsesüsteemi kaitsmiseks päevavalguse eest tehakse katse pimedas ruumis 
või kaetakse katsenõu alumiiniumfooliumiga.  
36. Katse tehakse võimalikult tolmuvabas keskkonnas.  
37. 1-oktanooli ja vee süsteemi segatakse tasakaalu saabumiseni. Tasakaalusta ­
misaja hindamiseks tehakse eeluuring, mille jooksul süsteemi segatakse aeglaselt ning võetakse perioodiliselt 1-oktanoolist ja veest proove. Proove 
võetakse mitte sagedamini kui viie tunni tagant.
 
38. Iga P  OW määramiseks tehakse vähemalt kolm sõltumatut aeglase segamise 
katset.  
Tasakaalustamisaja määramine  
39. Eeldatakse, et tasakaal on saabunud, kui 1-oktanooli faasi ja veefaasi kont ­
sentratsioonide suhte ja aja regressioonisirge tõus nelja järjestikuse proovi ­
võtu ulatuses ei erine oluliselt nullist usaldusnivool 0,05. Enne proovivõtu alustamist tasakaalustatakse süsteemi vähemalt üks ööpäev. Kogemused näitavad, et kui aine hinnanguline log P
 OW väärtus on alla viie, saab proovid 
võtta teisel ja kolmandal päeval. Hüdrofoobsemate ühendite puhul võib 
tasakaalustamine kesta kauem. Ühendi puhul, mille log P  OW väärtus on 
8,23 (dekaklorobifenüül), oli piisav tasakaalustamisaeg 144 tundi. Tasakaalu hindamiseks võetakse korduvalt proove ühest nõust.
 
Katse alustamine  
40. Katse alguses täidetakse katsenõu veega, mis on küllastunud 1-oktanooliga. 
Püsiva temperatuuri saavutamiseks termostateeritakse katsenõu piisava aja jooksul.
 
41. Katsenõusse lisatakse ettevaatlikult vajalik kogus uuritavat ainet, mis on 
eelnevalt lahustatud sobivas mahus veega küllastunud 1-oktanoolis. See 
etapp on väga oluline, kuna siin tuleb vältida kahe faasi turbulentset segu ­
nemist. Selleks võib 1-oktanooli faasi lisada aeglaselt pipetiga, hoides pipetti vastu katsenõu seina veefaasi pinna läheduses. 1-oktanooli faas voolab 
mööda klaasseina, moodustades veefaasi peale kihi. Mingil juhul ei tohi 
1-oktanooli kallata otse katsenõusse; 1-oktanooli tilgad ei tohi kukkuda otse vette.
 
42. Pärast segamise alustamist tõstetakse segamise kiirust aeglaselt. Kui segaja 
mootorit ei saa vajalikul määral reguleerida, tuleb kasutada trafot. Segamise kiirus reguleeritakse selliseks, et vee ja 1-oktanooli piirpinnal tekiks 0,5–2,5 cm sügavune keeris. Kui keerise sügavus ületab 2,5 cm, tuleb sega ­
mise kiirust vähendada; vastasel korral võivad 1-oktanooli tilkadest 
veefaasis tekkida mikropiisakesed, mille tagajärjel uuritava aine kontsentrat ­
siooni vees hinnatakse tegelikust suuremaks. Maksimaalselt 2,5 cm sügavu ­
sele keerisele vastavat segamiskiirust soovitatakse laboritevaheliste võrdlus ­
katsete tulemuste alusel (5). See on kompromiss, mis võimaldab 1-oktanooli 
mikropiiskade tekke piiramisega samal ajal süsteemi kiiresti tasakaalustada.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Proovi võtmine ja ettevalmistamine  
43. Enne proovi võtmist peatatakse segaja ja oodatakse, kuni vedelike liikumine 
lakkab. Kui proovid on võetud, pannakse segaja uuesti aeglaselt tööle, nagu eespool kirjeldatud, ja seejärel suurendatakse järk-järgult segamise kiirust.
 
44. Vee proove võetakse katsenõu alumises osas oleva kraani kaudu. Kraani 
sees olev tasakaalustamata veekogus visatakse alati ära (2. liites kujutatud nõu puhul on selle maht umbes 5 ml). Kraani sees olev vesi ei segune 
ülejäänud faasiga ega ole sellepärast tasakaalus. Registreeritakse veeproo ­
vide mahud ja jälgitakse, et massibilansi koostamisel võetaks arvesse ka äravisatud vees leiduv uuritava aine kogus. Aurumiskao vähendamiseks lastakse veel rahulikult voolata jaotuslehtrisse, nii et vee- ja 1-oktanoolikihi 
olekut ei häiritaks.
 
45. 1-oktanooli proove võetakse 1-oktanooli kihist väikeste alikvootide (umbes 
100 μl) kaupa 100-mikroliitrise tervenisti klaasist ja metallist süstla abil. 
Seejuures jälgitakse, et ei häiritaks faasidevahelist piirpinda. Registreeritakse 
proovide mahud. Väiksest alikvoodist piisab, kuna 1-oktanooli proovi lahjendatakse.
 
46. Tuleb vältida asjatuid proovi ülekandmisi. Seepärast määratakse proovi maht 
gravimeetriliselt. Veeproovi puhul saab seda teha nii, et proov võetakse jaotuslehtrisse, millesse on enne pandud vajalik kogus lahustit.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
47. Käesoleva katsemetoodika kohaselt tehakse P  OW määramiseks uuritava 
ainega ühesugustes tingimustes kolm aeglase segamise katset (kolm paral ­
leelkatset). Tasakaalu saavutamist näitav regressioonikõver peab põhinema C
 O /C W määramisel vähemalt neljas järjestikuses eri aegadel võetud proovis. 
See võimaldab arvutada dispersiooni, mis iseloomustab paralleelkatsetest 
leitud keskväärtuse määramatust.  
48. P  OW väärtust võib iseloomustada igast paralleelkatsest saadud andmete 
dispersiooni abil. Neid andmeid kasutatakse kaalutud keskmise P  OW väär­
tuse arvutamiseks üksikute paralleelkatsete tulemuste alusel. Selleks kasuta ­
takse statistilise kaaluna paralleelkatsete tulemuste dispersiooni pöördväär ­
tust. Suure hajuvusega (suure dispersiooniga) ja seega vähem usaldatavad andmed mõjutavad kaalutud keskmist tulemust vähem kui väiksema disper ­
siooniga andmed.
 
49. Samal viisil arvutatakse ka kaalutud standardhälve. See iseloomustab P  OW 
määramise korratavust. Kaalutud standardhälbe väike väärtus näitab, et P  OW 
määramise tulemus on ühes ja samas laboratooriumis hästi korratav. Järgne ­
valt on kirjeldatud katseandmete formaalstatistilist analüüsi.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Tulemuste töötlemine  
Tasakaalu saavutamise näitamine  
50. Iga proovivõtuhetke jaoks arvutatakse 1-oktanoolis ja vees määratud uuri ­
tava aine kontsentratsioonide suhte logaritm (log C  O /C W ). Tasakaalu saavu ­
tamise näitamiseks ehitatakse graafik, mis kajastab selle suhte sõltuvust ajast. Kui vähemalt nelja proovi tulemused moodustavad graafikul platoo, 
tähendab see, et tasakaal on saavutatud ja uuritav aine on 1-oktanoolis tõesti 
lahustunud. Kui kõnesolevat platood ei ole, jätkatakse katset, kuni nelja järjestikuse proovi tulemused annavad tõusu, mis ei erine oluliselt 0-st usal ­
dusnivool 0,05, näidates, et log C
 O /C W ei sõltu ajast.  
Log P  OW arvutamine  
51. Iga paralleelkatse log P  OW saamiseks arvutatakse kaalutud keskmine log 
C O /C W väärtus kõvera log C  O /C W vs. aeg tasakaaluolekule vastaval osal. 
Kaalutud keskmise arvutamisel kaalutakse katseandmeid dispersiooni pöörd ­
väärtusega; selle tulemusena on katseandmete mõju lõpptulemusele pöörd ­
võrdeline nende määramatusega.  
Keskmine log P  OW 
52. log P  OW keskväärtuse arvutamiseks eri paralleelkatsete keskväärtustest 
leitakse vastavate dispersioonidega kaalutud paralleelkatsete tulemuste kesk ­
mine.  
Arvutused tehakse järgmiselt:  
log P  OW;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
kus 
log P  OW,i = on paralleelkatses i leitud log P  OW väärtus,  
log P  OW,Av  = on üksikutes paralleelkatsetes määratud log P  OW väärtuste 
kaalutud keskmine,  
w i = on paralleelkatses i log P  OW väärtusele omistatud statistiline 
kaal.  
Statistilise kaaluna w  i kasutatakse log P  OW,i dispersiooni pöördväärtust 
(w i ¼ varðlog P  OW;i Þ –1 ). 
53. log P  OW keskväärtuse viga hinnatakse tasakaaluolekus üksikutes paralleel ­
katsetes määratud log C  O /C W väärtuste korratavuse järgi. See väljendatakse 
log P  OW,Av  kaalutud standardhälbena ( σ log Pow,Av  ), mis omakorda on log 
P OW,Av  väärtusega seotud vea mõõt. Kaalutud standardhälbe võib arvutada 
kaalutud dispersioonist (var  log Pow,Av  ) järgmisel viisil:  
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW;i Ä log P  OW;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
n on paralleelkatsete arvu tähis.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Katseprotokoll  
54. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav aine:  
— tavanimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem (mis 
näitab märgistuse asukohta, kui kasutatakse radioaktiivselt märgistatud 
ainet) ja olulised füüsikalis-keemilised omadused (vt punkt 17);  
— uuritava aine puhtusaste (lisandid);  
— märgistatud kemikaali märgise puhtus ja molaarne aktiivsus (vajaduse 
korral);  
— log P  OW esialgne hinnanguline väärtus ja selle tuletusviis.  
Katsetingimused:  
— uuringu kuupäevad;  
— katsetemperatuur;  
— 1-oktanooli ja vee maht katse alguses;  
— võetud 1-oktanooli ja vee proovide maht;  
— pärast proovide võtmist katsenõusse jäänud 1-oktanooli ja vee maht;  
— katsenõu ja segamistingimuste kirjeldus (segamispulga ja katsenõu 
ehitus, keerise sügavus millimeetrites ja segamiskiirus, kui see on teada);  
— uuritava aine määramiseks kasutatud analüüsimeetod ja selle meetodi 
mõõtmislävi;  
— proovivõtuajad;  
— vee faasi ja kasutatud puhvrite pH (kui ioniseeruvate molekulide tõttu 
reguleeriti pH väärtust);  
— paralleelkatsete arv.  
Tulemused:  
— kasutatud analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkus;  
— 1-oktanoolis ja vees määratud uuritava aine kontsentratsioonide sõltuvus 
ajast;  
— massibilansi kontroll;  
— katsetemperatuur ja selle standardhälve või katsetemperatuuri vahemik;  
— kontsentratsioonide suhte ja aja seost kajastav regressioonikõver;  
— keskväärtus log P  OW,Av  ja selle standardhälve;  
— tulemuste arutelu ja tõlgendus;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— representatiivse analüüsi originaalarvandmete näidis (hea laboritava 
kohaselt säilitatakse kõik originaalandmed), kaasa arvatud asendavate 
standardainete saagised, kaliibrimisel kasutatud kontsentratsioonide arv (koos kaliibrimiskõvera korrelatsioonikordaja kriteeriumidega) ning kvaliteedi tagamise ja/või kontrolli tulemused;
 
— kui on olemas, siis: mõõtmismeetodi valideerimisaruanne (esitatakse 
kirjandusviitena).  
KIRJANDUS  
1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring” method. Environ. 
Toxicol. Chem. 8: 499–512.  
2) Käesoleva lisa peatükk A.8. Jaotuskoefitsient.  
3) Käesoleva lisa peatükk A.8. Jaotuskoefitsient.  
4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
 
5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01.  
6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596–2602.  
9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Paris.  
10) Käesoleva lisa peatükk A.6. Lahustuvus vees.  
11) Käesoleva lisa peatükk C.7. Lagunemine – abiootiline lagunemine hüdro ­
lüüsi teel sõltuvalt pH-st.  
12) Käesoleva lisa peatükk C.4, II–VII osa (meetodid A–F). Kiire biolagunevuse 
määramine.  
13) Käesoleva lisa peatükk A.4. Aururõhk.  
14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623–626.  
15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, 
Washington, DC, 2–1 to 2–52.
 
16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA.  
17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl 
WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, D.C.  
21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479–488.  
22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen 
Chemie : 386–390.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
1. liide  
Eri log P  OW väärtusega uuritavate ainete veefaasis määramiseks vajalike 
vee miinimumkoguste arvutamise tabel  
Eeldused  
— Ühe alikvoodi maksimaalne maht on 10 % üldmahust, 5 alikvooti on 50 % 
üldmahust.  
— Uuritava aine kontsentratsioon on 70 % lahustuvusest kummaski faasis. Väik ­
sema kontsentratsiooni puhul on vaja kasutada veel suuremat mahtu.  
— Avastamisläve juures määramiseks vajalik maht on 100 ml.  
— Uuritavatel ainetel on mõistlikud log P  ow vs. log S  w ja log P  ow vs. SR 
(S oct /S w ) sõltuvused.  
S w hindamine  
log P  ow Võrrand log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,426 3,750E–01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,887 1,297E–01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,348 4,487E–02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,809 1,552E–02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,270 5,370E–03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,731 1,858E–03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –3,192 6,427E–04  
S oct hindamine  
log P  ow Võrrand S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Uuritava aine 
üldmass 
(mg) Mass  oct /Mass  H2O Mass  H2O 
(mg) Konts  H2O 
(mg/l) Mass  oct 
(mg) Konts  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Mahtude arvutamine  
Veefaasi väikseim vajalik maht avastamisläve eri väärtuste korral  
log K  ow Avastamislävi (mikro ­
gramm/l) 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Avastamisläve 
juures määra ­
miseks vajalik 
maht (l) 0,1 
Selgitused arvutuste kohta  
Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 1-liitrine katsenõu tasakaa ­
lustamiseks.  
Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 2-liitrine katsenõu tasakaa ­
lustamiseks.  
Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 5-liitrine katsenõu tasakaa ­
lustamiseks.  
Vastab vähem kui 10 protsendile veefaasi üldmahust, 10-liitrine katsenõu tasa ­
kaalustamiseks.  
Ületab 10 % isegi 10-liitrise katsenõu mahust.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Vajaliku mahu sõltuvus lahustuvusest vees ja log P  OW väärtusest  
Veefaasi väikseim vajalik maht avastamisläve eri väärtuste korral (ml)  
log P  ow S w (mg/l) Avastamislävi 
(mikrogramm/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) Avastamislävi 
(mikrogramm/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Avastamisläve juures 
määramiseks vajalik maht 
(l) on 0,1 
2. liide  
Klaasist veesärgiga katsenõu P  OW määramiseks aeglase segamise katse abil
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
B OSA: MÜRGISUSE JA MUUDE TERVISEMÕJUDE MÄÄRAMISE 
MEETODID  
SISUKORD 
ÜLDINE SISSEJUHATUS 
B.1a. ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE PROT ­
SEDUUR 
B.1b. ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISU ­
SASTME MEETOD 
B.2. ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL B.3. ÄGE MÜRGISUS (NAHAKAUDNE) B.4. ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS B.5. ÄGE MÜRGISUS: SILMADE ÄRRITUS/SÖÖVITUS B.6. NAHA SENSIBILISEERIMINE B.7. SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 28-PÄEVANE 
UURING NÄRILISTEL 
B.8. SUBAKUUTNE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL: 28- 
PÄEVANE UURING 
B.9. KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, NAHAKAUDNE) B.10. MUTAGEENSUS – IMETAJATE KROMOSOOMABERRAT ­
SIOONKATSE  IN VITRO  
B.11. MUTAGEENSUS – KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE 
IMETAJATE LUUÜDIS  IN VIVO  
B.12. MUTAGEENSUS – PISITUUMA KATSE IMETAJATE 
ERÜTROTSÜÜTIDES  IN VIVO  
B.13/14. MUTAGEENSUS – BAKTERITE PÖÖRDMUTATSIOON ­
KATSE 
B.15. MUTAGEENSUSE JA KARTSINOGEENSUSE UURING, 
GEENMUTATSIOON –  SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
B.16. MITOOTILINE REKOMBINATSIOON –  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
B.17. MUTAGEENSUS  – IN VITRO  IMETAJATE RAKKUDE GEEN ­
MUTATSIOONKATSE 
B.18. DNA KAHJUSTAMINE JA PARANDAMINE – PLAANIVÄ ­
LINE DNA SÜNTEES – IMETAJATE RAKKUDEL  IN VITRO  
B.19. ÕDEKROMATIIDI VAHETUSE  IN VITRO  ANALÜÜS 
B.20. SUGULIITELISE RETSESSIIVSE LETAALSUSE TEST ÄÄDI ­
KAKÄRBSEL  DROSOPHILA MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. IMETAJARAKU TRANSFORMATSIOONITESTID  IN VITRO  
B.22. NÄRILISTE DOMINANTSE LETAALSUSE TEST B.23. IMETAJATE SPERMATOGOONIDE KROMOSOOMABER ­
RATSIOONKATSE 
B.24. HIIRE NAHALAIKUDE TEST B.25. HIIRE PÄRILIK TRANSLOKATSIOON 
B.26. SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – 
SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE UURING NÄRILISTEL 
B.27. SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – 
SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE UURING MITTENÄRILISTEL 
B.28. SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST NAHAKAUDSEL 
MANUSTAMISEL 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE NAHA ­
KAUDSE MANUSTAMISE UURING NÄRILISTE LIIKIDEL 
B.29. SUBKROONILINE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL: 90- 
PÄEVANE UURING 
B.30. KROONILISE MÜRGISUSE UURINGUD B.31. SÜNNIEELSE ARENGU MÜRGISUSE UURIMUS 
B.32. KANTSEROGEENSUSE UURINGUD 
B.33. KOMBINEERITUD KROONILISE TOKSILISUSE – KANTSE ­
ROGEENSUSE UURING 
B.34. ÜHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONITOKSILISUSE 
UURING 
B.35. KAHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONI TOKSILISUSE 
UURING 
B.36. TOKSIKOKINEETIKA 
B.37. FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD 
VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUS PÄRAST ÄGEDAT 
KOKKUPUUTUMIST 
B.38. FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD 
VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUSE 28PÄEVANE KORDUSDOOSI UURING 
B.39. PLAANIVÄLISE DNA SÜNTEESI (UDS) KATSE IMETAJATE 
MAKSARAKKUDEGA  IN VIVO  
B.40. NAHASÖÖVITUSKATSE  IN VITR0 : TRANSKUTAANSE 
ELEKTRITAKISTUSE (TER) MÕÕTMINE 
B.40a. NAHASÖÖVITUS  IN VITRO : KATSE INIMNAHA MUDELIGA
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41.  IN VITRO  3T3 NRU FOTOTOKSILISUSE KATSE 
B.42. NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕL ­
MEDE KATSE 
B.43. NEUROTOKSILISUSE UURING NÄRILISTEL 
B.44. NAHAKAUDNE IMENDUMINE:  IN VIVO  MEETOD 
B.45. NAHAKAUDNE IMENDUMINE:  IN VITRO  MEETOD 
B.46.  IN VITRO  NAHAÄRRITUSKATSE: REKONSTRUEERITUD 
INIMEPIDERMISE MUDELI KATSEMEETOD 
B.47. VEISE SARVKESTA HÄGUSUSE JA LÄBILASKVUSE 
KATSEMEETOD SILMA SÖÖVITAVATE JA TUGEVASTI ÄRRITAVATE AINETE KINDLAKSTEGEMISEKS 
B.48. ISOLEERITUD KANASILMA MEETOD SILMA SÖÖVITA ­
VATE JA TUGEVALT ÄRRITAVATE AINETE KINDLAKS ­
TEGEMISEKS 
B.49.  IN VITRO  IMETAJARAKKUDE MIKROTUUMA KATSE 
B.50. NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕL ­
MEDE KATSE: DA 
B.51. NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕL ­
MEDE KATSE: BRDU-ELISA
 
▼M4 
B.52. ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL – ÄGEDA MÜRGI ­
SUSE KLASSI MÄÄRAMISE MEETOD  
▼M5 
B.53. ARENGUHÄIREID PÕHJUSTAVA NEUROTOKSILISUSE 
UURING 
B.54. UTEROTROOFNE BIOKATSE NÄRILISTEL: KIIRE SÕEL ­
KATSE ÖSTROGEENSETE OMADUSTE VÄLJASELGITAMI ­
SEKS 
B.55. HERSHBERGERI BIOKATSE ROTTIDEL: KIIRE 
SÕELKATSE (ANTI)ANDROGEENSETE OMADUSTE VÄLJASELGITAMISEKS 
B.56. LAIENDATUD ÜHE PÕLVKONNA REPRODUKTIIVTOKSI ­
LISUSE UURING 
B.57. H295R STEROIDOGENEESI KATSE B.58. TRANSGEENSE NÄRILISE SOMAATILISTE JA SUGURAK ­
KUDE GEENIDE MUTATSIOONI KATSE
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
ÜLDINE SISSEJUHATUS  
A. UURITAVA AINE ISELOOMUSTUS  
Uuritava aine koostis, sealhulgas peamised lisandid ja selle vastavad 
füüsikalis-keemilised omadused (sealhulgas stabiilsus), peaksid 
olema teada enne toksilisuse uuringu alustamist.  
Uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused annavad olulist teavet 
manustamisviisi valimise, iga konkreetse uuringu kavandamise ning uuritava aine käitlemise ja säilitamise jaoks.
 
Doseeritavas aines ja bioloogilises materjalis oleva uuritava aine 
(sealhulgas võimaluse korral peamiste lisandite) kindlakstegemiseks 
kasutatav kvalitatiivne ja kvantitatiivne analüüsimeetod tuleks välja töötada enne uuringu alustamist.
 
Katsearuanne peaks hõlmama kogu teavet uuritava aine identifitsee ­
rimise, selle füüsikalis-keemiliste omaduste, selle puhtuse ja käitu ­
mise kohta.  
B. LOOMADE HOOLDAMINE  
Toksilisuse uurimisel on oluline keskkonnatingimuste range kontroll 
ja õiged loomade hooldamise viisid.  
i) Pidamistingimused  
Katsealuste loomade ruumide või piirdeaedade keskkonnatingimused 
peaksid olema katseliikide jaoks sobivad. Rottide, hiirte ja merisi ­
gade puhul on sobiv toatemperatuur 22 ± 3  o C ning suhteline 
õhuniiskus peaks olema 30–70 %; küülikute puhul peaks tempera ­
tuur olema 20 ± 3  o C ning suhteline õhuniiskus 30–70 %.  
Mõned uurimismeetodid on temperatuuri suhtes eriti tundlikud ning 
sellistel puhkudel on sobivate temperatuuritingimuste üksikasjad 
lisatud uurimismeetodi kirjeldusse. Kõikide toksilise toime uuringute 
puhul tuleks jälgida temperatuuri ja niiskust, samuti tuleks need andmed registreerida ning uuringu lõpparuandesse lisada.
 
Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valget ja 12 tundi pimedat 
aega. Valgustustsükli üksikasjad tuleks registreerida ja märkida 
uuringu lõpparuandesse.  
Kui meetodis ei ole teisiti sätestatud, võib loomi pidada üksikult või 
väikeste rühmadena, kus emas- ja isasloomad on eraldi; kui puuris on mitu looma, ei tohiks koos olla rohkem kui viis looma.
 
Loomkatsete aruannetes on oluline ära märkida, millist tüüpi puure 
kasutati ning mitu looma igas puuris nii keemilise ainega kokkupuu ­
tumise kui ka järgneva vaatlusperioodi jooksul oli.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Söötmistingimused  
Toiduvalik peaks vastama kõikidele katses kasutatava liigi toitaine ­
vajadustele. Kui uuritavat ainet manustatakse loomadele toidu kaudu, võib toidu toiteväärtust vähendada vastava uuritava aine ja toidu ­
komponendi võrra. Sellise reaktsiooni võimalikkust tuleks katse tule ­
muste tõlgendamisel arvesse võtta. Kasutada võib ka tavapärast katseloomadele mõeldud toitu ning joogivee hulk peab olema piira ­
matu. Toidu valikut võib mõjutada vajadus tagada sobiv segu, mis 
võimaldab uuritava aine manustamist koos toiduga.
 
Toksilisust mõjutavaid toidu saasteaineid ei tohiks olla sellises kont ­
sentratsioonis, et see segaks katse tegemist.  
C. ALTERNATIIVSED KATSED  
Euroopa Liit püüab edendada alternatiivmeetodite väljatöötamist ja 
kinnitamist, mis annaksid loomkatsetest saadud teabega tasemelt 
samaväärset teavet, kuid kus kasutataks vähem loomi ja mis põhjus ­
taksid vähem kannatusi või milles välditakse üldse loomade kasuta ­
mist.  
Selliste meetodite olemasolu korral tuleb neid kasutada igal võima ­
lusel ohu kirjeldamisel ja seejärel loomuomase ohtlikkuse liigitamisel 
ja märgistamisel.  
D. HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Katsete hindamisel ja tõlgendamisel tuleb arvesse võtta seda, millisel 
määral on loomkatsete ja  in vitro  uuringute tulemusi võimalik ekstra ­
poleerida vahetult inimesele, ning seetõttu võib võimaluse korral kasutada katse tulemuste kinnitamiseks tõendeid kahjulikust toimest 
inimese tervisele.
 
E. VIITED KIRJANDUSELE  
Enamik nendest meetoditest on töötatud välja OECD programmi 
„Testing Guidelines” raames ning neid tuleks kasutada kooskõlas heade laboritavadega, et tagada võimalikult laialdane „andmete vastastikune heakskiitmine”.
 
Lisateavet võib leida OECD suunistes olevatest viidetest ja muust 
asjakohasest kirjandusest.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1a.  ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – KINDLA ANNUSE 
PROTSEDUUR  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 420ga (2001).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Traditsioonilised ägeda mürgisuse hindamise meetodid kasutavad 
loomade surma lõpetamiskriteeriumina. 1984. aastal soovitas British 
Toxicology Society uut lähenemist ägeda mürgisuse katsetamisele, 
mis põhineb aine manustamisel kindla annusemääraga seeriana (1). See lähenemine vältis loomade surma kasutamist lõpetamiskriteeriu ­
mina ja tugines selle asemel selgete mürgisuse nähtude vaatlemisele 
ühel seeriast valitud kindlal annusemääral. Protseduur kiideti katse ­
meetodina heaks 1992. aastal Ühendkuningriigi (2) ja rahvusvahe ­
liste (3)  in vivo  valideerimiste põhjal. Seejärel hinnati kindla annuse 
protseduuri statistilisi omadusi matemaatiliste mudelite abil mitmetes 
uuringutes (4, 5, 6).  In vivo  ja mudeluuringud on tõestanud, et prot ­
seduur on korratav, et selles kasutatakse vähe loomi ja et see põhjustab vähem kannatusi kui traditsioonilised meetodid ning et selle abil saab klassifitseerida ained nii nagu muude ägeda mürgisuse 
katsemeetoditega.
 
Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi 
valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katsete juhisdoku ­
mendist („Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing” (7)). Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti lisateavet katsemeetodi 
B.1a kasutamise ja tõlgendamise kohta.
 
Meetodi põhimõte on, et põhiuuringus kasutatakse üksnes mõõdukalt 
mürgiseid annuseid ja et tõenäoliselt surmavate annuste manustamist 
tuleks vältida. Samuti ei tohiks manustada annuseid, mis teatavasti põhjustavad märkimisväärset valu või kannatusi sööbivate või tõsi ­
selt ärritavate mõjude tõttu. Suremas loomad või loomad, kes ilmselt 
on valus või kellel on tugeva ja kestva kannatuse tunnused, surma ­
takse humaanselt ning need võetakse arvesse katsetulemuste tõlgen ­
damisel samamoodi nagu loomi, kes surid katse käigus. Eraldi juhis ­
dokumendis (8) on esitatud kriteeriumid, mille põhjal tehakse otsus 
suremas või raskelt kannatavate loomade surmamiseks, ja juhised 
prognoositava või ähvardava surma kindlakstegemiseks.
 
Meetod annab teavet ohtlike omaduste kohta ning võimaldab reas ­
tada ja klassifitseerida ainet ägedat mürgisust põhjustavate kemikaa ­
lide klassifitseerimiseks vastavalt globaalselt harmoneeritud süstee ­
mile (Globally Harmonised System – GHS (9)).  
Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava 
teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja 
keemilist struktuuri, selle füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainega  
in vitro  või  in vivo  tehtud mürgisuskatsete tulemusi, struktuurilt 
samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, 
et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat 
lähteannust.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. MÕISTED  
Äge suukaudne mürgisus  – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, 
mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.
 
Edasilükkunud surm  – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 
tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14päevase jälgimisperioodi jooksul.  
Annus  – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katse ­
aine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).  
Ilmne mürgisus  – üldine mõiste, mis kirjeldab katseaine manusta ­
mise järel ilmnenud selgeid mürgisuse tunnuseid (vt näiteid viitest 3). Suuruselt järgmine kindel annus võib põhjustada enamikul loomadest tõenäoliselt kas tugevat valu ja kestva tugeva kannatuse 
tunnuseid, surmaeelset seisundit (kriteeriumid on toodud humaanseid 
lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)) või tõenäoliselt surma.
 
GHS  – Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles 
osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete 
vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevahe ­
line programm (IOMC).
 
Ähvardav surm  – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne 
järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele 
seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, 
loidus ja värin (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamis ­
kriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).  
LD 50 (surmava annuse mediaan)  – aine statistiliselt määratletud 
ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel manusta ­
misel surma 50 %-l loomadest. LD  50 väärtust väljendatakse katseaine 
massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).  
Piirannus  – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele 
(2 000 või 5 000 mg/kg).  
Surmaeelne seisund  – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu 
jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (8)).
 
Ennustatav surm  – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis 
viitavad sellele, et surm saabub teatud aja möödumisel enne katse kavandatavat lõppu, näiteks suutmatus tarbida vett või toitu (vt üksi ­
kasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas 
juhisdokumendis (8)).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Ühesooliste loomade rühmadele annustatakse katseainet järk-järgult 
5, 50, 300 ja 2 000 mg/kg kindlate annustena (erandkorras võidakse kasutada 5 000 mg/kg kindlat lisaannust, vt punkti 1.6.2). Esialgne 
annusemäär valitakse eelkatse põhjal annusena, mis eeldatavasti 
põhjustab mõningaid mürgisuse nähte, kuid ei põhjusta tõsiseid toksilisi mõjusid või suremust. Valu, kannatuse ja ähvardava surmaga seotud kliinilisi tunnuseid ja tingimusi kirjeldatakse üksi ­
kasjalikult OECD juhisdokumendis (8). Järgnevatele loomarühma ­
dele võib annustada kaitseaine suuremaid või väiksemaid kindlaid annuseid sõltuvalt sellest, kas neil on olemas või puuduvad märgid 
mürgisuse või suremuse kohta. Käesolevat protseduuri jätkatakse 
seni, kuni on kindlaks tehtud tõenäoliselt mürgisust põhjustav annus või surmajuhtum, või kui suurim annus ei avalda mõju või kui väikseim annus põhjustab surma.
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Loomaliikide valik  
Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi 
liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (7). Selle põhjuseks on, et 
tavapäraseid LD  50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et 
sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui erinevusi on täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad 
(10). Kui struktuurselt samalaadsete kemikaalide toksikoloogilisi või 
toksikokineetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isas ­
loomad on tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse sooritatakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.
 
Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enim kasutatavaid 
laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom 
peaks annustamise alustamisel olema 8–12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.
 
1.4.2.  Loomade pidamise ja toitmise tingimused  
Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22  o C (± 3  o C). Kuigi 
suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 
70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, peaks eesmärk olema hoida seda vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel 
võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga 
joogiveega. Loomad võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.
 
1.4.3.  Loomade ettevalmistamine  
Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identi ­
fitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puurides vähemalt 5 
päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda 
laboritingimustega.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Annuste valmistamine  
Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus 
konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentrat ­
sioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata 
katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla 
siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil. See on mõnede reguleerivate asutuste nõue. Kummalgi juhul ei tohi manus ­
tamisel ületada annuse suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt 
manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei 
tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesila ­
huste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. 
Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasu ­
tada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks järjestus lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeainete 
puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. 
Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.
 
1.5. PROTSEDUUR  
1.5.1.  Annuste manustamine  
Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või 
sobiva intubeerimiskanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus 
ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates osades kuni 24 tunni jooksul.
 
Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse 
söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paas ­
tumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseaine. Pärast aine 
manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 tundi. Kui annust manustatakse osadena teatud ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda looma ­
dele toitu ja vett.
 
1.5.2.  Eelkatse  
Eelkatse eesmärk on võimaldada valida põhiuuringu tarbeks sobiv 
lähteannus. Katseainet manustatakse üksikutele loomadele järk- 
järgult lisas 1 toodud vooskeemide kohaselt. Eelkatse on lõpetatud siis, kui saab langetada otsuse põhikatse lähteannuse kohta (või kui 
tuvastatakse surm madalaima kindla annuse puhul).
 
Eelkatse lähteannus valitakse kindlate annusmäärade 5, 50, 300 ja 
2 000 mg/kg hulgast annusena, mis eeldatavasti põhjustab ilmset 
mürgisust, mis võimaluse korral põhineb sama kemikaali või struk ­
tuurselt sarnaste kemikaalidega sooritatud  in vivo  ja in vitro  katsete 
andmetel. Sellise teabe puudumise korral on lähteannuseks 
300 mg/kg.  
Iga looma korral on manustamiste vahel vähemalt 24tunnine 
vahemik. Kõiki loomi jälgitakse vähemalt 14 päeva.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Maksimaalset kindla annuse määra 5 000 mg/kg võidakse kasutada 
erandkorras või siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiiv ­
sete vajadustega (vt 3. lisa). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS 5. kategooria (2 000–5 000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on eriti tõenäoline, 
et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade 
tervise või keskkonna kaitsmiseks.
 
Juhul kui loom, kelle peal katsetati madalaimat kindla annuse 
määra (5 mg/kg), eelkatse käigus sureb, on tavapäraseks toimin ­
guks uuringu peatamine ja aine klassifitseerimine GHS 1. kate ­
gooriasse (nagu on näidatud 1. lisas). Kui on siiski nõutav 
klassifitseerimise täiendav kinnitamine, võib teha järgmise valiku ­
lise lisaprotseduuri. Teisele loomale manustatakse annus 5 mg/kg. Kui teine loom sureb, siis kinnitab see GHS 1. kategooriat ja katse lõpetatakse kohe. Kui teine loom jääb ellu, siis manusta ­
takse maksimaalselt kolmele täiendavale loomale annus 5 mg/kg. 
Kuna suremuse risk on suur, tuleb ainet manustada kõnealustele loomadele ükshaaval, et tagada nende heaolu. Ajavahemik igale loomale annuse manustamise vahel peab olema piisav selleks, et 
eelmine loom jääks tõenäoliselt ellu. Kui teine loom sureb, lõpe ­
tatakse viivitamata annustamine ja rohkematele loomadele doose ei manustata. Kuna teise surma juhtum (olenemata uuritud loomade arvust katse lõpetamise hetkel) kuulub tulemuse kate ­
gooriasse A (kaks või enam surma), järgitakse 5 mg/kg fiksee ­
ritud annuse puhul 2. lisas toodud klassifitseerimisreeglit (1. kategooria, kui on kaks või enam surmajuhtumit, või 2. kate ­
gooria, kui on vaid üks surmajuhtum). Lisaks sellele antakse 4. 
lisas juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise kohta enne 
uue GHSi kasutuselevõttu.
 
1.5.3.  Põhiuuring  
1.5.3.1.  Loomade arv ja annusemäärad  
Lähteannuse tasemel katsete tegemise järel võetavad meetmed on 
esitatud 2. lisas toodud vooskeemides. Üks kolmest meetmest on nõutav; kas katse peatamine või sobiva ohuklassi määramine, katse 
sooritamine suurema kindla annusega või väiksema kindla annusega. 
Loomade kaitsmiseks ei kasutata põhiuuringus uuesti eelkatses surma põhjustanud annusemäära (vt 2. lisa). Kogemused on näidanud, et kõige tõenäolisem tulemus läheannuse tasemel on see, et ainet on 
võimalik klassifitseerida ja täiendavaid katseid ei ole vaja teha.
 
Igal uuritava annusemäära korral kasutatakse tavaliselt kokku viit 
ühest soost looma. Nende viie looma hulka kuulub üks loom eelkat ­
sest, kellele manustati valitud annusemäärale vastav annus, ja veel neli looma (v.a harvaesineval juhul, kui põhiuuringus kasutatav 
annusemäär ei sisaldunud eelkatses).
 
Annustamistevaheline ajavahemik iga annusemäära korral määra ­
takse kindlaks mürgisuse tunnuste ilmnemise, kestuse ja ägeduse 
järgi. Järgmise annuse manustamist tuleb edasi lükata, kuni juba doosi saanud loomade ellujäämine on kindel. Vajaduse korral soovi ­
tatakse annustamistevaheliseks ajaks jätta iga annusemäära puhul 3 
või 4 päeva, et võimaldada jälgida viivitunud mürgisust. Ajavahe ­
mikku võib vajaduse korral korrigeerida, nt ebaselge vastuse puhul.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Kui kasutatakse kõrgeimat kindlat annust 5 000 mg/kg, tuleks järgida 
3. lisas esitatud protseduuri (vt ka punkti 1.6.2).  
1.5.3.2.  Piirsisalduskatse  
Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus katse tegijal on 
teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet 
katsematerjali mürgisuse kohta võib saada samalaadseid uuritud 
ühendeid või segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendi ­
määra. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see 
puudub üldse või mil katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks 
sooritada põhikatse.
 
Käesoleva juhise kohase piirkatsena võidakse tavalist protseduuri 
kasutades kasutada eelkatset, mille lähteannus on 2 000 mg/kg (või erandkorras 5 000 mg/kg), mille järel manustatakse veel neljale loomale sama annus.
 
1.6. VAATLUSED  
Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 
30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist tähelepanu pööratakse esimese 4 tunni jooksul ja seejärel iga päev, kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb 
kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt nende heaolu pärast 
või kui loomad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioo ­
nide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib 
seega vajaduse korral pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja 
kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud võivad ilmneda hilistumisega (11). Kõik vaatlused registreeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.
 
Täiendavad vaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt 
mürgisuse tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja 
karvkattes, silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamis ­
süsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, 
une ja kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpeta ­
miskriteeriumide juhisdokumendis esitatud põhimõtteid ja kritee ­
riume (8). Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaan ­
selt. Kui loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, 
tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
 
1.6.1.  Kehamass  
Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manus ­
tamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks 
arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellujäänud loomad kaalutakse 
ja siis surmatakse humaanselt.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Patoloogia  
Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või 
kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. 
Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade 
üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikro ­
skoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.
 
2. ANDMED  
Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele 
tuleb kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katserühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnäh ­
tudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel 
põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning 
lahangul tehtud leiud.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama vastavalt vajadusele järgmist teavet.  
Katseaine:  
— füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised 
omadused (kaasa arvatud isomeerumine);  
— identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi 
number.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/tüved;  
— loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;  
— loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isas ­
loomade kasutamise kohta emasloomade asemel);  
— päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.  
Katsetingimused:  
— katseaine valmistamise üksikasjalikud andmed, sh üksikasjalikud 
andmed manustatava aine füüsilise oleku kohta;  
— katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annusta ­
mise aeg;  
— üksikasjalikud andmed toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda 
tüüp/allikas, vee allikas);  
— põhjendus lähteannuse valikuks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Tulemused:  
— tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgistustunnused, kaasa 
arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta;
 
— tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta;  
— iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervalli ­
dega ja surma- või surmamishetkel;  
— surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavan ­
datud surmamist;  
— iga looma korral mürgistusnähtude algusaeg ja nende võimalik 
taandumine;  
— iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on 
olemas.  
Tulemuste arutelu ja tõlgendamine.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of subs ­
tances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, 85–92.  
2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). 
Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and 
preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279–291.
 
3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Felling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose proce ­
dure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469–482.  
4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313–324.  
5) Stallard, N. and Whitehead, A. (199 5). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol.
 
6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical 
evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196.
 
7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Pariis
 
8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assesment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Subs ­
tances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.Org/oecd/pages/home/ ­
displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no- 
0,FF.html].
 
10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P, Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, JA. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, 
Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. 
Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231.  
11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3
 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. 
New York, USA.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
1. LISA  
EELKATSE VOOSKEEM

 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
2. LISA  
PÕHIUURINGU VOOSKEEM

 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
3. Lisa  
KRITEERIUMID SELLISTE KATSEAINETE KLASSIFITSEERIMISE 
JAOKS, MILLE KORRAL OODATAVAD LD  50 VÄÄRTUSED 
ÜLETAVAD 2 000 MG/KG JA MIDA EI OLE VAJA UURIDA  
Ohukategooriat 5 käsitlevad kriteeriumid on ette nähtud selliste katseainete iden ­
tifitseerimiseks, mille korral on ägeda mürgisuse oht suhteliselt madal, kuid mis 
teatud tingimustel võivad ohustada tundlikke populatsioone. Nimetatud ainete LD
 50 väärtused on oodatavalt vahemikus 2 000–5 000 mg/kg suu- või naha ­
kaudsel manustamisel või samaväärsete annustena muude manustamisviiside 
korral. Katseained võidakse klassifitseerida ohukategooriasse, mis on määratletud 
tingimusega: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (GHS-kategooria 5), järgmistel 
juhtudel:  
a) kui on suunatud nimetatud kategooriasse lisas 2 toodud mis tahes katsekava 
korral, mis põhineb surmajuhtumitel;  
b) kui on juba olemas usaldusväärsed tõendid, mis näitavad, et LD  50 väärtus 
asub kategooriale 5 vastavas vahemikus, või muud loomauuringud või toksi ­
lised mõjud inimestel osutavad sellele, et ainel on vahetu mõju inimese tervisele;
 
c) andmete ekstrapoleerimise, hindamise või mõõtmise alusel, kui määramine 
ohtlikumasse kategooriasse ei ole põhjendatud, ja  
— usaldusväärse teabe olemasolul oluliste toksiliste mõjude kohta 
inimestele või  
— kui täheldatakse suremust suukaudse manustamisega katsetes kuni kate ­
gooriale 4 vastavate väärtusteni või  
— kui eksperdiarvamus kinnitab mürgisuse olulisi kliinilisi tunnuseid katse ­
tamisel kuni kategooriale 4 vastavate väärtusteni, välja arvatud kõhulah ­
tisus, piloerektsioon või hoolitsemata välimus, või  
— kui eksperdiarvamus kinnitab usaldusväärset teavet võimalike märkimis ­
väärsete ägedate mõjude kohta muude loomauuringute põhjal.  
KATSETAMINE 2 000 MG/KG ÜLETAVATE ANNUSTEGA  
Maksimaalset kindlat annust 5 000 mg/kg võidakse kasutada erandkorras või siis, 
kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega. Tunnistades vaja ­
dust kaitsta loomade heaolu, ei kiideta katsetamist annustega 5 000 mg/kg heaks 
ja seda kasutatakse üksnes siis, kui on suur tõenäosus, et sellise katse tulemused oleks otseselt seotud loomade või inimeste tervise kaitsega (9).
 
Eeluuring  
1. lisas esitatud järjestamist reguleerivate otsuste eeskirju laiendatakse annuse ­
määra 5 000 mg/kg kohta. Seetõttu, kui kasutatakse eeluuringus lähteannusena 5 000 mg/kg, eeldab tulemus A (surm) teise looma korral katse tegemist annu ­
sega 2 000 mg/kg; tulemused B ja C (ilmne mürgisus või ei esine mürgisust) 
lubavad valida põhiuuringus lähteannuseks 5 000 mg/kg. Analoogiliselt, kui 
lähteannusena kasutatakse 5 000 mg/kg erinevat annust, jätkatakse katset kuni annuseni 5 000 mg/kg sellisel juhul, kui annusega 2 000 mg/kg on tulemus B või C. Kui annusega 5 000 mg/kg on tulemuseks A, on põhiuuringus lähteannu ­
seks 2 000 mg/kg. Kui tulemuseks saadaks B ja C, on põhiuuringus algdoosiks 
lähteannuseks 5 000 mg/kg.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Põhiuuring  
2. lisas esitatud järjestamist reguleerivate otsuste eeskirju laiendatakse annuse ­
määra 5 000 mg/kg kohta. Seetõttu, kui kasutatakse põhiuuringus lähteannusena 
5 000 mg/kg, eeldab tulemus A ( ≥2 surma) teise rühmaga katse tegemist annu ­
sega 2 000 mg/kg; tulemuste B (ilmne mürgisus ja/või ≤1 surm) või C (ei esine 
mürgisust) puhul on tulemuseks see, et ainet ei klassifitseerita vastavalt GHSile. 
Analoogiliselt, kui lähteannusena kasutatakse 5 000 mg/kg erinevat annust, jätka ­
takse katset kuni annuseni 5 000 mg/kg sellisel juhul, kui annusega 2 000 mg/kg on tulemus C. Kui annusega 5 000 mg/kg on tulemuseks A, klassifitseeritakse aine GHS 5. kategooriasse. Tulemuste B või C puhul jääb aine klassifitseerimata.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
Lisa 4  
KATSEMEETOD B.1a  
EÜ süsteemi kohased klassifitseerimisjuhised, mida kasutatakse üleminekuperiodil kuni globaalselt harmoneeritud süsteemi (GHS) täieliku rakendamiseni (viites (8))

 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1b.  ÄGE SUUKAUDNE MÜRGISUS – ÄGEDA MÜRGISUSASTME 
MEETOD  
1. MEETOD  
See katsemeetod on samaväärne OECD TG 423ga (2001).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolevas katses sätestatud ägeda mürgisusastme meetod (1) on 
astmeline meetod, mille igal etapil kasutatakse kolme samast soost looma. Olenevalt loomade suremusest ja/või sellest, kas loomad on 
suremas, on katseaine ägeda mürgisuse hindamiseks vaja keskmiselt 
2–4 etappi. Käesolev protseduur on korratav, selles kasutatakse väga vähe loomi. Selle abil võidakse järjestada ained nii nagu muude ägeda mürgisuse katsemeetodite puhul. Ägeda mürgisusastme 
meetod põhineb biomeetrilistel hindamistel (2, 3, 4, 5), kus kasuta ­
takse kindlaid annuseid, mis on üksteisest piisavalt eraldatud aine klassifitseerimise eesmärgil ja ohu hindamiseks. 1996. aastal vastu ­
võetud meetodit valideeriti ulatuslikult  in vivo , võrreldes kirjandusest 
saadud LD
 50 väärtusi käsitlevaid andmeid nii riiklikul (6) kui ka 
rahvusvahelisel tasandil (7).  
Juhised antud eesmärgi saavutamiseks kõige sobivama katsemeetodi 
valimiseks võib leida ägeda suukaudse mürgisuse katseid käsitlevast 
(8) juhisdokumendist. Nimetatud juhisdokument sisaldab samuti lisa ­
teavet B.1b katsemeetodi rakendamise ja tõlgendamise kohta.  
Katseaineid ei ole vaja manustada annustes, mis teadaolevalt põhjus ­
tavad märkimisväärset valu ja kannatusi sööbiva või tugeva ärritava toime tõttu. Suremas olevad loomad ja loomad, kes kannatavad ilmselgelt valu või kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste 
tunnused, tuleks surmata humaanselt; need loomad võetakse arvesse 
katsetulemuste tõlgendamisel samamoodi nagu katse käigus surnud loomi. Eraldi juhisdokumendis (9) on esitatud kriteeriumid, mille alusel tehakse otsus suremas olevate või tõsiselt kannatavate loomade 
surmamise kohta, ning juhised prognoositava või ähvardava surma 
äratundmiseks.
 
Meetod kasutab kindlaks määratud annuseid ja tulemused võimal ­
davad aineid järjestada ja klassifitseerida vastavalt ägedat mürgisust 
põhjustavate kemikaalide klassifitseerimist käsitlevale globaalselt harmoneeritud süsteemile (10).
 
Põhimõtteliselt ei ole meetod ette nähtud võimaldama arvutada täpset 
LD 50 annust, kuid võimaldab kindlaks määrata määratletud kokku ­
puutevahemikku, kus suremus on eeldatav, kuna käesoleva katse põhipunkt on endiselt see, et osa loomi sureb. Meetod võimaldab 
kindlaks määrata LD
 50 väärtuse üksnes siis, kui vähemalt kaks 
annust põhjustavad suremuse, mis on 0 %st suurem ja 100 %st väiksem. Tänu kindlaksmääratud annuste valikule sõltumata katseai ­
nest, ja klassifitseerimise selgelt väljendatud seosele erinevas 
seisundis täheldatud loomade arvuga on laborite aruanded järjepide ­
vamad ja korratavamad.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Katselaboratoorium võtab arvesse kogu katseaine kohta kättesaadava 
teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab aine nimetust ja 
keemilist struktuuri, selle füüsikalis-keemilisi omadusi, muude aine ­
tega in vitro  või in  vivo  tehtud mürgisuskatsete tulemusi, struktuurilt 
sarnaste ainete toksikoloogilisi andmeid ja aine eeldatavat otstarvet. 
Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmiseks, et katse on 
tähtis inimeste tervise kaitsmiseks ja aitab valida sobivat lähteannust.  
1.2. MÕISTED  
Äge suukaudne mürgisus  – viitab sellistele kahjulikele mõjudele, 
mis ilmnevad pärast aine suukaudselt manustamist ühekordse annuse või seeriaviisiliste annustena 24 tunni jooksul.
 
Edasilükkunud surm  – loom ei sure ega näi olevat suremas 48 
tunni jooksul, kuid sureb hiljem, 14päevase jälgimisperioodi jooksul.  
Annus  – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse katse ­
aine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg/kg).  
GHS  – Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures (keemiliste ainete ja segude globaalselt 
harmoneeritud klassifitseerimissüsteem). Ühistegevus, milles 
osalevad OECD (inimeste tervis ja keskkond), ohtlike ainete vedu käsitlev ÜRO eksperdikomitee (füüsikalis-keemilised omadused) ja ILO (ohtudest teavitamine) ning mida koordineerib kemikaalide 
mõistlikku haldamist käsitlev organisatsioonidevaheline programm 
(IOMC).
 
Ähvardav surm  – loom on suremas või sureb tõenäoliselt enne 
järgmist kavandatud jälgimisperioodi. Närilistel võiksid sellisele 
seisundile viitavateks märkideks olla krambid, külili magamine, 
loidus ja värin (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid lõpetamis ­
kriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).  
LD 50 (surmava suukaudse annuse mediaan)  – aine statistiliselt 
määratletud ühekordne annus, mis tõenäoliselt põhjustab suukaudsel 
manustamisel surma 50 %l loomadest. LD  50 väärtust väljendatakse 
katseaine massina katselooma massiühiku kohta (mg/kg).  
Piirannus  – vastab katses kasutatavale maksimaalsele annusele 
(2 000 või 5 000 mg/kg).  
Surmaeelne seisund  – loomad, kes on suremas või kes ei suuda ellu 
jääda ravist hoolimata (vt üksikasjalikumaid andmeid humaanseid 
lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhisdokumendis (9)).  
Ennustatav surm  – selliste kliiniliste tunnuste olemasolu, mis 
viitavad sellele, et surm saabub teatud aja pärast enne katse kavan ­
datavat lõppu; näiteks suutmatus tarbida vett või toitu (vt üksikasja ­
likumaid andmeid humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhis ­
dokumendis (9)).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. KATSE PÕHIMÕTE  
Tuginedes protseduurile, mille kohaselt kasutatakse igal etapil mini ­
maalset arvu loomi, on katse põhimõtteks saada aine klassifitseeri ­
miseks piisavalt teavet katseaine ägeda mürgisuse kohta. Ainet 
manustatakse katseloomade rühmale suukaudselt ühe kindlaksmää ­
ratud doosina. Ainet katsetatakse etapiviisiliselt, igal etapil kasuta ­
takse kolme ühest soost looma (tavaliselt emaslooma). Ühendiga seotud suremuse puudumine või esinemine loomadel, kellele ühel 
etapil annustati ainet, määrab kindlaks järgmise etapi, s.t:
 
— lisakatseid ei ole vaja;  
— aine sama annus manustatakse veel kolmele loomale;  
— ainet manustatakse vastavalt vahetult järgmisele või eelmisele 
annusemäärale veel kolmele loomale.  
Katseprotseduuri üksikasju on kirjeldatud 1. lisas. Meetod võimaldab 
langetada otsuse seoses katseaine klassifitseerimisega ühte mürgisuse 
kategooriasse, mis on määratletud kindlaksmääratud LD  50 piirväär­
tuse põhjal.  
1.4. MEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Loomaliikide valik  
Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib kasutada ka näriliste teisi 
liike. Tavaliselt kasutatakse emasloomi (9). Selle põhjuseks on, et 
tavapäraseid LD  50 katseid käsitlevad kirjandusülevaated näitavad, et 
sugupoolte tundlikkuses on vähe erinevusi, kuid neil juhtudel, kui on erinevusi täheldatud, on emasloomad üldiselt veidi tundlikumad (11). Kui struktuurselt sarnaste kemikaalide toksikoloogilisi või toksikoki ­
neetilisi omadusi käsitlevatest andmetest nähtub, et isasloomad on 
tõenäoliselt tundlikumad, siis kasutatakse neid. Kui katse tehakse isasloomadega, tuleks esitada piisav põhjendus.
 
Kasutatakse noorte tervete täiskasvanud loomade enim kasutatavaid 
laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Iga loom 
peaks annustamise alustamisel olema 8–12 nädalat vana ning tema mass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % varem annuse saanud loomade keskmisest massist.
 
1.4.2.  Loomade pidamise ja toitmise tingimused  
Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22  o C (± 3  o C). Kuigi 
suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 
70 %, välja arvatud ruumi koristamise aja, peaks seda hoidma vahe ­
mikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tava ­
pärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Loomad 
võib grupeerida puuridesse annuse põhjal, kuid puuris olevate 
loomade arv ei tohiks takistada iga looma selget jälgimist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Loomade ettevalmistamine  
Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identi ­
fitseerimise jaoks ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise alustamist, et võimaldada neil kohaneda laboritin ­
gimustega.
 
1.4.4.  Annuste valmistamine  
Üldiselt manustatakse katseaineid kasutatavate annuste vahemikus 
konstantses mahus nii, et muutub annustatava valmistise kontsentrat ­
sioon. Kui uuritakse vedelat lõppsaadust või segu, võib lahjendamata katseaine kasutamine, s.t konstantse kontsentratsiooni juures, olla 
siiski olulisem nimetatud aine hilisemal riskianalüüsil, ja see on 
mõnede reguleerivate asutuste nõue. Kummalgi juhul ei tohi ületada manustamisel annuste suurimat mahtu. Vedeliku suurim ühekordselt manustatav maht sõltub katselooma suurusest. Näriliste puhul ei 
tohiks maht tavaliselt ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta: vesila ­
huste puhul võib siiski manustada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Annuse valmistise koostamiseks on soovitav võimaluse korral kasu ­
tada vesilahust/suspensiooni/emulsiooni, tähtsuse järjekorras oleks 
järjestus järgmine: lahus/suspensioon/emulsioon õlis (nt maisiõli) ja 
seejärel muudel kandeainetel põhinev lahus. Veest erinevate kandeai ­
nete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised omadused olema teada. Annused tuleb valmistada ette natuke aega enne manustamist, välja 
arvatud juhul, kui valmistise stabiilsus sellel ajavahemikul, mil seda 
kasutatakse, on teada ja näib aktsepteeritav.
 
1.5. PROTSEDUUR  
1.5.1.  Annuste manustamine  
Katseainet manustatakse ühekordse annusena söögitoru kaudu või 
sobiva intubeerimiskanüüli abil. Erandkorras, kui ühekordne annus 
ei ole võimalik, võib annust manustada väiksemates kogustes kuni 
24 tunni jooksul.  
Loomad peaksid enne doosi manustamist paastuma (nt rotte hoitakse 
söömata terve öö ja hiiri 3–4 tundi, üksnes vesi on saadaval). Paas ­
tumise järel loomi kaalutakse ja manustatakse katseainet. Pärast aine 
manustamist võib hoida rotte söömata veel 3–4 tundi ja hiiri 1–2 
tundi. Kui annust manustatakse osadena teatud ajavahemiku jooksul, võib sõltuvalt ajavahemiku pikkusest osutuda vajalikuks anda looma ­
dele toitu ja vett.
 
1.5.2.  Loomade arv ja annusemäärad  
Igal etapil kasutatakse kolme looma. Lähteannusena kasutatav annu ­
semäär valitakse üks neljast kindlast suurusest – 5, 50, 300 ja 2 000 
mg/kehamassi kg. Lähteannuse määr peaks olema sellise väärtusega, 
mis kutsub suurima tõenäosusega esile suremust mõnede loomade hulgas, kellele ainet manustati. 1. lisas toodud vooskeemid kirjel ­
davad protseduure, mida tuleks järgida iga lähteannuse puhul. Lisaks 
sellele antakse 4. lisas juhiseid EL süsteemi kohase klassifitseerimise 
kohta enne uue GHSi kasutuselevõttu.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Kui olemasolev teave kinnitab, et suremus on ebatõenäoline suurima 
algdoosi taseme juures (2 000 mg/kg kehamassi kohta), tuleks teha 
piirkatse. Kui puudub teave uuritava aine kohta, soovitatakse loomade heaolu tagamiseks kasutada algdoosina 300 mg/kg keha ­
massi kohta.
 
Katserühmadele annustamiste ajavahemik määratakse kindlaks 
mürgisustunnuste algushetke, kestuse ja raskuse abil. Järgmise 
annuse manustamist loomadele tuleb edasi lükata hetkeni, kuni 
juba annuse saanud loomade ellujäämine on kindel.  
Maksimaalset kindla annuse määra 5 000 mg/kg võidakse kasutada 
erandkorras ja ainult siis, kui see on põhjendatud konkreetsete normatiivsete vajadustega (vt 2. lisa). Loomade heaolu pärast ei ole soositud loomkatsete tegemisel GHS 5. kategooria (2 000 – 
5 000 mg/kg) annus ja seda tuleks kasutada üksnes siis, kui on 
eriti tõenäoline, et sellise katse tulemustel on otsene tähtsus inimeste ja loomade tervise või keskkonna kaitsmisel.
 
1.5.3.  Piirkatse  
Piirkatset kasutatakse peamiselt olukordades, kus eksperimentaatoril 
on teavet selle kohta, et katsematerjal ei ole tõenäoliselt mürgine, s.t selle mürgisus ületab üksnes normatiivseid piirannuseid. Teavet 
katsematerjali mürgisuse kohta võib saada samalaadseid uuritud 
ühendeid, segusid või tooteid käsitlevatest teadmistest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisosade olemust ja protsendimäära. Sellistel juhtudel, kui on vähe teavet mürgisuse kohta või see puudub 
üldse või kui katsematerjal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada 
põhikatse.
 
Piirkatse võidakse teha ühel annusemääral (2 000 mg/kg kehamassi 
kohta) kuue loomaga (kolm looma igal etapil). Erandkorras võib piirkatse teha ühel annusemääral (5 000 mg/kg) kolme loomaga (vt 2. lisa). Kui esineb katseainega seotud suremust, võib sooritada lisa ­
katseid astme võrra madalama annusemääraga.
 
1.6. VAATLUSED  
Loomi jälgitakse individuaalselt pärast annustamist vähemalt esimese 
30 minuti jooksul, perioodiliselt esimese 24 tunni jooksul, erilist 
tähelepanu pööratakse esimese nelja tunni jooksul ja seejärel iga 
päev kokku 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui loomad tuleb kõrvaldada uuringust ja surmata humaanselt loomade heaolu pärast või kui nad leitakse surnuna. Vaatluse kestust ei tuleks siiski 
jäigalt määratleda. See tuleks kindlaks määrata toksiliste reaktsioo ­
nide, nende algushetke ja taastusperioodi pikkuse põhjal ja seda võib seepärast vajaduse korral pikendada. Mürgisuse nähtude ilmumise ja kadumise aeg on tähtis, eriti siis, kui on tendents, et mürgisusnähud 
võivad ilmneda hilistumisega (12). Kõik vaatlused registreeritakse 
süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Lisavaatlused on vajalikud siis, kui loomadel on jätkuvalt mürgisuse 
tunnused. Vaatlused peaksid hõlmama muutusi nahal ja karvkattes, 
silmades ja limaskestades ning samuti muutusi hingamissüsteemis, vereringes, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomo ­
toorses tegevuses ja käitumises. Tähelepanu peaks olema suunatud 
värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja 
kooma jälgimisele. Arvesse tuleks võtta humaanseid lõpetamiskritee ­
riume käsitlevas juhisdokumendis (9) esitatud põhimõtteid ja kritee ­
riume. Suremas olevad loomad või loomad, kellel on tugev valu või 
tugeva kannatuse kestvad tunnused, tuleks surmata humaanselt. Kui 
loomad surmatakse humaansel viisil või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
 
1.6.1.  Kehamass  
Iga looma mass tuleks määrata kindlaks veidi enne katseaine manus ­
tamist ja seejärel vähemalt kord nädalas. Massi muutused tuleks arvutada ja protokollida. Katse lõpus ellu jäänud loomad kaalutakse ja siis surmatakse humaanselt.
 
1.6.2.  Patoloogia  
Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või 
kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagamiseks) lahatakse. Kõik üldpatoloogilised muutused tuleks iga looma puhul protokollida. 
Esialgse annustamise järel 24 või enam tundi elus püsinud loomade 
üldpatoloogiliste muutustega organeid võidakse samuti uurida mikro ­
skoopiliselt, kuna see võib anda kasulikku teavet.
 
2. ANDMED  
Andmed esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleb kõik 
andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates ära iga katse ­
rühma puhul osalevate loomade arvu, mürgisusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnud või humaansetel põhjustel surmatud 
loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise 
kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahangul tehtud leiud.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.  
Katseaine:  
— füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised 
omadused (kaasa arvatud isomeerumine);  
— identifitseerimiseks vajalikud andmed, kaasa arvatud CASi 
number.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/tüved;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— loomade mikrobioloogiline seisund, kui see on teada;  
— loomade arv, vanus ja sugu (sh vajaduse korral põhjendus isas ­
loomade kasutamise kohta emasloomade asemel);  
— päritolu, pidamistingimused, toitumine jne.  
Katsetingimused:  
— katseaine valmistamise üksikasjad, sh üksikasjad manustatava 
aine füüsilise oleku kohta;  
— katseaine manustamise üksikasjad, sh annuste mahud ja annusta ­
mise aeg;  
— üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, 
vee allikas);  
— põhjendus lähteannuse valikuks.  
Tulemused:  
— tabelid iga looma (st loomad, kellel on mürgisustunnused, kaasa 
arvatud suremus, mõjude laad, ägedus ja kestus) reageerimise andmete ja annusemäärade kohta;
 
— tabelid kehamassi ja kehamassi muutuste kohta;  
— iga looma mass annustamispäeval, seejärel nädalaste intervalli ­
dega ja surma- või surmamishetkel;  
— surma kuupäev ja kellaaeg juhul, kui loom sureb enne kavan ­
datud surmamist;  
— iga looma korral mürgisusnähtude algusaeg ja nende võimalik 
taandumine;  
— iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on 
olemas.  
Tulemuste arutlus ja tõlgendamine.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspec ­
tives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., 
Suppl. 31, 86.  
2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341.  
3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610.
 
4) Diener W., Mischke U, Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734.  
5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129–134.  
6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – 
An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method 
(Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670.  
8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment N 19.
 
10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28
 th Joint Meeting 
of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/ ­
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14- no-24-no-0,FF.html].
 
11) Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel 
K.A., Walker A.P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer 
J.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and 
Down, Conventional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231.  
12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxi ­
city and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxico ­
logy. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., 
New York, USA.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
1. LISA  
PROTSEDUUR, MIDA JÄRGITAKSE IGA LÄHTEANNUSE PUHUL  
ÜLDISED MÄRKUSED  
Selles lisas toodud vastavad katsekavad selgitavad protseduuri, mida tuleb järgida 
iga lähteannuse puhul.  
— 1a lisa: lähteannus on 5 mg kg kehamassi kohta  
— 1b lisa: lähteannus on 50 mg kg kehamassi kohta  
— 1c lisa: lähteannus on 300 mg kg kehamassi kohta  
— 1d lisa: lähteannus on 2 000 mg kg kehamassi kohta  
Humaanselt surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katseprot ­
seduuris vastavalt nooltega näidatud suunale.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
1a LISA  
KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 5 MG/KEHAMASSI KG KORRAL

 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
1b LISA  
KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 50 MG/KEHAMASSI KG KORRAL

 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
1C Lisa  
KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 300 MG/KEHAMASSI KG KORRAL

 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
1d LISA  
KATSEPROTSEDUUR LÄHTEANNUSE 2 000 MG/KEHAMASSI KG KORRAL

 2. LISA  
KLASSIFITSEERIMISKRITEERIUMID SELLISTE KATSEAINETE 
KORRAL, MILLE OODATAVAD LD  50 VÄÄRTUSED ÜLETAVAD 
2 000 MG/KG JA MIDA EI OLE VAJA TESTIDA  
Ohukategooriat 5 käsitlevad kriteeriumid on ette nähtud selliste katseainete iden ­
tifitseerimiseks, mille korral on ägeda mürgisuse oht suhteliselt väike, kuid mis 
teatud tingimustel võivad ohustada tundlikke populatsioone. Nimetatud ainete korral on LD
 50 väärtused oodatavalt vahemikus 2 000–5 000 mg/kg suu- või 
nahakaudsel manustamisel või samaväärsete annustena muude manustamisviiside 
puhul. Katseaine võidakse klassifitseerida ohukategooriasse, mis on määratletud 
tingimusega: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (GHS 5. kategooria), järgmistel 
juhtudel:  
a) kui on suunatud nimetatud kategooriasse lisades 1a–1d toodud katsete tege ­
mise mis tahes katsekava poolt, mis põhineb surmajuhtumitel;  
b) kui on juba olemas usaldusväärsed tõendid, mis näitavad, et LD  50 väärtus 
asub 5. kategooriale vastavas vahemikus, või muud loomauuringud või toksi ­
lised mõjud inimestel osutavad sellele, et ainel on vahetu mõju inimese tervi ­
sele; 
c) andmete ekstrapoleerimise, hindamise või mõõtmise alusel, kui määramine 
ohtlikumasse kategooriasse ei ole põhjendatud, ja  
— usaldusväärse teabe olemasolul oluliste toksiliste mõjude kohta inimestele 
või 
— kui täheldatakse suremust suukaudse manustamisega katsetes kuni 4. kate ­
gooriale vastavate väärtusteni või  
— kui eksperdiarvamus kinnitab mürgisuse olulisi kliinilisi tunnuseid katse ­
tamisel kuni 4. kategooriale vastavate väärtusteni, välja arvatud kõhulah ­
tisus, piloerektsioon või hoolitsemata välimus, või  
— kui eksperdiarvamus kinnitab usaldusväärset teavet võimalike märkimis ­
väärsete ägedate mõjude kohta muude loomauuringute põhjal.  
KATSETAMINE 2 000 MG/KG ÜLETAVATE ANNUSTEGA  
Tunnistades vajadust kaitsta loomade heaolu, ei kiideta heaks loomkatsete tege ­
mist 5. kategooriale vastavas vahemikus (5 000 mg/kg annustega) ja seda kasu ­
tatakse üksnes siis, kui on suur tõenäosus, et sellise katse tulemused oleks otse ­
selt seotud loomade või inimeste tervise kaitsega (10). Lisakatseid kõrgemate 
annusemääradega ei ole vaja teha.  
Kui katse tegemine annusega 5 000 mg/kg on nõutav, vajatakse vaid ühte etappi 
(st kolme looma). Kui esimese annuse saanud loom sureb, jätkatakse 2 000 mg/kg doosi manustamist vastavalt 1. lisas toodud vooskeemidele. Kui esimene 
loom jääb ellu, manustatakse doos ka kahele järgmisele loomale. Kui sureb vaid 
üks kolmest loomast, siis ületab LD
 50 väärtus eeldatavalt 5 000 mg/kg. Kui 
mõlemad loomad surevad, jätkatakse manustamist annusega 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
Lisa 3  
KATSEMEETOD B.1 b: EÜ süsteemi kohased klassifitseerimisjuhised, mida kasutatakse 
üleminekuperioodil kuni globaalselt harmoneeritud süsteemi (GHS) täieliku rakendamiseni 
(viite (8) alusel)
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 403 (2009) 
(1). Esialgne sissehingamisel avalduvat ägedat mürgisust käsitlev katseju ­
hend nr 403 võeti vastu 1981. aastal. Käesolev läbivaadatud katsemeetod 
B.2 (mis on samaväärne katsejuhendi nr 403 läbivaadatud versiooniga) on 
koostatud suurema paindlikkuse tagamiseks, loomade kasutamise vähenda ­
miseks ja regulatiivsete vajaduste täitmiseks. Läbivaadatud katsemeetod hõlmab kahte järgmist uuringu tüüpi: tavaline LC
 50 määramise eeskiri ja 
C × t (kontsentratsioon × aeg) määramise eeskiri. Käesoleva katsemeetodi 
peamised omadused on järgmised: meetod võimaldab määrata mõju sõltu ­
vust kontsentratsioonist alates mitteletaalsest kuni letaalse mõjuni, et leida letaalne mediaankontsentratsioon (LC
 50 ), mitteletaalse kontsentratsiooni lävi ­
väärtus (näiteks LC  01 ) ja kõvera tõus, ning määrata kindlaks mõju võimalik 
sõltuvus soost. C × t määramise eeskirja tuleks kasutada konkreetse regu ­
latiivse või teadusliku vajaduse puhul, kui on vaja teha mitmesuguse kestu ­
sega loomkatsed, näiteks hädaolukorrale reageerimise kavandamiseks (nt 
akuutse kokkupuute näidistasemete ( Acute Exposure Guideline Levels , 
AEGL) leidmine, hädaolukorras toimimise juhendite ( Emergency Response 
Planning Guidelines , ERPG) kavandamine või akuutse kokkupuute läviväär ­
tuste ( Acute Exposure Threshold Levels , AETL) leidmine) või maakasutuse 
planeerimiseks.  
2. Käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemise ja tõlgendamise juhendid on 
esitatud sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse katse juhenddokumendis (juhenddokument nr 39) (2).
 
3. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle 
peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 39 (2).  
4. Käesolev katsemeetod võimaldab iseloomustada uuritavat kemikaali, hinnata 
kvantitatiivselt riski ning määruse (EÜ) nr 1272/2008 (3) kohaselt järjestada 
ja klassifitseerida uuritavat kemikaali. Juhenddokumendis nr 39 (2) on 
esitatud juhendid ägeda mürgisuse uurimiseks sobiva katsemeetodi valimi ­
seks. Kui soovitakse saada ainult klassifitseerimiseks ja märgistamiseks 
vajalikku teavet, soovitatakse üldiselt kasutada käesoleva lisa peatükis 
B.52 esitatud meetodit (4) (vt juhenddokument nr 39 (2)). Käesolev katse ­
meetod B.2 ei ole spetsiaalselt ette nähtud erimaterjalide, nagu vähe lahus ­
tuvad isomeetrilised või kiudmaterjalid või toodetud nanomaterjalid, uurimi ­
seks.  
LÄHTEKAALUTLUSED  
5. Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi 
vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, sh tehtud 
uuringud (näiteks käesoleva lisa peatükk B.52 (4)), mille andmete abil 
oleks võimalik täiendava katse tegemisest loobuda, et minimeerida loomade kasutust. Teave, mis võib aidata valida katseks kõige sobivama liigi, liini, soo, kokkupuuteviisi ja sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järg ­
mist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemi ­
lised omadused; mis tahes  in vitro  või in vivo  mürgisuse katsete tulemused; 
eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; ole ­
masolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) 
andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta 
(vt juhenddokument nr 39 (2)).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Võimaluste piires tuleks vältida söövitava ja/või ärritava kemikaali katseta ­
mist kontsentratsioonil, mis eeldatavasti põhjustab suurt valu ja/või kanna ­
tusi. Söövitava/ärritava mõju võimalust tuleks hinnata eksperdihindamise abil, kasutades selliseid tõendeid nagu inimeste kogemused ja varasemad loomkatsete andmed (näiteks korduvdoosi uuringutest, mis on tehtud mitte ­
söövitava/-ärritava kontsentratsiooniga), olemasolevad  in vitro  andmed 
(näiteks käesoleva lisa peatükid B.40 (5) ja B.40a (6) või OECD katseju ­
hend nr 435 (7)), pH-väärtused, teave samalaadsete ainete kohta või iga muu asjakohane teave, et hinnata, kas täiendavast katsetamisest on võimalik 
loobuda. Konkreetse regulatiivse vajaduse jaoks (näiteks hädaolukorras 
tegutsemise kava koostamiseks) võidakse käesolevat katsemeetodit kasutada, et viia loomad kokkupuutesse kõnealuste materjalidega, kuna sellega saab uuringu juht või peamine uurija kontrollida sihtkontsentratsioonide valimise 
õigsust. Sihtkontsentratsioon ei tohiks siiski põhjustada tugevat ärritavat/söö ­
vitavat mõju, kuid peaks olema piisav, et pikendada kontsentratsiooni-mõju kõver tasemeni, millega saavutatakse katse regulatiivne ja teaduslik eesmärk. Kõnealused kontsentratsioonid tuleks valida juhtumipõhiselt ja seda valikut 
tuleks põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)).
 
KATSE PÕHIMÕTE  
7. Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.2 on koostatud selleks, et saada piisa ­
valt teavet uuritava kemikaali ägeda mürgisuse kohta, et kemikaal klassifit ­
seerida ja saada letaalsuse andmed (näiteks LC  50, LC 01 ja kõvera tõus) ühe 
või mõlema soo kohta, mida vajatakse riski kvantitatiivseks hindamiseks. Käesolev katsemeetod hõlmab kahte meetodit. Esimene meetod on tavaline määramiseeskiri, mille puhul loomade rühmad viiakse kokkupuutesse piir ­
kontsentratsiooniga (piirsisalduskatse) või astmeliselt mitme eri kontsentrat ­
siooniga eelnevalt kindlaks määratud aja jooksul, mis tavaliselt on neli tundi. Konkreetse regulatiivse eesmärgi jaoks võib kasutada muid kokku ­
puute ajavahemikke. Teine meetod on C × t määramise eeskiri, mille puhul 
loomade rühmad viiakse kokkupuutesse ühe (piir)kontsentratsiooniga või 
mitme eri kontsentratsiooniga mitme ajavahemiku jooksul.
 
8. Suremas loomad või loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel 
ilmnevad raskete ja kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil surmata; selliseid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse sama ­
moodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille põhjal tehakse 
suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise otsus, ja juhised prog ­
noositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas OECD juhenddokumendis nr 19 (8).
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
9. Tuleks kasutada katseloomade enim kasutatavate laboriliinide noori terveid 
täiskasvanud isendeid. Eelistatav loomaliik on rott; muude liikide kasutamise korral tuleks seda põhjendada.
 
Loomade ettevalmistamine  
10. Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kokkupuute päeval peaksid 
loomad olema 8 kuni 12 nädala vanused noored täiskasvanud, kelle keha ­
mass ei tohiks erineda rohkem kui ±20 % selliste samas vanuses ja samast soost loomade keskmisest kehamassist, keda kasutati varasemates kemikaa ­
liga kokkupuute katsetes. Loomad valitakse juhuslikult ja märgistatakse 
individuaalselt. Loomi hoitakse oma puuris vähemalt viis päeva enne katse algust, et võimaldada neil laboritingimustega kohaneda. Loomad peaksid olema enne katset ka katseseadmetega lühikese aja vältel koha ­
nenud, kuna sel viisil vähendatakse uude keskkonda viimisest põhjustatud 
stressi.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Pidamistingimused  
11. Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist 
õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi olla võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet 
tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmita ­
tuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitle ­
mise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib 
olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjustada 
loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsioloo ­
gilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise 
minutimahtu. Kui kättesaadavad on üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, siis ei ole eelnev hoiutoruga koha ­
nemine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokku puutuvaid loomi tuleks 
kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli 
filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja serti ­
fitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi 
pimedust.
 
Inhalatsioonikambrid  
12. Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi ja 
katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab 
ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina kaudu toimuvat 
kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaerosooli ja aerosooliks kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda 
tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasutamise korral 
keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade kogumaht ületada 5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudujääke on kirjeldatud juhend ­
dokumendis nr 39 (2).
 
KOKKUPUUTETINGIMUSED  
Kontsentratsioonide manustamine  
13. Kokkupuude ainult nina kaudu võib rottidel kesta kuni kuus tundi. Kui 
hiirtel kasutatakse ainult nina kaudu kokkupuudet, siis ei tohiks kokkupuude tavaliselt ületada nelja tundi. Kui vajatakse pikema kestusega uuringuid, siis 
tuleks seda põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kogukehakambris 
aerosoolidega kokku puutuvad loomad tuleks eraldi paigutada, et vältida puurikaaslaste karvkatte korrastamise tõttu uuritava kemikaali suukaudset manustamist. Kokkupuute ajal ei tohiks loomi sööta. Loomadele võib 
kogu keha kaudu toimuva kokkupuute ajal vett anda.
 
14. Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, 
aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava 
kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitse ­
mise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuri ­
tavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ette ­
vaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Osakeste jaotus suuruse järgi  
15. Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti 
aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hinga ­
misteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks 
soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaa ­
miline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–4 μm ning geomeetriline stan ­
dardhälve ( σ g ) on 1,5–3,0 (2, 9, 10). Kõnealuse standardi järgimiseks tuleks 
teha mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks 
esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed võivad olla kõne ­
alusest normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed, kiud ja hügros ­
koopsed materjalid (mille suurus hingamisteede niiskes keskkonnas 
suureneb) võivad olla suuremad.  
Uuritava kemikaali preparaat kandeaines  
16. Selleks et tagada uuritava kemikaali vajalik kontsentratsioon õhus ja 
osakeste suurus, võib olla vaja kasutada kandeainet. Eelistatult tuleks kasu ­
tada vett. Aineosakesi võib töödelda mehaaniliselt, et saavutada osakeste soovitud suurusjaotus, kuid tuleks olla hoolikas, et uuritavat kemikaali mitte lagundada ega muuta. Kui mehaaniline töötlus (näiteks tugeval jahva ­
tamisel hõõrdumisest tekkinud kõrge temperatuur) võib olla uuritava kemi ­
kaali koostist muutnud, siis tuleks uuritava kemikaali koostist analüüsiga kontrollida. Tuleks olla hoolikas, et vältida uuritava kemikaali saastamist. 
Ei ole vaja katsetada raskesti peenestuvat teralist materjali, mis on sihipära ­
selt valmistatud nii, et seda ei saa sisse hingata. Materjali hõõrumisega tuleks tõendada, et teralise materjali käsitsemisel ei teki sissehingatavaid osakesi. Kui hõõrumiskatsel tekib sissehingatavaid osakesi, tuleks teha sisse ­
hingamisel mürgisust näitav katse.
 
Loomade kontrollrühm  
17. Samaaegne negatiivne (puhtas õhus peetavate) loomade kontrollrühm ei ole 
vajalik. Kui katsekeskkonna loomiseks kasutatakse muud kandeainet kui 
vesi, siis tuleks kandeaine kontrollrühma kasutada ainult juhul, kui vara ­
semad sissehingamisel avalduva mürgisuse andmed ei ole kättesaadavad. 
Kui kandeaines sisalduva uuritava kemikaali mürgisuse uuringuga mürgisust 
ei leita, siis võib järeldada, et kandeaine ei ole katsetatud kontsentratsioonil mürgine, seega ei ole kandeaine kontrollrühm vajalik.
 
KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE  
Kambri õhuvarustus  
18. Igas kokkupuutekatses tuleks kambri õhuvarustust hoolikalt kontrollida, 
pidevalt seirata ning andmed vähemalt kord tunnis registreerida. Keskkonnas oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (või selle stabiilsuse) seire on kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab 
endast kaudset vahendit keskkonna tekitamise kõigi asjakohaste dünaami ­
liste parameetrite kontrollimiseks. Eraldi tuleks jälgida, et ainult nina kaudu kokkupuute uurimise kambris ei hingataks väljahingatud õhku uuesti sisse, kuna kokkupuutesüsteemi õhuvarustus ei ole piisav uuritavat kemikaali 
sisaldava õhu dünaamilise voo tagamiseks. On olemas metoodika, mille 
abil saab tõendada, et valitud katsetingimustes ei hingata väljahingatud õhku uuesti sisse (2, 11). Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisisaldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõne ­
aluseid nõudeid ei ole võimalik täita, siis tuleks hapniku- ja süsinikdioksii ­
disisaldust mõõta.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus  
19. Kambri temperatuuri tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamist ­
sooni suhtelist õhuniiskust tuleks nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu kokkupuute katsetes seirata ja registreerida vähemalt kolm korda kuni nelja ­
tunnise katse jooksul ning iga tund lühema katse puhul. Suhtelist õhuniis ­
kust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju tõttu (näiteks veepõhise segu uurimisel) ei pruugi see olla saavutatav või mõõdetav.
 
Uuritav kemikaal: nimikontsentratsioon  
20. Kui see on võimalik, siis tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon 
alati arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda 
lisatud uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku 
kontsentratsiooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning 
seega saab seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avasta ­
miseks.
 
Uuritav kemikaal: tegelik kontsentratsioon  
21. Tegelik kontsentratsioon on inhalatsioonikambris loomade hingamistsoonist 
võetud proovist määratud uuritava kemikaali kontsentratsioon. Tegelikke 
kontsentratsioone on võimalik määrata spetsiifiliste meetodite abil (näiteks 
otsene proovivõtt, adsorptsiooni- või keemilise reaktsiooni meetodid ning järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimeetriline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud 
ainult ühest koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vede ­
liku aerosooli korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud konkreetse kemikaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulbe ­
raerosooli kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada 
gravimeetrilist analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus oleva 
materjali koostis sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuritava kemikaali (eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. 
Aerosoolainete puhul, mis võivad aurustuda või sublimeeruda, tuleks 
näidata, et valitud meetodiga koguti kõiki faase. Katseprotokollis tuleks esitada siht-, nimi- ja tegelikud kontsentratsioonid, kuid letaalse kontsentrat ­
siooni arvutamiseks kasutatakse statistilises analüüsis ainult tegelikke kont ­
sentratsioone.
 
22. Võimaluse korral tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte partiid ning uuri ­
tavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib selle puhtus, homo ­
geensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks uuritavat kemikaali, sh 
selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, tuleb keemili ­
selt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning määrata nende kogused. Seda on võimalik tõendada muu hulgas järgmiste andmete alusel: retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, molekulmass massispektroskoopia 
või gaaskromatograafia analüüsidest või muud hinnangud. Kuigi uurimis ­
labor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemilise määratlemise eest, võib uurimislaboril olla mõttekas kinnitada tellija iseloomustust vähemalt piiratud ulatuses (näiteks värv, füüsikalised omadused jne).
 
23. Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna ja seiratakse 
pidevalt ja/või pisteliselt, olenevalt analüüsimeetodist. Kui kasutatakse piste ­
list proovivõttu, tuleks neljatunnise uuringu vältel võtta kambrikeskkonnast proove vähemalt kaks korda. Kui see ei ole piiratud õhuvarustuse või väikeste kontsentratsioonide tõttu võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi 
kohta võtta ühe proovi. Kui proovide analüüsimisel saadakse oluliselt 
erinevad tulemused, tuleks järgmiste uuritavate kontsentratsioonide puhul
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
võtta kokkupuute kohta neli proovi. Kambrist võetud proovide üksikud 
kontsentratsioonid ei tohiks keskmisest kontsentratsioonist erineda rohkem 
kui ±10 % gaaside ja aurude puhul või ±20 % vedelik- või pulberaerosoo ­
lide korral. Tuleks arvutada kambri tasakaaluoleku saavutamise aeg (t  95 ) ja 
see registreerida. Kokkupuute kestus on aeg, mille vältel lisatakse uuritavat 
kemikaali ja seejuures arvestatakse t  95 saavutamiseks vajalikku ajavahe ­
mikku. Juhendid t  95 hindamise kohta on esitatud juhenddokumendis 
nr 39 (2).  
24. Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest 
(näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda inhalatsioonikambris erinevalt, nii et tuleks valida vähemalt üks uuritav 
aine (mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, 
iga faasi (gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, siis tuleks kirja panna segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toime ­
aine või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisa ­
teave tegelike kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).
 
Uuritav kemikaal: osakeste suurusjaotus  
25. Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt kaks korda 
iga neljatunnise kokkupuute ajal, kasutades kaskaadimpaktorit või alterna ­
tiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on 
võimalik tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud 
tulemuste võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alterna ­
tiivset seadet. Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada teist seadet, näiteks gravimeetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veen ­
duda peamise seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu 
saadud massikontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kui uuringu varajases etapis on võimalik tõendada võrdväärsust, 
siis võib loobuda täiendavatest kinnitavatest mõõtmistest. Loomade heaolu 
silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik kokkupuudet korrata. Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on võimalik, et auru 
kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool või kui auru keskkonnas tuvas ­
tatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside seguga (vt punkt 15).
 
KATSE KÄIK  
26. Allpool on kirjeldatud kahte järgmist uuringutüüpi: tavaline määramiseeskiri 
ja C × t määramise eeskiri. Mõlemad eeskirjad võivad hõlmata eeluuringut, 
põhiuuringut ja/või piirsisalduskatset (tavaline määramiseeskiri) või katseta ­
mist piirkontsentratsiooni juures (C × t). Kui mõju on teadaolevalt suurem ühele soole, võib uuringu juht otsustada, et uuringus kasutatakse ainult tundlikuma soo isendeid. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasu ­
tatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust 
kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Enne alustamist tuleks loomade kasutamise minimeerimiseks võtta arvesse kõik kättesaadavad andmed. Näiteks käesoleva lisa peatüki B.52 (4) kohaselt 
saadud andmed võivad muuta eeluuringu tarbetuks ja näidata, kas mõju 
sõltub looma soost (vt juhenddokument nr 39 (2)).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
TAVALINE MÄÄRAMISEESKIRI  
Üldised põhimõtted: tavaline määramiseeskiri  
27. Tavalise uuringu puhul viiakse loomarühmad kokkupuutesse uuritava kemi ­
kaaliga kindla ajavahemiku jooksul (tavaliselt neli tundi) kas ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldavas või kogukehakambris. Loomad viiakse kokkupuutesse kas piirkontsentratsiooniga (piirsisalduskatse) või vähemalt 
kolme kontsentratsiooniga astmelises protseduuris (põhiuuring). Põhiuurin ­
gule võib eelneda eeluuring, v.a juhul, kui uuritava kemikaali kohta on mingil määral teavet juba olemas, näiteks eelnevalt tehtud uuring B.52 (vt juhenddokument nr 39 (2)).
 
Eeluuring: tavaline määramiseeskiri  
28. Eeluuringut kasutatakse uuritava kemikaali mõju prognoosimiseks, mõju 
sooliste erinevuste kindlaksmääramiseks ning põhiuuringu või piirsisaldus ­
katse jaoks kokkupuute kontsentratsioonide valimisel abistamiseks. Eeluu ­
ringu kontsentratsioonide valimisel tuleks kasutada kogu kättesaadavat teavet, sh olemasolevaid (kvantitatiivse) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuse 
((Q)SAR) andmeid ja andmeid samalaadsete kemikaalide kohta. Iga kont ­
sentratsiooniga ei tohiks puutuda kokku rohkem kui kolm isast ja kolm emast isendit (soolise erinevuse kindlaksmääramiseks võidakse vajada kolme looma kummagi soo kohta). Eeluuringus võib kasutada ühte kontsen ­
tratsiooni, aga vajaduse korral võib kasutada ka rohkem kui ühte kontsen ­
tratsiooni. Eeluuringus ei tuleks katsetada nii palju loomi ja kontsentrat ­
sioone, et see sarnaneks juba põhiuuringuga. Eeluuringu asemel võib kasu ­
tada varem tehtud uuringut B.52 (4) (vt juhenddokument nr 39 (2)).
 
Piirsisalduskatse: tavaline määramiseeskiri  
29. Piirsisalduskatset kasutatakse, kui uuritav kemikaal ei ole teadaolevalt või 
eeldatavalt mürgine, s.o mürgistus tekib ainult regulatiivse piirkontsentrat ­
siooni ületamise puhul. Piirsisalduskatses viiakse uuritava kemikaaliga piir ­
kontsentratsiooni juures kokkupuutesse üks kolmest isasest ja kolmest emasest koosnev loomarühm. Teavet uuritava kemikaali mürgisuse kohta võib saada varem katsetatud samalaadseid kemikaale käsitlevatest andmetest, 
võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisainete keemilist laadi ja sisal ­
dust. Kui teavet mürgisuse kohta on vähe või ei ole üldse või kui uuritav kemikaal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada põhikatse.
 
30. Piirkontsentratsiooni valimine sõltub tavaliselt regulatiivsetest nõuetest. Kui 
kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaasi, auru ja aerosooli piir ­
kontsentratsioon vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l (või suurim saavu ­
tatav kontsentratsioon) (3). Mõne uuritava kemikaali, eelkõige auru või aerosooli piirkontsentratsiooni saavutamine võib olla tehniliselt keeruline. 
Aerosooli katsetamisel peaks olema peamine eesmärk saavutada sissehinga ­
miseks sobiv osakeste suurus (MMAD 1–4 μm). See on enamiku uuritavate 
kemikaalide puhul võimalik kontsentratsioonil 2 mg/l. Aerosooli katsetamist rohkem kui 2 mg/l juures tuleks proovida ainult juhul, kui on võimalik 
saavutada sissehingamiseks sobiv osakeste suurus (vt juhenddokument 
nr 39 (2)). Määruses (EÜ) nr 1272/2008 ei soovitata loomade heaolu kaalut ­
lustel kasutada katses piirkontsentratsiooni ületavat kontsentratsiooni (3). Piirkontsentratsiooni kasutamist tuleks kaaluda ainult siis, kui on suur 
tõenäosus, et kõnealuse katse tulemustest võib otseselt sõltuda inimeste 
tervise kaitse (3), ja seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Plahvatusoht ­
liku uuritava kemikaali puhul tuleks olla hoolikas, et vältida plahvatust võimaldavaid tingimusi. Loomade tarbetu kasutamise vältimiseks tuleks 
enne piirsisalduskatset teha proovikatse ilma loomadeta, et tagada piirsisal ­
duskatse jaoks vajalike kambritingimuste saavutamine.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Kui piirkontsentratsiooni juures täheldatakse, et loomad surevad või on 
suremas, siis võib piirsisalduskatse tulemusi kasutada eeluuringuna muudel 
kontsentratsioonidel edasiseks katsetamiseks (vt põhiuuring). Kui uuritava kemikaali füüsikalised või keemilised omadused muudavad piirkontsentrat ­
siooni saavutamise võimatuks, siis tuleks katsetada suurimat saavutatavat 
kontsentratsiooni. Kui suurim saavutatav kontsentratsioon põhjustab alla 
50 % suremuse, siis ei ole edasine katsetamine vajalik. Kui piirkontsentrat ­
siooni ei ole võimalik saavutada, siis tuleks katseprotokollis esitada selgitus ja täiendavad andmed. Kui auruga saavutatav suurim kontsentratsioon ei ole 
mürgine, siis võib olla vajalik lisada uuritavat kemikaali vedelikaerosoolina.
 
Põhiuuring: tavaline määramiseeskiri  
32. Põhiuuring tehakse tavaliselt vähemalt kolme kontsentratsiooniga, kasutades 
viit isas- ja viit emaslooma (või kui on teada, kummast soost isendid on 
tundlikumad, siis viit sellest soost looma) igal kontsentratsioonil. Usaldus ­
väärse statistilise analüüsi tagamiseks tuleks kasutada piisavalt suuri kont ­
sentratsioone. Ajavahemik katserühmade kokkupuutekatsete vahel määra ­
takse kindlaks mürgistusnähtude alguse, kestuse ja raskuse järgi. Loomade 
kokkupuude järgmise kontsentratsiooniga tuleks edasi lükata seni, kuni eelmises katses kasutatud loomade ellujäämises võib olla mõistlikkuse piires veendunud. See võimaldab uuringu juhil kohandada järgmise kokkupuute ­
rühma sihtkontsentratsiooni. Kuna katses kasutatakse keerukat tehnoloogiat, 
ei pruugi see inhalatsiooniuuringute puhul alati olla praktiline. Sellisel juhul peaks loomade kokkupuude järgmise kontsentratsiooniga põhinema vara ­
semal kogemusel ja teaduslikul hinnangul. Segu katsetamisel tuleks tugineda 
juhenddokumendile nr 39 (2).
 
C × T (KONTSENTRATSIOON × AEG) MÄÄRAMISE EESKIRI  
Üldised põhimõtted: C × t määramise eeskiri  
33. Sissehingamisel avalduva mürgisuse hindamisel võidakse tavalise määrami ­
seeskirja alternatiivina kaaluda astmelist C × t määramise eeskirja (12, 13, 
14). Selle lähenemisviisi puhul võivad loomad puutuda uuritava kemikaaliga kokku mitmel kontsentratsioonil ja mitme ajavahemiku vältel. Kõik katsed tehakse ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldavas kambris (kogukeha ­
kambrid ei ole selle määramiseeskirja jaoks praktilised). Seda eeskirja on 
kirjeldatud 1. liite toimimisskeemiga. Simulatsioonianalüüsiga on näidatud, et tavaline määramiseeskiri ja C × t määramise eeskiri võivad mõlemad anda kindlaid LC
 50 väärtusi, kuid C × t määramise eeskiri annab tavaliselt kind ­
lamaid LC  01 ja LC  10 väärtusi (15).  
34. Simulatsioonianalüüs on näidanud, et C × t intervalli kohta kahe looma 
kasutamine (üks loom kummastki soost mõlema soo kasutamise korral või kaks looma sellest soost, kummale on suurem mõju) võib tavaliselt olla piisav põhiuuringus nelja kontsentratsiooni ja viie kokkupuute ajavahemiku 
katsetamise korral. Mõnel juhul võib uuringu juht otsustada kasutada 
kummagi soo puhul kahte rotti C × t intervalli kohta (15). Kummastki soost kahe looma kasutamine kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta võib vähendada andmete kallutatust ja hinnangute hajumist, suurendada ennus ­
tuste täpsust ja hälvete kirjeldatavust usaldusvahemikuga. Kui andmete 
kooskõla ei ole hindamiseks piisav (kui kasutatakse ühte looma kummastki soost või kahte looma soost, millele on suurem mõju), siis võib piisata viienda kokkupuutekontsentratsiooni kasutamisest. Täiendavad juhendid C 
× t uuringus kasutatavate loomade arvu ja kontsentratsioonide kohta on 
juhenddokumendis nr 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Eeluuring: C × t määramise eeskiri  
35. Uuritava kemikaali mõju hindamiseks ja põhiuuringu kokkupuutekontsen ­
tratsioonide valimiseks kasutatakse eeluuringut. Vajalik võib olla eeluuring, milles kasutatakse kuni kolme looma soo ja kontsentratsiooni kohta 
(vt lähemalt juhenddokumendi nr 39 (2) III liide), et valida põhiuuringu 
jaoks sobiv algkontsentratsioon ja minimeerida kasutatavate loomade arvu. Soolise erinevuse kindlaksmääramiseks võib olla vajalik kasutada kolme looma soo kohta. Need loomad peaksid puutuma ainega kokku katse ühe 
ajavahemiku jooksul, tavaliselt 240 minutit. Asjakohaste katsekeskkondade 
loomise võimalikkust tuleks hinnata ilma loomadeta tehtavate tehniliste proovikatsete ajal. Eeluuringu tegemine ei ole tavaliselt vajalik, kui sure ­
muse andmed on kättesaadavad B.52 kohasest uuringust (4). B.2 kohase 
uuringu lähtesihtkontsentratsiooni valides peaks uuringu juht arvesse võtma kõiki olemasolevaid B.52 kohastes uuringutes (4) mõlema soo ja kõigi katsetatud kontsentratsioonide kohta saadud suremuse andmeid 
(vt juhenddokument nr 39 (2)).
 
Lähtekontsentratsioon: C × t määramise eeskiri  
36. Lähtekontsentratsioon (I kokkupuude) (1. liide) on kas piirkontsentratsioon 
või uuringu juhi poolt eeluuringu alusel valitud kontsentratsioon. Kahest 
loomast (üks kummagi soo kohta) koosnevad rühmad viiakse kokkupuutesse kõnealuse kontsentratsiooniga mitme ajavahemiku vältel (näiteks 15, 30, 60, 120 või 240 minutit), mis teeb kokku kümme looma (I kokkupuude) (1. 
liide).
 
37. Piirkontsentratsiooni valimine sõltub tavaliselt regulatiivsetest nõuetest. Kui 
kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaaside, aurude ja aerosoolide piirkontsentratsioonid vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l (või suurim saavutatav kontsentratsioon) (3). Mõne uuritava kemikaali, eelkõige auru või 
aerosooli piirkontsentratsiooni tekitamine võib olla tehniliselt keeruline. 
Aerosooli katsetamisel peaks eesmärk olema saavutada sissehingamiseks sobiv osakeste suurus (st MMAD 1–4 μm) piirkontsentratsioonil 2 mg/l. 
See on enamiku uuritavate kemikaalide puhul võimalik. Aerosooli katseta ­
mist rohkem kui 2 mg/l juures tuleks proovida ainult juhul, kui sissehinga ­
miseks sobiv osakeste suurus on võimalik saavutada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Määruses (EÜ) nr 1272/2008 ei soovitata loomade heaolu kaalut ­
lustel piirkontsentratsiooni ületava kontsentratsiooniga katsetamist (3). Piir ­
kontsentratsiooni ületava kontsentratsiooni katsetamist tuleks kaaluda ainult 
juhul, kui on suur tõenäosus, et kõnealuse katse tulemustel on otsene mõju inimeste tervise kaitsele (3), ja katseprotokollis tuleks seda põhjendada. Plahvatusohtliku uuritava kemikaali puhul tuleks olla hoolikas, et vältida 
plahvatust võimaldavaid tingimusi. Loomade ebavajaliku kasutamise välti ­
miseks tuleks enne katset lähtekontsentratsiooniga teha proovikatse ilma loomadeta, et tagada kõnealuse kontsentratsiooni jaoks vajalike kambritingi ­
muste saavutatavus.
 
38. Kui lähtekontsentratsiooni juures täheldatakse, et loomad surevad või on 
suremas, võib kõnealuse kontsentratsiooniga saadud tulemusi kasutada lähte ­
punktina edasiseks katsetamiseks muude kontsentratsioonidega (vt põhiuu ­
ring). Kui uuritava kemikaali füüsikalised või keemilised omadused muudavad piirkontsentratsiooni saavutamise võimatuks, tuleks katsetada 
suurimat saavutatavat kontsentratsiooni. Kui suurim saavutatav kontsentrat ­
sioon põhjustab alla 50 % suremuse, ei ole edasine katsetamine vajalik. Kui piirkontsentratsiooni ei ole võimalik saavutada, tuleks katseprotokollis esitada selgitus ja seda toetavad andmed. Kui auru suurim saavutatav kont ­
sentratsioon ei ole mürgine, siis võib olla vajalik lisada uuritavat kemikaali 
vedelikaerosoolina.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Põhiuuring: C × t määramise eeskiri  
39. Põhiuuringus katsetatav lähtekontsentratsioon (I kokkupuude) (1. liide) on 
kas piirkontsentratsioon või uuringu juhi poolt eeluuringu alusel valitud kontsentratsioon. Kui I kokkupuute ajal või selle järel täheldatakse loomade 
suremist, võetakse suremist põhjustav minimaalne kokkupuude (C × t) 
aluseks II kokkupuute kontsentratsiooni ja ajavahemike kindlaksmääramisel. Iga edasine kokkupuude oleneb eelnevast kokkupuutest (vt 1. liide).
 
40. Paljude uuritavate kemikaalide puhul on lähtekontsentratsiooniga saadud 
tulemused koos kolme lühema täiendava kokkupuutega (kokkupuute ajava ­
hemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille järjestikuste ajava ­
hemike erinevust näitab progressiooni kordaja, tavaliselt √2) piisav C × t 
suremuse suhte kindlaksmääramiseks (15), kuid otstarbekas võib olla 
viienda kokkupuutekontsentratsiooni kasutamine (vt 1. liide ja juhenddoku ­
ment nr 39 (2)). C × t protokolli tulemuste matemaatiline käsitlus on esitatud 1. liites.
 
VAATLUSED  
41. Loomi tuleks kokkupuute ajal sageli kliiniliselt jälgida. Pärast kokkupuudet 
tuleks kliinilised vaatlused korraldada vähemalt kaks korda kokkupuute ­
päeva jooksul või, kui loomade reageerimine kokkupuutele seda nõuab, ka sagedamini, ja seejärel vähemalt kord päevas kokku 14 päeva jooksul. 
Vaatlemise ajavahemiku kestus ei ole kindlaks määratud; see tuleks määrata 
kliiniliste nähtude laadi, tekkimisaja ja taastumisperioodi pikkuse alusel. Mürgistusnähtude ilmumise ja kadumise aeg on oluline eelkõige juhul, kui mürgistusnähtudel on kalduvus avalduda viitmõjuna. Kõik vaatlused regis ­
treeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed. 
Suremas olevad loomad ja loomad, kellel esinevad tugeva valu ja/või püsivad suurte kannatuste tunnused, tuleks loomade heaolu kaalutlustel humaansel viisil surmata. Mürgistuse kliiniliste nähtude vaatluste tegemisel 
tuleks olla hoolikas, et mitte pidada kokkupuutekatsest põhjustatud esialgset 
kehva välimust ja ajutisi hingamismuutusi uuritava kemikaaliga seotud mürgistuseks, mis nõuaks loomade enneaegset surmamist. Tuleks võtta arvesse humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (nr 19) 
esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (7). Kui loomad surmatakse humaansetel 
kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg võimalikult täpselt regis ­
treerida.
 
42. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade 
ja limaskestade, hingamise, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvi ­
süsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Võimaluse korral tuleks eristada lokaalset ja süsteemset mõju ja need registreerida. 
Tuleb pöörata tähelepanu värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, 
letargia, une ja kooma esinemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib anda lisaandmeid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüper ­
termia kohta, mis on seotud kokkupuute või vangistusega.
 
Kehamass  
43. Iga looma kehamass tuleks registreerida üks kord kohanemise perioodi 
vältel, kokkupuute päeval enne kokkupuudet (päev 0) ning vähemalt 
päevadel 1, 3 ja 7 (ning seejärel iga nädal) ja surma või eutanaasia korral, kui see toimub pärast päeva 1. Kehamass on teatavasti mürgistuse oluline näitaja ja seega tuleks täpselt jälgida loomi, kelle kehamass väheneb püsivalt 
≥ 20 % võrreldes uuringueelsete näitajatega. Ellujäänud loomad kaalutakse 
ja surmatakse humaansel viisil kokkupuutejärgsel ajavahemikul.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patoloogia  
44. Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kes 
surmati eutanaasiaga või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagami ­
seks) lahatakse täielikult. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leid ­
mist ei ole võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi 
minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloo ­
gilised muutused tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede 
mis tahes muutustele.
 
45. Uuringu tõlgendusväärtuse laiendamiseks võidakse kaaluda kavandis eelne ­
valt ette nähtud täiendavaid uuringuid, näiteks ellujäänud rottide kopsude massi mõõtmine ja/või hingamisteede ärrituse tõendamine hingamisteede 
mikroskoobiga vaatlemise alusel. Uurida võib ka organeid, milles 24 tundi 
või kauem elanud loomadel esineb patoloogilisi muutusi, samuti organeid, mis teadaolevalt või eeldatavasti võivad olla kahjustatud. Kogu hingamistee mikroskoobiuuring võib anda kasulikku teavet veega reageeriva uuritava 
kemikaali, näiteks happe või hügroskoopse kemikaali kohta.
 
ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
46. Tuleks esitada andmed iga üksiku looma kehamassi ja lahkamistulemuste 
kohta. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, 
näidates iga katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete 
mürgistusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaan ­
setel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud.
 
Katseprotokoll  
47. Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.  
Katseloomad ja pidamistingimused  
— Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri 
kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline niiskus, valgustusperiood ja sööt.
 
— Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus.  
— Loomade arv, vanus ja sugu.  
— Randomiseerimismeetod.  
— Sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda tüüp/päritolu, vee päritolu).  
— Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karan ­
tiin ja haiguste ravi.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Uuritav kemikaal  
— Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised 
omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).  
— Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi 
nr, kui see on teada.  
Kandeaine  
— Kandeaine kasutamise põhjendus ja valiku põhjendus (kui kandeainena 
ei kasutata vett).  
— Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta 
uuringu tulemusi.  
Inhalatsioonikamber  
— Inhalatsioonikambri, sh selle mõõtmete ja mahu kirjeldus.  
— Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus 
ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.  
— Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni 
mõõtmise seadmed.  
— Õhuallikas ja kambrisse suunatud / kambrist välja lastud õhu töötlemine 
ning konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.  
— Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud 
meetodid.  
— Rõhuerinevus (positiivne või negatiivne).  
— Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokku ­
puude); loomade paiknemine süsteemis (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
 
— Katsekeskkonna ajaline homogeensus/stabiilsus.  
— Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonnast proo ­
vide võtmine kambris.  
— Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina 
kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha 
kaudu toimuv kokkupuude).  
— Teave hapniku ja süsinikdioksiidi sisalduse mõõtmiseks kasutatud sead ­
mete kohta, vajaduse korral.  
— Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t  95 ). 
— Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.  
— Mõõteseadmed (vajaduse korral).  
Andmed kokkupuute kohta  
— Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.  
— Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemi ­
kaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).  
— Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoo ­
nist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, 
aur, aerosool) puhul võidakse iga faasi eraldi analüüsida.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutes (näiteks mg/l, 
mg/m  3 jne); sulgudes võib lisada ka ruumalaühikud (näiteks ppm, ppb 
jne). 
— Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline 
diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve ( σ g ) ning nende 
arvutamise meetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.  
Katsetingimused  
— Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh 
andmed mis tahes meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste 
suuruse vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks. Kui mehaanilised protsessid võivad olla muutnud uuritava kemikaali koostist, tuleb lisada nende analüüside tulemused, mille abil kontrolliti 
uuritava kemikaali koostist.
 
— Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkon ­
naga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).  
— Andmed kasutatud keemilise analüüsi meetodi kohta ja meetodi validee ­
rimise kohta (sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukesk ­
konna analüüsil).  
— Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.  
Tulemused  
— Tabelid katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu kohta.  
— Tabelid kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni andmete kohta.  
— Tabelid osakeste suurusjaotuse kohta, sh analüüsiproovide võtmise 
andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σ g arvutamine.  
— Tabelid iga looma reageerimise ja kontsentratsioonide kohta (st mürgis ­
tusnähtudega loomad, kaasa arvatud surnud loomad, mõjude laad, raskus, ilmumise aeg ja mõju kestus).
 
— Uuringul registreeritud konkreetse looma kehamass; surmakuupäev ja 
-aeg, kui loom sureb enne plaanijärgset eutanaasiat, mürgistusnähtude 
tekke aeg ja pöörduvus konkreetse looma puhul.  
— Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.  
— Suremuse hinnangud (näiteks LC  50 , LD  01 ), sh 95 % usalduspiirid ja 
kõvera tõus (kui see hindamismeetodi alusel esitatakse).  
— Statistiline seos, sh eksponendi n hinnang (C × t määramise eeskiri). 
Tuleks esitada kasutatud statistikatarkvara nimetus.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Tulemuste arutelu ja tõlgendamine  
— Eritähelepanu tuleks pöörata nende meetodite kirjeldamisele, mida kasu ­
tati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piirkontsen ­
tratsioon või osakeste suurus.  
— Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda osakeste sissehingamiseks sobivat 
suurust, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei olnud võimalik 
täita.  
— Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (8) 
sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis 
tuleks esitada selgitus.
 
— Kui katsetamine käesoleva lisa peatüki B.52 (4) alusel katkestati käes ­
oleva katsemeetodi B.2 rakendamiseks, siis tuleks seda põhjendada.  
— Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioo ­
nide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tege ­
liku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.  
— Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist 
toimeviisi (süsteemne või lokaalne).  
KIRJANDUS  
1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil 
http://www.oecd.org/env/testguidelines.  
2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/ ­
testguidelines.  
3) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 
2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja paken ­
damist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 
(ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
 
4) Käesoleva lisa peatükk B.52 „Äge mürgisus sissehingamisel – ägeda mürgi ­
suse klassi määramise meetod”.  
5) Käesoleva lisa peatükk B.40 „Nahasöövituskatse  in vitro : transkutaanse 
elektritakistuse (TER) mõõtmine”.  
6) Käesoleva lisa peatükk B.40a „Nahasöövituskatse  in vitro : katse inimnaha 
mudeliga”.  
7) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Kätte ­
saadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.  
8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil 
http://www.oecd.org/env/testguidelines.
 
9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of 
Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.  
10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167.  
12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with 
Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290.
 
13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.
 
14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.  
15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/env/testguidelines.
 
16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
MÕISTE  
Uuritav kemikaal:  iga aine või segu, mida uuritakse/uuriti käesoleva katsemee ­
todi abil.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
1. liide  
C × t määramise eeskiri  
1. Sissehingamisel avalduva mürgisuse hindamisel võib tavalise määramisees ­
kirja alternatiivina kaaluda astmelist C × t (kontsentratsioon × aeg) määra ­
mise eeskirja (12, 13, 14). Seda tuleks kasutada eelistatavalt juhul, kui konkreetne regulatiivne või teaduslik vajadus nõuab loomade katsetamist 
mitme ajavahemiku vältel, näiteks hädaolukorrale reageerimise või maaka ­
sutuse kavandamiseks. Sel juhul alustatakse tavaliselt piirkontsentratsioonil katsetamisest (I kokkupuude), mille puhul loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga viie ajavahemiku jooksul (näiteks 15, 30, 60, 120 ja 
240 min), nii et ühe kokkupuute ajal püütakse saada andmed mitme ajava ­
hemiku kohta (vt joonis 1). Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, on gaasi, auru ja aerosooli piirkontsentratsioon vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l. Neid tasemeid võib ületada ainult juhul, kui kõnealustel 
tasemetel katsetamiseks on regulatiivne või teaduslik vajadus (vt B.2 põhi ­
teksti punkt 37).
 
2. Kui uuritava kemikaali mürgisuse kohta on vähe teavet või seda ei ole 
üldse, tuleks teha eeluuring, mille vältel loomarühmad, milles on kuni kolm looma kummastki soost, viiakse tavaliselt 240 minuti vältel kokku ­
puutesse uuringu juhi valitud sihtkontsentratsiooniga.
 
3. Kui I kokkupuute ajal katsetatakse piirkontsentratsiooni ja täheldatakse sure ­
must alla 50 %, ei ole täiendav katsetamine vajalik. Kui on regulatiivne või teaduslik vajadus määrata kontsentratsiooni/aja/mõju vaheline seos piirkont ­
sentratsioonist suuremal kontsentratsioonil, tuleks järgmine kokkupuude teha 
kõrgema tasemega, näiteks piirkontsentratsioonist kaks korda suurema kont ­
sentratsiooniga (s.o 2L joonisel 1).
 
4. Kui piirkontsentratsiooni juures täheldatakse mürgisust, on vaja teha 
täiendav uuring (põhiuuring). Kõnealused täiendavad kokkupuuted tehakse kas väiksema kontsentratsiooniga (joonisel 1: II, III või IV’ kokkupuude) 
või suurema kontsentratsiooniga, kasutades lühemaid ajavahemikke (joonisel 
1: IV kokkupuude), mis on kohandatud ja mille vahed ei ole nii suured.
 
5. Katse (esialgne kontsentratsioon ja täiendavad kontsentratsioonid) tehakse, 
kasutades iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta kas ühte looma kummastki soost või kahte looma sellest soost, kumb on tundlikum. 
Mõnel juhul võib uuringu juht otsustada, et iga kontsentratsiooni ja ajava ­
hemiku kohta kasutatakse kahte rotti kummastki soost (või nelja looma tundlikumast soost) (15). Kui kirjeldatud määramiseeskirja puhul kasuta ­
takse iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta kahte looma kummastki 
soost, väheneb tavaliselt andmete kallutatus ja hinnangute muutlikkus, 
suureneb hinnangute täpsus ja paraneb hälvete kirjeldatavus usaldusvahe ­
mikuga. Täpsemad üksikasjad on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
 
6. Ideaaljuhul tehakse iga kokkupuude ühel päeval. See võimaldab viivitada 
järgmise kokkupuutega, kuni võib olla mõistlikult kindel, et loomad jäävad 
ellu, ja see võimaldab uuringu juhil kohandada järgmise kokkupuute jaoks 
sihtkontsentratsiooni ja ajavahemikku. Iga kokkupuudet soovitatakse alus ­
tada rühmaga, kelle kokkupuute kestus on kõige pikem, näiteks 240-minu ­
tilise kokkupuutega rühm, seejärel 120-minutilise kokkupuutega rühm jne. 
Kui näiteks loomad 240 minuti rühmas 90 minuti möödudes surevad või 
neil täheldatakse raske mürgistuse nähte (näiteks hingamisrütmi äärmuslikud muutused, nagu raske hingamine), ei ole mõistlik rühmale 120 minuti pikkust kokkupuudet korraldada, kuna suremus oleks tõenäoliselt 100 %. 
Seega peaks uuringu juht valima kõnealuse kontsentratsiooni jaoks lühemad 
kokkupuute ajavahemikud (näiteks 90, 65, 45, 33 ja 25 minutit).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Kambrikontsentratsiooni tuleks mõõta sageli, et määrata kindlaks ajaga 
kaalutud keskmine kontsentratsioon kokkupuute iga ajavahemiku kohta. 
Alati kui on võimalik, tuleks statistilise analüüsi jaoks kasutada iga looma surmaaega (kokkupuute kestuse asemel).
 
8. Esimese nelja kokkupuute tulemusi tuleks uurida, et määrata kindlaks kont ­
sentratsiooni ja aja kõvera andmelüngad (vt joonis 1). Kui kooskõla ei ole piisav, võib korraldada täiendava kokkupuute (5. kontsentratsioon). 5. 
kokkupuutekontsentratsioon ja ajavahemikud tuleks valida nii, et kõrvalda ­
takse kõnealune andmelünk.
 
9. Kõiki kokkupuuteid (sh esimest kokkupuudet) kasutatakse statistilise 
analüüsi alusel kontsentratsiooni, aja ja mõju vahelise seose arvutamiseks (16). Kui see on iga C × t intervalli puhul võimalik, siis tuleks kasutada 
ajaga kaalutud keskmist kontsentratsiooni ja kokkupuute kestust surmani 
(kui loom sureb kokkupuute ajal).
 
Joonis 1  
Hüpoteetiline joonis kontsentratsiooni, aja ja suremuse vahelise seose kohta 
rottidel
  
Valged sümbolid = ellujäänud; mustad sümbolid = surnud loomad  
Kolmnurgad = emased; ringid = isased  
Katkematu joon = LC  50 väärtused (vahemik 7,5–240 min) kõigi n = 1 isaste 
puhul  
Katkendjoon = LC  50 väärtused (vahemik 7,5–240 min) kõigi n = 1 emaste 
puhul  
Punktiirjooned = hüpoteetilised LC  50 väärtused isaste ja emaste puhul, kui n 
oleks olnud 2 (12).  
Mõisted  
kontsentratsioon  
kokkupuute aeg  
piir ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Allpool on esitatud astmelise toimimiskäigu näide.  
I kokkupuude. Katse piirkontsentratsioonil (vt joonis 1)  
— Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; 
kokku 10 looma (  a ) 
— Sihtkontsentratsioon (  b ) = piirkontsentratsioon.  
— Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga kõnealusel 
sihtkontsentratsioonil vastavalt 15, 30, 60, 120 ja 240 minutiks.  
↓ 
II kokkupuude  ( c ). Põhiuuring  
— Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; 
kokku 10 looma.  
— Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal 
kontsentratsioonil (  d ) (1/2L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahe ­
mikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).
 
↓ 
III kokkupuude. Põhiuuring  
— Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; 
kokku 10 looma.  
— Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal 
kontsentratsioonil (  d ) (1/4L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahe ­
mikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).
 
↓ 
IV’ kokkupuude. Põhiuuring  
— Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; 
kokku 10 looma.  
— Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga väiksemal 
kontsentratsioonil (  d ) (1/8L) mõnevõrra pikemateks kokkupuute ajavahe ­
mikeks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).
 
↓ või ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Kui soost sõltuva tundlikkuse andmeid ei ole, kasutatakse kummastki soost rotte, st üks 
loom kummastki soost iga kontsentratsiooni kohta. Olemasoleva teabe alusel või kui 
kõnealuse kokkupuute vältel selgub, et üks sugu on tundlikum, kasutatakse edasistes 
katsetes iga kontsentratsiooni kohta 10 tundlikumast soost looma (kaks looma iga kont ­
sentratsiooni ja ajavahemiku kohta). 
( b ) Kui kohaldatakse määrust (EÜ) nr 1272/2008, siis on gaasi, auru ja aerosooli piirkont ­
sentratsioon vastavalt 20 000 ppm, 20 mg/l ja 5 mg/l. Kui eeldatakse mürgisust või kui 
mürgisus on tuvastatud eeluuringuga, tuleks valida väiksem lähtekontsentratsioon. Regu ­
latiivse või teadusliku vajaduse korral võib kasutada suuremat kontsentratsiooni. 
( c ) Ideaaljuhul tuleks loomade kokkupuude järgmisel kontsentratsioonil edasi lükata seni, 
kuni eelnevalt töödeldud loomade ellujäämises on mõistlikkuse piires veendutud. See 
võimaldab uuringu juhil kohandada järgmise kokkupuute sihtkontsentratsiooni ja ajava ­
hemikke. 
( d ) Minimaalne doos (kontsentratsioon × aeg), mis põhjustas esialgsel kontsentratsioonil 
katsetamise ajal surma (esimene kokkupuude), võetakse aluseks kontsentratsiooni ja 
kokkupuute ajavahemiku järgmise kombinatsiooni kindlaksmääramisel. Tavaliselt vähen ­
datakse kontsentratsiooni kaks korda (1/2L) ja loomade kokkupuude kemikaalidega 
toimub uute väiksemate vahedega ajavahemike vältel. Kokkupuute ajavahemikud 
moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on 1,4 ( √2; vt viide 11) ja mille 
keskel on see aeg, kus esimese kokkupuute raames leiti minimaalne letaalne doos (aeg × 
kontsentratsioon). Kõnealusel joonisel (joonis 1) täheldati surma I kokkupuute vältel 
esmakordselt 15 minuti möödumisel; II kokkupuute ajavahemike keskel on seega 30 
minutit ja ajavahemikud on 15, 21, 30, 42 ja 60 min. Pärast esimest kahte kokkupuudet 
on väga soovitatav koostada andmete alusel eespool näidatuga samalaadne joonis ning 
kontrollida, kas kontsentratsiooni ja aja sõltuvuse tõus on 45 kraadi (n = 1) või on 
kontsentratsiooni, aja ning mõju vaheline sõltuvus laugem (näiteks n = 2) või järsem 
(näiteks n = 0,8). Viimasel juhul on väga soovitatav edasiste kokkupuudete kontsentrat ­
sioone ja ajavahemikke selle alusel kohandada.
 IV kokkupuude. Põhiuuring  
— Kummastki soost üks loom iga kontsentratsiooni ja ajavahemiku kohta; 
kokku 10 looma.  
— Viis loomarühma viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga suuremal 
kontsentratsioonil (  e ) (2L) mõnevõrra lühemateks kokkupuute ajavahemi ­
keks (ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progressiooni, mille tegur on √2; vt joonis 1).
 
C × t määramise eeskirja tulemuste matemaatiline tõlgendamine  
11. Nelja või viie kokkupuutekontsentratsiooniga ja viie ajavahemikuga C × t 
määramise eeskiri annab tulemuseks vastavalt 20 või 25 andmepunkti. Kõnealuste andmepunktide põhjal on võimalik arvutada C × t seos statisti ­
lise analüüsi abil (16).
 
Võrrand 1:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
kus C = kontsentratsioon;  t = kokkupuute kestus, või  
võrrand 2:  
toime ¼ ƒðC n tÞ 
kus n ¼ b 1=b 2: 
Võrrandi 1 abil on võimalik arvutada LC  50 väärtus konkreetse ajavahemiku 
jaoks (näiteks 4 tundi, 1 tund, 30 minutit või muu ajavahemik katsetatud 
ajavahemike piires), kasutades väärtust P = 5 (50 % vastus). Pange tähele, et Haberi seadus on kohaldatav ainult juhul, kui n = 1. LC
 01 saab arvutada P = 
2,67 alusel.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) Mõnikord võib olla vajalik suurendada kontsentratsiooni (2L) ja kasutada uusi veelgi 
väiksemate vahedega ajavahemikke; ajavahemikud moodustavad geomeetrilise progres ­
siooni, mille tegur on 1,4 ( √2) ja mille keskel on see aeg, kus esimese kokkupuute 
raames leiti minimaalne letaalne kontsentratsioon. Kokkupuute minimaalne kestus 
peaks eelistatavalt olema pikem kui 5 minutit; kokkupuute kestus ei tohiks ületada 8 
tundi.
 B.3. ÄGE MÜRGISUS (NAHAKAUDNE)  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust (A).  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust (B).  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Testaine kantakse astmeliste annustena mitme rühma katseloomade 
nahale nii, et üks rühm saab ühesuguse annuse. Järgnevalt jälgitakse 
mõju ja surmajuhtumite esinemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
 
Tõsistele ja kestvatele kannatustele ja valule viitavate märkidega 
loomad võib vaja olla humaanselt surmata. Testaineid pole vaja annustada moel, mis teadaolevalt tekitab märgatavat söövitavatest 
või ärritavatest omadustest tingitud valu ja kannatusi.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Puuduvad.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistused  
Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsepuurides 
katsele vastavatel pidamis- ja söötmistingimustel. Täiskasvanud 
noored terved katseloomad randomiseeritakse enne katset ja jaga ­
takse katserühmadesse. Ligikaudu 24 tundi enne katset eemaldatakse pügamise või raseerimise teel katseloomade keha seljaosalt karvkate. Karvkatte pügamisel või raseerimisel tuleb vältida naha marrastamist, 
kuna see võib mõjutada naha läbilaskvust. Testaine nahale kandmi ­
seks tuleb vabastada vähemalt 10 % kehapinnast. Tahkete, vajaduse korral peenestatud ainete puhul tuleks testainet nahaga hea kokku ­
puute saavutamiseks niisutada piisava koguse vee või sobiva kand ­
jaga. Kandja kasutamisel tuleb arvestada selle mõjuga testaine naha ­
läbimisvõimele. Vedelaid testaineid kasutatakse üldjuhul lahjenda ­
mata kujul.
 
1.6.2.  Katsetingimused  
1.6.2.1.  Katseloomad  
Kasutada võib täiskasvanud rotte või küülikuid. Kasutada võib ka 
muid liike, kuid seda tuleb põhjendada. Kasutada tuleks tavapäraseid laboritöös kasutatavaid liine. Kasutatavate katseloomade masside 
erinevus katse alguses kummagi soo puhul eraldi ei tohiks ületada 
± 20 % vastavast keskmisest.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Katseloomade arv ja sugu  
Iga annuse taseme kohta tuleb kasutada vähemalt viit katselooma. 
Nad peaksid olema samast soost. Emasloomade kasutamisel ei tohiks nad olla poeginud ega tiined. Kui on andmeid selle kohta, et ühe soo 
esindajad on märgatavalt tundlikumad, tuleks kasutada sellest soost 
loomi.
 
Märkus:  ägeda mürgisuse katsetes närilistest kõrgemate loomadega 
tuleks kaaluda väiksema arvu loomade kasutamist. Annused tuleks valida hoolikalt ja vältida tuleks mõõdukalt mürgiste annuste ületa ­
mist. Testaine surmavate annuste manustamist tuleks sellistes 
katsetes vältida.
 
1.6.2.3.  Annused  
Erinevaid annusemäärasid peaks olema küllaldaselt, vähemalt kolm, 
ja nende vahed peaksid olema sellised, et saadakse erinevate mürgis ­
tusnähtude ja suremusega katserühmad. Annusemäärade valikul 
tuleks arvesse võtta mis tahes võimalikku ärritavat või söövitavat 
mõju. Andmeid peaks olema küllaldaselt annuse/reaktsioonikõvera koostamiseks ja võimalusel LD
 50 nõuetekohaseks määramiseks.  
1.6.2.4.  Piirsisalduskatse  
Eespool kirjeldatud meetodi kohaselt võib teha piirsisalduskatse 
viiest isas- ja viiest emasloomast koosnevas rühmas annusega vähe ­
malt 2 000 mg/kg kehakaalu kohta. Kui katses esineb ühendiga seotud suremust, võib kaaluda täiemahulise uuringu tegemist.
 
1.6.2.5.  Vaatlusperiood  
Vaatlusperioodi kestus peaks olema vähemalt 14 päeva. Vaatlemise 
kestust ei tohiks siiski jäigalt fikseerida. See peaks sõltuma mürgis ­
tusnähtudest, nende ilmnemise kiirusest ja paranemisperioodi pikku ­
sest; seega võib seda vajadusel pikendada. Mürgistusnähtude ilmne ­
mise ja kadumise aeg, nende kestus ja surma aeg on väga olulised, 
eriti kui surm saabub sageli hiljem.  
1.6.3.  Katse käik  
Loomi tuleks puurides pidada ühekaupa. Testaine tuleks kanda ühtla ­
selt alale, mis moodustab ligikaudu 10 % kogu kehapinnast. Väga 
mürgiste ainete puhul võib katta väiksema osa kehapinnast, kuid 
võimalikult suur osa pinnast tuleks katta võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga.
 
Testainet tuleks 24tunnise kokkupuuteperioodi jooksul poorse marli ­
sideme ja mitteärritava kleeplindi abil naha vastas hoida. Manusta ­
miskoht tuleks veel lisaks sobival moel kinni katta, et hoida marli ­
sidet ja testainet paigal ja vältida testaine allaneelamist katselooma 
poolt. Et vältida testaine allaneelamist, võib kasutada looma liikuvust 
piiravaid vahendeid, kuid looma täielikku fikseerimist ei soovitata.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Kokkupuuteperioodi lõpus tuleks testaine jääk nahalt võimaluse 
korral veega või muu sobiva puhastusmeetodi abil eemaldada.  
Vaatlustulemused tuleks vaatluse käigus süstemaatiliselt registree ­
rida. Iga looma kohta tuleb pidada eraldi arvestust. Esimesel päeval tuleks loomi vaadelda tavapärasest sagedamini. Vähemalt kord 
tööpäevas tuleks läbi viia põhjalik kliiniline uuring; muid vaatlusi 
tuleks teha iga päev, rakendades sobivaid abinõusid loomade kao piiramiseks uuringus, nt surnuna leitud loomad lahata või külmutada ja nõrgad või surevad loomad eraldada või surmata.
 
Vaadelda tuleks muutusi nii karvkattes, testainega töödeldud nahas, 
silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüsteemis ning somatomotoorses aktiiv ­
suses ja käitumises. Erilist tähelepanu tuleks pöörata värinatele, 
krampidele, süljeeritusele, kõhulahtisusele, letargiale, unele ja koomale. Surmahetk tuleb registreerida võimalikult täpselt. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse 
ka ellujäänud loomad. Registreerida tuleks kõik makropatoloogilised 
muutused. Vastaval näidustusel tuleks võtta koeproove histopatoloo ­
gilisteks uuringuteks.
 
Mürgisuse hindamine teisel sool  
Uuringute lõpetamisel ühest soost katseloomadega annustatakse 
vähemalt viiest vastassoost loomast koosnevale rühmale, et kontrol ­
lida, ega selle soo esindajad testaine suhtes märgatavalt tundlikumad 
pole. Üksikjuhtudel võib olla õigustatud väiksema arvu loomade 
kasutamine. Kui on küllalt andmeid selle kohta, et uuritavast soost loomad on märgatavalt tundlikumad, võib katsetest vastassoost loomadega loobuda.
 
2. ANDMED  
Andmed tuleks esitada kokkuvõtliku tabelina, mis iga katserühma 
puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul, iga looma surma aega, muude mürgistusnähtudega loomade arvu, mürgistusnähtude 
kirjeldust ja lahkamistulemusi. Kõik loomad kaalutakse ja mass 
registreeritakse vahetult enne testaine manustamist, seejärel igal nädalal ning surmahetkel; kui looma elumus katses ületab ühe päeva, tuleks arvutada ja registreerida tema massimuutused. Ühen ­
diga seotud kannatuste ja valu tõttu humaanselt surmatud loomad 
registreeritakse ühendiga seotud suremusena. Tunnustatud meetodi kohaselt määratakse LD
 50 . 
Andmetele hinnangu andmisel tuleks arvesse võtta kõigi kõrvalekal ­
lete, sealhulgas käitumuslike ja kliiniliste kõrvalekallete, makropato ­
loogiliste kahjustuste, kehamassi muutuste, suremuse ja mis tahes muude mürgistusnähtude mis tahes võimalikku sõltuvust kokkupuu ­
test testainega ning nende esinemissagedust ja tõsidust.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— liiki, liini, päritolu, keskkonnatingimusi, toidusedelit jne;  
— katsetingimusi (sealhulgas naha puhastamise meetodit ja sideme 
tüüpi: oklusiivside või tavaline side);  
— annuseid (kandja kasutamisel koos kandjaga ja kontsentrat ­
sioone);  
— katseloomade sugu;  
— tabelit reaktsiooni andmetega soo ja annuse määra järgi (st katse 
käigus surnud või surmatud loomade arvu, mürgistusnähtudega 
loomade arvu, kokkupuutes olnud loomade arvu);  
— surma aega, arvestatuna annuse saamise ajast loomade humaanse 
surmamise põhjusi ja seejuures rakendatud kriteeriume;  
— kõiki vaatlusandmeid;  
— täiemahulises uuringus kasutatud soo 14 päeva kestel määratud 
LD 50 väärtust (märkega määramismeetodi kohta);  
— leitud LD  50 väärtuse 95 % usaldusvahemikku (kui seda on 
võimalik esitada);  
— annuse/suremuse kõverat ja selle tõusu (kui määramismeetod 
seda võimaldab);  
— lahkamistulemusi;  
— kõiki histopatoloogilisi leide;  
— kõiki katsetulemusi teisest soost loomade puhul;  
— tulemuste analüüsi (erilist tähelepanu tuleks pöörata katse ajal 
tehtud viidud humaanse surmamise võimalikule mõjule arvutatud 
LD 50 väärtusele);  
— tulemuste tõlgendust.  
3.2. HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Vt B osa üldist sissejuhatust (D).  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust (E).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. ÄGE MÜRGISUS: NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 404ga (2002).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist 
tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida 
mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka 
kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, aine söövitavust ja ärritavust uuriva  in vivo  katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asjaomaste 
andmete osakaalu. Kui saadaolevad andmed on ebapiisavad, saab 
neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (1). Katsete tege ­
mise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud  in vitro  katsete sooritamist. Lisaks 
sellele soovitatakse vastavalt olukorrale, et  in vivo  algkatses kohal ­
datakse looma suhtes kolme katselappi järjestikku, mitte korraga.
 
Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei 
tehta  in vivo  katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava katse ­
aine võimalikku naha söövitamist/ärritamist käsitleva teabe osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste ja/või labori ­
loomadega tehtud uurimustest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt 
samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele viitavad andmed (2, 3) ning valideeritud ja heakskiidetud  in vitro  või ex 
vivo katsete tulemused (4, 5, 5a). Käesolev analüüs peaks vähendama 
vajadust teha  in vivo  katseid selliste ainetega, mille nahasöövitavuse 
ja -ärritavuse kohta on muudest uurimustest juba piisavalt tõendeid saadud.
 
Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab vali ­
deeritud ja heakskiidetud  in vitro  või ex vivo  katsete sooritamist 
söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi 
lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (6), millest osavõtjad seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katses ­
trateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas globaalselt 
harmoneeritud süsteemis (GHS) (7). Soovitatakse, et nimetatud 
katsestrateegiat kasutataks enne  in vivo  katsete tegemist. Uute ainete 
katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teaduslikult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritatavuse 
kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille nahasöövitavuse ja -ärrita ­
vuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada muud katsetamisstrateegiat või menetlust või mitte kasutada etapiviisilist 
katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.
 
Kui söövitavust või ärritavust ei saa kindlaks määrata järjestikuste 
katsete tegemise strateegia kohaselt osakaalu analüüsimise abil, 
tuleks kaaluda  in vivo  katset (vt lisa).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. MÕISTED  
Nahaärritus  – pöörduva nahakahjustuse tekkimine kuni neli tunni 
jooksul pärast katseaine manustamist.  
Nahasöövitus  – pöördumatu nahakahjustuse, s.t nähtava marraskna ­
hast pärisnahani ulatuva nekroosi tekkimine kuni nelja tunni jooksul pärast katseaine manustamist. Tüüpilised söövitusreaktsioonid on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14päevase jälgimispe ­
rioodi lõpus naha heledaks muutumise tõttu värvimuutus, täielik 
karvakadu ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogiat.
 
1.3 KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma nahale, 
katselooma töötlemata kehapinnad toimivad kontrollina. Ärritavuse/ ­
söövitavuse astet konstateeritakse ja märgitakse täpsustatud inter ­
vallid ning seda astet kirjeldatakse mõjude hindamise täiendamiseks. Uurimus kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöör ­
dumatust saaks hinnata.
 
Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal 
katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse 
tapmise kriteeriumid on toodud viites 8.
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  In vivo  katse ettevalmistamine  
1.4.1.1.  Loomaliikide valik  
Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori 
täiskasvanud küülikuid. Muude liikide kasutamist tuleks põhjendada.  
1.4.1.2.  Loomade ettevalmistamine  
Ligikaudu 24 tunni jooksul enne katset lõigatakse loomade seljaosa 
karvad lühikeseks. Tuleks vältida naha marrastamist ning kasutama peaks üksnes terveid, terve nahaga loomi.
 
Mõnedel küüliku liinidel esineb tihedaid karvalaike, mis on silma ­
torkavamad teatavatel aastaaegadel. Selliseid tiheda karvastikuga kehapindasid ei tohiks kasutada katsetamise kohana.
 
1.4.1.3.  Loomade pidamise ja toitmise tingimused  
Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur 
küülikutel peaks olema 20  o C (± 3  o C). Kuigi suhteline niiskus 
peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, peaks seda hoidma vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 
tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast 
labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  Katsemenetlus  
1.4.2.1.  Katseaine manustamine  
Katseainet tuleks panna väikesele nahapinnale (ligikaudu 6 cm  2 ) ja 
see kaetakse marlilapiga, mis kinnitatakse nahka mitteärritava 
teibiga. Kui ainet ei ole võimalik otse peale kanda (nt vedelikud 
või mõned pastad), kantakse katseaine esmalt marlilapile, mis seejärel asetatakse nahale. Lappi hoitakse õrnalt vastu nahka sobiva, pooltihke sideme abil kogu mõjuaja. Kui katseaine kantakse lapile, 
tuleks see lapp kinnitada nahale selliselt, et aine puutuks nahaga 
hästi kokku ja leviks nahal ühtlaselt. Tuleks tõkestada looma ligi ­
pääsu lapile ja katseaine allaneelamist või sissehingamist.
 
Vedalaid katseaineid kasutatakse üldiselt lahjendamata kujul. Tehes 
katseid tahkete ainetega (mida võib vajaduse korral pulbristada), 
tuleks katseainet niisutada väikese koguse veega (või vajaduse korral muu sobiva kandeainega), et tagada hea kokkupuude nahaga. Kui kasutatakse muid kandeaineid kui vesi, on kandeaine võimalik mõju 
katseaine põhjustatud nahaärritusele minimaalne või olematu.
 
Mõjuaja lõpus, mis kestab tavaliselt neli tundi, allesjäänud katseaine 
eemaldatakse võimaluse korral vee või sobiva lahustiga, muutmata marrasknaha olemasolevat reaktsiooni või puutumatust.
 
1.4.2.2.  Annusmäär  
Uuritavale pinnale kantakse 0,5 ml vedelat või 0,5 g tahket ainet või 
pastat.  
1.4.2.3.  Algkatse (ühe loomaga  in vivo  nahaärrituvus-/-söövitavuskatse)  
On eriti soovitav, et algselt tehtaks  in vivo  katse ühe loomaga, eriti 
juhul, kui aine võib tõenäoliselt olla söövitav. See on kooskõlas järjestikuste katsete tegemise strateegiaga (vt 1. lisa).
 
Kui osakaalu analüüsi põhjal on tõendatud, et aine on söövitav, ei 
ole vaja loomadega katseid jätkata. Enamiku võimalike söövitavate 
ainete puhul ei ole tavaliselt täiendava  in vivo  katse tegemine vajalik. 
Juhul, kui lisateavet peetakse vajalikuks puudulike tõendite tõttu, 
võidakse sooritada piiratud loomkatse, kasutades järgmist lähenemist: 
Loomale pannakse üksteise järel kuni kolm katselappi. Esimene lapp eemaldatakse kolme minuti pärast. Kui ei täheldata tõsist nahareakt ­
siooni, asetatakse teine lapp ja eemaldatakse tunni aja pärast. Kui 
vaatlus antud etapil viitab sellele, et mõjutamist võib humaanselt 
pikendada nelja tunnini, pannakse peale kolmas lapp ja see eemal ­
datakse nelja tunni pärast, misjärel reaktsiooni hinnatakse.
 
Kui sööbiv mõju on vaadeldav pärast ükskõik millist kolmest järjes ­
tikusest mõjutamisest, lõpetatakse katse kohe. Kui sööbiv mõju ei ole 
vaadeldav pärast viimase lapi eemaldamist, jälgitakse looma 14 
päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui söövitus ei teki varem.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
Kui katseaine ei tekita söövitust, kuid võib olla ärritav, asetatakse 
üks lapp ühele loomale neljaks tunniks.  
1.4.2.4.  Kinnitav katse ( in vivo  nahaärritust käsitlev katse täiendavate 
loomadega)  
Kui söövitavat toimet ei ole algkatses jälgitud, tuleks ärritavat või 
negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil neljatunnisel mõjuperioodil. Kui algkatses on jälgitud ärritavat mõju, tuleks seejärel sooritada kinnitav katse või mõjutada kahte 
muud looma korraga. Erandkorras, kui algkatset ei ole tehtud, võib 
kahele või kolmele loomale asetada ühe lapi, mis eemaldatakse nelja tunni pärast. Kui kasutatakse kahte looma, ei ole vaja lisakatset teha, kui mõlematel esineb sama reaktsioon. Muul juhul tehakse katse ka 
kolmanda loomaga. Ebaselgeid reaktsioone on vaja hinnata, tehes 
katseid muude loomadega.
 
1.4.2.5.  Jälgimisperiood  
Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude 
pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused. Mõjude pöörduvuse kind ­
laksmääramiseks tuleks jälgida loomi kuni 14 päeva pärast lapi 
eemaldamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 14 päeva möödumist, 
tuleks katse lõpetada sel ajal.
 
1.4.2.6.  Kliinilised vaatlused ja naha reaktsioonide hindamine  
Kõikidel loomadel uuritakse nahapunetuse ja turse nähte, reaktsioone 
hinnatakse 60 minuti pärast, seejärel 24, 48 ja 72 tundi pärast lapi eemaldamist. Ühe loomaga algkatses uuritakse uuritavat pinda samuti vahetult pärast lapi eemaldamist. Nahareaktsioone hinnatakse ja 
registreeritakse vastavalt allpool tabelis toodud hinnetele. Kui nahal 
on kahjustus, mida ei suudeta tuvastada ärrituse või söövitusena 72 tunni jooksul, võib olla vajalik jälgida kuni 14. päevani, et kindlaks määrata mõjude pöörduvus. Lisaks ärrituse jälgimisele tuleks täieli ­
kult kirjeldada ja registreerida kõik sellised paiksed toksilised mõjud 
nagu naha rasva lahustumine ja mis tahes organismi kahjulikud mõjud (nt mõjud mürgisuse kliinilistele tunnustele ja kehakaalule). Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline 
uurimine.
 
Naha reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Naha reakt ­
siooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide ning 
jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi tege ­
vatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüsteemi (vt tabelit allpool). Illustreeritud juhis nahaärrituse või muude kahjus ­
tuste hindamiseks võib olla abiks (9).
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE ESITAMINE  
Uurimuse tulemused esitatakse tabeli kujul lõplikus katsearuandes ja 
peaks hõlmama kõiki punktis 3.1 nimetatud asju.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE  
Nahaärrituse määramisi tuleks hinnata vastavalt kahjustuse laadile ja 
raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, 
kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks 
vaadelda kontrollväärtustena üksikuid määramisi, mis vajavad hinda ­
mist koos kõikide muude uurimuses tehtud vaatlustega.
 
Nahakahjustuste pöörduvust tuleb võtta arvesse ärritusreaktsioonide 
hindamisel. Kui sellised reaktsioonid nagu alopeetsia (piiratud 
pinnal), liigsarvestus, hüperplaasia ja kestendus jätkuvad 14päevase 
jälgimisperioodi lõpus, tuleks käsitada katseainet naha ärritajana.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab hõlmama järgmist teavet.  
Põhjendus  in vivo  katse tegemiseks: olemasolevate katseandmete, sh 
järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste osakaalu analüüs:
 
— varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus;  
— katsestrateegia igal etapil saadud andmed;  
— in vitro  katsete kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/ ­
võrdlusainetest saadud tulemused;  
— osakaalu analüüs  in vivo  uurimuse sooritamiseks.  
Katseaine:  
— tunnusandmed (nt CASi number, algupära, puhtus, tuntud 
lisandid, partii number);  
— füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, 
lenduvus, lahustuvus, stabiilsus);  
— kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised prot ­
sendimäärad.  
Kandeaine:  
— nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;  
— kandeaine valiku põhjendamine.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküüli ­
kute kasutamiseks;  
— igast soost loomade arv;  
— üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus;  
— vanus katse alguses;  
— päritolu, elamistingimused, toitumine jne.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Katsetingimused:  
— lapi asetuskoha ettevalmistamine;  
— üksikandmed lapi materjali kohta ning asetustehnika;  
— katseaine ettevalmistust, pealekandmist ja eemaldamist käsitlevad 
üksikasjad.  
Tulemused:  
— iga looma ärritus-/söövitusreaktsioonide määramised igal mõõt ­
miskorral tabeli kujul;  
— kõikide täheldatud kahjustuste kirjeldused;  
— täheldatud ärrituse või söövituse laadi ja astme jutustav kirjeldus 
ja võimalikud histopatoloogilised leiud;  
— muude kahjulike paiksete (nt naha rasva lahustumine) ning 
nahaärritusele ja -söövitusele lisaks kogu organismile suunatud mõjude kirjeldus.
 
Tulemuste arutelu.  
4. VIITED  
1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.
 
2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19–26.
 
3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720.
 
4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.
 
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K, Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. 
(1998) The ECVAM international validation study on in vitro 
tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
 
5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. 
Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http:// ­
wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting 
of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/ ­
HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
 
9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides 
and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.  
(Saadaval taotluse korral OECD sekretariaadist).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabel 1  
NAHA REAKTSIOONIDE MÄÄRAMINE  
Nahapunetuse ja kooriku tekkimine  
Nahapunetust ei esine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Väga kerge nahapunetus (vaevumärgatav) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Selgesti nähtav nahapunetus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Mõõdukas kuni tõsine nahapunetus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Tõsine nahapunetus (tugev punetus) – kooriku tekkimine, mis takistab 
nahapunetusele punktide andmist . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Suurim võimalik punktide arv: 4  
Turse tekkimine  
Turset ei esine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Väga kerge turse (vaevumärgatav) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Kerge turse (nahapinna servad on kindlalt üleval) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Mõõdukas turse (ligikaudu 1 mm üleval) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Tugev turse (enam kui 1 mm üleval ja levinud ainega mõjutatud alast 
kaugemale) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Suurim võimalik punktide arv: 4  
Ebaselgete reaktsioonide selgitamiseks tuleks teha histopatoloogiline uuring.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
Lisa 
Nahaärritavuse ja -söövitavuse kohta järjestikuste katsete tegemise 
strateegia  
ÜLDKAALUTLUSED  
Mõistlike teaduslike meetodite ja loomade heaolu huvides on oluline vältida 
loomade tarbetut kasutamist ja vähendada selliste katsete tegemist, mis tõenäoli ­
selt tekitavad loomadel raskeid tagajärgi. Kogu teavet aine võimaliku nahaärritavuse/-söövitavuse kohta tuleks hinnata enne  in vivo  katse tegemise 
kaalumist. Kui on juba olemas piisavalt tõendeid katseaine klassifitseerimiseks 
nahaärritavuse või -söövitavuse järgi, ei ole vaja sooritada katset laborilooma ­
dega. Seetõttu vähendaks osakaalu analüüsi kasutamine ja järjestikuste katsete tegemise strateegia vajadust  in vivo  katsete tegemise järele, eriti siis, kui aine 
tõenäoliselt tekitab tõsiseid reaktsioone.
 
On soovitav, et kasutataks osakaalu analüüsi olemasoleva, nahaärritavust ja 
-söövitavust käsitleva teabe hindamiseks, et kindlaks määrata, kas sellise võime iseloomustamiseks tuleks teha lisauuringuid, v.a  in vivo  nahauuringud. Kui on 
vaja teha täiendavaid uuringuid, on soovitav, et asjaomaste katseandmete paran ­
damiseks kasutataks järjestikuste katsete tegemise strateegiat. Ainete puhul, 
millega ei ole katseid tehtud, tuleks kasutada järjestikuste katsete tegemise stra ­
teegiat sellise andmekogumi parandamiseks, mida läheb vaja nahaärritavuse ja -söövitavuse hindamiseks. Käesolevas lisas kirjeldatud katsete tegemise strateegia 
töötati välja OECD seminaril (1) ning see kinnitati ja seda laiendati hiljem 
keemiliste ainete mõju inimeste tervisele ja keskkonnale käsitleva lihtsustatud integreeritud ohu klassifitseerimise süsteemis, nagu see kiideti heaks kemikaali ­
komitee ja kemikaalitöörühma 28. ühisistungil 1998. aasta novembris (2).
 
Kuigi käesolev järjestikuste katsete tegemise strateegia ei ole B.4 katsemeetodi 
lahutamatu osa, väljendab see soovitavat lähenemist nahaärritavuse ja -söövitavuse tunnuste kindlaksmääramisele. Nimetatud lähenemine väljendab nii head tava kui ka eetilist võrdluspunkti  in vivo  katsete tegemiseks nahaärritavuse ja -söövitavuse 
kohta. Katsemeetod annab juhiseid  in vivo  katse sooritamiseks ja esitab kokkuvõtte 
teguritest, mida käsitletakse enne katse alustamist. Strateegia on lähenemine katse ­
aine nahaärritavus- ja -söövitavusomadusi käsitlevate olemasolevate andmete hindamisele ja mitmetasandiline lähenemine selliste asjaomaste andmete tekitami ­
sele, mille suhtes on vaja teha lisauuringuid või mille suhtes ei ole tehtud uurin ­
guid. See soovitab samuti nahaärritavust ja -söövitavust käsitlevaid valideeritud ja heakskiidetud  in vitro  või ex vivo  katsete sooritamist teatavatel asjaoludel.
 
HINDAMISTE JA KATSETE TEGEMISE STRATEEGIA KIRJELDUS  
Enne katse sooritamist järjestikuste katsete tegemise strateegia osana (joonis) 
tuleks hinnata kogu kättesaadavad teavet  in vivo  nahauuringute tegemise vajaduse 
kindlaksmääramiseks. Kuigi üksikute parameetrite hindamisel võib saada märki ­
misväärset teavet (nt äärmine pH-väärtus), tuleks olemasolevat teavet tervikuna 
arvesse võtta. Kõigi kõnealuse aine või selle analoogide mõjusid käsitlevate 
andmete hindamiseks tuleks teha otsus osakaalu kohta ja esitada selle otsuse kohta põhjendus. Esmalt rõhutatakse inimestelt ja loomadelt varem saadud ainet käsitlevaid andmeid ja seejärel  in vitro  või ex vivo  katsete tulemusi. Söövi ­
tavaid aineid käsitlevaid  in vivo  katseid tuleks võimaluse korral vältida. Katsete 
tegemise strateegias võetakse arvesse järgmisi tegureid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Inimestelt ja loomadelt varem saadud andmete hindamine (1. etapp).  Inimestelt 
varem saadud andmeid, nt kliinilised või töökeskkonna uuringud ning juhtumia ­
ruanded, ja/või loomadega tehtud katseid käsitlevaid andmeid, nt ühekordsete või korduvate naha vastuvõtlikkust käsitlevate mürgisusuuringute tulemused, tuleks võtta arvesse esmalt, kuna need annavad sellist teavet, mis on vahetult seotud 
nahale mõjumisega. Tuntud ärritavuse või söövitavusega ainetega ja nendega, 
mis on selgelt mittesöövitavad või -ärritavad, ei ole vaja  in vivo  katseid teha.
 
Struktuur-aktiivsusanalüüs (SAR) (2. etapp).  Struktuuriliselt seotud ainetega 
tehtud katsete tulemusi tuleks võimaluse korral arvesse võtta. Kui struktuuriliselt samalaadsete ainete või selliste ainete segude kohta on olemas piisavalt inimestelt ja/või loomadelt saadud andmeid, saame eeldada, et hinnatav katseaine põhjustab 
samu reaktsioone. Sellistel juhtudel ei ole vaja katseainega katset teha. Nega ­
tiivsed tulemused struktuuriliselt samalaadsete ainete või selliste ainete segudega tehtud katsete kohta ei anna piisavalt tõendeid aine mitteärritavuse/ ­
mittesöövitavuse kohta järjestikuste katsete tegemise strateegia alusel. Validee ­
ritud ja heakskiidetud struktuur-aktiivsusanalüüsi abil tuleks kindlaks teha nii 
nahasöövitus kui ka -ärritus.
 
Füüsikalis-keemilised omadused ja keemiline reaktiivsus (3. etapp).  Ained, mille 
äärmine pH-väärtus on näiteks < 2,0 ja > 11,5, võivad avaldada tõsist paikset mõju. Kui äärmine pH-väärtus on aluseks aine nahaärritavuse kindlakstegemisele, 
siis võib samuti võtta arvesse happe-/alusreservi (või puhverdusvõimet) (3, 4). 
Kui puhverdusvõime viitab sellele, et aine ei saa olla nahka ärritav, siis tuleks selle kinnitamiseks teha lisakatse, soovitavalt valideeritud ja heakskiidetud  in 
vitro  või ex vivo  katsete abil (vt 5. ja 6. etapp).
 
Nahakaudne mürgisus (4. etapp).  Kui kemikaal on tõestatult naha kaudu väga 
mürgine, ei ole otstarbekas teha  in vivo  nahaärritust ja -söövitust käsitlevat katset, 
kuna tavapärane katseaine kogus võib ületada väga mürgist annust ning põhjus ­
tada seetõttu loomade surma või tõsiseid kannatusi. Lisaks sellele, kui on juba tehtud nahakaudset mürgisust käsitlevaid katseid albiinoküülikutega kuni piiran ­
nusmäärani 2 000 mg kg kehakaalu kohta või rohkem ning ei ole tuvastatud 
nahaärritust või -söövitust, ei ole vaja teha lisakatset nahaärrituse ja -söövituse kohta. Tarvis on meeles pidada mõned kaalutlused, kui hinnatakse varem soori ­
tatud katsete tulemusi ägeda nahakaudse mürgisuse kohta. Näiteks võib nahakah ­
justuste kohta antud teave olla puudulik. Katsetes ja vaatlustel võib kasutada 
muid liike kui küülik ning liigid võivad oma reaktsioonide tundlikkuse poolest suuresti erineda. Samuti ei pruugi loomadel kasutatava katseaine vorm olla sobiv nahaärrituse/-söövituse hindamiseks (nt ainete lahjendamine nahakaudse mürgi ­
suse kohta katsete tegemiseks (5)). Juhtudel, mil hästi kavandatud ja nahakaudset 
mürgisust käsitlevad katsed on sooritatud küülikutega, võidakse käsitada nega ­
tiivseid leide piisavate tõenditena selle kohta, et aine ei ole söövitav või ärritav.
 
In vitro  või ex vivo  katsete tulemused (5. ja 6. etapp).  Aineid, mis on näidanud 
söövitavaid või tugevalt ärritavaid omadusi valideeritud ja heakskiidetud  in vitro  
või ex vivo  katses (6, 7), mis on kavandatud nimetatud konkreetsete mõjude 
hindamiseks, ei ole vaja katsetada loomade peal. Võib eeldada, et sellistel ainetel 
on samalaadsed tõsised mõjud  in vivo . ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
In vivo  katse küülikutega (7. ja 8. etapp).  Kui tuleks teha osakaaluanalüüs  in vivo  
katse sooritamise kohta, peaks see algama eelkatsest ühte looma kasutades. Kui 
nimetatud katse tulemused viitavad aine söövitavusele nahal, ei tohiks lisakatseid teha. Kui söövitavat toimet ei ole algkatses jälgitud, tuleks ärritavat või nega ­
tiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil neljatunnisel mõju ­
perioodil. Kui algkatses on jälgitud ärritavat mõju, tuleks seejärel sooritada 
kinnitav katse või mõjutada kahte muud looma korraga.
 
VIITED  
1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop söövitavusega Harmonization of Validation and Acceptance 
Criteria mittesöövitavad Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/ background.htm).
 
2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as 
endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/ Qass/HCL6.htm).
 
3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdail D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709–720.
 
4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline 
Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp. 19–26.  
5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411–436.
 
6) Testing Method B.40.  
7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management  Team. Toxicology in Vitro 12, 
pp. 483–524.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Joonis  
NAHAÄRRITUST/-SÖÖVITUST KÄSITLEVATE KATSETE JA HINDAMISE 
STRATEEGIA
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. ÄGE MÜRGISUS: SILMADE ÄRRITUS/SÖÖVITUS  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD TG 405ga (2002).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesoleva ajakohastatud meetodi ettevalmistamisel pööratakse erilist 
tähelepanu võimalikele parandustele seoses loomade heaoluga ja kogu olemasoleva katseainet käsitleva teabe hindamisele, et vältida 
mittevajalikke katseid laboriloomadega. Käesoleva meetodi hulka 
kuulub soovitus, et enne kirjeldatud, silmade ägedat söövitust ja ärritust uuriva  in vivo  katse tegemist analüüsitaks olemasolevate asja ­
omaste andmete osakaalu (1). Kui saadaolevad andmed on puudu ­
likud, saab neid täiendada järjestikuste katsete tegemise abil (2, 3). 
Katsete tegemise strateegia, mis on esitatud käesoleva meetodi lisas, hõlmab valideeritud ja heakskiidetud  in vitro  katsete sooritamist. 
Lisaks sellele on soovitav enne  in vivo  silmade katse tegemist teha 
silmade söövituse ennustamiseks  in vivo  nahaärrituse ja -söövituse 
katse.
 
Nii mõistlike teaduslike meetodite kui ka loomade heaolu huvides ei 
tehta in  vivo  katseid enne, kui on hinnatud kogu kättesaadava, katse ­
aine võimalikku silmade söövitamist/ärritamist käsitleva teabe 
osakaalu. Sellisteks andmeteks on tõendid varasematest inimeste 
ja/või laboriloomadega tehtud uuringutest, tõendid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse ja ärrituse kohta, aine tugevale happesusele või leelisusele 
viitavad andmed (4, 5) ning valideeritud ja heakskiidetud  in vitro  või 
ex vivo  silmade söövitust ja ärritust uurivate katsete tulemused (6, 
6a). Katsed võib teha enne osakaalu analüüsi või selle tulemusena.
 
Teatavate ainete puhul võib selline analüüs viidata vajadusele teha  in 
vivo katseid aine võimaliku silmade söövitavuse ja ärrituvuse välja ­
selgitamiseks. Kõikidel sellistel juhtudel on soovitav esmalt enne  in 
vivo silmade katse tegemist teha katse  in vivo  aine nahakaudsete 
mõjude väljaselgitamiseks ja hinnata tulemusi vastavalt katsemeeto ­
dile B.4 (7). Osakaalu analüüsi tegemine ja järjestikuste katsete tege ­
mise strateegia vähendaksid vajadust  in vivo  aine võimalikku silmade 
söövitavust/ärritavust uuriva katse tegemise järele, mille kohta on 
muudest katsetest saadud juba piisavalt tõendeid. Kui silmade söövi ­
tavust või ärritavust ei suudeta kindlaks määrata järjestikuste katsete tegemise strateegiat kasutades isegi pärast  in vivo  nahasöövitust ja 
-ärritust uuriva katse tegemist, võib teha  in vivo  silmade söövitust/ ­
ärritust uuriva katse.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Eelistatud järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab vali ­
deeritud ja heakskiidetud  in vitro  või ex vivo  katsete sooritamist 
söövitavuse ja ärritavuse kohta, on esitatud käesoleva meetodi lisas. Strateegia töötati välja OECD seminaril (8), kus osalenud seda ühehäälselt soovitasid, ja see kiideti heaks soovitusliku katsete 
tegemise strateegiana keemiliste ainete klassifitseerimist käsitlevas 
globaalselt ühtlustatud süsteemis (GHS) (9). Soovitatakse, et nime ­
tatud katsestrateegiat kasutataks enne  in vivo  katsete tegemist. Uute 
ainete katsetamisel on soovitav etapiviisiline katsete tegemine teadus ­
likult usaldatavate andmete tootmiseks aine söövitavuse ja ärritata ­
vuse kohta. Olemasolevate ainete puhul, mille naha ja silmade söövi ­
tavuse ja -ärritavuse kohta ei ole piisavalt andmeid, tuleks strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Kui otsustatakse kasutada 
muud katsete tegemise strateegiat või menetlust või mitte kasutada 
etapiviisilist katsete tegemist, siis tuleks seda otsust põhjendada.
 
1.2. MÕISTED  
Silmade ärritus –  selliste muutuste tekkimine silmas pärast seda, kui 
katseainet on manustatud silma eespinnale, mis täielikult pöörduvad 
21 päeva jooksul pärast manustamist.  
Silmade söövitus –  koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsi ­
line nägemislangus pärast seda, kui katseainet on manustatud silma eespinnale, mis on täielikult pöördumatud 21 päeva jooksul pärast aine manustamist.
 
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritavat ainet manustatakse ühekordse annusena katselooma ühte 
silma, katselooma töötlemata silm toimib kontrollina. Silmade ärrituse/söövituse astet hinnatakse sidekesta, sarvkesta ja vikerkesta kahjustustele punkte andes teatavate intervallide tagant. Muid 
mõjusid silmas ja kahjulikke süsteemseid mõjusid kirjeldatakse 
samuti selleks, et hinnata täielikult mõjusid. Katse kestab niikaua, et vaadeldud mõjude pöörduvust või pöördumatust saaks hinnata.
 
Loomad, kellel on jätkuvalt tugeva stressi ja/või valu tunnused igal 
katseetapil, tuleks humaanselt tappa ja seda võetakse aine hindamisel arvesse. Suremas olevate ja tugevalt kannatavate loomade humaanse 
tapmise kriteeriumid on toodud viites (10).
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  In vivo  katse ettevalmistamine  
1.4.1.1  Loomaliikide valik  
Eelistatud laboriloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori 
täiskasvanud küülikuid. Muude liikide või liinide kasutamist tuleks põhjendada.
 
1.4.1.2.  Loomade ettevalmistamine  
Kummagi katsesse valitud looma mõlemat silma uuritakse 24 tunni 
jooksul enne katse algust. Ei tohiks kasutada loomi, kellel esineb 
silmade ärritust, silmadefekte või varasemaid sarvkestakahjustusi.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Loomade pidamise ja toitmise tingimused  
Loomi hoitakse eraldi puurides. Loomade katseruumi temperatuur 
küülikutel peaks olema 20  o C (± 3  o C). Kuigi suhteline niiskus 
peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja 
arvatud ruumi puhastamise ajal, siis eesmärk on hoida see vahemikus 
50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.
 
1.4.2.  Katsemenetlus  
1.4.2.1.  Katseaine manustamine  
Katseainet manustatakse iga looma ühe silma sidekestakotti, tõmmates 
alumist laugu õrnalt silmamunast eemale. Seejärel pigistatakse laud 
umbes üheks sekundiks õrnalt kinni, et vältida aine silmast väljavalgu ­
mist. Teine silm, mida ei töödelda, toimib kontrollina.  
1.4.2.2.  Loputamine  
Katseloomade silmi ei tohiks pesta vähemalt 24 tundi pärast katse ­
aine manustamist, välja arvatud tahkete ainete puhul (vt punkt 1.4.2.3.2) ja koheste sööbivate või ärritavate mõjude korral. 24 
tunni pärast võib loputada, kui seda peetakse vajalikuks.
 
Pesemise mõju selgitamiseks ei soovitata kasutada loomade kontroll ­
rühma, välja arvatud juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud. Kui 
on vaja kontrollrühma, kasutatakse kahte küülikut. Pesemise tingi ­
mused tuleks hoolikalt dokumenteerida, nt pesemisaeg, pesemisla ­
huse koostis ja temperatuur, pesemise kestus, vedeliku kogus ja 
voolukiirus.  
1.4.2.3  Annusmäär  
1.4.2.3.1.  Vedelike uurimine  
Vedelike uurimiseks kasutatakse 0,1 ml annust. Pumppihustist ei tohi 
ainet otse silma manustada. Vedelikujuga tuleks väljutada ja koguda mahutisse enne 0,1 ml silma manustamist.
 
1.4.2.3.2.  Tahkete ainete uurimine  
Tahkete ainete, pastade ja osakeste uurimisel peaks kasutatav kogus 
olema 0,1 ml või kaaluga kuni 100 mg. Katseaine tuleks jahvatada 
peeneks tolmuks. Tahke aine kogust tuleks mõõta pärast selle õrnalt tihendamist, nt raputades mõõtemahutit. Kui tahket katseainet ei ole katselooma silmast eemaldatud füsioloogiliste mehhanismide abil 
esimese vaatluse ajal üks tund pärast käsitlemist, loputatakse silma 
füsioloogilise soolalahusega või destilleeritud veega.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3.  Aerosoolide uurimine  
Soovitatavalt kogutakse kõik pumbatavad joad ja aerosoolid enne 
silma manustamist. Üheks erandiks on survestatud aerosoolmahutites 
ained, mida ei saa koguda aurustumise tõttu. Sellistel juhtudel tuleks silm hoida lahti ja katseaine panna silma ligikaudu üks sekund kestva lihtsa purskega 10 cm kauguselt otse silma ees. Nimetatud 
vahemaa võib muutuda sõltuvalt pihusti survest ja sisaldusest. Tuleks 
olla ettevaatlik, et pihusti surve ei teeks silmale liiga. Mõnel juhul võib osutuda vajalikuks hinnata pihusti tugevusest silmale põhjus ­
tatud võimalikke „mehaanilisi” kahjustusi.
 
Aerosooliannuse suurust võib hinnata katset järgmiselt simuleerides: 
ainet pihustatakse kaalupaberile otse paberi ees oleva küüliku silma 
suurusest avausest. Paberi kaalu suurenemise abil hinnatakse silma pihustatud kogust. Lenduvate ainete puhul võib hinnata annust kogu ­
mismahuti kaalumise teel enne ja pärast katseaine eemaldamist.
 
1.4.2.4.  Algkatse (ühe loomaga  in vivo  nahaärrituvus/-söövitavuskatse)  
Järjestikuste katsete tegemise strateegia kohaselt (vt 1. lisa) on väga 
soovitav, et  in vivo  katse sooritataks algselt ühe loomaga.  
Kui nimetatud katse tulemused tõendavad, et aine on kirjeldatud 
menetlust kasutades silma söövitav või tugevalt ärritav, ei ole silma ärritavuse kindlakstegemiseks vaja teha täiendavaid katseid.
 
1.4.2.5.  Lokaalanesteetikumid  
Lokaalanesteetikume võib kasutada igal üksikjuhul. Kui osakaalu 
analüüs viitab sellele, et aine võib põhjustada valu, või kui algkat ­
sega tõendatakse, et võib toimuda valulik reaktsioon, võib lokaala ­
nesteetikume kasutada enne katseaine manustamist. Lokaalanesteeti ­
kumi liik, kontsentratsioon ja annus tuleks valida hoolikalt, et erine ­
vused katseainele reageerides ei tuleneks selle kasutamisest. Kont ­
rollsilma tuleb samamoodi tuimestada.  
1.4.2.6.  Kinnitav katse ( in vivo  silmade ärritust käsitlev katse täiendavate 
loomadega)  
Kui söövitavat toimet ei ole algkatses täheldatud, tuleks ärritavat või 
negatiivset reaktsiooni kinnitada kahe muu looma kasutamise abil. Kui algkatses täheldatakse tugevat ärritavat mõju, mis viitab võima ­
likule tugevale (pöördumatule) mõjule kinnitava katse tegemisel, on 
soovitav, et kinnitav katse tehtaks järjestikku ühe loomaga korraga, mitte kahte lisalooma korraga mõjutades. Kui teisel loomal esineb söövitavaid või tugevalt ärritavaid mõjusid, siis katset enam ei 
jätkata. Lisaloomasid võib vaja minna nõrkade või mõõdukate ärri ­
tavate reaktsioonide kinnitamiseks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Jälgimisperiood  
Jälgitakse seni, kuni on võimalik täielikult hinnata vaadeldud mõjude 
ulatust ja pöörduvust. Katse tuleks lõpetada igal juhul siis, kui loomal on jätkuvalt tugeva valu või stressi tunnused (9). Mõjude 
pöörduvuse kindlaksmääramiseks tuleks jälgida loomi tavaliselt 21 
päeva pärast katseaine manustamist. Kui pöörduvus ilmneb enne 21 päeva möödumist, tuleks katse lõpetada sel ajal.
 
1.4.2.7.1.  Kliinilised vaatlused ja silma reaktsioonide hindamine  
Silmi tuleks jälgida 1, 24, 48 ja 72 tundi pärast katseaine manusta ­
mist. Loomi ei uurita pärast seda, kui on saadud lõplikud andmed. Loomad, kellel jätkuvalt esineb tugevat valu või stressi, tuleks viivi ­
tamata humaanselt tappa, ning ainet tuleks hinnata vastavalt sellele. 
Humaanselt tuleks tappa loomad, kellel aine manustamise järel 
esineb järgmisi silmakahjustusi: sarvkesta perforatsioon või märgatav sarvkesta haavand, kaasa arvatud silmasopislaiend; veri silma eeskambris; hinde 4 sarvkesta läbipaistmatus, mis püsib 48 tunni 
jooksul; valgusrefleksi puudumine (vikerkesta reaktsioon – hinne 
2), mis püsib 72 tunni jooksul; sidekesta haavand; sidekesta või niktatsioonikesta nekroos või armistumine. Seda seetõttu, et sellised kahjustused üldiselt on pöördumatud.
 
Loomad, kellel ei esine silmakahjustusi, võib tappa mitte varem kui 
kolm päeva pärast manustamist. Loomi, kellel esinevad kerged või mõõdukad kahjustused, tuleks jälgida seni, kuni kahjustused on selged, või 21 päeva, mil katse lõpetatakse. Jälgitakse 7, 14 ja 21 
päeva, et kindlaks määrata kahjustuste seisund ning nende pöörduvus 
või pöördumatus.
 
Silmade reaktsiooni (sidekest, sarvkest ja vikerkest) hinded tuleks 
registreerida iga kord, kui looma uuritakse (tabel 1). Kõikidest 
muudest silmakahjustustest (nt silma sarvkestakiht, värvumine) või 
kahjulikest süsteemsetest mõjudest tuleks samuti teada anda.  
Reaktsioonide uurimist võib hõlbustada binokulaarluubi, pilulambi, 
biomikroskoobi või muu sobiva seadme kasutamine. Pärast vaat ­
luste registreerimist 24 tunni jooksul võib silmi edasi uurida fluo ­
restseiini abil.  
Silma reaktsioonide hindamine on tingimata subjektiivne. Silma 
reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning katselaboratooriumide 
ning jälgivate või tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatlusi 
tegevatel isikutel piisavalt tundma õppida kasutatavat hindamissüs ­
teemi (vt tabel allpool).  
2. ANDMED  
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE  
Silmaärrituse punkte tuleks hinnata vastavalt kahjustuste laadile ja 
raskusele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud 
määramised ei esinda aine ärritavate omaduste absoluutset taset, kuna samuti hinnatakse katseaine muid mõjusid. Selle asemel tuleks käsitada üksikuid punkte kontrollväärtustena ja need on tähendus ­
rikkad üksnes siis, kui neid on täielikult kirjeldatud ja kõiki vaatlusi 
on hinnatud.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Põhjendus  in vivo  katse tegemiseks: varasemate katseandmete, sh 
järjestikuste katsete tegemise strateegia põhjal saadud tulemuste 
osakaalu analüüs:  
— varasematest katsetest saadud asjaomaste andmete kirjeldus;  
— katsestrateegia igal etapil saadud andmed;  
— in vitro  katsete kirjeldus, sh menetluste üksikasjad, katse-/ ­
võrdlusainetest saadud tulemused;  
— in vivo  nahaärritust/-söövitust uuriva katse, sh saadud tulemuste 
kirjeldus;  
— osakaalu analüüs  in vivo  uurimuse sooritamiseks.  
Katseaine:  
— tunnusandmed (nt CASi number, algupära, puhtus, tuntud 
lisandid, partii number);  
— füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, 
lenduvus, lahustuvus, stabiilsus, reaktiivsus veega);  
— kui tegu on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised prot ­
sendimäärad;  
— kui kasutatakse lokaalanesteetikumi, selle nimetus, puhtus, liik, 
annus ja võimalik koostoime katseainega.  
Kandeaine:  
— —– nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;  
— kandeaine valiku põhjendamine.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/liin, põhjendus muude loomade kui albiinoküüli ­
kute kasutamiseks;  
— iga looma vanus katse alguses;  
— mõlemast soost loomade arv katse- ja kontrollrühmas (vajaduse 
korral);  
— üksikute loomade kaalud katse alguses ja lõpus;  
— päritolu, elamistingimused, toitumine jne.  
Tulemused:  
— igal vaatlusel ärritusele punktide andmisel kasutatava meetodi 
kirjeldus (nt pilulamp, biomikroskoop, fluorestseiin);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— tabeli kujul andmed iga looma ärritavate/söövitavate reaktsioo ­
nide kohta igal vaatlusel kuni katselooma kõrvaldamiseni katsest;  
— jälgitud ärrituse või söövituse astme ja laadi kirjeldus;  
— muude jälgitud silmakahjustuste kirjeldus (nt vaskularisatsioon, 
silma sarvkestakihi tekkimine, liited, värvumine);  
— mujal kui silmas tuvastatud paiksete või süsteemsete kahjulike 
mõjude ja histopatoloogiliste leidude kirjeldus.  
Tulemuste arutelu.  
3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Katseloomadega tehtud silma ärritust uurivate katsete tulemuste 
ekstrapolatsioon inimestele on kehtiv üksnes piiratud ulatuses. 
Paljudel juhtudel on albiinoküülikud silma ärritavatele või söövita ­
vatele ainetele tundlikumad kui inimesed.  
Tuleks olla ettevaatlik andmete tõlgendamisel, et välistada sekun ­
daarsest nakkusest tingitud ärritust.  
4. VIITED  
1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L, Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., 
Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.
 
2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., 
Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35., 159–164.
 
3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.  
4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P, Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19–26.
 
5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.
 
6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
 
6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.  
8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. 
Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http:// ­
www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, as endorsed by the 28  th Joint Meeting 
of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).  
10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications. Series on Testing and 
Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabel 1  
SILMAKAHJUSTUSTE HINDAMINE  
Sarvkest  
Hägusus: tihedusaste (mõõtmised tuleks teha kõige tihedamas kohas) (*) 
Ei esine haavandeid või hägusust . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Hajutatud või hajusad hägususalad (välja arvatud tavapärase läike kerge 
tuhmumine); vikerkesta selgelt nähtavad detailid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Kergesti märgatav poolläbipaistev ala; vikerkesta kergelt varjatud 
detailid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Pärlmutrine ala; vikerkesta detailid ei ole nähtavad; pupilli suurus on 
vaevunähtav . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Läbipaistmatu sarvkest; vikerkest ei eristu läbi hägususe . . . . . . . . . . . . . 4  
Suurim võimalik punktide arv: 4  
MÄRKUSED  
(*) Sarvkesta hägususala tuleks mainida.  
Vikerkest  
Tavaline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Selgesti süvenenud kurrud, verepais, turse, mõõdukas liigveresus sarv ­
kesta ümber; või injektsioon; vikerkest reageerib valgusele (pikaldast 
reaktsiooni peetakse katseaine mõjuks) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Verejooks, täielikult hävinud vikerkest või ei reageeri valgusele . . . . . 2  
Suurim võimalik punktide arv: 2  
Sidekest  
Punasus (viitab laugude ja silmamuna sidekestale, v.a sarv- ja vikerkest) 
Tavaline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Mõned hüpereemilised veresooned (injekteeritud) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Hajunud sügavpunane värvus; üksikuid veresooni ei ole kerge eristada 2 Hajunud tumepunane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
 
Suurim võimalik punktide arv: 3  
Sidekesta turse  
Turse (viitab laugudele ja/või niktatsioonikestale) 
Tavaline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Mõningane tavapärasest suurem turse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Selge turse, laud osaliselt ümber pöördunud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Turse, laud poolsuletud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Turse, laud rohkem kui poolsuletud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Suurim võimalik punktide arv: 4  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
Lisa 
Silma ärritavust ja söövitavust uurivate järjestikuste katsete tegemise 
strateegia  
ÜLDKAALUTLUSED  
Mõistlike teaduslike meetodite ja loomade heaolu huvides on oluline vältida 
loomade tarbetut kasutamist ja vähendada selliste katsete tegemist, mis tõenäoli ­
selt tekitab tõsiseid reaktsioone loomadel. Kogu teavet aine võimaliku silmade ärritavuse/söövitavuse kohta tuleks hinnata enne  in vivo  katse tegemise kaalumist. 
Võimalik, et on juba olemas piisavalt tõendeid katseaine klassifitseerimiseks 
silmade ärritavuse või söövitavuse järgi, ja ei ole vaja sooritada katset laboriloo ­
madega. Seetõttu vähendaks osakaaluanalüüsi kasutamine ja järjestikuste katsete tegemise strateegia vajadust  in vivo  katsete tegemise järele, eriti siis, kui aine 
tõenäoliselt tekitab tõsiseid reaktsioone.
 
On soovitav, et kasutataks osakaaluanalüüsi olemasoleva, silmade ärritavust ja 
söövitavust käsitleva teabe hindamiseks, et kindlaks määrata, kas tuleks teha 
lisakatseid, v.a  in vivo  silmi uurivad katsed, sellise võime iseloomustamiseks. 
Kui on vaja teha täiendavaid katseid, on soovitav, et kasutatakse järjestikuste katsete tegemise strateegiat asjaomaste katseandmete parandamiseks. Ainete 
puhul, millega ei ole katseid tehtud, tuleks kasutada järjestikuste katsete tegemise 
strateegiat selliste andmete parandamiseks, mida läheb vaja silmade ärritavuse ja söövitavuse hindamisel. Käesolevas lisas kirjeldatud katsete tegemise strateegia töötati välja OECD seminaril (1). Seda kinnitati ja laiendati hiljem keemiliste 
ainete mõju inimeste tervisele ja keskkonnale käsitleva integreeritud ohtude 
harmoneeritud klassifitseerimise süsteemis, nagu see on heaks kiidetud kemikaa ­
likomitee ja kemikaalitöörühma 28. ühisistungil 1998. aasta novembris (2).
 
Kuigi käesolev järjestikuste katsete tegemise strateegia ei ole B.5 katsemeetodi 
lahutamatu osa, väljendab see soovitavat lähenemist silmade ärritavuse ja söövi ­
tavuse tunnuste kindlaksmääramiseks. Nimetatud lähenemine väljendab nii head 
tava kui ka eetilist võrdluspunkti  in vivo  silmade ärritust ja söövitust uurivate 
katsete tegemise kohta. Katsemeetod annab juhiseid  in vivo  katse sooritamiseks ja 
esitab kokkuvõtte teguritest, mida käsitletakse enne katse alustamist. Järjestikuste 
katsete tegemise strateegia on lähenemine katseaine silmade ärritavus- ja söövi ­
tavusomadusi käsitlevate olemasolevate andmete hindamisele ning mitmetasandi ­
line lähenemine selliste asjaomaste andmete tekitamisele, mille suhtes on vaja teha täiendavaid katseid või mille suhtes ei ole tehtud katseid. Strateegia hõlmab 
esmalt valideeritud ja heakskiidetud  in vitro  või ex vivo  katsete ja seejärel katse ­
meetodi B.4 sooritamist (nahaärritust/-söövitust uurivad katsed) teatavatel tingi ­
mustel (3, 4).
 
ETAPIVIISILISE KATSETE TEGEMISE STRATEEGIA KIRJELDUS  
Enne katse sooritamist järjestikuste katsete tegemise strateegia osana (joonis) 
tuleks hinnata kogu kättesaadavad teavet  in vivo  silmi uurivate katsete tegemise 
vajaduse kindlaksmääramiseks. Kuigi üksikute parameetrite hindamisel võib saada märkimisväärset teavet (nt äärmine pH-väärtus), tuleks võtta arvesse ole ­
masolev teave tervenisti. Kõiki kõnealuse aine ja selle analoogide mõjusid käsit ­
levaid andmeid tuleks hinnata, tehes otsuse osakaalu kohta, ja esitada selle otsuse kohta põhjendus. Esmalt rõhutatakse inimestelt ja loomadelt varem saadud, ainet käsitlevaid andmeid ja seejärel  in vitro  või ex vivo  katsete tegemise tulemusi. 
Söövitavaid aineid käsitlevaid  in vivo  katseid tuleks võimaluse korral vältida. 
Katsete tegemise strateegias võetakse arvesse järgmiseid tegureid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Inimestelt ja loomadelt varem saadud andmete hindamine (1. etapp).  Inimestelt 
varem saadud andmeid, nt kliinilised või töökeskkonna uuringud ning juhtumia ­
ruanded, ja/või loomadega tehtud silmi uurivaid katseid käsitlevaid andmeid tuleks võtta arvesse esmalt, kuna need annavad sellist teavet, mis on vahetult seotud silmadele mõjumisega. Seejärel tuleks hinnata inimesi ja/või loomi uuri ­
vatest katsetest kättesaadavaid andmeid, mis uurivad naha söövitust/ärritust. 
Loomadele ei saa silma manustada aineid, mis on teatavasti silmi söövitavad või tugevalt ärritavad, ega aineid, millel on nahka söövitav või ärritav toime, sest selliseid aineid tuleks pidada samuti silmi söövitavateks ja/või ärritavateks. 
Aineid, mille kohta on varem tehtud silmi uurivatest katsetest piisavalt tõendeid, 
et need ei ole söövitavad ega ärritavad, ei tohiks samuti kasutada  in vivo  silmi 
uurivates katsetes.
 
Struktuur-aktiivsusanalüüs (SAR) (2. etapp) . Struktuuriliselt samalaadsete aine ­
tega tehtud katsete tulemusi tuleks võimaluse korral arvesse võtta. Kui struktuu ­
riliselt samalaadsete ainete või selliste ainete segude kohta on olemas piisavalt 
inimestelt ja/või loomadelt saadud andmeid, mis viitavad nende silmi 
söövitavale/ärritavale mõjule, saame eeldada, et hinnatav katseaine põhjustab samu reaktsioone. Sellistel juhtudel ei ole vaja katseainet uurida. Negatiivsed tulemused struktuuriliselt samalaadsete ainete või selliste ainete segudega tehtud 
katsete kohta ei anna piisavalt tõendeid aine mitteärritavuse/mittesöövitavuse 
kohta järjestikuste katsete tegemise strateegia alusel. Valideeritud ja heakskii ­
detud struktuur-aktiivsusanalüüsi abil tuleks kindlaks teha nii naha kui ka silmade söövitus ja ärritus.
 
Füüsikalis-keemilised omadused ja keemiline reaktiivsus (3. etapp).  Ained, mille 
äärmine pH-väärtus on näiteks ≤ 2,0 ja ≥ 11,5, võivad avaldada tõsist paikset 
mõju. Kui äärmine pH-väärtus on aluseks aine silmade söövitavuse või ärritavuse 
kindlakstegemiseks, siis võib samuti võtta arvesse happe-/alusreservi (või puhver ­
dusvõimet) (5, 6). Kui puhverdusvõime viitab sellele, et aine ei või olla silmi söövitav, siis tuleks selle kinnitamiseks teha lisakatse, soovitavalt valideeritud ja 
heakskiidetud  in vitro  või ex vivo  katsete abil (vt 5. ja 6. etapp).
 
Muu olemasoleva teabe arvessevõtmine (4. etapp).  Kogu süsteemset nahakaudset 
mürgisust käsitlevat kättesaadavat teavet tuleks hinnata igal etapil. Samuti tuleks 
arvesse võtta katseaine ägedat nahakaudset mürgisust. Kui on tõendatud, et katse ­
aine on väga mürgine naha kaudu, siis seda ei või silmas katsetada. Kuigi ägeda nahakaudse mürgisuse ja silmade ärrituse/söövituse vahel ei ole tingimata seost, 
võib eeldada, et kui aine on naha kaudu väga mürgine, võib see samuti olla väga 
mürgine silma pannes. Selliseid andmeid võib samuti arvesse võtta 2. ja 3. etapil.
 
In vitro  või ex vivo  katsete tulemused (5. ja 6. etapp).  Aineid, mis on näidanud 
söövitavaid või tugevalt ärritavaid omadusi valideeritud ja heakskiidetud  in vitro  
või ex vivo  katses (7, 8), mis on valideeritud ja heakskiidetud spetsiaalselt 
silmade või naha ärrituse/söövituse hindamiseks, ei ole vaja katsetada loomade peal. Võib eeldada, et sellistel ainetel on sarnased tõsised mõjud  in vivo . Kui 
valideeritud ja heakskiidetud  in vitro /ex vivo  katsed ei ole kättesaadavad, tuleks 
vahele jätta 5. ja 6. etapp ning liikuda otse etappi 7.
 
Aine in vivo  nahakaudse ärritavuse või söövitavuse hindamine (7. etapp).  Kui ei 
ole piisavalt tõendeid selle kohta, millega teha lõplik osakaaluanalüüs aine võimaliku silmade ärritavuse/söövitavuse kohta, mis põhineb eespool nimetatud katsetest saadud andmetel, siis esmalt hinnatakse  in vivo  nahaärritavuse/-söövita ­
vuse võimet, kasutades katsemeetodit B.4 (4) ja selle lisa (9). Kui on tõendatud, 
et aine võib tekitada söövitust või tugevaid nahaärritusi, tuleks seda pidada söövitavaks silmaärritust tekitavaks aineks, välja arvatud juhul, kui teave toetab alternatiivset järeldust. Seega ei ole vaja sooritada  in vivo  silmi uurivat katset. 
Kui aine ei ole nahka söövitav ega tugevalt ärritav, siis tuleks sooritada  in vivo  
silmi uuriv katse.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
In vivo  katse küülikutega (8. ja 9. etapp ). In vivo  silmi uurivad katsed peaksid 
algama algkatsega, kus kasutatakse ühte looma. Kui nimetatud katse tulemused 
tõendavad, et aine on silma söövitav või tugevalt ärritav kirjeldatud menetlust kasutades, ei ole vaja teha täiendavaid katseid. Kui nimetatud katsest ei ilmne mis tahes söövitavad või tugevalt ärritavad mõjud, tehakse kinnitav katse kahe 
lisaloomaga.
 
VIITED  
1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria 
for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 
22–24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/ 
Qass/HCL6.htm).  
3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161–177.  
4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion.  
5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro, 2,  19–26.  
6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential 
of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 
12, 227-231.  
7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, PA., Curren, R.D., Earl, 
L.K, Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 
483–524.
 
8) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
9) Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irri ­
tation and Corrosion.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Joonis  
Silmade ärritust/söövitust käsitlevate katsete ja hindamise strateegia
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. NAHA SENSIBILISEERIMINE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Märkused  
Katsete tundlikkust ja võimet tuvastada inimeste naha võimalikke 
sensibiliseerijaid loetakse inimese tervisega seotud toksilisuse liigita ­
mise seisukohalt oluliseks.  
Ei ole olemas uurimismeetodit, mis identifitseeriks adekvaatselt kõik 
ained, mis võivad inimese nahka sensibiliseerida ja mis sobiks kõikide ainete puhul.
 
Katse valimisel tuleb kaaluda aine füüsikalisi omadusi, sealhulgas 
aine võimet tungida läbi naha.  
Välja on töötatud kahte liiki katsed, milles kasutatakse merisigu: 
abiainega katsed, milles võimendatakse allergiaseisundit sellega, et 
uuritavat ainet lahustatakse või suspendeeritakse Freundi täielikus abiaines  (Freund's Complete Adjuvant  – FCA), ja abiaineta katsed.
 
Abiainega katsed on tõenäoliselt konkreetse aine võimaliku nahka 
sensibiliseeriva toime ennustamisel täpsemad kui need meetodid, mis ei kasuta Freundi täielikku abiainet, ning seega tuleks selliseid meetodeid eelistada.
 
Merisigade maksimeerimise katse (GPMT) on laialdaselt kasutatud 
abiainega katse. Olgugi, et on olemas mitmeid meetodeid, millega on võimalik tuvastada aine potentsiaali kutsuda esile naha sensibiliseeriv reaktsioon, loetakse GPMT katset eelistatud abiainega katseks.
 
Paljude keemiliste ainete klasside puhul peetakse abiaineta katseid 
(millest eelistatakse Buehleri katset) vähem tundlikuks.  
Teatavatel juhtudel võib Buehleri katse valimine olla põhjendatud, 
kuna selles katses manustatakse aine paikselt, mitte nahasisese süsti ­
mise teel nagu GPMT puhul. Buehleri katse kasutamist tuleks teaduslikult põhjendada.
 
Käesolevas meetodis kirjeldatakse GPMTd ja Buehleri katset. Kasu ­
tada võib ka teisi meetodeid tingimusel, et need on hästi valideeritud ja teaduslikult põhjendatud.
 
Kui tunnustatud sõelkatsega saadakse positiivne tulemus, võib uuri ­
tava aine määrata võimalikuks sensibiliseerijaks ning täiendava meri ­
seakatse tegemine ei pruugi olla vajalik. Kui sellisel katsel on siiski negatiivne tulemus, tuleb meriseakatse teha käesolevas uurimismee ­
todis kirjeldatud korras.
 
Vt ka üldise sissejuhatuse B osa.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. MÕISTED  
Naha sensibiliseerimine  – (allergiline kontaktne dermatiit) on mingi 
aine poolt põhjustatud immunoloogiliselt vahendatud nahareaktsioon. Inimestel võib vastureaktsiooniks olla sügelemine, punetus, paistetus, 
paapulid, vesivillid või nende kombinatsioon. Teiste liikide puhul 
võivad reaktsioonid erineda ning esineda võib ainult punetust ja paistetust.
 
Induktsioonkokkupuude  – katsealuse kokkupuude uuritava ainega, 
mille eesmärk on kutsuda esile ülitundlik seisund.  
Induktsiooniperiood  – pärast induktsioonkokkupuudet vähemalt 
nädal aega kestev periood, mille ajal võib kujuneda ülitundlik 
seisund.  
Allergilise reaktsiooni esile kutsuv kokkupuude  – eelnevalt käsitletud 
katsealuse kokkupuude uuritava ainega pärast induktsiooniperioodi 
selleks, et määrata kindlaks, kas katsealune reageerib ülitundlikult.  
1.3. VÕRDLUSMATERJAL  
Kasutatud uurimismeetodi tundlikkust ja usaldusväärsust tuleks 
hinnata kord kuue kuu jooksul, kasutades selleks aineid, mille 
puhul on teada, et neil on nõrga või keskmise toimega nahka sensi ­
biliseerivad omadused.  
Nõuetekohaselt tehtud abiainega katses peaks eeldatavasti reageerima 
vähemalt 30 % ja abiaineta katses vähemalt 15 % nõrga või kesk ­
mise toimega sensibiliseerijat.  
Eelistatakse järgmisi aineid:  
CASi number EINECSi number EINECSi nimed Üldnimetused  
101-86-0 202-983-3 α-heksüülkaneelaldehüüd α-heksüülkaneelaldehüüd 
149-30-4 205-736-8 bensotiasool-2-tiool (merkapto ­
bensotiasool) kaptaks 
94-07-7 202-303-5 bensokaiin nordkaiin  
Teatavas olukorras võib piisavate põhjenduste korral kasutada ka 
teisi eespool nimetatud kriteeriumidele vastavaid võrdlusaineid.  
1.4. UURIMISMEETODI PÕHIMÕTE  
Katseloomad puutuvad uuritava ainega esimest korda kokku nahasi ­
sese süstimise ja/või nahale määrimise kaudu (induktsioonkokku ­
puude). Pärast 10–14päevast puhkeaega (induktsiooniperioodi), 
mille jooksul võib välja kujuneda immuunsusreaktsioon, puutuvad loomad kokku nakatumist esile kutsuva doosiga. Katseloomade naha reaktsiooni määra ja ulatust võrreldakse võrdlusloomade 
omaga, kes saavad induktsiooni ajal platseeboravi ning kellele 
seejärel manustatakse nakatumist esile kutsuv doos.
 
1.5. UURIMISMEETODI KIRJELDUS  
Kui uuritava aine eemaldamist peetakse vajalikuks, tuleks seda teha 
vee või sobiva lahustiga, ilma et see muudaks olemasolevat reakt ­
siooni või kahjustaks naha pinda.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Merisigade maksimeerimise katse (GPMT)  
1.5.1.1. V a l m i s t i s e d  
Terveid albiinomerisigu harjutatakse laboritingimustega vähemalt 
viie päeva jooksul enne katse tegemist. Enne katse tegemist jagatakse 
loomad juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Karvad eemaldatakse 
sõltuvalt kasutatavast uurimismeetodist lõikamise, raseerimise või vajaduse korral keemilise depilatsiooni teel. Tuleb olla ettevaatlik, et vältida naha hõõrdumist. Loomi kaalutakse enne katse algust ning 
katse lõpus.
 
1.5.1.2. K a t s e t i n g i m u s e d  
1.5.1.2.1. Katseloomad  
Katseloomadena kasutatakse üldkasutatavate albiinomerisigade labo ­
ratoorseid aretusliine.  
1.5.1.2.2. Arv ja sugu  
Kasutada võib isas- ja/või emasloomi. Kui kasutatakse emasloomi, 
peaksid nad olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined.  
Katserühmas on vähemalt kümme looma ning võrdlusrühmas vähe ­
malt viis looma. Kui katserühmas ja võrdlusrühmas on kasutatud 
vastavalt vähem kui 20 ja kümmet merisiga ning kui ei ole võimalik järeldada, et uuritav aine on sensibilisaator, soovitatakse tungivalt täiendavate loomad uurimist, et kokku oleks vähemalt 20 katse- ja 
kümme võrdluslooma.
 
1.5.1.2.3. Doositasemed  
Uuritava aine kontsentratsioon peaks iga induktsioonkokkupuute 
kohta olema süsteemselt hästi talutav ning kasutada tuleks kõrgeimat kerget kuni keskmist nahaärritust tekitavat kontsentratsiooni. Naka ­
tumist esile kutsuva doosi puhul kasutatav kontsentratsioon peaks 
olema suurim ärritust mitte esile kutsuv doos. Vajaduse korral võib 
vajalikud kontsentratsioonid määrata kindlaks kahe või kolme loomaga tehtud prooviuuringute põhjal. Sellisel juhul tuleks kaaluda selliste loomade kasutamist, kellele on ainet manustatud FCA abil.
 
1.5.1.3. K a t s e k ä i k  
1.5.1.3.1. Induktsioon  
Katserühma 0-päev  
Abaluude piirkonda, kust on eemaldatud karvad, süstitakse naha alla 
3 × 2 korda 0,1 ml selliselt, et kolm süsti tehakse keskjoonest vasakule ja kolm keskjoonest paremale.
 
Injektsioon 1: 1:1 segu (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest 
keedusoolalahusest  
Injektsioon 2: valitud kontsentratsiooniga uuritav aine sobivas vehii ­
kelis  
Injektsioon 3: valitud kontsentratsiooniga uuritav aine 1:1 segus (v/v) 
FCAst ja veest või füsioloogilisest keedusoolalahusest  
Injektsioonis 3 lahustatakse vees lahustuvad ained vesifaasis enne 
FCAga segamist. Rasvades lahustuvad või lahustumatud ained suspendeeritakse FCAs enne vesifaasiga segamist. Uuritava aine 
lõppkontsentratsioon peab olema võrdne sellega, mida on kasutatud 
injektsioonis 2.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Injektsioonid 1 ja 2 tehakse lähestikku ning peale kõige lähemale, 
samal ajal kui injektsioon 3 tehakse piirkonna kõige tagapoolsemasse 
osasse.  
Võrdlusrühma 0-päev  
3 × 2 korda 0,1 ml süstitakse naha alla samadesse kohtadesse kui 
katseloomade puhul.  
Injektsioon 1: 1:1 segu (v/v) FCAst ja veest või füsioloogilisest 
keedusoolalahusest  
Injektsioon 2: lahjendamata vehiikel  
Injektsioon 3: 50 %line w/v segu vehiikelit FCA ja vee või füsio ­
loogilise keedusoolalahuse segus 1:1 (v/v).  
Katse- ja võrdlusrühma 5.–7. päev  
Kui aine ei ärrita nahka, manustatakse katsepinda ligikaudu 24 tundi 
enne paikset induktsioonkokkupuudet ja pärast karvade lõikamist ja/või raseerimist 0,5 ml 10 %list naatriumlaurüülsulfaati vaseliinis kohaliku ärrituse tekitamiseks.
 
Katserühma 6.–8. päev  
Katsepiirkond puhastatakse uuesti karvadest. Sobivas vehiikelis 
oleva uuritava ainega täielikult küllastatud filterpaber (2 × 4 cm) asetatakse katsepiirkonnale ning kaetakse 48 tunniks oklusioonmähi ­
sega. Vehiikeli valikut tuleb põhjendada. Tahked ained pulbristatakse 
peeneks ja lisatakse sobivasse vehiikelisse. Vedelikke võib kasutada vajaduse korral lahjendamata kujul.
 
Võrdlusrühma 6.–8. päev  
Katsepiirkond puhastatakse uuesti karvadest. Vehiikel asetatakse 
samal viisil uuritava ainega katsepiirkonnale ja kaetakse 48 tunniks 
oklusioonmähisega.  
1.5.1.3.2. Nakatumise esilekutsumine  
Katse- ja võrdlusrühma 20.–22. päev  
Katserühma ja võrdlusrühma loomade küljed puhastatakse karvadest. 
Uuritava ainega immutatud lapp või uuritavat ainet sisaldav nõu pannakse looma ühele küljele ja vajaduse korral võib teisele küljele panna vehiikeliga immutatud lapi või seda sisaldava nõu. Lappe 
hoitakse oklusioonmähisega 24 tundi naha vastas.
 
1.5.1.3.3. Vaatlus ja hindamine: katse- ja võrdlusrühm  
— Umbes 21 tundi pärast lapi äravõtmist nakatatud ala puhasta ­
takse, pügatakse ja/või raseeritakse ning vajaduse korral depilee ­
ritakse.  
— Umbes 3 tundi hiljem (umbes 48 tundi pärast nakatumise esile ­
kutsumise alustamist) vaadeldakse naha reaktsiooni ning see registreeritakse liites esitatud hindamisskaala põhjal.
 
— Umbes 24 tundi pärast vaatlust tehakse teine vaatlus (72 tunni 
pärast) ning tulemused märgitakse üles.  
Soovitav on hinnata katse tulemusi pimemeetodiga.  
Kui esimese nakatumist esile kutsuva katse tulemusi on vaja täpsus ­
tada, tuleks kaaluda vajaduse korral uue võrdlusrühmaga teise naka ­
tumist esile kutsuva katse (st taasnakatumise katse) tegemist umbes 
nädal pärast esimest katset. Taasnakatumise katse võib teha ka 
esialgse võrdlusrühmaga.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Vaadelda tuleks kõiki nahareaktsioone ja ebatavalisi leidusid, seal ­
hulgas induktsioonist ja nakatumise esilekutsumisest tulenevaid 
süsteemseid reaktsioone, ja need tuleks üles märkida Magnussoni/ ­
Klingmani (vt liidet) hindamisskaala alusel. Muude toimingute puhul, nt histopatoloogiline uuring, võib küsitavate mõjude täpsusta ­
miseks mõõta nahavoldi paksust.
 
1.5.2.  Buehleri katse  
1.5.2.1. V a l m i s t i s e d  
Terveid albiinomerisigu harjutatakse laboritingimustega vähemalt 
viie päeva jooksul enne katse tegemist. Enne katse tegemist jagatakse loomad juhuslikkuse alusel katserühmadesse. Karvad eemaldatakse sõltuvalt kasutatavast uurimismeetodist lõikamise, raseerimise või 
vajaduse korral keemilise depilatsiooni teel. Tuleb olla ettevaatlik, 
et vältida naha hõõrdumist. Loomi kaalutakse enne katse algust ning katse lõpus.
 
1.5.2.2. K a t s e t i n g i m u s e d  
1.5.2.2.1. Katseloomad  
Katseloomadena kasutatakse üldkasutatavate albiinomerisigade labo ­
ratoorseid aretusliine.  
1.5.2.2.2. Arv ja sugu  
Kasutada võib isaseid ja/või emaseid loomi. Kui kasutatakse emas ­
loomi, peaksid nad olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined.  
Katserühmas on vähemalt 20 looma ning võrdlusrühmas vähemalt 
kümme looma.  
1.5.2.2.3. Doositasemed  
Uuritava aine kontsentratsioon iga induktsioonkokkupuute kohta 
peaks olema kõrgeim kontsentratsioon, mis kutsub esile kerge, 
kuid mitte ülemäärase ärrituse. Nakatumist esile kutsuva doosi puhul kasutatav kontsentratsioon peaks olema suurim ärritust mitte esile kutsuv doos. Vajaduse korral võib vajalikud kontsen ­
tratsioonid määrata kindlaks kahe või kolme loomaga tehtava proo ­
viuuringute põhjal.
 
Vees lahustuvate uuritavate ainete puhul on vehiikelina asjakohane 
kasutada vett või lahjendatud mitteärritavat pindaktiivse aine lahust. Teiste uuritavate ainete vehiikeliks sobib induktsioonkokkupuute 80 %line etanooli ja vee lahus ning nakatumise esilkutsumise 
puhul atsetoon.
 
1.5.2.3. A n a l ü ü s i k ä i k  
1.5.2.3.1. Induktsioon  
Katserühma 0-päev  
Üks külg puhastatakse korralikult karvadest. Katselapp peab olema 
sobivas vehiikelis uuritava ainega põhjalikult immutatud (vehiikeli valikut tuleks põhjendada; vedelaid uuritavaid aineid võib vajaduse 
korral kasutada lahjendamata kujul).
 
Katselapid pannakse katsepiirkonda ning hoitakse kuus tundi 
oklusioonlapi või uuritavat ainet sisaldava nõu ja sobiva mähi ­
sega naha peal.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Katselapid peavad olema oklusiivsed. Kasutamiseks sobib umbes 
4–6 cm  2 suurune puuvillalapike ning see võib olla ümmargune või 
kandiline. Oklusiooni tagamiseks soovitatakse sobivat kinnitusmeh ­
hanismi. Mähise kasutamisel võib olla vaja täiendavat kokku ­
puudet.  
Võrdlusrühma 0-päev  
Üks külg puhastatakse korralikult karvadest. Vehiikel asetatakse 
katsepinnale samal viisil kui katserühma puhul. Katselappe hoitakse kuus tundi oklusioonlapi või uuritavat ainet sisaldava nõuga ja 
sobiva mähisega naha peal. Kui on võimalik tõestada, et platseebo ­
ravi saavat võrdlusrühma ei ole vaja, võib kasutada varem kasuta ­
mata võrdlusrühma.
 
Katse- ja võrdlusrühma 6.–8. ja 13.–15. päev  
Samas katsepiirkonnas, 6.–8. ja siis 13.–15. päevaga samal küljel 
viiakse läbi samasugune kokkupuude nagu 0-päeval (vajaduse korral puhastatakse nahk karvadest).
 
1.5.2.3.2. Nakatumise esilekutsumine  
Katse- ja võrdlusrühma 27.–29. päev  
Katserühma ja võrdlusrühma loomade külg, mis ei ole seni uuritava 
ainega kokkupuutes olnud, puhastatakse karvadest. Oklusioonlapp või nõu, milles on piisaval määral kõrgeima mitteärritava kontsen ­
tratsiooniga uuritavat ainet, pannakse katse- ja võrdlusrühma 
loomade selle külje tagaosale, millel ei ole veel katset tehtud.
 
Vajaduse korral pannakse katse- ja võrdlusrühma loomade töötlemata 
külje tagaosale vehiikelit sisaldav oklusioonlapp või -nõu. Neid lappe või nõusid hoitakse sobiva mähisega kuus tundi naha vastas.
 
1.5.2.3.3. Vaatlus ja hindamine  
— Umbes 21 tundi pärast lapi äravõtmist puhastatakse karvadest ala, 
millel nakatumine esile kutsuti.  
— Umbes kolm tundi hiljem (umbes 30 tundi pärast nakatumist 
esile kutsuva lapi katsepiirkonda asetamist) vaadeldakse naha ­
reaktsioone ning need märgitakse üles vastavalt liites esitatud 
hindamisskaalale.  
— Umbes 24 tundi pärast 30 tundi kestnud vaatlusperioodi (umbes 
54 tundi pärast nakatumist esile kutsuva lapi nahapinnale aseta ­
mist) vaadeldakse nahareaktsioone uuesti ning tulemused märgi ­
takse üles.  
Katse tulemusi tuleks hinnata soovitatavalt pimemeetodiga.  
Kui esimese nakatumist esile kutsuva katse tulemusi on vaja täpsus ­
tada, tuleks kaaluda vajaduse korral uue võrdlusrühmaga teise naka ­
tumist esile kutsuva katse (st taasnakatumise katse) tegemist umbes 
nädal pärast esimest katset. Taasnakatumise katse võib teha ka 
esialgse võrdlusrühmaga.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Kõiki nahareaktsioone ja ebatavalisi leidusid, sealhulgas induktsioo ­
nist ja nakatumise esilekutsumisest tulenevaid süsteemseid mõjusid, 
tuleks vaadelda ja need tuleks üles märkida Magnussoni/Klingmani (vt liidet) hindamisskaala alusel. Muude toimingute puhul, nt histo ­
patoloogiline uuring, võib küsitavate mõjude täpsustamiseks mõõta 
nahavoldi paksust.
 
2. ANDMED (GPMT ja Buehleri katse)  
Andmed tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga looma 
kohta märgitud kõikidel vaatlustel täheldatud nahareaktsioonid.  
3. ARUANDLUS (GPMT ja Buehleri katse)  
Kui enne merisigade maksimeerimise katset tehakse sõeluuring, tuleb 
koos katse- ja võrdlusrühmaga saadud tulemustega esitada ka katse (nt paikne lümfisõlmede uuring (LLNA), hiire kõrva turse määratle ­
mise katse (MEST)) kirjeldus või viide sellele, sealhulgas meetodi 
üksikasjad.
 
Katsearuanne (GMPT ja Buehleri katse)  
Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.  
Katseloomad:  
— kasutatud merisea aretusliin;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, toit jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  
Katsetingimused:  
— lapi asetuskoha ettevalmistamise meetod;  
— lapi materjali ja lappide asetamise meetodi üksikasjad;  
— prooviuuringu tulemused ning järeldused katses kasutatavate 
induktsiooni- ja nakatumist esile kutsuvate kontsentratsioonide 
kohta;  
— uuritava aine ettevalmistamise, kasutamise ja eemaldamise üksik ­
asjad;  
— vehiikeli valiku põhjendus;  
— induktsioonkokkupuutes ja nakatumise esilekutsumisel kasutatud 
vehiikeli ja uuritava aine kontsentratsioonid ning induktsiooni ja nakatumise esilekutsumise ajal kasutatud aine kogumäär.
 
Tulemused:  
— kokkuvõte kõige värskemate tundlikkuse ja usaldusväärsuse 
kontrollide tulemuste kohta (vt 1.3), sealhulgas teave kasutatud 
aine, kontsentratsiooni ja vehiikeli kohta;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— iga looma kohta, sealhulgas hindamissüsteem;  
— täheldatud toime iseärasuse ja määra kirjeldus;  
— histopatoloogilised leiud.  
Tulemuste üle arutlemine.  
Järeldused.  
4. VIITED  
Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 406.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Liide  
TABEL  
Magnussoni/Kligmani hindamisskaala mähiskatsega esilekutsutava 
reaktsiooni hindamiseks  
0 = nähtavat muutust ei esine  
1 = juhuslik või laiguline punetus  
2 = mõõdukas ja kokkuvalgunud punetus  
3 = intensiivne punetus ja paistetus  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 28-PÄEVANE 
UURING NÄRILISTEL  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test Guide ­
line, TG) 407 (2008). Esialgne TG 407 võeti vastu 1981. aastal. 1995. aastal 
võeti vastu läbivaadatud versioon, et saada uuringus kasutatud katseloomalt 
lisateavet, eelkõige neurotoksilisuse ja immuuntoksilisuse kohta.  
2. OECD algatas 1998. aastal prioriteetse tegevussuunana olemasolevate katse ­
juhendite läbivaatamise ja uute väljatöötamise, et sõeluuringutega selgitada välja võimalikud sisesekretsioonisüsteemi kahjustajad ja katsetada neid (8). Selle tegevuse üks osa on olemasoleva OECD juhendi „Suukaudse kordus ­
doosi toksilisuse 28-päevane uuring närilistel” (TG 407) ajakohastamine 
selliste näitajate lisamiseks, millega saab määrata uuritavate kemikaalide sisesekretsioonisüsteemi kahjustavat toimet. Ajakohastamiseks viidi ellu 
laialdane rahvusvaheline programm, et katsetada täiendavate näitajate asja ­
kohasust ja kasutatavust, osutatud näitajate sobivust kemikaalide puhul, millel on (anti)östrogeenne, (anti)androgeenne ja (anti)türoidne toime, labo ­
risisest ja laboritevahelist korratavust ning uute näitajate ja varasema TG 
407 kohaselt nõutud näitajate vastastikust mõju. Niimoodi saadud suur hulk 
andmeid on kokku võetud põhjalikus OECD aruandes (9), milles andmeid on ka üksikasjalikult hinnatud. Käesolev ajakohastatud katsejuhend B.7 (mis on samaväärne katsejuhendiga TG 407) on välja töötatud rahvusvahelise 
uurimisprogrammi käigus saadud tulemuste ja kogemuste alusel. Käesolev 
katsemeetod võimaldab seada teatavad endokriinsüsteemi kaudu põhjusta ­
tavad toimed muude toksikoloogiliste mõjude konteksti.
 
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
3. Kemikaali toksiliste omaduste kindlaksmääramisel ja hindamisel võib teha 
suukaudse mürgisuse katseid kordusdoosidega pärast seda, kui on saadud esialgne teave mürgisuse kohta ägeda mürgisuse katsetest. Käesoleva katse ­
meetodi eesmärk on uurida mürgisust, mille põhjuseks on väga mitmesu ­
gustele võimalikele mürgisuse sihtsüsteemidele avaldatav toime. Sellega 
saadakse teavet võimalike terviseohtude kohta, mis võivad tekkida korduval kokkupuutel suhteliselt piiratud ajavahemiku jooksul ja mis hõlmavad mõju närvisüsteemile, immuunsüsteemile ja sisesekretsioonisüsteemile. Seoses 
nende konkreetsete eesmärkidega peaks käesoleva meetodiga olema 
võimalik kindlaks teha võimalikke neurotoksilisi kemikaale, mida tuleb sellest aspektist edaspidi veel süvendatult uurida, ja kemikaale, mis mõju ­
tavad kilpnäärme talitlust. Meetodiga võib saada andmeid ka kemikaalide 
kohta, mis mõjutavad mees- ja/või naissuguelundeid noortel täiskasvanud loomadel, samuti nende kemikaalide immunoloogilise toime kohta.
 
4. Käesoleva katsemeetodiga B.7 saadud tulemusi tuleks kasutada ohtude kind ­
lakstegemiseks ja riskide hindamiseks. Sisesekretsioonisüsteemi iseloomus ­
tavate näitajate kaudu saadud tulemuste käsitlemisel tuleks arvestada 
„OECD kontseptuaalset raamistikku sisesekretsioonisüsteemi kahjustavate 
kemikaalide katsetamiseks ja hindamiseks” (11). Meetod kujutab endast põhilist kordusdoosi toksilisuse uurimise meetodit, mida võib kasutada kemikaalide korral, mille puhul 90-päevane uuring ei ole põhjendatud 
(näiteks kui tootmismaht ei ületa teatavat piiri), või pikaajalist katset ette ­
valmistava uuringuna. Kokkupuute ajavahemik peaks olema 28 päeva.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Nagu näitas rahvusvaheline programm, mis viidi ellu selliste parameetrite 
valideerimiseks, mis kõlbaksid uuritava kemikaali võimaliku sisesekretsioo ­
nisüsteemi häiriva mõju kindlakstegemiseks, sõltub käesoleva katsemeetodi B.7 tulemuste kvaliteet tugevasti sellest, kui kogenud on uurimislabor. See kehtib eriti emaslooma suguorganite tsükliliste muutuste histopatoloogilise 
määramise kohta ning selliste väikeste hormoonsõltuvate organite massi 
määramise kohta, mida on lahkamisel raske eraldada. On välja töötatud histopatoloogiaalane juhend (19). Juhend on kättesaadav OECD katsejuhen ­
deid käsitleva avaliku veebisaidi kaudu. Juhendi eesmärk on aidata patoloo ­
gidel teha vaatlusi ja aidata suurendada katse tundlikkust. Sisesekretsiooni ­
süsteemiga seotud toksilisuse kohta saab andmeid mitmesuguste näitajate kaudu, mida määratakse käesoleva katsemeetodiga. Näitajaid, mille kasulik ­
kuse tõendamiseks ei olnud piisavalt andmeid või mille kohta valideerimisel 
selgus, et nende võime leida sisesekretsioonisüsteemi kahjustavaid kemi ­
kaale on vähe tõendatud, pakutakse vabal valikul kasutatavate näitajatena (vt 2. liide).
 
6. Valideerimise käigus saadud andmete põhjal tuleb rõhutada, et käesoleva 
katse tundlikkus ei ole piisav selleks, et teha kindlaks kõik ained, millel on (anti)östrogeenne või (anti)androgeenne toime (9). Käesolevat meetodit ei kasutata eluetapil, mis on sisesekretsioonisüsteemi mõjutamise suhtes kõige 
tundlikum. Valideerimisel võimaldas käesolev meetod siiski kindlaks teha 
aineid, mis nõrgalt või tugevasti mõjutavad kilpnäärme funktsiooni, ning tugeva ja mõõduka endokriinse toimega aineid, mis toimivad östrogeeni või androgeeni retseptorite kaudu, kuid enamikul juhtudest ei võimaldanud 
meetod kindlaks teha selliseid endokriinse aktiivsusega aineid, mis mõju ­
tavad östrogeeni või androgeeni retseptoreid nõrgalt. Seepärast ei saa seda meetodit pidada endokriinse aktiivsuse leidmise sõeluuringu meetodiks.
 
7. Järelikult ei saa sellise toimeviisiga seotud mõju puudumist pidada tõendiks, 
et aine ei mõjuta sisesekretsioonisüsteemi. Sisesekretsioonisüsteemi kaudu avalduva mõju puhul ei tohiks aine iseloomustamisel toetuda üksnes käes ­
olevale meetodile, vaid seda meetodit tuleks kasutada tõendite kaalumise 
lähenemisviisi raames ja aine võimaliku endokriinse aktiivsuse iseloomusta ­
miseks võtta arvesse kõik kemikaali kohta olemas olevad andmed. Seepärast peaks õigusloomealaste otsuste tegemine endokriinse toime kohta (aine 
iseloomustamine) olema põhjendatud laiaulatuslikul alusel, mitte üksnes 
käesoleva katsemeetodi abil saadud andmetega.
 
8. Meetodi kasutamisel arvestatakse, et kõik katsed loomadega peavad vastama 
loomade hooldamise kohalikele normidele; siin esitatud hoolduse ja kohtle ­
mise kirjeldused on katse tegemise miinimumnõuded ning kui kohalikud eeskirjad on rangemad, tuleb lähtuda kohalikest eeskirjadest. OECD on 
esitanud loomade humaanse kohtlemise täiendavad juhendid (14).
 
9. Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.  
KATSE PÕHIMÕTE  
10. Uuritav kemikaal manustatakse katseloomade eri rühmadele suu kaudu kord 
päevas astmeliselt suurenevate doosidena selliselt, et üks rühm saaks 28 
päeva jooksul ainult ühte doosi. Manustamisperioodi jooksul jälgitakse loomi iga päev hoolikalt toksilisuse märkide tuvastamiseks. Katse ajal surnud või humaansel viisil surmatud loomad lahatakse ning katse lõppe ­
misel surmatakse humaansel viisil ja lahatakse ka ellujäänud loomad. 28- 
päevane katse annab teavet korduva suukaudse kokkupuute mõjude kohta ja
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
katsest võib selguda, et on vaja korraldada pikemaid uuringuid. Samuti võib 
katse anda teavet pikemas uuringus kasutatavate kontsentratsioonide vali ­
mise kohta. Käesoleva katsemeetodiga saadud andmed peaksid võimaldama kirjeldada uuritava kemikaali mürgisust, koostada mõju doosist sõltuvuse ja määrata katseloomadele täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsiooni ( No- 
Observed Adverse Effect Level , NOAEL).
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
11. Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka muid närilisi. Kui käes ­
olevas katsemeetodis B.7 kirjeldatud näitajaid uuritakse mõne muu närilise ­
liigiga, tuleb seda üksikasjalikult põhjendada. Kuigi bioloogiliselt on 
võimalik, et muu liik peaks mürgisele kemikaalile reageerima sarnaselt 
rotiga, võib väiksemate loomade kasutamisel suureneda tulemuste hajuvus, kuna väikseid organeid on tehniliselt keerukam eraldada. Sisesekretsiooni ­
süsteemi häirivate kemikaalide kindlakstegemise rahvusvahelises valideeri ­
misprogrammis kasutati ainsa liigina rotte. Kasutatakse enim kasutatavate 
laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Doseerimisega tuleks alustada võimalikult kohe pärast võõrutamist ja igal juhul enne loomade üheksanädalaseks saamist. Uuringu 
alguses peaks loomade kehamassi erinevus olema minimaalne ega tohiks 
ületada ±20 % kummastki soost loomade keskmisest kehamassist. Kui suukaudse kordusdoosi uuringule järgneb pikaajaline uuring, tuleks mõlemas uuringus kasutada eelistatult samast aretusliinist ja sama päritoluga loomi.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
12. Kogu katse teostus peaks vastama laboriloomade hooldamise kohalikele 
normidele. Temperatuur katseloomade ruumis peab olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte 
üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, on eesmärk hoida see 
vahemikus 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavalist labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata. Söödavalikut võib mõjutada vajadus kindlustada 
sobiva lisasegu lisamine, kui uuritavat kemikaali manustatakse sellisel viisil. 
Loomi tuleks pidada puurides väikeste samast soost isendite rühmadena; kui see on teaduslikult põhjendatud, võib loomi pidada ka üksikpuurides. Rühmaviisilisel pidamisel ei tohiks puuris olla rohkem kui viis looma.
 
13. Sööta tuleb korrapäraselt analüüsida saasteainete suhtes. Sööda proov tuleb 
alles hoida kuni katseprotokolli lõpliku valmimiseni.  
Loomade ettevalmistamine  
14. Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- 
ja katserühma. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad märgistatakse individuaalseks eristamiseks 
ning enne katse alustamist hoitakse neid vähemalt viis päeva puurides, et 
nad jõuaksid laboritingimustega kohaneda.
 
Dooside ettevalmistamine  
15. Uuritav kemikaal manustatakse sundsöötmisega või koos sööda või joogi ­
veega. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja uuri ­
tava kemikaali füüsikalis-keemilistest ja toksiko-kineetilistest omadustest.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas 
kandeaines. On soovitav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/- 
suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-suspensiooni (nt maisiõlis) kasu ­
tamist ja siis lahustamist mõnes muus võimalikus kandeaines. Kui kandeai ­
nena kasutatakse muud ainet peale vee, tuleb teada kandeaine toksilisusega 
seotud omadusi. Kindlaks tuleks määrata uuritava kemikaali stabiilsus 
kandeaines.  
KATSE KÄIK  
Loomade arv ja sugu  
17. Igal doositasemel tuleks kasutada vähemalt kümmet looma (viis emas- ja 
viis isaslooma). Kui plaanitakse vahepealset loomade surmamist, tuleb isendite arvu suurendada vastavalt selle arvu võrra, kui palju loomi kavat ­
setakse surmata enne uuringu täielikku lõpetamist. Tuleb kaaluda täiendava 
kümnest loomast (viis kummastki soost) koosneva lisarühma (edaspidi: „satelliitrühm”) kasutamist kontrollina ja suurima doosi rühmas, et jälgida mürgise toime pöörduvust, püsivust või mürgisuse avaldumist hilinemisega 
vähemalt 14 päeva jooksul pärast doseerimise lõppu.
 
Doseerimine  
18. Üldiselt tuleks kasutada vähemalt kolme doosi- ja kontrollrühma, kuid kui 
muude andmete hindamise põhjal ei eeldata ühtegi mõju korduva doosiga 1 000 mg kg kehamassi kohta päevas, võib teha piirsisalduskatse. Kui sobi ­
vaid andmeid ei ole, võib kasutatavate dooside kindlaksmääramise hõlbus ­
tamiseks teha doosipiirkonna määramise katse (kasutades sama liini ja pärit ­
oluga loomi). Kontrollrühma loomi tuleks kohelda samamoodi kui katse ­
rühma loomi, välja arvatud uuritava kemikaali manustamine. Kui uuritava 
kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet, tuleb võrdlusrühmale 
manustada kandeainet suurimas kasutatud mahus.
 
19. Doositaseme valimisel tuleks arvesse võtta kõiki uuritava kemikaali või 
sellelaadsete kemikaalide toksilisust käsitlevaid ja (toksiko-)kineetilisi andmeid. Kõrgeim doositase tuleks valida nii, et see kutsuks esile toksilise toime, kuid ei põhjustaks surma ega tõsiseid kannatusi. Seejärel tuleks 
valida aste-astmelt vähenevad doositasemed, et näidata doosi ja toime vahe ­
list seost ning kahjuliku toime puudumist madalaimal doositasemel ehk täheldatava kahjuliku toimeta doositasemel (NOAEL). Alanevate kontsen ­
tratsioonide valimisel on sageli parim viis kasutada kahe- kuni neljakordseid 
vahemikke ja väga suurte kontsentratsioonivahemike (nt üle kümnekordne 
tegur) kasutamise asemel on parem lisada neljas katserühm.
 
20. Täheldatava üldise toksilisuse puhul (nt kehamassi vähenemine, mõju 
maksale, südamele, kopsudele või neerudele jne) või muude muutuste puhul, mille põhjuseks ei tarvitse olla toksiline toime (näiteks isu halvene ­
mine, maksa suurenemine), tuleks jälgitavaid mõjusid immuunsüsteemi, 
närvisüsteemi või sisesekretsioonisüsteemi näitajatele tõlgendada suure ette ­
vaatusega.
 
Piirsisalduskatse  
21. Kui käesolevas uuringus kirjeldatud meetodiga ei tuvastata katses päeva ­
doosil vähemalt 1 000 mg kehamassi kg kohta või uuritava kemikaali prot ­
sentuaalselt sama suurel määral (määratud kehamassi alusel) sööda või 
joogivee kaudu manustamisel märkimisväärset toksilist mõju ja kui toksi ­
lisus ei ole samalaadse struktuuriga kemikaalide kohta saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta täielikku kolme doositasemega uuringut vajali ­
kuks. Võib teha piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokku ­
puude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Dooside manustamine  
22. Loomadele doseeritakse uuritavat kemikaali seitsmel päeval nädalas 28 
päeva jooksul. Kui uuritavat kemikaali manustatakse loomadele sundsöötmi ­
sega, tuleks seda teha ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat 
intubatsioonikanüüli. Suurim vedelikukogus, mida saab ühel korral manus ­
tada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml 100 g keha ­
massi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kus võib kasutada mahtu 2 ml 100 g kehamassi kohta. Katsekoguse varieeruvust tuleks vähendada ja regu ­
leerida kontsentratsioone nii, et doosi kogumaht oleks kõikide dooside 
korral sama; seda ei saa teha ärritavate või söövitavate kemikaalide puhul, mille mõju suurema kontsentratsiooni korral tavaliselt tugevneb.
 
23. Kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on oluline 
tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tavalist toitu ­
mise või joogivee tarbimise tasakaalu. Kui uuritavat kemikaali manustatakse 
söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehamassile; tuleb täpsustada, 
millist võimalust kasutatakse. Kui kemikaali manustatakse sundsöötmisega, 
tuleks doos anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vajaduse korral kohandada, et säiliks püsiv doositase looma kehamassi suhtes. Kui pärast kordusdoosi uuringut tehakse pikaajaline uuring, tuleks mõlema uuringu 
puhul kasutada samasugust sööta.
 
Vaatlused  
24. Jälgimise ajavahemik peaks olema 28 päeva. Satelliitrühma kuuluvaid 
loomi, keda vaadeldakse pikema aja jooksul, et teha kindlaks uuritava kemi ­
kaali toksilise toime hilinenud ilmnemist, toime püsimist või toimest toibu ­
mist, tuleks pidada veel vähemalt 14 päeva ilma uuritavat kemikaali manus ­
tamata.  
25. Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas, soovitatavalt iga 
kord samal ajal ning võttes arvesse kõige tõenäolisemat aega pärast dosee ­
rimist, mille jooksul oodatud mõju peaks olema kõige tugevam. Üles tuleks 
märkida loomade tervislik seisund. Vähemalt kaks korda päevas tuleks kont ­
rollida, kas loomad on haigestunud või surnud.  
26. Kõikide loomade puhul tuleks üksikasjalik kliiniline vaatlus teha enne seda, 
kui loomale esimest korda uuritavat kemikaali manustatakse (selleks, et 
loomi oleks võimalik omavahel võrrelda), ning seejärel vähemalt kord 
nädalas. Need vaatlused tuleks teha väljaspool puuri, selleks ette nähtud kohas ja eelistatavalt iga kord samal kellaajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral uurimislabori selgelt kind ­
laks määratud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et katsetingimused 
varieeruksid võimalikult vähe ja eelistatult ei tohiks vaatlejad olla teadlikud uuritava kemikaali manustamisest. Üles tuleks märkida vähemalt järgmised tunnused: muutused nahal, karvastikus, silmades, limaskestal, eritiste esine ­
mine ning autonoomsed muutused (nt pisaravool, turris karv, pupillide 
suurus, muutunud hingamine). Samuti tuleks üles märkida muutused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemää ­
rane karvastiku hooldamine, ringiratast keerlemine) või kummaline käitu ­
mine (nt enese vigastamine, tagurpidi liikumine) (2).
 
27. Neljandal kokkupuutenädalal tuleks hinnata sensoorseid reaktsioone eri liiki 
ärritajatele (2) (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptiivsetele ärritajatele) (3, 4, 5), samuti haardetugevust (6) ja motoorset tegevust (7). Võimalike meeto ­
dite täpsemad üksikasjad on esitatud vastavates viidatud dokumentides. 
Siiski võib kasutada ka muid meetodeid kui need, millele viidatakse.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Neljanda kokkupuutenädala funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta juhul, 
kui uuring tehakse subkroonilise toksilisuse 90-päevase uuringu eeluurin ­
guna. Sellisel juhul tuleks funktsionaalsed vaatlused teha kõnealuse järeluu ­
ringu käigus. Teiselt poolt võivad kordusdoosi uuringu käigus tehtud funkt ­
sionaalsete vaatluste andmed hõlbustada järgneva subkroonilise uuringu 
jaoks doositasemete valimist.  
29. Erandkorras võib funktsionaalsed vaatlused ära jätta ka rühmade puhul, 
kellel esineb toksilisuse märke niisugusel määral, et see oluliselt takistab 
funktsionaalsete katsete tegemist.  
30. Lahkamisel võiks tupeäiete abil määrata kõikide emasloomade innatsükli 
(valikuline). Sellistest andmetest saadakse teavet innatsükli järgu kohta looma surmamise ajal ja see aitab histoloogiliselt hinnata östrogeenitund ­
likke kudesid (vt histopatoloogia juhendid (19)).
 
Kehamass ja sööda/vee tarbimine  
31. Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Sööda tarbimist tuleks 
mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogi ­
veega, tuleb vee tarbimist samuti mõõta vähemalt kord nädalas.  
Hematoloogia  
32. Katseperioodi lõpus tuleks teha järgmised hematoloogilised uuringud: hema ­
tokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, retikulotsüütide arv, leukotsüütide üldarv ja eri leukotsüüdipopulatsioonide arvud, vereliistakute arv ja vere hüübimisaja/hüübimisvõime mõõtmine. Kui uuritav kemikaal või 
selle oletatavad metaboliidid on või võivad olla oksüdeerivate omadustega, 
tuleks teha veel muid määramisi, sealhulgas määrata methemoglobiini kont ­
sentratsioon ja Heinzi kehakesed.
 
33. Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast vahetult enne loomade 
surmamist või selle ajal ja neid tuleks säilitada sobivates tingimustes. Enne surmamist tuleks loomi hoida üks öö söömata (
 1 ). 
Kliiniline biokeemia  
34. Kliinilised biokeemilised analüüsid peamiste toksiliste mõjude uurimiseks 
kudedes ja eelkõige toime uurimisel neerudele ja maksale tuleks teha vere ­
proovidega, mis on võetud loomadelt vahetult enne surmamist või selle ajal 
(välja arvatud loomad, kes leiti suremas ja/või surmati katse ajal). Plasma- või seerumiuuringud peavad hõlmama naatriumi, kaaliumi, glükoosi, üldko ­
lesterooli, karbamiidi, kreatiniini, üldvalgu ja albumiini, vähemalt kahe 
hepatotsellulaarsele toimele osutava ensüümi (näiteks alaniinaminotransfe ­
raas, aspartaataminotransferaas, leeliseline fosfataas, γ-glutamüültranspepti ­
daas, ja glutamaatdehüdrogenaas) ja sapphapete määramist. Muude ensüü ­
mide (maksa- või muud ensüümid) ja bilirubiini mõõtmised võivad teata ­
vatel tingimustel anda kasulikku teavet.
 
35. Uuringu viimasel nädalal on loomadelt teatava aja jooksul teatava mahuga 
uriiniproovide kogumise teel võimalik teha järgmisi uriinianalüüse: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valk, glükoos ja veri/vere ­
rakud.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Mitmete seerumi ja plasma, eelkõige glükoosi mõõtmiste korral oleks eelistatav looma ­
dele eelneva öö jooksul süüa anda. Selle peamine põhjendus on see, et söötmise korral 
oleks tulemuste varieeruvus suurem ning see varjaks raskemini tuvastatava toime ning 
muudaks tõlgendamise raskeks. Teisest küljest võib öö läbi söötmata hoidmine aga 
häirida loomade tavalist üldist ainevahetust ja eelkõige söödaga manustamise uuringute 
puhul võib see häirida igapäevast kokkupuudet uuritava kemikaaliga. Kui loomadele ei 
anta öö jooksul süüa, tuleks uuringu neljandal nädalal tehtud funktsionaalsete vaatluste 
järel teha kliinilis-biokeemilised määramised.
 36. Lisaks sellele tuleks kaaluda üldistele koekahjustustele osutavate plasma- 
või seerumimarkerite uurimist. Muud määramised, mis tuleks teha juhul, 
kui uuritava kemikaali teadaolevad omadused võivad mõjutada või mõju ­
tavad eeldatavasti sellega seotud metaboliseerimise profiili, hõlmavad kalt ­
siumi, fosfaadi, triglütseriidide, teatavate hormoonide ja koliinesteraasi 
määramist. Need on vaja määrata teatud klassi kuuluvate kemikaalide 
puhul või iga juhtumi puhul eraldi.  
37. Kuigi sisesekretsioonisüsteemi näitajate rahvusvahelise evalueerimisega ei 
õnnestunud näidata kilpnäärmehormoonide (T3, T4) ja TSH määramise selgeid eeliseid, võib siiski olla kasulik hoida alles plasma- ja seerumi ­
proovid, et määrata T3, T4 ja (soovi korral) TSH, kui on andmeid, et 
võib esineda mõju ajuripatsi-kilpnäärme süsteemile. Neid proove võib säili ­
tada külmutatult –20 °C juures. Hormoonide määramisel võivad hajuvust ja absoluutseid kontsentratsioone mõjutada järgmised tegurid:
 
— surmamise aeg, kuna hormoonide kontsentratsioonil on ööpäevane 
muutumise rütm;  
— surmamisviis – tuleb vältida loomade tarbetut stressi, mis võib mõjutada 
hormoonide kontsentratsioone;  
— hormoonide määramise testikomplektid, mille standardkõverad võivad 
olla erinevad.  
Usaldusväärsemalt kui hormoonide taseme määramisega saab kilpnääret 
mõjutavaid kemikaale teha kindlaks histopatoloogilise analüüsiga.  
38. Hormoonide määramiseks ette nähtud plasmaproovid tuleb saada 
enam-vähem ühel kellaajal. T3, T4 ja TSH määramist soovitatakse kaaluda siis, kui kilpnäärmes leitakse histopatoloogilise uuringuga muutusi. Müügi ­
lolevate eri testikomplektidega saadakse erinevad hormoonikontsentratsioo ­
nide arvväärtused. Järelikult ei tarvitse olla võimalik esitada kvaliteedinõu ­
deid, mis põhineksid ühesugustel varasematel andmetel. Teise võimalusena peaksid laborid püüdma hoida hajuvuskoefitsiendid T3 ja T4 puhul allpool 
25 ning TSH puhul allpool 35. Kõik kontsentratsioonid esitatakse ühikutes 
ng/ml.
 
39. Kui varasemad andmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hematoloogiliste ja 
kliinilise biokeemia näitajate määramist enne doseerimise algust või määrata need loomadel, keda ei kasutata katserühmades.
 
PATOLOOGIA  
Täielik lahkamine  
40. Kõik uuringus kasutatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, 
milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja 
kõhuõõnt ja nende sisaldist. Kõikide loomade (välja arvatud need, kes leitakse surevana ja/või surmatakse uuringu ajal)
 maks,  neerud,  neerupea ­ 
lised,  munandid,  munandimanused,  eesnääre ja seemnepõiekesed koos  
koagulatsiooninäärmetega tervikuna,  harknääre,  põrn,  aju ja  süda tuleb vaja ­
duse korral puhastada muudest kudedest ja nende märgmass määratakse kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti pärast väljalõikamist. Eesnäärme ­
kompleksi puhastamisel naaberkudedest tuleb hoolikalt vältida vedelikuga 
täidetud seemnepõiekeste vigastamist. Teise võimalusena võib seemnepõie ­
kesed ja eesnäärme eraldada ja kaaluda pärast fikseerimist.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Lisaks tuleks vajaduse korral ja kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti 
pärast väljalõikamist kaaluda veel kaks kude: munasarjade paar (märgmass) 
ja emakas, kaasa arvatud emakakael (juhendid emakakudede eemaldamiseks ja kaalumiseks ettevalmistamiseks on esitatud dokumendis OECD TG 440 (18)).
 
42. Kilpnäärme massi võib (soovi korral) määrata pärast fikseerimist. Ka siin 
tuleks väljalõikamine teha väga hoolikalt ja alles pärast fikseerimist, et 
vältida koe kahjustamist. Koe kahjustamine võib histopatoloogilise analüüsi 
nurjata.  
43. Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise 
uuringu (vt punkt 47) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas: kõik
 silmaga täheldatavad vigastused,  aju (olulised piirkonnad, sealhulgas 
suuraju, väikeaju, ajusild),  seljaaju,  silm,  magu,  peensool ja jämesool (seal ­
hulgas Peyeri naastud),  maks,  neerud,  neerupealised,  põrn,  süda,  harknääre,  
kilpnääre,  hingetoru ja  kopsud (kopsud pumbatakse fiksaatorit täis ja 
pannakse fiksaatorisse),  sugunäärmed (munandid ja munasarjad),  sugue­ 
lundid (emakas ja emakakael, munandimanused, eesnääre ja seemnepõie ­
kesed koos koagulatsiooninäärmetega),  tupp,  kusepõis,  lümfisõlmed (peale 
manustamiskohale kõige lähedasema lümfisõlme tuleks võtta teine lümfi ­
sõlm vastavalt labori oskustele (15)),  perifeerne närv (istmiku- või sääreluu 
närv), mis on eelistatult lihase lähedal,  skeletilihas ning  luu koos  luuüdiga 
(saadud lõikamisega või alternatiivselt värskelt imetud luuüdi). Munandid soovitatakse fikseerida sukeldamisega Bouini või muudetud Davidsoni fikseerimislahusesse (16, 17).  Tunica albuginea  tuleb elundi mõlemast otsast 
ettevaatlikult ja mitte sügavalt nõelaga läbi torgata, et fikseerimislahus saaks 
kiiresti sisse tungida. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla 
sihtorganid.
 
44. Sisesekretsiooniga seotud mõjude kohta võib väärtuslikke osundusi saada 
järgmiste kudede uurimisega: sugunäärmed (munasarjad ja munandid), 
suguelundid (emakas koos emakakaelaga, munandimanused, seemnepõie ­
kesed koos koagulatsiooninäärmetega, eesnäärme dorsolateraalne ja ventraalne osa), tupp, ajuripats, isaslooma rinnanääre, harknääre ja neeru ­
pealised. Muutusi isaslooma rinnanäärmetes ei ole piisavalt dokumentee ­
ritud, kuid see näitaja võib olla väga tundlik östrogeense toimega kemikaa ­
lide suhtes. Soovi korral võib uurida ka organeid või kudesid, mida ei ole punktis 43 loetletud (vt 2. liide).
 
45. Histopatoloogia juhendis (19) on üksikasjaliselt esitatud lisateavet lahka ­
mise, fikseerimise, väljalõikamise ja sisesekretsioonikudede histopatoloogia 
kohta.  
46. Rahvusvahelise katsetusprogrammiga saadi mõningaid tõendeid, et suguhor ­
moonide homeostaasi vähe mõjutavate kemikaalide nõrka endokriinset toimet võib kindlaks teha pigem mitmesuguste kudede ja östruse tsükli vahelise sünkronisatsiooni häirumise kaudu, mitte aga emassuguelundite 
selgete histopatoloogiliste muutuste kaudu. Kuigi sellise mõju kohta selgeid 
tõendeid ei saadud, soovitatakse tõendeid östruse tsükli võimaliku asün ­
kroonsuse kohta võtta arvesse munasarjade (folliikulrakkude, teekarakkude ja granuloosrakkude), emaka, emakakaela ja tupe histopatoloogiliste 
muutuste tõlgendamisel. Kui tupeäietega määratakse ka tsükli faasi, võiks 
saadud tulemust selles võrdluses samuti arvestada.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatoloogia  
47. Kõikide võrdlusrühma ja suure doosiga rühmade loomade säilitatud orga ­
neid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. Histopatoloo ­
gilised uuringud tuleks teha ka muude doosirühmade loomade puhul, kui 
suure doosi rühmas leitakse manustamisega seotud muudatusi.  
48. Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi.  
49. Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks teha selliste kudede ja organite histo ­
patoloogiline uuring, milles katserühma loomadel tehti kindlaks mõju.  
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
50. Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleks kõik 
andmed koondada tabelisse, milles iga katserühma kohta märgitakse loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arv, iga surma või surmamise aeg, mürgistusnähtudega 
loomade arv, täheldatud mürgistusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgistus ­
nähtude ilmnemise aeg, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik, raskusaste ja iga liiki kahjustuse kohta nende loomade 
protsent, kellel neid esines.
 
51. Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt 
tunnustatud statistilise meetodiga. Mõju võrdlemisel manustatud doosidega tuleks vältida mitme t-testi kasutamist. Statistilised meetodid tuleks valida 
uuringu kavandamise etapis.
 
52. Kvaliteedikontrolliks soovitatakse koguda varasemaid kontrollkatsete 
andmeid ja arvutada arvandmete hajuvuskoefitsiendid, eriti näitajate puhul, 
mis on seotud sisesekretsioonisüsteemi häirivate kemikaalide kindlakstege ­
misega. Neid andmeid võib kasutada võrdlemiseks, kui hinnatakse parajasti tehtavaid uuringuid.
 
Katseprotokoll  
53. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav kemikaal:  
— füüsikaline olemus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused;  
— tunnusandmed.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valimise põhjendus, kui kandeaine on muu kui vesi.  
Katseloomad:  
— kasutatud liik/liin;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;  
— iga looma kehamass katse alguses;  
— kui kasutatakse muud katselooma kui rott, siis liigi valimise põhjendus.  
Katsetingimused:  
— doositaseme valimise põhjendus;  
— üksikasjad uuritava kemikaali koostise / söödavalmistise kohta, valmis ­
tises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse kohta;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;  
— vajaduse korral söödas/joogivees oleva uuritava kemikaali määra (ppm) 
teisendus tegelikuks päevadoosiks (mg kehamassi kg kohta);  
— sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad.  
Uuritud valikulised näitajad:  
— uuritud valikuliste näitajate loetelu.  
Tulemused:  
— kehamass/kehamassi muutused;  
— sööda tarbimine ja vajaduse korral vee tarbimine;  
— toksilise mõju andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, seal ­
hulgas mürgistusnähud;  
— kliiniliste ilmingute laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas nähud on 
pöörduvad või mitte);  
— sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hindamine;  
— hematoloogilised näitajad ja vastavad normaalväärtused;  
— kliinilise biokeemia näitajad ja vastavad normaalväärtused;  
— kehamass surmamise ajal ja organite mass;  
— lahkamise tulemused;  
— kõikide histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— võimaluse korral andmed imendumise kohta;  
— vajaduse korral tulemuste statistiline töötlus.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
1. liide  
MÕISTED  
Androgeensus –  kemikaali võime mõjutada imetaja organismi samamoodi kui 
looduslik meessuguhormoon (st testosteroon).  
Antiandrogeensus –  kemikaali võime alla suruda loodusliku meessuguhormooni 
(st testosterooni) mõju imetaja organismile.  
Antiöstrogeensus –  kemikaali võime alla suruda loodusliku östrogeense 
hormooni (st östradiool 17ß) mõju imetaja organismile.  
Antitüroidne aktiivsus –  kemikaali võime alla suruda loodusliku kilpnäärme ­
hormooni (st hormoon T  3 ) mõju imetaja organismile.  
Doseerimine –  üldmõiste, mis hõlmab doosi, doseerimise sagedust ja kestust.  
Doos –  manustatav uuritava kemikaali kogus. Doos väljendatakse uuritava kemi ­
kaali massina katselooma kehamassi ühiku kohta päevas (näiteks mg / kehamassi 
kg / päev) või söödas oleva püsiva kontsentratsioonina.  
Ilmne toksilisus –  üldmõiste, mis osutab selgetele mürgistusnähtudele pärast 
uuritava kemikaali manustamist. Kõnealused nähud peaksid olema piisavad ohu hindamiseks ja peaksid olema sellised, et manustatava doosi suurendamise 
tõenäoliseks tulemuseks on tugev toksilisus ning tõenäoliselt ka surm.
 
NOAEL –  lühend, millega tähistatakse doositaset, mis ei põhjusta ilmseid 
mürgistusnähte. See on kõrgeim doositase, kus doseerimine ei põhjusta manus ­
tamisega seotud leide.  
Östrogeensus –  kemikaali võime mõjutada imetaja organismi samamoodi kui 
looduslik östrogeenne hormoon (st östradiool 17ß).  
Uuritav kemikaal –  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. 
Türoidne aktiivsus –  kemikaali võime mõjutada imetaja organismi samamoodi 
kui looduslik kilpnäärmehormoon (st hormoon T  3 ). 
Valideerimine –  teaduslik menetlus, mille eesmärk on iseloomustada katsemee ­
todi läbiviimise nõudeid ning tõendada meetodi usaldusväärsust ja asjakohasust 
konkreetse eesmärgi saavutamiseks.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
2. liide  
Käesolevas katsemeetodis B.7 sisesekretsioonisüsteemi häirivate 
kemikaalide kindlakstegemiseks soovitatavad näitajad  
Kohustuslikud näitajad Vabalt valitavad näitajad 
Mass 
— munandid 
— munandimanused 
— neerupealised 
— eesnääre ja seemnepõiekesed koos 
koagulatsiooninäärmetega — munasarjad 
— emakas koos emakakaelaga 
— kilpnääre  
Histopatoloogia  
— sugunäärmed: 
— munandid ja — munasarjad 
— suguelundid: 
— munandimanused — eesnääre ja seemnepõiekesed 
koos koagulatsiooninäärmetega 
— emakas koos emakakaelaga 
— neerupealised — kilpnääre 
— tupp — tupeäiged 
— isaslooma rinnanäärmed — ajuripats
 
Hormoonide määramine  
— T3 ja T4 tase vereringes 
— TSH tase vereringes  
KIRJANDUS  
1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity.  
2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60  
3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704.  
5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
 
6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
 
8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11 March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
9) OECD (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
11) OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/docu ­
ment/58/0,3343,fr_2649_37407_23487 94_1_1_1_37407,00.html  
12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endoc ­
rine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of 
clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO 
(2000)7.  
15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404–407.  
16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52–85.
 
17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM (2002). Fixation 
of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533.
 
18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N  o 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endoc ­
rine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. SUBAKUUTNE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL: 28-PÄEVANE 
UURING  
KOKKUVÕTE  
Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.8 on koostatud uuritava kemikaali sisse ­
hingamisega toimuval korduval kokkupuutel piiratud ajavahemiku jooksul (28 
päeva) avalduva mürgisuse täielikuks iseloomustamiseks ning sissehingamise riski kvantitatiivse hindamise andmete saamiseks. Vähemalt viiest isas- ja viiest emasloomast koosnevad närilisterühmad viiakse 28 päeva jooksul kuus tundi 
päevas kokkupuutesse a) uuritava kemikaaliga kolmel või enamal kontsentrat ­
sioonil, b) filtritud õhuga (negatiivne kontrollgrupp) ja/või c) kandeainega (kandeaine kontrollrühm). Loomade kokkupuude toimub üldjuhul viiel päeval nädalas, aga lubatud on ka kokkupuude seitsmel päeval nädalas. Alati katseta ­
takse nii isas- kui ka emasloomi, aga neid võidakse viia kokkupuutesse erinevate 
kontsentratsioonidega, kui on teada, et üks sugu on konkreetse uuritava kemikaali suhtes tundlikum. See meetod võimaldab uuringu juhile paindlikkust kaasata satelliitrühmad (pöörduvuse rühmad), teha bronhoalveolaarset lavaaži (BAL), 
neuroloogiakatseid ning täiendavaid kliinilise patoloogia ja histopatoloogia 
alaseid hindamisi, et uuritava kemikaali mürgisust paremini iseloomustada.
 
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test Guide ­
line, TG) 412 (2009). Algne sissehingamisel avalduvat subakuutset mürgi ­
sust käsitlev katsejuhend (katsejuhend nr 412) võeti vastu 1981. aastal (1). 
Käesolev katsemeetod B.8 (mis on samaväärne katsejuhendi nr 412 läbivaa ­
datud versiooniga) on ajakohastatud, et võtta arvesse teaduse taset ja rahu ­
ldada praegusi ja tulevasi regulatiivseid vajadusi.  
2. Käesolev meetod võimaldab iseloomustada uuritava kemikaali sissehingami ­
sega toimuval korduval igapäevasel kokkupuutel 28 päeva jooksul avalda ­
tavat kahjulikku mõju. Sissehingamisel avalduva subakuutse mürgisuse 28- päevastest uuringutest saadud andmeid on võimalik kasutada kvantitatiivse ­
teks riskihindamisteks (kui neile ei järgne sissehingamisel avalduva 
subkroonilise mürgisuse 90-päevane uuring (käesoleva lisa peatükk B.29)). 
Andmetest saab samuti teavet pikema ajavahemiku uuringu jaoks (näiteks sissehingamise subkroonilise mürgisuse 90-päevase uuringu jaoks) kontsen ­
tratsioonide valimiseks. Käesolev katsemeetod ei ole spetsiaalselt ette 
nähtud nanomaterjalide katsetamiseks. Käesoleva katsemeetodi kontekstis 
kasutatud mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 39 (2).
 
LÄHTEKAALUTLUSED  
3. Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi 
vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, et parandada 
uuringu kvaliteeti ja minimeerida loomade kasutamist. Teave, mis aitab 
valida katseks sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järgmist: uuri ­
tava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes  in vitro  või in vivo  mürgisuse katsete tulemused; 
eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; ole ­
masolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta ning sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse katsete andmed. Kui 
uuringu puhul eeldatakse neurotoksilisust või täheldatakse uuringus selle 
olemasolu, võib uuringu juht otsustada teha sellekohased hindamised, näiteks funktsionaalsed vaatluskatsed ( functional observational battery , 
FOB) ja motoorse aktiivsuse mõõtmise. Kuigi konkreetsete hindamiste 
jaoks kokkupuute korraldamise ajastus võib olla kriitilise tähtsusega, ei 
tohiks kõnealused täiendavad uuringud põhiuuringu kava elluviimist segada.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Söövitava või ärritava uuritava kemikaali lahjendatud lahuseid võib katse ­
tada kontsentratsioonil, mis annab soovitud mürgisuse määra (vt juhenddo ­
kument nr 39 (2)). Loomade kokkupuutesse viimisel kõnealuste materjali ­
dega peaks sihtkontsentratsioon olema piisavalt väike, et see ei põhjustaks märkimisväärset valu ega kannatusi, kuid piisav, et pikendada 
kontsentratsiooni-mõju kõver tasemeni, millega saavutatakse katse regula ­
tiivne ja teaduslik eesmärk. Kõnealused kontsentratsioonid tuleks valida juhtumipõhiselt, eelistatavalt asjakohaselt koostatud doosipiirkonna määra ­
mise katse alusel, millega saadakse teavet kõige olulisema näitaja, ärrituse 
ilmnemise läviväärtuse ja aja kohta (vt punktid 11–13). Tuleks esitada 
kontsentratsiooni valimise põhjendus.
 
5. Suremas olevad loomad ja loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel 
ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil surmata. Suremas olevaid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse samamoodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille 
põhjal tehakse suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise 
otsus, ja juhised prognoositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas OECD juhenddoku ­
mendis (3).
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
6. Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud 
loomi. Eelistatud liigiks on rott. Muu liigi kasutamise korral tuleks seda põhjendada.
 
Loomade ettevalmistamine  
7. Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Randomiseerimise päeval 
peaksid loomad olema seitsme kuni üheksa nädala vanused noored täiskas ­
vanud. Kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ± 20 % samast soost 
loomade keskmisest kehamassist. Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähista ­
takse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puuris vähemalt viis päeva enne katse algust, et võimaldada neil laboritin ­
gimustega kohaneda.
 
Pidamistingimused  
8. Loomad peaksid olema individuaalselt märgistatud, võimaluse korral nahaa ­
luse transponderiga, et hõlbustada vaatlusi ja vältida segiajamist. Katseloo ­
made pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist õhuniis ­
kust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi olla 
võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmita ­
tuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset 
jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitle ­
mise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjus ­
tada loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest 
tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsio ­
loogilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise minutimahtu. Kui on kättesaadavad üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, ei ole eelnev hoiutoruga kohane ­
mine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokku puutuvaid loomi tuleks 
kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja serti ­
fitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses 
kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi 
pimedust.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalatsioonikambrid  
9. Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi 
ja katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina 
kaudu toimuvat kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaero ­
sooli ja aerosooliks kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasu ­
tamise korral keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade 
kogumaht kambris ületada 5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudu ­
jääke on kirjeldatud juhenddokumendis nr 39 (2).
 
TOKSILISUSE UURINGUD  
Piirkontsentratsioonid  
10. Erinevalt ägeda mürgisuse uuringutest ei ole sissehingamisel avalduva suba ­
kuutse mürgisuse 28-päevastel uuringutel kindlaksmääratud piirkontsentrat ­
sioone. Maksimaalse katsetatava kontsentratsiooni valimisel tuleks arvesse 
võtta järgmist: 1) maksimaalne saavutatav kontsentratsioon, 2) millise kemi ­
kaalikontsentratsiooniga võib inimene kokku puutuda halvimal juhul, 3) vajadus säilitada piisav varustatus hapnikuga ja/või 4) loomade heaolu 
kaalutlused. Kui andmetel põhinevad piirangud puuduvad, võib kasutada 
määruse (EÜ) nr 1272/2008 (13) ägeda mürgisuse piirmäärasid (st kuni kontsentratsioonini 5 mg/l aerosooli puhul, 20 mg/l auru puhul ja 20 000 ppm gaasi puhul); vt juhenddokument nr 39 (2). Kui kõnealune piirmäär 
tuleb gaasi või väga lenduva uuritava kemikaali (näiteks külmutusagens) 
katsetamisel ületada, tuleks seda põhjendada. Piirkontsentratsioonil peaks ilmnema üheselt mõistetav mürgisus, kuid see ei tohiks põhjustada looma ­
dele liigset stressi ega lühendada nende elu (3).
 
Doosipiirkonna määramise katse  
11. Enne põhiuuringu alustamist võib olla vaja teha doosipiirkonna määramise 
katse. Doosipiirkonna määramise katse on eeluuringust põhjalikum, kuna 
selles ei piirduta kontsentratsiooni valimisega. Doosipiirkonna määramise 
katsest saadud teadmistest võib sõltuda põhiuuringu edukus. Doosipiirkonna määramise katses võidakse näiteks saada tehnilist teavet analüüsimeetodite 
ja osakeste suuruse määramise kohta, teha kindlaks toksilisusmehhanisme, 
saada kliinilise patoloogia ja histopatoloogia andmeid ning hinnata, milline võib põhiuuringus olla täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) ja minimaalne mürgine kontsentratsioon (MTC). Uuringu juht 
võib otsustada kasutada doosipiirkonna määramise katset, et määrata kind ­
laks hingamisteede ärrituse läviväärtus (näiteks hingamisteede histopato ­
loogia, kopsutalitluse katsete või bronhoalveolaarse lavaaži abil), maksi ­
maalne kontsentratsioon, mille juures loomadele ei tekitata liigset stressi, 
ja uuritava kemikaali mürgisust kõige paremini iseloomustavad parameetrid.
 
12. Doosipiirkonna määramise katse võib hõlmata ühte või enamat kontsentrat ­
siooni. Iga kontsentratsiooniga peaks kokku puutuma kuni kolm isas- ja kolm emaslooma. Doosipiirkonna määramise katse peaks kestma vähemalt viis päeva ja üldjuhul mitte kauem kui 14 päeva. Põhiuuringu kontsentrat ­
sioonide valimise põhjendused tuleks esitada uuringuprotokollis. Põhiuu ­
ringu eesmärk on näidata mõju sõltuvust kontsentratsioonist eelduste koha ­
selt kõige tundlikuma näitaja alusel. Väike kontsentratsioon peaks ideaal ­
juhul olema täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon ja suur kontsen ­
tratsioon peaks näitama üheselt mõistetavat mürgistust, kuid see ei tohiks 
põhjustada loomadele liigset stressi ega lühendada nende elu (3).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Doosipiirkonna määramise katse jaoks kontsentratsioonide valimisel tuleks 
arvesse võtta kogu saadaolevat teavet, sh struktuuri-aktiivsuse sõltuvusi ja 
samalaadseid kemikaale käsitlevaid andmeid (vt punkt 3). Doosipiirkonna määramise katse võib kinnitada mehhanistlike kriteeriumide alusel kõige tundlikumaks peetavaid näitajaid, nagu organofosfaatide põhjustatud kolii ­
nesteraasi inhibeerimine, erütrotsütotoksiliste ainete põhjustatud methemo ­
globiini teke, türoidhormoonid (T
 3 , T  4 ) türotoksikantide puhul, valk, 
laktaatdehüdrogenaas (LDH) või neutrofiilid bronhoalveolaarses lavaažis ohutute vähe lahustuvate osakeste või kopse ärritavate aerosoolide puhul, 
või need ümber lükata.
 
Põhiuuring  
14. Subakuutse mürgisuse põhiuuring hõlmab üldjuhul kolme kontsentratsiooni 
ning vajaduse korral samuti samaaegseid negatiivseid (õhu) ja/või kandeaine kontrollrühmi (vt punkt 17). Asjakohaste kokkupuutetasemete valimisel 
tuleks kasutada kõiki kättesaadavaid andmeid, sh süsteemse mürgisuse 
uuringute, metaboliseerimise ja kineetika uuringute tulemusi (eriti tuleks tähelepanu pöörata suure kontsentratsiooni vältimisele, mille puhul kineeti ­
lised protsessid küllastatakse). Iga katserühm koosneb vähemalt kümnest 
närilisest (viis isas- ja viis emaslooma), kes viiakse uuritava kemikaaliga 
kokkupuutesse kuueks tunniks päevas viiel päeval nädalas nelja nädala vältel (uuringu kogukestus on 28 päeva). Loomad võib viia kokkupuutesse ka seitsmel päeval nädalas (näiteks sissehingatavate ravimite katsetamisel). 
Kui üks sugu on teatava uuritava kemikaali suhtes teadaolevalt tundlikum, 
võib eri sugude puhul kasutada kokkupuutel erinevaid kontsentratsioone, et optimeerida mõju kontsentratsioonist sõltuvust, nagu on kirjeldatud punktis 15. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu närilise ­
liigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et mini ­
meerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Päevas vähem kui kuuetunnise kokkupuute kasutamisel või kui on vajalik korraldada pika kestusega (näiteks 22 tundi päevas) kogu keha kaudu kokkupuute uuring, 
tuleb seda põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Loomi ei tohiks 
kokkupuute ajal sööta, v.a juhul, kui kokkupuuteperiood ületab kuut tundi. Kogu keha kaudu toimuva kokkupuute ajal võib loomadele anda vett.
 
15. Valitud sihtkontsentratsioonid peaksid võimaldama kindlaks teha sihtor ­
gani(d) ja saada mõju selge sõltuvus kontsentratsioonist.  
— Suur kontsentratsioon peaks põhjustama mürgist mõju, kuid ei tohiks 
põhjustada püsivaid nähte ega surma, mis takistaks usaldusväärset hindamist.
 
— Keskmine (keskmised) kontsentratsioon(id) peaks(id) olema eraldatud, et 
esile kutsuda eri tugevusega mürgist mõju väikese ja suure kontsentrat ­
siooni vahemikus.  
— Väike kontsentratsioon peaks põhjustama vähe mürgistusnähtusid või 
olema mõjuta.  
Satelliituuring (pöörduvuse uuring)  
16. Mürgistuse pöörduvuse, püsivuse või viivitusega avaldumise jälgimiseks 
võidakse korraldada satelliituuring (pöörduvuse uuring) töötlusjärgsel asja ­
kohase pikkusega ajavahemikul, mis ei tohi olla lühem kui 14 päeva. Satel ­
liitrühmades (pöörduvuse rühmades) on viis isas- ja viis emaslooma, kellele korraldatakse kokkupuude põhiuuringu katseloomadega samal ajal. Satellii ­
tuuringu (pöörduvuse uuringu) rühmad peaksid uuritava kemikaaliga kokku 
puutuma suurimal kontsentratsioonil ning vajaduse korral tuleks kasutada 
samaaegseid õhu ja/või kandeaine kontrollrühmi (vt punkt 17).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Loomade kontrollrühm  
17. Samaaegse negatiivse (õhu) kontrollrühma loomi tuleks kohelda katserühma 
loomadega samalaadsel viisil selle erinevusega, et nad viiakse uuritava kemikaali asemel kokkupuutesse filtritud õhuga. Kui katsekeskkonna 
loomisel kasutatakse vett või muud ainet, tuleks uuringus kasutada nega ­
tiivse (õhu) kontrollrühma asemel kandeaine kontrollrühma. Võimaluse korral tuleks kandeainena alati kasutada vett. Kui kandeainena kasutatakse vett, peaks loomade kontrollrühm puutuma kokku sama suhtelise õhuniis ­
kusega õhuga kui katse käigus kokku puutuvad rühmad. Sobiva kandeaine 
valimine peaks põhinema asjakohasel eeluuringul või varasematel andmetel. Kui kandeaine mürgisus ei ole hästi teada, võib uuringu juht otsustada 
kasutada nii negatiivset (õhu) kontrollrühma kui ka kandeaine kontroll ­
rühma, kuid see ei ole soovitatav. Kui varasematest andmetest nähtub, et kandeaine ei ole mürgine, ei ole negatiivset (õhu) kontrollrühma vaja ja tuleks kasutada ainult kandeaine kontrollrühma. Kui kandeaines oleva uuri ­
tava kemikaali eeluuringust mürgisust ei nähtu, siis võib järeldada, et kande ­
aine ei ole katsetataval kontsentratsioonil mürgine ja tuleks kasutada selle kandeaine kontrollrühma.
 
KOKKUPUUTETINGIMUSED  
Kontsentratsioonide manustamine  
18. Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, 
aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava 
kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitse ­
mise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuri ­
tavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ette ­
vaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist. Aineosakesi võib osakeste suuruse vähendamiseks mehaaniliselt töödelda. Täpsemad 
juhendid on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
 
Osakeste suurusjaotus  
19. Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti 
aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hinga ­
misteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaa ­
miline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–3 μm ning geomeetriline stan ­
dardhälve ( σ
 g ) on 1,5–3,0 (4). Kõnealuse standardi järgimiseks tuleks teha 
mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed võivad olla kõne ­
alusest normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed ja kiud võivad 
sätestatud näitajaid ületada.
 
Uuritava kemikaali preparaat kandeaines  
20. Ideaaljuhul tuleks uuritavat kemikaali katsetada ilma kandeaineta. Kui 
kandeaine kasutamine on vajalik sobiva uuritava kemikaali kontsentratsiooni 
ja osakeste suuruse tekitamiseks, tuleks eelistatavalt kasutada vett. Alati, kui uuritav kemikaal lahustatakse kandeaines, tuleks tõendada uuritava kemi ­
kaali stabiilsust.
 
KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE  
Kambri õhuvarustus  
21. Kokkupuutekambri õhuvarustust tuleks hoolikalt kontrollida, pidevalt seirata 
ning andmed iga kokkupuute korral vähemalt kord tunnis registreerida. Katsekeskkonna kontsentratsiooni (või ajalise stabiilsuse) reaalajas seire on kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab 
endast kaudset vahendit sissehingamise kõigi asjakohaste dünaamiliste para ­
meetrite kontrollimiseks. Kui kontsentratsiooni jälgitakse reaalajas, võib
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
õhuvoogude mõõtmise sageduse vähendada ühele mõõtmisele kokkupuute 
kohta päevas. Ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldava kambri puhul 
tuleks eritähelepanu pöörata väljahingatud õhu uuesti sissehingamise välti ­
misele. Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisi ­
saldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõnealuseid norme ei 
ole võimalik täita, tuleks hapniku- ja süsinikdioksiidisisaldust mõõta. Kui 
kokkupuute esimese päeva mõõtmistest nähtub, et kõnealuste gaaside sisaldus on nõuetekohasel tasemel, ei peaks edasine mõõtmine olema vajalik.
 
Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus  
22. Kambri temperatuur tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamist ­
sooni suhtelist õhuniiskust nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu toimuva 
kokkupuute korral tuleks pidevalt seirata ja see tuleks registreerida võima ­
luse korral üks kord tunnis iga kokkupuute ajal. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatavalt hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju tõttu 
ei pruugi see olla saavutatav (näiteks veepõhise segu uurimisel) või 
mõõdetav.
 
Uuritav kemikaal: nimikontsentratsioon  
23. Kui see on võimalik, tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon alati 
arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda lisatud 
uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud 
õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku kontsentrat ­
siooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning seega saab 
seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avastamiseks.
 
Uuritav kemikaal: tegelik kontsentratsioon  
24. Tegelik kontsentratsioon on inhalatsioonikambris loomade hingamistsoonist 
võetud proovist määratud uuritava kemikaali kontsentratsioon. Tegelikke kontsentratsioone on võimalik saada kas spetsiifiliste meetodite abil (näiteks 
otsene proovivõtt, adsorptsiooni või keemilise reaktsiooni meetodid ning 
järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimeetriline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud ainult ühest koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vede ­
liku aerosooli korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud 
konkreetse kemikaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulbe ­
raerosooli kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada gravimeetrilist analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus 
oleva materjali koostis sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline 
teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuri ­
tava kemikaali (eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. Aerosoolainete puhul, mis võivad aurustuda või subli ­
meeruda, tuleks näidata, et valitud meetodiga koguti kõiki faase.
 
25. Võimaluse korral tuleks kogu katse jooksul kasutada uuritava kemikaali 
ühte partiid ning uuritavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib 
selle puhtus, homogeensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks 
uuritavat kemikaali, sh selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, tuleb keemiliselt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning määrata nende kogused. Seda on võimalik tõendada muu 
hulgas järgmiste andmete alusel: retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, 
molekulmass massispektroskoopia või gaaskromatograafia analüüsidest või muud hinnangud. Kuigi uurimislabor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemilise määratlemise eest, võib uurimislaboril olla mõttekas kinnitada 
tellija iseloomustust vähemalt piiratud ulatuses (näiteks värv, füüsikalised 
omadused jne).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna. Kokkupuu ­
tetingimuste stabiilsuse tõendamiseks võib kasutada reaalajas seire seadet, 
näiteks aerosooli fotomeetrit aerosoolide puhul või süsivesinike kogusisal ­
duse analüsaatorit aurude puhul. Tegelikku kambrikontsentratsiooni tuleks mõõta vähemalt kolm korda iga kokkupuutepäeva jooksul iga kokkupuute ­
kontsentratsiooni kohta. Kui see piiratud õhuvarustuse või väikeste kontsen ­
tratsioonide tõttu ei ole võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi kohta võtta ühe proovi. Ideaaljuhul tuleks kõnealune proov võtta kogu kokkupuuteaja jooksul. Kambrist võetud proovide kontsentratsioon ei tohiks keskmisest 
kontsentratsioonist erineda rohkem kui ±10 % gaaside ja aurude puhul või 
±20 % vedelik- või pulberaerosoolide korral. Tuleks arvutada kambri tasa ­
kaaluoleku saavutamise aeg (t
 95 ) ja see registreerida. Kokkupuute ajava ­
hemik kestab selle aja, kui uuritavat kemikaali lisatakse. Selles võetakse 
arvesse aega, mis on vajalik kambri tasakaaluseisundi saavutamiseks (t  95 ) 
ja kontsentratsiooni vähenemiseks. Juhendid t  95 hindamise kohta on esitatud 
juhenddokumendis nr 39 (2).  
27. Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest 
(näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja 
mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda 
inhalatsioonikambris erinevalt. Seepärast tuleks valida vähemalt üks uuritav aine (mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, iga faasi (gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, tuleks 
kirja panna kogu segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toimeaine 
või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisateave tegelike kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).
 
Uuritav kemikaal: osakeste suurusjaotus  
28. Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt iga nädal 
iga kontsentratsiooni kohta, kasutades kaskaadimpaktorit või alternatiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on võimalik 
tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud tulemuste 
võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alternatiivset seadet.
 
29. Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada muud seadet, näiteks gravi ­
meetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veenduda peamise seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu saadud massi ­
kontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil 
saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kui uuringu varajases etapis on kõikidel uuritavatel kontsentratsioonidel võimalik tõendada võrdväärsust, võib täiendavatest kinnitavatest mõõtmis ­
test loobuda. Loomade heaolu silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et 
mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik uuringut korrata.
 
30. Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on 
võimalik, et auru kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool või kui auru 
keskkonnas tuvastatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside 
seguga.  
VAATLUSED  
31. Loomi tuleks enne kokkupuuteperioodi, selle vältel ja pärast seda kliiniliselt 
jälgida. Olenevalt loomade reageerimisest kokkupuutele võidakse ette näha 
sagedasem jälgimine. Kui loomade jälgimist takistab looma hoiutoru, halvasti valgustatud kogukehakamber või läbipaistmatu keskkond, tuleks loomi hoolikalt jälgida pärast kokkupuudet. Enne järgmise päeva kokku ­
puudet toimuva jälgimise abil on võimalik hinnata mürgise mõju pöörduvust 
või süvenemist.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Kõik vaatlusandmed registreeritakse iga looma kohta eraldi. Kui loomad 
surmatakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg 
võimalikult täpselt registreerida.  
33. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade, 
limaskestade, hingamis-, vereringe- ja närvisüsteemi muutusi, samuti soma ­
tomotoorse aktiivsuse ja käitumismustri muutusi. Tähelepanu peaks olema 
suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja 
kooma kindlakstegemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib anda lisaand ­
meid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüpertermia kohta, mis on seotud kokkupuute või vangistusega. Uuringusse võib lisada täien ­
davaid hindamisi, nagu kineetika, bioseire, kopsutalitlus, kopsukudedesse 
kogunevate vähe lahustuvate materjalide püsivus ja käitumismuutused.
 
KEHAMASS  
34. Iga looma kehamass tuleks registreerida natuke enne esimest kokkupuudet 
(päev 0) ja seejärel kaks korda nädalas (näiteks reedeti ja esmaspäeviti, et tõendada taastumist ilma kokkupuuteta nädalavahetuse jooksul, või pärast ajavahemikku, mis võimaldab süsteemse mürgisuse hindamist) ning surma 
või eutanaasia ajal. Kui esimese kahe nädala jooksul nähtusid ei ilmne, võib 
ülejäänud uuringu vältel mõõta kehamassi kord nädalas. Satelliitrühma (pöörduvuse rühma) loomade (kui neid kasutatakse) kaalumist tuleks jätkata iga nädal kogu taastumisperioodi vältel. Uuringu lõpetamisel tuleks iga 
looma veidi enne surmamist kaaluda, et võimaldada organite ja kehamassi 
suhte täpset arvutamist.
 
SÖÖDA JA VEE TARBIMINE  
35. Sööda tarbimist tuleks mõõta iga nädal. Samuti võib mõõta vee tarbimist.  
KLIINILINE PATOLOOGIA  
36. Kliinilise patoloogia hindamised tuleks teha igale loomale, sh kontrollrühma 
ja satelliitrühma (pöörduvuse rühma) loomadele, kui nad surmatakse. Kokkupuute lõpetamise ja vereproovide võtmise vaheline ajavahemik tuleks registreerida, eriti kui kõnealuse näitaja taastumine on kiire. Plasmast kiiresti 
kaduvate indikaatorainete (näiteks COHb, CHE ja MetHb) määramiseks 
tuleb proov võtta kohe pärast kokkupuute lõppu.
 
37. Tabelis 1 on loetletud kliinilised patoloogilised parameetrid, mida nõutakse 
üldjuhul kõigi toksikoloogiliste uuringute puhul. Uriinianalüüs ei ole alati vajalik; selle võib teha, kui seda oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu 
peetakse kasulikuks. Uuringu juht võib uuritava kemikaali mürgisuse pare ­
maks iseloomustamiseks otsustada hinnata täiendavaid parameetreid (näiteks koliinesteraas, lipiidid, hormoonid, happe-aluse tasakaal, methemoglobiin või Heinzi kehakesed, kreatiinkinaas, müeloidi/erütroidi suhe, troponiinid, 
arteriaalse vere gaasid, laktaatdehüdrogenaas, sorbitooldehüdrogenaas, gluta ­
maatdehüdrogenaas ja γ-glutamüül-transpeptidaas).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabel 1  
Standardsed kliinilise patoloogia parameetrid  
Hematoloogia  
Erütrotsüütide arv 
Hematokrit 
Hemoglobiini kontsentratsioon 
Hemoglobiini keskmine kogus 
erütrotsüüdis (MCH) 
Keskmine erütrotsüüdi maht (MCV) 
Hemoglobiini keskmine kontsentrat ­
sioon erütrotsüüdis 
Retikulotsüüdid Leukotsüütide koguarv 
Diferentseeritud leukotsüütide arv 
Trombotsüütide arv 
Hüübimisvõime (valige üks): — protrombiini aeg 
— hüübimisaeg 
— osalise tromboplastiini aeg
 
Kliiniline keemia  
Glükoos (*) 
Üldkolesterool 
Triglütseriidid 
Vere karbamiidlämmastik Üldbilirubiin Kreatiniin 
Üldvalk 
Albumiin Globuliin Alaniinaminotransferaas 
Aspartaataminotransferas 
Leeliseline fosfataas 
Kaalium Naatrium Kaltsium 
Fosfor 
Kloriid
 
Uriinianalüüs (valikuline)  
Välimus (värvus ja hägusus) 
Kogus Suhteline tihedus või osmolaalsus 
pH Üldvalk 
Glükoos Veri/vererakud
 
(*) Kuna pikaajaline nälgimine võib põhjustada glükoosi mõõtmise tulemuste erine ­
vust katserühma ja kontrollrühma loomade vahel, peaks uuringu juht otsustama, 
kas loomade söödata jätmine on asjakohane. Kui loomad jäetakse söödata, peaks 
ajavahemik olema vastav kasutatavale liigile; roti puhul võib see ajavahemik olla 
16 tundi (nälgimine öö jooksul). Paastuglükoosi võib määrata pärast öist nälgimist 
viimasel kokkupuutenädalal või pärast öist nälgimist enne lahkamist (viimasel juhul määratakse paastuglükoos koos kõigi muude kliinilise patoloogia näitaja ­
tega).
 
38. Kui on tõendeid, et peamine kogunemise ja säilitamise piirkond on mada ­
lamad hingamisteed (s.o alveoolid), võib oletatava doosi-toime seose para ­
meetrite kvantitatiivseks hindamiseks kasutada bronho-alveolaarset lavaaži, keskendudes alveoliidile, kopsukoe põletikule ja fosfolipidoosile. See võimaldab asjakohaselt kontrollida alveolaarse kahjustuse puhul esinevat 
doosi-toime seost ning toime sõltuvust ajast. Bronhoalveolaarse lavaaži 
vedelikku võib analüüsida leukotsüütide üldarvu ja diferentseeritud leukot ­
süüdiarvude, üldvalgu ja laktaatdehüdrogenaasi määramiseks. Veel võib kaaluda lüsosoomide kahjustust, fosfolipidoosi, fibroosi ning ärritus- või 
allergilist põletikku tõendavate näitajate määramist, selleks võib määrata 
ka põletikuaineid tsütokiine/kemokiine. Bronhoalveolaarse lavaaži mõõt ­
mised üldiselt täiendavad histopatoloogiliste uuringute tulemusi, kuid ei saa neid asendada. Kopsude lavaaži tegemise juhendid on esitatud juhend ­
dokumendis nr 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
MAKROPATOLOOGIA JA ORGANITE MASS  
39. Kõik katseloomad (kaasa arvatud katse käigus surnud, humaansel viisil 
surmatud või uuringust looma heaolu tagamiseks kõrvaldatud loomad) tuleks (võimaluse korral) täielikult veretustada ja täielikult lahata. Iga 
looma viimase kokkupuute lõpu ja surmamise vaheline ajavahemik tuleks 
registreerida. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leidmist ei ole võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt 
ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloogilised muutused 
tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede mis tahes muutus ­
tele.
 
40. Tabelis 2 on loetletud organid ja koed, mis täieliku lahkamise ajal tuleks 
sobivas keskkonnas säilitada histopatoloogilise uuringu jaoks. [Nurksul ­
gudes esitatud] organite ja kudede ning muude organite ja kudede säilita ­
mise otsustab uuringu juht.  Paksus kirjas esitatud  organid tuleb välja 
puhastada ja kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kilp ­
nääret ja munandimanuseid tuleks kaaluda ainult vajaduse korral, kuna 
nende väljapuhastamisel tekkivad moonutused võivad takistada histopato ­
loogilist hindamist. Koed ja organid tuleks paigutada 10 % puhverdatud formaliini või muusse sobivasse fikseerivasse ainesse vahetult pärast lahka ­
mist ja mitte vähem kui 24–48 tundi enne väljapuhastamist, olenevalt kasu ­
tatavast fikseerivast ainest.
 
Tabel 2  
Täieliku lahkamise juures säilitatavad organid ja koed  
Neerupealised  
Luuüdi (ja/või värske aspiraat)  
Aju (sh suuraju osad, väikeaju ning piklika ­
ju/ajusild)  
[Silmad (võrkkest, nägemisnärv) ja silma ­
laud]  
Süda  
Neerud  
Kõri (3 taset, üks tase hõlmab kõripealise 
põhja)  
Maks  
Kopsud  (kõik ühe tasandi sagarad, sh 
peamised bronhid)  
Lümfisõlmed kopsu kopsuvärati piirkonnast 
eelkõige vähe lahustuvatest osakestest koos ­
neva uuritava kemikaali korral. Põhjalikuma 
immunoloogiavaatluse või -uuringu jaoks 
võib kaaluda täiendavate lümfisõlmede, näiteks keskseinandi, kaela/submandibulaarse ja/või kõrva piirkonna lümfisõlmede säilita ­
mist.
 
Nasofarüngeaalsed koed (vähemalt neljal 
tasandil; üks tasand peab hõlmama nasofa ­
rüngeaalset kanalit ja ninaga seotud lümfikude (NALT)).
 
Söögitoru  
[Haistmissibul]  
Munasarjad  Seemnepõiekesed  
Seljaaju (kaela-, rinna- ja nimmepiirkond)  
Põrn  
Magu  
Munandid  
Harknääre  
Kilpnääre  
Hingetoru (vähemalt 2 tasandit, sh 1 piki ­
suunaline lõige läbi hingetoruharja ja 1 rist ­
lõige)  
[Kusepõis]  
Emakas  
Kõik silmaga nähtavad kahjustused  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Kopsud tuleks tervena eemaldada, kaaluda ja paigutada sobivasse fikseeri ­
vasse ainesse rõhul 20–30 cm veesammast, et tagada kopsude struktuuri 
säilimine (5). Tuleks koguda ühel tasandil tehtud lõiked kõikidest sagaratest, sh peamistest bronhidest, kuid kui tehakse kopsude lavaaž, tuleks sellest sagarast, millele lavaaži ei tehtud, teha lõiked kolmel tasandil (mitte seeria ­
viisilised lõiked).
 
42. Tuleks uurida vähemalt nelja nasofarüngeaalsete kudede tasandit, millest 
üks peaks hõlmama nasofarüngeaalset kanalit (5, 6, 7, 8, 9), et võimaldada asjakohaselt uurida skvamoosrakulist, ülemineku- (hingamisteede  clara - 
rakud), hingamisteede (ripsepiteel) ja olfaktoorset epiteeli ning neid dree ­
nivat lümfikude (NALT; 10, 11). Tuleks uurida kõri kolme tasandit ja üks 
neist tasanditest peaks hõlmama kõripealise põhja (12). Tuleks uurida vähe ­
malt kahte hingetoru tasandit, sh ühte pikisuunalist lõiget läbi peabronhide bifurkatsiooni harja ja ühte ristlõiget.
 
HISTOPATOLOOGIA  
43. Kontrollrühma ja suure kontsentratsiooni rühma ning kõigi loomade puhul, 
kes uuringu jooksul surevad või surmatakse, tuleks teha kõigi tabelis 2 
loetletud organite ja kudede histopatoloogiline hindamine. Eritähelepanu 
tuleks pöörata hingamisteedele, sihtorganitele ja nähtavatele kahjustustele. Organeid ja kudesid, milles suure kontsentratsiooni rühma isenditel leiti kahjustusi, tuleks uurida kõigi rühmade isenditel. Uuringu juht võib otsus ­
tada teha histopatoloogilised hindamised täiendavate rühmade puhul, et 
tõendada selget sõltuvust kontsentratsioonist. Kui kasutatakse satelliitrühma (pöörduvuse rühma), tuleks teha kõigi selliste kudede ja organite histopato ­
loogiline hindamine, milles katserühmade indiviididel leiti muutusi. Kui 
suure kokkupuute rühmas sureb liiga palju loomi varajases etapis või 
tekib muid probleeme, mis muudavad andmete tähenduse ähmaseks, tuleks histopatoloogiliselt uurida järgmise väiksema kontsentratsiooni rühma. Tuleks püüda omavahel seostada üldisi tähelepanekuid ja mikroskoopilisi 
leide.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
44. Iga looma kohta tuleks esitada kehamassi, sööda tarbimise, kliinilise pato ­
loogia, üldpatoloogia, organite massi ja histopatoloogia andmed. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga 
katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete mürgistusnähtu ­
dega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende 
ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud. Kõiki tulemusi, 
nii kvantitatiivseid andmeid kui ka üksiktähelepanekuid, tuleks sobiva statis ­
tilise meetodi abil hinnata. Võib kasutada kõiki üldtunnustatud statistilisi meetodeid; statistilised meetodid tuleks valida juba uuringu kavandamisel.
 
Katseprotokoll  
45. Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.  
Katseloomad ja pidamistingimused  
— Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri 
kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline õhuniiskus, valgustuspe ­
riood ja sööt.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus. Võib 
esitada lähteandmed ja varasemad andmed, kui need on saadud loomade 
kohta, kes viidi kemikaaliga kokkupuutesse samasugustes kokkupuute-, pidamis- ja nälgimistingimustes.
 
— Loomade arv, vanus ja sugu.  
— Randomiseerimismeetod.  
— Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karan ­
tiin ja haiguste ravi.  
Uuritav kemikaal  
— Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised 
omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).  
— Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi 
nr, kui see on teada.  
Kandeaine  
— Kandeaine kasutamise põhjendus ja kandeaine valiku põhjendus (kui 
kandeainena ei kasutata vett).  
— Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta 
uuringu tulemusi.  
Inhalatsioonikamber  
— Inhalatsioonikambri üksikasjalik kirjeldus, sh selle mahu andmed ja 
joonis.  
— Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus 
ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.  
— Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni 
mõõtmise seadmed.  
— Õhuallikas ja õhu konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.  
— Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud 
meetodid.  
— Rõhuvahe (positiivne või negatiivne).  
— Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokku ­
puude); loomade paiknemine kambris (kogu keha kaudu toimuv kokku ­
puude).  
— Katsekeskkonna (atmosfääri) stabiilsus.  
— Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonnast proo ­
vide võtmine kambris.  
— Sissejuhitud ja väljatõmmatud õhu töötlemine.  
— Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina 
kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha 
kaudu toimuv kokkupuude).  
— Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t  95 ). 
— Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.  
— Mõõteseadmed (vajaduse korral).  
Andmed kokkupuute kohta  
— Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemi ­
kaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).  
— Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoo ­
nist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, aur, aerosool) puhul võidakse iga faasi eraldi analüüsida.
 
— Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutena (mg/l, mg/m  3 
jne), mitte mahuühikutena (ppm, ppb jne).  
— Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline 
diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve ( σ g ) ning nende 
arvutamise meetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.  
Katsetingimused  
— Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh 
andmed meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste suuruse 
vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks.  
— Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkon ­
naga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).  
— Kambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoo jälgimiseks kasutatud seadmete 
üksikasjad (st kalibreerimiskõvera koostamine).  
— Kambrikontsentratsiooni ja osakeste suurusjaotuse määramise proovide 
kogumise seadmete andmed.  
— Kasutatud keemilise analüüsi meetodi ja selle valideerimise üksikasjad 
(sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukeskkonna analüü ­
simisel).  
— Loomade katse- ja kontrollrühma määramiseks kasutatud randomiseeri ­
mismeetod.  
— Üksikandmed sööda ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee 
allikas).  
— Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.  
Tulemused  
— Tabelid katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu kohta.  
— Tabelid kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni andmete kohta.  
— Tabelid osakeste suurusjaotuse kohta, sh analüüsiproovide võtmise 
andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σ g arvutamine.  
— Tabelid iga looma reageerimise ja kontsentratsioonide kohta (st mürgis ­
tusnähtudega loomad, kaasa arvatud surnud loomad, mõjude laad, 
raskus, ilmumise aeg ja kestus).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— Tabelid iga katselooma kehamassi kohta.  
— Tabelid sööda tarbimise kohta.  
— Tabelid kliinilise patoloogia andmete kohta.  
— Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.  
— Tabelid kõigi muude mõõdetud näitajate kohta.  
Tulemuste arutelu ja tõlgendamine  
— Eritähelepanu tuleks pöörata selliste meetodite kirjeldamisele, mida 
kasutati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piir ­
kontsentratsioon või osakeste suurus.  
— Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda küsimust, kas osakeste suurus oli 
sobiv sissehingamiseks, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei olnud võimalik täita.
 
— Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioo ­
nide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tege ­
liku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.  
— Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist 
toimeviisi (süsteemne või lokaalne).  
— Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (3) 
sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata 
valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis tuleks esitada selgitus.
 
— Tuleks kindlaks teha sihtorgan(id).  
— Tuleks määrata kindlaks täheldatava kahjuliku toimeta 
kontsentratsioon (NOAEL) ja väikseim täheldatavat kahjulikku toimet 
avaldav kontsentratsioon (LOAEL).  
KIRJANDUS  
1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guide ­
line No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency.  
5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229–258.
 
6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.  
7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
 
9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
 
10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyn ­
geal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.  
11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.  
12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428.  
13) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 
2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja paken ­
damist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja 
tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
1. liide  
MÕISTE  
Uuritav kemikaal –  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. KORDUSDOOSI MÜRGISUS (28 PÄEVA, NAHAKAUDNE)  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust (A).  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust (B).  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Testainet kantakse 28 päeva jooksul iga päev astmeliste annustena 
mitme rühma katseloomade nahale nii, et üks rühm saab ühesuguse 
annuse. Manustamisperioodil jälgitakse loomi iga päev, et kontrollida 
mürgistusnähtude ilmnemist. Katse jooksul surnud loomad lahatakse, katse lõpus surmatakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Puuduvad.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistused  
Loomi hoitakse enne katset vähemalt viis päeva katsele vastavatel 
pidamis- ja söötmistingimustel. Noored terved katseloomad randomi ­
seeritakse enne katset ja jagatakse katse- ja kontrollrühmadesse. Vahetult enne katset eemaldatakse pügamise teel katselooma keha 
seljaosalt karvkate. Kasutada võib ka raseerimist, seda tuleks teha 
24 tundi enne katset. Korduspügamist või -raseerimist on tavaliselt vaja ligikaudu nädalaste vahedega. Karvkatte pügamisel või raseeri ­
misel tuleb vältida naha marrastamist. Testaine nahale kandmiseks 
tuleb vabastada vähemalt 10 % kehapinnast. Vabastatava ala ja katte 
mõõtmete valikul tuleks arvesse võtta looma massi. Tahkete, vaja ­
duse korral peenestatud ainete puhul tuleks testainet nahaga hea kokkupuute saavutamiseks niisutada piisava koguse vee või sobiva 
kandjaga. Vedelaid testaineid kasutatakse üldjuhul lahjendamata 
kujul. Testainet kantakse nahale kord päevas, 5–7 päeval nädalas.
 
1.6.2.  Katsetingimused  
1.6.2.1.  Katseloomad  
Kasutada võib täiskasvanud rotti, küülikut või merisiga. Kasutada 
võib ka muid liike, kuid seda tuleb põhjendada.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Kasutatavate katseloomade masside erinevus katse alguses ei tohiks 
ületada ± 20 % vastavast keskmisest.  
1.6.2.2.  Katseloomade arv ja sugu  
Iga uuritavat annusemäära katsetakse vähemalt kümnel terve nahaga 
loomal (viiel emas- ja viiel isasloomal). Emasloomad ei tohiks olla 
poeginud ega tiined. Kui uuringu jooksul plaanitakse loomi surmata, 
tuleks loomade arvu enne uuringu lõppu surmamisele määratud loomade arvu võrra suurendada. Lisaks võib testaine kõrgeima annu ­
sega mõjutada 28 päeva jooksul üht kümne loomaga (viis looma 
kummastki soost) satelliitrühma ja jälgida sellel 14 päeva jooksul 
pärast kokkupuudet mürgistusnähtude pöörduvust, püsivust või hilist avaldumist. Kasutatakse ka üht kümne kontroll-loomaga (viis looma kummastki soost) satelliitrühma.
 
1.6.2.3.  Annused  
Kasutatakse vähemalt kolme annusemäära ja kontrolli või kandja 
kasutamisel kandja kontrolli. Kokkupuuteperioodi kestus peaks 
olema vähemalt kuus tundi päevas. Testainet tuleks peale kanda 
iga päev sarnastel kellaaegadel ja annuseid järk-järgult (üks või kaks korda nädalas) reguleerida, et annus jääks looma kehamassi suhtes konstantseks. Testainega töötlemine välja arvatud, tuleks kont ­
rollrühma loomi kohelda samamoodi nagu katserühma loomi. Kui 
annustamise lihtsustamiseks kasutatakse kandjat, tuleks kandja kont ­
rollrühmale manustada kandjat analoogselt katserühmaga ja nad peaksid saama sama koguse kandjat nagu kõrgeima annusemääraga 
rühm. Kõrgeim annus peaks põhjustama mürgistusnähte, kuid ei 
tohiks põhjustada suremust või siis peaks suremus olema väike. Väikseima doosi puhul ei tohiks mürgisust ilmneda. Kasutuskõlbliku hinnangulise inimkokkupuute annuse olemasolul peaks madalaim 
annus olema sellest kõrgem. Ideaaljuhul peaks keskmine annusemäär 
põhjustama minimaalseid täheldatavaid mürgistusnähte. Rohkem kui ühe vahepealse annuse kasutamisel peaks annusemäärad jaotuma nii, et tekkivad mürgistusnähud jaotuvad astmeliselt. Tulemuste usaldus ­
väärse hindamise võimaldamiseks peaks suremus madala ja vahe ­
pealsete annusemääradega ning kontrollrühmades olema madal.
 
Kui testaine nahale kandmine toob kaasa tugeva nahaärrituse, tuleks 
kontsentratsioone vähendada; selle tulemuseks võib olla muude 
mürgistusnähtude vähenemine või puudumine kõrgeima annusemäära kasutamisel. Lisaks võib tõsiste nahakahjustuste ilmnemisel olla vaja uuring lõpetada ja teha madalamatel kontsentratsioonidel uus uuring.
 
1.6.2.4.  Piirsisalduskatse  
Kui eelkatse annusemääraga 1 000 mg/kg või kõrgema, võimaliku 
teadaoleva inimkokkupuute kontsentratsiooniga seotud annusemää ­
raga ei kutsu esile mürgistusnähte, võib edasise kontrollimise lugeda 
tarbetuks.  
1.6.2.5.  Vaatlusperiood  
Kõigil katseloomadel tuleb iga päev jälgida mürgistusnähtude ilmne ­
mist. Mürgistusnähtude ilmnemise ja kadumise ning surma aeg on 
väga olulised ning tuleks registreerida.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Katse käik  
Loomi tuleks puurides pidada ühekaupa. Testainet kantakse loomade 
nahale 28 päeva jooksul, ideaaljuhul 7 päeval nädalas. Mis tahes satelliitrühma loomadele, kellega planeeritakse hilisemaid vaatlusi, 
ei tohiks järgneva 14 päeva jooksul ainet manustada, et kontrollida 
mürgistusnähtudest paranemist või nende püsivust. Kokkupuute kestus peaks olema vähemalt kuus tundi päevas.
 
Testaine tuleks kanda ühtlaselt alale, mis moodustab ligikaudu 10 % 
kogu kehapinnast. Väga mürgiste ainete puhul võib katta väiksema osa kehapinnast, kuid võimalikult suur osa pinnast tuleks katta võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga.
 
Testainet tuleks kokkupuuteperioodi jooksul hoida poorse marlisi ­
deme ja mitteärritava kleeplindi abil naha vastas. Manustamiskoht tuleks veel lisaks sobival moel kinni katta, et hoida marlisidet ja 
testainet paigal ja vältida testaine allaneelamist katselooma poolt. 
Et vältida testaine allaneelamist, võib kasutada looma liikuvust piira ­
vaid vahendeid, kuid looma täielikku fikseerimist ei soovitata. Kasu ­
tada võib ka kaitsekraed.
 
Kokkupuuteperioodi lõpus tuleks testaine jääk nahalt võimaluse 
korral veega või muu sobiva puhastusmeetodi abil eemaldada.  
Kõiki loomi tuleb iga päev jälgida ja registreerida kõik mürgistus ­
nähud ja nende ilmnemise aeg, raskusaste ja kestus. Vaadelda tuleks 
muutusi nii nahas ja karvkattes, silmades ja limaskestades kui ka hingamis- ja vereringeelundkonnas, autonoomses ja kesknärvisüs ­
teemis ning somatomotoorses aktiivsuses ja käitumises. Loomi tuleks 
iga nädal kaaluda. Soovitatav on iga nädal mõõta ka toidu tarbimist. 
Loomi tuleb regulaarselt vaadelda, et võimaluse piirides vältida loomade kadu sellistel põhjustel nagu kannibalism, kudede autolüüs või loomade kaotsiminek nende ümberpaigutamisel. Uuringuperioodi 
lõpus surmatakse ja lahatakse kõik ellujäänud loomad, v.a satellii ­
trühma loomad. Surevad ja tõsistes kannatustes või valudes loomad tuleks avastamisel kõrvaldada, humaanselt surmata ja lahata.
 
Kõigile loomadele, sh kontrollrühma loomadele, tehakse katsepe ­
rioodi lõpus järgmine uuring:  
1) hematoloogia, sealhulgas vähemalt hematokrit, hemoglobiini 
kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja suhtarv 
ja hüübimisvõime;  
2) kliiniline verebiokeemia, sh vähemalt üks maksa ja neerude 
funktsiooni parameeter: alaniini aminotransferaas (varem tuntud 
glutamaatpüruvaadi transaminaasina), seerumi aspartaadi amino ­
transferaas (varem tuntud glutamaatoksaloatsetaadi transaminaa ­
sina, kusiainelämmastik, albumiin, kreatiniin, üldbilirubiin ja 
seerumi üldvalk.  
Muud analüüsinäidud, mida võib pädeva toksikoloogilise hinnangu 
andmiseks vaja minna, on järgmised: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, veresuhkur (tühja kõhuga), lipiidianalüüs, 
hormoonid, happe/aluse tasakaal, methemoglobiin ja koluni esteraasi 
aktiivsus.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Vajaduse korral võib vaadeldava toime põhjalikumaks uurimiseks 
kasutada täiendavaid kliinilisi biokeemilisi näitajaid.  
1.6.4.  Üldlahang  
Kõik katseloomad tuleks üleni lahata. Vähemalt maks, neerud, neeru ­
pealised ja munandid tuleks kohe pärast lahti lõikamist kuivamise 
vältimiseks märjalt kaaluda. Elundid ja koed, st normaalne ja 
töödeldud nahk, maks, neerud, põrn, munandid, neerupealised, süda ja muud sihtelundid (see tähendab makropatoloogiliste kahjus ­
tustega või muutunud suurusega elundid) tuleks säilitada sobivas 
keskkonnas võimaliku hilisema histopatoloogilise uuringu jaoks.
 
1.6.5.  Histopatoloogiline uuring  
Kõrgeima annusega rühma ja kontrollrühma loomade säilitatud elun ­
deid ja kudesid tuleks histoloogiliselt uurida. Kõrgeima annusega 
rühmal testainega seostatavaid kahjustusi sisaldavaid elundeid ja 
kudesid tuleks kontrollida ka kõigil madalama annusega rühmadel. Võimaliku satelliitrühma loomi tuleks samuti histoloogiliselt uurida, 
pöörates eriti tähelepanu nendele elunditele ja kudedele, milles 
muudes katserühmades esines muutusi.
 
2. ANDMED  
Andmed tuleks esitada kokkuvõtlikus tabelis, mis iga katserühma 
puhul näitab katseloomade arvu selle katse algul ja igat tüüpi kahjus ­
tustega loomade arvu.  
Kõiki vaatlustulemusi tuleks hinnata sobiva statistilise meetodi abil. 
Kasutada võib kõiki tunnustatud statistilisi meetodeid.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— katseloomade kohta käivaid andmeid (liiki, liini, päritolu, kesk ­
konnatingimusi, toidusedelit jne);  
— katsetingimusi (sealhulgas sideme tüüpi: oklusiivside või tavaline 
side);  
— annuseid (kandja kasutamisel koos kandjaga) ja kontsentrat ­
sioone;  
— võimaluse korral toimeta annust;  
— mürgistusnähtude andmeid soo ja annuse järgi;  
— surmahetke katse ajal või seda, kas loomad jäid kuni surmami ­
seni ellu;  
— mürgistus- või muid nähte;  
— iga kõrvalekalde täheldamise aega ja kõrvalekalde hilisemat 
kulgu;  
— sööda ja kehakaalu andmeid;  
— kasutatud hematoloogilisi analüüse ja nende tulemusi;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— kasutatud kliinilise biokeemia analüüse ja nende tulemusi;  
— lahkamistulemusi;  
— kõigi histopatoloogiliste leidude üksikasjalikku kirjeldust;  
— võimaluse korral tulemuste statistilist käsitlust;  
— tulemuste analüüsi;  
— tulemuste tõlgendust.  
3.2. HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Vt B osa üldist sissejuhatust (D).  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust (E).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGEENSUS – IMETAJATE KROMOSOOMABERRAT ­
SIOONKATSE  IN VITRO  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 473,  In Vitro  Mamma­
lian Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. SISSEJUHATUS  
In vitro  kromosoomaberratsioonkatse eesmärgiks on kindlaks 
määrata ained, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberrat ­
sioone kultiveeritud imetajarakkudes (1, 2, 3). Struktuursed aberrat ­
sioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberrat ­
sioonid. Keemiliste mutageenide põhjustatud aberratsioonid on 
enamasti kromatiidaberratsioonid, aga esineb ka kromosoomaberrat ­
sioone. Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et kemikaal võib esile kutsuda numbrilisi aberratsioone. Käesolev meetod ei võimalda siiski mõõta numbrilisi aberratsioone ja seda ei kasutata 
sel eesmärgil korrapäraselt. Kromo-soommutatsioonid ja nendega 
seotud juhud on süüdi paljudes inimeste geneetilistes haigustes ja on olemas olulisi tõendeid, et kromosoommutatsioonid ja nendega 
seotud juhud, mis põhjustavad muutusi keharakkude onkogeenides ja 
kasvaja supressorgeenides, osalevad vähktõve tekkes inimestel ja katseloomadel.
 
In vitro  kromosoommutatsiooni katsetes võib kasutada loodud raku ­
liinide kultuure, rakutüvesid või primaarsete rakkude kultuure. Kasu ­
tatavad rakud valitakse rakkude kasvuvõime, karüotüüpide püsivuse, 
kromosoomiarvu, kromosoomide mitmekesisuse ja kromosoomaber ­
ratsioonide spontaanse sageduse põhjal.  
Läbiviidud  in vitro  katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset meta ­
boolset aktiveerimist. Kõnealune metaboolse aktiveerimise süsteem ei saa tervenisti jäljendada  in vivo  tingimusi imetajatel. 
Tuleb hoolt kanda selle eest, et välditakse positiivseid tulemusi 
põhjustavaid tingimusi, mis ei peegelda looduslikku mutageensust 
ja võivad tuleneda pH muutustest, osmolaalsusest või tsütotoksi ­
lisuse kõrgetest tasemetest (4, 5).
 
Kõnealust katset kasutatakse imetajate võimalike mutageenide ja 
kantserogeenide skriinimiseks. Mitmed ühendid, mis annavad kõne ­
aluses katses positiivseid tulemusi, on imetajate kantserogeenid; siiski ei ole kõnealuse katse ja kantserogeensuse vahel täielikku 
korrelatsiooni. Korrelatsioon sõltub ühendi keemilisest klassist ja 
üha enam uurimistulemusi viitab sellele, et on olemas kantsero ­
geenid, mida kõnealuse katse abil ei avastata, kuna need näivad mõjuvat muude mehhanismide kui otsese DNA kahjustuse kaudu.
 
Vt ka üldist sissejuhatust B osas.  
1.2. MÕISTED  
Kromatiidaberratsioon –  struktuurne kromosoomikahjustus, mis 
ilmneb üksikute kromatiidide katkemises või kromatiididevahelises katkemises ja taasühinemises.
 
Kromosoomaberratsioon –  struktuurne kromosoomikahjustus, mis 
ilmneb mõlema kromosoomi katkemises või mõlema kromatiidi 
samas kohas katkemises ja taasühinemises.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikatsioon –  protsess, milles pärast DNA replikatsiooni 
S-faasi tuum ei lähe mitoosi, vaid algab uus S-faas. Selle tulemusena 
tekivad kromosoomid, milles on 4, 8, 16, ... kromatiidi.  
Tühik –  akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi 
laius ja millel on kromatiidide orientatsiooni erinevus minimaalne.  
Mitootiline indeks –  metafaasis olevate rakkude arv jagatakse raku ­
populatsioonis vaadeldud rakkude koguarvuga; näitab rakkude proli ­
feratsiooni astet kõnealuses populatsioonis.  
Numbriline aberratsioon –  kasutatud rakkude tüüpilisest kromosoo ­
miarvust erinev kromosoomide arv.  
Polüploidsus –  haploidse kromosoomiarvu (n) kordsus, v.a diploidne 
kromosoomiarv (nt 3n, 4n jne).  
Struktuurne aberratsioon –  kromosoomistruktuuri muutus, mis on 
avastatav raku jagunemise metafaasi etapi mikroskoopilisel uurimisel 
ja mida täheldatakse deletsiooni ja fragmentidena, kromosoomisiseste 
või -väliste muutustena.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Rakukultuurid allutatakse uuritava aine toimele nii metaboolse akti ­
veerimise tingimustes kui ka ilma selleta. Pärast rakukultuuridele uuritava ainega toimimist töödeldakse neid kindlaksmääratud ajava ­
hemike järel metafaasi peatava ainega (nt Colcemid® või kolhitsiin), 
rakud kogutakse ja värvitakse ning metafaasis olevaid rakke analüü ­
sitakse mikroskoopiliselt kromosoomaberratsioonide suhtes.
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Ettevalmistused  
1.4.1.1.  Rakud  
Katses võib kasutada erinevaid rakuliine, rakutüvesid või primaarsete 
rakkude kultuure, sh inimrakke (nt hiina hamstri fibroplaste, inimeste 
või muude imetajate perifeerse vere lümfotsüüte).  
1.4.1.2.  Kasvukeskkonnad ja söötmed  
Rakukultuuride säilitamiseks tuleks kasutada vastavaid kasvukesk ­
kondi ja inkubeerimistingimusi (kasvunõud, CO  2 kontsentratsioon, 
temperatuur ja niiskus). Püsivaid rakuliine ja -tüvesid tuleb kontrol ­
lida regulaarselt modaalse kromosoomiarvu stabiilsuse ning müko ­
plasma saastumise puudumise suhtes; kui see on saastunud, siis ei tohiks seda kasutada. Rakkude normaalse rakutsükli kestus ja kasu ­
tatavad kasvutingimused peaksid teada olema.
 
1.4.1.3.  Rakukultuuride valmistamine  
Püsivad rakuliinid ja -tüved: rakud paljundatakse tüvikultuuridest, 
mis on külvatud kasvukeskkonda sellise tihedusega, et rakukultuurid 
ei saavuta konfluentsust enne kogumisaega, ja inkubeeritakse 37  o C 
juures.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Lümfotsüüdid: antikoagulandiga (nt hepariin) töödeldud täisveri või 
tervetelt isenditelt saadud eraldatud lümfotsüüdid lisatakse mitogeeni 
(nt fütohemaglutiniini) sisaldavale kasvukeskkonnale ja inkubeeri ­
takse 37  o C juures.  
1.4.1.4.  Metaboolne aktiveerimine  
Rakud allutatakse uuritava aine toimele nii vastava metaboolse akti ­
veerimissüsteemi olemasolu kui ka puudumise korral. Enim kasu ­
tatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainete, nt Aroclor 1254ga (6, 7, 8, 9) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (10, 11, 12) 
töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa 
(S9), millele on lisatud kofaktor.
 
Tavaliselt kasutatakse postmitokondriaalset fraktsiooni kontsentrat ­
sioonis 1–10 mahuprotsenti lõplikus katsekeskkonnas. Metaboolse 
aktiveerimissüsteemi tingimused võivad sõltuda uuritava keemilise aine klassist. Mõnel juhul on vaja kasutada postmitokondriaalse 
fraktsiooni rohkem kui üht kontsentratsiooni.
 
Rida meetodeid, sh geneetiliselt muudetud rakuliini loomine, mis 
ekspresseerivad teatavaid aktiveerimisensüüme, võivad omada endo ­
geense aktiveerimise võimet. Kasutatavate rakuliinide valik peab olema teaduslikult põhjendatud (nt tsütokroom P450 isoensüümi 
tähtsus uuritava aine metabolismi puhul).
 
1.4.1.5.  Uuritav aine/preparaat  
Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates 
lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne rakkude töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult katsesüsteemidesse ja/või lahjendada enne töötlemist. Tuleks kasu ­
tada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed 
püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
 
1.4.2.  Katsetingimused  
1.4.2.1.  Lahusti/kandjaaine  
Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida 
ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega. 
Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab nende kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. 
Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kand ­
jaaine kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad orgaanilised lahustid peavad olema veevabad. Vett saab eemaldada molekulaarsõelte lisamisega.
 
1.4.2.2.  Toimimiseks kasutatavad kontsentratsioonid  
Suurima kontsentratsiooni määramisel on arvestatavad kriteeriumid 
tsütotoksilisus, lahustuvus katsesüsteemis ning pH või osmolaalsuse 
muutused.  
Tsütotoksilisus määratakse põhikatses kindlaks nii metaboolse akti ­
veerimisega kui ka ilma selleta, kasutades sobivaid rakkude puhtuse ja kasvu indikaatoreid, nt konfluentsuse astet, eluvõimeliste rakkude 
arvu või mitootilist indeksit. Tsütotoksilisust ja lahustuvust võib olla 
kasulik määrata eelkatses.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Tuleks kasutada vähemalt kolme analüüsitavat kontsentratsiooni. Kui 
esineb tsütotoksilisust, peaksid need kontsentratsioonid katma vahe ­
miku suurimast kontsentratsioonist vähimani või sellise kontsentrat ­
sioonini, mille korral mürgisus puudub; mis tavaliselt tähendab seda, et kontsentratsioonide erinevus üksteisest võib olla mitte rohkem kui 
vahemikus 2 kuni √10 asuv koefitsient. Rakkude kogumise ajal 
peaks suurima kontsentratsiooni korral ilmnema märkimisväärne konfluentsuse astme, rakkude arvu või mitootilise indeksi (kõigi osas rohkem kui 50 %) vähenemine. Mitootiline indeks on üksnes 
tsütotoksiliste/tsütostaatiliste mõjude kaudne mõõt ja sõltub töötlemi ­
sele järgnevast ajast. Mitootilist indeksit tunnustatakse siiski suspen ­
sioonkultuuride puhul, milles muude toksilisust mõõtvate vahendite kasutamine võib olla tülikas ja ebapraktiline. Teavet rakutsükli kinee ­
tika kohta, nagu näiteks keskmist generatsiooniaega (AGT), tuleks 
kasutada lisateabena. AGT on siiski üldine keskmine, mis alati ei too esile hilistunud alampopulatsioonide olemasolu, ning isegi keskmise generatsiooniaja kerge pikenemine võib lükata aberratsioonide opti ­
maalse tõestamisaja palju hilisemaks.
 
Suhteliselt mittetoksiliste ainete puhul peaks suurim testkontsentrat ­
sioon olema 5 μl/ml, 5 mg/ml või 0,01 M, sõltuvalt sellest, milline 
neist on väikseim.  
Suhteliselt lahustumatute ainete puhul, mis ei ole lahustumispiirile 
vastavast kontsentratsioonist madalamatel kontsentratsioonidel toksi ­
lised, peaks suurim kasutatud annus olema lahustumispiiri ületav kontsentratsioon viimases kasvukeskkonnas manustamisperioodi 
lõpus. Mõnedel juhtudel (nt siis, kui toksilisus esineb üksnes mada ­
laimast lahustumatuskontsentratsioonist kõrgematel kontsentratsioo ­
nidel), on soovitav katseid teha rohkem kui ühe kontsentratsiooniga, millel on nähtav sadestus. On kasulik hinnata lahustuvust töötlemise 
alguses ja lõpus, kuna lahustuvus katsesüsteemis muutub töötlemise 
ajal rakkude, S9-seerumi jms mõjul. Lahustumatust saab avastada palja silmaga. Sadestus ei tohiks mõjutada tulemust.
 
1.4.2.3.  Negatiivsed ja positiivsed kontrollkatsed  
Igas uuringus kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid 
(lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid koos metaboolse aktiveerimi ­
sega või ilma selleta. Kui kasutatakse metaboolset aktiveerimist, käsitatakse positiivse kontrollainena sellist kemikaali, mis eeldab 
aktiveerimist mutageense reaktsiooni saamiseks.
 
Positiivsed kontrollkatsed peaksid kasutama tuntud elastogeeni toimi ­
mistasemetel, mis ootuspäraselt peaks reprodutseeritavust ja avasta ­
tavust suurendama fooniga võrreldes, mis näitab katsesüsteemi tund ­
likkust.  
Kontsentratsioonid positiivsetes kontrollkatsetes valitakse sellised, et 
mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objek ­
tiklaaside identsus. Positiivsete kontrollainete näited:  
Metaboolse aktiveerimise tingimus Aine CASi nr EINECSi nr  
Eksogeense metaboolse aktivee ­
rimise puudumine Metüülmetaansulfonaat 66-27-3 200-625-0 
Etüülmetaansulfonaat 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Metaboolse aktiveerimise tingimus Aine CASi nr EINECSi nr  
N-etüül-N-nitrosokarbamiid 759-73-9 212-072-2 
Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 
4-nitrokinoliin-N-oksiid 56-57-5 200-281-1 
Eksogeense metaboolse aktivee ­
rimise olemasolu Benso(α)püreen 50-32-8 200-028-5 
Tsüklofosfamiid 
Tsüklofosfamiidmonohüdraat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Võidakse kasutada muid sobivaid positiivseid kontrollaineid. 
Samasse keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemi ­
kaalide kasutamist tuleks kaaluda, kui sellised ained on kättesaa ­
davad.  
Igal kogumisperioodil võetakse ka negatiivsetest kontrollkatsetest 
proovid, mis koosnevad üksnes kasvukeskkonnas olevast lahustist 
või kandjaainest ning mida on töödeldud samal viisil kui kasvukul ­
tuure. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad kontrollandmed näitavad, et valitud lahustil ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
 
1.4.3.  Menetlus  
1.4.3.1.  Töötlemine uuritava ainega  
Paljunevaid rakke töödeldakse uuritava ainega nii metaboolse akti ­
veerimise süsteemis kui ka ilma selleta. Lümfotsüütide töötlemist 
alustatakse ligikaudu 48 tundi pärast mitogeenset stimulatsiooni.  
1.4.3.2. Tavaliselt tuleks kasutada iga kontsentratsiooni korral paralleelseid 
kultuure ja see on rangelt soovitatav negatiivsete/lahusti kontrollkul ­
tuuride puhul. Kui varasemad andmed näitavad, et paralleelkultuu ­
ride vahel on väike erinevus (13, 14), siis võib olla vastuvõetav iga kontsentratsiooni korral ühe kultuuri kasutamine.
 
Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks 
suletud kasvuanumates (15, 16).  
1.4.3.3.  Kultuuride kogumise aeg  
Esimeses katses alluvad rakud uuritava aine toimele nii metaboolse 
aktiveerimise teel kui ka ilma selleta 3–6 tunni jooksul ning proovid 
võetakse pärast töötlemise algust (12) ajal, mis vastab ligikaudu 1,5 
normaalse rakutsükli kestusele. Kui kõnealusel meetodil saadakse negatiivsed tulemused nii aktiveerimisega kui ka ilma selleta, tehakse uus katse ilma aktiveerimiseta ja töötlemist jätkatakse kuni proovi ­
võtmise hetkeni, mis vastab ligikaudu 1,5 normaalse rakutsükli 
kestusele. Teatud keemilisi aineid saab hõlpsamini avastada, kui töötlemis-/proovivõtuaeg on pikem kui 1,5 rakutsüklit. Metaboolse aktiveerimise korral saadud negatiivseid tulemusi tuleb kooskõlastada 
igal üksikjuhul eraldi. Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste koos ­
kõlastamist ei peeta vajalikuks, esitatakse põhjendus.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Kromosoomipreparaatide valmistamine  
Rakukultuure töödeldakse ainega Colcemid® või kolhitsiiniga tava ­
liselt 1–3 tundi enne kogumist. Iga rakukultuuri kogutakse ja töödel ­
dakse eraldi kromosoomipreparaatide jaoks. Kromosoomipreparaa ­
tide valmistamise alla kuulub rakkude hüpotooniline töötlemine, 
fikseerimine ja värvimine.  
1.4.3.5.  Analüüs  
Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete 
omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Kui 
fikseerimismenetlused viivad tihti metafaasis olevate rakkude suhte rikkumiseni ja kromosoomide kaotamiseni, peaksid seega loetud rakud sisaldama tsentromeere koguses, mis vastab modaalarvule ± 
2 kõikide rakutüüpide korral. Iga kontsentratsiooni ja kontrollkatse 
puhul tuleb lugeda vähemalt 200 hästi levinud metafaasi, mis on võrdselt jaotunud paralleelkultuuride vahel, kui neid kasutatakse. Seda arvu saab vähendada, kui täheldatakse palju aberratsioone.
 
Kuigi katse eesmärk on avastada struktuursed kromosoomaberrat ­
sioonid, on tähtis registreerida ka polüploidsus ja endoreduplikat ­
sioon, kui need esinevad.  
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Katseühikuks on rakk, mistõttu hinnatakse nende rakkude protsendi ­
määra, milles on struktuurne kromosoomaberratsioon või struk ­
tuursed kromosoomaberratsioonid. Eri tüüpi struktuursed kromosoo ­
maberratsioonid loetletakse koos nende arvukuse ja esinemissagedus ­
tega katse- ja kontrollkultuurides. Tühikud registreeritakse eraldi ja 
nende kohta antakse teavet, aga üldiselt ei arvestata neid aberratsioo ­
nide üldsageduse hulka.  
Samuti registreeritakse kõikides töödeldud ja negatiivsetes kontroll ­
kultuurides tehtud samaaegsed tsütotoksilisuse mõõtmised peamistes aberratsioonikatsetes.
 
Tulemused esitatakse iga üksiku kultuuri kohta. Lisaks esitatakse 
kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul.  
Selget positiivset vastust ei ole vaja verifitseerida. Ebaselgeid tule ­
musi tuleks selgitada täiendaval uurimisel muudetud katsetingi ­
mustes. Vajadust negatiivsete tulemuste kinnitamise järele on arutatud punktis 1.4.3.3. Katse parameetrite muutmist hinnatud tingi ­
muste vahemiku laiendamiseks tuleb arvesse võtta järelkatsetel. 
Katse parameetrite, mida võidakse muuta, hulka kuuluvad kontsen ­
tratsioonivahemik ja metaboolse aktiveerimise tingimused.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
On mitmeid kriteeriume positiivse tulemuse määramiseks, nagu nt 
kontsentratsioonist sõltuv kromosoomaberratsioone sisaldavate 
rakkude arvu suurenemine või selle reprodutseeruv kasv. Tule ­
muste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hinda ­
misel (3, 13). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur 
positiivse vastuse jaoks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Polüploidsete rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et 
katseainel on võime inhibeerida mitoosiprotsessi ja põhjustada 
numbrilisi kromosoomaberratsioone. Endoreduplitseeritud kromo ­
soome sisaldavate rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav aine võib takistada rakutsükli progressi (17, 18).
 
Uuritavat ainet, mille tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumi ­
dele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas süsteemis.  
Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tule ­
mused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud korduskatsete arvust hoolimata.
 
In vitro  kromosoomaberratsiooni katse positiivsed tulemused viitavad 
sellele, et uuritav aine põhjustab struktuurseid kromosoomaberrat ­
sioone imetajate kultiveeritud keharakkudes. Negatiivsed tulemused 
viitavad sellele, et katsetingimuste põhjal ei põhjusta uuritav aine 
kromsoomaberratsioone imetajate kultiveeritud keharakkudes.  
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Lahusti/kandjaaine:  
— kandjaaine valiku põhjendamine;  
— uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on 
teada.  
Rakud:  
— rakkude tüüp ja allikas;  
— karüotüübi omadused ja kasutatava rakutüübi sobivus;  
— mükoplasma puudumine, vajaduse korral;  
— teave rakutsükli pikkuse kohta;  
— veredoonorite sugu, täisveri või eraldatud lümfotsüüdid, kasu ­
tatav mitogeen;  
— passaažide arv, vajaduse korral;  
— rakukultuuri säilitamise meetodid, vajaduse korral;  
— kromosoomide modaalarv  
Katsetingimused:  
— metafaasi peatav aine, selle kontsentratsioon ja rakule toimimise 
kestus;  
— kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, 
sh nt tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud, kui need 
on olemas;  
— kasvukeskkonna koostis, CO  2 kontsentratsioon, vajaduse korral;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— uuritava aine kontsentratsioon;  
— lisatud kandjaaine ja uuritava aine maht;  
— inkubatsioonitemperatuur;  
— inkubatsiooniaeg;  
— töötlemise kestus;  
— rakutihedus külvamisel, vajaduse korral;  
— metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle vastu ­
võetavuse kriteeriumid;  
— positiivsed ja negatiivsed kontrollkatsed;  
— objektiklaaside valmistamise meetodid;  
— aberratsioonide loendamise kriteeriumid;  
— analüüsitud metafaaside arv;  
— toksilisuse mõõtmise meetodid;  
— kriteeriumid, mille alusel uuringuid liigitatakse positiivseteks, 
negatiivseteks või ebaselgeteks.  
Tulemused:  
— toksilisuse tunnused, nt konfluentsuse aste, rakutsüklit käsitlev 
teave, rakkude loendused, mitootiline indeks;  
— sadestumise tunnused;  
— teave kasvukeskkonna pH ja osmolaalsuse kohta, kui see on 
määratud;  
— aberratsioonide, sh tühikute määratlemine;  
— kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arv ja kromosoo ­
maberratsioonide tüüp, mis on toodud eraldi iga katse- ja kont ­
rollkultuuri kohta;  
— ploidsuse muutused, kui neid esineb;  
— doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;  
— võimalikud statistilised analüüsid;  
— paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kont ­
rollide tulemused;  
— varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kont ­
rollkatsete andmed, sh vahemik, keskväärtused ja standardhälbed.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and 
Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum 
Press, New York and London, pp. 1–29.  
2) Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The  In Vitro  Chromo­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427–432.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Naka-mura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary 
cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 
10 (suppl.10), pp. 1–175.
 
4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257,pp. 147–204.
 
5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells, Mutation Res., 268, pp. 297–305.  
6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347–364.
 
7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (19 8 3), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215.
 
8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. 
and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/ 
Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In 
Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chro ­
matid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dime-thyl ­
nitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver 
Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83–90.  
9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In Vitro , Mutation Res., 66, pp. 277–290.  
10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Geno­
toxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175–177.
 
11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A. Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds),  In Vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North- 
Holland, pp. 85–88.
 
12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., 
Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofu-mi, T. (1994), 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241–261.  
13) Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University 
Press, Cambridge, pp. 141–154.
 
14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139–149.  
15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), 
Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 
91–103.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells 
Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Muta ­
gens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795–801.
 
17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403–413.
 
18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer 
Res., 43, pp. 1362–1364.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGEENSUS – KROMOSOOMABERRATSIOONKATSE 
IMETAJATE LUUÜDIS  IN VIVO  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 475, Mammalian Bone 
Marrow Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Imetajate in  vivo  kromosoomaberratsioonkatset kasutatakse uuritava 
aine põhjustatud strukturaalsete kromosoomaberratsioonide avastami ­
seks imetajate, tavaliselt näriliste luuüdirakkudes (1, 2, 3, 4). Struk ­
turaalsed kromosoomaberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromo ­
soom- või kromatiidaberratsioonid. Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et kemikaal võib esile kutsuda numbrilisi aberrat ­
sioone. Keemiliste mutageenide põhjustatud aberratsioonid on 
enamasti kromatiidaberratsioonid, aga esineb ka kromosoomaberrat ­
sioone. Kromosoommutatsioonid ja nendega seotud juhud põhjus ­
tavad paljusid inimeste geneetilisi haigusi ja on olemas olulisi tõen ­
deid selle kohta, et kromosoommutatsioonid ja nendega seotud 
juhud, mis põhjustavad muutusi keharakkude onkogeenides ja 
kasvaja supressorgeenides, osalevad vähktõve tekkes inimestel ja katseloomadel.
 
Kõnealuses katses kasutatakse tavaliselt närilisi. Kõnealuses katses 
on sihtkoeks luuüdi, kuna selle verevarustus on väga rikkalik ja see 
sisaldab rakupopulatsiooni, mille rakutsükkel on kiire ning mida on 
kerge isoleerida ja töödelda. Käesoleva meetodi puhul ei kasutata muid liike ega sihtkudesid.
 
Käesolev kromosoomaberratsioonkatse on eriti oluline mutageensuse 
ohu hindamisel, kuna see võimaldab arvesse võtta  in vivo  metabo­
lismi, farmakokineetika ja DNA parandamisprotsesside tegureid, 
kuigi need võivad erineda liigiti ja kudede vahel.  In vivo  katset 
võidakse samuti kasutada  in vitro  katses avastatud mutageense 
mõju täiendaval uurimisel.  
Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine või reageerimisvõimeline 
metaboliit ei pääse sihtkoesse, ei ole sobiv kasutada käesolevat 
katset.  
Vt ka üldist sissejuhatust B osas.  
1.2. MÕISTED  
Kromatiidaberratsioon –  strukturaalne kromosoomikahjustus, mis 
ilmneb üksikute kromatiidide katkemises või kromatiididevahelises katkemises ja taasühinemises.
 
Kromosoomaberratsioon –  strukturaalne kromosoomikahjustus, mis 
ilmneb mõlema kromosoomi katkemises või mõlema kromatiidi katkemises ja taasühinemises samas kohas.
 
Endoreduplikatsioon –  protsess, milles pärast DNA replikatsiooni 
S-perioodi tuum ei lähe mitoosi, vaid algab uus S-periood. Selle 
tulemusena tekivad kromosoomid, milles on 4, 8, 16, ... kromatiidi.  
Tühik –  akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi 
laius ja millel on kromatiidide orientatsiooni erinevus minimaalne.  
Numbriline aberratsioon –  kasutatud rakkude tüüpilisest normaal ­
sest kromosoomiarvust erinev kromosoomide arv.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Polüploidsus –  haploidse kromosoomiarvu (n) kordsus, v.a diploidne 
arv (nt 3n, 4n jne).  
Struktuurne aberratsioon –  kromosoomistruktuuri muutus, mida 
saab avastada raku jagunemise metafaasi etapi mikroskoopilisel uuri ­
misel ja mida täheldatakse deletsiooni ja fragmentidena, kromosoo ­
misiseste või -väliste muutustena.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Loomad allutatakse uuritava aine toimele, kasutades sobivat toimi ­
misviisi, ja tapetakse sobiva aja möödudes töötlemisest. Enne tapmist 
töödeldakse loomi metafaasi peatava ainega (nt kolhitsiiniga või ainega Colcemid®). Seejärel tehakse luuüdirakkudest kromosoomi ­
preparaadid ja need värvitakse ning metafaasi rakkude kromosooma ­
berratsioone analüüsitakse.
 
1.4. MEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Ettevalmistused  
1.4.1.1.  Loomaliikide valik  
Tavaliselt kasutatakse rotte, hiiri ja hiina hamstreid, kuigi võib kasu ­
tada mis tahes sobivaid imetajate liike. Rakendatakse noorte tervete loomade tavaliselt kasutatavaid laboritüvesid. Uuringut alustades 
peaks loomade massi muutus olema minimaalne ja ei tohiks ületada 
± 20 % iga soo keskmisest massist.
 
1.4.1.2.  Pidamis- ja söötmistingimused  
Üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi kohaldatakse, kuigi 
otstarbekas niiskusesisaldus peaks olema 50–60 %.  
1.4.1.3.  Loomade ettevalmistamine  
Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel 
kontroll- ja katserühma. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse individuaalselt. Loomi harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie 
päeva jooksul.
 
1.4.1.4.  Annuste ettevalmistamine  
Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates 
lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne 
loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahe ­
tult või lahjendada enne doseerimist. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta 
näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
 
1.4.2.  Katsetingimused  
1.4.2.1.  Lahusti/kandjaaine  
Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatava annuse 
korral ega reageerida keemiliselt siooni uuritava ainega. Kui kasuta ­
takse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab selle kasuta ­
mine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovitatav 
on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasu ­
tamist.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Kontrollkatsed  
Käesolevasse katsesse kaasatakse mõlema sugupoole korral paral ­
leelsed positiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollkatsed. Kontrollrühma loomi käsitletakse nii nagu katserühma loomi, kuid 
neid ei töödelda uuritava ainega.
 
Positiivsed kontrollkatsed ei tohiks põhjustada struktuurseid aberrat ­
sioone  in vivo  kokkupuutetasemel, mis peaksid põhjustama avasta ­
tavat suurenemist fooniga võrreldes. Positiivsete kontrollainete 
annused valitakse sellised, et mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objektiklaaside identsus. On aktsepteeritav, et positiivses kontrollkatses võib kasutada uuritava aine manustamis ­
viisist erinevat viisi ja proovid võetakse üksnes korra. Samasse 
keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist võib kaaluda, kui selline aine on kättesaadav. Positiivsete kontrollainete näited:
 
Aine CASi nr EINECSi nr  
Etüül-metaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 
N-etüül-N-nitroso-karbamiid 759-73-9 212-072-2 
Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 Tsüklofosfamiid 
Tsiklofosfamiidmonohüdraat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietüleen-melamiin 51-18-3 200-083-5
 
Üksnes lahusti või kandjaainega töödeldud või muul katserühmaga 
samalaadsel viisil töödeldud negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse 
proovid igal proovivõtukorral, välja arvatud siis, kui varasemad kont ­
rollitulemused näitavad vastuvõetavat loomadevahelist varieerumist ja kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude esinemissagedust. Kui negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse üksnes üks proov, on 
kõige sobivam võtta see esimesel proovivõtukorral. Lisaks sellele 
kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad või avaldatud kontrollandmed näitavad, et valitud lahusti/kandjaaine ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid 
mõjusid.
 
1.5. MENETLUS  
1.5.1.  Loomade arv ja sugu  
Nii katse- kui kontrollrühmas on mõlemast soost vähemalt viis 
analüüsitavat looma. Kui uuringu ajal on kättesaadavad tulemused sama liigi sama vastuvõtlikkuse liini kasutades tehtud uuringute kohta, mille tulemused näitavad, et toksilisuses ei ole sugupoolte 
vahel olulisi erinevusi, siis piisab vaid ühe sugupoolega katsete tege ­
misest. Kui inimese vastuvõtlikkus kemikaalidele on soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse sobivast soost loomadega.
 
1.5.2.  Katse kava  
Uuritavad ained tuleb eelistatavalt manustada ühekordsete annustena. 
Uuritavaid aineid võib manustada ka jagatud annustena, näiteks kaks annust ühel päeval kuni mõnetunnise vahega, et hõlbustada suurte 
ainekoguste manustamist. Muud manustamisrežiimid peaksid olema 
teaduslikult tõestatud.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Proovid võetakse kahel korral samal päeval pärast manustamist. 
Näriliste puhul esimene proovivõtuaeg on 1,5 normaalset rakutsüklit 
(rakutsükkel kestab tavaliselt 12–18 tundi) pärast manustamist. Kuna aeg uuritava aine sissevõtmise ja metabolismi vahel ja selle mõju rakutsükli kineetikale saavad mõjutada kromosoomaberratsiooni 
avastamise optimaalset aega, on soovitav 24 tundi pärast esimese 
proovi võtmist koguda hilisem proov. Kui uuritavat ainet antakse kauem kui üks päev, tuleks võtta üks proov pärast viimast manusta ­
mist ajal, mis vastab 1,5 normaalse rakutsükli kestusele.
 
Enne tapmist süstitakse loomade kõhukelmesse sobiv annus meta ­
faasi peatavat ainet (nt ainet Colcemid® või kolhitsiini). Loomadelt 
võetakse seejärel proovid sobiva intervalli järel. Hiirte puhul on see intervall ligikaudu 3–5 tundi; hiina hamstrite korral ligikaudu 4–5 
tundi. Rakud kogutakse luuüdist ja neid analüüsitakse kromosooma ­
berratsioonide tuvastamiseks.
 
1.5.3.  Annused  
Kui sobivate andmete puudumisel tehakse annuse vahemiku määra ­
miseks uuring, siis tehakse uuring samas laboris, kasutades samu 
liike, tüvesid, sugu ja manustamiskava kui põhiuuringus (5). Kui 
esineb mürgisus, kasutatakse esimeses proovivõtus kolme erinevat annust. Need annused peaksid hõlmama vahemikku suurimast kuni väiksema mürgisuseni või mürgisuse puudumiseni. Hilisemal proo ­
vivõtuajal on vaja kasutada üksnes suurimat annust. Suurim annus on 
määratletud annusena, mis põhjustab selliseid mürgistusnähte, et samale manustamisrežiimile põhinevate suuremate annusetasemete kasutamine võib põhjustada surma. Ained, millel on spetsiifilised 
bioloogilised mõjud väikeste mittetoksiliste annustena (nt hormoonid 
ja mitogeenid), võivad olla erandiks annuse määramise kriteeriumi ­
dele ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Suurimat 
annust võidakse samuti määratleda annusena, mis põhjustab mõnin ­
gaid mürgisusele viitavaid muutusi luuüdis (nt mitootiline indeks väheneb üle 50 %).
 
1.5.4.  Piirkatse  
Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2 000 mg/kg keha ­
massi kohta ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe 
annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt lähedaste ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku 
uuringut vajalikuks. Kauem kestvate uuringute korral on piirannus 
2 000 mg/kg kehamassi kohta päevas kuni 14 päeva kestval manus ­
tamisel ja 1 000 mg/kg kehamassi kohta päevas, kui manustamine 
kestab kauem kui 14 päeva. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus 
võib viidata piirkatses kasutatavatest annustest suuremate annuste kasutamise vajadusele.
 
1.5.5.  Manustamine  
Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva 
intubeerimiskanüüli abil või süstides kõhuõõnde. Samuti võib muid 
manustamisviise aktsepteerida, kui need on põhjendatud. Vedeliku suurim maht, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 2 ml/ ­
100 g kehamassi kohta. Suuremate mahtude kasutamine peab olema 
põhjendatud. Kui välja arvata ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katses kasutatavate mahtude varieeruvust, regulee ­
rides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks 
samaks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Kromosoomipreparaat  
Vahetult pärast tapmist kogutakse luuüdi, seda töödeldakse hüpotoo ­
nilise lahusega ja fikseeritakse. Seejärel kantakse rakud objektiklaa ­
sidele ja värvitakse.  
1.5.7.  Analüüs  
Mitootiline indeks tuleks määrata tsütotoksilisuse määrana vähemalt 
1 000 rakust looma kohta kõikides katseloomades (sh positiivsed 
kontrollid) ja töötlemata negatiivsetes kontroll-loomades.  
Vähemalt 100 rakku tuleks iga looma puhul analüüsida. Seda arvu 
saab vähendada, kui täheldatakse palju aberratsioone. Kõik objekti ­
klaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete omad, kodeeri ­
takse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Kui objektiklaasi valmistamise menetlused viivad tihti metafaasis olevate rakkude suhte rikkumiseni ja kromosoomide kaotamiseni, peaksid seega loen ­
datud rakud sisaldama tsentromeere koguses, mis vastab modaalar ­
vule 2n ± 2.
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabeli kujul. Katseühi ­
kuks on loom. Iga looma puhul tuleks hinnata loendatud rakkude arvu, aberratsioonide arvu raku kohta ja struktuurse(te) kromosooma ­
berratsiooni(de)ga rakkude protsendimäära. Eri tüüpi struktuursed 
kromosoomaberratsioonid tuleks loetleda koos nende arvukuse ja esinemissagedustega katse- ja kontrollkultuurides. Tühikud ( gaps ) 
registreeritakse eraldi ja nende kohta antakse teavet, aga üldiselt ei 
võeta neid aberratsioonide üldsageduse hulka. Kui pole tõestust 
toime erinevuse kohta sugude vahel, võidakse kombineerida mõlema sugupoole andmed statistiliseks analüüsiks.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Positiivse tulemuse saamiseks on mitmeid kriteeriume, nt kromosoo ­
maberratsioone sisaldavate rakkude suhtelise arvu suurenemine annu ­
sest tingituna või kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arvu 
selge suurenemine ühes annuse rühmas ühel proovivõtuajal. Tule ­
muste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hinda ­
misel (6). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur posi ­
tiivse vastuse jaoks. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval 
uurimisel muudetud katsetingimustes.
 
Polüploidsuse suurenemine võib viidata sellele, et uuritav aine võib 
esile kutsuda numbrilisi aberratsioone. Endoreduplikatsiooni suure ­
nemine võib viidata sellele, et uuritaval ainel on võime inhibeerida rakutsükli kulgemist (7, 8).
 
Uuritavat ainet, mille korral saadud tulemused ei vasta eespool 
toodud kriteeriumidele, peetakse käesolevas katses mittemutageen ­
seks aineks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Kuigi enamikus katsetes saadakse selged positiivsed või negatiivsed 
tulemused, välistavad harvadel juhtudel saadud tulemused uuritava 
aine aktiivsuse kohta kindlate otsuste tegemise. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete arvust sõltumata.
 
In vivo  kromosoomaberratsioonkatsel saadud positiivsed tulemused 
viitavad sellele, et aine põhjustab kromosoomaberratsioone testitud 
liikide luuüdis. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et antud 
katsetingimustes ei põhjusta aine kromosoomaberratsioone testitud liikide luuüdis.
 
Tõenäosust, et uuritav aine või selle metaboliidid jõuavad üldisesse 
vereringesse või eriti sihtkoesse (nt süsteemne toksilisus), tuleks arutada.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Kandjaaine:  
— kandjaaine valiku põhjendamine;  
— uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui see 
on teada.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/tüved;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, toitumine jne;  
— loomade individuaalne mass katse alustamisel, sh kehamassi 
vahemik, keskväärtused ja standardhälve iga rühma kohta.  
Katsetingimused:  
— positiivsed ja negatiivsed (kandjaaine/lahusti) kontrollkatsed;  
— annuse vahemiku määramise uuringu andmed, kui see on tehtud;  
— manustamise tasemete valimise põhimõtted;  
— uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;  
— uuritava aine manustamise üksikasjad;  
— manustamistee põhjendus;  
— meetodid, mis verifitseerivad, et uuritav aine jõuab üldisesse 
vereringesse või sihtkoesse, vajaduse korral;  
— toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni 
(ppm) teisendamine tegelikuks annuseks (mg/kg kehamassi kohta päevas), vajaduse korral;
 
— üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;  
— manustamis- ja proovivõtukavade üksikasjalik kirjeldus;  
— toksilisuse mõõtmise meetodid;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— metafaasi peatav aine, selle kontsentratsioon ja töötlemise kestus;  
— objektiklaaside ettevalmistamise meetodid;  
— aberratsioonide loendamise kriteeriumid;  
— analüüsitud rakkude arv looma kohta;  
— kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, 
negatiivseteks või ebaselgeteks.  
Tulemused:  
— toksilisuse tunnused;  
— mitootiline indeks;  
— aberratsioonide tüüp ja arv, antud iga looma kohta eraldi;  
— aberratsioonide üldarv rühma kohta ning keskväärtused ja stan ­
dardhälbed;  
— aberratsioone sisaldavate rakkude arv rühma kohta ning 
keskväärtused ja standardhälbed;  
— ploidsuse muutused, kui neid esineb;  
— doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;  
— võimalikud statistilised analüüsid;  
— paralleelsed negatiivsed kontrollandmed;  
— varasemad negatiivsed kontrollandmed ning vahemikud, 
keskväärtused ja standardhälbed;  
— paralleelsed positiivsed kontrollandmed.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in:  Mutage­
nicity Testing: a Practical Approach,  S. Venitt and J. M. Parry 
(eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C, pp. 275–306.  
2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. 
F. and Shelby, M. (19 8 7), Mammalian In Vivo Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157–165.
 
3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., 
Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic 
Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, 
UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141.
 
4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., 
Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., 
F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305–312.
 
5) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7, pp. 313–319.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytoge ­
netic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, pp. 184–232.
 
7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 
119, pp. 403–413.  
8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362–1364.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGEENSUS – PISITUUMA KATSE IMETAJATE 
ERÜTROTSÜÜTIDES  IN VIVO  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 474, Mammalian 
Erythrocyte Micronucleus Test (1997).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Imetajate pisituuma katset  in vivo  kasutatakse uuritava aine põhjus ­
tatud kromosoomikahjustuse või mitoosiaparaadi kahjustuse avasta ­
miseks erütroblastides, analüüsides loomade, tavaliselt näriliste luuü ­
dist ja/või perifeersetest vererakkudest võetud erütrotsüüte.  
Pisituuma katse eesmärk on identifitseerida ained, mis põhjustavad 
tsütogeenset kahjustust, mille tulemuseks on kromosoomiloive frag ­
mente või terveid kromosoome sisaldava pisituuma moodustamine.  
Kui luuüdi erütroblast areneb polükromaatseks erütrotsüüdiks, siis 
põhituum lükatakse välja; mis tahes moodustatud pisituum võib jääda muul viisil tuumata tsütoplasmasse. Põhituuma puudumine hõlbustab pisituumade avastamist neis rakkudes. Pisituumsete polü ­
kromaatsete erütrotsüütide sageduse suurenemine katseloomade 
puhul on indutseeritud kromosoomikahjustuse indikaatoriks.
 
Tavaliselt kasutatakse näriliste luuüdi käesolevas katses kuni polü ­
kromaatsete erütrotsüütide moodustumiseni kõnealuses koes. 
Ebaküpsete mikrotuumsete (polükromaatsete) erütrotsüütide mõõt ­
mine perifeerses veres on võrdselt vastuvõetav mis tahes liigi puhul, mille põrn ei suuda hävitada pisituumseid erütrotsüüte või mis on piisavalt tundlikud selleks, et avastada struktuurseid või 
numbrilisi kromosoomaberratsioone põhjustavaid aineid. Pisituuma 
saab eristada erinevate kriteeriumide alusel. Nende hulka kuulub kinetohoori või tsentromeerse DNA olemasolu või puudumise tõen ­
damine pisituumas. Ebaküpsete (polükromaatsete) pisituumsete 
erütrotsüütide esinemissagedus on peamine lõpp-punkt. Küpsete 
(normokromaatsete) erütrotsüütide arvu perifeerses veres, mis sisaldab pisituuma küpsete erütrotsüütide hulgas, saab samuti kasu ­
tada katse lõpp-punktina, kui loomadele manustatakse uuritavat ainet 
nelja või enama nädala jooksul.
 
Käesolev imetajate  in vivo  pisituuma katse on eriti vajalik mutageen ­
suse ohu hindamiseks, kuna selles võidakse arvesse võtta in  vivo  
metabolismi, farmakokineetika ja DNA parandusprotsesside tegureid, 
kuigi need võivad liigiti, kudede vahel ja geneetiliste lõpp-punktide 
osas erineda.  In vivo  katset võidakse samuti kasutada  in vitro  katses 
avastatud mutageense mõju täiendaval uurimisel.  
Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine või reaktsioonivõimeline 
metaboliit ei pääse sihtkoesse, ei ole sobiv kasutada käesolevat 
katset.  
Vt ka üldist sissejuhatust B osas.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. MÕISTED  
Tsentromeer (kinetohoor) –  kromosoomi ala(d), kus kääviniidid 
kinnituvad raku jagunemise ajal, võimaldades tütarkromosoomide korrapärast liikumist tütarrakkude poolustele.
 
Pisituum –  väike tuum, mis on rakkude põhituumast eraldi ja sellega 
paralleelselt esinev, see on moodustunud mitoosi telofaasi (meioosi) ajal kromosoomiloive fragmentidest või tervetest kromosoomidest.
 
Normokromaatne erütrotsüüt –  küps erütrotsüüt, millel puuduvad 
ribosoomid ja mida saab eristada mitteküpsetest, polükromaatsetest 
erütrotsüütidest ribosoomide jaoks valikuliste värvainete abil.  
Polükromaatne erütrotsüüt –  ebaküps erütrotsüüt, arengu vahe ­
faasis olev erütrotsüüt, millel on endiselt alles ribosoomid ja seetõttu 
saab seda eristada küpsetest, normokromaatsetest erütrotsüütidest 
ribosoomide jaoks valikuliste värvainete abil.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Loomadele manustatakse uuritavat ainet sobiva manustamistee 
kaudu. Kui kasutatakse luuüdi, tapetakse loomad pärast manustamist 
sobival ajal, luuüdi eemaldatakse ning valmistatakse preparaadid ja need värvitakse (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Kui kasutatakse perifeerset verd, kogutakse veri sobival ajal pärast manustamist ning äigepreparaadid 
valmistatakse ja värvitakse (4, 8, 9, 10). Perifeerse vere uurimisel 
peaks jääma võimalikult vähe aega viimase manustamise ja rakkude kogumise vahele. Preparaate analüüsitakse pisituuma avastamiseks.
 
1.4. MEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Ettevalmistused  
1.4.1.1.  Loomaliikide valik  
Kui kasutatakse luuüdi, siis on soovitatav kasutada hiiri või rotte, 
kuigi võib kasutada mis tahes imetajate liike. Perifeerse vere kasu ­
tamise korral soovitatakse hiiri. Siiski võib kasutada mis tahes imeta ­
jate liike, kelle põrn ei eemalda pisituumseid erütrotsüüte, või liike, kes on näidanud piisavat tundlikkust struktuursete või numbriliste kromosoomaberratsioonide tekitajate avastamiseks. Kasutatakse 
noorte tervete loomade tavaliselt kasutatavaid laboritüvesid. Uuringut 
alustades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest kaalust.
 
1.4.1.2.  Pidamis- ja söötmistingimused  
Üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi kohaldatakse, kuigi 
otstarbekas niiskusesisaldus peaks olema 50–60 %.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Loomade ettevalmistamine  
Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel 
kontroll- ja katserühma. Loomad identifitseeritakse individuaalselt. Loomi harjutatakse laboritingimustega vähemalt viie päeva jooksul. 
Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võima ­
likult väikesed.
 
1.4.1.4.  Annuste ettevalmistamine  
Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates 
lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahe ­
tult või lahjendada enne doseerimist. Tuleks kasutada uuritava aine 
värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta 
näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
 
1.4.2.  Katsetingimused  
1.4.2.1.  Lahusti/kandjaaine  
Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatavate 
annuste korral ega reageerida keemiliselt uuritava ainega. Kui kasu ­
tatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, peab selle kasutamine 
toetuma ühtesobivuse kohta käivatele võrdlusandmetele. Soovitatav 
on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine kasu ­
tamist.  
1.4.2.2.  Kontrollkatsed  
Käesolevasse katsesse kaasatakse mõlema sugupoole korral paral ­
leelsed positiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollkatsed. Kontrollrühma loomi käsitletakse nii nagu katserühma loomi, kuid 
neid ei töödelda uuritava ainega.
 
Positiivsed kontrollkatsed peaksid tekitama pisituuma  in vivo  toime 
tasemel, millelt oodatakse fooniga võrreldes märgatava suurenemise põhjustamist. Positiivsete kontrollainete annused valitakse sellised, et 
mõjud on selged, kuid neist ei ilmne riideris kohe kodeeritud objek ­
tiklaaside identsus. On aktsepteeritav, et positiivses kontrollkatses võib kasutada uuritava aine manustamisviisist erinevat viisi ja proovid võetakse üksnes korra. Lisaks võib kaalutleda samasse 
keemiliste ainete klassi kuuluvate positiivsete kontrollkemikaalide 
kasutamist, kui sellised ained on kättesaadavad. Positiivsete kontrol ­
lainete näited:
 
Aine CASi nr EINECSi nr  
Etüül-metaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 
N-etüül-N-nitrosokarbamiid 759-73-9 212-072-2 Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 Tsüklofosfamiid 
Tsüklofosfamiidmonohüdraat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietüleen-melamiin 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Üksnes lahustit või kandjaainet saanud või muul katserühmaga sama ­
laadsel viisil töödeldud negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse 
proovid igal proovivõtukorral, välja arvatud siis, kui varasemad kont ­
rollitulemused näitavad vastuvõetavat loomadevahelist varieerumist ja kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude esinemissagedust. 
Kui negatiivsetest kontrollkatsetest võetakse üksnes üks proov, on 
kõige sobivam võtta see esimesel proovivõtukorral. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollproove, välja arvatud juhul, kui varasemad või avaldatud kontrollandmed näitavad, et valitud 
lahusti/kandjaaine ei indutseeri kahjulikke ega mutageenseid 
mõjusid.
 
Kui kasutatakse perifeerset verd, võib enne töötlemist võetud proov 
olla samuti aktsepteeritav paralleelse negatiivse kontrollina, kuid 
üksnes perifeerse verega tehtud lühiajalistel katsetel (nt 1–3 töötle ­
mist), kui saadud tulemused on varasemate kontrollide alusel ooda ­
tavas vahemikus.  
1.5. MENETLUS  
1.5.1.  Loomade arv ja sugu  
Nii katse- kui kontrollrühmas on mõlemast soost vähemalt viis 
analüüsitavat looma (11). Kui uuringu ajal on kättesaadavad tule ­
mused sama liigi korral sama manustamisteed kasutades tehtud 
uuringute kohta, mille tulemused näitavad, et toksilisuse osas ei 
ole olulisi erinevusi sugupoolte vahel, siis piisab katsete tegemisest vaid ühe sugupoolega. Kui inimese vastuvõtlikkus kemikaalidele on soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse 
sobivast soost loomadega.
 
1.5.2.  Manustamiskava  
Ei ole võimalik soovitada ühtegi standardset manustamiskava (nt 
üks, kaks või enam manustamist 24tunniste intervallidega). Pikemate 
manustamisrežiimide ajal kogutud proovid on aktsepteeritavad, kui 
positiivset mõju on näidatud käesolevas katses või negatiivses katses on näidatud toksilisust või on kasutatud piirannust ja manustamist on jätkatud proovivõtmise ajani. Uuritavaid aineid võib manustada ka 
jagatud annustena, näiteks kaks annust ühel päeval kuni mõnetunnise 
vahega, et hõlbustada suurte ainemahtude andmist.
 
Katset võib sooritada kahel viisil:  
a) loomadele manustatakse uuritavat ainet ühel korral. Proove luuü ­
dist võetakse vähemalt kahel korral, alustades mitte varem kui 24 
tundi pärast manustamist, kuid mitte hiljem kui 48 tundi pärast manustamist, ning proovide võtmise vahel on sobiv intervall. Proovide võtmine varem kui 24 tundi pärast manustamist peaks 
olema põhjendatud. Perifeerse vere proovid võetakse vähemalt 
kahel korral, alustades mitte varem kui 36 tundi pärast manusta ­
mist, ning esimesele proovile järgneb sobiv intervall, kuid mitte hiljem kui 72 tundi pärast manustamist. Kui positiivne tulemus on 
tuvastatav ühel proovivõtukorra järel, siis lisaproovide võtmist ei 
ole vaja;
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) kui kasutatakse kahte või enamat päevaannust (nt kaks või 
rohkem manustamist 24tunniste intervallidega), kogutakse 
proovid üks kord 18–24 tundi pärast viimast manustamist luuü ­
disse ja korra 36–48 tundi pärast viimast manustamist perifeer ­
sesse verre (12).  
Vajaduse korral võib lisaproove võtta muul ajal.  
1.5.3.  Annused  
Kui tehakse annuse vahemiku määramiseks uuring sobivate andmete 
puudumisel, siis tehakse uuring samas laboris, kasutades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamisrežiimi, mida kasutatakse põhiuuringus 
(13). Kui esineb mürgisus, kasutatakse kolme erinevat annust 
esimese proovivõtu jaoks. Need annused peaksid hõlmama vahe ­
mikku suurimast kuni väiksema mürgisuseni või mürgisuse puudu ­
miseni. Hilisemal proovivõtuajal on vaja kasutada üksnes suurimat 
annust. Suurim annus on määratletud annusena, mis põhjustab selli ­
seid mürgistusnähte, et samale manustamisrežiimile põhinevate suuremate annuste kasutamine võib põhjustada surma. Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetoksiliste annus ­
tena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks annuse 
määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Suurimat annust võidakse samuti määratleda annusena, mis põhjustab mõningaid mürgisusele viitavaid muutusi luuüdis (nt 
ebaküpsete erütrotsüütide hulga vähenemine erütrotsüütide 
koguarvus luuüdis või perifeerses veres).
 
1.5.4.  Piirkatse  
Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2 000 mg/kehamassi kg 
kohta ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui geno ­
toksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt lähedaste ainete 
andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uuringut vajalikuks. Kauem kestvate uuringute korral on piirannus 2 000 mg/kehamassi kg kohta päevas kuni 14 päeva kestval manus ­
tamisel ja 1 000 mg/kehamassi kg kohta päevas, kui manustamine 
kestab kauem kui 14 päeva. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutatavatest annustest suuremate annuste 
kasutamise vajadusele.
 
1.5.5.  Manustamine  
Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva 
intubeerimiskanüüli abil või süstides kõhuõõnde. Samuti võib muid 
manustamisviise aktsepteerida, kui need on põhjendatud. Vedeliku suurim maht, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Maht ei tohiks ületada 
2 ml/100 g kehamassi kohta. Suuremate mahtude kasutamine peab 
olema põhjendatud. Kui välja arvata ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katses kasutatavate mahtude varieeruvust, 
reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste 
korral jääks samaks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Luuüdi-/verepreparaat  
Luuüdirakud saadakse tavaliselt reieluudest või sääreluudest vahetult 
pärast tapmist. Rakud eemaldatakse reieluudest või sääreluudest, neist tehakse preparaadid ja värvitakse kindlakskujunenud meeto ­
ditel. Perifeerne veri võetakse sabaveenist või muust sobivast vere ­
soonest. Vererakud värvitakse kohe supravitaalvärvide abil (8, 9, 10) või tehakse äigepreparaadid ja seejärel värvitakse. DNA-spetsiifilise värvaine kasutamine (nt akridiinoranž (14) või Hoechst 33258 + püro ­
niin-Y (15)) võib kõrvaldada mõned mitte-DNA-spetsiifiliste värvai ­
nete kasutamisega seotud artefaktid. See eelis ei välista tavaliste värvainete (nt Giemsa) kasutamist. Täiendavaid süsteeme (nt tsellu ­
looskolonne tuumsete rakkude eemaldamiseks (16)) saab samuti 
kasutada, kui kõnealused süsteemid on piisavalt toimivad laboris pisituumapreparaatide valmistamiseks.
 
1.5.7.  Analüüs  
Ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikide (ebaküpsete + küpsete) 
erütrotsüütide hulgas määratakse iga looma puhul eraldi, loendades 
kokku vähemalt 200 erütrotsüüti luuüdist ja 1 000 erütrotsüüti peri ­
feersest verest (17). Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja negatiiv ­
sete kontrollkatsete omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoo ­
pilist analüüsi. Ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide esinemissage ­
duse määramiseks loendatakse looma kohta vähemalt 2 000 
ebaküpset erütrotsüüti. Lisateavet võidakse saada, loendades pisituu ­
masid küpsetes erütrotsüütides. Objektiklaase analüüsides ei tohiks ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikide erütrotsüütide hulgas olla 
väiksem kui 20 % kontrollväärtusest. Kui loomadele manustatakse 
uuritavat ainet pidevalt nelja või enama nädala jooksul, saab loen ­
dada vähemalt 2 000 küpset erütrotsüüti looma kohta pisituumade esinemissageduse määramiseks. Automaatsed analüüsisüsteemid 
(kujutise analüüs ja rakususpensioonide voolutsütomeetria) on vastu ­
võetavad alternatiivid manuaalsele hindamisele, kui see on asjakoha ­
selt põhjendatud ja valideeritud.
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabeli kujul. Katseühi ­
kuks on loom. Ebaküpsete erütrotsüütide arv, pisituumsete ebaküp ­
sete erütrotsüütide arv ja ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikidest erütrotsüütidest tuleks iga analüüsitava looma kohta loetleda eraldi. Kui loomadele manustatakse uuritavat ainet pidevalt nelja või enama 
nädala jooksul, tuleks samuti esitada teave küpsete erütrotsüütide 
kohta, kui seda on kogutud. Ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikidest erütrotsüütidest ja, vajaduse korral, pisituumsete erütrotsüütide prot ­
sendimäär esitatakse iga looma kohta. Kui pole tõestust vastuse 
sugudevahelise erinevuse kohta, võidakse kombineerida mõlema 
sugupoole andmed statistiliseks analüüsiks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Positiivse tulemuse saamiseks on mitmeid kriteeriume, nt pisituum ­
sete rakkude arvu suurenemine annusest tingituna või pisituumsete rakkude arvu selge suurenemine ühes annuse rühmas ühel proovivõ ­
tuajal. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. 
Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (18, 19). Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada 
täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katsetingimustes.
 
Uuritavat ainet, mille korral saadud tulemused ei vasta eespool 
toodud kriteeriumidele, peetakse käesolevas katses mittemutageen ­
seks aineks.  
Kuigi enamikus katsetes saadakse selged positiivsed või negatiivsed 
tulemused, välistavad harvadel juhtudel saadud tulemused uuritava 
aine aktiivsuse kohta kindlate otsuste tegemise. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata.
 
Pisituuma katse positiivsed tulemused viitavad sellele, et aine indut ­
seerib pisituumi, mis põhjustavad kromosoomikahjustuse või mitoo ­
siaparaadi kahjustuse katseliikide erütroblastides. Negatiivsed tule ­
mused viitavad sellele, et antud katsetingimustes ei tekita aine katse ­
liikide ebaküpsetes erütrotsüütides pisituumi.  
Tõenäosust, et uuritav aine või selle metaboliidid jõuavad üldisesse 
vereringesse või eriti sihtkoesse (nt süsteemne toksilisus), tuleks 
arutada.  
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Lahusti/kandjaaine:  
— kandjaaine valiku põhjendamine;  
— uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui see 
on teada.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/tüved;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, toitumine jne;  
— loomade individuaalne mass katse alustamisel, sh kehamassi 
vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta.  
Katsetingimused:  
— positiivseid ja negatiivseid (lahus/kandjaaine) kontrollkatseid 
käsitlevad andmed;  
— annuse vahemiku määramise uuringu tulemused, kui see on 
tehtud;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— annuste valimiku põhimõtted;  
— uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;  
— uuritava aine manustamise üksikasjad;  
— manustamistee põhjendus;  
— meetodid, mis verifitseerivad, et uuritav aine jõuab üldisesse 
vereringesse või sihtkoesse, vajaduse korral;  
— toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni 
(ppm) teisendamine tegelikuks annuseks (mg/kehamassi kg 
kohta päevas), vajaduse korral;  
— üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;  
— manustamis- ja proovivõtukavade üksikasjalik kirjeldus;  
— objektiklaaside ettevalmistamise meetodid;  
— toksilisuse mõõtmise meetodid;  
— ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide loendamise kriteeriumid;  
— analüüsitud rakkude arv looma kohta;  
— kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, 
negatiivseteks või ebaselgeteks.  
Tulemused:  
— toksilisuse tunnused;  
— ebaküpsete erütrotsüütide osa kõikides erütrotsüütides;  
— ebaküpsete pisituumsete erütrotsüütide arv, esitatakse iga looma 
kohta eraldi;  
— ebaküpsete erütrotsüütide keskväärtus ± standardhälve rühma 
kohta;  
— doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;  
— kasutatud statistilised analüüsid ja meetodid;  
— paralleelsed ja varasemad negatiivsed kontrollandmed;  
— paralleelsed positiivsed kontrollandmed.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, pp. 187–190.  
2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
pp. 9–15.  
3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., 
Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G W. (1983), 
The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, 
Mutation Res. 123, pp. 61–118.  
4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. 
F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of 
the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, 
Mutation Res., 239, pp. 29–80.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. 
Elsevier, Amsterdam, pp. 555–558.
 
6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., 
Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. 
(1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 
189, pp. 103–112.
 
7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. 
E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measu ­
rement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513–522.
 
8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245–249.
 
9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryth ­
rocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary 
Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83–98.
 
10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study 
Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), 
Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153–159.
 
11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchic ­
rotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. 
(1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Muta ­
tion Res., 312, pp. 293–304.  
12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313–319.  
13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen 
Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity 
Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319.
 
14) Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241–247.  
15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269–275.
 
16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91–104.  
17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the 
estimation of polychromatic to nor-mochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 
347, pp. 97–99.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, 
in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised, 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141.
 
19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cyto ­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines 
for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGEENSUS – BAKTERITE PÖÖRDMUTATSIOON ­
KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 471, Bacterial Reverse 
Mutation Test (1997).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Bakterite pöördmutatsioonkatses kasutatakse aminohappeid vajavaid  
Salmonella typhimurium ’i ja Escherichia coli  tüvesid punktmutat ­
siooni avastamiseks, millega kaasneb ühe või mitme DNA aluspaari asendus, lisamine või deletsioon (1, 2, 3). Käesoleva bakterite pöörd ­
mutatsioonkatse põhimõtteks on avastada mutatsioonid, mis paran ­
davad katsetüvedes olevaid mutatsioone ja taastavad bakterite funkt ­
sionaalse võime sünteesida põhilisi aminohappeid. Revertantsed bakterid avastatakse seepärast, et nad on võimelised kasvama, 
kuigi katsebakteritüves vajalik aminohape puudub.
 
Punktmutatsioonid põhjustavad inimestel mitmeid geneetilisi haigusi 
ja on märkimisväärseid tõendeid selle kohta, et punktmutatsioonid 
onkogeenides ja keharakkude kasvaja supressorgeenides osalevad 
inimeste ja katseloomade kasvajate moodustumisel. Bakterite pöörd ­
mutatsioonkatse on kiire, odav ja suhteliselt kergesti sooritatav. Paljudel katsetüvedel on mitmeid omadusi, mis muudavad nad tund ­
likumaks mutatsioonide avastamiseks, sh kergesti reageerivad DNA 
järjestused pöördmutatsiooni saitides, rakkude suurenenud läbitavus suurte molekulide suhtes ja DNA parandamise süsteemide kõrvalda ­
mine või vigadele vastuvõtlike DNA parandamisprotsesside tõhusta ­
mine. Katsetüvede spetsiifilisus võib anda vajalikku teavet genotok ­
siliste ainete põhjustatud mutatsiooni tüüpide kohta. Väga ulatuslik andmebaas eri struktuuride korral saadud tulemuste kohta on kätte ­
saadav bakterite pöördmutatsioonkatsete põhjal ja kindlakskujunenud 
meetodid on välja töötatud erinevate füüsikalis-keemiliste omadus ­
tega keemiliste ainete, sh lenduvate ühendite testimiseks.
 
Vt ka üldist sissejuhatust B osas.  
1.2. MÕISTED  
Pöördmutatsioonkatse  kas  Salmonella typhimurium ’i või  Esche­
richia coli  puhul avastab mutatsiooni aminohapet (vastavalt histi ­
diinis või trüptofaanis) nõudvas tüves, mille tulemusena tekib väljast ­
poolt saadud aminohappest sõltumatu tüvi.  
Aluspaari asendusmutageenid  on ained, mis põhjustavad aluse 
vahetust DNAs. Pöördmutatsioonkatses võib kõnealune muutus aset 
leida algupärase mutatsiooni kohas või muus bakterigenoomi saidis.  
Raaminihke mutageenid  on ained, mis põhjustavad ühe või mitme 
DNA aluspaari lisamist või deletsiooni, seega muutes RNA lugemis ­
raami.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. ALGSED KAALUTLUSED  
Bakterite pöördmutatsioonkatse kasutab prokarüootseid rakke, mis 
erinevad imetajate rakkudest sellise tegurite poolest nagu tagasi ­
haare, metabolism, kromosoomi struktuur ja DNA parandamisprot ­
sessid. Tehtud  in vitro  katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset meta ­
boolset aktiveerimist.  In vitro  metaboolse aktiveerimise süsteem ei 
saa tervenisti jäljendada  in vivo  tingimusi imetajatel. Seetõttu ei 
anna katse otsest teavet aine mutageensuse või kantserogeensuse 
kohta imetajatel.  
Bakterite pöördmutatsioonkatset kasutatakse tavaliselt genotoksilisust 
ja eriti punktmutatsiooni põhjustava tegevuse algseks skriinimiseks. Ulatuslik andmebaas on näidanud, et mitmetel keemilistel ainetel, 
mis annavad käesolevas katses positiivseid tulemusi, on mutageenne 
aktiivsus ka muudes katsetes. On näiteid mutageensetest ainetest, mida ei avastata käesoleva katse abil; nende ebaõnnestumiste põhjus ­
teks on avastatud lõpp-punkti spetsiifiline olemus, metaboolse akti ­
veerimise erinevused või biosaadavuse erinevused. Teisalt võivad 
tegurid, mis tõhustavad bakterite pöördmutatsioonikatse tundlikkust, viia mutageense aktiivsuse ülehindamiseni.
 
Bakterite pöördmutatsioonkatse ei sobi teatud klassidesse kuuluvate 
keemiliste ainete hindamiseks, nt väga bakteritsiidsed ühendid (nt 
teatud antibiootikumid) ja need, mida peetakse (või tuntakse) imeta ­
jate raku replikatsioonisüsteemi (nt mõnede topoisomeraasi inhibiito ­
rite ja mõnede nukleosiidide analoogide) mõjutajatena. Sellistel 
juhtudel on imetajate mutatsioonikatsed sobivamad.  
Kuigi paljud ühendid, mis annavad positiivseid tulemusi käesolevas 
katses, on imetajate kantserogeenid, ei ole korrelatsioon täielik. See sõltub keemilisest aineklassist ning esineb kantserogeene, mida käes ­
oleva katse abil ei avastata, kuna nad tegutsevad muude, mittegeno ­
toksiliste mehhanismide või bakterirakkudes puuduvate mehhanis ­
mide abil.
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Bakterirakkude suspensioonid allutatakse uuritava aine toimele ekso ­
geense metaboolse aktiveerimise olemasolu ja puudumise korral. Vahetu kokkusegamise meetodil segatakse kõnealused suspensioonid külviagariga ja asetatakse vahetult minimaalsesse kasvukeskkonda. 
Preinkubatsioonimeetodi puhul inkubeeritakse uuritavat ainet 
sisaldav segu ja segatakse seejärel külviagariga enne minimaalsesse kasvukeskkonda asetamist. Mõlema metoodika puhul pärast kahte või kolme inkubatsioonipäeva loendatakse revertantkolooniad ja 
võrreldakse nende arvu spontaansete revertantkolooniate arvuga 
lahusti kontrollplaatidel.
 
On kirjeldatud mitmeid bakterite pöördmutatsioonkatse sooritamise 
menetlusi. Nende seas on enimkasutatavad vahetu kokkusegamise meetod (1, 2, 3, 4), preinkubatsioonimeetod (2, 3, 5, 6, 7, 8), fluk ­
tuatsioonimeetod (9, 10) ja suspensioonimeetod (11). Gaaside või 
aurude uurimist käsitlevaid muudatusi on kirjeldatud (12).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Kõnealuses meetodis kirjeldatud menetlused puudutavad peamiselt 
vahetu kokkusegamise ja preinkubatsioonimeetodit. Nende mõlema 
abil võidakse teha katseid koos metaboolse aktiveerimisega või ilma selleta. Mõned ained võivad olla paremini tuvastatavad preinkubat ­
sioonimeetodi abil. Need ained kuuluvad keemilistesse aineklassi ­
desse, kus on lühiahelalised alifaatsed nitrosoamiinid, metallid oksü ­
datsiooniastmega + 2, aldehüüdid, asovärvid ja diasoühendid, pürol ­
lisidiinalkaloidid, allüülühendid ja nitroühendid (3). Samuti on tähel ­
datud, et teatud mutageenide klasse ei tuvastata alati standardmenet ­
luste abil, nagu nt vahetu kokkusegamise meetodil või preinkubat ­
sioonimeetodil. Neid tuleks vaadelda „erijuhtudena” ja on rangelt soovitatav, et nende tuvastamiseks kasutataks alternatiivseid menet ­
lusi. Järgmised „erijuhud” on võimalik ära tunda (koos menetluste 
näidetega, mida võib nende tuvastamiseks kasutada): asovärvained ja 
diasoühendid (3, 5, 6, 13), gaasid ja lenduvad kemikaalid (12, 14, 15, 16) ning glükosiidid (17, 18). Kõrvalekaldeid standardmenetlus ­
test on vaja teaduslikult põhjendada.
 
1.5. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.5.1.  Ettevalmistused  
1.5.1.1.  Bakterid  
Värsked bakterikultuurid tuleb kasvatada kuni hilise eksponentsiaalse 
või varase statsionaarse kasvufaasini (ligikaudu 10  9 rakku ml kohta). 
Hilises statsionaarses faasis olevaid kultuure ei tohiks kasutada. On 
oluline, et katses kasutatavad kultuurid sisaldaksid elujõuliste rakkude suuri tiitreid. Tiitrit võib näidata kas varasematest kontroll ­
katsetest saadud kasvukõverate abil või määrates igas analüüsis 
elujõuliste rakkude arv külvikatsel.
 
Soovitav inkubatsioonitemperatuur on 37  o C. 
Tuleks kasutada vähemalt viit bakteritüve. Nende hulka peaks 
kuuluma neli tüve  S. typhimurium ’ilt (TA 1535; TA 1537 või 
TA97a või TA97; TA98; ja TA100), mida peetakse usaldusväärse ­
teks ja mis on andnud reprodutseeritava vaste eri laborites. Nendes neljas  S. typhimurium ’i tüves on GC aluspaarid algses pöördmutat ­
sioonisaidis ja on teada, et need ei avasta teatud oksüdeerivaid muta ­
geene, ristseoseid moodustavaid aineid ja hüdrasiine. Selliseid aineid võib avastada  E. coli  WP2-tüvede või  S. typhimurium  TA1 02 (19) 
abil, millel on AT aluspaar algses pöördmutatsioonisaidis. Seetõttu 
on soovitavad tüvede kombinatsioonid järgmised:
 
— S. typhimurium  TA1535;  
— S. typhimurium  TA1537 või TA97 või TA97a;  
— S. typhimurium  TA98;  
— S. typhimurium  TA100;  
— E. coli  WP2 uvrA või  E. coli  WP2 uvrA (pKM101) või  S. 
typhimurium  TA102.  
Ristseostuvate mutageenide avastamiseks on eelistatav kasutada TA1 
02 või lisada DNA parandusele spetsiifilist  E. coli  tüve (nt  E. coli  
WP2 või  E. coli  WP2 (pKMIOl)).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Tüvikultuuri preparaatide valmistamiseks, markeri verifitseerimiseks 
ja säilitamiseks tuleks kasutada väljakujunenud menetlusi. Kasvuks 
mõeldud aminohappe vajadust tuleks näidata iga külmutatud tüvikul ­
tuuri varupreparaadi puhul  (S. typhimurium ’i tüvede puhul histidiin 
ja E. coli  tüvede puhul trüptofaan). Muid fenotüüpseid tunnuseid 
tuleks vastavalt kontrollida: R-faktori plasmiidide esinemist või 
puudumist, vajaduse korral (nt ampitsilliini resistentsus TA98, TA100 ja TA97a või TA97, WP2 uvrA ja WP2 uvrA (pKM101) tüvede puhul ning ampitsilliini + tetratsükliini resistentsus TA102 
tüve puhul); iseloomulike mutatsioonide esinemine (nt tundlikkusest 
kristallvioleti suhtes põhjustatud rfa-mutatsioon  S. typhimurium ’is ja 
tundlikkusest ultraviolettkiirguse suhtes põhjustatud uvrA-mutatsioon  
E. coli ’is või uvrB-mutatsioon  S. typhimurium ’is) (2, 3). Tüved 
peaksid samuti andma plaatidel spontaansete revertantsete bakterite 
kolooniate loendamise tulemusi, mis vastavad laborite esinemissage ­
duste kontrollandmete vahemikele ja kirjanduses eelistatult esitatud vahemikele.
 
1.5.1.2.  Sööde  
Kasutatakse sobivat minimaalset agarit (sisaldab nt Vogel-Bonneri 
minimaalset söödet E ja glükoosi) ja külviagarit, mis sisaldab histidiini ja biotiini või trüptofaani, mis võimaldavad raku jagu ­
nemist (1, 2, 9).
 
1.5.1.3.  Metaboolne aktiveerimine  
Bakterid puutuvad kokku uuritava ainega nii vastava metaboolse 
aktiveerimissüsteemi olemasolu kui ka puudumise korral. Enim kasu ­
tatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainete, nt Aroclor 1254ga (1, 2) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (18, 20, 21) 
töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa 
(S9), millele on lisatud kofaktor. Tavaliselt kasutatakse postmito ­
kondriaalset fraktsiooni kontsentratsiooni vahemikus 5–30 mahuprot ­
senti S9-segus. Metaboolse aktiveerimissüsteemi valik ja tingimused võivad sõltuda uuritava keemilise aine klassist. Mõnel juhul on vaja 
kasutada postmitokondriaalse fraktsiooni rohkem kui üht kontsentrat ­
siooni. Asovärvainete ja diasoühendite puhul võib olla sobivam kasutada redutseerivat metaboolse aktiveerimise süsteemi (6, 13).
 
1.5.1.4.  Uuritav aine/ettevalmistused  
Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates 
lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne bakte ­
rite töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult katse ­
süsteemidesse ja/või lahjendada enne manustamist. Tuleks kasutada 
uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
 
Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida 
ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega 
(22). Kui kasutatakse muud kui tuntud lahustit/kandjaainet, siis peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andme ­
tele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/- 
kandjaaine kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad 
orgaanilised lahustid peavad olema veevabad.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Katsetingimused  
1.5.2.1.  Katsetüved (vt 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Manustamise kontsentratsioon  
Kasutatavate katseainete suurima koguse määramisel võetakse 
arvesse tsütotoksilisust ja lahustuvust lõplikus katsesegus.  
Tsütotoksilisust ja lahustuvust võib olla kasulik määrata eelkatses. 
Tsütotoksilisust võib tuvastada töödeldud kultuurides revertantsete 
kolooniate arvu vähenemise, lausfooni selginemise või vähenemise või rakkude ellujäämisastme abil. Aine tsütotoksilisust võib muuta metaboolsete aktiveerimissüsteemide esinemise korral. Lahustumatust 
tuleks hinnata lõplikus segus palja silmaga nähtava sadestuse tekke 
põhjal tegelikes katsetingimustes.
 
Soovitatav suurim katsekontsentratsioon lahustuvate mittetoksiliste 
ainete kohta on 5 mg plaat või 5 μl plaat. Mittetoksiliste ainete 
puhul, mis on lahustumatud kontsentratsioonidel 5 mg plaadi kohta 
või 5 μl plaadi kohta, peaks üks või enam uuritavat kontsentratsiooni 
vastama lahustumatusele lõplikus katsesegus. Katseaineid, mis on tsütotoksilised juba kontsentratsioonidel alla 5 mg plaadi kohta või 5 μl plaadi kohta, tuleks testida tsütotoksilise kontsentratsiooni 
suhtes. Sadestus ei tohiks mõjutada tulemust.
 
Tuleks kasutada vähemalt viit erinevat analüüsitava katseaine kont ­
sentratsiooni, mille korral on katsepunktidele vastav vahemik ligi ­
kaudu poollogaritmiline (nt √10). Kontsentratsioonsõltuvuse uuri ­
misel võivad olla sobivamad väiksemad intervallid. Hinnates aineid, mis sisaldavad märkimisväärsel hulgal võimalikke mutageenseid 
lisandeid, võib kõne alla tulla katsete tegemine suuremate kontsen ­
tratsioonidega kui 5 mg plaadi kohta või 5 μl plaadi kohta.
 
1.5.2.3.  Negatiivsed ja positiivsed kontrollkatsed  
Igas katses kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid 
(lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid nii metaboolse aktiveerimi ­
sega kui ka ilma selleta. Positiivsetes kontrollkatsetes kasutatavad 
kontsentratsioonid tuleb valida selliselt, et need näitaksid iga katse 
sooritamise tõhusust.  
Metaboolset aktiveerimissüsteemi kasutavate katsete puhul tuleks 
välja valida positiivsete kontrollkatsete võrdlusaine(d) kasutatavate bakteritüvede tüübi põhjal.
 
Järgmised ained on näited sobivatest positiivsetest kontrollainetest 
metaboolse aktiveerimisega katsete jaoks:  
Aine CASi nr EINECSi nr  
781-43-1 212-308-4 9,10-dimetüülantratseen 
57-97-6 200-359-5 7,12-dimetüülbens( α)antratseen 
50-32-8 200-028-5 Benso(a)püreen 
613-13-8 210-330-9 2-aminoantratseen  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Aine CASi nr EINECSi nr  
50-18-0 Tsüklofosfamiid 
6055-19-2 200-015-4 Tsüklofosfamiidmonohüdraat  
Järgmine aine on sobiv positiivseks kontrolliks redutseeriva meta ­
boolse aktiveerimise meetodi jaoks:  
Aine CASi nr EINECSi nr  
Kongopunane 573-58-0 209-358-4  
2-aminoantratseeni ei tohiks kasutada S9-segu tõhususe ainsa indi ­
kaatorina. Kui kasutatakse 2-aminoantratseeni, peaks iga S9-partiid samuti iseloomustama mutageeniga (nt benso[a]püreen, dimetüülben ­
santratseen), mis eeldab mikrosomaalse ensüümi tekitatud meta ­
boolset aktiveerimist.
 
Järgmised ained on näited positiivsetest tüvele spetsiifilistest sobiva ­
test kontrollainetest eksogeense metaboolse aktiveerimissüsteemiga 
katsete jaoks:  
Aine CASi nr EINECSi nr Tüvi  
Naatriumasiid 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 ja TA 100 
2-nitrofluoreen 607-57-8 210-138-5 TA 98 
9-aminoakridiin 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 ja TA 97a 
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 ja TA 97a 
Kumeenvesinik ­
peroksiid 80-15-9 201-254-7 TA 102 
Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA ja TA 102 
l-metüül-3-nitro-l- 
nitrosoguanidiin 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA ja WP2uvrA 
(pKM101) 
4-nitrokinoliin-1- 
oksiid 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA ja WP2uvrA 
(pKM101) 
Furiilfuramiid 
(AF2) 3688-53-7 Plasmiidi sisaldavad tüved  
Võidakse kasutada muid sobivaid positiivse kontrolli võrdlusaineid. 
Lähedasse keemilisse aineteklassi kuuluvate positiivsete keemiliste kontrollainete kasutamist tuleks kaaluda, kui selline aine on kätte ­
saadav.
 
Tuleks kasutada negatiivseid kontrollaineid, mis sisaldavad üksnes 
lahustit või kandjaainet ilma katseaineta ja mida muidu manustatakse sarnasel viisil nagu katserühmade puhul. Lisaks sellele kasutatakse ka töötlemata kontrollkatseid, välja arvatud juhul, kui varasemad 
andmed kontrollaine kohta näitavad, et valitud lahusti ei indutseeri 
kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Menetlus  
Vahetu kokkusegamise meetodil (1, 2, 3, 4), ilma metaboolse akti ­
veerimiseta, segatakse 2,0 ml külviagariga tavaliselt 0,05 ml või 0,1 ml katselahuseid, 0,1 ml värskeid bakterikultuure (mis sisaldavad 
ligikaudu 10
 8 elujõulist rakku) ja 0,5 ml steriilset puhvrit. Meta ­
boolse aktiveerimisega katse puhul segatakse tavaliselt 0,5 ml meta ­
boolse aktiveerimise segu, mis sisaldab piisaval hulgal postmito ­
kondriaalset fraktsiooni (vahemikus 5–30 mahuprotsenti metaboolse 
aktiveerimise segus) külviagari (2,0 ml) ja bakterite ja uuritava aine/ ­
katselahusega. Iga katseklaasi sisu segatakse ja külvatakse mini ­
maalse agarinõu pinnale. Külviagarit võib lasta tahkestuda enne 
inkubatsiooni.  
Eelinkubatsioonimeetodi puhul (2, 3, 5, 6) eelinkubeeritakse uuritav 
aine/katselahus uuritava tüvega (mis sisaldab ligikaudu 10  8 elujõulist 
rakku) ja steriilse puhvriga või metaboolse aktiveerimise süsteemiga (0,5 ml) enamasti 20 minutit või kauem 30–37
 o C juures enne 
külviagariga segamist ja külvatakse minimaalse agariplaadi pinnale. 
Tavaliselt segatakse 0,05 või 0,1 ml uuritavat ainet/katselahust, 0,1 
ml baktereid ja 0,5 ml S9-segu või steriilset puhvrit 2,0 ml külvia ­
gariga. Katseklaase tuleks täita õhuga eelinkubatsiooni ajal, kasu ­
tades selleks loksutit.  
Varieerumise piisavaks hindamiseks tuleks kasutada kolme paral ­
leelset plaati iga annuse korral. Kahe paralleelse plaadi kasutamine 
on aktsepteeritav siis, kui seda on teaduslikult põhjendatud. Plaadi 
juhuslikul kaotsiminekul ei tunnistata katset ilmtingimata kehtetuks.  
Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks 
suletud kasvuanumates (12, 14, 15, 16).  
1.5.4.  Inkubatsioon  
Kõiki antud katse anumaid tuleks inkubeerida 37  o C juures 48–72 
tundi. Pärast inkubatsiooniperioodi loendatakse kokku revertantsete 
kolooniate arv plaadi kohta.  
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Tulemused tuleks esitada revertantsete kolooniate arvuna plaadi 
kohta. Revertantsete kolooniate arv nii negatiivsete (lahusti kontroll ­
katse ja töötlemata kontrollkatse, kui seda kasutatakse) kui ka posi ­
tiivsete kontrollplaatide korral tuleks esitada. Üksikute plaatide korral loendatud bakterite arvud, revertantsete kolooniate keskmine arv plaadi kohta ja standardhälve tuleks esitada uuritava aine ning posi ­
tiivsete ja negatiivsete (töötlemata ja/või lahusti) kontrollkatsete 
kohta.
 
Selget positiivset vastust ei ole vaja verifitseerida. Ebaselgeid tule ­
musi tuleks selgitada täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katsetingimustes. Negatiivseid tulemusi kinnitatakse igal üksikjuhul eraldi. Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste kinnitamist ei peeta 
vajalikuks, esitatakse põhjendus. Katse parameetrite muutmist 
hinnatud tingimuste vahemiku suurendamiseks tuleks arvesse võtta järelkatsetel. Katse parameetrid, mida võidakse muuta, hõlmavad kontsentratsioonivahemikku, manustamisviisi (vahetu kokkusegamise 
või vedeliku eelinkubatsiooni meetod) ja metaboolse aktiveerimise 
tingimusi.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Positiivse tulemuse määramise kriteeriumid, nagu näiteks kontsen ­
tratsiooniga seotud uuritava vahemiku suurenemine ja/või ühes või mitmes kontsentratsioonis revertantsete kolooniate arvu reprodut ­
seeruv suurenemine plaadil vähemalt ühe tüve korral süsteemis 
koos metaboolse aktiveerimisega või ilma selleta (23). Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (24). 
Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse 
saamiseks.
 
Uuritavat ainet, mille tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumi ­
dele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas katses.  
Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tule ­
mused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud korduskatsete arvust sõltumata.
 
Bakterite pöördmutatsioonkatse positiivsed tulemused näitavad, et 
aine põhjustab punktmutatsioone aluste asendamise või  Salmonella 
typhimurium ’i ja/või  Escherichia coli  genoomi raaminihke abil. 
Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et uuritav aine ei ole katse ­
tingimustes mutageenne uuritavate liikide puhul.  
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Lahusti/kandjaaine:  
— kandjaaine valiku põhjendus;  
— uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on 
teada.  
Tüved:  
— kasutatavad tüved;  
— rakkude arv rakukultuuri kohta;  
— tüvede omadused.  
Katsetingimused:  
— uuritava aine hulk plaadi kohta (mg plaadi kohta või μl plaadi 
kohta) annuse valiku põhjendusega ja plaatide arvuga ühe kont ­
sentratsiooni kohta;  
— kasutatavad söötmed;  
— metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle vastu ­
võetavuse kriteeriumid;  
— manustamismenetlused  
Tulemused:  
— toksilisuse tunnused;  
— sadestuse tunnused;  
— individuaalsed loendusandmed plaadi kohta;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— revertantsete kolooniate keskmine arv plaadi kohta ja standard ­
hälve;  
— doosi ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;  
— võimalikud statistilised analüüsid;  
— paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kont ­
rollkatsete andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standard ­
hälbed;  
— varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kont ­
rollkatsete andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standard ­
hälbed.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Arnes, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347–364.
 
2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (19 8 3), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215.
 
3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217–233.
 
4) Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., 
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), 
The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency 
Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69–240.
 
5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, 
pp. 91–96.  
6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Nor-poth K. H. and Garner, R. C, Springer, 
Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273–285.
 
7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. 
and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic 
Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, 
Cambridge University Press, pp. 13–61.  
8) Aeschacher, H. U, Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods,/. Food Safety, 8, pp. 167–177.
 
9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33–42.
 
10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. 
W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., 
Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam- 
New York-Oxford, pp. 141–161.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutage ­
nesis, 3, pp. 453–465.  
12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335–344.
 
13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzi ­
dine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33–47.
 
14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and 
Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2–141.
 
15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Muta ­
genic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in GeneticToxicology, D. Scott, B. Bridges and F., 
Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249–258.
 
16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. 
D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Acti ­
vity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella 
Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421–441.  
17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and 
Sugimura, T. (19 79), Mutagenicity of the Naturally Occurring 
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane 
Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780–3782.
 
18) Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961–4965.
 
19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285–291.
 
20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Meta ­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et 
al. Elsevier, North Holland, pp. 85–88.
 
21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxi ­
city Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175–177.  
22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/ 
Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343–350.  
23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nest ­
mann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella 
typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity, Mutation Res., 189, pp. 83–91.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evalua ­
tion of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge 
University Press, pp. 28–65.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  MUTAGEENSUSE JA KARTSINOGEENSUSE UURING, 
GEENMUTATSIOON –  SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Pärmseene  Saccharomyces cerevisiae  erinevaid haploidseid ja 
diploidseid tüvesid saab kasutada keemiliste ainete poolt põhjus ­
tatud geenmutatsioonide uurimiseks koos metabolismi aktiveerimi ­
sega või ilma.  
Haploidsete tüvede puhul on kasutusel otsemutatsiooni süsteemid, 
näiteks mõõtes mutatsiooni punasest, adeniinsõltuvast mutandist  
(ade-1, ade-2),  topelt adeniinsõltuvaks valgeks mutandiks, ja selek ­
tiivsed süsteemid, nagu resistentsuse induktsioon kanavnaiinile ja tsükloheksimiidile.
 
Kõige laialdasemalt tunnustatud pöördmutatsioonisüsteem hõlmab 
haploidse tüve XV 185-14C kasutamist, mis kannab ooker- nonsenss-mutatsioone  ade  2-1,  arg 4-17,  lys 1-1 ja  trp 5-48. Need 
mutatsioonid on pöörduvad baasasendatavate mutageenide poolt, mis 
indutseerivad kohaspetsiifilisi mutatsioone või ooker-supressor- 
mutatsioone. XV 185-14C kannab ka  his 1-7 markerit, missense- 
mutatsiooni, mis on pöörduv peamiselt sekundaarsete mutatsiooni ­
kohtade poolt, ja  hom  3-10 markerit, mis on pöörduv raaminihke 
mutageenide poolt.
 
Diploidsete  S. cerevisiae  tüvede korral on ainukeseks laialdaselt 
kasutatavaks tüveks D  7 mis on homosügootne  ilv 1-92 suhtes.  
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
Testitava aine ja kontrollaine lahused tuleb valmistada vahetult enne 
testimise alustamist, kasutades sobilikke vehiikleid. Vees mittelahus ­
tuvate orgaaniliste koostisosiste puhul ei tohiks kasutada rohkem kui 2 % orgaaniliste ainete lahustamiseks sobivaid lahusteid, näiteks etanool, atsetoon või dimetüülsulfoksiid (DMSO). Abiaine lõplik 
kontsentratsioon ei tohiks oluliselt mõjutada raku eluvõimet ja 
kasvu karakteristikuid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o o l n e a k t i v a t s i o o n  
Rakud tuleks eksponeerida testitavale kemikaalile nii sobivate ekso ­
geensete metabolismi aktiveerivate süsteemide juuresolekul kui ka ilma.
 
Kõige sagedamini kasutatavaks süsteemiks on kofaktor, mille koos ­
tises on eelnevalt ensüümindutseeriva ainega mõjutatud näriliste maksast saadav post-mitokondriaalne fraktsioon. Metaboolseks akti ­
vatsiooniks võib kasutada ka teisi loomaliike, kudesid, post-mito ­
kondriaalseid fraktsioone või protseduure.
 
Uuringu tingimused  
T e s t - t ü v i  
Geenmutatsiooni uuringutes on kõige kasutatavamad haploidne tüvi 
XV 185-14C ja diploidne tüvi D  7 . Teiste tüvede kasutamine võib 
olla kohane.  
R a k u s ö ö d e  
Elulemuse ja mutantide arvu kindlakstegemiseks kasutatakse sobi ­
vaid rakusöötmeid.  
P o s i t i i v s e t e j a n e g a t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Positiivsed, töötlemata ja lahuse kontrollid tuleb teha korraga. Iga 
spetsiifilise mutatsioonilise tulemusnäitaja puhul tuleks kasutada 
sobivaid positiivse kontrolli kemikaale.  
E k s p o s i t s i o o n i k o n t s e n t r a t s i o o n  
Testimisel peaks kasutama vähemalt viit piisavalt erinevat testitava 
aine kontsentratsiooni. Toksiliste ainete puhul ei tohiks kõrgeim 
testitav kontsentratsioon vähendada elulemust alla 5–10 %. Vees mittelahustuvad ained tuleks testida lahustuvuspiirini, kasutades selleks sobivaid meetodeid. Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste 
ainete puhul tuleks maksimaalne kontsentratsioon määrata üksikjuh ­
tumite kaupa.
 
I n k u b a t s i o o n i t i n g i m u s e d  
Alusklaase inkubeeritakse seitse päeva 28–30  o C juures pimedas.  
S p o n t a a n s e t e m u t a t s i o o n i d e s a g e d u s  
Tuleks kasutada subkultuure, mille spontaansete mutatsioonide 
sagedus on aktsepteeritud normivahemikus.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
R e p l i k a t s i o o n i d e a r v  
Raku eluvõime ja geenmutatsiooni poolt produtseeritud prototroofide 
analüüsimiseks tuleks kasutada vähemalt kolme replikatsiooni-alus ­
klaasi iga testitava aine kontsentratsiooniväärtuse kohta. Kui kasuta ­
takse madala mutatsioonitasemega markereid, nagu  horn  3-10, tuleb 
alusklaaside arvu suurendada, et saada statistiliselt olulisi andmeid.  
Protseduur  
S. cerevisiae  tüvede töötlus sooritatakse tavaliselt vedeltesti meetodil 
latentsete või paljunevate rakkudega. Algsed katsed tuleks teha palju ­
nevate rakkudega: 1-5 x 10  7 rakku/ml eksponeeritakse testitavale 
kemikaalile kuni 18 tunni jooksul temperatuuril 28–37  o C, aeg-ajalt 
loksutades; piisav kogus metabolismi aktiveerivat süsteemi lisatakse töötluse käigus sobilikul ajahetkel. Töötluse lõpus rakud tsentrifuu ­
gitakse, pestakse ja külvatakse sobivale rakusöötmele. Pärast inku ­
batsiooni hinnatakse alusklaase rakkude elulemuse ja mutatsioonide induktsiooni osas. Kui esimene katse on negatiivne, tuleks teha teine katse, kasutades latentse faasi rakke. Kui esimene katse on posi ­
tiivne, kinnitatakse see sobiva sõltumatu uuringuga.
 
2. ANDMED  
Andmed tuleks esitada tabelis, näidates loendatud kolooniate arvu, 
mutantide arvu, elulemuse ja mutantide sageduse. Kõik tulemused tuleks kinnitada sõltumatu uuringuga. Andmeid tuleks töödelda sobi ­
vaid statistilisi meetodeid kasutades.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— kasutatav tüvi;  
— katsetingimused: latentses faasis või paljunevad rakud, raku ­
söötme koostis, inkubatsiooni temperatuur ja kestus, metabolismi aktiveeriv süsteem;
 
— töötluse tingimused: ekspositsiooni tase, töötluse meetod ja 
kestus, töötluse temperatuur, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;  
— loendatud kolooniate arv, mutantide arv, elulemuse ja mutantide 
sagedus, doos/vastus suhe (kui oluline), andmete statistiline 
hinnang;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  MITOOTILINE REKOMBINATSIOON –  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Saccharomyces cerevisiae  mitootilist rekombinatsiooni saab määrata 
geenide vahel (üldisemalt geeni ja selle tsentromeeri vahel) või geenide sees. Esimest nimetatakse mitootiliseks ristsiirdeks, mille 
tulemuseks on retsiprooksed produktid, teist geeni konversiooniks, 
mis on kõige sagedamini mitteretsiprookne. Ristsiiret analüüsitakse tavaliselt retsessiivsete homosügootsete kolooniate produktsiooni 
järgi või heterosügootsete tüvede poolt produtseeritud sektorite 
järgi. Geeni konversiooni analüüsitakse prototroofsete revertantide produktsiooni järgi, mida toodavad kahte erinevat sama geeni defektset alleeli kandvad auksotroofsed heteroalleelsed tüved. 
Kõige sagedamini kasutatavad tüved mitootilise geeni konversiooni 
kindlakstegemiseks on D
 4 (heteroalleelne  ade  2-s ja  trp 5-s), D  7 
(heteroalleelne  trp 5-s), BZ  34 (heteroalleelne  arg 4-s) ja JD1 (hete ­
roalleelne  his 4-s ja  trp 5-s). Mitootilist ristsiiret, mis produtseerib 
punaseid ja roosasid homosügootseid sektoreid, saab analüüsida D  5 -s 
või D  7 -s (mis mõõdavad ka mitootilist geeni konversiooni ja pöörd ­
mutatsiooni  ilv 1-92-s), mõlemad tüved on heteroalleelsed  ade 2  
komplementaarsete alleelide osas.  
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
Testitava kemikaali ja kontroll- või võrdluslahused tuleks valmistada 
vahetult enne testimist, kasutades sobivaid vehiikleid. Vees mitte ­
lahustuvate orgaaniliste koostisosade puhul ei tohiks kasutada rohkem kui 2 % orgaaniliste ainete lahustamiseks sobivaid lahusteid, 
näiteks etanool, atsetoon või dimetüülsulfoksiid (DMSO). Vehiikli 
lõplik kontsentratsioon ei tohiks oluliselt mõjutada raku eluvõimet ja kasvu omadusi.
 
M e t a b o o l n e a k t i v a t s i o o n  
Rakud tuleks eksponeerida testitavale kemikaalile nii sobiva ekso ­
geense metabolismi aktiveeriva süsteemi juuresolekul kui ka ilma. 
Kõige sagedamini kasutatavaks süsteemiks on kofaktor, mille koos ­
tises on eelnevalt ensüümindutseeriva ainega mõjutatud näriliste maksast saadav post-mitokondriaalne fraktsioon. Ka teiste liikide, 
kudede, post-mitokondriaalsete fraktsioonide või meetodite kasuta ­
mine metaboolseks aktivatsiooniks on lubatud.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Katsetingimused  
T e s t - t ü v e d  
Kõige sagedamini kasutatavad tüved on diploidsed D  4 , D  5 , D  7 ja 
JD 1 . Teiste tüvede kasutamine võib olla kohane.  
R a k u s ö ö d e  
Mitootilise rekombinatsiooni ja elulemuse sageduse hindamiseks 
kasutatakse sobivaid rakusöötmeid.  
P o s i t i i v s e t e j a n e g a t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Positiivsed, mittetöödeldud ja lahusti kontrollid peaksid olema tehtud 
korraga. Iga spetsiifilise rekombinatsiooni tulemusnäitaja puhul tuleks kasutada sobivaid positiivse kontrolli kemikaale.
 
E k s p o s i t s i o o n i k o n t s e n t r a t s i o o n i d  
Tuleks kasutada vähemalt viit piisavalt erinevat testitava aine kont ­
sentratsiooni. Uuritavate faktorite hulgas peavad muu hulgas olema 
tsütotoksilisus ja lahustuvus. Kõige madalam kontsentratsioon ei tohi 
mõju avaldada raku eluvõimele. Toksiliste ainete puhul ei tohiks kõrgeim testitav kontsentratsioon vähendada elulemust alla 5–10 %. Vees mittelahustuvaid kemikaale tuleks testida lahustuvus ­
piirini, kasutades selleks sobivaid meetodeid. Vabalt vees lahustuvate 
mittetoksiliste ainete kõrgeim kontsentratsioon tuleb määrata üksik ­
juhtumite kaupa.
 
Rakke võib eksponeerida testitavale kemikaalile kas latentses või 
paljunemisfaasis kuni 18 tunni jooksul. Pika töötlemisaja puhul 
tuleks kultuure uurida mikroskoopiliselt spooride moodustumise aspektist, spooride olemasolu tühistab testi tulemuse.
 
I n k u b a t s i o o n i t i n g i m u s e d  
Alusklaase inkubeeritakse pimedas neli kuni seitse päeva tempera ­
tuuril 28–30  o C. Alusklaase, mida kasutatakse mitootilise ristsiirde 
poolt produtseeritud punaste ja roosade homosügootsete sektorite 
analüüsimiseks, tuleks enne loendust hoida üks kuni kaks päeva külmikus (umbes 4
 o C juures), mis võimaldab sobivate pigmentee ­
ritud kolooniate tekke.  
S p o n t a a n s e m i t o o t i l i s e r e k o m b i n a t s i o o n i 
s a g e d u s  
Tuleks kasutada subkultuuri, mille spontaanse mitootilise rekombi ­
natsiooni mutatsiooni sagedus on aktsepteeritud normivahemikus.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
R e p l i k a t s i o o n i d e a r v  
Elulemuse ja mitootilise geenikonversiooni poolt produtseeritud 
prototroofide analüüsimiseks tuleks kasutada vähemalt kolme repli ­
katsiooni-alusklaasi iga testitava aine kontsentratsiooni kohta. Mitoo ­
tilise ristsiirde poolt produtseeritud retsessiivse homosügoosi analüü ­
simiseks tuleks alusklaaside arvu suurendada, et saada piisavat 
kolooniate arvu.  
Protseduur  
S. cerevisiae  tüvede töötlus sooritatakse tavaliselt vedeltesti meetodil, 
kasutatakse latentseid või paljunevaid rakke. Algsed katsed tuleks 
teha paljunevate rakkudega. 1-5 x 10  7 rakku/ml eksponeeritakse 
testitavale kemikaalile kuni 18 tunniks temperatuuril 28–37  o C loksu­
tades; piisav kogus metabolismi aktiveerivat süsteemi lisatakse tööt ­
luse käigus sobilikul ajahetkel.  
Töötluse lõpus rakud tsentrifugeeritakse, pestakse ja külvatakse sobi ­
vale rakusöötmele. Pärast inkubatsiooni hinnatakse alusklaase 
rakkude elulemuse ja mitootilise rekombinatsiooni induktsiooni osas.  
Kui esimene katse on negatiivne, tuleks teha teine katse, kasutades 
latentse faasi rakke. Kui esimene katse on positiivne, kinnitatakse see sõltumatu uuringuga.
 
2. ANDMED  
Andmed tuleks esitada tabelis, näidates ära loendatud kolooniate 
arvu, rekombinantide arvu, elulemuse ja rekombinantide sagedus.  
Tulemused tuleks kinnitada sõltumatu uuringuga.  
Andmeid tuleks töödelda sobivaid statistilisi meetodeid kasutades.  
3. ARUANNE  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— kasutatud tüvi;  
— katsetingimused: latentse faasi või paljunevad rakud, kultuuri 
koostis, inkubatsiooni temperatuur ja kestus, metabolismi akti ­
veeriv süsteem;  
— töötluse tingimused: ekspositsiooni kontsentratsioon, meetod ja 
töötluse kestus, töötluse temperatuur, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;
 
— loendatud kolooniate arv, rekombinantide arv, elulemus ja 
rekombinantide sagedus, doosi/vastuse suhe (kui oluline), 
andmete statistiline hinnang;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGEENSUS —  IN VITRO  IMETAJATE RAKKUDE 
GEENMUTATSIOONKATSE  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 476,  In Vitro  Mamma­
lian Cell Gene Mutation Test (1997).  
1.1. SISSEJUHATUS  
In vitro  imetajate rakkude geenmutatsioonkatset saab kasutada 
keemiliste ainete põhjustatud geenmutatsioonide avastamiseks. Sobi ­
vate rakuliinide hulka kuuluvad hiire lümfoomirakud L5178Y, hiina 
hamstri rakuliinid CHO, CHO-AS52 ja V79 ning inimeste lümfo ­
blastoidrakud TK6 (1). Kõnealustes rakuliinides enim kasutatavad geneetilised lõpp-punktid mõõdavad mutatsioone tümidiinkinaasi- (TK) ja hüpoksantiin-guaniinfosforibosüültransferaasil (HPRT) ja 
ksantiin-guaniinfosforibosüültransferaasil (XPRT). TK-, HPRT-ja 
XPRT-mutatsiooni katsed avastavad erinevaid geneetilisi juhtumeid. TK ja XPRT autosomaalne asukoht võimaldab avastada geneetilisi juhtumeid (nt suuri deletsioone), mida ei avastata X-kromosoomides 
HPRT-lookuses (2, 3, 4, 5, 6).
 
In vitro  imetajate rakkude geenmutatsioonkatses saab kasutada kind ­
lakskujunenud rakuliinide või rakutüvede kultuure. Kasutatavad rakud valitakse kultuuris kasvamisvõime ja nende spontaanse mutat ­
sioonisageduse stabiilsuse põhjal.
 
Tehtud  in vitro  katsed üldjuhul nõuavad eksogeenset metaboolset 
aktiveerimist. Kõnealune metaboolse aktiveerimise süsteem ei saa 
tervenisti jäljendada  in vivo  tingimusi imetajates. Tuleks hoolikalt 
vältida tingimusi, mille tulemused ei peegelda neile omaseid muta ­
geensusi. Positiivsed tulemused, mis ei peegelda omast mutageen ­
sust, võivad tekkida pH, osmolaalsuse või tsütotoksilisuse kõrgete 
tasemete muutuste põhjal (7).  
Kõnealust katset kasutatakse imetajate võimalike mutageenide ja 
kantserogeenide skriinimiseks. Mitmed ühendid, mis annavad posi ­
tiivseid tulemusi kõnealuses katses, on imetajate kantserogeenid; 
siiski ei ole kõnealuse katse ja kantserogeensuse vahel täielikku 
korrelatsiooni. Korrelatsioon sõltub keemilisest aineklassist ning üha suuremal arvul esineb kantserogeene, mida ei avastata käesoleva katse abil, kuna need toimivad muude, mittegenotoksiliste mehhanis ­
mide või bakterirakkudes puuduvate mehhanismide abil (6).
 
Vt ka üldist sissejuhatust B osas.  
1.2. MÕISTED  
Päripidine mutatsioon:  geenimutatsioon parentaalset tüüpi mutant ­
vormist, mille tulemusena kodeeritud valk kaotab ensümaatilise 
aktiivsuse või seda ensümaatilist aktiivsust muudetakse.  
Aluspaari asendust põhjustavad mutageenid:  ained, mis põhjus ­
tavad ühe või mitme aluspaari asendust DNAs.  
Raaminihke mutageenid:  ained, mis põhjustavad ühe või mitme 
aluspaari lisamist või deletsiooni DNA-molekulis.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Fenotüübi ekspressiooniaeg:  periood, mille jooksul muutmata 
geeniproduktid lahkuvad äsja muteerunud rakkudest.  
Mutatsioonsagedus:  vaadeldud mutantrakkude arv, mis on jagatud 
elujõuliste rakkude arvuga.  
Suhteline kogukasv:  rakkude arvu suurenemine ajas võrrelduna 
rakkude kontrollpopulatsiooniga; arvutatud korrutisena, mille teguri ­
teks on suspensioonikasv negatiivse kontrollkatse suhtes ja klooni ­
misefektiivsus negatiivse kontrollkatse suhtes.  
Suhteline suspensioonikasv:  rakkude arvu suurenemine ekspres ­
siooniperioodi jooksul võrreldes negatiivse kontrollkatsega.  
Elujõulisus:  töödeldud rakkude kloonimisefektiivsus valiktingi ­
mustel plaatidele paigutamisel pärast ekspressiooniperioodi.  
Ellujäämine:  töödeldud rakkude kloonimisefektiivsus plaatidele 
paigutamisel töötlemisperioodi lõpus; ellujäämist väljendatakse tava ­
liselt rakkude kontrollpopulatsiooni elujäämise suhtes.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Rakud, millel TK  +/- —> TK  -/- -mutatsiooni tulemusel puudub tümi ­
diinkinaas (TK), on resistentsed pürimidiini analoogi trifluorotümi ­
diini (TFT) tsütotoksiliste mõjude suhtes. Tümidiinkinaasi suhtes spetsiifilised rakud on tundlikud TFT-le, mis takistab rakuainevahe ­
tust ja peatab edasise raku jagunemise. Seega mutantrakud on võime ­
lised TFT esinemise korral vohama, samal ajal kui normaalsed rakud, milles on tümidiinkinaas, ei voha. Analoogiliselt valitakse HPRT- või XPRT-defitsiidiga rakud 6-tioguaniinile (TG) või 8- 
asaguaniinile (AG) resistentsuse alusel. Uuritava aine omadusi 
tuleb hoolikalt arvesse võtta, kui testitakse selektiivainega seotud alusanaloogi või ühendit mis tahes imetajate rakkude geenimutat ­
siooni katsetes. Näiteks tuleb uurida uuritava aine võimalikku kaht ­
lustatavat selektiivset toksilisust mutantsetes või mittemutantsetes 
rakkudes. Valikusüsteemi/aine efektiivsust tuleb kinnitada, testides selektiivainega lähedase struktuuriga kemikaale (8).
 
Suspensioonis või monokihilises kultuuris olevad rakud allutatakse 
uuritava aine toimele, nii koos metaboolse aktiveerimisega kui ka ilma selleta, sobiva aja jooksul ning tsütotoksilisuse määramiseks külvatakse rakud ümber võimaldamaks fenotüübi avaldumist enne 
mutandi valikut (9, 10, 11, 12, 13). Tavaliselt määratakse tsütotok ­
silisus suhtelise kloonimisefektiivsuse (ellujäämise) või suhtelise rakkude kogukasvu mõõtmisega pärast töötlemisperioodi. Töödeldud katsekultuure hoitakse kasvukeskkonnas piisava aja jooksul, mis on 
igale valitud lookusele ja rakutüübile iseloomulik, võimaldamaks 
saavutatud mutatsioonide fenotüüpide avaldumist võimalikult lähedal optimaalsele tasemele. Mutatsioonisagedus määratakse teadaoleva arvu rakkude külvamisel söötmesse, mis sisaldab selektiivainet, 
millega avastatakse mutantrakud, ja söötmesse, milles pole selektii ­
vainet kloonimisefektiivsuse (elujõulisuse) määramiseks. Pärast piisavat inkubatsiooniaega loendatakse kolooniad. Mutatsioonisa ­
gedus saadakse selektiivses kasvukeskkonnas olevate mutantkoloo ­
niate arvu ja mitteselektiivses keskkonnas olevate kolooniate arvu 
alusel.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Ettevalmistused  
1.4.1.1.  Rakud  
Käesolevas katses kasutatakse erinevaid rakutüüpe, sh L5178Y, 
CHO, CHO-AS52, V79 või TK6 rakkude subkloone. Käesolevas 
katses kasutatavad rakutüübid on näidanud tundlikkust keemiliste mutageenide suhtes, suurt kloonimisefektiivsust ja stabiilset spon ­
taanset mutatsioonsagedust. Rakkudes kontrollitakse mükoplasma 
saastatust ja saastumise korral ei tohiks neid kasutada.
 
Katsed tuleb kavandada etteantud tundlikkusest ja usaldusväärsusest 
lähtudes. Rakkude, kultuuride ja uuritava aine kontsentratsioonide 
arv peaks peegeldama neid määratletud parameetreid (14). Töötle ­
mise järel ellu jäänud ja igas katsefaasis kasutatavate elujõuliste rakkude minimaalne arv peaks põhinema spontaansel mutatsioonsa ­
gedusel. Üldjuhendiks on see, et rakkude arv on vähemalt kümne ­
kordse spontaanse mutatsioonsageduse pöördväärtus. On soovitatav kasutada vähemalt 10
 6 rakku. Kasutatava rakusüsteemi kohta peab 
olema piisavalt varasemaid andmeid, mis viitavad katse efektiivsuse 
vastavusele.  
1.4.1.2.  Kasvukeskkonnad ja söötmed  
Tuleks kasutada sobivaid kasvukeskkondasid ja inkubatsioonitingi ­
musi (kasvuanumad, temperatuur, CO  2 kontsentratsioon ja niiskus). 
Kasvukeskkonnad tuleks valida vastavalt katses kasutatavatele vali ­
kusüsteemidele ja rakutüüpidele. On eriti tähtis, et kasvutingimused valitakse nii, et tagatakse rakkude optimaalne kasv ekspressioonipe ­
rioodi ajal ning nii mutantsete kui mittemutantsete rakkude võime 
moodustada kolooniaid.
 
1.4.1.3.  Rakukultuuride ettevalmistamine  
Rakud paljundatakse tüvekultuuridest, mis on külvatud kasvukesk ­
konda ja inkubeeritud 37  o C juures. Enne käesoleva katse tegemist 
tuleb kultuurid puhastada varasematest mutantrakkudest.  
1.4.1.4.  Metaboolne aktiveerimine  
Rakud allutatakse uuritava aine toimele nii vastava metaboolse akti ­
veerimissüsteemi olemasolu kui ka puud umise korral. Enim kasu ­
tatav süsteem on ensüüme indutseerivate ainetega, nt Aroclor 1254- 
ga (15, 16, 17, 18) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooni seguga (19, 
20), töödeldud näriliste maksast valmistatud postmitokondriaalne osa (S9), millele on lisatud kofaktor.
 
Tavaliselt kasutatakse postmitokondriaalset fraktsiooni kontsentrat ­
sioonis 1–10 mahuprotsenti lõplikus katsekeskkonnas. Metaboolse aktiveerimissüsteemi valik ja tingimused võivad sõltuda uuritava 
aine keemilisest aineklassist. Mõnel juhul on vaja kasutada rohkem 
kui üht postmitokondriaalse fraktsiooni kontsentratsiooni.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Osade meetodite korral, sh geneetiliselt muudetud rakuliini saamine, 
mis ekspresseerib spetsiifilisi aktiveerimisensüüme, võib avalduda 
endogeense aktiveerimise võime. Kasutatavate rakuliinide valik peab olema teaduslikult põhjendatud (nt tsütokroom P450 isoen ­
süümi tähtsus uuritava aine metabolismil).
 
1.4.1.5.  Uuritav aine/ettevalmistused  
Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates 
lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne 
rakkude töötlemist. Vedelad uuritavad ained võib lisada vahetult 
katsesüsteemidesse ja/või lahjendada enne töötlemist. Tuleks kasu ­
tada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
 
1.4.2.  Katsetingimused  
1.4.2.1.  Lahusti/kandjaaine  
Lahusti/kandjaaine ei tohiks uuritava ainega keemiliselt reageerida 
ning see peaks sobima rakkude eluvõimelisuse ja S9 aktiivsusega. Kui kasutatakse tuntud lahustist/kandjaainest erinevat, siis peab selle kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovi ­
tatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahusti/-kandjaaine 
kasutamist. Vees ebapüsivate ainete uurimisel kasutatavad orgaani ­
lised lahustid peavad olema veevabad. Vett saab eemaldada moleku ­
laarsõelte lisamisega.
 
1.4.2.2.  Toimimiseks kasutatavad kontsentratsioonid  
Suurima kontsentratsiooni määramisel on arvestatavad kriteeriumid 
tsütotoksilisus, lahustuvus katsesüsteemis ning pH või osmolaalsuse 
muutused.  
Tsütotoksilisus määratakse põhikatses kindlaks nii metaboolse akti ­
veerimisega kui ka ilma selleta, kasutades sobivaid rakkude puhtuse ja kasvu indikaatoreid, nt suhtelist kloonimisefektiivsust (ellujää ­
mine) või suhtelist kogukasvu. Tsütotoksilisust ja lahustuvust võib 
olla kasulik määrata eelkatses.
 
Tuleks kasutada vähemalt nelja analüüsitavat kontsentratsiooni. Kui 
esineb tsütotoksilisust, peaksid need kontsentratsioonid katma vahe ­
miku suurimast kontsentratsioonist vähimani või sellise kontsentrat ­
sioonini, mille korral mürgisus puudub; mis tavaliselt tähendab seda, et kontsentratsioonide erinevus üksteisest võib olla mitte rohkem kui vahemikus 2 kuni √10 asuv koefitsient. Kui maksimaalne kontsen ­
tratsioon põhineb tsütotoksilisusel, siis on selle tulemuseks ligikaudu 
10–20 % (aga mitte vähem kui 10 %) suhteline ellujäämine (suhte ­
line kloonimisefektiivsus) või suhteline kogukasv. Suhteliselt mitte ­
tsütotoksiliste ainete puhul peaks suurim katsekontsentratsioon olema 
5 μl/ml, 5 mg/ml või 1,01 M, selle järgi, olenevalt sellest, milline 
neist on väikseim.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Suhteliselt lahustumatute ainetega tehakse katseid kasvukeskkonna ­
tingimustes kuni lahustuvuspiirini või üle selle. Lahustumatus määra ­
takse lõplikus katsekeskkonnas, kuhu on rakud paigutatud. On kasulik hinnata lahustuvust töötlemise alguses ja lõpus, kuna katse ­
süsteemis võib lahustuvus töötlemise ajal muutuda rakkude, S9- 
seerumi jms mõjul. Lahustumatust saab avastada palja silmaga. 
Sadestus ei tohiks mõjutada tulemust.
 
1.4.2.3  Kontrollkatsed  
Igas uuringus kasutatakse paralleelseid positiivseid ja negatiivseid 
(lahusti või kandjaaine) kontrollkatseid nii koos metaboolse aktivee ­
rimisega kui ka ilma selleta. Kui kasutatakse metaboolset aktiveeri ­
mist, käsitatakse positiivse kontrollainena sellist kemikaali, mis eeldab aktiveerimist mutageense reaktsiooni saamiseks.
 
Positiivsete kontrollainete näited:  
Metaboolse aktivee ­
rimise tingimus Lookus Aine CAS nr EINECSi nr  
Eksogeense meta ­
boolse aktiveeri ­
mise puudumine HPRT Etüül-metaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 
N-etüül-N-nitrosokarbamiid 759-73-9 212-072-2 
TK (väikesed 
ja suured 
kolooniad) Metüül-metaansulfonaat 66-27-3 200-625-0 
XPRT Etüül-metaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 
N-etüül-N-nitrosokarbamiid 759-73-9 212-072-2 
Eksogeense meta ­
boolse aktiveeri ­
mise olemasolu HPRT 3-metüülkolantreen 56-49-5 200-276-4 
Dimetüülnitrosoamiin 62-75-9 200-549-8 7,12-dimetüülbensantratseen 57-97-6 200-359-5 
TK (väikesed 
ja suured 
kolooniad) Tsüklofosfamiid 50-18-0 200-015-4 
Tsüklofosfamiidmonohüdraat 6055-19-2 Benso(α)püreen 50-32-8 200-028-5 
3-metüülkolantreen 56-49-5 200-276-5 
XPRT Dimetüülnitrosoamiin (S9 kõrge 
taseme jaoks) 62-75-9 200-549-8 
Benso(α)püreen 50-32-8 200-028-5
 
Muid sobivaid positiivse kontrolli võrdlusaineid võib kasutada nt 
siis, kui laboril on andmebaas 5-bromo-2'-desoksüuridiini kohta (CASi nr 59-14-3, EINECSi nr 200-415-9), siis võib samuti kasutada kõnealust võrdlusainet. Lähedasse keemilisse aineklassi kuuluvate 
positiivsete kontrollkemikaalide kasutamist tuleks kaaluda, kui 
selline aine on kättesaadav.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Negatiivsed kontrollid, mis koosnevad üksnes kasvukeskkonnas 
olevast lahustist või kandjaainest ning mida on käsitletud samal viisil 
kui katserühma, peaksid sisalduma. Lisaks sellele käsitletakse ka manustamata kontrollaineid, välja arvatud juhul, kui varasemad andmed kontrollaine kohta näitavad, et valitud lahustil ei ole kahju ­
likke ega mutageenseid mõjusid.
 
1.4.3.  Menetlus  
1.4.3.1.  Vastuvõtlikkus uuritavale ainele  
Rakukultuure manustatakse uuritavale ainele koos metaboolse akti ­
veerimisega ja ilma selleta. Manustamisaeg peab olema sobiv (efek ­
tiivne aeg on tavaliselt 3–6 tundi). Manustamist võidakse jätkata ühe või mitme rakutsükli jooksul.
 
Igal uuritaval kontsentratsioonil võib kasutada kas kahte paralleelset 
või ühte kultuuri. Kui kasutatakse üksikkultuure, peaks kontsentrat ­
sioonide arv tõusma, et tagada analüüsitavate kultuuride piisav arv (nt vähemalt 8 analüüsitavat kontsentratsiooni). Tuleks kasutada paralleelseid negatiivseid (lahusti) kontrollkultuure.
 
Gaasilisi või lenduvaid aineid uuritakse sobiva meetodi abil, näiteks 
suletud kasvuanumates (21, 22).  
1.4.3.2.  Ellujäämise, elujõulisuse ja mutatsioonisageduse mõõtmine  
Manustamisperioodi lõpus rakud pestakse ja kultiveeritakse ellujää ­
mise määramiseks ja mutantse fenotüübi avaldumise võimaldami ­
seks. Tsütotoksilisuse suhtelise kloonimisefektiivsuse (ellujäämise) 
või suhtelise rakkude kogukasvu mõõtmise määramine algatatakse tavaliselt pärast manustamisperioodi.
 
Iga lookus on kindlaksmääratud minimaalse ajaga, et värskelt 
põhjustatud mutantide fenotüüpide avaldumine oleks lähedal opti ­
maalsele (HPRT ja XPRT eeldab vähemalt 6–8 päeva ja TK vähe ­
malt kahte päeva). Rakud kasvatakse selektiivse(te) aine(te)ga söötmes mutantide arvu ja ilma selektiivse(te) aine(te)ta söötmes 
kloonimisefektiivsuse määramiseks. Elujõulisuse mõõtmine (kasuta ­
takse mutatsioonisageduse arvutamiseks) algatatakse avaldumisaja lõpus, asetades rakke mitteselektiivsesse söötmesse.
 
Kui uuritav aine on positiivne L5178Y TK  +/- katses, tuleks koloo ­
niate arv määrata vähemalt ühes uuritavas kultuuris (suurim posi ­
tiivne kontsentratsioon) ning negatiivsetes ja positiivsetes kontrol ­
lides. Kui uuritav aine on negatiivne L5178Y TK  +/- katses, tuleks 
kolooniate arv määrata negatiivsetes ja positiivsetes kontrollides. 
Uurimustes, kus kasutatakse TK6TK  +/- , võidakse samuti kolooniate 
arvu määrata.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Tulemuste hulgas peaksid olema tsütotoksilisuse ja elujõulisuse 
määramine, kolooniate arv ja mutatsioonisagedused katse- ja kont ­
rollkultuuride kohta. L5178Y TK  +/- katse positiivse vastuse korral 
loendatakse kolooniad, kasutades selles väikeste või suurte koloo ­
niate kriteeriume uuritava aine vähemalt ühel kontsentratsioonil (suurim positiivne kontsentratsioon) ning negatiivses ja positiivses 
kontrollis. Nii suurte kui ka väikeste kolooniate mutantide moleku ­
laarset ja tsütogeenilist olemust on uuritud täpsemalt (23, 24). TK
 +/- 
katses loendatakse kolooniad, kasutades normaalse kasvuga (suurte) 
ja aeglase kasvuga (väikeste) kolooniate kriteeriumeid (25). 
Mutantsed rakud, millel on kõige ulatuslikum geneetiline kahjustus, on pikendanud kahekordistumise aega ja seetõttu moodustavad väikeseid kolooniaid. Kõnealune kahjustus ulatub tüüpiliselt kogu 
geeni kaotamisest kuni karüotüüpiliselt nähtavate kromosoomide 
aberratsioonideni. Väikese koloonia mutantide moodustamine on seotud keemiliste ainetega, mis põhjustavad suuri kromosoomaber ­
ratsioone (26). Vähem tõsiselt mõjutatud mutantrakud kasvavad 
kiirusel, mis on sarnane parentaalsete rakkudega ja moodustavad 
suuri kolooniaid.
 
Ellujäämine (suhtelised kloonimisefektiivsused) või suhteline kogu ­
kasv on ära toodud. Mutatsioonisagedust väljendatakse mutantrak ­
kude arvuga ellujäänud rakkude arvu kohta.  
Tulemused esitatakse iga üksiku kultuuri kohta. Lisaks esitatakse 
kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul.  
Selget positiivset vastust ei ole vaja kontrollida. Ebaselgeid tulemusi 
tuleks selgitada täiendaval uurimisel meelepäraselt muudetud katse ­
tingimustes. Negatiivseid tulemusi kinnitatakse igal üksikjuhul eraldi. 
Neil juhtudel, kui negatiivsete tulemuste kinnitamist ei peeta vajali ­
kuks, esitatakse põhjendus. Katse parameetrite muutmist hinnatud tingimuste vahemiku suurendamiseks tuleks arvesse võtta ebaselgete 
või negatiivsete tulemuste järelkatsetel. Katse selliste parameetrite, 
mida võidakse muuta, hulka kuuluvad kontsentratsioonivahemik ja metaboolse aktiveerimise tingimused.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
On mitmeid kriteeriume positiivse tulemuse määramiseks, nagu nt 
mutatsioonisageduse kontsentratsiooniga seotud suurenemine või 
paljundamine. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetu ­
lemuste hindamisel. Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav 
tegur positiivse vastuse jaoks.
 
Uuritavat ainet, mille puhul tulemused ei vasta eespool toodud 
kriteeriumidele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas 
katses.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tule ­
mused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate 
otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata.
 
Positiivsed tulemused  in vitro  imetajate rakkude geenmutatsiooni 
katses viitavad sellele, et uuritav aine põhjustab geenmutatsioone 
kasutatud kultiveeritud imetajate rakkudes. Paljundatav positiivne kontsentratsiooni ja toime suhe on kõige tähelepanuväärsem. Nega ­
tiivsed tulemused viitavad sellele, et katsetingimuste põhjal ei 
põhjusta uuritav aine geenmutatsioone kasutatud kultiveeritud imeta ­
jate rakkudes.
 
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Lahusti/kandjaaine:  
— kandjaaine/lahusti valiku põhjendamine;  
— uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on 
teada.  
Rakud:  
— rakkude tüüp ja allikas;  
— rakukultuuride arv;  
— raku passaažide arv, vajaduse korral;  
— rakukultuuri säilitamise meetodid, vajaduse korral;  
— mükoplasma puudumine.  
Katsetingimused:  
— kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, 
sh nt tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud, kui need on olemas;
 
— kasvukeskkonna koostis, CO  2 kontsentratsioon;  
— uuritava aine kontsentratsioon;  
— lisatud kandjaaine ja uuritava aine hulk;  
— inkubatsioonitemperatuur;  
— inkubatsiooniaeg;  
— manustamise kestus;  
— rakutihedus manustamise ajal;  
— metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle heaks ­
kiitmise kriteeriumid;  
— positiivsed ja negatiivsed kontrollid;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— avaldumisperioodi pikkus (sh külvatud rakkude arv, subkultuurid 
ja söötmiskavad, vajaduse korral);  
— selektiivsed ained;  
— kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, 
negatiivseteks või ebaselgeteks;  
— meetodid elujõuliste ja mutantrakkude loendamiseks;  
— kolooniate kindlakstegemine, kus kolooniate arvu ja tüüpi 
võetakse arvesse (sh „väikeste” ja „suurte” kolooniate kritee ­
riumid, vajaduse korral).  
Tulemused:  
— toksilisuse tunnused;  
— sadestuse tunnused;  
— teave pH ja osmolaalsuse kohta uuritavale ainele vastuvõtlikkuse 
ajal, kui see on määratud;  
— koloonia suurus, kui see on arvutatud vähemalt negatiivsetest ja 
positiivsetest kontrollidest;  
— labori valmisolek väikeste mutantide kolooniate avastamiseks 
L5178Y TK  +/- süsteemi abil, vajaduse korral;  
— doosi ja toime suhe, võimaluse korral;  
— võimalikud statistilised analüüsid;  
— paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kont ­
rollide tulemused;  
— varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kont ­
rollide andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;  
— mutatsioonisagedus.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, K. 
R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutage ­
nesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
2) Chu, E. H. Y. and Mailing H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
61, pp. 1306–1312.
 
3) Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467–485.
 
4) Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dear ­
field, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the 
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 
4, pp. 394–403.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
5) Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six 
Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121–128.  
6) Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 
235–239.
 
7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147–204.
 
8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and 
Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in 
L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental 
Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225–251.
 
9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/ ­
Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to 
Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections Agency Gene- Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17–36.
 
10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. 
F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of 
the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosp ­
horibosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135–141.
 
11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Compa ­
rison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9–17.
 
12) Stankowski, L. F. Jr., Tindal, K. R., and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate – and ICR 191 -Induced Molecular Analyses of Ethyl 
Methanosulphonate – and lCR 191 Induced Mutation in AS52 
Cells, Mutation Res., 160, pp. 133–147.  
13) Turner, N. T, Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for 
the L5178Y/TK  +/ „— TK  +/ " Mouse Lymphoma Cell Mutageni ­
city Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutage ­
nicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, 
pp. 239–268.  
14) Ariett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mamma ­
lian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, 
D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66–101.
 
15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365–373.
 
16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, 
pp. 347–364.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the 
L5178Y/TK  + '” – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, 
Mutat. Res. 59, pp. 61–108.  
18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173–215.
 
19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genoto ­
xicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175–177.
 
20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polycholri-nated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Meta ­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North- 
Holland, pp. 85–88.
 
21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91–103.
 
22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells 
Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Muta ­
gens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795–801.
 
23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and 
Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51–55.
 
24) Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, 
A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trif ­
luoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK  + '" – 
Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161–174.  
25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 
89–102.
 
26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient 
Mutant Frequency in L5178Y/TK  + '" – 3.7.2C Mouse Lymp ­
homa Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609–614.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  DNA KAHJUSTAMINE JA PARANDAMINE – PLAANIVÄLINE 
DNA SÜNTEES – IMETAJATE RAKKUDEL  IN VITRO  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Plaanivälise DNA sünteesi (PDS) test mõõdab DNA reparatiivset 
sünteesi pärast keemiliste ja füüsikaliste tegurite poolt kahjustatud DNA segmendi väljalõikamist. Test põhineb triitiumiga märgistatud tümidiini (
 3 H-TdR) sisestamisel sünteesifaasis (S) mitte oleva imeta ­
jaraku DNAsse. Radioaktiivse tümidiini (  3 H-TdR) seondumist 
töödeldud rakkude DNAga võib määrata autoradiograafiliselt või vedelik-stsintillatsiooniloenduri (VSL) abil. Imetajarakkude kultuuri, juhul kui ei kasutata primaarseid roti hepatotsüüte, töödeldakse uuri ­
tava ainega nii ilma kui ka koos eksogeense metaboolse aktivatsioo ­
nisüsteemiga. PDSi võib mõõta ka  in vivo  süsteemides.
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
Analüüsis kasutamiseks tuleb uuritavad kemikaalid ja kontroll- või 
võrdlusained valmistada söötmes või suspendeerida vastavatesse lahustitesse ja seejärel lahustada söötmes. Lahuse lõppkontsentrat ­
sioon ei tohiks mõjutada rakkude eluvõimelisust.
 
Analüüsiks võib kasutada roti hepatotsüütide primaarkultuuri, 
inimese lümfotsüüte või püsiliini rakke (nt inimese diploidseid fibro ­
blaste).  
Rakke tuleb eksponeerida uuritavale kemikaalile nii vastava meta ­
boolse aktivatsioonisüsteemi olemasolul kui ka ilma selleta.  
Katsetingimused  
R a k u k u l t u u r i d e a r v  
Igas eksperimendi lõigus on vajalikud vähemalt kaks rakukultuuri 
autoradiograafia jaoks ja kuus kultuuri (või vähem, kui see on 
teaduslikult põhjendatud) VSLi abil PDSi määramise jaoks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
N e g a t i i v s e t e j a p o s i t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Igasse eksperimenti peaks olema kaasatud sobiv positiivne ja nega ­
tiivne (töötlemata ja/või lahusti) kontroll nii aktivatsioonisüsteemi olemasolu korral kui ka ilma selleta.
 
Positiivseteks kontrollideks roti hepatotsüütide analüüsil võivad olla 
näiteks kas 7,12-dimetüülbensatratseen (7,12-DMBA) või 2-atsetüü ­
laminofluoreen (2-AAF). Püsiliini rakkude puhul võib 4-nitrokino ­
liin-N-oksiid (4-NQO) olla positiivseks kontrolliks nii autoradio ­
graafia kui ka VSLi analüüsi puhul, mis tehakse ilma metaboolse 
aktivatsioonita; N-dimetüülnitroosamiin on positiivse kontrolli näiteks sel juhul, kui kasutatakse metaboolset aktivatsioonisüsteemi.
 
K a s u t a t a v a d k o n t s e n t r a t s i o o n i d  
Kasutada tuleb uuritava aine palju erinevaid kontsentratsioone 
piirides, mis võimaldaksid välja selgitada selle aine toime. Kõige 
kõrgem kontsentratsioon peaks esile kutsuma mõningaid tsütotoksi ­
lisi toimeid. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid ühendeid tuleks uurida kuni nende veeslahustuvuse piirini. Vabalt vees lahustuvate 
mittetoksiliste kemikaalide ülemine testitav piirikontsentratsioon 
tuleb määrata igal üksikjuhul eraldi.
 
R a k u d  
Säilituskultuurides tuleb kasutada sobivat söödet, CO  2 kontsentrat ­
siooni ja temperatuuri. Püsiliini rakke tuleb perioodiliselt kontrollida 
mükoplasmaga kontamineerituse suhtes.  
M e t a b o o l n e a k t i v e e r i m i n e  
Metaboolse aktivatsiooni süsteemi ei kasutata hepatotsüütide 
primaarkultuuris. Püsiliini rakkude ja lümfotsüütide puhul eksponee ­
ritakse neid uuritavale ainele nii vastava metaboolse aktivatsiooni 
süsteemi olemasolu korral kui ka selle puudumisel.  
Protseduur  
R a k u k u l t u u r i d e v a l m i s t a m i n e  
Püsiliini rakud saadakse tüvikultuurist (nt selle trüpsiniseerimisel või 
lahtiraputamisel), külvatakse kultiveerimisnõusse vastaval tihedusel ja inkubeeritakse + 37
 o C juures.  
Roti hepatotsüütide lühiajalised kultuurid saadakse, kui värskelt 
üksteisest eraldatud hepatotsüütidel lastakse vastavas söötmes kinni ­
tuda kasvupinnasele.  
Inimese lümfotsüütide kultuurid valmistatakse selleks ette nähtud 
viisil.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
R a k u k u l t u u r i d e t ö ö t l e m i n e u u r i t a v a t e a i n e t e g a  
Primaarsed roti hepatotsüüdid  
Värskelt isoleeritud roti hepatotsüüte töödeldakse uuritava ainega 
ettenähtud aja jooksul radioaktiivset tümiini  3 H-TdR sisaldavas 
söötmes. Töötluse lõpus eemaldatakse rakkudelt sööde, nad loputa ­
takse, fikseeritakse ja kuivatatakse. Alusklaasid kastetakse kiirgus ­
tundlikku vedelasse emulsiooni (alternatiivselt võib kasutada kile- emulsiooni), eksponeeritakse, ilmutatakse, värvitakse ja loendatakse.
 
Püsiliini rakud ja lümfotsüüdid  
Autoradiograafilised tehnikad: pärast töötlemist  3 H-TdR-ga alluta ­
takse rakukultuurid ettenähtud ajaks uuritava aine toimele. Toimeaja 
kestus sõltub aine omadustest, metaboolsete süsteemide aktiivsusest 
ja rakutüübist. Et kindlaks määrata PDSi maksimaaltulemust, tuleks  
3 H-TdR-i lisada kas samal ajal uuritava ainega või mõne minuti 
jooksul pärast kokkupuudet uuritava ainega. Protseduuri valikut 
mõjutab võimalik koosmõju uuritava aine ja  3 H-TdR-i vahel. Selleks, 
et eristada PDSi semikonservatiivsest DNA replikatsioonist, võib viimase inhibeerida näiteks kas arginiin-defitsiitset söödet, madala seerumisisaldusega või hüdroksüuureat sisaldavat rakukultuuri söödet 
kasutades.
 
PDSi mõõtmine VSLi abil: enne uuritava ainega töötlemist tuleb 
blokeerida rakkude sisenemine S-faasi, nagu ülalpool kirjeldatud; 
seejärel tuleb rakke eksponeerida testitavale kemikaalile nagu auto ­
radiograafia puhul. Inkubatsiooniaja lõpus tuleb DNA rakkudest eral ­
dada ja määrata kogu DNA hulk ning  3 H-TdR-ga liitumise ulatus.  
Tuleb märkida, et kui ülalkirjeldatud meetodi puhul kasutatakse 
inimese lümfotsüüte, siis ei ole stimuleerimata kultuurides semi- 
konservatiivse DNA replikatsiooni mahasurumine vajalik.  
Analüüs  
A u t o r a d i o g r a a f i l i s e d m ä ä r a m i s e d  
PDSi määramisel rakukultuuris S-faasis olevaid rakutuumi ei loen ­
data. Iga erineva kontsentratsiooni kohta tuleb loendada vähemalt 50 
rakku. Alusklaasid tuleb enne loendamist kodeerida. Igal alusklaasil tuleb loendada mitu eraldi asetsevat juhuslikult valitud välja. Seon ­
dunud
 3 H-TdR-i kogus tsütoplasmas tuleb määrata, loendades igas 
loendatava raku tsütoplasmas kolm rakutuuma suurust ala.  
V S L i m ä ä r a m i s e d  
VSLi PDSi määramisel tuleb kasutada iga erineva kontsentratsiooni 
ja kontrolli puhul adekvaatset kultuuride arvu.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Kõiki andmeid tuleb kinnitada sõltumatu katsega.  
2. ANDMED  
Andmed tuleb esitada tabelina.  
2.1. AUTORADIOGRAAFILISED MÄÄRAMISED  
3 H-TdR-i tsütoplasmasse seondumise ulatus ja rakutuumalt leitud 
hõbedaterade arv tuleb eraldi registreerida.  
3 H-TdR-i tsütoplasmaga seondumuse ulatuse ja tuuma kohta tuleva 
hõbedaterade arvu kirjeldamiseks võib kasutada keskmist näitajat, 
mediaani ja moodväärtust.  
2.2. VSLI MÄÄRAMISED  
VSLi määramisteks tuleb  3 H-TdR-i seondumist väljendada kui 
dpm/μg DNA. Seondumise jaotuse kirjeldamiseks võib kasutada 
näitajat keskmine dpm/ μg DNA koos standardhälbega.  
Andmeid tuleb hinnata vastavaid statistilisi meetodeid kasutades.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— kasutatud rakud, tihedus ja külvi number töötluse ajal, rakukul ­
tuuride arv;  
— rakukultuuride säilitamiseks kasutatud meetodid, sealhulgas 
rakkude sööde, temperatuur ja CO  2 kontsentratsioon;  
— uuritav aine, lahusti, kontsentratsioonid ja analüüsiks kasutatud 
kontsentratsioonide valiku põhjendus;  
— metaboolsete aktivatsioonisüsteemide detailid;  
— töötluste kava;  
— positiivsed ja negatiivsed kontrollid;  
— kasutatud autoradiograafilised meetodid;  
— rakkude S-faasi mineku blokeerimiseks kasutatud meetodid;  
— DNA eraldamiseks ja DNA koguhulga määramiseks VSLiga 
kasutatud tehnikad;  
— kus võimalik, anda doosi/vastuse suhe;  
— statistiline hinnang;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  ÕDEKROMATIIDI VAHETUSE  IN VITRO  ANALÜÜS  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Õdekromatiidi vahetuse (ÕKV) analüüs on lühiajaline test retsi ­
prooksete DNA vahetuste kindlakstegemiseks kahe õdekromatiidi vahel duplitseeruvas kromosoomis. ÕKV väljendab DNA replikat ­
siooniproduktide väljavahetamist ilmselt homoloogsetes lookustes. 
Eeldatavasti sisaldab see vahetusprotsess DNA ahela lõhkumist ja 
uuesti ühendamist, ehkki tema molekulaarsest olemusest on vähe teada. ÕKV määramine nõuab õdekromatiidide erinevat märgista ­
mist, mida võib teha bromodeoksüuridiini (BrdU) sisestamisega 
kromosomaalsesse DNAsse kahes rakutsüklis.
 
Imetajate rakud eksponeeritakse testitavale kemikaalile nii koos 
imetajate eksogeense metaboolse aktivatsioonisüsteemiga kui ka 
ilma selleta ja kultiveeritakse kahe replikatsiooni vältel BrdU-d sisal ­
davas meediumis. Pärast töötlust spindel-inhibiitoriga (nt kolhitsiin), et akumuleerida rakke mitoosi metafaasi staadiumis (c-metafaasis), 
rakud külvatakse ja kromosoomid prepareeritakse.
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. UURINGUMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
— Selles analüüsis võib kasutada primaarkultuure (inimese lümfot ­
süüte) või püsiliini rakke (nt hiina hamstri munasarja rakke). 
Püsiliini rakukultuure tuleb kontrollida mükoplasmaga kontami ­
neerumise suhtes.  
— Kasutada tuleks sobivat söödet ja inkubeerimise tingimusi (nt 
temperatuur, kultiveerimisnõud, CO  2 kontsentratsioon ja niiskus).  
— Uuritavad ained võib ette valmistada söötmes või suspendeerida 
nad vastavatesse lahustitesse enne rakkude töötlemist. Lahusti lõppkontsentratsioon rakukultuuris ei tohiks oluliselt mõjutada 
rakkude eluvõimelisust ega kasvukiirust ja selle mõju ÕKV sage ­
dusele tuleb jälgida lahustiga kontrollis.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Rakke tuleb eksponeerida uuritavale ainele nii eksogeense imeta ­
jate metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolu kui ka selle 
puudumise korral. Kui kasutatakse sisemist metaboolset aktiiv ­
sust omavaid rakutüüpe, peab selle aktiivsuse kiirus ja olemus olema vastavuses testitava kemikaalide klassi omadustega.
 
Katsetingimused  
R a k u k u l t u u r i d e a r v  
Igas eksperimendi lõigus tuleb kasutada vähemalt kahte kultuuri.  
N e g a t i i v s e t e j a p o s i t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Positiivseid kontrolle peab kaasama igasse katsesse, kasutades nii 
otseselt toimivat ühendit kui metaboolset aktiveerimist vajavat 
ühendit, ja samuti tuleb kontrollina kasutada lahustit.  
Järgnevalt on näitena ära toodud ained, mida võiks kasutada posi ­
tiivsete kontrollidena:  
— otseselt toimiv ühend:  
— etüülmetaansulfonaat;  
— kaudselt toimiv ühend:  
— tsüklofosfamiid.  
Sobivuse korral võib kasutada ka täiendavat positiivset kontrolli 
samast kemikaalide klassist, kust pärineb uuritav kemikaal.  
T e s t i m i s e k s k a s u t a t a v a d k o n t s e n t r a t s i o o n i d  
Tuleks kasutada vähemalt kolme erinevat uuritava aine kontsentrat ­
siooni. Kõige suurem kontsentratsioon peaks esile kutsuma olulise 
toksilise efekti, võimaldades samal ajal rakkudel siiski normaalselt jaguneda. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid aineid tuleks testida kuni lahustuvuse piirini, kasutades selleks sobivaid protseduure. 
Vabalt vees lahustuvate mittetoksiliste kemikaalide ülemine testitav 
piirikontsentratsioon tuleb määrata igal üksikjuhul eraldi.
 
Protseduur  
R a k u k u l t u u r i d e v a l m i s t a m i n e  
Püsiliini rakud saadakse tüvikultuurist (nt selle trüpsiniseerimisel või 
lahtiraputamisel), külvatakse kultiveerimisnõusse vastaval tihedusel 
ja inkubeeritakse 37  o C juures. Ühekihiliste rakukultuuride saamiseks 
peab olema rakkude arv kultiveerimisnõus viidud vastavusse nii, et kultuuride konfluentsus ei oleks külvamise ajal üle 50 %. Teiseks võimaluseks on rakkude kasvatamine suspensioonis. Inimese lümfot ­
süütide kultuurid valmistatakse hepariniseeritud verest vastavat 
tehnikat kasutades ja inkubeeritakse 37
 o C juures.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
T ö ö t l e m i n e  
Eksponentsiaalse kasvu faasis olevaid rakke töödeldakse ettenähtud 
aja jooksul uuritava ainega. Enamikul juhtudest võib 1–2 tundi olla piisav, kuid teatud juhtudel võib töötluse aeg ulatuda kuni kahe täieliku rakutsüklini. Rakud, millel puudub metaboolne aktiivsus, 
tuleb allutada testitavate kemikaalide toimele, tehes seda nii vastava 
metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolu korral kui ka selle puudumisel. Kokkupuuteaja lõpus pestakse rakud uuritavast ainest puhtaks ja kultiveeritakse BrdU juuresolekul kahe replikatsioonit ­
sükli ajaks. Teiseks võimaluseks on rakkude samaaegne kokkupuude 
uuritava aine ja BrdU-ga kahe rakutsükli vältel.
 
Inimese lümfotsüütide kultuure töödeldakse semisünkroonse 
seisundi ajal.  
Rakke analüüsitakse pärast töötlust aset leidva teise jagunemise ajal, 
tagades nii kõige tundlikumate rakutsükli staadiumide eksponeerituse kemikaalile. Kõiki kultuure, kuhu on lisatud BrdU, tuleb töödelda pimedas või hämaras hõõglambi valguses kuni rakkude külvamiseni, 
et viia miinimumini BrdU-d sisaldava DNA fotolüüs.
 
R a k k u d e k ü l v a m i n e  
Üks kuni neli tundi enne külvamist töödeldakse rakukultuure 
spindel-inhibiitoriga (nt kolhitsiin). Iga kultuur külvatakse ja töödel ­
dakse kromosoomide prepareerimiseks eraldi.  
K r o m o s o o m i d e p r e p a r e e r i m i n e j a v ä r v i m i n e  
Kromosoomide prepareerimiseks kasutatakse standardseid tsütoge ­
neetilisi meetodeid. Preparaate võib ÕKV näitamiseks värvida 
mitmel meetodil (nt fluorestsents pluss Giemsa meetod).  
A n a l ü ü s  
Analüüsitavate rakkude arv peab põhinema ÕKV spontaanse kont ­
rolli sagedusel. Tavaliselt analüüsitakse ÕKV kindlakstegemiseks vähemalt 25 hästi väljakujunenud metafaasi kultuuri kohta. Alus ­
klaasid kodeeritakse enne analüüsi. Inimese lümfotsüütide puhul 
analüüsitakse vaid 46 tsentromeeri sisaldavaid metafaase. Püsiliini 
rakkude puhul analüüsitakse modaalarvust ainult ± 2 tsentromeeri sisaldavaid metafaase. Tuleb ära näidata, kas tsentromeerse märgis ­
tuse lülitumist loetakse ÕKVks või ei. Tulemusi tuleb kinnitada 
sõltumatu katsega.
 
2. ANDMED  
Andmed tuleb esitada tabelis. ÕKVde arv iga metafaasi kohta ja 
ÕKVde arv kromosoomi kohta igas metafaasis tuleb märkida eraldi 
kõigi töödeldud ja kontrollkultuuride kohta.  
Andmeid tuleb hinnata vastavate statistiliste meetoditega.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— kasutatud rakud, rakukultuuride säilitamise meetodid;  
— katsetingimused: söötme koostis, CO  2 kontsentratsioon, uuritava 
aine kontsentratsioon, kasutatud lahusti, inkubeerimise tempera ­
tuur, töötluse aeg, kasutatud tuumakäävi inhibiitor, selle kontsen ­
tratsioon ja sellega töötlemise kestus, kasutatud imetajate aktivat ­
sioonisüsteemi tüüp, positiivsed ja negatiivsed kontrollid;  
— rakukultuuride arv igas katse lõigus;  
— mikroskopeeritavate preparaatide valmistamise tehnika üksikas ­
jad; 
— analüüsitud metafaaside arv (andmed iga kultuuri kohta eraldi);  
— keskmine ÕKV arv raku ja kromosoomi kohta (andmed iga 
kultuuri kohta eraldi);  
— kriteeriumid ÕKV hindamiseks;  
— annuste valiku põhjendus;  
— võimaluse korral anda annuse/vastuse reaktsiooni suhe;  
— statistiline analüüs;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  SUGULIITELISE RETSESSIIVSE LETAALSUSE TEST 
ÄÄDIKAKÄRBSEL  DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Suguliitelise retsessiivse letaalsuse (SLRL) test äädikakärbsel  
Drosophila melanogaster  teeb kindlaks nii punktmutatsioonide kui 
ka väikeste deletsioonide esinemise putuka idurakkudes. See test kujutab endast otsemutatsioonide analüüsi, skriinides mutatsioone ligi kaheksasajas X-kromosoomi lookuses, esindades kuni 80 % 
kõikidest X-kromosoomi lookustest. X-kromosoom esindab ligi ­
kaudu ühte viiendikku tervest haploidsest genoomist.
 
X-kromosoomi mutatsioonid väljenduvad fenotüüpselt  Drosophila 
melanogaster ’i isasel, kes kannab mutantset geeni. Kui mutat ­
sioon on hemisügootses olekus letaalne, siis tema esinemine järeldub ühe klassi isaste järglaskonna puudumisest kahe asemel, mida tavaliselt produtseerib heterosügootne emane. SLRL test 
võimaldab neid fakte tuvastada spetsiaalselt markeeritud ja korral ­
datud kromosoomide abil.
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
K ä r b s e l i i n i d  
Võib kasutada isaseid hästi eristatavast metsiktüübist ja Muller-5 liini 
emaseid. Samuti võib kasutada teiste liinide vastavalt markeeritud 
emaseid, kellel esinevad mitmekordselt inverteerunud X-kromo ­
soomid.  
U u r i t a v a i n e  
Uuritavad ained tuleb vees lahustada. Vees mittelahustuvaid aineid 
võib lahustada või suspendeerida vastavates lahustites (nt etanooli ja Tween-60 või 80 segus) ning vahetult enne kasutamist lahustatakse 
nad vees või soolalahuses. Lahustina ei tohi kasutada dimetüülsul ­
foksiidi (DMSO).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
L o o m a d e a r v  
Test tuleb planeerida ettemääratud tundlikkuse ja võimsusega. Spon ­
taansete mutatsioonide sagedus vastaval kontrollil mõjutab tugevalt töödeldavate ja analüüsimisele kuuluvate kromosoomide arvu.
 
M a n u s t a m i s v i i s  
Aineid võib loomadele manustada kas suukaudselt, süstevedelikuga 
või eksponeerides neid selle aine gaasidele või aurudele. Testitavat ainel võib kärbestele sisse sööta koos suhkrulahusega. Vajaduse korral võib uuritavad ained lahustada 0,7 % NaCl lahuses ja süstida 
rindmikku või tagakehasse.
 
N e g a t i i v s e t e j a p o s i t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Kasutada negatiivseid (lahusti) ja positiivseid kontrolle. Kui on aga 
olemas vastavad eelnevad laboratoorsed andmed kontrollide kohta, ei 
ole samaaegseid kontrolle vaja.  
E k s p o s i t s i o o n i t a s e m e d  
Kasutada kolme ekspositsiooni taset. Uuritava aine esialgseks hinda ­
miseks võib kasutada ühte ekspositsiooni taset, mis oleks kas maksi ­
maalne talutav kontsentratsioon või mis tekitaks juba mõningast toksilisust. Mitte-toksiliste ainete puhul tuleks kasutada praktikas kasutatavat maksimaalset kontsentratsiooni.
 
P r o t s e d u u r  
Metsiktüüpi isaseid (kolm kuni viis päeva vanad) töödeldakse 
uuritava ainega ja paaritatakse individuaalselt liias olevate eelne ­
valt paaritamata Muller-5 liini või mõne muu vastavalt markee ­
ritud (mitmekordselt inverteeritud X-kromosoomidega) liini emas ­
tega. Paaritatud emased asendatakse noorte veel paaritamata emastega iga kahe kuni kolme päeva järel, et kogu idurakkude tsükkel saaks kaetud. Nende emaste järglaskonna põhjal hinna ­
takse letaalseid efekte, mis vastavad küpsete spermatosoidide 
mõjutamisele, keskmise või lõpustaadiumi spermatiidide mõjuta ­
misele, noorte spermatiidide, spermatotsüütide ja spermatogoonia mõjutamisele uuritava ainega.
 
Ülalkirjeldatud ristamistest saadud heterosügootseid F  1 emaseid 
lastakse individuaalselt paarituda (s.o üks emane viaali kohta) oma 
vendadega. F  2 generatsioonis hinnatakse igat kultuuri metsiktüübi 
isaste puudumise alusel. Kui kultuur on tekkinud F  1 emasest, kellel 
oli vanematelt saadud letaalsust kandev X-kromosoom (s.o töödeldud kromosoomiga isased isendid puuduvad), tuleb selle emase sama 
genotüübiga tütreid testida, et teha kindlaks, kas letaalsus kordub 
järgmises generatsioonis.
 
2. ANDMED  
Andmed esitatakse tabelis, et näidata testitud X-kromosoomide arv, 
mittefertiilsete isaste arv ja letaalsete kromosoomide arv iga testitud aine kontsentratsiooni kohta ja iga töödeldud isase iga paarituspe ­
rioodi kohta. Raportis tuleb ära tuua ühe isase kohta esinevate 
erineva suurusega klastrite arv. Neid andmeid tuleb kinnitada sõltu ­
matu eksperimendiga.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Suguliitelise retsessiivse letaalsuse testide hindamiseks tuleb kasu ­
tada vastavaid statistilisi meetodeid. Arvesse tuleb võtta ühelt isaselt 
pärinevate retsessiivsete letaalide klastrite moodustumist ja hinnata seda vastava statistilise meetodiga.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— liin:  Drosophila  kasutatud tüved või liinid, putukate vanus, 
töödeldud isaste arv, steriilsete isaste arv, saadud F  2 kultuuride 
arv, ilma järglaskonnata F  2 kultuuride arv, letaalset geeni kand ­
vate kromosoomide arv, mis määratakse igas idurakkude staa ­
diumis;  
— töödeldud gruppide suuruse kindlaksmääramise kriteeriumid;  
— katsetingimused: üksikasjalik töötluste ja katseplaani kirjeldus, 
ekspositsiooni tasemed, toksilisuse andmed, vajaduse korral 
negatiivne (lahusti) ja positiivne kontroll;  
— letaalsete mutatsioonide hindamiskriteeriumid;  
— kus võimalik, esitada ekspositsiooni/toime suhe;  
— andmete hindamine;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  IMETAJARAKU TRANSFORMATSIOONITESTID  IN VITRO  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Imetajarakukultuure on võimalik  in vitro  kasutada keemiliste muta ­
geenide poolt indutseeritud fenotüübiliste muutuste avastamiseks. Neid mutageene seostatakse maliigse transformatsiooni tekkega  in 
vivo.  Laialt kasutatavateks rakkudeks on C
 3 H 10 T 1/2 , 3T3, SHE ja 
Fischeri roti rakuliinid. Testid põhinevad rakumorfoloogia muutuste, fookuse moodustumise või agaroosgeelidel rakkude pesastumise muutuste avastamisel. Harvem tehakse uuringuid, mis avastavad 
kartsinogeensetele kemikaalidele eksponeeritud rakkudel teisi morfo ­
loogilisi või füsioloogilisi muutuseid. Ükski  in vitro  testi tulemusnäi ­
taja ei ole kinnitanud ühegi mehhanismi konkreetset süstemaatilist seost kasvajatega. Osad testsüsteemid on võimelised kindlaks tegema 
kasvajate promootoreid. Uuritavate ainete tsütotoksilisuse astet saab 
määrata, kui mõõta aine toimet pesasid moodustavatele ühikutele (kloonide produktsiooni efektiivsusele) ja rakukultuuride kasvukiiru ­
sele. Tsütotoksilisuse määramine on oluline tõestamaks, et testitav 
kemikaal avaldab toksilist toimet rakkudele, vaatamata sellele, et 
rakkude maliigse transformatsiooni sagedust ei ole alati võimalik mõõta. Põhjuseks on osades katsetes kasutatav pikem inkubatsioo ­
niaeg ja/või ümber külvamine teisele alusele.
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. UURINGUMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
R a k u d  
Läbiviidavast transformatsioonitestist sõltuvalt on võimalik kasutada 
erinevaid rakuliine või tüvirakke. Katse tegija peab olema kindel, et testis kasutatavad rakud teevad läbi vajaliku fenotüüpse muutuse 
pärast kokkupuudet tuntud kartsinogeenidega. Samuti peab katse 
tegija tagama optimaalsed laboritingimused ning dokumenteeritud tõestuse, et uuring on kehtiv ja usaldusväärne.
 
K e s k k o n d  
Transformatsiooni analüüsi tegemise keskkond ja katsetingimused 
peavad vastama vajadustele.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
U u r i t a v a i n e  
Uuritavad ained võib valmistada kultiveerimiskeskkonnas või lahus ­
tada või suspendeerida vastavates lahustis enne rakkude töötlemist. Lahusti lõppkontsentratsioon kultiveerimiskeskkonnas ei tohi mõju ­
tada rakkude elulemust ega kasvukiirust.
 
M e t a b o o l n e a k t i v a t s i o o n  
Rakud peaksid olema eksponeeritud uuritavale ainele nii imetaja 
metaboolse aktivatsioonisüsteemi olemasolul kui ka selle puudu ­
misel. Kui kasutatakse sisemist metaboolset aktiivsust omavaid raku ­
tüüpe, peab tegema kindlaks, et rakkude metabolismi kiirus ja aktiiv ­
suse iseloom vastavad tingimustele.  
Katsetingimused  
P o s i t i i v s e t e j a n e g a t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Igas eksperimendis peab rakendama positiivset kontrolli rakkudele 
otsest mõju avaldava ühendiga ja ka ühendiga, mille toime avaldu ­
miseks on vajalik metaboolse aktiivsuse olemasolu. Samuti on 
vajalik negatiivne kontroll (lahusti).  
Positiivsete kontrollidena võib kasutada  
— otsest toimet avaldavaid ühendeid:  
— etüülmetaansulfonaat;  
— β-propiolaktoon;  
— kaudse toimega ühendeid:  
— 2-atsetüülaminofluoreen;  
— 4-dimetüülaminoasobenseen;  
— 7,12-dimetüülbensantratseen.  
Kui võimalik, võib kasutada positiivse kontrollina uuritava ühendiga 
samasse keemilisse klassi kuuluvat ainet.  
K a s u t a t a v a d k o n t s e n t r a t s i o o n i d  
Testis tuleb kasutada erineva uuritava aine kontsentratsiooniga lahu ­
seid. Eesmärk on teha kindlaks kontsentratsioonist sõltuv toksiline efekt. Efekti olemasolul peaks kõrge uuritava aine kontsentratsioo ­
niga lahuse toime järel rakkude elulemus langema ning väikese kont ­
sentratsiooniga lahuse toime järel peaks rakkude elulemus olema 
ligikaudu sama, mis negatiivses kontroll-lahuses. Vees suhteliselt halvasti lahustuvaid aineid tuleks vastavate meetodite abil uurida lahustuvuse piirini. Täielikult veeslahustuvatele mittetoksilistele aine ­
tele tuleb maksimaalne kontsentratsioonimäär valida vastavalt iga 
katse vajadusele.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Protseduur  
Rakud peavad toksilisele substantsile olema eksponeeritud sobiva aja 
vältel, mis oleneb kasutatud testisüsteemist. Kui kokkupuuteaega pikendatakse, võib olla vajalik aine uuesti lisamine koos keskkonna vahetamisega (ja vajaduse korral värske, metaboolselt aktiivse lahuse 
lisamine). Piisava sisemise metaboolse aktiivsuseta rakud peavad 
uuritava ainega kokku puutuma nii sobiva metaboolset aktivatsiooni esilekutsuva süsteemi olemasolul kui ka puudumisel. Kokkupuuteaja lõppemisel pestakse rakud uuritavast ainest puhtaks ning külvatakse 
tingimustel, mis sobivad uuritava fenotüübi muutuse ilmnemiseks ja 
transformatsioonide arvu määramiseks. Kõik tulemused tõestatakse sõltumatu uuringuga.
 
2. ANDMED  
Andmed tuleks esitada tabelis, mis võib olla erinev sõltuvalt kasu ­
tatud testist (kasutatud alusklaaside arv, positiivse tulemusega alus ­
klaaside arv, mutatsioonidega rakkude arv). Võimaluse korral tuleks 
esitada mutatsioonisagedus muteerunud rakkude arvu ja eluvõime ­
liste rakkude arvu suhtena. Eluvõimelisuse määr ja kloonide produt ­
seerimismäär esitatakse protsendina kontrollmäärast. Andmeid peab 
analüüsima sobivate statistiliste meetodite abil.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— kasutatud rakuliin, rakukultuuride arv, rakukultuuride säilitus ­
meetodid;  
— katsetingimused: uuritava aine kontsentratsioon, kasutatud 
lahusti, inkubatsiooni aeg, rakutihedus töötlemise ajal, imetaja 
metaboolset aktiivsust omava süsteemi tüüp, positiivsed ja nega ­
tiivsed kontrollid, jälgitud fenotüüpide kirjeldus, kasutatud selek ­
tiivsed ained (kui on asjakohane), annuste valiku põhimõte;  
— eluvõimeliste ja mutantsete rakkude loendamise meetod;  
— statistiline hindamine;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt üldtutvustus, B osa.  
4. VIITED  
Vt üldtutvustus, B osa.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  NÄRILISTE DOMINANTSE LETAALSUSE TEST  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt üldtutvustus, B osa.  
1.2. MÕISTED  
Vt üldtutvustus, B osa.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Dominantsed letaalsed toimed põhjustavad loote surma. Dominant ­
sete letaalide indutseerimine keemiliste ainetega töötlemisel näitab, et 
see aine on mõjutanud uuritava liigi lootekudet. Üldiselt aktseptee ­
ritakse, et dominantne letaalsus tekib kromosoomide kahjustumise tõttu (struktuurilised ja arvulised anomaaliad). Loodete suremine 
ravitud emasloomal võib olla ka toksilise mõju tulemuseks.
 
Üldiselt eksponeeritakse uuritavale ainele isasloomi ning neid paari ­
tatakse ravimata ja seni paaritamata emastega. Erinevaid iduraku 
staadiume võib testida eraldi, kasutades järjestikuseid paarituste inter ­
valle. Ühe emase kohta tulevate surnud implanteerunud loodete arvu suurenemine töödeldud grupis võrrelduna surnud implantaatide 
arvuga kontrollgrupi emastel peegeldab implantatsioonijärgset 
loodete surma. Enne implantatsiooni toimunud loodete hävimist saab hinnata kollaskehade  (corpora lutea)  arvu järgi või võrreldes 
ühe emase kohta tulevat implantaatide koguarvu ravi saanute ja kont ­
rollgrupis. Dominantne letaalne üldtoime on implantatsioonieelsete ja 
-järgsete kadude summa. Dominantse letaalse üldtoime arvutamine põhineb ravi saanute grupis ühe emase kohta tulevate elusate implan ­
taatide arvu võrdlemisel kontrollgrupi sama näitajaga. Implantaatide 
arvu vähenemine teatud ajavahemikes võib olla rakkude hävimise 
tulemuseks (s.o kas spermatotsüütide ja/või spermatogoonide).
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. UURINGUMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
Kui võimalik, tuleb uuritavad ained lahustada või suspendeerida 
isotoonilises soolalahuses. Vees mittelahustuvad ained võib lahustada või suspendeerida vastavates lahustites. Kasutatav lahusti ei tohi omada koostoimeid uuritava kemikaaliga ega avaldada tokilist 
mõju. Uuritav kemikaal tuleb ette valmistada vahetult enne kasuta ­
mist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Katsetingimused  
M a n u s t a m i s v i i s  
Testitavat ühendit tuleb üldjuhul manustada ainult üks kord. Vaja ­
duse korral võib rakendada korduvaid manustamisi, olenevalt toksi ­
koloogilisest informatsioonist. Tavalisteks manustamisviisideks on 
suukaudselt sondi teel või intraperitoneaalne süstimine. Võivad 
sobida ka teistsugused manustamisviisid.  
K a t s e l o o m a d  
Soovitatavateks loomaliikideks on rotid ja hiired. Terved täielikult 
suguküpsed loomad jagatakse juhuslikkuse alusel töötlemisele 
kuuluva ja kontrollgrupi vahel ära.  
A r v j a s u g u  
Uuritava aine manustamiseks tuleb kasutada piisavat arvu isaseid 
loomi, võttes arvesse hinnatava bioloogilise tunnuse iseeneslikku varieerumist. Loomade arvu valik peaks põhinema eelnevalt kindlaks tehtud määramise tundlikkusel ja olulisuse määral. Näiteks ühes 
tüüpilises testis peaks olema isaste arv igas erineva annusega ravi ­
tavas grupis piisav, et saada 30–50 tiinet emaslooma ühe paaritusin ­
tervalli kohta.
 
N e g a t i i v s e t e j a p o s i t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Tavaliselt peavad igas eksperimendis olema korraga nii positiivsed 
kui ka negatiivsed (lahusti) kontrollid. Kui samas laboratooriumis on 
olemas hiljuti tehtud katse positiivse kontrolli aktsepteeritavad tule ­
mused, siis võib kasutada neid tulemusi positiivse kontrolli katsesse lülitamise asemel. Positiivseid kontrollaineid tuleb kasutada vastavas madalas annuses (nt MMS, intraperitoneaalselt annuses 10 mg/kg), et 
näidata testi sensitiivsust.
 
A n n u s e d  
Tavaliselt tuleb kasutada kolme annust. Kõrge annus peaks avaldama 
toksilist toimet või vähendama uuritavat ainet saanud loomade vilja ­
kust. Teatud juhtudel võib olla piisav ühe suure annuse kasutamine.  
P i i r t e s t  
Mittetoksilisi aineid tuleb testida annuses 5 g/kg ühekordsel manus ­
tamisel või 1 g/kg päevas korduval manustamisel.  
Protseduur  
Kasutusel on mitmesugused uuritava aine manustamise skeemid. 
Kõige enam kasutatakse uuritava aine ühekordset manustamist. 
Võib kasutada ka teisi skeeme.  
Ühte isaslooma paaritatakse manustamisjärgselt ettenähtud aja 
möödudes järgemööda ühe või kahe ainet mittesaanud ja paaritamata emasega. Emased tuleb jätta isastega kokku vähemalt ühe östraalt ­
sükli ajaks või seniks, kuni paaritumine on toimunud. Seda hinna ­
takse sperma leidumise alusel tupes või vaginaalkorgi olemasolu 
järgi.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Aine manustamise järgsete paarituste arvu määrab manustamise 
ajaline skeem, mis peab võimaldama kõigi idurakustaadiumide mõju ­
tamise uurimist.  
Emased lahatakse tiinuse teisel poolel ja emaka sisaldist uuritakse 
surnud ja elusate implanteerunud loodete arvu kindlakstegemiseks. Munasarju võib uurida kollaskehade arvu kindlakstegemiseks.
 
2. ANDMED  
Andmed tuleb esitada tabelis, näidates isaste arvu, tiinete ja mitte ­
tiinete emaste arvu. Iga paarituse tulemused tuleb esitada individuaal ­
selt iga isase ja emase kohta eraldi. Iga emase kohta tuleb näidata paarituse nädal, isasele manustatud annus, elusate ja surnud loodete 
esinemine.
 
Dominantse letaalsuse kogutoime arvutatakse välja, võrreldes 
omavahel elusate implantaatide arvu ühe emase kohta testgrupis elusate implantaatide arvuga ühe emase kohta kontrollgrupis. Saadud andmeid – surnud loodete suhe elusatesse ainet saanute grupis 
võrrelduna sama suhtega kontrollgrupis – analüüsitakse implantat ­
sioonijärgset loodete hävimise näitamiseks.
 
Kui andmed pannakse kirja varaste ja hiliste surmadena, peab ka see 
tabelites kajastuma. Kui hinnatakse implantatsioonieelset kadu, peab see olema registreeritud. Implantatsioonieelset kadu võib arvutada 
kui erinevust kollaskehade arvu ja implantaatide arvu vahel või kui 
implantaatide keskmise arvu vähenemist emaka kohta võrrelduna kontrollpaaritustega.
 
Andmeid hinnatakse vastavaid statistilisi meetodeid kasutades.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— kasutatud loomade liik, aretusliin, vanus, kehakaal, isaste ja 
emaste arv testitavas ja kontrollgrupis;  
— testitav aine, lahusti, testitavad annused ja annuste valiku 
põhjendus, negatiivsed ja positiivsed kontrollid, andmed toksili ­
suse kohta;  
— töötlemisviis ja töötluste ajakava;  
— paarituste ajakava;  
— paarituse toimumise määramiseks kasutatud meetod;  
— lahangu aeg;  
— dominantse letaalsuse hindamise kriteeriumid;  
— võimaluse korral anda annuse/vastuse reaktsiooni suhe;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— statistiline analüüs;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt üldtutvustus, B osa.  
4. VIITED  
Vt üldtutvustus, B osa.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  IMETAJATE SPERMATOGOONIDE KROMOSOOMABER ­
RATSIOONKATSE  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 483, Mammalian Sper ­
matogonial Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. SISSEJUHATUS  
In vivo  imetajate spermatogoonide kromosoomaberratsioonide katse 
eesmärk on ära tunda need ained, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberratsioone imetajate spermatogoonide rakkudes (1, 2, 3, 4, 5). Struktuursed aberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromo ­
soom- või kromatiidaberratsioonid. Keemiliste mutageenide põhjus ­
tatud aberratsioonid on enamuses kromatiidaberratsioonid, aga esineb ka kromosoomaberratsioone. Käesolev meetod ei ole siiski mõeldud numbriliste aberratsioonide mõõtmiseks ja seda ei kasutata korrapä ­
raselt sel eesmärgil. Kromosoommutatsioonid ja sellega seotud juhud 
on paljude inimeste geneetiliste haiguste põhjuseks.
 
Käesolev katse mõõdab kromosoomaberratsioone spermatogoonide 
idurakkudes ja seetõttu oodatakse, et need ennustaksid idurakkudes pärinevaid mutatsioone.
 
Käesolevas katses kasutatakse tavaliselt närilisi. Käesolev  in vivo  
tsütogeneetiline katse avastab kromosoomaberratsioonid spermato ­
goonide mitoosides. Käesolevat meetodit ei kasutata muudes siht ­
kudedes.  
Et avastada kromatiidaberratsioone spermatogoonide rakkudes, tuleks 
uurida esimest mitoosiraku jagunemist manustamise järel enne, kui 
need kahjustused kaovad järgmistes raku jagunemistes. Lisateavet manustatud spermatogoonide tüverakkudest saadakse meiootilise kromosoomi analüüsil kromosoomaberratsioonide suhtes diakineesi- 
metafaasis I, kui manustatud rakud muutuvad spermatotsüütideks.
 
Käesolev  in vivo  katse on määratud uurima, kas keharakkude muta ­
geenid on ka aktiivsed idurakkudes. Lisaks sobib spermatogoonidega 
tehtav katse ka mutageensuse ohu hindamiseks, kuna see võimaldab  
in vivo  metabolismi, farmakokineetika ja DNA parandusprotsesside 
tegurite arvessevõtmist.  
Munandites on mitu spermatogoonide põlvkonda, mille tundlikkus 
keemiliste ainete mõjule vaheldub. Seetõttu esindavad avastatud 
aberratsioonid töödeldud spermatogoonide rakupopulatsioonide 
koguvastust, milles domineerib suurem hulk eristunud spermatogoo ­
nide rakke. Eri põlvkondadesse kuuluvate spermatogoonide kuulu ­
mine üldvereringesse sõltub nende asukohast munandites.  
Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine või reaktiivne metaboliit 
ei pääse sihtkoesse, ei ole asjakohane kasutada käesolevat katset.  
Vt ka üldist sissejuhatust B osas.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. MÕISTED  
Kromatiidaberratsioon –  struktuurne kromosoomikahjustus, mis 
ilmneb üksikute kromatiidide katkemises või kromatiididevahelises katkemises või taasühinemises.
 
Kromosoomaberratsioon –  struktuurne kromosoomikahjustus, mis 
ilmneb mõlema kromosoomi katkemises või katkemises ja taasühi ­
nemises samas kohas.  
Tühik –  akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi 
laius ja millel on minimaalne kromatiidide üleminek.  
Numbriline aberratsioon –  kasutatud rakkude tüüpilisest normaal ­
sest kromosoomiarvust erinev kromosoomide arv.  
Polüploidsus –  haploidse kromosoomiarvu (n) paljukordsus, v.a 
diploidne arv (nt 3n, 4n jne).  
Struktuurne aberratsioon –  kromosoomistruktuuri muutus, mis on 
avastatud rakujaotuse metafaasi faasi mikroskoopilisel uurimisel ja 
mida täheldatakse deletsiooni ja fragmentidena, kromosoomisiseste või -väliste muutustena.
 
1.3. KATSE PÕHIMÕTE  
Loomadele manustatakse uuritavat ainet, kasutades sobivat manusta ­
misteed, ja tapetakse sobiva aja möödumisel manustamisest. Enne 
tapmist antakse loomadele metafaasi peatavat ainet (nt kolhitsiini 
või ainet Colcemid®). Seejärel tehakse idurakkudest kromosoomi ­
preparaadid ja need värvitakse ning metafaasi rakkude kromosooma ­
berratsioone analüüsitakse.  
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Ettevalmistused  
1.4.1.1.  Loomaliikide valik  
Enamasti kasutatakse isaseid hiina hamstreid ja hiiri. Võib kasutada 
ka muude sobivate imetajate liikide isaseid loomi. Rakendatakse noorte tervete loomade enim kasutatavaid laboritüvesid. Uuringut 
alustades peaks loomade kaalumuutus olema minimaalne ja ei tohiks 
ületada ± 20 % keskmisest kaalust.
 
1.4.1.2.  Elamis- ja söötmistingimused  
Kohaldatakse üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi, kuigi 
niiskuse eesmärk peaks olema 50–60 %.  
1.4.1.3.  Loomade ettevalmistamine  
Terved noored täiskasvanud isasloomad määratakse juhuvaliku alusel 
kontroll- ja katserühmadesse. Puurid asetatakse nii, et puuri asetami ­
sest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeri ­
takse individuaalselt. Loomi harjutatakse laboritingimustega vähe ­
malt viis päeva enne uuringu alustamist.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Annuste ettevalmistamine  
Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates 
lahustites või kandjaainetes ja vajaduse korral lahjendada enne loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahe ­
tult või lahjendatakse neid enne doseerimist. Tuleks kasutada uuri ­
tava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsi ­
vuse kohta näitavad, et säilitamine on lubatav.
 
1.4.2.  Katsetingimused  
1.4.2.1.  Lahusti/kandjaaine  
Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatavate 
annuste korral ja ei tohi astuda keemilisse reaktsiooni uuritava ainega. Kui kasutatakse muid kui tuntud lahusteid/kandjaaineid, 
peab nende kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andme ­
tele. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahustite/-kandjaainete kasutamist.
 
1.4.2.2.  Kontrollid  
Käesolevasse katsesse kaasatakse paralleelsed positiivsed ja nega ­
tiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollid. Kontrollrühma loomi käsit ­
letakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuri ­
tavat ainet.  
Positiivsed kontrollid ei tohiks põhjustada struktuurseid aberratsioone  
in vivo  spermatogoonide rakkudes manustamistasemetel, mis peaksid 
põhjustama avastatavat suurenemist taustaga võrreldes.  
Positiivsete kontrollainete annused valitakse nii, et mõjud on selged, 
kuid need ei paljasta lugejale kohe kodeeritud objektiklaaside iden ­
titeeti. On aktsepteeritav, et positiivsed kontrollid võivad kasutada 
erinevaid manustamisteid kui uuritav aine ja proovid võetakse üksnes korra. Keemiliste ainete rühmaga seotud positiivsete keemiliste kont ­
rollainete kasutamist tuleks kaaluda, kui sellised ained on kättesaa ­
davad. Positiivsete kontrollainete näited:
 
Aine CASi nr EINECSi nr  
Tsüklofosfamiid 
Tsüklofosfamiidmonohüdraat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Tsükloheksüülamiin 108-91-8 203-629-0 
Mitomütsiin-C 50-07-7 200-008-6 
Akrüülamiidmonomeer 79-06-1 201-173-7 
Trietüleenmelamiin 51-18-3 200-083-5  
Üksnes lahustit või kandjaainet saanud või muul katserühmaga sama ­
laadsel viisil töödeldud negatiivsetest kontrollidest võetakse proovid 
igal proovivõtukorral, välja arvatud siis, kui varasemad kontrollitu ­
lemused näitavad loomade väliste varieerumiste ja kromosoomaber ­
ratsioone sisaldavate rakkude esinemissageduste tunnustamist. Lisaks sellele käsitletakse ka töötlemata kontrolle, välja arvatud juhul, kui 
varasemad või avaldatud andmed kontrolli kohta näitavad, et valitud 
lahustil/kandjaainel ei ole kahjulikke ega mutageenseid mõjusid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. MENETLUS  
1.5.1.  Loomade arv  
Nii katse- kui ka kontrollrühmas on vähemalt viis analüüsitavat 
looma.  
1.5.2.  Manustamiskava  
Uuritavaid aineid manustatakse eelistatult ühel või kahel korral (nt 
ühekordse annusena või kahekordsete annustena). Uuritavaid aineid võib anda ka jagatud annustena, näiteks kaks annust ühel päeval kuni 
mõnetunnise vahega, et hõlbustada suurte ainekoguste andmist. 
Muud manustamiskavad peaksid olema teaduslikult tõestatud.
 
Suurimat annust saavas rühmas võetakse manustamise järel proove 
kahel korral. Kuna uuritav aine saab mõjutada rakutsükli kineetikat, 
siis võetakse proove üks kord varajasel ja teine kord hilisemal ajal 
ligikaudu 24–48 tunni jooksul pärast manustamist. Muude annuste, v.a suurim annus, puhul on proovide võtmise ajaks 24 tundi või 1,5 rakutsüklit pärast manustamist, välja arvatud siis, kui muu proovivõ ­
tuaeg on sobivam mõjude avastamiseks (6).
 
Lisaks võib kasutada muid proovivõtuaegasid. Näiteks keemiliste 
ainete puhul, mis võivad põhjustada kromosoomi aeglustumist või võivad esile tuua S-faasist sõltumatuid mõjusid, on sobivam vara ­
jasem proovide võtmise aeg (1).
 
Kordusmanustamiste sobivus tuleb määrata iga üksikjuhtumi puhul 
eraldi. Kordusmanustamise järel tuleb loomad tappa 24 tunni (1,5 rakutsükli) jooksul pärast viimast manustamist. Täiendavaid proovi ­
võtuaegasid võib kasutada vajaduse korral.
 
Enne tapmist süstitakse loomade kõhukelmesse metafaasi peatavat 
ainet (nt ainet Colcemid® või kolhitsiini). Loomadelt võetakse seejärel proovid sobiva intervalli järel. Hiirte puhul on see intervall ligikaudu 3–5 tundi, hiina hamstritel ligikaudu 4–5 tundi.
 
1.5.3.  Annused  
Kui tehakse annuste vahemiku määramiseks uuring sobivate andmete 
puudumisel, siis tehakse uurimus samas laboris, kasutades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamiskava, mida kasutatakse põhiuuri ­
muses (7). Kui esineb mürgisus, kasutatakse kolme erinevat annust 
esimesest proovivõtust alates. Need annused peaksid hõlmama vahe ­
mikku suurimast kuni väiksema mürgisuseni või mürgisuse puudu ­
miseni. Hilisemal proovivõtuajal on vaja kasutada üksnes suurimat annust. Suurim annus määratakse annusena, mis põhjustab sarnaseid 
mürgisusenähte, et samale manustamisrežiimile põhinevate suure ­
mate annuste kasutamine võib põhjustada surma.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetok ­
siliste annustena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks 
annuse määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksik ­
juhtumi puhul eraldi. Suurim annus võib samuti põhjustada toksili ­
suse nähte spermatogoonide rakkudes (nt spermatogoonide mitooside 
suhe esimese ja teise meiootilisse metafaasi on vähenenud; kõne ­
alune vähenemine ei tohi ületada 50 %).  
1.5.4.  Piirkatse  
Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2 000 mg/kg kehakaalu 
kohta päevas ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid 
ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt seotud 
ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uurimust vajalikuks. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata piirkatses kasutavatest annustest suuremate annuste kasuta ­
mise vajadusele.
 
1.5.5.  Manustamine  
Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva 
intubeerimise kanüüli abil või süstides kõhuõõnde. Samuti võib muid 
manustamisteid aktsepteerida, kui need on põhjendatud. Vedeliku suurim kogus, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral 
manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus ei tohiks ületada 
2 ml/100 g kehakaalu kohta. Suurimate koguste kasutamine peab olema põhjendatud. Välja arvatud ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide 
korral, tuleks vähendada katsekoguse varieeruvust, reguleerides kont ­
sentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.
 
1.5.6.  Kromosoomipreparaat  
Kohe pärast tapmist võetakse rakususpensioonid ühest või mõlemast 
munandist, mis pannakse hüpotoonilisse lahusesse ja fikseeritakse. Seejärel rakud asetatakse objektiklaasidele ja värvitakse.
 
1.5.7.  Analüüs  
Iga looma puhul analüüsitakse vähemalt 100 väga levinud metafaasi 
(vähem kui 500 metafaasi rühma kohta). Seda arvu saab vähendada, 
kui esineb palju aberratsioone. Kõik objektiklaasid, sh positiivsete ja 
negatiivsete kontrollide omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikro ­
skoopilist analüüsi. Kui fikseerimise menetlused viivad tihti meta ­
faasis olevate rakkude katkemise ja kromosoomide kaotamiseni, 
peaksid arvutatud rakud sisaldama tsentromeeride hulka, mis vastab 
arvule 2n ± 2.  
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Üksikute loomade andmed esitatakse tabelis. Katseühikuks on loom. 
Iga üksiku looma puhul hinnatakse struktuurseid kromosoomaberrat ­
sioone sisaldavate rakkude arvu ja kromosoomaberratsioonide arvu 
raku kohta. Eri tüüpi struktuursed kromosoomaberratsioonid tuleks loetleda ning mainitakse nende arvud ja esinemissagedused katse- ja kontrollkultuurides. Tühikud registreeritakse eraldi ja nende kohta 
antakse teavet, aga üldiselt ei kuulu need aberratsioonide üldsage ­
duse hulka.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Kui vaadeldakse nii meioosi kui ka mitoosi, tuleks määrata kindlaks 
spermatogoonide mitooside suhe esimesse ja teise meiootilisse meta ­
faasi tsütotoksilisuse mõõduna kõikidest uuritavale ainele vastuvõtli ­
kest loomadest ja negatiivsetest kontrollidest kokku 100 jaguneva rakuga proovis looma kohta võimalikule tsütotoksilisele mõjule 
osutamiseks. Kui üksnes mitoosi vaadeldakse, tuleks määrata mitoo ­
tiline indeks vähemalt 1 000 rakust iga looma kohta.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Positiivse tulemuse saamiseks on mitmeid kriteeriume, nt kromosoo ­
maberratsioone sisaldavate rakkude suhtelise arvu annusest tingitud 
suurenemine või kromosoomaberratsioone sisaldavate rakkude arvu selge suurenemine ühes annuses ühel proovivõtuajal. Tulemuste bioloogilist tähtsust tuleks esmalt arvesse võtta. Statistilisi meetodeid 
võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel (8). 
Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse jaoks. Ebaselgeid tulemusi tuleks selgitada täiendaval uurimisel ootuspäraselt muudetud katsetingimustes.
 
Uuritavat ainet, mille tulemused ei vasta eespool toodud kriteeriumi ­
dele, peetakse mittemutageenseks aineks käesolevas katses.  
Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tule ­
mused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata.
 
In vivo  kromosoomaberratsiooni katsel saadud positiivsed tulemused 
viitavad sellele, et aine põhjustab struktuurseid kromosoomaberrat ­
sioone uuritud liikide idurakkudes. Negatiivsed tulemused viitavad 
sellele, et katsetingimuste põhjal ei põhjusta aine kromosoomaberrat ­
sioone uuritud liikide idurakkudes.  
Tõenäosust, et uuritav aine või selle metaboliidid jõuavad sihtkoesse, 
tuleks arutada.  
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Lahusti/kandjaaine:  
— kandjaaine valiku põhjendamine;  
— uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on 
teada.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/tüved;  
— loomade arv ja vanus;  
— päritolu, elamistingimused, toitumine jne;  
— loomade individuaalne kaal katse alustamisel, sh kehakaalu 
vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Katsetingimused:  
— annuse määramise katse tulemused, kui need on läbi viidud;  
— annuste valiku põhimõtted;  
— manustamisviis;  
— uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;  
— uuritava aine manustamise üksikasjad;  
— tapmisaja põhjendused;  
— toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni 
(ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kehakaalu kg kohta 
päevas), vajaduse korral;  
— üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;  
— manustamis- ja proovivõtukavade detailne kirjeldus;  
— toksilisuse mõõtmise meetodid;  
— metafaasi peatav aine, selle kontsentratsioon ja manustamise 
kestus;  
— objektiklaaside valmistamise meetodid;  
— aberratsioonide loendamise kriteeriumid;  
— analüüsitud rakkude arv looma kohta;  
— kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, 
negatiivseteks või ebaselgeteks.  
Tulemused:  
— toksilisuse tunnused;  
— mitootiline indeks;  
— spermatogoonide mitoosirakkude suhe esimesse ja teise meiooti ­
lisse metafaasi;  
— aberratsioonide tüüp ja arv, antud iga looma kohta eraldi;  
— aberratsioonide koguarv rühma kohta;  
— aberratsioone sisaldavate rakkude arv rühma kohta;  
— doosi ja toime suhe, võimaluse korral;  
— võimalikud statistilised analüüsid;  
— paralleelsed negatiivse kontrolli tulemused;  
— varasemad negatiivsest kontrollist saadud tulemused ning vahe ­
mikud, keskväärtused ja standardhälbed;  
— paralleelse positiivse kontrolli tulemused;  
— ploidsuse muutused, kui neid esineb.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. VIITED  
1) Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, 
Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477–484.
 
2) Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275–306.
 
3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cyto ­
genetics and Cell Genetics, 3, pp. 289–294.  
4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and 
Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, pp. 115–141.
 
5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (19 78), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Muta ­
tion Res., 52, pp. 207–209.  
6) Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., 
Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (19 94), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. 
Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ 
Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313–318.
 
7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7, pp. 313–319.
 
8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytoge ­
netic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines 
for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  HIIRE NAHALAIKUDE TEST  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
See on  in vivo  test hiirtega, kelles arenevaid embrüoid mõjutatakse 
kemikaalidega. Märklaudadeks arenevas embrüos on melanoblastid 
ja märklaudgeenideks on need, mis kontrollivad karvastiku pigmen ­
tatsiooni. Arenevad embrüod on heterosügootsed terve rea karvavär ­
vuse geenide suhtes. Sellise geeni dominantse alleeli muteerumine või kadumine (erinevate geneetiliste sündmuste tulemusena) melano ­
blastis annab tulemuseks retsessiivse fenotüübi ekspressiooni tema 
järglasrakkudes, moodustades muutunud värvusega laigu hiire karvastikus. Tehakse kindlaks selliste laikudega – mutatsioonidega – järglaste arv ja nende sagedust võrreldakse sama näitajaga järglas ­
konnas, keda embrüostaadiumis töödeldi ainult lahustiga. Hiire naha ­
laikude test teeb kindlaks eeldatavaid somaatilisi mutatsioone loote rakkudes.
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
Võimaluse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritavad ained 
isotoonilises soolalahuses. Vees mitte-lahustuvad kemikaalid lahusta ­
takse või suspendeeritakse vastavates lahustites. Kasutatav lahusti ei tohi omada koostoimet uuritava kemikaaliga ega avaldada toksilist toimet. Katses tuleb kasutada värskelt valmistatud kemikaali.
 
K a t s e l o o m a d  
T-liini hiiri (mitteaguuti, a/a; tšintšilja, roosa silm, c  ch p/c ch p; pruun, 
b/b; dilute,  lühike kõrv, d se/d se; laiguline, s/s) paaritatakse kas HT 
liiniga (kahkjas, mitteaguuti, brahhüpoodne, pa a bp/pa a bp; tinajas 
kräsukarvaline, ln fz/ln fz; pärl pe/pe) või C57 BL liiniga (mitte ­
aguuti, a/a). Teisi sobivaid ristamisi nagu NMRI (mitteaguuti, a/a; albiino, c/c) ja DBA (mitteaguuti, a/a; pruun, b/b; dilute d/d) vahel 
võib samuti kasutada, juhul kui nad annavad mitteaguutit järglas ­
konda.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
A r v j a s u g u  
Uuritavat ainet manustatakse piisavale arvule tiinetele emastele, et 
saada vastav arv ellujäävat järglaskonda iga annuse jaoks. Vastav proovide suurus määratakse uuritavat ainet saanud hiirtel kindlaks tehtud karvalaikude arvu ja kontrollandmete põhjal. Negatiivne 
tulemus on ainult siis aktsepteeritav, kui hinnatud on vähemalt 300 
kõige suurema annusega töödeldud emaste järglast.
 
N e g a t i i v s e t e j a p o s i t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Kättesaadavad peavad olema samaaegsed kontrollandmed hiirtelt, kes 
said ainult vehiiklit (negatiivsed kontrollid). Samast laboratooriumist saadud varasemaid kontrollandmed võib testi tundlikkuse suurenda ­
miseks ühendada eeldusel, et nad on homogeensed. Kasutatavad 
peavad olema samast laboratooriumist selle testiga hiljuti saadud 
positiivse kontrolli andmed teadaolevalt mutageense kemikaali kohta, kui testitava kemikaali puhul ei avastata mutageenset toimet.
 
M a n u s t a m i s v i i s  
Tavalisteks manustamisviisideks on suukaudne sondi teel manusta ­
mine või tiinete emaste intraperitoneaalne süstimine. Vajaduse korral kasutatakse inhalatsiooni või teisi manustamisviise.
 
A n n u s e d  
Kasutatakse vähemalt kahte annust, millest ühel ilmneb toksilisuse 
tunnuseid või mis põhjustab väiksemaarvulisi pesakondi. Mittetoksi ­
liste kemikaalide puhul tuleb kasutada maksimaalset praktikas kasu ­
tatavat annust.  
Protseduur  
Ühekordne töötlus tehakse tavaliselt 8., 9. või 10. tiinuse päeval, 
lugedes esimeseks päeva, mil esmakordselt täheldati vaginaalkorki. Need päevad vastavad 7,25., 8,25. ja 9,25. päevale pärast viljasta ­
mist. Nendel päevadel võib rakendada järjestikusi töötlemisi.
 
A n a l ü ü s  
Järglaskond kodeeritakse ning neid hinnatakse laikude esinemise 
alusel kolmanda ja neljanda nädala jooksul pärast sündimist. Erista ­
takse kolme laikude klassi:  
a) kuni 5 mm suurused valged laigud ventraalsel keskjoonel, mida 
peetakse rakkude surmamise tulemuseks (WMVS);  
b) kollased aguutivärvi laigud, mis on seotud piimanäärmete, 
genitaalide, kõri, õlavarre ja kubemepiirkonnaga ning lauba 
keskosaga, arvatakse olevat diferentseerumishäirete (MDS) tu ­
lemuseks ja  
c) hajusalt üle keha esinevad pigmenteerunud ja valged laigud, mida 
peetakse somaatiliste mutatsioonide (RS) tulemuseks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Kõik need kolm erinevat laikude klassi kuuluvad hindamisele, kuid 
ainult viimane neist (RS) omab geneetilist tähtsust. MDS ja RS 
eristamisel tekkivaid probleeme saab lahendada proovikarvade uuri ­
misel fluorestsentsmikroskoobi abil.  
Tuleb tähele panna kõiki ilmseid morfoloogilisi ebanormaalsusi 
järglaskonnas.  
2. ANDMED  
Andmed esitatakse hinnatud järglaskonna koguarvuna ja ühte või 
enamat eeldatavat somaatilise mutatsioonilaiku omavate järglaste arvuna. Uuritavat ainet saanud loomade ja negatiivse kontrolli 
andmeid võrreldakse vastavate meetodite abil. Andmed esitatakse 
samuti eraldi iga pesakonna kohta.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— ristamiseks kasutatud liinid;  
— tiinete emaste arv katse- ja kontrollgrupis;  
— keskmine pesakonna suurus uuritavat ainet saanute ja kontroll ­
grupis sündimise ja võõrutamise ajal;  
— testitava kemikaali annus(ed);  
— kasutatud lahusti;  
— tiinuse päev, millal töötlus tehti;  
— manustamisviis;  
— hinnatud järglaskonna koguarv, WMVS, MDS ja RS muutusi 
kandvate järglaste arv eksperimentaal- ja kontrollgrupis;  
— kõik morfoloogilised anomaaliad;  
— võimaluse korral anda annuse/toime suhe RS muutuste kohta;  
— statistiline analüüs;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  HIIRE PÄRILIK TRANSLOKATSIOON  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Hiire päriliku translokatsiooni test teeb kindlaks esimese põlvkonna 
järglastel kindlaks tehtud struktuursed ja arvulised muutused imeta ­
jate idurakkude kromosoomides. Kindlaks tehtud kromosomaalsed muutused on retsiprooksed translokatsioonid ja juhul kui kaasa on 
haaratud ka järglaskonna emasloomad, kantakse edasi X-kromosoo ­
mide kadu. Translokatsioonide kandjatel ja XO-emastel on vähe ­
nenud viljakus, mida kasutatakse F
 1 järglaskonna selekteerimiseks 
tsütogeneetilise analüüsi jaoks. Täielikku steriilsust põhjustavad 
teatud kindlat tüüpi translokatsioonid (X-autosoomi ja c-t tüüp). 
Translokatsioone jälgitakse tsütogeneetiliselt meiootilistes rakkudes diakineesi I metafaasis isastel indiviididel, kas F
 1 isastel või F  1 
emaste isastel järglastel. XO-emased identifitseeritakse tsütogeneeti ­
liselt ainult 39 kromosoomi olemasolu põhjal luuüdi mitoosides.  
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. UURINGUMEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
Testitavad kemikaalid lahustatakse isotoonilises soolalahuses. Kui 
ained on vees lahustumatud, siis lahustatakse või suspendeeritakse nad vastavates lahustites. Kasutatakse värskelt valmistatud testitavate ühendite lahuseid. Kui lahustit kasutatakse annustamise lihtsustami ­
seks, ei tohi sellel olla koostoimet testitava kemikaaliga, samuti ei 
tohi see mõjuda toksiliselt.
 
M a n u s t a m i s v i i s  
Manustamisviisideks on tavaliselt suukaudselt sondi teel või intrape ­
ritoneaalne süstimine. Sobida võivad ka teised manustamisviisid.  
K a t s e l o o m a d  
Paarituste läbiviimise ja tsütoloogilise tõestamise lihtsustamiseks 
tehakse need katsed hiirtega. Spetsiifiliste hiireliinide kasutamine ei 
ole vajalik, kuid keskmine pesakonna suurus antud liini hiirtel peaks olema suurem kui kaheksa ja see peaks olema suhteliselt konstantne.
 
Katsesse valitakse terved suguküpsed loomad.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
L o o m a d e a r v  
Vajalik loomade arv sõltub spontaansete translokatsioonide sagedu ­
sest ja positiivse tulemuse saamiseks vajaliku induktsiooni minimaal ­
sest tasemest.  
Test põhineb tavaliselt F  1 järglaskonna isasloomade analüüsil. Ühes 
uuritavat ainet saavate hiirte grupis tuleb testida vähemalt 500 F  1 
järglaskonna isast. Kui on kaasatud ka F  1 järglaskonna emased, 
siis tuleb testida 300 isas- ja 300 emaslooma.  
N e g a t i i v s e t e j a p o s i t i i v s e t e k o n t r o l l i d e k a s u t a ­
m i n e  
Kasutatavad peavad olema vastavad kontrollandmed, mis on saadud 
konkureerivate ja varem tehtud testide kontrollrühmade kohta. Kui 
on olemas aktsepteeritavad hiljuti samas laboris tehtud eksperimen ­
tide positiivsete kontrollide tulemused, siis võib kasutada neid andmeid ja jätta positiivsed kontrollid käesolevast testist välja.
 
A n n u s e d  
Testitakse ühte, tavaliselt kõige suuremat annust, mis on seotud 
loomal minimaalsete toksiliste mõjutuste esilekutsumisega, kuid mis ei mõjuta reproduktiivset käitumist ega ellujäämist. Annuse/ ­
vastusreaktsiooni suhte kindlakstegemiseks on vaja katsesse lisada 
kaks madalamat annust. Mittetoksilise kemikaali puhul tuleb uurida 
maksimaalset praktiliselt kasutatavat annust.
 
Protseduur  
U u r i t a v a a i n e m a n u s t a m i n e j a p a a r i t a m i n e  
Kasutusel on kaks skeemi. Kõige laialdasemalt kasutatakse uuritava 
aine ühekordset manustamist. Võib kasutada ka uuritava aine manus ­
tamist seitsmel päeval nädalas 35 päeva järjest. Manustamisele 
järgnev paarituste arv sõltub manustamisskeemist ja peaks tagama, et proove võetaks kõigist iduraku staadiumidest. Pärast paarituspe ­
rioodi lõppu pannakse emasloomad eraldi puuridesse. Kui emasloom 
poegib, märgitakse üles poegimise kuupäev ja järglaste arv ning 
sugu. Kõik isased järeltulijad võõrutatakse ja kõik emased järeltulijad hukatakse, välja arvatud juhul, kui nad on kaasatud eksperimenti.
 
T r a n s l o k a t s i o o n i h e t e r o s ü g o o t s u s e t e s t i m i n e  
Kasutatakse ühte kahest võimalikust meetodist:  
— F  1 järglaskonna viljakuse testimine ja järgnev võimalike translo ­
katsiooni kandjate kindlakstegemine tsütogeneetilise analüüsi abil;
 
— kogu isase F  1 järglaskonna tsütogeneetiline analüüs ilma eelneva 
fertiilsuse testimisel põhineva selektsioonita.  
a) Viljakuse testimine  
Vähenenud viljakust F  1 indiviididel saab kindlaks teha pesakonna 
suuruse põhjal ja/või paaritatud emaste emaka sisu analüüsimisel.  
Normaalse ja vähenenud viljakuse määratlemise kriteerium peab 
olema kasutava hiireliini jaoks kindlaks määratud.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Pesakonna suuruse jälgimine:  uuritavad F  1 isased paigutatakse 
individuaalselt puuridesse kas koos sama eksperimendi või 
kolooniast saadud emastega. Puure kontrollitakse iga päev 18. paaritusjärgsest päevast alates. Pesakonna suurus ja sooline vahe ­
kord registreeritakse F
 2 põlvkonna sünnimomendil ja seejärel 
pesakond likvideeritakse. Kui testitakse emast F  1 järglaskonda, 
siis jäetakse väikeste pesakondade F  2 järglased ellu edaspidisteks 
testimisteks. Emaseid translokatsiooni kandjaid kontrollitakse tsütogeneetilise translokatsiooni analüüsiga kõigi nende isaste 
järeltulijate põhjal. XO-emaseid tuntakse ära sugude suhte 
muutumise põhjal nende järglaskonnas suhtelt 1:1 suhtele 1:2 isased  vs.  emased. Järgnevas protseduuris elimineeritakse 
normaalsed F
 1 loomad edasisest testimisest, kui esimene F  2 pesa­
kond saavutab või ületab predetermineeritud normaalväärtuse, 
vastasel korral võetakse vaatluse alla teine või kolmas F  2 pesa­
kond.  
F 1 loomi, keda ei saa kuni kolme F  2 pesakonna jälgimise põhjal 
normaalseks tunnistada, kas testitakse edasi paaritatud emaste emaka sisu analüüsimisega või tehakse kohe tsütogeneetiline 
analüüs.
 
Emaka sisu analüüsimine:  pesakonna suuruse vähenemine trans ­
lokatsiooni kandjatel on põhjustatud loodete embrüonaalsest hukkumisest, nii et surnud implantaatide suur arv peegeldab 
translokatsiooni esinemist testitaval loomal. Igat testitavat F
 1 
isaslooma paaritatakse 2–3 emasega. Viljastumine tehakse kind ­
laks igahommikuse vaginaalkorkide olemasolu kontrollimisega. Emased surmatakse 14–16 päeva pärast ning nende emakates 
loendatakse elusad ja surnud implantaadid.
 
b) Tsütogeneetiline analüüs  
Testised valmistatakse ette õhu käes kuivatamise tehnika abil. 
Translokatsiooni kandjad identifitseeritakse multivalentsete konfi ­
guratsioonide leiu alusel diakineesi I metafaasis olevatel primaar ­
setel spermatotsüütidel. Vähemalt kahe multivalentse assotsiat ­
siooniga raku leidmine on piisavaks tõestuseks, et testitav loom on translokatsiooni kandja.
 
Juhul kui aretusselektsiooni pole rakendatud, kontrollitakse kõiki 
F 1 isasloomi tsütogeneetiliselt. Mikroskoopiliselt tuleb uurida 
vähemalt 25 diakineesi I metafaasis olevat rakku ühe isase 
looma kohta. Mitootiliste metafaaside uurimine kas spermato ­
goonia ajal või luuüdis on nõutav F  1 isaste puhul, kellel on 
väikesed testised ja meioosi katkemine enne diakineesi või F  1 
emastel XO kahtlusalusklaasidel. Ebatavaliselt pika ja/või lühi ­
kese kromosoomi olemasolu igas kümnes rakus kümnest on 
erilise steriilsust põhjustava translokatsiooni (c-t tüüpi) tõendu ­
seks isasloomal. Mõnesid X-autosoomi translokatsioone, mis põhjustavad isaste steriilsust, saab identifitseerida ainult mitooti ­
liste kromosoomide bandinganalüüsi abil. 39 kromosoomi esine ­
mine igas kümnes mitoosis kümnest on tõestuseks emase XO seisundile.
 
2. ANDMED  
Andmed esitatakse tabelis.  
Keskmine pesakonna suurus ja sugude suhe sünnimomendil ja 
võõrutamise ajal registreeritakse iga paaritusintervalli kohta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
F 1 loomade viljakuse hindamiseks esitatakse keskmine pesakondade 
suurus kõikide normaalsete paarituste kohta ja individuaalne pesa ­
konna suurus F  1 translokatsiooni kandjatel. Emaka sisaldise analüü ­
simiseks registreeritakse elus ja surnud implantaatide keskmine arv normaalpaarituste korral ja individuaalsed elus ja surnud implantaa ­
tide arvud iga F
 1 translokatsiooni kandja paarituse kohta.  
Diakineesi I metafaasi tsütokineetilisel analüüsil leitakse multivalent ­
sete konfiguratsioonide arv ja tüübid ja antakse rakkude üldarv iga 
translokatsiooni kandja kohta.  
Steriilsete F  1 indiviidide puhul registreeritakse paarituste üldarv ja 
paaritusperioodi kestus. Antakse testiste kaalud ja tsütogeneetilise analüüsi detailid.
 
XO emaste puhul registreeritakse keskmine pesakonna suurus, 
sugude suhe F  1 järglaskonnas ja tsütogeneetilise analüüsi tulemused.  
Kus on võimalik, eelselekteeritakse F  1 translokatsiooni kandjad 
fertiilsustesti põhjal, tabelid peavad sisaldama informatsiooni selle 
kohta, kui paljude korral neist oli tõestatud translokatsiooniline hete ­
rosügootsus.  
Esitatakse negatiivsete ja positiivsete kontrollide testimisandmed.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— hiirte liin, loomade vanus, töödeldud loomade kaalud;  
— mõlemast soost vanemloomade arv katse- ja kontrollgrupis;  
— katsetingimused, detailne aine manustamise kirjeldus, annused, 
lahustid, paarituste skeem;  
— järglaste arv ja sugu ühe emase kohta, saadud järglaste arv ja 
sugu translokatsiooni analüüsil;  
— translokatsiooni analüüsi aeg ja kriteeriumid;  
— translokatsiooni kandjate arv ja detailne kirjeldus, kus võimaluse 
korral oleks antud ka paarituste andmed ja emaka sisaldise uuri ­
mise andmed;  
— tsütogeneetilised protseduurid ja mikroskoopilise uuringu 
detailid, eelistatavalt koos piltidega;  
— statistiline hinnang;  
— tulemuste arutelu;  
— järeldused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. HINNANG JA JÄRELDUSED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – 
SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE 
UURING NÄRILISTEL  
1. MEETOD  
Käesolev subkroonilise suukaudse toksilisuse uurimismeetod lähtub 
juhendist OECD TG 408 (1998).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kemikaali toksiliste omaduste määramisel ja hindamisel võib teha 
subkroonilise suukaudse toksilisuse katseid, kasutades kordusdoose pärast seda, kui toksilisuse kohta on akuutsetest või 28päevastest 
kordusdoosidega toksilisuse katsetest saadud esialgne teave. 
90päevane uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, mis võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral pikaajalise perioodi jooksul alates võõrutusjärgsest küpsemisest kuni täisealiseks 
arenemiseni. Uuring annab teavet toksilisuse peamiste mõjude kohta, 
tuvastab sihtorganid ja akumuleerumisvõimaluse ja võib anda katsea ­
lustele organismidele täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentrat ­
siooni väärtuse, mida saab kasutada doositasemete valimisel krooni ­
liste mõjude uurimisel ja kokkupuutel inimestega ohutuskriteeriu ­
mide väljatöötamisel.
 
Meetod asetab lisarõhu neuroloogilistele küsimustele ja selle abil 
saadakse teavet immunoloogilist ja paljunemisvõimet puudutavate mõjude kohta. Samuti rõhutatakse vajadust teha loomade hoolikas 
kliiniline läbivaatus, et hankida võimalikult palju teavet. Kõnealune 
uuring peaks võimaldama määrata neid kemikaale, mis on võime ­
lised põhjustama neurotoksilist ja immunoloogilist mõju või mõju paljunemisorganitele, mis võib tagada edasise sügavuti uuringu.
 
Vt ka üldise sissejuhatuse B osa.  
1.2. MÕISTED  
Doos  – uuritava aine manustatav kogus. Doosi väljendatakse massina 
(g, mg) või uuritava aine massina katsealuse looma kaaluühiku kohta 
(nt mg/kg) või toidus oleva püsikontsentratsioonina (ppm).  
Doseerimine  – üldmõiste, mis hõlmab doosi, manustamise sagedust 
ja doseerimise kestust.  
NOAEL  – lühend sõnadest „no observed adverse effect level” ehk 
doosi kõige kõrgem tase, mis vastab katseorganismidele täheldatavat 
toimet mitteavaldavale kontsentratsioonile.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritavat ainet manustatakse katseloomade erinevatele rühmadele 
suu kaudu iga päev astmeliselt suurenevates doosides, üks doosi suurus rühma kohta 90 päeva jooksul. Manustamisperioodi jooksul jälgitakse loomi hoolikalt mürgitusnähtude suhtes. Loomad, kes 
surevad või katse jooksul tapetakse, lahatakse ja uuringu lõppedes 
tapetakse ja lahatakse ka need loomad, kes jäid ellu.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Loomade ettevalmistamine  
Kasutada tuleks terveid loomi, kes on labororitingimustega vähemalt 
viie päeva jooksul kohanenud ning keda ei ole varem uuringutes 
kasutatud. Katseloomi tuleks kirjeldada vastavalt nende liigile, liinile, 
päritolule, soole, kaalule ja/või vanusele. Loomad tuleks kontroll- ja menetlusrühmadesse paigutada juhuslikult. Puurid tuleks asetada nii, et puuri ümberasetamisega seotud võimalikud mõjud oleks mini ­
maalsed. Igale loomale peab määrama unikaalse identifitseerimis ­
numbri.
 
1.4.2.  Dooside ettevalmistamine  
Uuritavat ainet manustatakse kunstlikult või koos toidu või joogi ­
veega. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja uuritava aine fuüsikalis-keemilistest omadustest.
 
Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine 
sobivas vehiikelis. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõige ­
pealt kasutada vesilahust/suspensiooni, seejärel õlilahust/emulsiooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist teistes vehiikelites. Mittevesilahuse ­
liste vehiikelite puhul peab teadma kandeaine toksilisi omadusi. 
Kindlaks tuleks määrata uuritava aine püsivus manustamise tingi ­
mustes.
 
1.4.3.  Katsetingimused  
1.4.3.1.  Katseloomad  
Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka teisi närilisi, nt 
hiiri. Katseloomadena tuleks kasutada üldkasutatavate tervete täiskas ­
vanud laboratooriumiloomade aretusliine. Emasloomad peaksid 
olema nullpaarid ja nad ei tohiks olla tiined. Doseerimisega tuleks 
alustada võimalikult kohe pärast võõrutamist ja igal juhul enne loomade üheksanädalaseks saamist. Uuringu alguses peaks loomade kaaluerinevus olema minimaalne ega tohiks ületada ± 20 % 
kummastki soost loomade keskmisest kaalust. Kui uuring tehakse 
eeluuringuna pikaajalise kroonilise toksilisuse uuringu raames, tuleks mõlemas uuringus kasutada samast aretusliinist ja sama päritoluga loomi.
 
1.4.3.2.  Arv ja sugu  
Igal doositasemel tuleks kasutada vähemalt 20 looma (10 emast ja 10 
isast). Kui osa loomi on kavas katse käigus tappa, tuleks loomade arvu enne katse lõppu tapetavate loomade arvu võrra suurendada. 
Tuginedes eelnevatele teadmistele kemikaali või selle lähedase 
analoogi kohta, tuleks kaaluda kümneloomalise (viis kummastki soost) satelliitrühma lisamist kontrollrühma ja suurima doosi rühma, et jälgida pärast manustamisperioodi lõppu mis tahes toksilise 
toime pöörduvust või püsivust. Selle menetlusjärgse perioodi kestus 
tuleks dokumenteerida vastavalt täheldatud mõjudele.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Annused  
Uuringus tuleb kasutada vähemalt kolme doositaset ja uuringuga 
samal ajal peab tegema ka kontrolli, välja arvatud siis, kui tehakse piirsisalduskatse (vt 1.4.3.4). Doositasemed võivad põhineda kordus ­
doosi või vahemiku leidmise uuringu tulemustel ja peaksid arvesse 
võtma uuritava aine või sellega seotud materjalide kohta olemasole ­
vat toksikoloogilist ja toksikokineetilist teavet. Kui uuritava aine füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline mõju ei piira 
suurima doosi valimist, tuleb doositase valida nii, et sellega kaasneks 
mürgitus, kuid et see ei põhjustaks surma ega tõsiseid kannatusi. Dooside suurused tuleks valida kahanevas järjekorras eesmärgiga 
näidata iga doosiga seotud reaktsioonid ja katseorganismidele tähel ­
datavat toimet mitteavaldav sisaldus (NOAEL) kõige madalama annuse korral. Kahanevate annuste puhul on tavaliselt optimaalsemad kahe- kuni neljakordsed intervallid ja väga pikkadele intervallidele 
(nt kui koefitsient on 6–10) eelistatakse tavaliselt neljanda katse ­
rühma lisamist.
 
Kontrollrühm peab olema rühm, millele ei manustata, või rühm, mis 
saab vehiikelit siis, kui uuritava aine manustamisel kasutatakse vehii ­
kelit. Kontrollrühma loomi tuleb käidelda samal viisil kui katserüh ­
made loomi, välja arvatud see, et neile ei anta uuritavat ainet. Kui 
kasutatakse vehiikelit, manustatakse kontrollrühmale vehiikelit 
suurimas kasutatavas ruumalas. Kui uuritavat ainet antakse koos toiduga ja see põhjustab toidu tarbimise vähenemist, võib paaristoi ­
detav kontrollrühm olla kasulik selleks, et teha vahet maitsest või 
katsemudelis aset leidnud toksikoloogilistest muutustest põhjustatud 
vähenemistel.
 
Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmisi vehiikeli ja teiste 
lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotuvusele, ainevahetusele või retentsioonile; mõju uuritava aine keemilistele 
omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi; ja mõju 
loomade toidu või vee tarbimisele või nende toitumisseisundile.
 
1.4.3.4.  Piirsisalduskatse  
Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega 
päevadoosil 1 000 mg kehakaalu kg kohta täheldatavat toksilist 
toimet ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga ainete osas 
saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta suurema doosiga uuringut vajalikuks. Teha võib piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat 
doositaset.
 
1.5. ANALÜÜSI KAIK  
1.5.1.  Doseerimine  
Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 90 
päeva jooksul. Mis tahes muu doseerimismeetodi, nt viis päeva nädalas, kasutamist tuleb põhjendada. Kui uuritavat ainet manusta ­
takse kunstlikult, peaks seda tegema loomadele ühe doosi kaupa, 
kasutades maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Maksimaalne vedelikumaht, mida võib korraga loomale manustada, sõltub katse ­
looma suurusest. Maht ei tohiks ületada 1 ml kehakaalu 100 g kohta, 
välja arvatud vesilahuste puhul, mille puhul võib kasutada ka suhet 
2 ml kehakaalu 100 g kohta. Välja arvatud ärritavate ja söövitavate ainete puhul, millel on suurematel kontsentratsioonidel tavaliselt halvem toime, tuleks katsemahu varieeruvus muuta minimaalseks 
sellega, et kõikide annuste puhul kohandatakse ühesuguse mahu 
tagamiseks kontsentratsiooni.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Ainete puhul, mida manustatakse toidu või joogiveega, on oluline 
tagada, et toiduga kasutatavad uuritava aine kogused ei häiriks tava ­
list toitmise või joogivee tasakaalu. Kui uuritavat ainet manustatakse toiduga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni toidus (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehakaalule; tuleks täpsus ­
tada, millist võimalust kasutatakse. Kui ainet manustatakse kunstli ­
kult, tuleks doos anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vaja ­
duse korral kohandada, et looma kehakaalu suhtes säiliks püsiv doositase. Kui 90päevane uuring tehakse eeluuringuna pikaajalise 
kroonilise toksilisuse uuringu raames, tuleks mõlema uuringu puhul 
kasutada samasugust toitu.
 
1.5.2.  Vaatlused  
Vaatlusperiood peaks kestma vähemalt 90 päeva. Järelvaatluse jaoks 
planeeritud satelliitrühma loomad tuleks hoida sobiva perioodi jooksul menetlemata, et oleks võimalik avastada toksilise toime pööratavust või püsivust.
 
Vähemalt üks kord päevas tuleks teha üldine kliiniline läbivaatus, 
eelistatavalt igal päeval samal ajal (samadel aegadel), arvestades 
eeldatavat mõju kõrgperioodil pärast doseerimist. Loomade kliiniline 
seisund tuleks dokumenteerida. Vähemalt kaks korda päevas, tavali ­
selt iga päeva alguses ja lõpus, tuleks kontrollida, kas loomad on haigestunud või surnud.
 
Vähemalt üks kord enne esimest kokkupuudet (et võimaldada subjek ­
tide omavahelist kõrvutamist) ja pärast seda kord nädalas tuleks teha kõikide loomade üksikasjalik kliiniline läbivaatus. Need vaatlused 
tuleks teha väljaspool puuri, eelistatavalt selleks ette nähtud kohas ja 
iga kord samal ajal. Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasu ­
tades selleks võimaluse korral katselabori poolt fikseeritud hindamis ­
süsteeme. Tuleks püüda tagada, et vaatlustingimuste varieeruvus oleks 
võimalikult minimaalne. Tuvastatud märgid peaksid hõlmama lisaks muule muutusi nahal, karvades, silmades, limaskestas, ekstraktide ja eritiste esinemist ning autonoomseid toiminguid (nt pisarate vool, 
piloerektsioon, pupillide suunis, ebaregulaarne hingamine). Samuti 
tuleks üles märkida muudatused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, samuti kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku 
hooldus, ringiratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese 
vigastamine, vastupidine käitumine) (1).
 
Oftalmoloogiline läbivaatus, kasutades silmapeeglit või samalaadset 
sobivat vahendit, tuleks teha enne uuritava aine manustamist ja 
uuringu lõppedes eelistatavalt kõikidel loomadel, kuid vähemalt suure doosiga rühmas ja kontrollrühmas. Kui silmades avastatakse muutusi, tuleb läbi vaadata kõik loomad.
 
Kokkupuuteperioodi lõpupoole, kuid mitte varem kui 11. nädalal, 
tuleks läbi viia sensoorse reageerimise kontroll erinevat liiki ärrita ­
jatele (1) (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptori ärritustele) (2, 3, 
4), kinnihaaramise tugevuse (5) ja motoorse aktiivsuse (6) hinda ­
mine. Võimalike meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud vasta ­
vates viidetes. Siiski võib kasutada ka muid meetodeid kui need, 
millele viidatakse.  
Funktsionaalsed vaatlused, mis viiakse läbi uuringu lõpupoole, võib 
ka ära jätta, kui on olemas teiste uuringute funktsionaalsete vaatluste 
andmed ja kui igapäevased kliinilised vaatlused ei toonud esile 
mingeid funktsionaalseid vaegusi.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Erandkorras võib funktsionaalsed vaatlused ära jätta rühmade puhul, 
millel esineb toksilisuse märke niisugusel määral, et see takistaks 
märkimisväärselt funktsionaalsete katsete läbiviimist.  
1.5.2.1.  Kehakaal ja toidu/vee tarbimine  
Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Toidu tarbimist 
tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat ainet manusta ­
takse joogiveega, tuleks vee tarbimist samuti vähemalt kord nädalas mõõta. Vee tarbimise mõõtmist võib kaaluda ka selliste toitumis- või sundsöötmise uuringute korral, mille jooksul võib joomisaktiivsuses 
esineda muutusi.
 
1.5.2.2.  Hematoloogia ja kliiniline biokeemia  
Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast ja neid tuleks 
vajaduse korral säilitada sobivates tingimustes. Katseperioodi lõpus 
võetakse proovid vahetult enne loomade tapmist või selle käigus.  
Katseperioodi lõpul või kui võetakse vahepealseid vereproove, tuleks 
teha järgmised hematoloogilised uuringud: hematokrit, hemoglobiini 
kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja diferentsee ­
ritud arv, vereliistakute arv ja vere hüübimisaja/hüübimisvõime mõõtmine.
 
Kliinilised biokeemilised analüüsid peamiste toksiliste mõjude uuri ­
miseks kudedes ja eelkõige nende toime uurimisel neerudele ja maksale tuleks teha vereproovidega, mis on võetud loomadelt vahe ­
tult enne tapmist või selle ajal (välja arvatud loomad, kes leiti sure ­
vana ja/või tapeti katse ajal). Nii nagu hematoloogilisel uuringul, 
võib võtta ka kliiniliste biokeemiliste katsete jaoks vahepealseid proove. Üks öö enne vereproovi võtmist soovitatakse loomadel paastuda (
 1 ). Plasma või seerumiuuringud peavad hõlmama 
naatriumi, kaaliumi, glükoosi, üldkolesterooli, karbamiidi, kreatiniini, 
üldvalku ja albumiini, vähemalt kahte hepatotsellulaarsele toimele osutavat ensüümi (näiteks alaniinaminotransferaas, aspartaatamino ­
transferaas, aluseline fosfataas, gammaglutamüültranspeptidaas, ja 
sorbitooldehüdrogenaas). Teha võib ka muude ensüümide (maksa 
või teiste organite) ja sapphapete mõõtmisi, mis võivad teatavatel tingimustel anda kasulikku teavet.
 
Alternatiivselt on uuringu viimasel nädalal võimalik loomadelt urii ­
niproovide kogumise teel teha järgmisi uriinianalüüse: välimus, 
ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, valk, glükoos ja veri/vererakud.
 
Lisaks sellele tuleks uurida, kas seerumis on üldistele koekahjustus ­
tele osutavaid markereid. Muud määramised, mis tuleks teha juhul, kui uuritava aine teadaolevad omadused võivad mõjutada või mõju ­
tavad eeldatavasti sellega seotud ainevahetuse profiili, hõlmavad 
kaltsiumi, fosforit, triglütseriide, mis on määratud enne sööki, teata ­
vaid hormoone, methemoglobiini ja koliinesteraasi. Need on vaja määrata teatavatesse klassidesse kuuluvate ainete puhul või konkreet ­
sete juhtude põhiselt.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Mitmete seerumi ja plasma, peamiselt glükoosi mõõtmiste korral ei tohiks loomadele 
eelneva öö jooksul toitu anda. Selle peamiseks põhjuseks on see, et toidu andmise korral 
oleks tulemuste varieeruvus suurem ning see varjaks raskemini tuvastatava toime ning 
muudaks tõlgendamise raskeks. Teisest küljest võib see aga häirida loomade tavapärast 
üldist ainevahetust ja eelkõige toitumisuuringute puhul võib see häirida igapäevaseid 
kokkupuuteid uuritava ainega. Kui loomadele ei anta öö jooksul toitu, tuleks uuringu 
neljandal nädalal tehtud funktsionaalsete vaatluste järel teha kliinilis-biokeemilised 
määramised
 Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi, mis sõltub vastava aine 
liigist ja selle täheldatud ja/või oodatud toimest.  
Kui varasemad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks enne dosee ­
rimise alustamist määrata hematoloogilised ja kliinilis-biokeemi ­
lised muutujad; tavaliselt ei soovitata neid andmeid hankida enne menetlust (7).
 
1.5.2.3.  Täielik lahang  
Kõik uuringusse kaasatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahka ­
mise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki haavu, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Kõikide loomade (välja arvatud need, kes leitakse surevatena ja/või tapetakse uuringu ajal) 
maks, neerud, neerupealsed, munandid, munandimanused, emakas, 
munasarjad, harknääre, põrn, aju ja süda tuleb vajaduse korral puhas ­
tada muudest kudedest ja nende märgmass määratakse kuivamise vältimiseks võimalikult kiiresti pärast dissekteerimist.
 
Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloo ­
gilise uuringu seisukohast kõige sobivamas fiksaatoris: kõik silmaga 
täheldatavad vigastused, aju (olulised piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju ja medulla/ajusild), seljaaju (kolmel tasandil: tservikaalne, poolrindmik, lumbaarne), ajuripats, kilpnääre, kõrvalkilpnääre, hark ­
nääre, söögitoru, süljenäärmed, magu, peen- ja jämesool (sealhulgas 
Peyeri naastud), maks, kõhunääre, neerud, neerupealsed, põrn, süda, trahhea ja kopsud (mis puhutakse kõigepealt säilitusainet täis ja 
seejärel sukeldatakse sinna), aort, sugunäärmed, emakas, lisasuguor ­
ganid, emaste rinnanäärmed, eesnääre, kusepõis, sapipõis (hiir), lümfisõlmed (eelistatult üks lümfisõlm, mis hõlmab manustamis ­
kohta, ja teine lümfisõlm, mis on manustamiskohast eemal, et anda 
teavet süsteemse toime kohta), perifeerne närv (istmiku- või sääreluu 
närv), mis on eelistatult lihase lähedal, ning osa luuüdi (või alterna ­
tiivselt väike kogus toorest luuüdi), nahk ja silmad (kui oftalmoloo ­
gilise läbivaatuse käigus avastati muutusi). Kliinilised ja muud leiud 
võivad osutada vajadusele uurida ka teisi kudesid. Säilitada tuleks ka 
teised organid, mis on uuritava aine teadaolevatest omadustest tule ­
nevalt tõenäoliselt sihtorganid.
 
1.5.2.4.  Histopatoloogia  
Kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud 
organeid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. 
Histopatoloogilised uuringud tuleks läbi viia ka teiste doosirühmade loomade puhul juhul, kui kõrge doosiga rühma osas tuvastatakse manustamisega seotud muudatusi.
 
Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi.  
Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogiline uuringteha 
nende kudede ja organite puhul, millel esineb samasugune toime 
kui katserühma puhul.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. ANDMED  
Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Lisaks sellele 
tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma 
kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või 
humaansetel põhjustel tapetud loomade arv, toksiliste märkidega loomade arv, täheldatud toksiliste märkide kirjeldus, sealhulgas toksilise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade 
arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta loomade protsent, 
kellel neid esines.
 
Kui võimalik, tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohaste ja üldi ­
selt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistiliste meetodite ja 
analüüsitavate andmete valik tuleks teha uuringu kavandamisel.  
2.2. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.  
2.2.1.  Uuritav aine:  
— füüsikaline loomus, puhtus ning füüsikalis-keemilised omadused;  
— identifitseerimisandmed;  
— vehiikel (vajaduse korral): vehiikeli valiku põhjendamine, kui 
vehiikeliks ei ole vesi.  
2.2.2.  Katseloomade liigid:  
— liik ja kasutatav liin;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, toit jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  
2.2.3.  Katsetingimused:  
— doositaseme valimise põhjendus;  
— üksikasjad uuritava aine koostise/toiduvalmistise kohta, valmis ­
tises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse 
kohta;  
— uuritava aine manustamise üksikasjad;  
— tegelikud doosid (mg kehakaalu kg kohta päevas) ja vajaduse 
korral ümberarvestustegur toidu/joogivee uuritava aine kontsen ­
tratsiooni (ppm) ja tegeliku doosi vahel;  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.  
2.2.4.  Tulemused:  
— eluskaal ja muutused eluskaalus;  
— toidu ja vajaduse korral vee tarbimine;  
— toksilise reaktsiooni andmed vastavalt looma soole ja doositase ­
mele, sealhulgas toksilisuse märgid;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või 
mitte);  
— oftalmoloogilise läbivaatuse tulemused;  
— sensoorse aktiivsuse, haardetugevuse ja motoorse tegevuse hinda ­
mine (kui võimalik);  
— hematoloogilised katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;  
— kliinilise biokeemia katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;  
— lõplik kehakaal, organite kaal ja organite/kehakaalu suhted;  
— lahkamise tulemused;  
— histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— võimaluse korral andmed imendumise kohta;  
— vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
3. VIITED  
1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
2) Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999–1003.  
3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691–704.  
4) Moser, V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, pp. 267–283.
 
5) Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. (1979). A 
Method for the Routine Assessment of Fore-and Hind- limb grip 
Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 
233–236.  
6) Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C, Gill M. W, Reiter L. 
W, Tilson H. A, MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Compa ­
rison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxi ­
cological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599–609.  
7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety 
Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198–201.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  SUBKROONILISE SUUKAUDSE TOKSILISUSE KATSE – 
SUUKAUDSE KORDUSDOOSI TOKSILISUSE 90PÄEVANE 
UURING MITTENÄRILISTEL  
1. MEETOD  
See subkroonilise suukaudse toksilisuse uurimismeetod lähtub juhen ­
dist OECD TG 409 (1998).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kemikaali toksiliste omaduste kindlaksmääramisel ja hindamisel võib 
teha subkroonilise suukaudse toksilisuse katseid, kasutades kordus ­
doose pärast seda, kui on saadud esialgne teave toksilisuse kohta 
akuutsetest või 28päevastest kordusdoosidega toksilisuse katsetest. 
90päevane uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, mis võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral kiire kasvu ­
perioodi jooksul kuni nooremasse täisikka arenemiseni. Uuring 
annab teavet toksilisuse peamiste mõjude kohta, tuvastab sihtorganid 
ja akumuleerumisvõimaluse ja võib anda katsealustele organismidele täheldatavat toimet mitteavaldava kontsentratsiooni väärtuse, mida saab kasutada doositasemete valimisel krooniliste mõjude uurimisel 
ja ohutuskriteeriumide väljatöötamisel kokkupuutel inimestega.
 
Käesolev uurimismeetod võimaldab kindlaks määrata keemilise 
ainega kokkupuute ebasoodsaid mõjusid mittenäriliste liikidel ja 
seda tuleks kasutada ainult siis,  
— kui teistes uuringutes täheldatud mõjud viitavad vajadusele saada 
selgust või iseloomustust teise, mittenäriliste liigi kohta või  
— kui toksikokineetilised uuringud viitavad sellele, et konkreetse 
mittenäriliste liigist laboratooriumiloomade kasutamine on 
parim valik, või  
— kui mõni muu konkreetne põhjus õigustab mittenäriliste liigi 
kasutamist.  
Vt ka üldise sissejuhatuse B osa.  
1.2. MÕISTED  
Doos –  uuritava aine manustatav kogus. Doosi väljendatakse massina 
(g, mg) või uuritava aine massina katsealuse looma kaaluühiku kohta 
(nt mg/kg) või toidus oleva püsikontsentratsioonina (ppm).  
Doseerimine –  üldmõiste, mis hõlmab doosi, selle sagedust ja dosee ­
rimise kestust.  
NOAEL –  lühend sõnadest „no observed adverse effect level” ehk 
dooside kõige kõrgem tase, mis vastab katseorganismidele tähelda ­
tavat toimet mitteavaldavale sisaldusele.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritav aine manustatakse erinevatele katseloomade rühmadele suu 
kaudu kord päevas astmeliselt suureneva koguse kaupa selliselt, et üks rühm saaks 90 päeva jooksul ainult ühte doosi. Manustamispe ­
rioodi jooksul vaadeldakse loomi põhjalikult toksilisuse märkide 
tuvastamiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning 
katse lõppemisel tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Loomaliigi valik  
Tavaliselt kasutatav mittenäriliste liik on koerad, kelle tõug peaks 
olema täpselt määratletud; sageli kasutatakse jänesekoeri. Kasutada 
võib ka teisi liike, nt sigu ja minisigu. Esikloomaliste kasutamine ei 
ole soovitatud ja nende kasutamist tuleb põhjendada. Kasutada tuleks noori, terveid loomi ja koerte puhul võiks doseerimine eelistatavalt alata 4-6 kuu aga mitte hiljem kui üheksa kuu vanuselt. Kui uuring 
tehakse eeluuringuna pikaajalise kroonilise toksilisuse uuringu 
raames, tuleks mõlemas uuringus kasutada sama liiki/tõugu loomi.
 
1.4.2.  Loomade ettevalmistamine  
Kasutada tuleks terveid noori loomi, kes on aklimatiseerunud labo ­
ratooriumi tingimustega ning keda ei ole varem uuringus kasutatud. Aklimatiseerumise kestus sõltub valitud katselooma liigist ja pärito ­
lust. Selle kestuseks soovitatakse vähemalt viis päeva koertele või 
vastaval eesmärgil kohapeal kasvatatavatele sigadele ja vähemalt kaks nädalat kõnealustele loomadele, kui need on pärit väljastpoolt laboratooriumi. Katseloomad tuleks kirjeldada vastavalt nende liigile, 
liinile, päritolule, soole, kaalule ja/või vanusele. Loomad tuleks 
juhuslikult paigutada kontroll- ja katserühmadesse. Puurid tuleks asetada nii, et puuri ümberasetamisega seotud võimalikud mõjud 
oleks minimaalsed. Igale loomale peab määrama unikaalse identifit ­
seerimisnumbri.
 
1.4.3.  Dooside ettevalmistamine  
Uuritavat ainet võib manustada söögi või joogiveega, sundsöötmi ­
sega või kapslitena. Suukaudse manustamise meetod sõltub uuringu eesmärgist ja uuritava aine füüsikalis-keemilistest omadustest.
 
Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine 
sobivas vehiikelis. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõige ­
pealt kasutada vesilahust/suspensiooni, seejärel õlilahust/emulsiooni 
(nt maisiõli) ja siis lahustamist teistes vehiikelites. Mittevesilahuse ­
liste vehiikelite puhul peab teadma vehiikeli toksilisi omadusi. Kind ­
laks tuleks määrata uuritava aine püsivus manustamise tingimustes.  
1.5. KATSE KÄIK  
1.5.1.  Loomade arv ja sugu  
Iga doositaseme juures tuleks kasutada vähemalt kaheksat looma 
(nelja emast ja nelja isast). Kui osa loomi on kavas katse käigus 
tappa, tuleks loomade arvu enne katse lõppu tapetavate loomade arvu võrra suurendada. Loomade arv uuringu lõpul peab olema piisav toksilise mõju adekvaatseks hindamiseks. Tuginedes eelneva ­
tele teadmistele aine või selle lähedase analoogi kohta, tuleks 
kaaluda kaheksaloomalise (neli kummastki soost) satelliitrühma lisa ­
mist kontrollrühma ja suurima doosi rühma, et jälgida pärast manus ­
tamisperioodi lõppu mis tahes toksilise toime pööratavust või püsi ­
vust. Selle menetlusjärgse perioodi kestus tuleks dokumenteerida 
vastavalt täheldatud mõjudele.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Doseerimine  
Uurimuses tuleb kasutada vähemalt kolme doositaset ja ühel ajal 
uuringuga peab tegema ka kontrolli, välja arvatud piirsisalduskatse tegemisel (vt 1.5.3). Doositasemed võivad põhineda kordusdoosi või 
vahemiku leidmise uuringu tulemustel ja peaksid arvesse võtma uuri ­
tava ühendi või sellega seotud materjalide kohta olemasolevat toksi ­
koloogilist ja toksikokineetilist teavet. Kui uuritava aine füüsikalis- keemilised omadused või bioloogiline mõju ei piira suurima doosi 
valimist, tuleb doositase valida nii, et sellega kaasneks mürgitus, 
kuid et see ei põhjustaks surma ega tõsiseid kannatusi. Doositasemed tuleks valida kahanevas järjekorras, eesmärgiga näidata iga doosiga 
seotud reaktsioonid ja katseorganismidele täheldatavat toimet mitte ­
avaldav sisaldus (NOAEL) kõige madalamal doositasemel. Sageli on kõige optimaalsemad kahe- kuni neljakordsed erinevused alanevate doositasemete korral ja sageli on kasulikum lisada neljas katserühm, 
kui kasutatakse väga suuri vahesid dooside vahel (nt suuremaid kui 
6–10kordseid).
 
Kontrollrühm peab olema rühm, millele ei manustata, või rühm, mis 
saab vehiikelit, kui uuritava aine manustamisel kasutatakse vehiikelit. 
Kontrollrühma loomi tuleb käidelda samal viisil kui katserühmade loomi, välja arvatud see, et neile ei anta uuritavat ainet. Kui kasu ­
tatakse vehiikelit, manustatakse kontrollrühmale vehiikelit suurimas 
kasutatavas ruumalas. Kui uuritavat ainet antakse koos toiduga ja see 
põhjustab toidu tarbimise vähenemist, võib paaristoidetav kontroll ­
rühm olla kasulik selleks, et teha vahet maitsest või katsemudelis aset leidnud toksikoloogilistest muutustest põhjustatud vähenemisel.
 
Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmiseid vehiikeli ja teiste 
lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotumisele, 
ainevahetusele või retentsioonile; mõju uuritava aine keemilistele 
omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi; ja mõju loomade toidu või vee tarbimisele või nende toitumisseisundile.
 
1.5.3.  Piirsisalduskatse  
Kui katse ühe doosi suurusega, mis on vähemalt 1 000 mg looma 
kehakaalu kg kohta ööpäevas, kasutades käesoleva uuringu jaoks 
kirjeldatud töökorda, ei põhjusta märgatavat ebasoodsat mõju ja 
kui toksilisust ei eeldata samalaadse struktuuriga ainete kohta käivate andmete põhjal, ei ole kolme doosi suurustega täisuuring vajalik. Teha võib piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokku ­
puude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
 
1.5.4.  Doseerimine  
Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 90 
päeva jooksul. Mis tahes muu doseerimisrežiim, nt viis päeva 
nädalas, vajab põhjendamist. Kui uuritavat ainet manustatakse kunst ­
likult, peaks seda tegema loomadele ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Maksimaalne vedeliku ­
maht, mida võib korraga loomale manustada, sõltub katselooma 
suurusest. Tavaliselt tuleks hoida need mahud võimalikult madalal. Välja arvatud ärritavate või söövitavate ainete puhul, millel on suure ­
matel kontsentratsioonidel tavaliselt halvem toime, tuleks katsemahu 
varieeruvus muuta minimaalseks sellega, et kõikidel doositasemetel 
kohandatakse ühesuguse mahu tagamiseks kontsentratsiooni.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Ainete puhul, mida manustatakse toidu või joogiveega, on oluline 
tagada, et toiduga kasutatavad uuritava aine kogused ei häiriks tava ­
list toitmise või joogivee tasakaalu. Kui uuritavat ainet manustatakse toiduga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni toidus (ppm) või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehakaalule; valitud alterna ­
tiiv tuleb täpsustada. Kui ainet manustatakse kunstlikult, tuleks doos 
anda igal päeval samal ajal ning seda tuleks vajaduse korral kohan ­
dada, et looma kehakaalu suhtes säiliks püsiv doositase. Kui 90päevane uuring tehakse eeluuringuna pikaajalise kroonilise toksi ­
lisuse uuringu raames, tuleks mõlemas uuringus kasutada sama ­
laadset toitu.
 
1.5.5.  Vaatlused  
Vaatlusperiood peaks kestma vähemalt 90 päeva. Järelvaatluse jaoks 
planeeritud satelliitrühma loomad tuleks hoida sobiva perioodi jooksul menetlemata, et oleks võimalik avastada toksilise toime pööratavust või püsivust.
 
Vähemalt üks kord päevas tuleks teha üldine kliiniline läbivaatus, 
eelistatavalt igal päeval samal ajal/samadel aegadel, arvestades eelda ­
tavat mõju kõrgperioodil pärast doseerimist. Loomade kliiniline 
seisund tuleks dokumenteerida. Vähemalt kaks korda päevas, tavali ­
selt iga päeva alguses ja lõpus, tuleks kontrollida, kas loomad on haigestunud või surnud.
 
Vähemalt üks kord enne esimest kokkupuudet (et võimaldada 
subjektide omavahelist kõrvutamist) ja pärast seda kord nädalas tuleks teha kõikide loomade üksikasjalik kliiniline läbivaatus. Kui 
see on praktiliselt võimalik, tuleks sellised vaatlused tuleks teha 
väljaspool puuri, selleks ettenähtud kohas ja eelistatavalt iga kord samal ajal. Tuleks üritada tagada, et vaatlustingimuste varieerumine oleks minimaalne. Toksilisuse nähud tuleks koos nende algusaja, 
raskusastme ja kestusega hoolikalt üles märkida. Vaatlus peaks seal ­
hulgas sisaldama muutusi nahal, karvkattes, silmades, limaskestadel, sekretsiooni ja ekskretsiooni esinemises ja autonoomses tegevuses (nt pisaratevool, karvade jäigastumine, pupilli suurus, ebatavaline hinga ­
misrütm). Samuti tuleks üles märkida muutused käimises, seisangus 
ja samuti reageerimine käitlemisele ning klooniliste või tooniliste liigutuste esinemine, stereotüübid (nt liigne karvade puhastamine, korduv tiirlemine) või igasugune kummaline käitumine.
 
Oftalmoloogiline läbivaatus, kasutades silmapeeglit või samalaadset 
sobivat vahendit, tuleks teha enne uuritava aine manustamist ja uuringu lõppedes eelistatavalt kõikidel loomadel, kuid vähemalt 
suure doosiga rühmas ja kontrollrühmas. Kui silmades avastatakse 
muutusi, tuleb läbi vaadata kõik loomad.
 
1.5.5.1.  Kehakaal ja toidu/vee tarbimine  
Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas. Toidu tarbimist 
tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat ainet manusta ­
takse joogiveega, tuleb vee tarbimist samuti vähemalt kord nädalas mõõta. Vee tarbimise mõõtmist võib kaaluda ka selliste toitumis- või 
kunstlikult toitmise uuringute korral, mille jooksul võib joomisaktiiv ­
suses esineda muutusi.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hematoloogia ja kliiniline biokeemia  
Vereproovid tuleks võtta kindlaksmääratud kohast ja neid tuleks 
vajaduse korral säilitada sobivates tingimustes. Katseperioodi lõpus võetakse proovid vahetult enne loomade tapmist või selle käigus.
 
Katse alguses tuleks uurida hematoloogiat, sealhulgas hematokritti, 
hemoglobiini kontsentratsiooni, erütrotsüütide arvu, leukotsüütide 
üld- ja diferentseeritud arvu, vereliistakute arvu ja mõõta vere hüübi ­
misvõimet, nagu näiteks hüübimise kiirust, protrombiiniaega või tromboplastiiniaega, seejärel kas kord iga kuu või katseperioodi keskel ja lõpuks katseperioodi lõpus.
 
Kliinilise biokeemia analüüsid, millega uuritakse kõige tähtsamaid 
mürgi mõjusid kudedes ja eriti selle mõju neerule ja maksale, tuleks teha vereproovide kohta, mis on võetud kõikidelt loomadelt katse 
alguses, seejärel kas kord iga kuu või katseperioodi keskel ja lõpuks 
katseperioodi lõpus. Vaatluse alla tuleks võtta sellised uuringuvald ­
konnad nagu elektrolüütide tasakaal, sahhariidide ainevahetus ja maksa ning neeru funktsioon. Konkreetsete katsete valikut mõjutavad 
tähelepanekud uuritava aine mõju kohta. Sõltuvalt liigist ei tohiks 
loomadele enne vereproovide võtmist teatud aja vältel süüa anda. Soovitatavad analüüsid on kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, paastumise glükoos, alaniinaminotransferaas, aspartaadami ­
notransferaas, ornitiindekarboksülaas, gamma-glutamüültranspepti ­
daas, karbamiidlämmastik, albumiin, vere kreatiniin, kogu bilirubiin ja kogu seeriumi valgu mõõtmised.
 
Uriinianalüüsi peaks tegema vähemalt uuringu alguses, keskel ja 
lõpus, kasutades uriini kogumist kindlatel aegadel. Uriinianalüüsi puhul määratakse välimus, ruumala, osmolaalsus või erikaal, pH, 
valk, glükoos ja veri ja/või vererakud. Vajadusel võib kasutada lisa ­
parameetreid, kui on tarvis laiendada täheldatud mõju uurimist.
 
Lisaks tuleks kaaluda üldisele kudede kahjustusele osutavate marke ­
rite uurimist. Muud analüüsid, mis võivad osutuda vajalikuks 
adekvaatse toksikoloogilise hindamise saamiseks, hõlmavad lipiidide, hormoonide, happe-aluse tasakaalu, methemoglobiini ja kolineste ­
raasi pärssimise analüüse. Vajadusel võib kasutada täiendavaid klii ­
nilise biokeemia valdkonda kuuluvaid uuringuid, kui on tarvis laien ­
data täheldatud mõju uurimist. Need tuleb kindlaks määrata teatud klassi kuuluvate kemikaalide puhul või iga juhtumi puhul eraldi.
 
Üldiselt on vaja paindlikku lähenemist, mis sõltub liigist ja antud 
aine täheldatud ja/või eeldatavast mõjust.  
1.5.5.3.  Täielik lahang  
Kõik uuringusse kaasatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahka ­
mise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki haavu, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisu. Kõikide loomade (välja 
arvatud need, kes leitakse surevatena ja/või tapetakse uuringu ajal) 
maks koos sapipõiega, neerud, neerupealsed, munandid, munandima ­
nused, munasarjad, emakas, kilpnääre (koos kõrvalkilpnäärmetega), harknääre, põrn, aju ja süda tuleb vajaduse korral puhastada muudest 
kudedest ja nende märgmass tuleks fikseerida võimalikult kohe 
pärast nende eemaldamist, et vältida kuivamist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloo ­
gilise uuringu seisukohast kõige sobivamas fiksaatoris: kõik silmaga 
täheldatavad vigastused, aju (olulised piirkonnad, sealhulgas suuraju, väikeaju ja medulla/ajusild), seljaaju (kolmel tasandil: tservikaalne, poolrindmik, lumbaarne), ajuripats, silmad, kilpnääre, kõrvalkilp ­
nääre, harknääre, söögitoru, süljenäärmed, magu, peen- ja jämesool 
(sealhulgas Peyeri naastud), maks, sapipõis kõhunääre, neerud, neerupealsed, põrn, süda, trahhea ja kopsud, aort, sugunäärmed, emakas, lisasuguorganid, emaste rinnanäärmed, eesnääre, kusepõis, 
lümfisõlmed (eelistatavalt üks lümfisõlm, mis paikneb manustamise 
teel, ja teine, mis asub manustamise teest kaugel ja näitab süsteemset mõju), perifeerne närv (istmik või sääreluu), eelistatavalt vastava lihase läheduses olev, luuüdi proov (ja/või värske luuüdi aspiraat) 
ja nahk. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida 
ka teisi kudesid. Säilitada tuleks ka teised organid, mis on uuritava aine teadaolevatest omadustest tulenevalt tõenäoliselt sihtorganid.
 
1.5.5.4.  Histopatoloogia  
Kõikide võrdlusrühma ja kõrge doosiga rühmade loomade säilitatud 
organeid ja kudesid tuleks histopatoloogiliselt põhjalikult uurida. See uuring tuleks läbi viia ka teiste doosirühmade loomade puhul juhul, kui kõrge doosiga rühma osas tuvastatakse manustamisega seotud 
muudatusi.
 
Uurida tuleks kõiki silmaga täheldatavaid kahjustusi.  
Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogiline uuring teha 
nende kudede ja organite puhul, millel esineb samasugune toime kui 
katserühma puhul.  
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. ANDMED  
Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Lisaks sellele 
tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või 
humaansetel põhjustel tapetud loomade arv, toksiliste märkidega 
loomade arv, täheldatud toksiliste märkide kirjeldus, sealhulgas toksilise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta loomade protsent, 
kellel neid esines.
 
Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja 
üldiselt tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid ja analüüsitavad andmed tuleks valida uuringu kavandamise etapis.
 
2.2. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Uuritav aine:  
— füüsikaline loomus, puhtus ning füüsikalis-keemilised omadused;  
— identifitseerimisandmed;  
— vehiikel (vajaduse korral): vehiikeli valiku põhjendus, kui vehii ­
keliks ei ole vesi.  
2.2.2.  Katseloomade liigid:  
— liik ja kasutatav liin;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, toit jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  
2.2.3.  Katsetingimused:  
— doositaseme valimise põhjendus;  
— üksikasjad uuritava aine koostise/toiduvalmistise kohta, valmis ­
tises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse 
kohta;  
— uuritava aine manustamise üksikasjad;  
— tegelikud doosid (mg kehakaalu kg kohta päevas) ja vajaduse 
korral ümberarvestustegur toidu/joogivee uuritava aine kontsen ­
tratsiooni (ppm) ja tegeliku doosi vahel;  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.  
2.2.4.  Tulemused  
— eluskaal/muutused eluskaalus;  
— toidu ja vajaduse korral vee tarbimine;  
— toksilise reaktsiooni andmed vastavalt looma soole ja doositase ­
mele, sealhulgas toksilisuse märgid;  
— kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või 
mitte);  
— oftalmoloogiline läbivaatus;  
— hematoloogilised katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;  
— kliinilise biokeemia katsed ja vastavate põhijoonte väärtused;  
— lõplik kehakaal, organite kaal ja organite kaalu/kehakaalu suhted;  
— lahkamise tulemused;  
— histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— vajaduse korral tulemuste  
— statistiline töötlemine.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  SUBKROONILISE TOKSILISUSE TEST NAHAKAUDSEL 
MANUSTAMISEL – 90PÄEVANE KORDUVANNUSTE 
NAHAKAUDSE MANUSTAMISE UURING NÄRILISTE 
LIIKIDEL  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritavat ainet manustatakse 90 päeva jooksul iga päev suu kaudu 
gradueeritud annustes mitmele katseloomade rühmale, iga uuringu ­
rühm saab eri suurusega annuse. Ravimi manustamise perioodil jälgi ­
takse loomi iga päev, et tuvastada toksilisuse nähtude ilmnemist. 
Katse ajal surnud loomad lahatakse, katse lõppedes surmatakse ja 
lahatakse kõik ellujäänud loomad.  
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistused  
Loomi hoitakse eksperimentaalsetes elu- ja toitumistingimustes vähe ­
malt viis päeva enne uuringu algust. Enne katse algust terved noored 
loomad randomiseeritakse ning määratakse ravi- ja kontrollrühma ­
desse. Vahetult enne uuringut pügatakse katseloomade karv kehatü ­
velt selja piirkonnast. Kasutada võib raseerimist, kuid seda tuleb teha umbes 24 tundi enne uuringu algust. Korduvat pügamist või rasee ­
rimist on tavaliselt vaja rakendada nädalaste intervallidega. Karva 
lõigates või raseerides tuleb olla ettevaatlik, et mitte nahka kriimus ­
tada. Uuritava aine manustamiseks peaks olema paljastatud vähemalt 10 % nahapinnast. Paljastamist vajava nahapinna suuruse ja katmise 
dimensioonide otsustamisel tuleb arvesse võtta looma kaalu. Tahkete 
ainete manustamisel pulverisaatoriga, kui see on sobilik, tuleb uuri ­
tavat ainet piisavalt niisutada veega või vajadusel sobiva kandeai ­
nega, et kindlustada head kontakti nahaga. Vedelaid aineid kasuta ­
takse tavaliselt ilma lahjendamata. Kasutatakse igapäevast manusta ­
mist viiest kuni seitsme päevani nädalas.
 
1.6.2.  Katsetingimused  
1.6.2.1. K a t s e l o o m a d  
Kasutada tuleks täiskasvanud rotte, küülikuid või merisigu. Teisi 
liike võib kasutada, kuid selline otsus peab olema põhjendatud. Uuringu alguses ei tohiks loomade kaal erineda keskmisest rohkem kui ± 20 %. Kui subkroonilise nahakaudse manustamise uuring 
tehakse pikaajalise uuringu eelfaasina, tuleks mõlemas kasutada 
samu loomaliike ja liine.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
1.6.2.2. A r v j a s u g u  
Igasse annuserühma peaks kuuluma vähemalt 20 terve nahaga looma 
(10 isast ja 10 emast). Emasloomad tohi olla poeginud ega tiined. Kui osa loomi kavandatakse surmata uuringu vältel, tuleb katsealuste 
algarvu suurendada enne uuringu lõppu surmata plaanitud loomade 
arvu võrra. Peale selle võib moodustada satelliitrühma 20 loomast (10 looma kummastki soost), keda ravida suurte annustega 90 päeva ja jälgida toksiliste toimete pöörduvust, püsivust ja hilinenud avaldu ­
mist 28 päeva pärast ravi lõppu.
 
1.6.2.3. A n n u s e d  
Kasutada tuleb vähemalt kolme erinevat annust saavat rühma ja ühte 
kontrollrühma või vehiikli kontrollrühma, kui kasutatakse vehiiklit. Uuritavat ainet tuleks manustada iga päev samal ajal ja annuseid 
tuleb kohandada kindlate ajavahemike järel (üks või kaks korda 
nädalas), et säilitada püsiv tase looma kehamassi kohta. Kontroll ­
rühma loomi tuleks kohelda nii nagu katserühma loomi (v.a uuritava ravimi manustamine). Kui annustamiseks kasutatakse vehiiklit, tuleks 
kontrollrühmale manustada vehiiklit samal viisil nagu ravirühmale ja 
nad peaksid seda saama võrdses koguses suurimat annust saava rühmaga. Suurima annuse korral peaks ilmnema toksiline toime, 
kuid surmajuhte ei tohiks olla või tekib neid vähe. Väikseim annus 
ei peaks põhjustama mingeid toksilisuse nähte. Kui saadaval on andmeid inimese ekspositsioonist, peaks madalaim annus ületama inimesel kasutatud taset. Ideaalselt peaks keskmine annus põhjus ­
tama minimaalset tuvastatavat toksilisust. Kui kasutatakse enam kui 
ühte vahepealset annusetaset, peaks nende vahed olema sellised, et tekiks toksiliste toimete astmeline suurenemine. Väikesi ja keskmisi annuseid saavates rühmades ja kontrollrühmas peaks surmajuhte 
olema vähe, et tulemustest saaks teha tähenduslikke järeldusi.
 
Kui uuritava aine manustamine põhjustab tõsist nahaärritust, tuleb 
kontsentratsiooni vähendada. See võib kaasa tuua toksiliste toimete vähenemise või puudumise suure annuse rühmas. Kui nahk on raskelt kahjustunud, võib osutuda vajalikuks uuring lõpetada ja alus ­
tada uut uuringut madalamate kontsentratsioonidega.
 
1.6.3. P i i r s i s a l d u s k a t s e  
Kui eelnev uuring annusega 1 000 mg/kg kehakaalu kohta päevas 
või teadaolev inimese ekspositsioon sellest suuremale annusele ei ole põhjustanud toksilisi toimeid, pole edasine uuring vajalik.
 
1.6.4. J ä l g i m i s a e g  
Katseloomi tuleb iga päev jälgida toksilisuse ilmingute suhtes. Regis ­
treerida tuleb surma aeg ja aeg, millal toksilisuse nähud ilmuvad või 
kaovad.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
1.6.5. P r o t s e d u u r  
Loomad peavad olema kambrites ühekaupa. Loomadele manusta ­
takse uuritavat ainet ideaalsel juhul seitse päeva nädalas 90 päeva jooksul.
 
Satelliitrühmadesse kuuluvaid loomi hoitakse jälgimiseks ilma ravita 
järgmised 28 päeva, et tuvastada toksilise toime möödumist või püsimist. Ekspositsiooni aeg peab olema kuus tundi päevas.
 
Uuritavat ainet tuleb manustada ühtlaselt nahapiirkonnale suurusega 
umbes 10 % kehapinnast. Väga toksiliste ainete puhul võib kasutada 
väiksemat nahapinda, kuid üldiselt tuleks katta nii suur ala kui 
võimalik võimalikult õhukese ja ühtlase kihiga.  
Ekspositsiooniaja jooksul hoitakse uuritavat ainet nahaga kontaktis 
poorse marlisideme ja mitteärritava teibiga. Manustamiskohta tuleb katta sobival viisil, et hoida side ja uuritav aine paigal ja kindlustada, 
et loomad ei saaks uuritavat ainet alla neelata. Uuritava aine allanee ­
lamise vältimiseks võib kasutada piiravaid vahendeid, kui täielik immobilisatsioon ei ole soovitatav meetod.
 
Ekspositsiooniaja lõpus tuleb uuritava aine jäägid nahalt kõrvaldada, 
kui see on rakendatav. Puhastamiseks kasutatakse vett või mõnda 
muud sobivat nahapuhastamise meetodit.  
Kõiki loomi tuleb jälgida iga päev ja registreerida toksilisuse 
ilmingud, sealhulgas algusaeg, ulatus ja kestus. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade ja limaskes ­
tade, aga ka hingamis-, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse 
närvisüsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismus ­
trit. Iga nädal tuleks mõõta toidu tarbimist ja loomi kaaluda. Loomade regulaarne jälgimine on vajalik tagamaks niipalju kui 
võimalik, et loomad ei langeks katsest välja sellistel põhjustel nagu 
kannibalism, kudede autolüüs või loomade vale paigutus. Katsepe ­
rioodi lõpus lahatakse kõik mitte-satelliitravirühma kuulunud loomad. Surevad loomad tuleb eemaldada, surmata ja lahata, kui 
nad leitakse.
 
Tavalisel juhul tehakse kõigil loomadel (kaasa arvatud kontrollgruppi 
kuuluvatel) järgmised uuringud:  
a) oftalmoloogiline uuring tuleks teha oftalmoskoobi või sobiva 
samaväärse vahendi abil enne kokkupuudet uuritava ainega ja uuringu lõppedes kõigile loomadele, kuid kindlasti suuri annuseid 
saanud ja kontrollrühma kuulunud loomadele. Kui leitakse 
muutusi silmades, tuleks uurida kõiki loomi;
 
b) katse lõpus tuleks uurida hematoloogilisi näitajaid, sealhulgas 
hematokrit, hemoglobiini kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide absoluutarv ja valem ning vere hüübimisnäitajaid, 
nagu näiteks hüübimisaeg, protrombiini aeg, tromboplastiini aeg 
või trombotsüütide arv;
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) kliinilise biokeemia näitajaid tuleb määrata uuringuperioodi lõpus. 
Kõikide uuringute puhul sobivate analüüside hulka kuuluvad 
elektrolüütide tasakaalu, süsivesikute metabolismi, maksa- ja neerufunktsiooni kajastavad näitajad. Spetsiifiliste testide valik sõltub vaatlusandmetest uuritava aine toimeviisi kohta. Soovita ­
tavad analüüsid on: kaltsium, fosfor, kloriid, naatrium, kaalium, 
tühja kõhu glükoos (liigile kohase näljaperioodiga), seerumi glutamaatpüruvaadi transaminaas, (
 1 ) seerumi glutamaatoksaloat ­
setaadi transami-naas, (  2 ) ornitiini dekarboksülaas, gammagluta ­
müültranspeptidaas, uurea lämmastik, albumiin, seerumi kreati ­
niin, üldbilirubiin ja üldvalk. Toksilisuse adekvaatseks hindami ­
seks võib olla vajalik määrata järgmisi näitajaid: lipiidid, hormoonid, hape-alus tasakaal, methemoglobiin ja koliinesteraasi 
aktiivsus. Kui ilmnenud toimeid on vaja põhjalikumalt uurida, 
võib kasutada veel teisigi kliinilise biokeemia analüüse;
 
d) uriinianalüüsi ei ole vaja teha rutiinselt, vaid ainult juhul, kui see 
on näidustatud oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu.  
Kui teadaolevad lähteandmed ei ole piisavad, tuleks kaaluda hema ­
toloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate määramist enne annusta ­
mise algust.  
L a h a n g  
Kõikidele loomadele tuleb teha täielik lahang, mis hõlmab keha 
välispinna ja kõigi kehaavauste uurimist, samuti kolju, rindkere ja kõhuõõne ja nende sisu uurimist. Maks, neerud, neerupealised ja 
testised tuleb kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. 
Kõik järgmised organid või koed tuleb säilitada vastavates keskkon ­
natingimustes võimalikeks hilisemateks histopatoloogilisteks uurin ­
guteks: ajukude, sealhulgas piklikaju/ajusild, väikeaju ja suuraju 
korteksi lõigud, ajuripats, kilpnääre/kõrvalkilpnääre, kõik harknäärme 
koed, hingetoru ja kopsud, süda, aort, süljenäärmed, maks, põrn, neerud, neerupealised, pankreas, gonaadid, emakas lisasugunäärmed, sapipõis (kui see on olemas), söögitoru, magu, kaksteistsõrmiksool, 
tühi- ja niudesool, umbsool, jämesool, pärak, põis, näidislümfi ­
sõlmed, (emasloomal piimanäärmed), (reiepiirkonna lihaskond), peri ­
feerne närv, (silmad), rinnak koos luuüdiga, (reieluu, sealhulgas liigespind), (seljaaju kolmel tasemel – kaelaosa, keskmine rinnaosa, 
lumbaarosa) ja (ekstraorbitaalsed pisaranäärmed). Kudesid, mida on 
mainitud sulgudes, on vaja uurida ainult juhul, kui see on näidus ­
tatud toksilisuse ilmingute tõttu või sihtorgani haaratuse tõttu.
 
H i s t o p a t o l o o g i l i n e u u r i n g  
a) Täielik histopatoloogiline uuring tuleb teha kontrollrühma või 
suuri annuseid saanud rühma kuulunud loomade normaalsest ja ravitud nahast ja organitest ja kudedest.
 
b) Uurida tuleb kõiki silmaga nähtavaid lesioone.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Praegu tuntud kui aspartaadi aminotransferaas. 
( 2 ) Praegu tuntud kui alaniini aminotransferaas.
 c) Teiste annustega rühmades tuleb uurida sihtorganeid.  
d) Kui kasutatakse rotte, tuleks väikese ja keskmise annuse rühma ­
desse kuuluvatel loomadel teostada kopsude histopatoloogilised 
uuringud infektsioonitunnuste suhtes, sest sel viisil on mugav hinnata loomade tervislikku seisundit. Edasisi histopatoloogilisi uuringuid ei pruugi nendesse rühmadesse kuuluvatel loomadel 
rutiinselt vaja olla, kuid need tuleb igal juhul teostada organitel, 
kus suurte annuste kasutamisel täheldati lesioonide teket.
 
e) Kui kasutatakse satelliitrühma, tuleks histopatoloogilised uuringud 
teha nendel organitel, mis ravi saanutel kahjustusid.  
2. ANDMED  
Andmed tuleks võtta kokku tabelis, näidates iga katsegrupi puhul ära 
loomade arvu uuringu alguses, nende loomade arvu, kellel ilmnes 
lesioone ja lesioonide tüübid ja iga tüübi protsentuaalse osakaalu. Tulemusi tuleb hinnata sobiva statistilise meetodi abil. Kasutada võib ükskõik millist tunnustatud statistilist meetodit.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— loomaliik, liin, päritolu, keskkonnatingimused, dieet;  
— katsetingimused;  
— annused (sealhulgas vehiikel, kui seda kasutatakse) ja kontsen ­
tratsioonid;  
— toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa;  
— toime puudumise tase, kui see on võimalik;  
— surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpe ­
tamiseni;  
— toksiliste või muude toimete kirjeldus;  
— iga normist kõrvalekalduva sümptomi ilmnemise aeg ja edasine 
kulg;  
— andmed toidu ja kehakaalu kohta;  
— oftalmoloogilised leiud;  
— kasutatud hematoloogilised analüüsid ja kõik tulemused;  
— kasutatud kliinilise biokeemia analüüsid ja kõik tulemused (seal ­
hulgas kõik uriinianalüüside tulemused);  
— lahanguleiud;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— histopatoloogiliste leidude detailne kirjeldus;  
— tulemuste statistiline analüüs, kui see on võimalik;  
— tulemuste arutelu;  
— tulemuste tõlgendamine.  
3.2. HINNANG JA TÕLGENDAMINE  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  SUBKROONILINE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL: 90- 
PÄEVANE UURING  
KOKKUVÕTE  
Käesolev läbivaadatud katsemeetod B.29 on koostatud uuritava kemikaali mürgi ­
suse täielikuks iseloomustamiseks sissehingamisel subkroonilise ajavahemiku 
vältel (90 päeva) ning usaldusväärsete andmete saamiseks, et kvantitatiivselt 
hinnata sissehingamise riski. Kümnest isas- ja kümnest emasloomast koosnevad närilisterühmad viiakse 90 päeva (13 nädala) jooksul kuus tundi päevas kokku ­
puutesse a) uuritava kemikaaliga kolmel või enamal kontsentratsioonil, b) filtritud 
õhuga (negatiivne kontrollgrupp) ja/või c) kandeainega (kandeaine kontrollrühm). 
Loomade kokkupuude toimub üldjuhul viiel päeval nädalas, aga lubatud on ka kokkupuude seitsmel päeval nädalas. Alati katsetatakse nii isas- kui ka emas ­
loomi, aga neid võidakse viia kokkupuutesse erinevate kontsentratsioonidega, kui 
on teada, et üks sugu on konkreetse uuritava kemikaali suhtes tundlikum. See 
meetod võimaldab uuringu juhile paindlikkust kaasata satelliitrühmad (pöördu ­
vuse rühmad), surmata vahepeal loomi, teha bronhoalveolaarset lavaaži (BAL), neuroloogiakatseid ning täiendavaid kliinilise patoloogia ja histopatoloogia 
alaseid hindamisi, et uuritava kemikaali mürgisust paremini iseloomustada.
 
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test Guide ­
line, TG) 413 (2009). Algne sissehingamisel avalduvat subkroonilist mürgi ­
sust käsitlev katsejuhend (katsejuhend nr 413) võeti vastu 1981. aastal (1). 
Käesolev katsemeetod B.29 (mis on samaväärne katsejuhendi nr 413 läbi ­
vaadatud versiooniga (2009)) on ajakohastatud, et võtta arvesse teaduse taset ning rahuldada praegusi ja tulevasi regulatiivseid vajadusi.
 
2. Sissehingamisel subkroonilise mürgisuse uuringuid kasutatakse peamiselt 
töökeskkonnas töötajate jaoks tekkiva riski hindamiseks, et õigusaktidega kehtestada lubatud kontsentratsioone. Neid kasutatakse samuti inimeste 
elamute ja transpordiga seotud riskide ja keskkonnariski hindamiseks. 
Käesolev meetod võimaldab iseloomustada uuritava kemikaali sissehingami ­
sega toimuval korduval igapäevasel kokkupuutel 90 päeva jooksul (ligi ­
kaudu 10 % roti elueast) avaldatavat kahjulikku mõju. Sissehingamisel 
subkroonilise mürgisuse uuringute andmeid saab kasutada kvantitatiivseks 
riski hindamiseks ja kroonilise mõju uuringute jaoks kontsentratsioonide valimiseks. Käesolev katsemeetod ei ole spetsiaalselt ette nähtud nanoma ­
terjalide katsetamiseks. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud 
mõisted on esitatud selle peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 39 (2).
 
LÄHTEKAALUTLUSED  
3. Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi 
vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, et parandada 
uuringu kvaliteeti ja minimeerida loomade kasutamist. Teave, mis aitab 
valida katseks sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järgmist: uuri ­
tava kemikaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes  in vitro  või in vivo  mürgisuse katsete tulemused; 
eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; ole ­
masolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta ning muude korduva kokkupuute uuringutega saadud andmed. Kui uuringu 
puhul eeldatakse neurotoksilisust või täheldatakse uuringus selle olemasolu, 
võib uuringu juht otsustada teha sellekohased hindamised, näiteks funktsio ­
naalsed vaatluskatsed ( functional observational battery , FOB) ja motoorse 
aktiivsuse mõõtmise. Kuigi konkreetsete hindamiste jaoks kokkupuute 
korraldamise ajastus võib olla kriitilise tähtsusega, ei tohiks kõnealused 
täiendavad uuringud põhiuuringu kava elluviimist segada.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Söövitava või ärritava uuritava kemikaali lahjendatud lahuseid võib katse ­
tada kontsentratsioonil, mis annab soovitud mürgisuse määra. Lisateave on 
avaldatud juhenddokumendis nr 39 (2). Loomade kokkupuutesse viimisel kõnealuste materjalidega peaks sihtkontsentratsioon olema piisavalt väike, et see ei põhjustaks märkimisväärset valu ega kannatusi, kuid piisav, et 
pikendada kontsentratsiooni-mõju kõver tasemeni, millega saavutatakse 
katse regulatiivne ja teaduslik eesmärk. Kõnealused kontsentratsioonid tuleks valida juhtumipõhiselt, eelistatavalt asjakohaselt koostatud doosipiir ­
konna määramise katse alusel, millega saadakse teavet kõige olulisema 
näitaja, ärrituse ilmnemise läviväärtuse ja aja kohta (vt punktid 11–13). 
Tuleks esitada kontsentratsiooni valimise põhjendus.
 
5. Suremas olevad loomad ja loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel 
ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil surmata. Suremas olevaid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse samamoodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille 
põhjal tehakse suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise 
otsus, ja juhised prognoositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas OECD juhenddoku ­
mendis (3).
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
6. Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud 
loomi. Eelistatud liigiks on rott. Muu liigi kasutamise korral tuleks seda põhjendada.
 
Loomade ettevalmistamine  
7. Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Randomiseerimise päeval 
peaksid loomad olema seitsme kuni üheksa nädala vanused noored täiskas ­
vanud. Kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ±20 % samast soost loomade 
keskmisest kehamassist. Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse indi ­
viduaalse identifitseerimise võimaldamiseks ning hoitakse oma puuris vähe ­
malt viis päeva enne katse algust, et võimaldada neil laboritingimustega kohaneda.
 
Pidamistingimused  
8. Loomad peaksid olema individuaalselt märgistatud, eelistatult nahaaluse 
transponderiga, et hõlbustada vaatlusi ja vältida segiajamist. Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist õhuniiskust 
tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi olla 
võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmita ­
tuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset 
jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitle ­
mise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjustada loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest 
tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsioloo ­
gilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise minutimahtu. Kui on kättesaadavad üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, ei ole eelnev hoiutoruga kohane ­
mine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokkupuutuvaid loomi tuleks 
kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja serti ­
fitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses 
kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi 
pimedust.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalatsioonikambrid  
9. Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi ja 
katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina kaudu toimuvat 
kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaerosooli ja aerosooliks 
kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasutamise korral 
keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade kogumaht ületada 
5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudujääke on kirjeldatud juhend ­
dokumendis nr 39 (2).
 
TOKSILISUSE UURINGUD  
Piirkontsentratsioonid  
10. Erinevalt ägeda mürgisuse uuringutest ei ole sissehingamisel avalduva 
subkroonilise mürgisuse uuringutel kindlaksmääratud piirkontsentratsioone. 
Maksimaalse katsetatava kontsentratsiooni valimisel tuleks arvesse võtta 
järgmist: 1) maksimaalne saavutatav kontsentratsioon, 2) millise kemikaali ­
kontsentratsiooniga võib inimene kokku puutuda halvimal juhul, 3) vajadus 
säilitada piisav varustatus hapnikuga ja/või 4) loomade heaolu kaalutlused. 
Kui andmetel põhinevad piirangud puuduvad, võib kasutada määruse (EÜ) nr 1272/2008 (13) ägeda mürgisuse piirmäärasid (st kuni kontsentratsioonini 5 mg/l aerosooli puhul, 20 mg/l auru puhul ja 20 000 ppm gaasi puhul), vt 
juhenddokument nr 39 (2). Kui kõnealune piirmäär tuleb gaasi või väga 
lenduva uuritava kemikaali (näiteks külmutusagens) katsetamisel ületada, tuleks seda põhjendada. Piirkontsentratsioonil peaks ilmnema üheselt mõis ­
tetav mürgisus, kuid see ei tohiks põhjustada loomadele liigset stressi ega 
lühendada nende elu (3).
 
Doosipiirkonna määramise katse  
11. Enne põhiuuringu alustamist on tavaliselt vaja teha doosipiirkonna määra ­
mise katse. Doosipiirkonna määramise katse on eeluuringust põhjalikum, kuna selles ei piirduta kontsentratsiooni valimisega. Doosipiirkonna määra ­
mise katsest saadud teadmistest võib sõltuda põhiuuringu edukus. Doosipiir ­
konna määramise katses võidakse näiteks saada tehnilist teavet analüüsimee ­
todite ja osakeste suuruse määramise kohta, teha kindlaks toksilisusmehha ­
nisme, saada kliinilise patoloogia ja histopatoloogia andmeid ning hinnata, milline võib põhiuuringus olla täheldatava kahjuliku toimeta 
kontsentratsioon (NOAEL) ja minimaalne mürgine 
kontsentratsioon (MTC). Uuringu juht võib otsustada kasutada doosipiir ­
konna määramise katset, et määrata kindlaks hingamisteede ärrituse lävi ­
väärtus (näiteks hingamisteede histopatoloogia, kopsutalitluse katsete või 
bronhoalveolaarse lavaaži abil), maksimaalne kontsentratsioon, mille juures 
loomadele ei tekitata liigset stressi, ja uuritava kemikaali mürgisust kõige paremini iseloomustavad parameetrid.
 
12. Doosipiirkonna määramise katse võib hõlmata ühte või enamat kontsentrat ­
siooni. Olenevalt valitud näitajatest tuleks kokkupuude iga kontsentratsioo ­
niga korraldada kolmele kuni kuuele isasloomale ja kolmele kuni kuuele emasloomale. Doosipiirkonna määramise katse peaks kestma vähemalt viis päeva ja üldjuhul mitte kauem kui 28 päeva. Põhiuuringu kontsentratsioo ­
nide valimise põhjendused tuleks esitada uuringuprotokollis. Põhiuuringu 
eesmärk on näidata mõju sõltuvust kontsentratsioonist eelduste kohaselt kõige tundlikuma näitaja alusel. Väike kontsentratsioon peaks ideaaljuhul olema täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon ja suur kontsentrat ­
sioon peaks näitama üheselt mõistetavat mürgistust, kuid see ei tohiks 
põhjustada loomadele liigset stressi või lühendada nende elu (3).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Doosipiirkonna määramise katse jaoks kontsentratsioonide valimisel tuleks 
arvesse võtta kogu saadaolevat teavet, sh struktuuri-aktiivsuse sõltuvusi ja 
samalaadseid kemikaale käsitlevaid andmeid (vt punkt 3). Doosipiirkonna määramise katse võib kinnitada mehhanistlike kriteeriumide alusel kõige tundlikumaks peetavaid näitajaid, nagu organofosfaatide põhjustatud kolii ­
nesteraasi inhibeerimine, erütrotsütotoksiliste ainete põhjustatud methemo ­
globiini teke, türoidhormoonid (T
 3 , T  4 ) türotoksikantide puhul, valk, 
laktaatdehüdrogenaas (LDH) või neutrofiilid bronhoalveolaarses lavaažis ohutute vähe lahustuvate osakeste või kopse ärritavate aerosoolide puhul, 
või need ümber lükata.
 
Põhiuuring  
14. Subkroonilise mürgisuse põhiuuring hõlmab üldjuhul kolme kontsentrat ­
siooni ning vajaduse korral samuti samaaegseid negatiivseid (õhu) ja/või 
kandeaine kontrollrühmi (vt punkt 18). Asjakohaste kokkupuutetasemete valimisel tuleks kasutada kõiki kättesaadavaid andmeid, sh süsteemse mürgi ­
suse uuringute, metaboliseerimise ja kineetika uuringute tulemusi (eriti 
tuleks tähelepanu pöörata suure kontsentratsiooni vältimisele, mille puhul 
kineetilised protsessid küllastatakse). Iga katserühm koosneb kümnest isas- ja kümnest emasloomast (närilised), kes viiakse uuritava kemikaaliga kokku ­
puutesse kuueks tunniks päevas viiel päeval nädalas 13 nädala vältel 
(uuringu kogukestus on vähemalt 90 päeva). Loomad võib viia kokkupuu ­
tesse ka seitsmel päeval nädalas (näiteks sissehingatavate ravimite katseta ­
misel). Kui üks sugu on teatava uuritava kemikaali suhtes teadaolevalt 
tundlikum, võib eri sugude puhul kasutada kokkupuutel erinevaid kontsen ­
tratsioone, et optimeerida mõju kontsentratsioonist sõltuvust, nagu on kirjel ­
datud punktis 15. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohan ­
dada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Päevas 
vähem kui kuuetunnise kokkupuute kasutamisel või kui on vajalik korral ­
dada pika kestusega (näiteks 22 tundi päevas) kogu keha kaudu kokkupuute uuring, tuleb seda põhjendada (vt juhenddokument nr 39 (2)). Loomi ei 
tohiks kokkupuute ajal sööta, v.a juhul, kui kokkupuuteperiood ületab 
kuut tundi. Kogu keha kaudu toimuva kokkupuute ajal võib loomadele anda vett.
 
15. Valitud sihtkontsentratsioonid peaksid võimaldama kindlaks teha sihtor ­
gani(d) ja saada mõju selge sõltuvus kontsentratsioonist.  
— Suur kontsentratsioon peaks põhjustama mürgist mõju, kuid ei tohiks 
põhjustada püsivaid nähte ega surma, mis takistaks usaldusväärset hinda ­
mist.  
— Keskmine (keskmised) kontsentratsioon(id) peaks(id) olema eraldatud, et 
esile kutsuda eri tugevusega mürgist mõju väikese ja suure kontsentrat ­
siooni vahemikus.  
— Väike kontsentratsioon peaks põhjustama vähe mürgistusnähtusid või 
olema mõjuta.  
Vahepealsed surmamised  
16. Kui osa loomi kavandatakse surmata uuringu vältel, tuleks iga kokkupuute ­
taseme loomade arvu suurendada enne uuringu lõppu surmata plaanitud 
loomade arvu võrra. Tuleks esitada vahepealsete surmamiste kasutamise 
põhjendus ja statistilistes analüüsides tuleks neid asjakohaselt arvesse võtta.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Satelliituuring (pöörduvuse uuring)  
17. Mürgistuse pöörduvuse, püsivuse või viivitusega avaldumise jälgimiseks 
võidakse korraldada satelliituuring (pöörduvuse uuring) töötlusjärgsel asja ­
kohase pikkusega ajavahemikul, mis ei tohi olla lühem kui 14 päeva. Satel ­
liitrühmades (pöörduvuse rühmades) on kümme isas- ja kümme emaslooma, 
kellele korraldatakse kokkupuude põhiuuringu katseloomadega samal ajal. Satelliituuringu (pöörduvuse uuringu) rühmad peaksid uuritava kemikaaliga kokku puutuma suurimal kontsentratsioonil ning vajaduse korral tuleks 
kasutada samaaegseid õhu ja/või kandeaine kontrollrühmi (vt punkt 18).
 
Loomade kontrollrühm  
18. Samaaegse negatiivse (õhu) kontrollrühma loomi tuleks kohelda katserühma 
loomadega samalaadsel viisil selle erinevusega, et nad viiakse uuritava 
kemikaali asemel kokkupuutesse filtritud õhuga. Kui katsekeskkonna 
loomisel kasutatakse vett või muud ainet, tuleks uuringus kasutada nega ­
tiivse (õhu) kontrollrühma asemel kandeaine kontrollrühma. Võimaluse korral tuleks kandeainena alati kasutada vett. Kui kandeainena kasutatakse 
vett, peaks loomade kontrollrühm puutuma kokku sama suhtelise õhuniisku ­
sega õhuga kui katse käigus kokku puutuvad rühmad. Sobiva kandeaine valimine peaks põhinema asjakohasel eeluuringul või varasematel andmetel. Kui kandeaine mürgisus ei ole hästi teada, võib uuringu juht otsustada 
kasutada nii negatiivset (õhu) kontrollrühma kui ka kandeaine kontroll ­
rühma, kuid see ei ole soovitatav. Kui varasematest andmetest nähtub, et kandeaine ei ole mürgine, ei ole negatiivset (õhu) kontrollrühma vaja ja tuleks kasutada ainult kandeaine kontrollrühma. Kui kandeaines oleva uuri ­
tava kemikaali eeluuringust mürgisust ei nähtu, siis võib järeldada, et kande ­
aine ei ole katsetataval kontsentratsioonil mürgine ja tuleks kasutada selle kandeaine kontrollrühma.
 
KOKKUPUUTETINGIMUSED  
Kontsentratsioonide manustamine  
19. Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, 
aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava 
kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitse ­
mise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuri ­
tavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ette ­
vaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist. Aineosakesi võib osakeste suuruse vähendamiseks mehaaniliselt töödelda. Täpsemad juhendid on esitatud juhenddokumendis nr 39 (2).
 
Osakeste suurusjaotus  
20. Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti 
aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hinga ­
misteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaa ­
miline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–3 μm ning geomeetriline stan ­
dardhälve ( σ
 g ) on 1,5–3,0 (4). Kõnealuse standardi järgimiseks tuleks teha 
mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed on kõnealusest 
normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed ja kiud võivad sätestatud 
näitajaid ületada.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Uuritava kemikaali preparaat kandeaines  
21. Ideaaljuhul tuleks uuritavat kemikaali katsetada ilma kandeaineta. Kui 
kandeaine kasutamine on vajalik sobiva uuritava kemikaali kontsentratsiooni ja osakeste suuruse tekitamiseks, tuleks eelistatavalt kasutada vett. Alati, kui 
uuritav kemikaal lahustatakse kandeaines, tuleks tõendada uuritava kemi ­
kaali stabiilsust.
 
KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE  
Kambri õhuvarustus  
22. Kokkupuutekambri õhuvarustust tuleks hoolikalt kontrollida, pidevalt seirata 
ning andmed iga kokkupuute korral vähemalt kord tunnis registreerida. Katsekeskkonna kontsentratsiooni (või ajalise stabiilsuse) reaalajas seire on 
kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab 
endast kaudset vahendit sissehingamise kõigi asjakohaste dünaamiliste para ­
meetrite kontrollimiseks. Kui kontsentratsiooni jälgitakse reaalajas, võib õhuvoogude mõõtmise sageduse vähendada ühele mõõtmisele kokkupuute 
kohta päevas. Ainult nina kaudu kokkupuudet võimaldava kambri puhul 
tuleks eritähelepanu pöörata väljahingatud õhu uuesti sissehingamise välti ­
misele. Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisi ­
saldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõnealuseid norme ei 
ole võimalik täita, tuleks hapniku- ja süsinikdioksiidisisaldust mõõta. Kui 
kokkupuute esimese päeva mõõtmistest nähtub, et kõnealuste gaaside sisaldus on nõuetekohasel tasemel, ei peaks edasine mõõtmine olema vajalik.
 
Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus  
23. Kambri temperatuur tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamistsooni 
suhtelist õhuniiskust nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu toimuva kokku ­
puute korral tuleks pidevalt seirata ja see tuleks registreerida võimaluse korral üks kord tunnis iga kokkupuute ajal. Suhtelist õhuniiskust tuleks 
eelistatavalt hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju 
tõttu ei pruugi see olla saavutatav (näiteks veepõhise segu uurimisel) või mõõdetav.
 
Uuritav kemikaal: nimikontsentratsioon  
24. Kui see on võimalik, tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon alati 
arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda lisatud 
uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku kontsentrat ­
siooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning seega saab 
seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avastamiseks.
 
Uuritav kemikaal: tegelik kontsentratsioon  
25. Tegelik kontsentratsioon on inhalatsioonikambris loomade hingamistsoonist 
võetud proovist määratud uuritava kemikaali kontsentratsioon. Tegelikke 
kontsentratsioone on võimalik saada kas spetsiifiliste meetodite abil (näiteks 
otsene proovivõtt, adsorptsiooni või keemilise reaktsiooni meetodid ning järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimeetriline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud 
ainult ühest koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vede ­
liku aerosooli korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
konkreetse kemikaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulbe ­
raerosooli kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada 
gravimeetrilist analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus oleva materjali koostis sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuritava kemikaali 
(eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. 
Aerosoolainete puhul, mis võivad aurustuda või sublimeeruda, tuleks näidata, et valitud meetodiga koguti kõiki faase.
 
26. Võimaluse korral tuleks kogu katse jooksul kasutada uuritava kemikaali ühte 
partiid ning uuritavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib selle puhtus, homogeensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks uuritavat kemikaali, sh selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, 
tuleb keemiliselt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning 
määrata nende kogused. Seda on võimalik tõendada muu hulgas järgmiste andmete alusel: retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, molekulmass massispektroskoopia või gaaskromatograafia analüüsidest või muud 
hinnangud. Kuigi uurimislabor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemi ­
lise määratlemise eest, võib uurimislaboril olla mõttekas kinnitada tellija iseloomustust vähemalt piiratud ulatuses (näiteks värv, füüsikalised omadused jne).
 
27. Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna. Kokkupuu ­
tetingimuste stabiilsuse tõendamiseks võib kasutada reaalajas seire seadet, 
näiteks aerosooli fotomeetrit aerosoolide puhul või süsivesinike kogusisal ­
duse analüsaatorit aurude puhul. Tegelikku kambrikontsentratsiooni tuleks mõõta vähemalt kolm korda iga kokkupuutepäeva jooksul iga kokkupuute ­
kontsentratsiooni kohta. Kui see piiratud õhuvarustuse või väikeste kontsen ­
tratsioonide tõttu ei ole võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi kohta võtta 
ühe proovi. Ideaaljuhul tuleks kõnealune proov võtta kogu kokkupuuteaja jooksul. Kambrist võetud proovide kontsentratsioon ei tohiks keskmisest kontsentratsioonist erineda rohkem kui ±10 % gaaside ja aurude puhul või 
±20 % vedelik- või pulberaerosoolide korral. Tuleks arvutada kambri tasa ­
kaaluoleku saavutamise aeg (t
 95 ) ja see registreerida. Kokkupuute ajava ­
hemik kestab selle aja, kui uuritavat kemikaali lisatakse. Selles võetakse arvesse aega, mis on vajalik kambri tasakaaluseisundi saavutamiseks (t
 95 ) 
ja kontsentratsiooni langemiseks. Juhendid t  95 hindamise kohta on esitatud 
juhenddokumendis nr 39 (2).  
28. Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest 
(näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda inha ­
latsioonikambris erinevalt. Seepärast tuleks valida vähemalt üks indikaatoraine 
(mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, iga 
faasi (gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, tuleks kirja panna kogu segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toimeaine või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisateave tegelike 
kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (2).
 
Uuritav kemikaal: osakeste suurusjaotus  
29. Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt iga nädal 
iga kontsentratsiooni kohta, kasutades kaskaadimpaktorit või alternatiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on võimalik 
tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud tulemuste 
võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alternatiivset seadet.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada muud seadet, näiteks gravi ­
meetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veenduda peamise 
seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu saadud massi ­
kontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (2)). Kui 
uuringu varajases etapis on kõikidel uuritavatel kontsentratsioonidel 
võimalik tõendada võrdväärsust, võib täiendavatest kinnitavatest mõõtmis ­
test loobuda. Loomade heaolu silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik uuringut 
korrata.
 
31. Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on 
võimalik, et auru kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool või kui auru 
keskkonnas tuvastatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside 
seguga.  
VAATLUSED  
32. Loomi tuleks enne kokkupuuteperioodi, selle vältel ja pärast seda kliiniliselt 
jälgida. Olenevalt loomade reageerimisest kokkupuutele võidakse ette näha 
sagedasem jälgimine. Kui loomade jälgimist takistab looma hoiutoru, 
halvasti valgustatud kogukehakamber või läbipaistmatu keskkond, tuleks loomi hoolikalt jälgida pärast kokkupuudet. Enne järgmise päeva kokku ­
puudet toimuva jälgimise abil on võimalik hinnata mürgise mõju pöörduvust 
või süvenemist.
 
33. Kõik vaatlusandmed registreeritakse iga looma kohta eraldi. Kui loomad 
surmatakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks surmaaeg 
võimalikult täpselt registreerida.  
34. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade, 
limaskestade, hingamis-, vereringe- ja närvisüsteemi muutusi, samuti soma ­
tomotoorse aktiivsuse ja käitumismustri muutusi. Tähelepanu peaks olema 
suunatud värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, letargia, une ja kooma kindlakstegemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib anda lisaand ­
meid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüpertermia kohta, 
mis on seotud kokkupuute või vangistusega. Uuringusse võib lisada täien ­
davaid hindamisi, nagu kineetika, bioseire, kopsutalitlus, kopsukudedesse kogunevate vähe lahustuvate materjalide püsivus ja käitumismuutused.
 
KEHAMASS  
35. Iga looma kehamass tuleks registreerida natuke enne esimest kokkupuudet 
(päev 0) ja seejärel kaks korda nädalas (näiteks reedeti ja esmaspäeviti, et 
tõendada taastumist ilma kokkupuuteta nädalavahetuse jooksul, või pärast ajavahemikku, mis võimaldab süsteemse mürgisuse hindamist) ning pärast surma või eutanaasiat. Kui esimese nelja nädala jooksul nähtusid ei ilmne, 
võib ülejäänud uuringu vältel mõõta kehamassi kord nädalas. Satelliitrühma 
(pöörduvuse rühma) loomade (kui neid kasutatakse) kaalumist tuleks jätkata iga nädal kogu taastumisperioodi vältel. Uuringu lõpetamisel tuleks iga looma veidi enne surmamist kaaluda, et võimaldada organite ja kehamassi 
suhte täpset arvutamist.
 
SÖÖDA JA VEE TARBIMINE  
36. Sööda tarbimist tuleks mõõta iga nädal. Samuti võib mõõta vee tarbimist.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLIINILINE PATOLOOGIA  
37. Kliinilise patoloogia hindamised tuleks teha igale loomale, sh kontrollrühma 
ja satelliitrühma (pöörduvuse rühma) loomadele, kui nad surmatakse. Kokkupuute lõpetamise ja vereproovide võtmise vaheline ajavahemik tuleks 
registreerida, eriti kui kõnealuse näitaja taastumine on kiire. Plasmast kiiresti 
kaduvate indikaatorainete (näiteks COHb, CHE ja MetHb) määramiseks tuleb proov võtta kohe pärast kokkupuute lõppu.
 
38. Tabelis 1 on loetletud kliinilised patoloogilised parameetrid, mida nõutakse 
üldjuhul kõigi toksikoloogiliste uuringute puhul. Uriinianalüüs ei ole alati 
vajalik; selle võib teha, kui seda oodatava või ilmnenud toksilisuse tõttu peetakse kasulikuks. Uuringu juht võib uuritava kemikaali mürgisuse pare ­
maks iseloomustamiseks otsustada hinnata täiendavaid parameetreid (näiteks 
koliinesteraas, lipiidid, hormoonid, happe-aluse tasakaal, methemoglobiin 
või Heinzi kehakesed, kreatiinkinaas, müeloidi/erütroidi suhe, troponiinid, arteriaalse vere gaasid, laktaatdehüdrogenaas, sorbitooldehüdrogenaas, gluta ­
maatdehüdrogenaas ja γ-glutamüül-transpeptidaas).
 
Tabel 1  
Standardsed kliinilise patoloogia parameetrid  
Hematoloogia  
Erütrotsüütide arv 
Hematokrit Hemoglobiini kontsentratsioon 
Hemoglobiini keskmine kogus 
erütrotsüüdis (MCH) 
Keskmine erütrotsüüdi maht (MCV) Hemoglobiini keskmine kontsentrat ­
sioon erütrotsüüdis 
Retikulotsüüdid Leukotsüütide koguarv 
Diferentseeritud leukotsüütide arv Trombotsüütide arv 
Hüübimisvõime (valige üks): 
— protrombiini aeg — hüübimisaeg — osalise tromboplastiini aeg
 
Kliiniline keemia  
Glükoos (*) 
Üldkolesterool 
Triglütseriidid Vere karbamiidlämmastik Üldbilirubiin 
Kreatiniin 
Üldvalk Albumiin 
Globuliin Alaniinaminotransferaas 
Aspartaataminotransferaas 
Leeliseline fosfataas Kaalium Naatrium 
Kaltsium 
Fosfor Kloriid
 
Uriinianalüüs (valikuline)  
Välimus (värvus ja hägusus) 
Kogus 
Suhteline tihedus või osmolaalsus 
pH Üldvalk 
Glükoos 
Veri/vererakud  
(*) Kuna pikaajaline nälgimine võib põhjustada glükoosi mõõtmistulemuste erinevust 
katserühma ja kontrollrühma loomade vahel, peaks uuringu juht otsustama, kas 
loomade söögita jätmine on asjakohane. Kui loomad jäetakse söögita, peaks ajava ­
hemik olema vastav kasutatavale liigile; roti puhul võib see ajavahemik olla 16 
tundi (nälgimine öö jooksul). Paastuglükoosi võib määrata pärast öist nälgimist 
viimasel kokkupuutenädalal või pärast öist nälgimist enne lahkamist (viimasel 
juhul määratakse paastuglükoos koos kõigi muude kliinilise patoloogia näitaja ­
tega). ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Kui on tõendeid, et peamine kogunemise ja säilitamise piirkond on mada ­
lamad hingamisteed (s.o alveoolid), võib oletatava annuse-mõju seose para ­
meetrite kvantitatiivseks hindamiseks kasutada bronho-alveolaarset lavaaži, keskendudes alveoliidile, kopsukoe põletikule ja fosfolipidoosile. See võimaldab asjakohaselt kontrollida alveolaarse kahjustuse puhul esinevat 
doosi-toime seost ning toime sõltuvust ajast. Bronhoalveolaarse lavaaži 
vedelikku võib analüüsida leukotsüütide üldarvu ja diferentseeritud leukot ­
süüdiarvude, üldvalgu ja laktaatdehüdrogenaasi määramiseks. Veel võib kaaluda lüsosoomide kahjustust, fosfolipidoosi, fibroosi ning ärritus- või 
allergilist põletikku tõendavate näitajate määramist, selleks võib määrata 
ka põletikuaineid tsütokiine/kemokiine. Bronhoalveolaarse lavaaži mõõt ­
mised üldiselt täiendavad histopatoloogiliste uuringute tulemusi, kuid ei saa neid asendada. Kopsude lavaaži tegemise juhendid on esitatud juhend ­
dokumendis nr 39 (2).
 
OFTALMOLOOGILINE LÄBIVAATUS  
40. Enne uuritava kemikaali manustamist tuleks kõikide loomade ning katse 
lõpetamisel kõikide suure kontsentratsiooni ja kontrollrühmade loomade puhul teha oftalmoskoobi või samaväärse seadme abil silmapõhja, valgust 
murdvate keskkondade, iirise ja sidekestade oftalmoloogilised uuringud. Kui 
silmas tuvastatakse muutusi, tuleks uurida kõiki muude rühmade (sh satel ­
liitrühma (pöörduvuse rühma)) loomi.
 
MAKROPATOLOOGIA JA ORGANITE MASS  
41. Kõik katseloomad (kaasa arvatud katse käigus surnud, humaansel viisil 
surmatud või uuringust looma heaolu tagamiseks kõrvaldatud loomad) tuleks (võimaluse korral) täielikult veretustada ja täielikult lahata. Iga looma viimase kokkupuute lõpu ja surmamise vaheline ajavahemik tuleks 
registreerida. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leidmist ei ole 
võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloogilised muutused 
tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede mis tahes muutus ­
tele.
 
42. Tabelis 2 on loetletud organid ja koed, mis täieliku lahkamise ajal tuleks 
sobivas keskkonnas säilitada histopatoloogia uuringu jaoks. [Nurksulgudes 
esitatud] organite ja kudede ning muude organite ja kudede säilitamise otsustab uuringu juht.  Paksus kirjas esitatud  organid tuleb välja puhastada 
ja kaaluda nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Kilpnääret ja 
munandimanuseid tuleks kaaluda ainult vajaduse korral, kuna nende välja ­
puhastamisel tekkivad moonutused võivad takistada histopatoloogilist hinda ­
mist. Koed ja organid tuleks paigutada 10 % puhverdatud formaliini või muusse sobivasse fikseerivasse ainesse vahetult pärast lahkamist ja mitte 
vähem kui 24–48 tundi enne väljapuhastamist, olenevalt kasutatavast fiksee ­
rivast ainest.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 431
 
Tabel 2  
Täieliku lahkamise juures säilitatavad organid ja koed  
Neerupealised  
Aort 
Luuüdi (ja/või värske aspiraat)  
Aju (sh suuraju osad, väikeaju ning piklika ­
ju/ajusild)  
Umbsool  
Käärsool  
Kaksteistsõrmiksool  
[Munandimanused ] 
[Silmad (võrkkest, nägemisnärv) ja silmalaud]  
Reieluu ja põlveliiges  
Sapipõis (kui see on olemas)  
[Harderi näärmed]  
Süda  
Niudesool  
Tühisool  
Neerud  
[Pisaranäärmed (eksorbitaalsed)]  
Kõri (kolm taset, kaasa arvatud kõripealise 
põhi)  
Maks  
Kopsud  (kõik ühe tasandi sagarad, sh 
peamised bronhid)  
Lümfisõlmed kopsu kopsuvärati piirkonnast, 
eelkõige vähe lahustuvatest osakestest koos ­
neva uuritava kemikaali puhul. Põhjalikuma immunoloogilise suunitlusega vaatluse ja/või uuringu puhul võib kaaluda täiendavate 
lümfisõlmede säilitamist, näiteks kesksei ­
nandi, kaela/submandibulaarsest ja/või kõrva piirkonnast.
 
Lümfisõlmed (distaalsed sisenemisavast)  
Piimanääre (emasloomadel)  
Lihas (reielihas)  
Nasofarüngeaalsed koed (vähemalt neljal 
tasandil; üks tasand peab hõlmama nasofarün ­
geaalset kanalit ja ninaga seotud 
lümfikude (NALT)).  Söögitoru  
[Haistmissibul]  
Munasarjad  
Kõhunääre  
Kõrvalkilpnäärmed  
Perifeerne närv (istmiku- või sääreluu närv, 
eelistatavalt lihase lähedal)  
Ajuripats  
Eesnääre  
Pärasool  
Süljenäärmed  
Seemnepõiekesed  
Nahk  
Seljaaju (kaela-, rinna- ja nimmepiirkond)  
Põrn  
Rinnak  
Magu  
Hambad  
Munandid  
Harknääre  
Kilpnääre  
[Keel]  
Hingetoru (vähemalt kaks tasandit, sh üks 
pikisuunaline lõige läbi hingetoruharja ja 
üks ristlõige)  
[Kusejuha]  
[Kusiti]  
Kusepõis  
Emakas  
Sihtorganid  
Kõik nähtavad kahjustused ja massid  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Kopsud tuleks tervena eemaldada, kaaluda ja paigutada sobivasse fikseeri ­
vasse ainesse rõhul 20–30 cm veesammast, et tagada kopsude struktuuri 
säilimine (5). Tuleks koguda ühel tasandil tehtud lõiked kõikidest sagaratest, sh peamistest bronhidest, kuid kui tehakse kopsude lavaaž, tuleks sellest sagarast, millele lavaaži ei tehtud, teha lõiked kolmel tasandil (mitte seeria ­
viisilised lõiked).
 
44. Tuleks uurida vähemalt nelja nasofarüngeaalsete kudede tasandit, millest üks 
peaks hõlmama nasofarüngeaalset kanalit (5, 6, 7, 8, 9), et võimaldada 
asjakohaselt uurida skvamoosrakulist, ülemineku- (hingamisteede  clara - 
rakud), hingamisteede (ripsepiteel) ja olfaktoorset epiteeli ning neid dree ­
nivat lümfikude (NALT) (10, 11). Tuleks uurida kõri kolme tasandit ja üks 
neist tasanditest peaks hõlmama kõripealise põhja (12). Tuleks uurida vähe ­
malt kahte hingetoru tasandit, sh ühte pikisuunalist lõiget läbi peabronhide bifurkatsiooni harja ja ühte ristlõiget.
 
HISTOPATOLOOGIA  
45. Kontrollrühma ja suure kontsentratsiooni rühma ning kõigi loomade puhul, 
kes uuringu jooksul surevad või surmatakse, tuleks teha kõigi tabelis 2 loetletud organite ja kudede histopatoloogiline hindamine. Eritähelepanu tuleks pöörata hingamisteedele, sihtorganitele ja nähtavatele kahjustustele. 
Organeid ja kudesid, milles suure kontsentratsiooni rühma isenditel leiti 
kahjustusi, tuleks uurida kõigi rühmade isenditel. Uuringu juht võib otsus ­
tada teha histopatoloogilised hindamised täiendavate rühmade puhul, et 
tõendada selget sõltuvust kontsentratsioonist. Kui kasutatakse satelliitrühma 
(pöörduvuse rühma), tuleks teha kõigi selliste kudede ja organite histopato ­
loogiline hindamine, milles katserühmade indiviididel leiti muutusi. Kui suure kokkupuute rühmas sureb liiga palju loomi varajases etapis või 
tekib muid probleeme, mis muudavad andmete tähenduse ähmaseks, tuleks 
histopatoloogiliselt uurida järgmise väiksema kontsentratsiooni rühma. Tuleks püüda omavahel seostada üldisi tähelepanekuid ja mikroskoopilisi leide.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
46. Iga looma kohta tuleks esitada kehamassi, sööda tarbimise, kliinilise pato ­
loogia, üldpatoloogia, organite massi ja histopatoloogia andmed. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete mürgistusnähtu ­
dega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaansetel põhjustel 
surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud. Kõiki tulemusi, nii kvantitatiivseid andmeid kui ka üksiktähelepanekuid, tuleks sobiva statis ­
tilise meetodi abil hinnata. Võib kasutada kõiki üldtunnustatud statistilisi 
meetodeid; statistilised meetodid tuleks valida juba uuringu kavandamisel.
 
Katseprotokoll  
47. Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.  
Katseloomad ja pidamistingimused  
— Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri 
kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline õhuniiskus, valgustuspe ­
riood ja sööt.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus. Võib 
esitada lähteandmed ja varasemad andmed, kui need on saadud loomade 
kohta, kes viidi kemikaaliga kokkupuutesse samasugustes kokkupuute-, pidamis- ja nälgimistingimustes.
 
— Loomade arv, vanus ja sugu.  
— Randomiseerimismeetod.  
— Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karan ­
tiin ja haiguste ravi.  
Uuritav kemikaal  
— Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised 
omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).  
— Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi 
nr, kui see on teada.  
Kandeaine  
— Kandeaine kasutamise põhjendus ja kandeaine valiku põhjendus (kui 
kandeainena ei kasutata vett).  
— Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta 
uuringu tulemusi.  
Inhalatsioonikamber  
— Inhalatsioonikambri üksikasjalik kirjeldus, sh selle mahu andmed ja 
joonis.  
— Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus 
ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.  
— Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni 
mõõtmise seadmed.  
— Õhuallikas ja õhu konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.  
— Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud 
meetodid.  
— Rõhuvahe (positiivne või negatiivne).  
— Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokku ­
puude); loomade paiknemine kambris (kogu keha kaudu toimuv kokku ­
puude).  
— Katsekeskkonna (atmosfääri) stabiilsus.  
— Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonnast proo ­
vide võtmine kambris.  
— Sissejuhitud ja väljatõmmatud õhu töötlemine.  
— Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina 
kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha 
kaudu toimuv kokkupuude).  
— Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t  95 ). 
— Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.  
— Mõõteseadmed (vajaduse korral).  
Andmed kokkupuute kohta  
— Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemi ­
kaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).  
— Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoo ­
nist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, aur, aerosool) puhul võidakse iga faasi eraldi analüüsida.
 
— Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutena (mg/l, mg/m  3 
jne), mitte mahuühikutena (ppm, ppb jne).  
— Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline 
diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve ( σ g ) ning nende 
arvutamise meetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.  
Katsetingimused  
— Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh 
andmed mis tahes meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste 
suuruse vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks.  
— Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkon ­
naga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).  
— Kambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoo jälgimiseks kasutatud seadmete 
üksikasjad (st kalibreerimiskõvera koostamine).  
— Kambrikontsentratsiooni ja osakeste suurusjaotuse määramise proovide 
kogumise seadmete andmed.  
— Kasutatud keemilise analüüsi meetodi ja selle valideerimise üksikasjad 
(sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukeskkonna analüü ­
simisel).  
— Loomade katse- ja kontrollrühma määramiseks kasutatud randomiseeri ­
mismeetod.  
— Üksikandmed sööda ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee 
allikas).  
— Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.  
Tulemused  
— Tabelid katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu kohta.  
— Tabelid kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni andmete kohta.  
— Tabelid osakeste suurusjaotuse andmete kohta, sh analüüsiproovide 
võtmise andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σ g arvutamine.  
— Tabelid iga looma reageerimise ja kontsentratsioonide andmete kohta (st 
mürgistusnähtudega loomad, kaasa arvatud surnud loomad, mõjude laad, 
raskus, ilmumise aeg ja kestus).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— Tabel iga katselooma kehamassi kohta.  
— Tabelid sööda tarbimise kohta.  
— Tabelid kliinilise patoloogia andmete kohta.  
— Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.  
Tulemuste arutelu ja tõlgendamine  
— Eritähelepanu tuleks pöörata selliste meetodite kirjeldamisele, mida kasu ­
tati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piirkontsen ­
tratsioon või osakeste suurus.  
— Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda küsimust, kas osakeste suurus oli 
sobiv sissehingamiseks, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei olnud võimalik täita.
 
— Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioo ­
nide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tege ­
liku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.  
— Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist 
toimeviisi (süsteemne või lokaalne).  
— Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (3) 
sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata 
valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis 
tuleks esitada selgitus.  
— Tuleks kindlaks teha sihtorgan(id).  
— Tuleks määrata kindlaks täheldatava kahjuliku toimeta 
kontsentratsioon (NOAEL) ja väikseim täheldatavat kahjulikku toimet avaldav kontsentratsioon (LOAEL).
 
KIRJANDUS  
1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Guide ­
line No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4) Whalan E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material,  Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229–258.  
6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.  
7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
 
9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
 
10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyn ­
geal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.  
11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.  
12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428.  
13) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 
2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja paken ­
damist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja 
tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
1. liide  
MÕISTE  
Uuritav kemikaal:  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30. KROONILISE MÜRGISUSE UURINGUD  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test Guide ­
line, TG) 452 (2009). Esialgne katsejuhend TG 452 võeti vastu 1981. aastal. 
Käesoleva läbivaadatud katsemeetodi B.30 koostamist peeti vajalikuks, et 
võtta arvesse hiljutist arengut loomade heaolu ja regulatiivsete nõuete vald ­
konnas (1, 2, 3, 4). Katsemeetodit B.30 on ajakohastatud paralleelselt käes ­
oleva lisa peatüki B.32 („Kantserogeensuse uuringud”) ja peatüki B.33 
(„Kombineeritud kroonilise mürgisuse/kantserogeensuse uuringud”) läbivaa ­
tamisega selleks, et saada uuringus kasutatavate loomade abil lisateavet ning esitada täpsemaid andmeid dooside valiku kohta. Käesolev katsemeetod on koostatud selleks, et kasutada seda mitmesuguste kemikaalide, sh pestitsii ­
dide ja tööstuslike kemikaalide katsetamiseks.
 
2. Enamik kroonilise mürgisuse uuringuid tehakse näriliseliikidega ja käesolev 
katsemeetod on seega kavandatud peamiselt kasutamiseks nende liikidega tehtavate uuringute puhul. Kui selliseid uuringuid on vaja teha mittenärilis ­
tega, võib samuti rakendada käesolevas katsemeetodis kirjeldatud põhimõt ­
teid ja menetlusi koos põhimõtete ja menetlustega, mida on kirjeldatud 
käesoleva lisa peatükis B.27 („Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90- päevane uuring mittenäriliste puhul”) (5) koos asjakohaste muudatustega, nagu on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 116, mis käsitleb kroonilise 
mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute kavandamist ja teostamist (6).
 
3. Kroonilise mürgisuse uuringutes kasutatavad kolm peamist manustamisteed 
on suukaudne, nahakaudne ja sissehingamise teel manustamine. Manusta ­
misviisi valik sõltub uuritava kemikaali füüsikalistest ja keemilistest omadustest ning inimeste peamisest võimalikust ainega kokkupuutumise viisist. Lisateave kokkupuutetee valimise kohta on esitatud OECD juhend ­
dokumendis nr 116 (6).
 
4. Käesolevas katsemeetodis on keskendutud suukaudsele manustamisele, mis 
on kroonilise mürgisuse uuringutes enim kasutatav manustamistee. Kuigi inimeste tervist ohustavate riskide hindamiseks võivad vajalikud olla ka pikaajalised kroonilise mürgisuse uuringud, mis hõlmavad nahakaudset või 
sissehingamise teel toimuvat kokkupuudet, ja/või neid võidakse nõuda teata ­
vate eeskirjadega, on mõlema nimetatud kokkupuutetee puhul katsete korral ­
damine tehniliselt keeruline. Kõnealused uuringud tuleb kavandada juhtumi ­
põhiselt, kuigi siin suukaudse manustamise kroonilise mürgisuse hindami ­
seks kirjeldatud katsemeetodi võib võtta aluseks sissehingamise teel ja/või 
nahakaudse manustamise uuringu katse-eeskirja koostamisel ja arvestades manustamise ajavahemikke, kliinilisi ja patoloogilisi parameetreid jne käsit ­
levaid soovitusi. On olemas OECD juhenddokumendid uuritava kemikaali 
sissehingamise teel (6, 7) ja nahakaudselt (6) manustamise kohta. Kui 
kavandatakse sissehingamise teel toimuvat kokkupuudet hõlmavaid pikaaja ­
lisi uuringuid, tuleks eelkõige vaadata käesoleva lisa peatükke B.8 (8) ja B.29 (9) koos sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse uurimist käsitleva 
OECD juhenddokumendiga (7). Nahakaudse manustamise katsete tegemisel 
tuleks vaadata käesoleva lisa peatükki B.9 (10).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Kroonilise mürgisuse uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, 
mis võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral kasutatava liigi 
eluea märkimisväärse osa jooksul. Uuringuga saadakse teavet uuritava kemi ­
kaali mürgiste mõjude kohta, tehakse kindlaks sihtorganid ja kemikaali akumulatsiooni võimalikkus. Uuringuga võib ka hinnata täheldatava kahju ­
liku toimeta kontsentratsiooni, mida võib kasutada inimeste kokkupuute 
jaoks ohutuskriteeriumide kehtestamiseks. Samuti rõhutatakse vajadust teha loomade hoolikas kliiniline läbivaatus, et hankida võimalikult palju teavet.
 
6. Käesoleva katsemeetodi kohaste uuringute eesmärgid on järgmised:  
— uuritava kemikaali kroonilise mürgisuse kindlaksmääramine;  
— sihtorganite tuvastamine;  
— mõju doosist sõltuvuse kirjeldamine;  
— täheldatava kahjuliku toimeta doositaseme ( no-observed-adverse-effect 
level, NOAEL) või võrdlusdoosi ( Benchmark Dose , BMD) kindlakste ­
gemiseks lähtepunkti määramine;  
— kroonilise mürgise mõju prognoosimine inimeste kokkupuutetasemetel;  
— andmete saamine toimeviisi käsitlevate hüpoteeside kontrollimiseks (6).  
LÄHTEKAALUTLUSED  
7. Uuritava kemikaali toksikoloogiliste omaduste hindamisel peaks uurimis ­
labor enne uuringu tegemist võtma arvesse kogu olemasoleva teabe uuritava 
kemikaali kohta, et uuringu kavandamisel keskenduda kroonilise toksilisuse võimaluse kõige tõhusamale katsetamisele ja minimeerida loomade kasuta ­
mine. Uuringu kavandamist hõlbustav teave hõlmab järgmist: uuritava kemi ­
kaali keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis 
tahes teave toimeviisi kohta;  in vitro  või in vivo  mürgisuse katsete tule ­
mused; eeldatav/eeldatavad kasutusvaldkond/-valdkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; samalaadse struktuuriga ainete kohta olemasolevad 
(kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksi ­
koloogilised andmed; olemasolevad toksiko-kineetilised andmed (võimaluse korral ühekordse doosi ja korduvdoosi kineetika) ning muude korduva kokkupuute uuringute käigus saadud andmed. Kroonilist mürgisust tuleks 
uurida alles pärast esialgse mürgisust käsitleva teabe saamist korduvdoosi 
28-päevasest ja/või 90-päevasest mürgisuse katsest. Konkreetse uuritava kemikaali võimalike kahjulike tervisemõjude üldhindamisel tuleks kaaluda kroonilise mürgisuse järkjärgulise uurimise lähenemisviisi (11, 12, 13, 14).
 
8. Enne uuringu alustamist tuleks uuringu kava ja eesmärkide alusel kindlaks 
määrata kõige sobivamad tulemuste analüüsi statistilised meetodid. Tuleb 
kaaluda ka seda, kas statistikas tuleks arvestada ellujäämise parandust ja 
analüüsi tegemist sel juhul, kui üks või mitu rühma tuleb enneaegselt surmata. Suunised asjakohaste statistiliste analüüside tegemiseks ja peamised viited rahvusvaheliselt tunnustatud statistilistele meetoditele on esitatud 
juhenddokumentides nr 116 (6) ning nr 35, milles käsitletakse kroonilise 
mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute analüüsi ja hindamist (15).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Kroonilise mürgisuse uuringu tegemisel tuleks alati järgida suunispõhimõt ­
teid ja kaalutlusi, mis on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 19 kliini ­
liste nähtude tuvastamise, hindamise ja kasutamise kohta ohutuse hindamisel kasutatavate katseloomade humaansete lõpetamiskriteeriumidena (16) ja eelkõige selle punktis 62. Kõnealuses punktis on sätestatud, et „[k]ui uurin ­
gutes, milles kasutatakse korduvat annustamist, tekivad loomal kliinilised 
progresseeruvad nähud, mis põhjustavad tema seisundi halvenemise, tuleb teha andmetel põhinev otsus, kas loom tuleks humaansel viisil surmata. Otsuse tegemisel tuleks kaaluda kõnealuse uuringus osaleva looma jätkuvast 
elushoidmisest saadava teabe väärtust võrreldes looma üldise seisundiga. 
Kui tehakse otsus kõnealune loom katsesse jätta, siis tuleks vajaduse korral suurendada vaatluste sagedust. Ilma katse eesmärki kahjulikult mõjutamata võib samuti olla võimalik annustamise ajutine peatamine, kui see vähendab 
looma valu või kannatusi, või katsedoosi vähendamine.”
 
10. Üksikasjalikke suuniseid ja arutelu kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse 
uuringute doosi valimise põhimõtete kohta on võimalik leida juhenddoku ­
mendist nr 116 (6) ning samuti kahest rahvusvahelise bioteaduste instituudi 
väljaandest (17, 18). Doosi valimise strateegia sõltub põhiliselt uuringu 
peamisest eesmärgist või peamistest eesmärkidest (punkt 6). Sobivate doosi ­
tasemete valimisel tuleks saavutada tasakaal ühelt poolt ohu sõeluuringute ja teiselt poolt väikese doosi mõju iseloomustamise ning doosi ja mõju vahe ­
lise seose kindlakstegemise vahel. See on eriti oluline juhul, kui tehakse 
kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuring (käesoleva lisa peatükk B.33; punkt 11).
 
11. Tuleks kaaluda eraldi kroonilise mürgisuse uuringu (käesolev katsemeetod 
B.30) ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.32) tegemise asemel kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.33) tegemist. Kombineeritud katse võimaldab 
kokku hoida aega ja kulusid, võrreldes kahe eraldi uuringu tegemisega, 
kuid annab samasuguse kvaliteediga andmed nii kroonilise mürgisuse kui ka kantserogeensuse kohta. Kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantse ­
rogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.33) tegemisel tuleks siiski 
hoolikalt kaaluda doosi valimise põhimõtteid (punktid 9 ja 20–25) ning 
tuleb ka arvestada, et mõnikord nõutakse eraldi uuringute tegemist eeskirja ­
dega.
 
12. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle 
peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 116 (6).  
KATSE PÕHIMÕTE  
13. Uuritavat kemikaali manustatakse iga päev astmeliselt suurenevate doosi ­
dena mitmele katseloomade rühmale üldjuhul 12 kuu vältel, kuigi regula ­
tiivsetest nõuetest olenevalt võib katse kestus olla ka pikem või lühem (vt punkt 33). Katse selline kestus tagab, et see on piisavalt pikk kumulatiivse 
mürgisuse mõjude avaldumiseks, kuid tulemusi ei hakka veel segama geriaa ­
trilised muutused. Kõrvalekaldeid 12-kuulisest kokkupuute kestusest tuleks põhjendada, eelkõige lühema kestuse puhul. Uuritavat kemikaali manusta ­
takse tavaliselt suu kaudu, kuigi ka sissehingamise või nahakaudse kokku ­
puute uurimine võib olla sobiv. Uuringu kavaga võib ette näha ühe või mitu 
vahepealset surmamist, näiteks kolme ja kuue kuu möödudes, ja selle võimaldamiseks võib kasutada täiendavaid loomarühmi (vt punkt 19). Manustamisperioodi jooksul vaadeldakse loomi põhjalikult toksilisuse 
märkide tuvastamiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse 
ning katse lõppemisel tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
14. See katsemeetod hõlmab kroonilise mürgisuse hindamist peamiselt näriliste 
puhul (vt punkt 2), kuigi tuleb arvestada, et mõnikord võidakse eeskirjadega nõuda samalaadsete katsete tegemist muude loomadega kui närilised. Liigi valikut tuleks põhjendada. Kui nõutakse kroonilise mürgisuse uuringut muu 
liigiga kui närilised, peaks selle kavandamine ja tegemine toetuma põhimõ ­
tetele, mis on esitatud käesolevas katsemeetodis ja käesoleva lisa peatükis B.27 („Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90-päevane uuring mittenäriliste puhul”) (5). Lisateave liigi ja aretusliini valimise kohta on esitatud juhend ­
dokumendis nr 116 (6).
 
15. Käesoleva katsemeetodi puhul on eelistatud näriliseliik rott, kuigi kasutada 
võib ka muid närilisi, nt hiiri. Rotid ja hiired on olnud eelistatud katsemu ­
delid tänu nende suhteliselt lühikesele elueale, laialdasele kasutamisele farmakoloogia- ja toksikoloogiauuringutes, võimalusele kutsuda neil kergesti 
esile kasvajaid ja tänu piisavalt iseloomustatud liinide kättesaadavusele. 
Nende omaduste tulemusena on olemas palju teavet nende füsioloogia ja patoloogia kohta. Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi. Kroonilise mürgisuse uuring tuleks teha loomadega, kes 
on samast liinist ja sama päritoluga kui loomad, keda kasutati lühema 
kestusega esialgses mürgisuse kindlakstegemise uuringus. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
16. Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades; 
eraldi pidamist tuleks kaaluda ainult juhul, kui see on teaduslikult põhjen ­
datud (19, 20, 21). Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud 
mõjud on võimalikult väikesed. Loomade katseruumi temperatuur peaks 
olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi 
pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee 
kogust ei piirata. Sööt peaks vastama kõigile uuritava liigi toitumisvajadus ­
tele ja sööda saasteainesisaldus, sh pestitsiidijäägid, püsivad orgaanilised saasteained, fütoöstrogeenid, raskmetallid ja mükotoksiinid, mis võivad 
mõjutada katse tulemusi, peaks olema võimalikult väike. Regulaarselt tuleks 
analüüsida sööda toitainete ja saasteainete sisaldust; vähemalt tuleks seda teha uuringu alguses ja siis, kui hakatakse kasutama uut söödapartiid, ning 
analüüside tulemused tuleks esitada lõpparuandes. Samuti tuleks esitada 
uuringus kasutatud joogivee analüüsi andmed. Sööda valikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali jaoks sobiv segu ja rahuldada loomade toitumisvajadused, kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga.
 
Loomade ettevalmistamine  
17. Kasutada tuleks terveid loomi, kes on labororitingimustega vähemalt seitsme 
päeva jooksul kohanenud ning keda ei ole varem uuringutes kasutatud. Näriliste korral tuleks loomadele uuritava kemikaali annustamist alustada 
võimalikult varakult pärast võõrutamist ja kohanemist ning eelistatavalt 
enne, kui loomad on kaheksa nädala vanused. Katseloomi tuleks kirjeldada ja teatada liik, liin, päritolu, sugu, kehamass ja vanus. Uuringu alguses peaks kummagi soo loomade kehamassi erinevus olema minimaalne ja kõrvale ­
kalle ei tohiks ületada 20 % uuringus kasutatavate loomade keskmisest 
kehamassist, mis leitakse eraldi kummagi soo loomade jaoks. Loomad tuleks
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
kontroll- ja katserühmadesse jaotada juhuslikkuse alusel. Pärast juhuslikkuse 
alusel jaotamist ei tohiks rühmades kummagi soo keskmised kehamassid 
oluliselt erineda. Kui erinevused on statistiliselt olulised, tuleks juhuslikkuse alusel jaotamise etappi võimaluse korral korrata. Igale loomale tuleks määrata ainuline tunnusnumber ja loom tuleks kõnealuse numbriga püsivalt 
märgistada tätoveerimise, mikrokiibi paigaldamise või muu sobiva meetodi 
abil.
 
KATSE KÄIK  
Loomade arv ja sugu  
18. Tuleks kasutada mõlemat sugu. Tuleks kasutada piisavalt palju loomi, et 
uuringu lõpus oleks igas rühmas küllalt loomi põhjalikuks bioloogiliseks ja statistiliseks hindamiseks. Näriliste puhul tuleks tavaliselt igas doositaseme 
rühmas kasutada vähemalt 20 looma kummastki soost ning mittenäriliste 
puhul on rühmas soovitatav kasutada vähemalt nelja looma kummastki soost. Hiirtega tehtavates uuringutes võib olla vajalik kasutada igas doosi ­
taseme rühmas rohkem loomi, et teha kõik nõutavad hematoloogilised 
analüüsid.
 
Loomade vahepealne surmamine, satelliitrühmad ja kontroll-loomad  
19. Kui see on teaduslikult põhjendatud, võib uuringus ette näha vahepealsed 
surmamised (vähemalt kümme looma kummagi soo ja iga doosirühma 
kohta), näiteks kuue kuu möödumisel, et saada teavet toksikoloogiliste 
muutuste arengu kohta ja toimemehhanismi kohta. Kui selline teave on uuritava kemikaaliga tehtud varasematest korduvdoosi mürgisuse uuringutest juba olemas, ei pruugi vahepealsed surmamised olla teaduslikult põhjen ­
datud. Samuti võib kaasata satelliitrühmi, et jälgida uuritava kemikaali 
põhjustatud toksikoloogiliste muutuste pöörduvust; nende puhul kasutatakse üldjuhul uuringu kõrgeimat doseerimistaset ja kontrollrühma. Vajaduse korral võib uuringu vältel lisada haigusseisundi seireks ka täiendava 
kontroll-loomade rühma (üldjuhul viis looma kummastki soost) (22). Kui 
kavandatakse vahepealseid surmamisi või satelliit- või kontroll-loomade rühmade kasutamist, tuleks uuringuprojekti kaasatud loomade arvu suuren ­
dada nende loomade arvu võrra, kes kavatsetakse enne uuringu lõppu 
surmata. Selliste loomade puhul tuleks üldjuhul teha samad vaatlused, sh 
kehamassi ja sööda/vee tarbimise mõõtmised, hematoloogilised ja kliinilise biokeemia mõõtmised ning patoloogiauuringud, kui põhiuuringu kroonilise mürgisuse etapi loomade puhul, kuigi võib ka otsustada, et vahepealse 
surmamise rühmade puhul piirdutakse konkreetsete peamiste näitajate, 
näiteks neurotoksilisuse või immunotoksilisuse mõõtmisega.
 
Doosirühmad ja doseerimine  
20. Juhendid kõigi doosi valiku ja doositaseme intervallidega seotud asjaolude 
kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (6). Uuringus tuleb kasutada 
vähemalt kolme doositaset ja uuringuga samal ajal peab tegema ka kontrolli, 
välja arvatud siis, kui tehakse piirsisalduskatse (vt punkt 27). Doositasemed põhinevad üldjuhul lühema ajavahemiku korduvdoosi või doosipiirkonna määramise katse tulemustel ja nende puhul tuleks arvesse võtta uuritava 
kemikaali või samalaadsete kemikaalide kohta olemasolevat toksikoloogia- 
ja toksikokineetikaalast teavet.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Kui uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline 
mõju seda ei piira, peaks kõrgeim doositase olema üldiselt valitud nii, et 
saaks määrata kindlaks peamised sihtorganid ja toksilise toime, põhjustamata siiski kannatusi, ägedat mürgisust, haigestumist või surma. Punktis 22 allpool loetletud asjaolusid arvesse võttes tuleks valida kõrgeim doositase, 
et saada tõendusmaterjali mürgisuse kohta, näiteks kehamassi tõusu vähene ­
mise kaudu (ligikaudu 10 %).
 
22. Sellest hoolimata võidakse uuringu eesmärkidest olenevalt (vt punkt 6) 
valida suurim doos, mis jääb allapoole mürgisust tõendavat doosi, näiteks 
kui doos avaldab teatavat kahjulikku mõju, kuid siiski ei mõjuta eluiga ega kehamassi. Suurim doos ei tohiks ületada 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas (piirdoos, vt punkt 27).
 
23. Doositaseme ja doositasemete intervalli võib valida nii, et määrata kindlaks 
mõju sõltuvus doosist, täheldatava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) või muu soovitud uuringutulemus, näiteks 
võrdlusdoos (BMD) (vt punkt 25) madalaimal doositasemel. Asjaolud, 
mida tuleks väiksemate dooside valimisel arvesse võtta, on toime doosist sõltuvuse eeldatav suurenemine, doosid, mis võivad põhjustada olulisi meta ­
boliseerimise muutusi või toksilisuse toimemehhanismi muutumist, kui 
eeldatakse läviväärtuse olemasolu, või mille puhul eeldatakse väikeste 
dooside ekstrapoleerimise lähtepunkti olemasolu.
 
24. Doositasemete vahemik sõltub uuritava kemikaali omadustest ja seda ei saa 
käesoleva katsemeetodiga ette kirjutada, aga kahe- kuni neljakordne 
vahemik annab sageli häid katsetulemusi, kui seda kasutatakse alanevate doositasemete määramiseks, ning dooside vahel väga suure (näiteks rohkem kui kuue- kuni kümnekordse) vahemiku kasutamise asemel on sageli parem 
lisada neljas katserühm. Üldiselt tuleks vältida kümnest suurema kordaja 
kasutamist ja kui seda tehakse, tuleks seda põhjendada.
 
25. Nagu juhenddokumendis nr 116 (6) on täpsemalt kirjeldatud, tuleb doosi 
valimisel arvesse võtta järgmist:  
— doosi-toime sõltuvuse teadaolev või oletatav mittelineaarsus või murde ­
punkt;  
— toksikokineetika ja doosipiirkonnad, mille puhul esineb metaboolne 
induktsioon, küllastumine või väliste ja sisemiste dooside vaheline mitte ­
lineaarsus või neid ei esine;  
— esmaskahjustused, toimemarkerid või märgid sellest, et tuleb arvesse 
võtta peamiste bioloogiliste alusprotsesside toimumist;  
— peamised (või oletatavad) toimeviisi asjaolud, näiteks annused, mille 
juures hakkab suurenema tsütotoksilisus, mõjutatakse hormoonitasemeid, homeostaasi säilitamise mehhanismid saavad üle koormatud jne;
 
— mõju doosist sõltuvuse kõvera piirkonnad, kus on vaja eriti usaldus ­
väärset hinnangut, näiteks eeldatava võrdlusdoosi (BMD) vahemikus või oletatava läviväärtuse juures;
 
— inimeste kokkupuute eeldatava tasemega seotud kaalutlused.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Kontrollrühm on rühm, kellega katseid ei tehta, või kandeaine kontrollrühm, 
kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet. Kontrollrühma 
loomi tuleks kohelda samamoodi kui katserühma loomi, välja arvatud uuri ­
tava kemikaali manustamine. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet kõige suuremas koguses, mida kasutatakse doosirühmades. Kui 
uuritavat kemikaali manustatakse söödaga ja katseloomad söövad seda 
sööda halvema maitse tõttu oluliselt vähem, võib asjakohasema kontroll ­
rühma tagamiseks olla sobiv täiendav kontrollrühm, kes saab samapalju sööta, kui doosirühmas ära süüakse.
 
27. Kui eeluuringust saadud teabe alusel võib oletada, et katse ühel doosita ­
semel, mis on võrdväärne päevas vähemalt 1 000 mg-ga kehamassi kg kohta 
ja mille puhul kasutatakse käesoleva uuringu jaoks kirjeldatud meetodeid, ei põhjusta tõenäoliselt kahjulikku mõju ja kui samalaadse struktuuriga ainete andmete alusel mürgisust ei eeldata, siis ei tarvitse kolme doositaseme 
kasutamisega täismahus uuring olla vajalik. Võib kasutada piirdoosi 1 000 
mg kehamassi kg kohta päevas, välja arvatud juhul, kui inimese võimalikku kokkupuudet arvestades on vaja kasutada suuremat doositaset.
 
Dooside ettevalmistamine ja uuritava kemikaali manustamine  
28. Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu koos sööda või joogi ­
veega või sundsöötmisega. Lisateave manustamisteede ja -meetodite kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (6). Manustamistee ja -meetod sõltub 
uuringu eesmärgist, uuritava kemikaali füüsikalistest/keemilistest omadus ­
test, biosaadavusest ja inimese uuritava kemikaaliga kokkupuutumise peami ­
sest teest ja viisist. Manustamistee ja -meetodi valikut tuleks põhjendada. Loomade heaolu huvides tuleks suukaudne manustamine sundsöötmisega 
üldiselt valida ainult selliste ainetega, mille puhul see manustamistee ja 
-meetod on põhjendatult sarnane inimese võimaliku kokkupuutega kemikaa ­
liga (näiteks ravimid). Toidu- või keskkonnakemikaalide puhul, sh pestitsii ­
dide puhul toimub manustamine tavaliselt sööda või joogivee kaudu. Mõne 
stsenaariumi puhul, näiteks kokkupuude töökohal, võib olla asjakohasem 
manustada kemikaali muul viisil.
 
29. Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas 
kandeaines. Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine ja muude lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotumisele, 
metaboliseerimisele või retentsioonile; mõju uuritava kemikaali keemilistele 
omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi, ning mõjud sööda või vee tarbimisele või loomade toitumusele. On soovitatav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/- 
emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku lahust muus 
kandeaines. Muu kandeaine kui vee puhul tuleks teada kandeaine mürgiseid omadusi. Tuleks teada uuritava kemikaali stabiilsust ning doseerimislahuste või sööda (nagu on asjakohane) homogeensust manustamise tingimustes 
(näiteks söödaga).
 
30. Nende kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on 
oluline tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tava ­
list toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Pikas mürgisuse uuringus, kus kemikaali manustatakse sööda kaudu, ei tohiks uuritava kemikaali kont ­
sentratsioon söödas üldiselt olla suurem kui 5 % sööda üldkogusest, et 
vältida tasakaalustamata toitumist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (mg sööda kg kohta või ppm) või püsivat doositaset looma kehamassi alusel (mg keha ­
massi kg kohta), mis arvutatakse iga nädal. Tuleks täpsustada, millist võima ­
lust kasutatakse.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Suukaudse manustamise korral saavad loomad uuritavat kemikaali iga päev 
(seitse päeva nädalas) üldjuhul 12 kuu vältel (vt ka punkt 33), kuigi regu ­
latiivsetest nõuetest olenevalt võib vaja minna ka pikemat katset. Iga muud doseerimiskava, nt viis päeva nädalas, tuleb põhjendada. Nahakaudse manustamise puhul töödeldakse loomi üldjuhul uuritava kemikaaliga 12 
kuu vältel vähemalt kuus tundi päevas seitse päeva nädalas, nagu on sätes ­
tatud käesoleva lisa peatükis B.9 (10). Sissehingamise teel toimuv kokku ­
puude toimub kuus tundi päevas ja seitse päeva nädalas; võib kasutada ka kokkupuudet viiel päeval nädalas, kui see on põhjendatud. Kokkupuutepe ­
riood on üldjuhul 12 kuud. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet 
kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Kui päevas kasutatakse alla kuuetunnist kokkupuute kestust, 
tuleks seda põhjendada. Vt ka käesoleva lisa peatükk B.8 (8).
 
32. Kui loomadele manustatakse uuritavat kemikaali sundsöötmisega, tuleks 
seda teha iga päev umbes samal kellaajal maosondi või sobiva intubatsioo ­
nikanüüli abil. Üldiselt manustatakse üks annus üks kord päevas; kui aga kemikaal on näiteks lokaalne ärritaja, võib igapäevase doosimäära säilitada, manustades jaotatud annust (kaks korda päevas). Suurim vedelikukogus, 
mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus 
peaks olema nii väike kui praktiliselt võimalik ega tohiks üldjuhul näriliste puhul ületada 1 ml kehamassi 100 g kohta (22). Katses kasutatava mahu erinevusi tuleks vähendada miinimumini; püsiva mahu tagamiseks tuleks 
kõikidel doositasemetel kasutada erinevaid kontsentratsioone. Erandiks on 
võimaliku söövitava või ärritava mõjuga kemikaalid, mida tuleb tugeva paikse mõju vältimiseks lahjendada. Tuleks vältida katseid kontsentratsioo ­
nidel, mis tõenäoliselt võivad seedetrakti söövitada või ärritada.
 
Uuringu kestus  
33. Kuigi käesolev katsemeetod on peamiselt kavandatud kroonilise mürgisuse 
12-kuulise uuringuna, võimaldab uuringu kava ka lühema (näiteks kuus või üheksa kuud) või pikema (näiteks 18 või 24 kuud) kestusega uuringuid, 
olenevalt konkreetsetest eeskirjadest või teatavatest toimemehhanismiga 
seotud eesmärkidest. Kõrvalekaldeid 12-kuulisest kokkupuute kestusest tuleks põhjendada, eelkõige lühema kestuse puhul. Uuritava kemikaali põhjustatud toksikoloogiliste muutuste pöörduvuse jälgimiseks kasutatavaid 
satelliitrühmi tuleks pärast kokkupuute lõpetamist hoida ilma annustamiseta 
vähemalt neli nädalat ja mitte rohkem kui kolmandiku uuringu kogukestu ­
sest. Täpsemad juhendid, sh uuringus ellujäämise arvestamise kohta, on esitatud juhenddokumendis nr 116 (6).
 
VAATLUSED  
34. Kõiki loomi tuleks haigestumise või suremise suhtes kontrollida, tavaliselt 
iga päeva alguses ja lõpus, sh nädalavahetustel ja pühadel. Vähemalt üks kord päevas tuleks teha üldine kliiniline läbivaatus, eelistatavalt igal päeval 
samal ajal / samadel aegadel, arvestades sundsöötmisega manustamise puhul 
eeldatava mõju kõrgperioodi pärast doseerimist.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Kõik loomad tuleks üksikasjalikult kliiniliselt läbi vaadata vähemalt kord 
enne esimest kokkupuudet (et võimaldada iga katselooma seisundi muutu ­
mise võrdlusi), uuringu esimese nädala lõpus ja seejärel iga kuu. Vaatlused tuleks korraldada nii, et üksikute vaatlejate vahelised erinevused oleksid minimeeritud ega sõltuks katserühmast. Need vaatlused tuleks teha väljas ­
pool puuri, eelistatavalt selleks ette nähtud kohas ja iga kord samal ajal. 
Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral katselabori selgelt kindlaks määratud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et vaatlustingimuste varieeruvus oleks minimaalne. Üles tuleks 
märkida vähemalt järgmised tunnused: muutused nahal, karvastikus, 
silmades, limaskestal, eritiste esinemine ning autonoomsed muutused (nt pisaravool, turris karv, pupillide suurus ja muutunud hingamine). Samuti tuleks üles märkida muutused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas 
loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, kloonilised või toonilised liigu ­
tused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldamine, ringiratast keer ­
lemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi liik ­
umine) (24).
 
36. Enne uuritava kemikaali esmakordset manustamist tuleks oftalmoskoobi või 
muu sobiva seadme abil teha kõikide loomade oftalmoloogiline kontroll. Pärast uuringu lõppu tuleks kõnealune kontroll teha eelistatavalt kõikidele 
loomadele, kuid vähemalt suure doosi rühma ja kontrollrühma loomadele. 
Kui silmades avastatakse muutusi, tuleb läbi vaadata kõik loomad. Kui struktuurianalüüs või muu teave viitab mürgisusele silmade suhtes, tuleks silmi kontrollida sagedamini.
 
37. Kui kemikaali varasem korduvannuse 28-päevane ja/või 90-päevane mürgi ­
suse uuring näitas võimalikku neurotoksilist mõju, võib soovi korral enne uuringu algust ja kolmekuuliste ajavahemike järel pärast uuringu algust kuni 
12 kuuni (kaasa arvatud) ning samuti uuringu lõpus (kui uuring kestab 
kauem kui 12 kuud) uurida erinevat tüüpi stiimulitele (24) (näiteks helilised, visuaalsed ja propriotseptiivsed stiimulid) sensoorset reageerimist (25, 26, 27), hinnata haardetugevust (28) ja motoorset tegevust (29). Võimalike 
meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud vastavates viidetes. Siiski võib 
kasutada ka muid meetodeid kui need, millele viidatakse.
 
38. Sellise kemikaali puhul, mille varasem korduvannuse 28-päevane ja/või 90- 
päevane mürgisuse uuring näitas immunotoksilise mõju võimalikkust, võib 
soovi korral teha uuringu lõpul kõnealuse näitaja täiendavaid uuringuid.  
Kehamass, sööda ja vee tarbimine ning söödakasutuse tõhusus  
39. Kõik loomad tuleks kaaluda kemikaali manustamise alguses, vähemalt kord 
nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Sööda 
tarbimist ja söödakasutuse tõhusust tuleks mõõta vähemalt kord nädalas 
esimese 13 nädala vältel ning seejärel vähemalt kord kuus. Kui kemikaali manustatakse joogiveega, siis tuleks vee tarbimist mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Joogivee 
tarbimise mõõtmisi tuleks kaaluda ka uuringute puhul, milles muutub 
loomade joomiskäitumine.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematoloogia ja kliiniline biokeemia  
40. Näriliste uuringutes tuleks hematoloogilised uuringud teha vähemalt kümne 
isas- ja kümne emasloomaga rühma kohta kolme, kuue ja 12 kuu möödu ­
misel ning samuti uuringu lõpus (kui uuring kestab kauem kui 12 kuud); 
kõik uuringud tehakse alati samadel loomadel. Hiirte puhul võib kõikide 
nõutavate hematoloogiliste näitajate määramiseks minna vaja satelliitloomi (vt punkt 18). Muude loomade kui näriliste uurimisel võetakse proovid väiksemalt arvult loomadelt (koerte uurimisel näiteks neljalt loomalt 
kummagi soo ja iga rühma kohta) vahepealsetel proovivõtu aegadel ja 
uuringu lõpus, nagu on kirjeldatud näriliste puhul. Kui võrreldavate doosi ­
tasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu vältel ei tuvastatud mõju 
hematoloogilistele parameetritele, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõt ­
misi teha ei näriliste ega muude loomade puhul. Vereproovid tuleks võtta määratud kohast, näiteks otse südamest või retroorbitaalsest siinusest, kasu ­
tades tuimestust.
 
41. Tuleks uurida järgmisi parameetreid (30): leukotsüütide üldarv ja diferent ­
seeritud leukotsüüdiarvud, erütrotsüütide arv, vereliistakute arv, hemoglo ­
biini kontsentratsioon, hematokrit (rakkude protsent vere üldmahus), erütrot ­
süütide keskmine maht (MCV), hemoglobiini keskmine kogus erütrotsüüdis (MCH), hemoglobiini keskmine kontsentratsioon erütrotsüüdis (MCHC), protrombiini aeg ja aktiveeritud osalise tromboplas ­
tiini aeg. Vajaduse korral võib mõõta muid hematoloogiaparameetreid, 
näiteks Heinzi kehakesi või muid atüüpilisi erütrotsüüdivorme või methe ­
moglobiini, olenevalt uuritava kemikaali mürgisusest. Üldiselt tuleks kasu ­
tada paindlikku lähenemisviisi sõltuvalt konkreetse uuritava kemikaali puhul 
täheldatud ja/või eeldatavast mõjust. Kui uuritav kemikaal mõjutab vere ­
loomesüsteemi, võib olla vajalik uurida samuti retikulotsüütide arvu ja luuüdi tsütoloogiat, kuigi need uuringud ei ole alati vajalikud.
 
42. Olulise kudesid kahjustava toksilise mõju ning eelkõige neerusid ja maksa 
kahjustava mõju uurimiseks tehakse kliinilise biokeemia analüüsid vereproo ­
videga, mis on võetud vähemalt kümnelt isas- ja kümnelt emasloomalt 
rühma kohta samade ajavahemike järel, mis on ette nähtud hematoloogiliste 
uuringute puhul; proovid võetakse alati samadelt loomadelt. Hiirte puhul võib kõikide nõutavate kliinilise biokeemia näitajate määramiseks minna vaja satelliitloomi. Muude loomade kui näriliste uurimisel võetakse proovid 
väiksemalt arvult loomadelt (koerte uurimisel näiteks neljalt loomalt 
kummagi soo ja iga rühma kohta) vahepealsetel proovivõtu aegadel ja uuringu lõpus, nagu on kirjeldatud näriliste puhul. Kui võrreldavate doosi ­
tasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu vältel ei tuvastatud mõju 
kliinilise biokeemia parameetritele, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõt ­
misi teha ei näriliste ega muude loomade puhul. Enne vereproovi võtmist on soovitatav loomi (v.a hiired) öö jooksul näljutada. Tuleks uurida järgmisi parameetreid (30): glükoos, karbamiid (karbamiidlämmastik), kreatiniin, 
üldvalk, albumiin, kaltsium, naatrium, kaalium, üldkolesterool, vähemalt 
kaks sobivat hepatotsellulaarse hindamise katset (alaniinaminotransferaas, aspartaataminotransferaas, glutamaatdehüdrogenaas, sapphapete kogusi ­
saldus) (31) ja vähemalt kaks sobivat hepatobiliaarse hindamise katset 
(aluseline fosfataas, γ-glutamüültransferaas, 5’-nukleotidaas, üldbilirubiini, 
sapphapete kogusisaldus) (31). Muid kliinilisi keemilisi parameetreid, näiteks triglütseriide paastutingimustes, teatavaid hormoone ja koliinesteraasi võib mõõta vastavalt vajadusele, olenevalt uuritava kemikaali mürgisusest. 
Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi sõltuvalt uuritava kemikaali tähel ­
datud ja/või oletatavast mõjust.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Uriinianalüüsi näitajad tuleks määrata vähemalt kümnel isas- ja kümnel 
emasloomal rühma kohta proovidest, mis on kogutud samade vahemikega 
kui hematoloogia- ja kliinilise keemia proovid. Kui võrreldavate doositase ­
metega tehtud varasema 90-päevase uuringu ajal ei leitud uriinianalüüsil mingit mõju, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha. Kliinilise 
patoloogia uuringute eksperdi soovituse (30) kohaselt tuleks määrata järg ­
mised parameetrid: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, üldvalk ja glükoos. Lisaks võib määrata ketoone, urobilinogeeni, bilirubiini ja peitverd. Kui täheldatud mõju on vaja laialdasemalt uurida, võib vajaduse 
korral määrata täiendavaid näitajaid.
 
44. Üldiselt arvatakse, et hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate lähte ­
väärtused on vaja enne kemikaali manustamist määrata koertega tehtavate uuringute puhul, kuid närilistega tehtavate uuringute puhul neid määrata vaja 
ei ole (30). Kui varem määratud lähteväärtused (vt punkt 50) ei ole õiged, 
tuleks kaaluda selliste väärtuste määramist.
 
Patoloogia  
Täielik lahkamine  
45. Kõik uuringus kasutatud loomad läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, 
milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja 
kõhuõõnt ja nende sisaldist. Siiski võib ka ette näha, et mõõtmised piirduvad (vahepeal surmatud või satelliitrühma loomade puhul) kõige olulisemate, näiteks neurotoksilisuse või immunotoksilisuse näitajate määramisega (vt 
punkt 19). Selliseid loomi ei ole vaja lahata ja nendega teha järgmistes 
punktides kirjeldatud protseduure. Kontroll-loomade puhul võib uuringu juht konkreetsel juhul otsustada, kas lahkamine on vajalik.
 
46. Kõikide loomade puhul, v.a loomad, kellele on tehtud erand punkti 45 
viimase osa järgi, tuleks määrata organite mass. Kõigi loomade (välja 
arvatud loomad, kes leitakse suremas ja/või surmatakse uuringu kestel) neerupealised, aju, munandimanused, süda, neerud, maks, munasarjad, põrn, munandid, kilpnääre (mis kaalutakse pärast fikseerimist koos kõrval ­
kilpnäärmetega) ja emakas tuleks puhastada kõigist nende küljes olevatest 
kudedest, nagu on asjakohane, ja kaaluda märjalt võimalikult kiiresti pärast lahkamist, et vältida organite kuivamist. Uuringus, kus kasutatakse hiiri, ei ole neerupealiste kaalumine kohustuslik.
 
47. Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise 
uuringu (vt punkt 32) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas (kandilistes sulgudes esitatud organite uuring ei ole kohustuslik): 
Kõik silmaga nähtavad 
kahjustused Süda Kõhunääre Magu (eesmagu, mao näär ­
meline osa) 
Neerupealised Niudesool Kõrvalkilpnääre [Hambad] Aort Tühisool Perifeerne närv Munandid 
Aju (sh suuraju osad, 
väikeaju ning piklikaju/ ajusild) Neerud Ajuripats Harknääre 
Umbsool Pisaranääre (eksorbi ­
taalne) Eesnääre Kilpnääre 
Emakakael Maks Pärasool [Keel]
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
Koagulatsiooninääre Kops Süljenääre Hingetoru 
Käärsool Lümfisõlmed (nii pealis ­
pinnalt kui ka sügavalt) Seemnepõiekesed Kusepõis 
Kaksteistsõrmiksool Piimanäärmed (kohustus ­
likud emaste puhul ja 
kui need on nähtavalt lõigatavad, siis ka isaste puhul) Skeletilihas Emakas (sh emakakael) 
Munandimanus [Ülemised hingamisteed, 
sh nina, ninakarbikud ja ninakõrvalkoopad] Nahk [Kusejuha] 
Silm (sh võrkkest) Söögitoru Seljaaju (kolmel 
tasandil: kaela-, rinna- 
ja nimmepiirkond) [Kusiti] 
[Reieluu koos liigesega] [Haistmissibul] Põrn Tupp 
Sapipõis (muud liigid kui 
rott) Munasarjad [Rinnak] Luuüdi lõige ja/või värske 
luuüdi aspiraat 
Harderi nääre
 
Paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks säilitada 
mõlemad organid. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava 
kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla 
sihtorganid. Nahakaudse manustamise uuringute puhul tuleks säilitada need organid, mis on ette nähtud suukaudse manustamise puhul, ja üliolu ­
line on manustamiskohast nahaproovide võtmine ja säilitamine. Inhalatsioo ­
niuuringute korral tuleks hingamisteedest säilitatavate ja uuritavate kudede 
puhul järgida käesoleva lisa peatükkide B.8 (8) ja B.29 (9) soovitusi. Muude organite/kudede puhul (ja lisaks hingamisteedest pärit konkreetselt säilitata ­
vatele kudedele) tuleks järgida suukaudse manustamise puhul esitatud orga ­
nite nimekirja.
 
Histopatoloogia  
48. On avaldatud juhendid toksikoloogilise patoloogia uuringute tegemise pari ­
mate tavade kohta (32). Tuleb teha vähemalt järgmised histopatoloogilised uuringud:
 
— suure annuse ja kontrollrühmade loomade kõik koed;  
— uuringu vältel surnud või surmatud loomade kõik koed;  
— kõik koed, milles täheldatakse makroskoopilisi anomaaliaid;  
— sihtkoed või koed, mille puhul suure annuse rühmas on näha kokkupuu ­
test tingitud muutusi, kõikidelt suure annuse rühmade loomadelt;  
— paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks uurida 
mõlemat organit.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
49. Kõigi hinnatavate parameetrite kohta tuleks esitada iga looma andmed. 
Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arv, mürgistusnähtudega 
loomade arv, täheldatud mürgistusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise 
toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta nende loomade protsent, kellel seda esines. Kokkuvõtlikes tabelites tuleks esitada (pidevalt mõõdetud katseandmete 
puhul) nende loomade keskmised ja standardhälbed, kellel täheldati mürgi ­
suse mõju või kahjustusi, lisaks kahjustuse raskusastme määramisele.
 
50. Varasemad kontrolli andmed võivad aidata uuringu tulemusi tõlgendada, 
näiteks kui samaaegse kontrolli andmed erinevad oluliselt sama katsekorral ­
duse juures kontrollrühma loomadelt saadud hiljutistest andmetest. Hinda ­
miseks võetud varasemad kontrolli andmed peaksid pärinema samast labo ­
rist, olema saadud sama vanuserühma ja sama liini loomadega ning olema 
kogutud kõnealusele uuringule eelneva viie aasta jooksul.  
51. Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt 
tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid ja analüüsitavad andmed tuleks valida uuringu kavandamise etapis (punkt 8). Sellisel vali ­
misel tuleks vajaduse korral ette näha, et tulemusi tuleb kohandada ellujää ­
mise määra arvestamiseks.
 
Katseprotokoll  
52. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav kemikaal:  
— füüsikaline olemus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused;  
— tunnusandmed;  
— kemikaali päritolu;  
— partii number;  
— keemilise analüüsi sertifikaat.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valimise põhjendus (kui kandeaine on muu kui vesi).  
Katseloomad:  
— kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;  
— loomade arv, vanus ja sugu katse alguses;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;  
— iga looma kehamass katse alguses.  
Katsetingimused:  
— manustamistee ja doosi valiku põhjendus;  
— kui see on kohaldatav, siis andmete analüüsimiseks valitud statistilised 
meetodid;  
— andmed uuritava kemikaali preparaadi/sööda valmistamise kohta;  
— analüüsiandmed preparaadis saavutatud kontsentratsiooni, preparaadi 
stabiilsuse ja homogeensuse kohta;  
— manustamistee ja uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;  
— inhalatsiooniuuringute puhul: kas manustamine toimub ainult nina või 
kogu keha kaudu;  
— tegelik doos (mg kehamassi kg kohta päevas) ja vajaduse korral ümbe ­
rarvestustegur söödas või joogivees oleva uuritava kemikaali kontsen ­
tratsiooni (mg/kg või ppm) ja tegeliku doosi vahel;  
— sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad.  
Tulemused (tuleks esitada kokkuvõtlikud tabelandmed ja andmed eraldi iga 
looma kohta):  
— ellujäämuse andmed;  
— kehamass / kehamassi muutused;  
— sööda tarbimine, söödakasutuse tõhususe arvutused (kui need tehti) ja 
vee tarbimine (kui on kohaldatav);  
— toksilise mõju andmed vastavalt looma soole ja doositasemele, seal ­
hulgas mürgistusnähud;  
— kliiniliste ilmingute laad, esinemissagedus (ja kui määrati, siis rasku ­
saste) ning kestus (sõltuvalt sellest, kas nähud on mööduvad või püsivad);
 
— oftalmoloogiline läbivaatus;  
— hematoloogilised analüüsid;  
— kliinilise biokeemia analüüsid;  
— uriinianalüüsid;  
— neurotoksilisuse või immunotoksilisuse uuringute tulemused;  
— kehamass surmamisel;  
— organite mass (ja kui võimalik, siis organi massi / kehamassi suhe);  
— lahkamise leiud;  
— kõigi kemikaaliga kokkupuutest tingitud histopatoloogiliste leidude üksi ­
kasjalik kirjeldus;  
— võimaluse korral andmed imendumise kohta.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Vajaduse korral tulemuste statistiline töötlus.  
Tulemuste arutelu:  
— mõju sõltuvus doosist;  
— võimalikku toimeviisi käsitleva teabe analüüsimine;  
— võimaliku modelleerimislähenemisviisi arutelu;  
— võrdlusdoosi (BMD), täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) või 
vähima täheldatava kahjuliku toimega doosi (LOAEL) kindlaksmäära ­
mine;  
— varasemad kontrolli andmed;  
— asjakohasus inimeste puhul.  
Järeldused  
KIRJANDUS  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
 
2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
 
3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191.  
4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  
5) Käesoleva lisa peatükk B.27 „Subkroonilise suukaudse toksilisuse katse – 
suukaudse kordusdoosi toksilisuse 90-päevane uuring mittenärilistel”.  
6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.or ­
g/env/testguidelines.
 
7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
8) Käesoleva lisa peatükk B.8 „Subakuutne mürgisus sissehingamisel: 28- 
päevane uuring”.  
9) Käesoleva lisa peatükk B.29 „Subkrooniline mürgisus sissehingamisel: 90- 
päevane uuring”.  
10) Käesoleva lisa peatükk B.9 „Kordusdoosi mürgisus (28 päeva, naha ­
kaudne)”.  
11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
 
12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
 
13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69–98.  
15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
19) Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 2010, 
teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 20.10.2010, lk 33).
 
20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals 
in various housing systems.  
23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.  
24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.  
27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.  
28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.  
29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. 
Teratol. 13: 599–609.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
30) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
31) EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al . (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
1. liide  
MÕISTE  
Uuritav kemikaal –  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  SÜNNIEELSE ARENGU MÜRGISUSE UURIMUS  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 414 (2001).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev arenguaegse mürgisuse uurimise meetod on välja töötatud 
selleks, et pakkuda üldist teavet sünnieelse kokkupuute mõjude kohta tiinetel katseloomadel ja emakas areneval organismil; see võib hõlmata nii emalt pärinevat mõjude kui ka surma, strukturaalsete 
kõrvalekallete või loote muundunud arengu hindamist. Funktsio ­
naalsed puudujäägid, mis on arengu tähtis osa, ei ole käesoleva testi lahutamatu osa. Neid võib uurida eraldi uurimuses või käesoleva uurimuse täiendusena, kasutades neurotoksilisuse uuringutele 
suunatud katsemeetodit. Funktsionaalsete puudujääkide ja muude 
sünnijärgsete mõjude uurimist käsitleva teabe puhul tuleks vajadusel pidada nõu kahe põlvkonna reproduktiivse mürgisuse uuringut ja arengulise neurotoksilisuse uuringut käsitleva katsemeetodi üle.
 
Käesolev katsemeetod võib eeldada konkreetset kohandamist üksik ­
juhtudel spetsiaalsete, nt katseaine füüsikalis-keemilisi või toksiko ­
loogilisi omadusi puudutavate teadmiste põhjal. Selline kohandamine on aktsepteeritav, kui on olemas veenvad teaduslikud tõendid, et 
kohandamise tõttu on katse informatiivsem. Sellisel juhul tuleks 
hoolikalt dokumenteerida uurimisprotokollis nimetatud teaduslikud tõendid.
 
1.2. MÕISTED  
Arengutoksikoloogia  – selliste areneva organismi kahjulike mõjude 
uuring, mis võivad tuleneda kokkupuutest enne viljastumist, 
sünnieelse arengu ajal või sünnijärgselt kuni seksuaalse küpsuse eani. Arengutoksikoloogia peamised ilmingud on järgmised: 1) orga ­
nismi surm, 2) strukturaalsed kõrvalekalded, 3) muundunud kasv ja 
4) funktsionaalsed puudujäägid. Arengutoksikoloogiale viidati varem 
sageli kui teratoloogiale.
 
Kahjulik mõju  – selline töötlemisega seotud muutus algtasemest, 
mis vähendab organismi võimet ellu jääda, sigida või kohaneda 
keskkonnaga. Võttes arvesse arengutoksikoloogiat, oma kõige 
laiemas tähenduses sisaldab see mis tahes mõju, mis segab viljasta ­
mise tulemuse normaalset arengut nii enne kui ka pärast sündi.  
Muundunud areng  – järglase organi või keha kaalu või suuruse 
muutumine.  
Muundumised (anomaaliad)  – strukturaalsed muundumised, mis 
hõlmavad nii väärarenguid kui ka muutusi (28).  
Väärareng/suur kõrvalekalle  – strukturaalne muutus, mida 
peetakse loomale kahjulikuks (võib olla samuti surmav) ja mida 
juhtub tavaliselt harva.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Muutus/väike kõrvalekalle  – strukturaalne muutus, millel on vähe 
või ei ole üldse kahjulikku mõju loomadele; võib olla ajutine ja võib 
esineda suhteliselt sagedasti kontrollpopulatsioonis.  
Viljastumise tulemus ( conceptus ) – viljastunud munaraku derivaa ­
tide summa arengu igal etapil viljastumisest kuni sünnini, kaasa 
arvatud lootevälised kestad ning embrüo või loode.  
Implantatsioon (nidatsioon)  – lootepõiekese kinnitumine emaka 
epiteelkoele, kaasa arvatud selle tungimine läbi emakaepiteeli, ning selle kinnitumine emakalimaskestale.
 
Embrüo  – organismi varane või arengustaadium, eelkõige munaraku 
viljastumise tulemus pärast pikitelje ilmumist ja seni, kuni kõik suuremad struktuurid on olemas.
 
Embrüotoksilisus  – embrüo tavalist struktuuri, arengut, kasvu ja/või 
elujõulisust kahjustav.  
Loode  – sündimata järglane embrüojärgsel perioodil.  
Lootetoksilisus  – loote tavalist struktuuri, arengut, kasvu ja/või 
elujõulisust kahjustav.  
Abort  – viljastumise tulemuse (embrüo või mitteelujõulise loote) 
enneaegne väljumine emakast.  
Resorptsioon  – viljastumise tulemus  (conceptus),  kes pärast 
emakasse istutamist sureb või resorbeerub või on resorbeerunud.  
Varajane resorptsioon  – tõendid implantatsiooni kohta ilma äratun ­
tava embrüo/looteta.  
Hiline resorptsioon  – surnud embrüo või väliste degeneratiivsete 
muutustega loode.  
NOAEL  – lühend sõnadest „no observed adverse effect” – tähelda ­
mata kahjuliku mõju tase. See on kõrgeim annus- või kokkupuute ­
tase, kus ei ole täheldatud kahjulikke, töötlemisega seotud leide.  
1.3. VÕRDLUSAINE  
Puudub.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Tavaliselt manustatakse katseainet tiinetele loomadele vähemalt 
alates implantatsioonist kuni ühe päevani enne ettemääratud tapmist, 
mis peaks olema niipalju kui võimalik tavalise sünnitustähtaja lähedal, et ei läheks andmed kaduma varase sünnituse tõttu. Katse ­
meetod ei ole mõeldud ainult uurima organogeneesi perioodi (nt 
närilistel 5.–15. päev ja küülikutel 6.–18. päev), vaid samuti kogu 
tiinusperioodi aegseid mõjusid alates enne implantatsiooni ja lõppedes päev enne keisrilõiget. Natuke enne keisrilõiget emas ­
loomad tapetakse, emakasisu uuritakse ning loodetele antakse 
hinnang väliselt nähtavate anomaaliate kohta ning pehme koe ja 
skeletimuutuste kohta.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.5.1.  Loomaliikide valik  
On soovitav, et katse tehtaks kõige sobivamate liikidega ja et kasu ­
tataks laboriliike ja -liine, mida tavaliselt kasutatakse sünnieelse aren ­
gutoksilisuse uurimiseks. Eelistatud näriliste liik on rott ja eelistatud 
muude kui näriliste liik on küülik. Tuleks põhjendada seda, kui kasutatakse muid liike.
 
1.5.2.  Loomade pidamise ja toitmise tingimused  
Loomade katseruumi temperatuur peaks närilistel olema 22  o C (± 3  o ) 
ja küülikutel 18  o C (± 3  o ). Kuigi suhteline niiskus peaks olema 
vähemalt 30 % ja soovitavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, siis eesmärk on hoida see vahemikus 50–60 %. 
Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus on selline – 12 tundi 
valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega.
 
Paaritumine peab toimuma selleks ettenähtud puurides. Kuna paari ­
tunud loomade puhul eelistatakse eraldi hoidmist, on samuti lubatud 
väikesearvulistes rühmades hoidmine.  
1.5.3.  Loomade ettevalmistamine  
Tuleks kasutada terveid loomi, kes on harjutatud laboritingimustega 
vähemalt viis päeva ja keda ei ole varem katsetes kasutatud. Katse ­
loomade liik, liin, päritolu, sugu, kaal ja/või vanus on äratuntavad. 
Kõikide katserühmade loomad peaksid niipalju kui võimalik olema ühesuguse kaalu ja vanusega. Noori täiskasvanud ja sünnitamata emasloomi tuleks kasutada iga annusmäära juures. Emasloomad 
tuleks paaritada sama liigi ja liini isasloomadega ning õdede-vendade 
paaritamist tuleks vältida. Näriliste puhul on tiinuse 0- päevaks päev, mil tupekorki ja/või spermat jälgiti; küülikute puhul on 0-päev tava ­
liselt suguühte või kunstliku viljastamise päev, kui kasutatakse sellist 
tehnikat. Paaritunud loomad määratakse erapooletult kontroll- või 
töödeldavatesse rühmadesse. Puurid asetatakse nii, et puuri asetami ­
sest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Igale loomale tuleks anda ainulaadne tunnusnumber. Paaritunud emasloomad tuleks 
erapooletult jagada kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse ning 
kui emasloomi paaritatakse partiides, tuleks iga partii loomad jaotada ühtlaselt rühmade vahel. Samamoodi tuleks sama isaslooma poolt viljastatud emasloomad jagada ühtlaselt rühmadesse.
 
1.6. KATSE KÄIK  
1.6.1.  Loomade arv ja sugu  
Igas katse- ja kontrollrühmas peaks olema piisaval hulgal emasloomi, 
et lahanguks saadakse ligikaudu 20 emaslooma, kellel täheldatakse implantatsiooni. Rühmad, kus on alla 16 sellise looma, ei ole 
sobivad. Emade suremus ei pruugi tunnistada kehtetuks uurimist, 
tingimusel et see ei ületa 10 %.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Annuste valmistamine  
Kui kandeainet või lisandit kasutatakse manustamise lihtsustamiseks, 
arvesse tuleks võtta järgmisi omadusi: katseaine absorbtsiooni, jaota ­
mist, metabolismi ja peetumist või eritumist käsitlevad mõjud; katse ­
aine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi 
omadusi; ning toidu- või veetarbimist või toitumust käsitlevad mõjud. Kandeaine ei tohiks olla arengust lähtuvalt mürgine ega mõjutada reproduktsiooni.
 
1.6.3.  Annustamine  
Tavaliselt katseainet manustatakse iga päev alates implantatsioonist 
(nt 5. päev pärast paaritumist) kuni päevani enne kavandatud keisri ­
lõiget. Kui esialgsed uurimused vajaduse korral ei viita preimplana ­
tatsiooni kaotuse kõrgele riskile, võib ravi pikendada kuni kogu tiinusperioodini paaritumiste ja ettekavandatud tapmiseni. On hästi 
teada, et ebasobiv käsitlemine või tiinusaegne stress võivad viia loote 
kaotuseni. Et vältida lootekaotust muude kui katsega seotud tegurite poolt, tiinete loomade tarbetu käsitamine ning stress välistest teguri ­
test, nagu näiteks müra, tuleks vältida.
 
Tuleks kasutada vähemalt kolme annusmäära ja teha samaaegselt 
kontrolli. Paaritunud loomad jagatakse erapooletult kontroll- või töödeldavatesse rühmadesse. Annusmäärade vahemikud määratakse 
nii, et saaks hinnata toksilisi mõjusid. Kui katseaine füüsikalis- 
keemiline laad või bioloogilised omadused ei sea piiranguid, vali ­
takse kõrgeim annus eesmärgiga põhjustada mõningat arengu- ja/või 
emale suunatud mürgisust (kliinilised nähud või kehakaalu vähene ­
mine), kuid mitte surma või tõsiseid kannatusi. Vähemalt üks vahe ­
pealne annusmäär tekitab minimaalseid täheldatavaid toksilisi mõjusid. Väikseima annusmäära puhul ei tohiks emale suunatud 
või arengutoksilisust ilmneda. Tuleks valida annusmäärade alanev 
järjestus, et näidata annusega seotud reaktsiooni ja mittetäheldatud kahjuliku mõju taset (NOAEL). Kahe- või neljakordsed vahemikud on sageli optimaalsed alanevate annusmäärade kehtestamisel ja sageli 
on eelistatav neljanda katserühma lisamine väga suurte vahemike (nt 
üle kümnekordne tegur) annuste vahel. Kuigi eesmärgiks on määrata ema täheldamata kahjulikud mõjud, kiideti samuti heaks uuringud, kus sellist vahemikku ei kasuta (1).
 
Annusmäärad tuleks valida, võttes arvesse olemasolevaid andmeid 
mürgisuse kohta ning ka lisateavet katseaine või samalaadse aine 
metabolismi ja toksikokineetika kohta. Käesolev teave aitab samuti 
viidata sellele, et annustamisrežiim on adekvaatne.  
Tuleks kasutada samaaegset kontrollrühma. Nimetatud rühmaks on 
võltskontrollrühm (platseebot saav kontrollrühm) või kandeainet saav 
kontrollrühm, kui kandeainet kasutatakse katseaine manustamisel. Kõikidele rühmadele tuleks manustada sama kogus kas katseainet või kandeainet. Kontrollrühma(de) loomi tuleks kohelda nii nagu 
katserühma loomi. Kandeainet saavatele kontrollrühmadele tuleks 
anda suurim kogus kasutatud kandeaineid (madalaim katserühm):
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Piirsisalduskatse  
Kui suukaudne annusmäär on vähemalt 1 000 mg kg kehakaalu 
kohta päevas, kasutades käesolevas uurimuses kirjeldatud menetlusi, täheldatavat mürgisust põhjustamata, kas tiinetel loomadel ja/või 
nende järglastel ning kui mõju eeldatavasti ei põhine olemasolevatel 
andmetel (nt struktuuriliselt ja/või metaboolselt samalaadsed ühendid), siis ei peeta vajalikuks kolme annusmäära kasutavat täie ­
likku uurimust. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib viidata 
piirkatses kasutavatest annustest suuremate suukaudsete annuste 
kasutamise vajadusele. Muude manustamisviiside puhul, nagu näiteks sissehingamine või nahakaudne kasutamine, võivad katseaine 
füüsikalis-keemilised omadused tihti viidata ja piirata suurimat 
saavutatava kokkupuutumise ulatusega (nt nahakaudne kasutamine ei põhjusta rasket paikset mürgisust).
 
1.6.5.  Annuste manustamine  
Katseainet või kandeained manustatakse tavaliselt suu kaudu intu ­
beerimise teel. Kui kasutatakse muud manustamisviisi, peaks katse 
tegija põhjendama selle valikut ja asjakohased muutused võivad olla 
vajalikud (2, 3, 4). Katseainet tuleks manustada ligikaudu samal ajal iga päev.
 
Üksikute loomade annus peab tavaliselt põhinema kõige viimasel 
ühe looma kehakaalu kindlaksmääramisel. Annuse määramisel tuleks 
siiski olla ettevaatlik tiinuse viimasel trimestril. Varasemaid andmeid 
tuleks kasutada annuse valimisel, et vältida liigset emale suunatud mürgisust. Kui liigset mürgisust on täheldatud käsitletud emasloo ­
madel, tuleks need loomad humaanselt tappa. Kui mitmetel tiinetel 
loomadel on liigse mürgisuse nähud, tuleks kaaluda nimetatud 
annusrühma lõpetamist. Kui aineid manustatakse sundsöötmise teel, peaks see olema eelistatult ühekordne annus loomadele söögitoru kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Vedeliku suurim 
kogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suuru ­
sest. Maht ei tohiks ületada 1 ml 100 g kehakaalu kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kui võib kasutada mahtu 2 ml 100 g kehakaalu kohta. Kui kandeainena kasutatakse maisiõli, ei tohiks 
selle maht ületada 0,4 ml 100 g kehakaalu kohta. Katsekoguse muut ­
likkust tuleks vähendada, kohandades kontsentratsioone konstantse koguse tagamiseks kõikidel annusmääradel.
 
1.6.6.  Emasloomade jälgimine  
Kliinilised vaatlused tuleks teha ja registreerida vähemalt üks kord 
päevas, soovitavalt sama ajal iga päev, võttes arvesse pärast annus ­
tamist oodatavate mõjude kõrgperioodi. Loomade seisund tuleks 
registreerida, kaasa arvatud suremus, haigestumus, asjassepuutuvad käitumismuutused ning kõik selge mürgisuse nähud.
 
1.6.7.  Kehakaal ja toidu tarbimine  
Loomi tuleks kaaluda tiinuse 0-päeval ja mitte hiljem kui tiinuse 3. 
päeval, kui kasutatakse välise aretaja tarnitud aegpaaritunud loomi, 
annustamise esimesel päeval, vähemalt iga kolme päeva tagant 
annustamisperioodil ja ettemääratud tapmise päeval.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Toidu tarbimist tuleks registreerida kolmepäevaste ajavahemike 
tagant ja see peaks kokku langema kehakaalu kindlaksmääramisega.  
1.6.8.  Tapajärgne uurimine  
Emasloomad tuleks tappa päev enne oodatavat sünnitustähtpäeva. 
Emasloomad, kellel ilmnevad abordi või enneaegse sünnituse 
nähud enne ettemääratud tapmiskuupäeva, tuleks tappa ja neile 
tehakse põhjalik makroskoopiline uuring.  
Lõpetamise ajal või uurimuse käigus aset leidnud surma korral tuleks 
uurida emaslooma makroskoopiliselt igasuguste strukturaalsete 
kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste osas. Emasloomade hinda ­
mine keisrilõike ajal ja sellele järgnevad looteanalüüsid tuleks teha soovitavalt teadmata, millisesse rühma emasloom kuulub, et vähen ­
dada süstemaatilist viga.
 
1.6.9.  Emakasisu uurimine  
Vahetult pärast lõpetamist või nii kiiresti kui võimalik pärast surma 
tuleks emakas eemaldada ja kinnitada loomade tiinust. Emakat, mis 
ei ole tiine, tuleks edasi uurida (nt näriliste puhul ammooniumsulfii ­
diga värvimisega ja Salewski värvimisega või muu sobiva meetodiga küülikute puhul), et kinnitada tiinuse puudumist (5).
 
Tiine emakas, kaasa arvatud emakakael, tuleks ära kaaluda. Tiine 
emaka kaalu ei tohiks saada loomadelt, kes surid katse käigus.  
Kollakehade arv tuleks kindlaks määrata tiinete loomade puhul.  
Emakasisu tuleks uurida mitmete embrüo- või lootesurmade suhtes ja 
elujõuliste loodete suhtes. Resorptsiooni ulatust tuleks kirjeldada, et 
hinnata  conceptus ’e surma suhtelist aega (vt punkti 1.2).  
1.6.10.  Loodete uurimine  
Iga loote sugu ja kehakaal tuleks kindlaks määrata.  
Iga loodet uuritakse väliste muundumiste suhtes (6).  
Looteid uuritakse skeleti- ja pehmekoe muundamiste osas (nt 
muutused ja väärarengud või anomaaliad) (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24). Loote muunduste liigi ­
tamine on soovitav, kuid mitte nõutav. Kui liigitamine on tehtud, tuleks selgesti sõnastada iga kategooria kindlaks määramise kritee ­
riumid. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivorganile, mida 
tuleks uurida muundunud arengu tunnuste suhtes.
 
Närilistel ligikaudu pool pesakonnast valmistataks ette skeletimuun ­
dumiste uurimiseks. Ülejäänud pesakond valmistatakse ette 
pehmekoe muundumiste uurimiseks, kasutades heakskiidetud või 
sobivat mikrotoommenetlust või hoolsat dissekteerimistehnikat.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Muude kui näriliste puhul, nt küülikud, tuleks uurida kõiki looteid 
nii pehmekoe- kui ka skeletimuutuste suhtes. Nende loodete kehasid 
hinnatakse hoolsa dissekteerimise abil pehmekoemuutuste osas, mis võivad hõlmata jätkumenetlusi südame sisestruktuuri (25) hindami ­
seks. Pooltel, selliselt uuritud loodetel eemaldatakse pead, mille 
pehmekoemuutusi (sh silmad, aju, ninaõõned ja keel) uuritakse tava ­
lise mikrotoommenetluse abil (26) või võrdselt tundliku meetodi abil. Nende loodete kehad ja ülejäänud looted, keda ei ole uuritud, prepa ­
reeritakse skeletimuutuste uurimise tarbeks, kasutades samu meeto ­
deid nagu näriliste puhul.
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Andmed edastatakse iga emaslooma ja nende järglase kohta tabeli 
kujul, näidates iga katserühma ja põlvkonna kohta loomade arvu 
katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel kaalutlustel tapetud loomade arvu, surma ja humaanse tapmise ajad, tiinete emas ­
loomade arvu, mürgisuse nähtudega loomade aru, mürgisuse nähtude 
kirjelduse, sh toksiliste mõjude algusaja, kestuse ja raskuse, 
embrüot/loodet käsitlevate vaatluste liigid ja kogu asjaomane teave pesakonna kohta.
 
Numbrilisi tulemusi hinnatakse asjaomase statistilise meetodi abil, 
kasutades andmeanalüüsi üksusena pesakonda. Kasutatakse üldiselt 
heakskiidetud statistilist meetodit; statistilised meetodid tuleks valida uurimuse kavandamisel ja neid tuleks põhjendada. Andmed looma ­
dest, kes ei ela ettemääratud tapmiseni, tuleks samuti edastada. 
Nimetatud andmed võivad sisalduda rühmakeskmiste hulgas vaja ­
duse korral. Sellistelt loomadelt saadud andmete olulisus ja seetõttu nende sisaldumist rühmakeskmis(t)e hulgas või sealt väljajätmist tuleks põhjendada ja hinnata ükshaaval.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE  
Sünnieelse arengutoksilisust käsitleva uurimuse avastusi hinnatakse 
vaadeldud mõjude tähenduses. Hindamine peab hõlmama järgmist teavet:
 
— ema ja embrüot/loodet uuriva katse tulemused, sh loomade 
katseainega kokkupuute ning kõikide avastuste esinemise ja raskuse vahelise seose või selle puudumise hindamine;
 
— loote väliste muutuste, pehmekoe- ja skeletimuutuste liigitamisel 
kasutatavad kriteeriumid, kui liigitamist on kasutatud;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— vajaduse korral ajaloolised kontrollandmed katsetulemuste 
tõlgendamise tõhustamiseks;  
— kõikide protsendimäärade või indeksite arvutamisel kasutatud 
arvud;  
— vajaduse korral katseavastuste piisav statistiline analüüs, mis 
peaks sisaldama piisavalt teavet analüüsimeetodi kohta, nii et sõltumatu arvustaja/statistik saaks uuesti hinnata ja rekonstruee ­
rida analüüsi.
 
Igas katses, mis tõendab toksiliste mõjude puudumist, tuleks kaaluda 
jätkuuurimisi katseaine absorbtsiooni ja biosaadavuse kindlaksmäära ­
miseks.  
2.3. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Sünnieelset arengutoksilisust käsitlev katse annab teavet emasloo ­
made korduva ainega kokkupuute kohta tiinuse ajal ja nende järglase 
üsasisese arengu kohta. Katse tulemusi tõlgendatakse koostoimes subkroonilisel, reproduktsiooni, toksikokineetilisel ja muudel katsetel saadud avastustega. Kuna rõhutatakse nii üldist mürgisust emale 
mõjuva mürgisuse tähenduses kui ka arengutoksilisuse lõpp-punkte, 
võimaldavad katsetulemused mingis teatud ulatuses vahetegemist üldise toksilisuse puudumisel asetleidvate arengumõjude ja nende arengumõjude vahel, mis on tekkinud tasemetel, mis on samuti 
emasloomale (27) mürgised.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.  
Katseaine:  
— füüsiline laad ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;  
— tunnusandmed, kaasa arvatud CASi number, kui see on teada/ ­
kasutusel;  
— puhtus.  
Kandeaine (vajadusel):  
— kandeaine valiku põhjendus, kui see on muu kui vesi. Katse ­
loomad:  
kasutatud liigid ja liinid;  
— loomade arv ja vanus;  
— päritolu, elamistingimused, toitumine jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  
— Katsetingimused:  
annuste valiku põhjendus;  
— katseaine valmistamise/toiduvalmistise üksikandmed, saavutatud 
kontsentratsioon, valmistise stabiilsus ja homogeensus;  
— katseaine manustamise üksikasjad;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni 
(ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kg kehakaalu kohta 
päevas) vajaduse korral;  
— keskkonnatingimused;  
— üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta.  
— Tulemused  
Andmed emaslooma mürgisele annusele reageerimise kohta,  
sealhulgas:  
— loomade arv katse alguses, ellujäänud loomade arv, tiinete 
loomade arv ja katkenud tiinusega loomade arv, enneaegselt 
sünnitanud loomade arv;  
— surmapäev katse ajal või andmed loomade ellujäämise kohta kuni 
lõpetamiseni;  
— andmed loomade kohta, kes ei elanud kuni ettemääratud tapmi ­
seni, edastatakse, kuid ei sisaldu rühmadevahelistes statistilistes võrdlustes;
 
— iga ebatavalise kliinilise tunnuse jälgimise päev ja selle edasia ­
renemine;  
— kehakaal, kehakaalu muutus ja tiine emaka kaal, sh valikuli ­
selt kehakaalu muutus, mida on korrigeeritud tiine emaka 
kaalu võrra;  
— toidu tarbimine ja, kui seda on mõõdetud, vee tarbimine;  
— lahangu leiud, sh emaka kaal;  
— edastatakse NOAEL-väärtused ema ja areneva loote kohta.  
Arenguga seotud lõpp-punktid annuse järgi pesakonna kohta, kellel 
on implantaadid, kaasa arvatud:  
— kollakehade arv;  
— implantatsioonide arv, elus ja surnud loodete ning resorptsioonide 
arv ja protsent;  
— implantatasioonieelsete või -järgsete tiinuste katkemise arv ja 
protsent.  
Arenguga seotud lõpp-punktid annuse järgi pesakonna kohta, kus on 
elus looted, kaasa arvatud:  
— elus järglaste arv ja protsent;  
— sooline jagunemine;  
— loote kehakaal, soovitavalt soo järgi ja kombineeritud mõlema 
sooga;  
— väliste, pehmekoe- ja skeletiväärarengud ning muud asjaomased 
muutused;  
— liigitamise kriteeriumid vajaduse korral;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— loodete ja selliste pesakondade koguarv ja protsent, kellel on 
välised, pehmekoe- või skeletimuutused. ning individuaalsete 
anomaaliate ja muude asjaomaste muutuste liigid ja esinemine.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.
 
2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal 
Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied 
Toxicology 14; 386-398.  
3) Wong, B.A., et al. (19 9 7) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CUT Activities 17; 1-8.
 
4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E- 
Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation 
Developmental Toxicity Study.  
5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experi ­
mentelle Pathologic 247:367.
 
6) Edwards, J.A. (19 6 8) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.
 
8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. 
Congenital Anomalies 32;:381-391.  
9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229-242.  
10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects 
of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.  
11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morpho ­
logy 127:291-306.  
12) Fritz, H. (19 74) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320.  
13) Gibson, J.P. et al. (19 6 6) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9; :398-408.  
14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316.  
15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.
 
17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible 
Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 
411-445.
 
18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.
 
19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. 
American Journal of Anatomy 36; 313-355.  
20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181-188.
 
21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the 
Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.  
22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.
 
23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Tera ­
tology, Vol. 4. Plenum, NY.  
24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techni ­
ques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.  
25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.  
26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, 
H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, 
Chicago, IL, pp. 126-144.
 
27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.
 
28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnor ­
malities in Common Laboratory Mamma ls (Version 1) Terato ­
logy 55; 249-292.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  KANTSEROGEENSUSE UURINGUD  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test Guide ­
line, TG) 451 (2009). Esialgne kantserogeensuse uuringuid käsitlev katseju ­
hend TG 451 võeti vastu 1981. aastal. Käesoleva läbivaadatud katsemeetodi 
B.32 koostamist peeti vajalikuks, et võtta arvesse hiljutist arengut loomade 
heaolu ja regulatiivsete nõuete valdkonnas (2, 3, 4, 5, 6). Käesolevat katse ­
meetodit B.32 on ajakohastatud paralleelselt käesoleva lisa peatüki B.30 („Kroonilise mürgisuse uuringud”) ja peatüki B.33 („Kombineeritud kroo ­
nilise mürgisuse/kantserogeensuse uuringud”) läbivaatamisega selleks, et 
saada uuringus kasutatavate loomade abil lisateavet ning esitada täpsemaid andmeid dooside valiku kohta. Käesolev katsemeetod B.32 on koostatud selleks, et kasutada seda mitmesuguste kemikaalide, sh pestitsiidide ja töös ­
tuslike kemikaalide katsetamiseks. Siiski tuleks märkida, et mõned üksik ­
asjad ja nõuded võivad ravimite puhul olla erinevad (vt rahvusvahelise ühtlustamiskonverentsi suunis S1B, mis käsitleb ravimite kantserogeensuse katsetamist).
 
2. Enamik kantserogeensuse uuringuid tehakse näriliseliikidega ja käesolev 
katsemeetod on seega kavandatud peamiselt kasutamiseks nende liikidega 
tehtavate uuringute puhul. Kui kõnealuseid uuringuid on vaja teha muu 
loomaliigi kui närilistega, tuleks käesoleva katsemeetodi põhimõtteid ja toimimiskäiku kasutada koos nendega, mis on esitatud käesoleva lisa peatükis B.27 „Subkroonilise suukaudse toksilisuse katse – suukaudse 
kordusdoosi toksilisuse 90-päevane uuring mittenärilistel” (6) ja teha asja ­
kohased muudatused. Täiendavad suunised on esitatud OECD juhenddoku ­
mendis nr 116, mis käsitleb kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uurin ­
gute kavandamist ja tegemist (7).
 
3. Kantserogeensuse uuringutes kasutatavad kolm peamist manustamisteed on 
suukaudne, nahakaudne ja sissehingamise teel manustamine. Manustamis ­
viisi valik sõltub uuritava kemikaali füüsikalistest ja keemilistest omadustest 
ning inimeste peamisest võimalikust kokkupuuteviisist ainega. Lisateave 
kokkupuutetee valimise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).  
4. Käesolevas katsemeetodis on keskendutud suukaudsele manustamisele, mis 
on kantserogeensuse uuringutes enim kasutatav manustamistee. Kuigi inimeste tervist ohustavate riskide hindamiseks võivad vajalikud olla ka kantserogeensuse uuringud, mis hõlmavad nahakaudset või sissehingamise 
teel toimuvat kokkupuudet, ja/või neid võidakse nõuda teatavate eeskirja ­
dega, on mõlema nimetatud kokkupuutetee puhul katsete korraldamine tehniliselt keeruline. Kõnealused uuringud tuleb kavandada juhtumipõhiselt, kuigi siin suukaudse manustamise kantserogeensuse hindamiseks kirjeldatud 
katsemeetodi võib võtta aluseks sissehingamise teel ja/või nahakaudse 
manustamise uuringu katse-eeskirja koostamisel, arvestades soovitusi manustamise ajavahemike, kliiniliste parameetrite ja patoloogianäitajate jne kohta. Uuritavate kemikaalide nahakaudse (7) ja sissehingamise teel (7, 8) 
manustamise kohta on avaldatud OECD juhenddokumendid. Kui kavanda ­
takse sissehingamise kaudu toimuvat kokkupuudet hõlmavaid pikaajalisi uuringuid, tuleks eelkõige vaadata käesoleva lisa peatükke B.8 (9) ja B.29 (10) koos sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse uurimist käsitleva 
OECD juhenddokumendiga (8). Nahakaudse manustamise katsete tegemise 
kohta tuleks vaadata käesoleva lisa peatükki B.9 (11).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Kantserogeensuse uuring annab teavet võimalike terviseriskide kohta, mis 
võivad tõenäoliselt tekkida korduva kokkupuute korral kasutatava liigi kogu 
eluea jooksul. Uuringuga saadakse teavet uuritava kemikaali mürgiste mõjude, sealhulgas võimaliku kantserogeensuse kohta, võidakse teha kind ­
laks sihtorganid ja kemikaali akumulatsiooni võimalikkus. Sellega võidakse 
hinnata täheldatava kahjuliku toimeta doosi taset toksilise mõju puhul ning 
mittegenotoksiliste kantserogeenide puhul kasvajate teket; saadud andmeid saab kasutada inimeste kokkupuute jaoks ohutuskriteeriumide kehtestami ­
seks. Samuti rõhutatakse vajadust teha loomade hoolikas kliiniline läbi ­
vaatus, et hankida võimalikult palju teavet.
 
6. Käesoleva katsemeetodi kohaste kantserogeensuse uuringute eesmärgid on 
järgmised:  
— uuritava kemikaali selliste kantserogeensete omaduste kindlakstegemine, 
mis põhjustavad uudismoodustiste arvu suurenemist, pahaloomuliste uudismoodustiste osakaalu suurenemist või uudismoodustiste tekkeni 
kuluva aja lühenemist, võrreldes samaaegsete kontrollrühmadega;
 
— kantserogeense toime sihtorgani(te) tuvastamine;  
— uudismoodustiste tekkimiseni kuluva aja kindlakstegemine;  
— kasvajaid tekitava mõju doosist sõltuvuse kirjeldamine;  
— täheldatava kahjuliku toimeta doositaseme ( no-observed-adverse-effect 
level, NOAEL) või võrdlusdoosi ( Benchmark Dose , BMD) kindlakste ­
gemiseks lähtepunkti määramine;  
— kantserogeense toime ekstrapoleerimine inimeste madala doositasemega 
kokkupuutele;  
— andmete saamine toimeviisi käsitlevate hüpoteeside kontrollimiseks (2, 
7, 12, 13, 14, 15).  
LÄHTEKAALUTLUSED  
7. Uuritava kemikaali võimalike kantserogeensete omaduste hindamisel peaks 
uurimislabor enne uuringu tegemist võtma arvesse kogu olemasoleva teabe 
uuritava kemikaali kohta, et uuringu kavandamisel keskenduda kantsero ­
geense toime võimaluse kõige tõhusamale katsetamisele ja minimeerida loomade kasutamine. Teave eeldatava kantserogeeni toimeviisi kohta ja 
selle arvessevõtmine (2, 7, 12, 13, 14, 15) on eriti tähtis, kuna katse opti ­
maalseks kavandamiseks võib olla vaja teada, kas uuritav kemikaal on teadaolev või eeldatav genotoksiline kantserogeen. Täpsemad juhendid toimeviisi arvestamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
 
8. Uuringu kavandamist hõlbustav teave hõlmab järgmist: uuritava kemikaali 
keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes  in 
vitro  või in vivo  mürgisuse, sealhulgas genotoksilisuse katsete tulemused; 
eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; ole ­
masolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed, mutageensus/genotoksilisus, kantserogeensus ja muud toksikoloo ­
gilised andmed samalaadse struktuuriga ainete kohta; olemasolevad 
toksiko-kineetilised andmed (võimaluse korral ühekordse doosi ja korduv ­
doosi kineetika) ning muud korduva kokkupuute uuringutega saadud
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
andmed. Kantserogeensust tuleks uurida alles pärast esialgse mürgisust 
käsitleva teabe saamist korduvdoosi 28-päevasest ja/või 90-päevasest mürgi ­
suse katsest. Kasulikku teavet võivad anda ka lühiajalised vähi tekke ja arenemise katsed. Konkreetse uuritava kemikaali võimalike kahjulike tervi ­
semõjude üldhindamisel tuleks kaaluda kantserogeensuse järkjärgulise uuri ­
mise lähenemisviisi (16, 17, 18, 19).
 
9. Enne uuringu alustamist tuleks uuringu kava ja eesmärkide alusel kindlaks 
määrata kõige sobivamad tulemuste analüüsi statistilised meetodid. Kaaluda tuleb seda, kas statistika peaks hõlmama ellujäämuse arvessevõtmist, katses 
ellujäämise kestusega seotud kasvajatekke kumulatiivse riski analüüsi, 
kasvaja tekkimiseni kuluva aja analüüsi ning analüüsi tegemist ühe või mitme rühma kavandatust varasema surmamise korral. Suunised asjakohaste statistiliste analüüside tegemiseks ja peamised viited rahvusvaheliselt 
tunnustatud statistilistele meetoditele on esitatud juhenddokumentides 
nr 116 (7) ning nr 35, milles käsitletakse kroonilise mürgisuse ja kantsero ­
geensuse uuringute analüüsi ja hindamist (20).
 
10. Kantserogeensuse uuringu tegemisel tuleks alati järgida suunispõhimõtteid ja 
kaalutlusi, mis on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 19 kliiniliste 
nähtude tuvastamise, hindamise ja kasutamise kohta ohutuse hindamisel kasutatavate katseloomade humaansete lõpetamiskriteeriumidena (21) ja eelkõige selle punktis 62. Kõnealuses punktis on sätestatud, et „[k]ui uurin ­
gutes, milles kasutatakse korduvat annustamist, tekivad loomal kliinilised 
progresseeruvad nähud, mis põhjustavad tema seisundi halvenemise, tuleb teha andmetel põhinev otsus, kas loom tuleks humaansel viisil surmata. Otsuse tegemisel tuleks kaaluda kõnealuse uuringus osaleva looma jätkuvast 
elushoidmisest saadava teabe väärtust võrreldes looma üldise seisundiga. 
Kui tehakse otsus kõnealune loom katsesse jätta, tuleks vajaduse korral suurendada vaatluste sagedust. Ilma katse eesmärki kahjulikult mõjutamata võib samuti olla võimalik annustamise ajutine peatamine, kui see vähendab 
looma valu või kannatusi, või katsedoosi vähendamine.”
 
11. Üksikasjalikke suuniseid ja arutelu kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse 
uuringute doosi valimise põhimõtete kohta on võimalik leida juhenddoku ­
mendist nr 116 (7) ning samuti kahest rahvusvahelise bioteaduste instituudi 
väljaandest (22, 23). Doosi valimise strateegia sõltub põhiliselt uuringu 
peamisest eesmärgist või peamistest eesmärkidest (punkt 6). Sobivate doosi ­
tasemete valimisel tuleks saavutada tasakaal ühelt poolt ohu sõeluuringute ja teiselt poolt väikese doosi mõju iseloomustamise ning doosi ja mõju vahe ­
lise seose kindlakstegemise vahel. See on eriti oluline juhul, kui tehakse 
kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuring (käesoleva lisa peatükk B.33; punkt 12).
 
12. Tuleks kaaluda eraldi kroonilise mürgisuse uuringu (käesoleva lisa peatükk 
B.30) ja kantserogeensuse uuringu (käesolev katsemeetod B.32) tegemise 
asemel kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.33) tegemist. Kombineeritud katse võimaldab kokku hoida aega ja kulusid, võrreldes kahe eraldi uuringu tegemisega, 
kuid annab samasuguse kvaliteediga andmed nii kroonilise mürgisuse kui 
ka kantserogeensuse kohta. Kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantse ­
rogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.33) tegemisel tuleks siiski hoolikalt kaaluda doosi valimise põhimõtteid (punktid 11 ja 22–25) ning 
tuleb ka tunnistada, et mõnikord nõutakse eraldi uuringute tegemist eeskir ­
jadega.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle 
peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 116 (7).  
KATSE PÕHIMÕTE  
14. Uuritavat kemikaali manustatakse iga päev astmeliselt suurenevate doosi ­
dena mitmele katseloomade rühmale enamiku nende eluea kestel, tavaliselt suukaudselt. Sissehingamise teel või nahakaudne manustamine võib samuti 
olla sobiv. Katseloomi vaadeldakse hoolikalt mürgistusnähtude ja uudismoo ­
dustistest põhjustatud kahjustuste arengu jälgimiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõpus tapetakse ja lahatakse ka ellu ­
jäänud loomad.
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
15. Käesoleva katsemeetodiga hinnatakse peamiselt kantserogeensust näriliste 
jaoks (punkt 2). Muu loomaliigi kui näriliste kasutamist võib kaaluda siis, kui olemasolevad andmed osutavad, et selline liik sobib paremini inimesele avalduva tervisemõju prognoosimiseks. Liigi valikut tuleks põhjendada. 
Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada võib ka teisi närilisi, nt hiiri. 
Kuigi hiire kasutamine kantserogeensuse katsetel võib anda piiratud väärtu ­
sega tulemusi (24, 25, 26), nõutakse mõne praegu kehtiva regulatiivse kava alusel kantserogeensuse katsetamist hiirtel, kui ei ole kindlaks tehtud, et 
kõnealune uuring ei ole teaduslikult vajalik. Rotid ja hiired on olnud eelis ­
tatud katsemudelid tänu nende suhteliselt lühikesele elueale, laialdasele kasutamisele farmakoloogia- ja toksikoloogiauuringutes, võimalusele kutsuda neil kergesti esile kasvajaid ja tänu piisavalt iseloomustatud liinide 
kättesaadavusele. Nende omaduste tulemusena on olemas palju teavet nende 
füsioloogia ja patoloogia kohta. Lisateave liigi ja aretusliini valimise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
 
16. Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud 
loomi. Kantserogeensuse uuring tuleks eelistatavalt teha samast liinist ja sama päritoluga loomadega, keda kasutati lühema kestusega mürgisuse 
eeluuringu(te)s. Kui kõnealusest liinist ja kõnealuse päritoluga loomad 
võivad teadaolevalt põhjustada probleeme pikaajaliste uuringute üldtunnus ­
tatud ellujäämiskriteeriumide (vt juhenddokument nr 116 (7)) saavutamisel, tuleks kaaluda sellise loomaliini kasutamist, kelle ellujäämise määr on pikaa ­
jalise uuringu jaoks vastuvõetav. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega 
tiined.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
17. Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades; 
eraldi pidamist tuleks kaaluda ainult juhul, kui see on teaduslikult põhjen ­
datud (27, 28, 29). Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % 
ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks 
olema 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata. Sööt peaks vastama kõigile uuritava liigi toitumisvajadus ­
tele ja sööda saasteainesisaldus, sh pestitsiidijäägid, püsivad orgaanilised 
saasteained, fütoöstrogeenid, raskmetallid ja mükotoksiinid, mis võivad
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
mõjutada katse tulemusi, peaks olema võimalikult väike. Regulaarselt tuleks 
analüüsida sööda toitainete ja saasteainete sisaldust; vähemalt tuleks seda 
teha uuringu alguses ja siis, kui hakatakse kasutama uut söödapartiid, ning analüüside tulemused tuleks esitada lõpparuandes. Samuti tuleks esitada uuringus kasutatud joogivee analüüsi andmed. Sööda valikut võib mõjutada 
vajadus tagada uuritava kemikaali jaoks sobiv segu ja rahuldada loomade 
toitumisvajadused, kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga.
 
Loomade ettevalmistamine  
18. Kasutada tuleks terveid loomi, kes on labororitingimustega vähemalt seitsme 
päeva jooksul kohanenud ning keda ei ole varem uuringutes kasutatud. Näriliste korral tuleks loomadele uuritava kemikaali annustamist alustada 
võimalikult varakult pärast võõrutamist ja kohanemist ning eelistatavalt 
enne, kui loomad on kaheksa nädala vanused. Katseloomi tuleks kirjeldada ja teatada liik, liin, päritolu, sugu, kehamass ja vanus. Uuringu alguses peaks kummagi soo loomade kehamassi erinevus olema minimaalne ja kõrvale ­
kalle ei tohiks ületada 20 % uuringus kasutatavate loomade keskmisest 
kehamassist, mis leitakse eraldi kummagi soo loomade jaoks. Loomad tuleks kontroll- ja katserühmadesse jaotada juhuslikkuse alusel. Pärast juhuslikkuse alusel jaotamist ei tohiks rühmades kummagi soo keskmised kehamassid 
oluliselt erineda. Kui erinevused on statistiliselt olulised, tuleks juhuslikkuse 
alusel jaotamise etappi võimaluse korral korrata. Igale loomale tuleks määrata ainuline tunnusnumber ja loom tuleks kõnealuse numbriga püsivalt märgistada tätoveerimise, mikrokiibi paigaldamise või muu sobiva meetodi 
abil.
 
KATSE KÄIK  
Loomade arv ja sugu  
19. Tuleks kasutada mõlemat sugu. Tuleks kasutada piisavat arvu loomi, et 
oleks võimalik põhjalik bioloogiline ja statistiline hindamine. Iga doosirühm ja samaaegne kontrollrühm peaks seega koosnema vähemalt 50 loomast kummagi soo kohta. Olenevalt uuringu eesmärgist võib suurendada peamiste 
näitajate statistilist tähtsust, kui jaotada loomad doosirühmadesse diferent ­
seeritult (mitte võrdselt), nii et väikese doosi rühmades on rohkem kui 50 looma, näiteks väikeste dooside võimaliku kantserogeense mõju prognoosi ­
miseks. Siiski tuleb tunnistada, et rühma mõningane suurendamine lisab 
uuringule suhteliselt vähe statistilist kaalu. Lisateave uuringu statistilise 
kavandamise ja doositasemete valiku kohta statistilise olulisuse maksimee ­
rimiseks on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
 
Loomade vahepealne surmamine ja satelliitrühmad (kontrollrühmad)  
20. Kui see on teaduslikult põhjendatud, võib uuringus ette näha vahepealsed 
surmamised, näiteks 12 kuu möödumisel, et saada teavet uudismoodustiste 
arengu ja toimemehhanismi kohta. Kui selline teave on uuritava kemikaaliga 
tehtud varasematest korduvdoosi mürgisuse uuringutest juba olemas, ei pruugi vahepealsed surmamised olla teaduslikult põhjendatud. Kui uuringu kavas on vahepealseid surmamisi, on igas vahepealseks surmamiseks ette 
nähtud doosirühmas tavaliselt kümme looma kummagi soo kohta, ja 
uuringus kasutatavate loomade koguarvu tuleks suurendada nende loomade arvu võrra, keda on kavas surmata enne uuringu lõppu. Vajaduse korral võib uuringu vältel lisada haigusseisundi seireks täiendava kontroll-loomade 
rühma (tavaliselt viis looma kummastki soost) (30). Täpsemad juhendid 
on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Doosirühmad ja doseerimine  
21. Juhendid kõigi doosi valiku ja doositaseme intervallidega seotud asjaolude 
kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Tuleks kasutada vähemalt kolme doosimäära ja samaaegset kontrollrühma. Doositasemed põhinevad 
üldjuhul lühema ajavahemiku korduvdoosi või doosipiirkonna määramise 
katse tulemustel ja nende puhul tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali või samalaadsete kemikaalide kohta olemasolevat toksikoloogia- ja toksiko ­
kineetikaalast teavet.
 
22. Kui uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline 
mõju seda ei piira, peaks kõrgeim doositase olema valitud nii, et saaks 
määrata kindlaks peamised sihtorganid ja toksilise toime, põhjustamata siiski 
kannatusi, ägedat mürgisust, haigestumist või surma. Punktis 23 allpool loetletud asjaolusid arvesse võttes tuleks tavaliselt valida kõrgeim doositase, et saada tõendusmaterjali mürgisuse kohta, näiteks kehakaalu tõusu vähene ­
mise kaudu (ligikaudu 10 %). Sellest hoolimata võidakse uuringu eesmärki ­
dest olenevalt (vt punkt 6) valida suurim doos, mis jääb allapoole mürgisust tõendavat doosi, näiteks kui doos avaldab teatavat kahjulikku mõju, kuid 
siiski ei mõjuta eluiga ega kehakaalu.
 
23. Doositaseme ja doositasemete intervalli võib valida nii, et määrata kindlaks 
mõju sõltuvus doosist, ning, olenevalt uuritava kemikaali toimeviisist, tähel ­
datava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) või muu soovitud uuringutulemus, näiteks võrdlusdoos (BMD) (vt punkt 25) madalaimal doositasemel. Asjaolud, mida tuleks väiksemate dooside valimisel arvesse 
võtta, on toime doosist sõltuvuse eeldatav tõus, doosid, mis võivad põhjus ­
tada olulisi metaboliseerimise muutusi või toksilisuse toimemehhanismi muutumist, kui eeldatakse läviväärtuse olemasolu, või mille puhul eelda ­
takse väikeste dooside ekstrapoleerimise lähtepunkti olemasolu.
 
24. Doositasemete vahemik sõltub uuritava kemikaali omadustest ja seda ei saa 
käesoleva katsemeetodiga ette kirjutada, aga kahe- kuni neljakordne 
vahemik alanevate doositasemete määramisel annab sageli häid katsetule ­
musi ning dooside vahel väga suure (näiteks rohkem kui kuue- kuni kümne ­
kordse) vahemiku kasutamise asemel on sageli parem lisada neljas katse ­
rühm. Üldiselt tuleks vältida kümnest suurema kordaja kasutamist ja kui 
seda tehakse, tuleks seda põhjendada.  
25. Nagu juhenddokumendis nr 116 (7) on selgitatud, tuleb doosi valimisel 
arvesse võtta järgmist:  
— doosi-toime sõltuvuse teadaolev või oletatav mittelineaarsus või murde ­
punkt;  
— toksikokineetika ja doosipiirkonnad, mille puhul esineb metaboolne 
induktsioon, küllastumine või väliste ja sisemiste dooside vaheline mitte ­
lineaarsus või seda ei esine;  
— esmaskahjustused, toimemarkerid või märgid sellest, et tuleb arvesse 
võtta peamiste bioloogiliste alusprotsesside toimumist;  
— peamised (või oletatavad) toimeviisi asjaolud, näiteks annused, mille 
juures hakkab suurenema tsütotoksilisus, mõjutatakse hormoonitasemeid, 
homeostaasi säilitamise mehhanismid saavad üle koormatud jne;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— mõju doosist sõltuvuse kõvera piirkonnad, kus on vaja eriti usaldus ­
väärset hinnangut, näiteks eeldatava võrdlusdoosi (BMD) vahemikus 
või oletatava läviväärtuse juures;  
— inimeste kokkupuute eeldatava tasemega seotud kaalutlused.  
26. Kontrollrühm on rühm, kellega katseid ei tehta, või kandeaine kontrollrühm, 
kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda samamoodi kui katserühma loomi, välja arvatud uuri ­
tava kemikaali manustamine. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm 
kandeainet kõige suuremas koguses, mida kasutatakse doosirühmades. Kui 
uuritavat kemikaali manustatakse söödaga ja katseloomad söövad seda sööda halvema maitse tõttu oluliselt vähem, võib asjakohasema kontroll ­
rühma tagamiseks olla sobiv täiendav kontrollrühm, kes saab samapalju 
sööta, kui doosirühmas ära süüakse.
 
Dooside ettevalmistamine ja uuritava kemikaali manustamine  
27. Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu koos sööda või joogi ­
veega või sundsöötmisega. Lisateave manustamisteede ja -meetodite kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Manustamistee ja -meetod sõltub 
uuringu eesmärgist, uuritava kemikaali füüsikalistest/keemilistest omadus ­
test, biosaadavusest ning inimese uuritava kemikaaliga kokkupuutumise peamisest teest ja viisist. Manustamistee ja -meetodi valikut tuleks põhjen ­
dada. Loomade heaolu arvestades tuleks suukaudne manustamine sundsööt ­
misega üldiselt valida ainult selliste ainetega, mille puhul kui see manusta ­
mistee ja -meetod on põhjendatult sarnane inimese võimaliku kokkupuutega kemikaaliga (näiteks ravimid). Toidu- või keskkonnakemikaalide puhul, sh pestitsiidide puhul toimub manustamine tavaliselt sööda või joogivee kaudu. 
Mõne stsenaariumi puhul, näiteks kokkupuude töökohal, võib olla asjako ­
hasem manustada kemikaali muul viisil.
 
28. Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas 
kandeaines. Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine ja 
muude lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotumisele, metaboliseerimisele või retentsioonile; mõju uuritava kemikaali keemilistele omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi, ning mõjud sööda või 
vee tarbimisele või loomade toitumusele. On soovitatav, et võimaluse korral 
kaalutakse esmalt vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/- emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku lahust muus kandeaines. Muu kandeaine kui vee puhul tuleks teada kandeaine mürgiseid 
omadusi. Tuleks teada uuritava kemikaali stabiilsust ning doseerimislahuste 
või sööda (nagu on asjakohane) homogeensust manustamise tingimustes (näiteks söödaga).
 
29. Nende kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on 
oluline tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tava ­
list toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Pikas mürgisuse uuringus, kus kemikaali manustatakse sööda kaudu, ei tohiks uuritava kemikaali kont ­
sentratsioon söödas üldiselt olla suurem kui 5 % sööda üldkogusest, et 
vältida tasakaalustamata toitumist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (mg sööda kg kohta või ppm) või püsivat doositaset looma kehamassi alusel (mg keha ­
kaalu kg kohta), mis arvutatakse iga nädal. Tuleks täpsustada, millist võima ­
lust kasutatakse.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Suukaudse manustamise korral manustatakse loomadele uuritavat kemikaali 
iga päev (seitse päeva nädalas), näriliste puhul üldjuhul 24 kuu vältel (vt ka 
punkt 32). Iga muu doseerimismeetodi (nt viis päeva nädalas) kasutamist tuleb põhjendada. Nahakaudse manustamise puhul töödeldakse loomi üldjuhul uuritava kemikaaliga 24 kuu vältel vähemalt kuus tundi päevas 
seitse päeva nädalas, nagu on sätestatud käesoleva lisa peatükis B.9 (11). 
Sissehingamise teel toimuv kokkupuude toimub kuus tundi päevas ja seitse päeva nädalas; võib kasutada ka kokkupuudet viiel päeval nädalas, kui see on põhjendatud. Kokkupuuteperiood on tavaliselt 24 kuud. Kui ainult nina 
kaudu toimuvat kokkupuudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, 
võib suurimat kokkupuute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Kui päevas kasutatakse alla kuuetunnist kokkupuute kestust, tuleks seda põhjendada. Vt ka käesoleva lisa peatükk 
B.8 (9).
 
31. Kui loomadele manustatakse uuritavat kemikaali sundsöötmisega, tuleks 
seda teha iga päev umbes samal kellaajal maosondi või sobiva intubatsioo ­
nikanüüli abil. Tavaliselt manustatakse üks annus üks kord päevas, kui aga kemikaal on näiteks lokaalne ärritaja, võib igapäevase doosimäära säilitada, manustades jaotatud annust (kaks korda päevas). Suurim vedelikukogus, 
mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus 
peaks olema nii väike kui praktiliselt võimalik ega tohiks üldjuhul näriliste puhul ületada 1 ml kehakaalu 100 g kohta (31). Katses kasutatava mahu 
erinevusi tuleks vähendada miinimumini; püsiva mahu tagamiseks tuleks 
kõikidel doositasemetel kasutada erinevaid kontsentratsioone. Erandiks on võimaliku söövitava või ärritava mõjuga kemikaalid, mida tuleb tugeva paikse mõju vältimiseks lahjendada. Tuleks vältida katseid kontsentratsioo ­
nidel, mis tõenäoliselt võivad seedetrakti söövitada või ärritada.
 
Uuringu kestus  
32. Uuringu kestus on näriliste puhul tavaliselt 24 kuud, mis moodustab 
suurema osa kasutatavate loomade tavalisest elueast. Võib kasutada lühemat 
või pikemat uuringu kestust, olenevalt uuringus kasutatava loomaliigi liini 
elueast, aga seda tuleks põhjendada. Konkreetsete hiireliinide puhul, näiteks liin AKR/J, C3H/J või C57BL/6J, võib asjakohasem olla 18kuuline kestus. Allpool on esitatud suunised uuringu kestuse ja lõpetamise ning ellujäämuse 
kohta; täpsemad suunised, sh uuringus ellujäämusega võrreldes negatiivse 
kantserogeensuse lubatavuse kaalumine, on esitatud OECD juhenddoku ­
mendis nr 116, mis käsitleb kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uurin ­
gute koostamist ja elluviimist (7).
 
— Kui väiksema doosi rühmade või kontrollrühma ellujäänute arv langeb 
alla 25 %, tuleks kaaluda uuringu lõpetamist.  
— Kui mürgistuse tõttu sureb enneaegselt ainult suure doosi rühm, ei tohiks 
selle pärast uuringut lõpetada.  
— Kummagi soo ellujäämust tuleks arvesse võtta eraldi.  
— Uuringut ei tohiks pikendada selle ajavahemikuni, kus uuringust 
saadavad andmed ei ole enam piisavad statistiliselt kehtivate hinnangute 
andmiseks.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
VAATLUSED  
33. Kõiki loomi tuleks haigestumise või suremise suhtes kontrollida, tavaliselt 
iga päeva alguses ja lõpus, sh nädalavahetustel ja pühadel. Loomi tuleks täiendavalt kontrollida kord päevas konkreetsete mürgistusnähtude suhtes, 
võttes sundsöötmisega manustamise puhul arvesse eeldatava mõju kõrgpe ­
rioodi pärast doseerimist. Erilist tähelepanu tuleks pöörata kasvajate tekki ­
misele; iga nähtava või palpeeritava tuumori kohta tuleb märkida ilmumise aeg, paiknemine, mõõtmed, välimus ja areng.
 
Kehamass, sööda ja vee tarbimine ning söödakasutuse tõhusus  
34. Kõiki loomi tuleks kaaluda kemikaali manustamise alguses, vähemalt kord 
nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Sööda 
tarbimist ja söödakasutuse tõhusust tuleks mõõta vähemalt kord nädalas 
esimese 13 nädala vältel ning seejärel vähemalt kord kuus. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, siis tuleks vee tarbimist mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. 
Joogivee tarbimise mõõtmisi tuleks kaaluda ka uuringute puhul, milles 
muutub loomade joomiskäitumine.
 
Hematoloogilised, kliinilise biokeemia ja muud mõõtmised  
35. Uuringust saadava teabe, eelkõige toimeviisiga seotud teabe maksimeerimi ­
seks tuleks uuringu juhi äranägemise järgi võtta hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia analüüside jaoks vereproove. Samuti võib olla asjakohane urii ­
nianalüüsi tegemine. Täpsemad juhendid kantserogeensuse uuringu raames 
kõnealuste proovide võtmise väärtuse kohta on esitatud juhenddokumendis 
nr 116 (7). Kui peetakse vajalikuks, võib hematoloogiliste ja kliinilise keemia näitajate kindlaksmääramiseks võtta vereproovid ja teha uriiniana ­
lüüs vahepealse surmamise osana (punkt 20) ning uuringu lõpus vähemalt 
kümne loomaga kummagi soo ja iga rühma kohta. Vereproovid tuleks võtta 
kindlaksmääratud kohast, näiteks otse südamest või retroorbitaalsest siinu ­
sest, kasutades tuimestust, ning kui proov on võetud, tuleks seda hoida vajalikes tingimustes. Uurimiseks võib samuti valmistada vere äigeprepa ­
raadid, eelkõige juhul, kui luuüdi näib olevat sihtorgan, kuigi kõnealuse 
uuringu väärtus kantserogeense/onkogeense mõju hindamiseks on küsitav (32).
 
PATOLOOGIA  
Täielik lahkamine  
36. Kõik uuringus kasutatud loomad, v.a kontroll-loomad (vt punkt 20) ja muud 
satelliitrühma loomad, läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse 
põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisaldist. Kontroll-loomade ja muude satelliitrühma loomade puhul võib uuringu juht konkreetsel juhul otsustada, kas lahkamine on vajalik. Organite 
massi kantserogeensuse uuringutes tavaliselt ei määrata, kuna geriaatrilised 
muutused ja hilisematel etappidel kasvajate areng piirab organite massi andmete kasulikkust. Kõnealused andmed võivad siiski olla üliolulised tõen ­
dusmaterjali kaalukuse hindamisel ja eelkõige toimeviisi hindamisel. Kui 
satelliituuringus seda määratakse, tuleks kõnealused andmed koguda hilje ­
malt aasta möödumisel uuringu algusest.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise 
uuringu (vt punkt 33) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas 
(kandilistes sulgudes esitatud organite uuring ei ole kohustuslik): 
Kõik silmaga nähtavad 
kahjustused Süda Kõhunääre Magu (eesmagu, mao näär ­
meline osa) 
Neerupealis Niudesool Kõrvalkilpnääre [Hambad] Aort Tühisool Perifeerne närv Munandid 
Aju (sh suuraju osad, 
väikeaju ning piklikaju/sild) Neerud Ajuripats Harknääre 
Umbsool Pisaranääre (eksorbi ­
taalne) Eesnääre Kilpnääre 
Emakakael Maks Pärasool [Keel] 
Koagulatsiooninääre Kops Süljenääre Hingetoru 
Käärsool Lümfisõlmed (nii pealis ­
pinnalt kui ka sügavalt) Seemnepõiekesed Kusepõis 
Kaksteistsõrmiksool Piimanääre (kohustuslik 
emaste puhul ja kui see 
on nähtavalt lõigatav, siis isaste puhul) Skeletilihas Emakas (sh emakakael) 
Munandimanus [Ülemised hingamisteed, 
sh nina, ninakarbikud ja nina kõrvalkoopad] Nahk [Kusejuha] 
Silm (sh võrkkest) Söögitoru Seljaaju (kolmel 
tasandil: kaela-, rinna- ja nimmepiirkond) [Kusiti] 
[Reieluu koos liigesega] [Haistmissibul] Põrn Tupp 
Sapipõis (muud liigid kui 
rott) Munasarjad [Rinnak] Luuüdi lõige ja/või värske 
luuüdi aspiraat 
Harderi nääre
 
Paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks säilitada 
mõlemad organid. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele 
uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava 
kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla sihtorganid. Nahakaudse manustamise uuringute puhul tuleks säilitada need organid, mis on ette nähtud suukaudse manustamise puhul, ning ülio ­
luline on manustamiskohast nahaproovide võtmine ja säilitamine. Inhalat ­
siooniuuringute korral tuleks hingamisteedest säilitatavate ja uuritavate kudede puhul järgida käesoleva lisa peatükkide B.8 ja B.29 soovitusi. Muude organite/kudede puhul (ja lisaks hingamisteedest pärit konkreetselt 
säilitatavatele kudedele) tuleks järgida suukaudse manustamise puhul 
esitatud organite nimekirja.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatoloogia  
38. On avaldatud juhendid toksikoloogilise patoloogia uuringute tegemise pari ­
mate tavade kohta (33). Tuleb teha vähemalt järgmised histopatoloogilised uuringud:
 
— suure annuse ja kontrollrühma loomade kõik koed;  
— uuringu vältel surnud või surmatud loomade kõik koed;  
— kõik koed, milles täheldatakse makroskoopilisi anomaaliaid, kaasa 
arvatud kasvajad;  
— kui suure doosi rühmas täheldatakse uuritava kemikaaliga kokkupuutest 
tingitud histopatoloogilisi muutusi, kontrollitakse kõikide muude doosi ­
rühmade loomadel samu kudesid;  
— paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks uurida 
mõlemat organit.  
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
39. Kõigi hinnatavate parameetrite kohta tuleks esitada iga looma andmed. 
Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud või humaansetel põhjustel surmatud loomade arv, mürgistusnähtudega 
loomade arv, täheldatud mürgistusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise 
toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta nende loomade protsent, kellel seda esines. Kokkuvõtlikes tabelites tuleks esitada (pidevalt mõõdetud katseandmete 
puhul) nende loomade keskmised ja standardhälbed, kellel täheldati mürgi ­
suse mõju või kahjustusi, lisaks kahjustuse raskusastme määramisele.
 
40. Varasemad kontrolli andmed võivad aidata uuringu tulemusi tõlgendada, 
näiteks kui samaaegse kontrolli andmed erinevad oluliselt sama katsekorral ­
duse juures kontrollrühma loomadelt saadud hiljutistest andmetest. Hinda ­
miseks võetud varasemad kontrolli andmed peaksid pärinema samast labo ­
rist, olema saadud sama vanuserühma ja sama liini loomadega ning olema 
kogutud kõnealusele uuringule eelneva viie aasta jooksul.  
41. Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt 
tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid ja analüüsitavad andmed tuleks valida uuringu kavandamise etapis (punkt 9). Sellisel vali ­
misel tuleks vajaduse korral ette näha, et tulemusi tuleb kohandada ellujää ­
mise määra arvestamiseks.
 
Katseprotokoll  
42. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav kemikaal:  
— füüsikaline olemus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused;  
— tunnusandmed;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— kemikaali päritolu;  
— partii number;  
— keemilise analüüsi sertifikaat.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valimise põhjendus (kui kandeaine on muu kui vesi).  
Katseloomad:  
— kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;  
— loomade arv, vanus ja sugu katse alguses;  
— päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;  
— iga looma kehamass katse alguses.  
Katsetingimused:  
— manustamistee ja annuse valiku põhjendus;  
— kui see on kohaldatav, siis andmete analüüsimiseks valitud statistilised 
meetodid;  
— andmed uuritava kemikaali preparaadi/sööda valmistamise kohta;  
— analüüsiandmed preparaadis saavutatud kontsentratsiooni, preparaadi 
stabiilsuse ja homogeensuse kohta;  
— manustamistee ja uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;  
— inhalatsiooniuuringute puhul: kas manustamine toimub ainult nina või 
kogu keha kaudu;  
— tegelik doos (mg kehakaalu kg kohta päevas) ja vajaduse korral ümbe ­
rarvestustegur söödas või joogivees oleva uuritava kemikaali kontsen ­
tratsiooni (mg/kg või ppm) ja tegeliku doosi vahel;  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.  
Tulemused (tuleks esitada kokkuvõtlikud tabelandmed ja andmed eraldi iga 
looma kohta)  
Üldosa:  
— ellujäämuse andmed;  
— kehamass / kehamassi muutused;  
— sööda tarbimine, söödakasutuse tõhususe arvutused (kui need tehti) ja 
vee tarbimine, kui see on kohaldatav;  
— võimaluse korral toksiko-kineetilised andmed;  
— oftalmoskoopia võimaluse korral;  
— hematoloogia andmed võimaluse korral;  
— kliinilise keemia andmed võimaluse korral.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Kliinilised leiud:  
— toksilisuse tunnused;  
— iga anomaalia esinemissagedus (ja kui määrati, siis raskusaste);  
— kliiniliste ilmingute laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas ilmingud 
on ajutised või püsivad).  
Lahkamise andmed:  
— kehamass surmamisel;  
— organite mass (ja kui võimalik, siis organi massi / kehamassi suhe);  
— lahkamise leiud; anomaaliate esinemissagedus ja raskusaste.  
Histopatoloogia:  
— uudismoodustistega mitteseotud histopatoloogilised leiud;  
— uudismoodustistega seotud histopatoloogilised leiud;  
— korrelatsioon makroskoopiliste ja mikroskoopiliste tulemuste vahel;  
— kõigi kemikaaliga kokkupuutest tingitud histopatoloogiliste leidude üksi ­
kasjalik kirjeldus koos raskusastme hindamisega;  
— aruanne mikroskoobipreparaatide võimalike vastastikuste hindamiste 
kohta.  
Vajaduse korral tulemuste statistiline töötlus.  
Tulemuste arutelu:  
— võimalike modelleerimispõhiste lähenemisviiside arutelu;  
— toime sõltuvus doosist;  
— varasemad kontrolli andmed;  
— võimalikku toimeviisi käsitleva teabe analüüsimine;  
— võrdlusdoosi (BMD), täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) või 
vähima täheldatava kahjuliku toimega doosi (LOAEL) kindlaksmäära ­
mine;  
— asjakohasus inimeste puhul.  
Järeldused  
KIRJANDUS  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3) Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
 
4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.  
5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
6) Käesoleva lisa peatükk B.27 „Subkroonilise suukaudse toksilisuse katse – 
suukaudse kordusdoosi toksilisuse 90-päevane uuring mittenärilistel”.  
7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.or ­
g/env/testguidelines.
 
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9) Käesoleva lisa peatükk B.8 „Subakuutne mürgisus sissehingamisel: 28- 
päevane uuring”.  
10) Käesoleva lisa peatükk B.29 „Subkrooniline mürgisus sissehingamisel: 90- 
päevane uuring”.  
11) Käesoleva lisa peatükk B.9 „Kordusdoosi mürgisus (28 päeva, naha ­
kaudne)”.  
12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
 
13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of 
Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589.  
14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56.  
15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653.
 
16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
 
17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.  
18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.  
19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98.
 
20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC.  
24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279–284.  
26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196–1203.
 
27) Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 2010, 
teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 20.10.2010, lk 33).
 
28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington, D.C., US Dept. of Health 
and Human Services.  
29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of 
Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
 
30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals 
in various housing systems.  
31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.
 
32) Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices Guide ­
line: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
1. liide  
MÕISTE  
Uuritav kemikaal –  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  KOMBINEERITUD KROONILISE TOKSILISUSE – 
KANTSEROGEENSUSE UURING  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test Guide ­
line, TG) 453 (2009). Esialgne katsejuhend TG 453 võeti vastu 1981. aastal. 
Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi B.33 koostamist peeti vajalikuks, et võtta arvesse hiljutist arengut loomade heaolu ja regulatiivsete nõuete vald ­
konnas (1, 2, 3, 4, 5). Käesolevat katsemeetodit B.33 on ajakohastatud 
paralleelselt käesoleva lisa peatüki B.32 („Kantserogeensuse uuringud”) ja 
peatüki B.30 („Kroonilise mürgisuse uuringud”) läbivaatamisega selleks, et saada uuringus kasutatavate loomade abil lisateavet ning esitada täpsemaid andmeid dooside valiku kohta. Käesolev katsemeetod on koostatud selleks, 
et kasutada seda mitmesuguste kemikaalide, sh pestitsiidide ja tööstuslike 
kemikaalide katsetamiseks. Siiski tuleks märkida, et mõned üksikasjad ja nõuded võivad ravimite puhul olla erinevad (vt rahvusvahelise ühtlustamis ­
konverentsi suunis S1B, mis käsitleb ravimite kantserogeensuse katsetamist).
 
2. Enamik kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringuid tehakse närili ­
seliikidega ja käesolev katsemeetod on seega kavandatud peamiselt kasuta ­
miseks nende liikidega tehtavate uuringute puhul. Kui selliseid uuringuid on vaja teha mittenärilistega, võib samuti rakendada käesolevas katsemeetodis 
kirjeldatud põhimõtteid ja toimimiskäiku koos põhimõtete ja toimimis ­
käiguga, mida on kirjeldatud käesoleva lisa peatükis B.27 („Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90-päevane uuring mittenäriliste puhul”) (6) koos asja ­
kohaste muudatustega, nagu on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 116, 
mis käsitleb kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringute kavanda ­
mist ja tegemist (7).
 
3. Kroonilise mürgisuse – kantserogeensuse uuringutes kasutatavad kolm 
peamist manustamisteed on suukaudne, nahakaudne ja sissehingamise teel 
manustamine. Manustamisviisi valik sõltub uuritava kemikaali füüsikalistest 
ja keemilistest omadustest ning inimeste peamisest võimalikust ainega kokkupuutumise viisist. Lisateave kokkupuutetee valimise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7).
 
4. Käesolevas katsemeetodis on keskendutud suukaudsele manustamisele, mis 
on kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringutes enim kasutatav manustamistee. Kuigi inimeste tervist ohustavate riskide hindamiseks võivad vajalikud olla ka pikaajalised uuringud, mis hõlmavad nahakaudset või 
sissehingamise teel toimuvat kokkupuudet, ja/või neid võidakse nõuda teata ­
vate eeskirjadega, on mõlema nimetatud kokkupuutetee puhul katsete korral ­
damine tehniliselt keeruline. Kõnealused uuringud tuleb kavandada juhtumi ­
põhiselt, kuigi siin suukaudse manustamise kroonilise mürgisuse ja kantse ­
rogeensuse hindamiseks kirjeldatud katsemeetodi võib võtta aluseks sisse ­
hingamise teel ja/või nahakaudse manustamise uuringu katse-eeskirja koos ­
tamisel ja arvestades manustamise ajavahemikke, kliinilisi ja patoloogilisi parameetreid jne käsitlevaid soovitusi. On olemas OECD juhenddokumendid 
uuritava kemikaali sissehingamise teel (7, 8) ja nahakaudselt (7) manusta ­
mise kohta. Kui kavandatakse sissehingamise kaudu toimuvat kokkupuudet hõlmavaid pikaajalisi uuringuid, tuleks eelkõige vaadata käesoleva lisa peatükke B.8 (9) ja B.29 (10) koos sissehingamisel avalduva ägeda mürgi ­
suse uurimist käsitleva OECD juhenddokumendiga (8). Nahakaudse manus ­
tamise katsete tegemisel tuleks vaadata käesoleva lisa peatükki B.9 (11).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Kombineeritud kroonilisuse mürgisuse – kantserogeensuse uuring annab 
teavet võimalike terviseriskide kohta, mis võivad tõenäoliselt tekkida 
korduva kokkupuute korral kasutatava liigi kogu eluea jooksul. Uuringuga saadakse teavet uuritava kemikaali mürgiste mõjude, sealhulgas võimaliku kantserogeensuse kohta, võidakse teha kindlaks sihtorganid ja kemikaali 
akumulatsiooni võimalikkus. Sellega võidakse hinnata täheldatava kahjuliku 
toimeta doosi taset toksilise mõju puhul ning mittegenotoksiliste kantsero ­
geenide puhul kasvajate teket; saadud andmeid saab kasutada inimeste kokkupuute jaoks ohutuskriteeriumide kehtestamiseks. Samuti rõhutatakse 
vajadust teha loomade hoolikas kliiniline läbivaatus, et hankida võimalikult 
palju teavet.
 
6. Käesoleva katsemeetodi kohaste kroonilise mürgisuse – kantserogeensuse 
uuringute eesmärgid on järgmised:  
— uuritava kemikaali selliste kantserogeensete omaduste kindlakstegemine, 
mis põhjustavad uudismoodustiste arvu suurenemist, pahaloomuliste 
uudismoodustiste osakaalu suurenemist või uudismoodustiste tekkeni kuluva aja lühenemist, võrreldes samal ajal kasutatavate kontrollrühma ­
dega;
 
— uudismoodustiste tekkimiseni kuluva aja kindlakstegemine;  
— uuritava kemikaali kroonilise mürgisuse kindlaksmääramine;  
— kroonilise mürgisuse ja kantserogeense toime sihtorgani(te) tuvastamine;  
— mõju doosist sõltuvuse kirjeldamine;  
— täheldatava kahjuliku toimeta doositaseme ( no-observed-adverse-effect 
level, NOAEL) või võrdlusdoosi ( Benchmark Dose , BMD) kindlakste ­
gemiseks lähtepunkti määramine;  
— kantserogeense toime ekstrapoleerimine inimeste madala doositasemega 
kokkupuutele;  
— kroonilise mürgise mõju prognoosimine inimeste kokkupuutetasemetel;  
— andmete saamine toimeviisi käsitlevate hüpoteeside kontrollimiseks (2, 
7, 12, 13, 14, 15).  
LÄHTEKAALUTLUSED  
7. Uuritava kemikaali võimalike kantserogeensete ja kroonilise mürgisuse 
omaduste hindamisel peaks uurimislabor enne uuringu tegemist võtma arvesse kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, et uuringu kavan ­
damisel keskenduda toksikoloogilise toime võimaluse kõige tõhusamale 
katsetamisele ja minimeerida loomade kasutamine. Teave eeldatava kantse ­
rogeeni toimeviisi kohta ja selle arvessevõtmine (2, 7, 12, 13, 14, 15) on eriti tähtis, kuna katse optimaalseks kavandamiseks võib olla vaja teada, kas uuritav kemikaal on teadaolev või eeldatav genotoksiline kantserogeen. 
Täpsemad juhendid toimeviisi arvestamise kohta on esitatud juhenddoku ­
mendis nr 116 (7).
 
8. Uuringu kavandamist hõlbustav teave hõlmab järgmist: uuritava kemikaali 
keemiline nimetus, struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; teave võimaliku toimeviisi kohta; mis tahes  in vitro  või in vivo  mürgisuse, seal ­
hulgas genotoksilisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja 
inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed, mutageensus/genotoksi ­
lisus, kantserogeensus ja muud toksikoloogilised andmed samalaadse struk ­
tuuriga ainete kohta; olemasolevad toksiko-kineetilised andmed (võimaluse 
korral ühekordse doosi ja korduvdoosi kineetika) ning muud korduva
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
kokkupuute uuringutega saadud andmed. Kroonilist mürgisust ja kantsero ­
geensust tuleks uurida alles pärast esialgse mürgisust käsitleva teabe saamist 
korduvdoosi 28-päevasest ja/või 90-päevasest mürgisuse katsest. Kasulikku teavet võivad anda ka lühiajalised vähi tekke ja arenemise katsed. Konkreetse uuritava kemikaali võimalike kahjulike tervisemõjude üldhinda ­
misel tuleks kaaluda kantserogeensuse järkjärgulise uurimise lähenemisviisi 
(16, 17, 18, 19).
 
9. Enne uuringu alustamist tuleks uuringu kava ja eesmärkide alusel kindlaks 
määrata kõige sobivamad tulemuste analüüsi statistilised meetodid. Kaaluda 
tuleb seda, kas statistika peaks hõlmama ellujäämuse arvessevõtmist, katses 
ellujäämise kestusega seotud kasvajatekke kumulatiivse riski analüüsi, kasvaja tekkimiseni kuluva aja analüüsi ning analüüsi tegemist ühe või mitme rühma kavandatust varasema surmamise korral. Suunised asjakohaste 
statistiliste analüüside tegemiseks ja peamised viited rahvusvaheliselt 
tunnustatud statistilistele meetoditele on esitatud juhenddokumentides nr 116 (7) ning nr 35, milles käsitletakse kroonilise mürgisuse ja kantsero ­
geensuse uuringute analüüsi ja hindamist (20).
 
10. Kantserogeensuse uuringu tegemisel tuleks alati järgida suunispõhimõtteid ja 
kaalutlusi, mis on sätestatud OECD juhenddokumendis nr 19 kliiniliste nähtude tuvastamise, hindamise ja kasutamise kohta ohutuse hindamisel kasutatavate katseloomade humaansete lõpetamiskriteeriumidena (21) ja 
eelkõige selle punktis 62. Kõnealuses punktis on sätestatud, et „[k]ui uurin ­
gutes, milles kasutatakse korduvat annustamist, tekivad loomal kliinilised progresseeruvad nähud, mis põhjustavad tema seisundi halvenemise, tuleb teha andmetel põhinev otsus, kas loom tuleks humaansel viisil surmata. 
Otsuse tegemisel tuleks kaaluda kõnealuse uuringus osaleva looma jätkuvast 
elushoidmisest saadava teabe väärtust võrreldes looma üldise seisundiga. Kui tehakse otsus kõnealune loom katsesse jätta, tuleks vajaduse korral 
suurendada vaatluste sagedust. Ilma katse eesmärki kahjulikult mõjutamata 
võib samuti olla võimalik annustamise ajutine peatamine, kui see vähendab looma valu või kannatusi, või katsedoosi vähendamine.”
 
11. Üksikasjalikke suuniseid ja arutelu kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse 
uuringute doosi valimise põhimõtete kohta on võimalik leida juhenddoku ­
mendist nr 116 (7) ning samuti kahest rahvusvahelise bioteaduste instituudi väljaandest (22, 23). Doosi valimise strateegia sõltub põhiliselt uuringu peamisest eesmärgist või peamistest eesmärkidest (punkt 6). Sobivate doosi ­
tasemete valimisel tuleks saavutada tasakaal ühelt poolt ohu sõeluuringute ja 
teiselt poolt väikese doosi mõju iseloomustamise ning doosi ja mõju vahe ­
lise seose kindlakstegemise vahel. See on eriti asjakohane käesoleva kombi ­
neeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu puhul.
 
12. Tuleks kaaluda eraldi kroonilise mürgisuse uuringu (käesoleva lisa peatükk 
B.30) ja kantserogeensuse uuringu (käesoleva lisa peatükk B.32) tegemise asemel käesoleva kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu tegemist. Kombineeritud katse võimaldab kokku hoida aega ja 
kulusid ning mõnevõrra vähendada ka katseloomade kasutamist, võrreldes 
kahe eraldi uuringu tegemisega, kuid annab samasuguse kvaliteediga andmed nii kroonilise mürgisuse kui ka kantserogeensuse kohta. Kombinee ­
ritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu tegemisel tuleks 
siiski hoolikalt kaaluda doosi valimise põhimõtteid (punktid 11 ja 22–26) 
ning tuleb ka tunnistada, et mõnikord nõutakse eraldi uuringute tegemist eeskirjadega. Täpsemad juhendid kombineeritud kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse uuringu kavandamise kohta, et kasutada võimalikult 
vähe katseloomi ning teha uuring võimalikult lihtsalt ja tõhusalt, on esitatud 
juhenddokumendis nr 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud selle 
peatüki lõpus ja juhenddokumendis nr 116 (7).  
KATSE PÕHIMÕTE  
14. Uuringu kava koosneb kahest paralleelsest etapist: kroonilisuse etapp ja 
kantserogeensuse etapp (kestused on esitatud vastavalt punktides 34 ja 35). Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu, kuigi ka sisse ­
hingamise või nahakaudse kokkupuute uurimine võib olla sobiv. Kroonili ­
suse etapi puhul manustatakse uuritavat kemikaali iga päev astmeliste doosi ­
dena mitmele katseloomade rühmale, igale katseloomade rühmale ühel doosiastmel, tavaliselt 12 kuu vältel, kuigi regulatiivsetest nõuetest olenevalt 
võib katse kestus olla ka pikem või lühem (vt punkt 34). Katse selline 
kestus tagab, et see on piisavalt pikk kumulatiivse mürgisuse mõjude aval ­
dumiseks, kuid tulemusi ei hakka veel segama geriaatrilised muutused. Uuringu kavaga võib ette näha ühe või mitu vahepealset surmamist, näiteks 
kolme ja kuue kuu möödudes, ja selle võimaldamiseks võib kasutada täien ­
davaid loomarühmi (vt punkt 20). Kantserogeensuse etapi puhul manusta ­
takse uuritavat kemikaali iga päev mitmele katseloomade rühmale nende 
elueast suure osa vältel. Mõlemal etapil vaadeldakse katseloomi hoolikalt 
mürgistusnähtude ja uudismoodustistest põhjustatud kahjustuste arengu jälgimiseks. Katse ajal surnud või tapetud loomad lahatakse ning katse lõpus tapetakse ja lahatakse ka ellujäänud loomad.
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
15. Käesoleva katsemeetodiga hinnatakse peamiselt kroonilist mürgisust ja kant ­
serogeensust näriliste jaoks (punkt 2). Muu loomaliigi kui näriliste kasuta ­
mist võib kaaluda siis, kui olemasolevad andmed osutavad, et selline liik sobib paremini inimesele avalduva tervisemõju prognoosimiseks. Liigi valikut tuleks põhjendada. Närilistest eelistatakse rotte, kuigi kasutada 
võib ka teisi närilisi, nt hiiri. Kuigi hiire kasutamine kantserogeensuse 
katsetel võib anda piiratud väärtusega tulemusi (24, 25, 26), nõutakse mõne praegu kehtiva regulatiivse kava alusel kantserogeensuse katsetamist hiirtel, kui ei ole kindlaks tehtud, et kõnealune uuring ei ole teaduslikult 
vajalik. Rotid ja hiired on olnud eelistatud katsemudelid tänu nende suhte ­
liselt lühikesele elueale, laialdasele kasutamisele farmakoloogia- ja toksiko ­
loogiauuringutes, võimalusele kutsuda neil kergesti esile kasvajaid ja tänu piisavalt iseloomustatud liinide kättesaadavusele. Nende omaduste tulemu ­
sena on olemas palju teavet nende füsioloogia ja patoloogia kohta. Kui 
nõutakse kroonilise mürgisuse – kantserogeensuse uuringut muu liigiga kui närilised, peaks selle kavandamine ja tegemine toetuma põhimõtetele, mis on esitatud käesolevas katsemeetodis ja käesoleva lisa peatükis B.27 
(„Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90-päevane uuring mittenäriliste 
puhul”) (6). Lisateave liigi ja aretusliini valimise kohta on esitatud juhend ­
dokumendis nr 116 (7).
 
16. Kasutatakse enim kasutatavate laboriliinide noori terveid täiskasvanud 
loomi. Kroonilise mürgisuse ja kantserogeensuse kombineeritud uuring tuleks eelistatavalt teha samast liinist ja sama päritoluga loomadega, keda 
kasutati lühema kestusega mürgisuse eeluuringu(te)s. Kui kõnealusest liinist 
ja kõnealuse päritoluga loomad võivad teadaolevalt põhjustada probleeme pikaajaliste uuringute üldtunnustatud ellujäämiskriteeriumide (vt juhenddo ­
kument nr 116 (7)) saavutamisel, tuleks kaaluda sellise loomaliini kasuta ­
mist, kelle ellujäämise määr on pikaajalise uuringu jaoks vastuvõetav. Emas ­
loomad ei tohi olla poeginud ega tiined.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
17. Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades; 
eraldi pidamist tuleks kaaluda ainult juhul, kui see on teaduslikult põhjen ­
datud (27, 28, 29). Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud 
mõjud on võimalikult väikesed. Loomade katseruumi temperatuur peaks 
olema 22 °C (±3 °C). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi 
pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee 
kogust ei piirata. Sööt peaks vastama kõigile uuritava liigi toitumisvajadus ­
tele ja sööda saasteainesisaldus, sh pestitsiidijäägid, püsivad orgaanilised 
saasteained, fütoöstrogeenid, raskmetallid ja mükotoksiinid, mis võivad 
mõjutada katse tulemusi, peaks olema võimalikult väike. Regulaarselt tuleks analüüsida sööda toitainete ja saasteainete sisaldust; vähemalt tuleks seda teha uuringu alguses ja siis, kui hakatakse kasutama uut söödapartiid, ning 
analüüside tulemused tuleks esitada lõpparuandes. Samuti tuleks esitada 
uuringus kasutatud joogivee analüüsi andmed. Sööda valikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali jaoks sobiv segu ja rahuldada loomade toitumisvajadused, kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga.
 
Loomade ettevalmistamine  
18. Kasutada tuleks terveid loomi, kes on labororitingimustega vähemalt seitsme 
päeva jooksul kohanenud ning keda ei ole varem uuringutes kasutatud. Näriliste korral tuleks loomadele uuritava kemikaali annustamist alustada 
võimalikult varakult pärast võõrutamist ja kohanemist ning eelistatavalt 
enne, kui loomad on kaheksa nädala vanused. Katseloomi tuleks kirjeldada ja teatada liik, liin, päritolu, sugu, kehamass ja vanus. Uuringu alguses peaks 
kummagi soo loomade kehamassi erinevus olema minimaalne ja kõrvale ­
kalle ei tohiks ületada 20 % uuringus kasutatavate loomade keskmisest kehamassist, mis leitakse eraldi kummagi soo loomade jaoks. Loomad tuleks kontroll- ja katserühmadesse jaotada juhuslikkuse alusel. Pärast juhuslikkuse 
alusel jaotamist ei tohiks rühmades kummagi soo keskmised kehamassid 
oluliselt erineda. Kui erinevused on statistiliselt olulised, tuleks juhuslikkuse alusel jaotamise etappi võimaluse korral korrata. Igale loomale tuleks määrata ainuline tunnusnumber ja loom tuleks kõnealuse numbriga püsivalt 
märgistada tätoveerimise, mikrokiibi paigaldamise või muu sobiva meetodi 
abil.
 
KATSE KÄIK  
Loomade arv ja sugu  
19. Tuleks kasutada mõlemat sugu. Tuleks kasutada piisavat arvu loomi, et 
oleks võimalik põhjalik bioloogiline ja statistiline hindamine. Näriliste 
puhul peaks kantserogeensuse etapil igas doosirühmas (nagu on näidatud 
punktis 22) ja samaaegses kontrollrühmas seega olema vähemalt 50 looma kummastki soost. Olenevalt uuringu eesmärgist võib suurendada peamiste näitajate statistilist tähtsust, kui jaotada loomad doosirühmadesse diferent ­
seeritult (mitte võrdselt), nii et väikese doosi rühmades on rohkem kui 50 
looma, näiteks väikeste dooside võimaliku kantserogeense mõju prognoosi ­
miseks. Siiski tuleb tunnistada, et rühma mõningane suurendamine lisab uuringule suhteliselt vähe statistilist kaalu. Kroonilise mürgisuse etapil 
peaks igas doosirühmas (nagu on näidatud punktis 22) ja samaaegses 
kontrollrühmas seega olema vähemalt kümme looma kummastki soost, kui
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
kasutatakse närilisi. Tuleb märkida, et see arv on väiksem kui kroonilise 
mürgisuse uuringu puhul (käesoleva lisa peatükk B.30). Väiksema loomade 
arvuga rühma andmete tõlgendamine kõnealuse kombineeritud uuringu kroonilise mürgisuse etapil toetub aga uuringu kantserogeensuse etapi suurema arvu loomade põhjal saadud andmetele. Hiirtega tehtavates uurin ­
gutes võib olla vajalik kasutada kroonilise mürgisuse etapil igas doositaseme 
rühmas rohkem loomi, et teha kõik nõutavad hematoloogilised analüüsid. Lisateave uuringu statistilise kavandamise ja doositasemete valiku kohta statistilise olulisuse maksimeerimiseks on esitatud juhenddokumendis 
nr 116 (7).
 
Loomade vahepealne surmamine, satelliitrühm ja kontroll-loomad  
20. Kui see on teaduslikult põhjendatud, võib uuringus ette näha vahepealsed 
surmamised, näiteks kroonilise mürgisuse etapil kuue kuu möödumisel, et saada teavet muude kui uudismoodustistega seotud muutuste arengu ja 
toimemehhanismi kohta. Kui selline teave on uuritava kemikaaliga tehtud 
varasematest korduvdoosi mürgisuse uuringutest juba olemas, ei pruugi vahepealsed surmamised olla teaduslikult põhjendatud. Uuringu tavaliselt 12 kuud kestva (punkt 34) kroonilise mürgisuse etapil kasutatavatest looma ­
dest saadakse vahepealse surmamise andmed uuringu kantserogeensuse etapi 
jaoks, millega vähendatakse kasutatavate loomade üldarvu. Uuringu krooni ­
lise mürgisuse etapil võidakse samuti kasutada satelliitrühmi, et jälgida uuritava kemikaali põhjustatud mis tahes toksikoloogiliste muutuste pöördu ­
vust. Nende puhul võidakse piirduda uuringu suurima doositasemega ja 
kontrollrühmaga. Vajaduse korral võib uuringu vältel lisada haigusseisundi seireks täiendava kontroll-loomade rühma (tavaliselt viis looma kummastki soost) (30). Täpsemad suunised uuringu kavandamise kohta, et hõlmata 
vahepealsed surmamised, satelliitrühmade ja kontroll-loomade kasutamine, 
minimeerides samal ajal kasutatud loomade üldarvu, on esitatud juhenddo ­
kumendis nr 116 (7).
 
21. Kui uuringu kavas on satelliitloomi ja/või vahepealseid surmamisi, on igas 
vahepealseks surmamiseks ette nähtud doosirühmas tavaliselt kümme looma kummagi soo kohta, ja uuringus kasutatavate loomade üldarvu tuleks suurendada nende loomade arvu võrra, keda on kavas surmata enne uuringu 
lõppu. Vahepeal surmatavate ja satelliitloomade puhul tuleks üldiselt teha 
samad vaatlused, sh kehamassi ja sööda/vee tarbimise mõõtmised, hemato ­
loogilised ja kliinilise biokeemia mõõtmised ning patoloogiauuringud, kui põhiuuringu kroonilise mürgisuse etapi loomade puhul, kuigi võib ka otsus ­
tada, et vahepealse surmamise rühmade puhul piirdutakse konkreetsete 
peamiste näitajate, näiteks neurotoksilisuse või immunotoksilisuse mõõtmi ­
sega.
 
Doosirühmad ja doseerimine  
22. Juhendid kõigi doosi valiku ja doositaseme intervallidega seotud asjaolude 
kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Tuleks kasutada vähemalt 
kolme doosimäära ja samaaegset kontrollrühma nii kroonilise mürgisuse kui ka kantserogeensuse etapil. Doositasemed põhinevad üldjuhul lühema ajava ­
hemiku korduvdoosi või doosipiirkonna määramise katse tulemustel ja 
nende puhul tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali või samalaadsete kemi ­
kaalide kohta olemasolevat toksikoloogia- ja toksikokineetikaalast teavet.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Uuringu kroonilise mürgisuse etapi puhul ei pruugita vajalikuks pidada 
kolme doositaset hõlmavat täielikku uuringut, kui võib eeldada, et katse 
tegemine ühel doositasemel, mis on võrdne vähemalt 1 000 mg kehakaalu kg kohta päevas, ei põhjusta tõenäoliselt kahjulikke mõjusid. See peaks põhinema eeluuringutest saadud teabel ja kaalutlusel, et mürgisust sama ­
laadse struktuuriga ainete andmete alusel ei eeldata. Võib kasutada piirdoosi 
1 000 mg kehakaalu kg kohta päevas, välja arvatud juhul, kui inimese võimalikku kokkupuudet arvestades on vaja kasutada suuremat doositaset.
 
24. Kui uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised omadused või bioloogiline 
mõju seda ei piira, peaks suurim doositase olema valitud nii, et saaks määrata kindlaks peamised sihtorganid ja toksilise toime, põhjustamata siiski kannatusi, ägedat mürgisust, haigestumist või surma. Kõrgeim doositase 
tuleks üldjuhul valida mürgistusnähtude tekitamiseks, mis võib seisneda 
näiteks kehakaalu kasvu vähenemises (ligikaudu 10 %). Sellest hoolimata võidakse uuringu eesmärkidest olenevalt (vt punkt 6) valida suurim doos, mis jääb allapoole mürgisust tõendavat doosi, näiteks kui doos avaldab 
teatavat kahjulikku mõju, kuid siiski ei mõjuta eluiga ega kehakaalu.
 
25. Doositaseme ja doositasemete intervalli võib valida nii, et määrata kindlaks 
mõju sõltuvus doosist, ning, olenevalt uuritava kemikaali toimeviisist, tähel ­
datava kahjuliku toimeta kontsentratsioon (NOAEL) või muu soovitud 
uuringutulemus, näiteks võrdlusdoos (BMD) (vt punkt 27). Asjaolud, mida tuleks väiksemate dooside valimisel arvesse võtta, on toime doosist sõltu ­
vuse eeldatav tõus, doosid, mis võivad põhjustada olulisi metaboliseerimise 
muutusi või toksilisuse toimemehhanismi muutumist, kui eeldatakse lävi ­
väärtuse olemasolu, või mille puhul eeldatakse väikeste dooside ekstrapo ­
leerimise lähtepunkti olemasolu. Kombineeritud kantserogeensuse – krooni ­
lise mürgisuse uuringu tegemisel on peamine eesmärk saada teavet kantse ­
rogeensuse riski hindamise jaoks ja teave kroonilise mürgisuse kohta on 
üldjuhul lisaeesmärk. Seda tuleks uuringu jaoks doositasemete ja doositase ­
mete intervalli valimisel silmas pidada.
 
26. Doositasemete vahemik sõltub uuringu eesmärkidest ja uuritava kemikaali 
omadustest ning seda ei saa käesoleva katsemeetodiga üksikasjalikult ette kirjutada, aga kahe- kuni neljakordne vahemik annab sageli häid katsetule ­
musi, kui seda kasutatakse alanevate doositasemete määramiseks, ning 
dooside vahel väga suure (näiteks rohkem kui kuue- kuni kümnekordse) vahemiku kasutamise asemel on sageli parem lisada neljas katserühm. Üldi ­
selt tuleks vältida kümnest suurema kordaja kasutamist ja kui seda tehakse, 
tuleks seda põhjendada.
 
27. Nagu juhenddokumendis nr 116 (7) on selgitatud, tuleb doosi valimisel 
arvesse võtta järgmist:  
— doosi-toime sõltuvuse teadaolev või oletatav mittelineaarsus või murde ­
punkt;  
— toksikokineetika ja doosipiirkonnad, mille puhul esineb metaboolne 
induktsioon, küllastumine või väliste ja sisemiste dooside vaheline mitte ­
lineaarsus või seda ei esine;  
— eellasaine põhjustatud kahjustused, toimemarkerid või märgid sellest, et 
tuleb arvesse võtta peamiste bioloogiliste alusprotsesside toimumist;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— peamised (või oletatavad) toimeviisi asjaolud, näiteks annused, mille 
juures hakkab suurenema tsütotoksilisus, mõjutatakse hormoonitasemeid, 
homeostaasi säilitamise mehhanismid saavad üle koormatud jne;  
— mõju doosist sõltuvuse kõvera piirkonnad, kus on vaja eriti usaldus ­
väärset hinnangut, näiteks eeldatava võrdlusdoosi (BMD) vahemikus 
või oletatava läviväärtuse juures;  
— inimeste kokkupuute eeldatava tasemega seotud kaalutlused, eriti kesk ­
miste ja väiksemate dooside valimisel.  
28. Kontrollrühm on rühm, kellega katseid ei tehta, või kandeaine kontrollrühm, 
kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet. Kontrollrühma 
loomi tuleks kohelda samamoodi kui katserühma loomi, välja arvatud uuri ­
tava kemikaali manustamine. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet kõige suuremas koguses, mida kasutatakse doosirühmades. Kui 
uuritavat kemikaali manustatakse söödaga ja katseloomad söövad seda 
sööda halvema maitse tõttu oluliselt vähem, võib asjakohasema kontroll ­
rühma tagamiseks olla sobiv täiendav kontrollrühm, kes saab samapalju sööta, kui doosirühmas ära süüakse.
 
Dooside ettevalmistamine ja uuritava kemikaali manustamine  
29. Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt suu kaudu koos sööda või joogi ­
veega või kurgusondiga. Lisateave manustamisteede ja -meetodite kohta on esitatud juhenddokumendis nr 116 (7). Manustamistee ja -meetod sõltub 
uuringu eesmärgist, uuritava kemikaali füüsikalistest ja keemilistest omadus ­
test, biosaadavusest ning inimese uuritava kemikaaliga kokkupuutumise peamisest teest ja viisist. Manustamistee ja -meetodi valikut tuleks põhjen ­
dada. Loomade heaolu huvides tuleks suukaudne manustamine kurguson ­
diga üldiselt valida ainult selliste ainetega, mille puhul see manustamistee ja 
-meetod on põhjendatult sarnane inimese võimaliku kokkupuutega kemikaa ­
liga (näiteks ravimid). Toidu- või keskkonnakemikaalide puhul, sh pestitsii ­
dide puhul toimub manustamine tavaliselt sööda või joogivee kaudu. Mõne 
stsenaariumi puhul, näiteks kokkupuude töökohal, võib olla asjakohasem 
manustada kemikaali muul viisil.
 
30. Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas 
kandeaines. Vastavalt vajadusele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine ja muude lisandite omadusi: mõju uuritava aine imendumisele, jaotumisele, metaboliseerimisele või retentsioonile; mõju uuritava kemikaali keemilistele 
omadustele, mis võivad muuta selle toksilisi omadusi, ning mõjud sööda või 
vee tarbimisele või loomade toitumusele. Soovitatakse, et võimaluse korral tuleks kõigepealt kasutada vesilahust/-suspensiooni, seejärel õlilahust/-emul ­
siooni (nt maisiõli) ja siis lahustamist muudes kandeainetes. Muu kandeaine 
kui vee puhul tuleks teada kandeaine mürgiseid omadusi. Tuleks teada 
uuritava kemikaali stabiilsust ning doseerimislahuste või sööda (nagu on asjakohane) homogeensust manustamise tingimustes (näiteks söödaga).
 
31. Nende kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on 
oluline tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tava ­
list toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Pikas mürgisuse uuringus, kus kemikaali manustatakse sööda kaudu, ei tohiks uuritava kemikaali kont ­
sentratsioon söödas üldiselt olla suurem kui 5 % sööda üldkogusest, et 
vältida tasakaalustamata toitumist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (mg sööda kg kohta või ppm) või püsivat doositaset looma kehamassi alusel (mg keha ­
kaalu kg kohta), mis arvutatakse iga nädal. Tuleks täpsustada, millist võima ­
lust kasutatakse.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Suukaudse manustamise korral manustatakse loomadele uuritavat kemikaali 
iga päev (seitse päeva nädalas) 12 kuu jooksul (kroonilise mürgisuse etapp) 
või 24 kuu jooksul (kantserogeensuse etapp), vt ka punktid 33 ja 34. Iga muu doseerimismeetodi, nt viis päeva nädalas, kasutamist tuleb põhjendada. Nahakaudse manustamise puhul töödeldakse loomi uuritava kemikaaliga 
tavaliselt 12 kuu jooksul (kroonilise mürgisuse etapp) vähemalt kuus tundi 
päevas seitse päeva nädalas, nagu on täpsustatud käesoleva lisa peatükis B.9 (11), või 24 kuu jooksul (kantserogeensuse etapp). Sissehingamise teel toimuv kokkupuude toimub kuus tundi päevas ja seitse päeva nädalas; 
võib kasutada ka kokkupuudet viiel päeval nädalas, kui see on põhjendatud. 
Kokkupuuteperiood on tavaliselt 12 kuud (kroonilise mürgisuse etapp) või 24 kuud (kantserogeensuse etapp). Kui ainult nina kaudu toimuvat kokku ­
puudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokku ­
puute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite 
kannatusi. Kui päevas kasutatakse alla kuuetunnist kokkupuute kestust, tuleks seda põhjendada. Vt ka käesoleva lisa peatükk B.8 (9).
 
33. Kui loomadele manustatakse uuritavat kemikaali sundsöötmisega, tuleks 
seda teha iga päev umbes samal kellaajal maosondi või sobiva intubatsioo ­
nikanüüli abil. Üldiselt manustatakse üks annus üks kord päevas; kui aga kemikaal on näiteks lokaalne ärritaja, võib igapäevase doosimäära säilitada, 
manustades jaotatud annust (kaks korda päevas). Suurim vedelikukogus, 
mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus peaks olema nii väike kui praktiliselt võimalik ega tohiks üldjuhul näriliste puhul ületada 1 ml kehamassi 100 g kohta (31). Katses kasutatava mahu 
erinevusi tuleks vähendada miinimumini; püsiva mahu tagamiseks tuleks 
kõikidel doositasemetel kasutada erinevaid kontsentratsioone. Erandiks on võimaliku söövitava või ärritava mõjuga kemikaalid, mida tuleb tugeva paikse mõju vältimiseks lahjendada. Tuleks vältida katseid kontsentratsioo ­
nidel, mis tõenäoliselt võivad seedetrakti söövitada või ärritada.
 
Uuringu kestus  
34. Käesoleva uuringu kroonilise mürgisuse etapi annustamise ajavahemik ja 
kestus on tavaliselt 12 kuud, kuigi uuringu kava võimaldab teha ka lühe ­
maid (näiteks kuus või üheksa kuud) või pikemaid (näiteks 18 või 24 kuud) uuringuid, olenevalt konkreetsetest eeskirjadest või teatavatest toimemehha ­
nismiga seotud eesmärkidest. Kõrvalekaldeid 12-kuulisest kokkupuute kestu ­
sest tuleks põhjendada, eelkõige lühema kestuse puhul. Kõik kõnealusele etapile määratud doosirühmad surmatakse määratud ajal kroonilise mürgi ­
suse ja uudismoodustistega mitteseotud patoloogia hindamiseks. Uuritava 
kemikaali põhjustatud toksikoloogiliste muutuste pöörduvuse jälgimiseks kasutatavaid satelliitrühmi tuleks pärast kokkupuute lõpetamist hoida ilma annustamiseta vähemalt neli nädalat ja mitte rohkem kui kolmandiku 
uuringu kogukestusest.
 
35. Kantserogeensuse uuringu kestus on näriliste puhul tavaliselt 24 kuud, mis 
moodustab suurema osa kasutatavate loomade tavalisest elueast. Võib kasu ­
tada lühemat või pikemat uuringu kestust, olenevalt uuringus kasutatava 
loomaliigi liini elueast, aga seda tuleks põhjendada. Konkreetsete hiireliinide 
puhul, näiteks liin AKR/J, C3H/J või C57BL/6J, võib asjakohasem olla 18kuuline kestus. Allpool on esitatud suunised uuringu kestuse ja lõpetamise ning ellujäämuse kohta; täpsemad suunised, sh uuringus ellujäämusega 
võrreldes negatiivse kantserogeensuse lubatavuse kaalumine, on esitatud 
juhenddokumendis nr 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Kui väiksema doosi rühmade või kontrollrühma ellujäänute arv langeb 
alla 25 %, tuleks kaaluda uuringu lõpetamist.  
— Kui mürgistuse tõttu sureb enneaegselt ainult suure doosi rühm, ei tohiks 
selle pärast uuringut lõpetada.  
— Kummagi soo ellujäämust tuleks arvesse võtta eraldi.  
— Uuringut ei tohiks pikendada selle ajavahemikuni, kus uuringust 
saadavad andmed ei ole enam piisavad statistiliselt kehtivate hinnangute andmiseks.
 
VAATLUSED (KROONILISE MÜRGISUSE ETAPP)  
36. Kõiki loomi tuleks haigestumise või suremise suhtes kontrollida, tavaliselt 
iga päeva alguses ja lõpus, sh nädalavahetustel ja pühadel. Vähemalt üks 
kord päevas tuleks teha üldine kliiniline läbivaatus, eelistatavalt igal päeval 
samal ajal / samadel aegadel, arvestades kunstliku manustamise puhul eelda ­
tava mõju kõrgperioodi pärast doseerimist.  
37. Kõik loomad tuleks üksikasjalikult kliiniliselt läbi vaadata vähemalt kord 
enne esimest kokkupuudet (et võimaldada iga katselooma seisundi muutu ­
mise võrdlusi), uuringu esimese nädala lõpus ja seejärel iga kuu. Vaatlused 
tuleks korraldada nii, et üksikute vaatlejate vahelised erinevused oleksid minimeeritud ega sõltuks katserühmast. Need vaatlused tuleks teha väljas ­
pool puuri, eelistatavalt selleks ette nähtud kohas ja iga kord samal ajal. 
Tulemused tuleks hoolikalt üles märkida, kasutades selleks võimaluse korral katselabori selgelt kindlaks määratud hindamissüsteeme. Tuleks püüda tagada, et vaatlustingimuste varieeruvus oleks minimaalne. Üles tuleks 
märkida vähemalt järgmised tunnused: muutused nahal, karvastikus, 
silmades, limaskestal, eritiste esinemine ning autonoomsed muutused (nt pisaravool, turris karv, pupillide suurus, muutunud hingamine). Samuti tuleks üles märkida muutused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas 
loomad endaga ümberkäimisele reageerivad, kloonilised või toonilised liigu ­
tused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldamine, ringiratast keer ­
lemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi liik ­
umine) (32).
 
38. Enne uuritava kemikaali esmakordset manustamist tuleks oftalmoskoobi või 
muu sobiva seadme abil teha kõikide loomade oftalmoloogiline kontroll. 
Pärast uuringu lõppu tuleks kõnealune kontroll teha eelistatavalt kõikidele loomadele, kuid vähemalt suure doosi rühma ja kontrollrühma loomadele. Kui silmades avastatakse muutusi, tuleb läbi vaadata kõik loomad. Kui 
struktuurianalüüs või muu teave viitab mürgisusele silmade suhtes, tuleks 
silmi kontrollida sagedamini.
 
39. Kui kemikaali varasem korduvannuse 28-päevane ja/või 90-päevane mürgi ­
suse uuring näitas võimalikku neurotoksilist mõju, võib soovi korral enne uuringu algust ja kolmekuuliste ajavahemike järel pärast uuringu algust kuni 
12 kuuni (kaasa arvatud) ning samuti uuringu lõpus (kui uuring kestab 
kauem kui 12 kuud) uurida sensoorset reageerimist erinevat tüüpi stiimuli ­
tele (32) (näiteks helilised, visuaalsed ja propriotseptiivsed stiimulid) (33, 34, 35), hinnata haardetugevust (36) ja motoorset tegevust (37). Võimalike 
meetodite täpsemad üksikasjad on esitatud vastavates viidetes. Siiski võib 
kasutada ka muid meetodeid kui need, millele viidatakse.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. Sellise kemikaali puhul, mille varasem korduvannuse 28-päevane ja/või 90- 
päevane mürgisuse uuring näitas immunotoksilise mõju võimalikkust, võib 
soovi korral teha uuringu lõpul kõnealuse näitaja täiendavaid uuringuid.  
Kehamass, sööda ja vee tarbimine ning söödakasutuse tõhusus  
41. Kõiki loomi tuleks kaaluda kemikaali manustamise alguses, vähemalt kord 
nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Sööda 
tarbimist ja söödakasutuse tõhusust tuleks mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ning seejärel vähemalt kord kuus. Kui uuritavat 
kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist mõõta vähemalt 
kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Joogivee tarbimise mõõtmisi tuleks kaaluda ka uuringute puhul, milles muutub loomade joomiskäitumine.
 
Hematoloogia ja kliiniline biokeemia  
42. Näriliste uuringutes tuleks hematoloogilised uuringud teha kõikidele katse ­
loomadele (kümme isas- ja kümme emaslooma rühma kohta) kolme, kuue ja 
12 kuu möödumisel ning samuti uuringu lõpus (kui uuring kestab kauem kui 
12 kuud). Hiirte puhul võib kõikide nõutavate hematoloogiliste näitajate määramiseks minna vaja satelliitloomi (vt punkt 19). Muude loomade kui näriliste uurimisel võetakse proovid väiksemalt arvult loomadelt (koerte 
uurimisel näiteks neljalt loomalt kummagi soo ja iga rühma kohta) vahe ­
pealsetel proovivõtu aegadel ja uuringu lõpus, nagu on kirjeldatud näriliste puhul. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu vältel ei tuvastatud mõju hematoloogilistele parameetritele, ei ole 
kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha ei näriliste ega muude loomade 
puhul. Vereproovid tuleks võtta määratud kohast, näiteks otse südamest või retroorbitaalsest siinusest, kasutades tuimestust.
 
43. Tuleks uurida järgmisi parameetreid (38): leukotsüütide üldarv ja diferent ­
seeritud leukotsüüdiarvud, erütrotsüütide arv, vereliistakute arv, hemoglo ­
biini kontsentratsioon, hematokrit (rakkude protsent vere üldmahus), erütrot ­
süütide keskmine maht (MCV), hemoglobiini keskmine kogus erütrotsüüdis (MCH), hemoglobiini keskmine kontsentratsioon erütrotsüüdis (MCHC), protrombiiniaeg ja aktiveeritud osalise tromboplas ­
tiini aeg. Vajaduse korral võib mõõta muid hematoloogiaparameetreid, 
näiteks Heinzi kehakesi või muid atüüpilisi erütrotsüüdivorme või methe ­
moglobiini, olenevalt uuritava kemikaali mürgisusest. Üldiselt tuleks kasu ­
tada paindlikku lähenemisviisi sõltuvalt konkreetse uuritava kemikaali puhul 
täheldatud ja/või eeldatavast mõjust. Kui uuritav kemikaal mõjutab vere ­
loomesüsteemi, võib olla vajalik uurida samuti retikulotsüütide arvu ja luuüdi tsütoloogiat, kuigi need uuringud ei ole alati vajalikud.
 
44. Olulise kudesid kahjustava toksilise mõju ning eelkõige neerusid ja maksa 
kahjustava mõju uurimiseks tehakse kliinilise biokeemia analüüsid vereproo ­
videga, mis on võetud kõikidelt katseloomadelt (kümnelt isas- ja kümnelt 
emasloomalt rühma kohta) samade ajavahemike järel, mis on ette nähtud hematoloogiliste uuringute puhul. Hiirte puhul võib kõikide nõutavate klii ­
nilise biokeemia näitajate määramiseks minna vaja satelliitloomi. Muude 
loomade kui näriliste uurimisel võetakse proovid väiksemalt arvult looma ­
delt (koerte uurimisel näiteks neljalt loomalt kummagi soo ja iga rühma kohta) vahepealsetel proovivõtu aegadel ja uuringu lõpus, nagu on kirjel ­
datud näriliste puhul. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90- 
päevase uuringu vältel ei tuvastatud mõju kliinilise biokeemia parameetri ­
tele, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha ei näriliste ega
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
muude loomade puhul. Enne vereproovi võtmist on soovitatav loomi (v.a 
hiired) öö jooksul näljutada (  1 ). Tuleks uurida järgmisi parameetreid (38): 
glükoos, karbamiid (karbamiidlämmastik), kreatiniin, üldvalk, albumiin, kaltsium, naatrium, kaalium, üldkolesterool, vähemalt kaks asjakohast hepa ­
totsellulaarse hindamise katset (alaniinaminotransferaas, aspartaataminotrans ­
feraas, glutamaatdehüdrogenaas, sapphapete kogusisaldus) (39) ja vähemalt 
kaks asjakohast hepatobiliaarse hindamise katset (aluseline fosfataas, γ- 
glutamüültransferaas, 5’-nukleotidaas, üldbilirubiini, sapphapete kogusi ­
saldus) (39). Muid kliinilisi keemilisi parameetreid, näiteks triglütseriide 
paastutingimustes, teatavaid hormoone ja koliinesteraasi võib mõõta vasta ­
valt vajadusele, olenevalt uuritava kemikaali mürgisusest. Üldiselt on vaja paindlikku lähenemisviisi sõltuvalt uuritava kemikaali täheldatud ja/või oletatavast mõjust.
 
45. Uriinianalüüsi näitajad tuleks määrata kõikidel katseloomadel (kümnel isas- 
ja kümnel emasloomal rühma kohta) proovidest, mis on kogutud samade 
vahemikega kui hematoloogia- ja kliinilise keemia proovid. Kui võrreldavate doositasemetega tehtud varasema 90-päevase uuringu ajal ei leitud uriinia ­
nalüüsil mingit mõju, ei ole kolme kuu möödumisel vaja mõõtmisi teha. 
Kliinilise patoloogia uuringute eksperdi soovituse (38) kohaselt tuleks 
määrata järgmised parameetrid: välimus, ruumala, osmolaalsus või suhteline tihedus, pH, üldvalk ja glükoos. Lisaks võib määrata ketoone, urobilino ­
geeni, bilirubiini ja peitverd. Kui täheldatud mõju on vaja laialdasemalt 
uurida, võib vajaduse korral määrata täiendavaid näitajaid.
 
46. Üldiselt arvatakse, et hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia näitajate lähte ­
väärtused on vaja enne kemikaali manustamist määrata koertega tehtavate uuringute puhul, kuid närilistega tehtavate uuringute puhul neid määrata vaja ei ole (38). Kui varem määratud lähteväärtused (vt punkt 58) ei ole õiged, 
tuleks kaaluda selliste väärtuste määramist.
 
PATOLOOGIA  
Täielik lahkamine  
47. Kõik uuringus kasutatud loomad läbivad tavaliselt täieliku, põhjaliku lahka ­
mise, milles uuritakse põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, 
rinna- ja kõhuõõnt ja nende sisaldist. Siiski võib ka ette näha, et mõõtmised 
piirduvad (vahepeal surmatud või satelliitrühma loomade puhul) kõige oluli ­
semate, näiteks neurotoksilisuse või immunotoksilisuse näitajate määrami ­
sega (vt punkt 21). Selliseid loomi ei ole vaja lahata ja nendega teha järg ­
mistes punktides kirjeldatud protseduure. Kontroll-loomade puhul võib 
uuringu juht konkreetsel juhul otsustada, kas lahkamine on vajalik.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Mitmete seerumi ja plasma, eelkõige glükoosi mõõtmiste korral oleks eelistatav looma ­
dele eelneva öö jooksul süüa mitte anda. Selle peamine põhjendus on see, et söötmise 
korral oleks tulemuste varieeruvus suurem ning see varjaks raskemini tuvastatava toime 
ning muudaks tõlgendamise raskeks. Kuid tuleb märkida, et öö läbi söötmata hoidmine 
võib häirida loomade tavalist üldist ainevahetust ja eelkõige söödaga manustamise uurin ­
gute puhul võib see häirida igapäevast kokkupuudet uuritava kemikaaliga. Kõiki loomi 
tuleks hinnata samas füsioloogilises seisundis ja seepärast tuleks üksikasjalikud või 
neuroloogilised hindamised määrata muule päevale kui kliinilise biokeemia proovide 
võtmise päev.
 48. Kõikide loomade puhul, v.a loomad, kellele on tehtud erand punkti 47 
viimases osas, tuleks määrata organite mass. Kõigi loomade (välja arvatud 
loomad, kes leitakse suremas ja/või surmatakse uuringu kestel) neerupea ­
lised, aju, munandimanused, süda, neerud, maks, munasarjad, põrn, munandid, kilpnääre (mis kaalutakse pärast fikseerimist koos kõrvalkilpnäär ­
metega) ja emakas tuleks puhastada kõigist nende küljes olevatest kudedest, 
nagu on asjakohane, ja kaaluda märjalt võimalikult kiiresti pärast lahkamist, et vältida organite kuivamist.
 
49. Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise 
uuringu (vt punkt 40) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas 
(kandilistes sulgudes esitatud organite uuring ei ole kohustuslik): 
Kõik silmaga nähtavad 
kahjustused Süda Kõhunääre Magu (eesmagu, mao näär ­
meline osa) 
Neerupealis Niudesool Kõrvalkilpnääre [Hambad] 
Aort Tühisool Perifeerne närv Munandid 
Aju (sh suuraju osad, 
väikeaju ning piklikaju/sild) Neerud Ajuripats Harknääre 
Umbsool Pisaranääre (eksorbi ­
taalne) Eesnääre Kilpnääre 
Emakakael Maks Pärasool [Keel] 
Koagulatsiooninääre Kops Süljenääre Hingetoru 
Käärsool Lümfisõlmed (nii pealis ­
pinnalt kui ka sügavalt) Seemnepõiekesed Kusepõis 
Kaksteistsõrmiksool Piimanääre (kohustuslik 
emaste puhul ja kui see 
on nähtavalt lõigatav, 
siis isaste puhul) Skeletilihas Emakas (sh emakakael) 
Munandimanus [Ülemised hingamisteed, 
sh nina, ninakarbikud ja nina kõrvalkoopad] Nahk [Kusejuha] 
Silm (sh võrkkest) Söögitoru Seljaaju (kolmel 
tasandil: kaela-, rinna- ja nimmepiirkond) [Kusiti] 
[Reieluu koos liigesega] [Haistmissibul] Põrn Tupp 
Sapipõis (muud liigid kui 
rott) Munasarjad [Rinnak] Luuüdi lõige ja/või värske 
luuüdi aspiraat 
Harderi nääre
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
Paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks säilitada 
mõlemad organid. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele 
uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla sihtorganid. Nahakaudse manustamise uuringute puhul tuleks uurida neid 
organeid, mis on ette nähtud suukaudse manustamise puhul, ning väga 
vajalik on manustamiskohast nahaproovide võtmine ja säilitamine. Inhalat ­
siooniuuringute korral tuleks hingamisteedest säilitatavate ja uuritavate kudede puhul järgida käesoleva lisa peatükkide B.8 (9) ja B.29 (10) soovi ­
tusi. Muude organite/kudede puhul (ja lisaks hingamisteedest pärit konkreet ­
selt säilitatavatele kudedele) tuleks järgida suukaudse manustamise puhul esitatud organite nimekirja.
 
Histopatoloogia  
50. On avaldatud juhendid toksikoloogilise patoloogia uuringute tegemise pari ­
mate tavade kohta (40). Tuleb teha vähemalt järgmised histopatoloogilised uuringud:
 
— suure annuse ja kontrollrühmade loomade kõik koed;  
— uuringu vältel surnud või surmatud loomade kõik koed;  
— kõik koed, milles täheldatakse makroskoopilisi anomaaliaid;  
— sihtkoed või koed, mille puhul suure annuse rühmas on näha kokkupuu ­
test tingitud muutusi, kõikidelt suure annuse rühmade loomadelt;  
— paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks uurida 
mõlemat organit.  
VAATLUSED (KANTSEROGEENSUSE FAAS)  
51. Kõiki loomi tuleks haigestumise või suremise suhtes kontrollida, tavaliselt 
iga päeva alguses ja lõpus, sh nädalavahetustel ja pühadel. Loomi tuleks samuti kord päevas kontrollida toksikoloogiliselt oluliste nähtude suhtes. Sundtoitmisega uuringute puhul tuleks loomi kontrollida vahetult doosi 
manustamisele järgneval ajavahemikul. Erilist tähelepanu tuleks pöörata 
kasvajate tekkimisele; iga nähtava või palpeeritava tuumori kohta tuleb märkida ilmumise aeg, paiknemine, mõõtmed, välimus ja areng.
 
52. Kõiki loomi tuleks kaaluda kemikaali manustamise alguses, vähemalt kord 
nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. Sööda 
tarbimist ja söödakasutuse tõhusust tuleks mõõta vähemalt kord nädalas 
esimese 13 nädala vältel ning seejärel vähemalt kord kuus. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist mõõta vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala vältel ja seejärel vähemalt kord kuus. 
Joogivee tarbimise mõõtmisi tuleks kaaluda ka uuringute puhul, milles 
muutub loomade joomiskäitumine.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematoloogilised, kliinilise biokeemia ja muud mõõtmised  
53. Uuringust saadava teabe, eelkõige toimeviisiga seotud teabe maksimeerimi ­
seks tuleks uuringu juhi äranägemise järgi võtta hematoloogiliste ja kliinilise biokeemia analüüside jaoks vereproove. Samuti võib olla asjakohane urii ­
nianalüüsi tegemine. Kõnealuste parameetrite kohta saab teavet kroonilise 
mürgisuse etapis, mille kestus on tavaliselt 12 kuud (punkt 34), kasutatud loomade andmetest. Täpsemad juhendid kantserogeensuse uuringu käigus kõnealuste proovide võtmise väärtuse kohta on esitatud juhenddokumendis 
nr 116 (7). Kui vereproovid võetakse, tuleb seda teha katseperioodi lõpus 
vahetult enne loomade tapmist või selle käigus. Vereproovid tuleks võtta määratud kohast, näiteks otse südamest või retroorbitaalsest siinusest, kasu ­
tades tuimestust. Uurimiseks võib samuti valmistada vere äigepreparaadid, 
eelkõige juhul, kui luuüdi näib olevat sihtorgan, kuigi kantserogeensuse etapil vere äigepreparaatide uurimise väärtus kantserogeense/onkogeense mõju hindamiseks on küsitav (38).
 
PATOLOOGIA  
Täielik lahkamine  
54. Kõik uuringus kasutatud loomad, v.a kontroll-loomad (vt punkt 20) ja muud 
satelliitrühma loomad, läbivad täieliku, põhjaliku lahkamise, milles uuritakse 
põhjalikult keha välispinda, kõiki avasid, kolju-, rinna- ja kõhuõõnt ja nende 
sisaldist. Kontroll-loomade ja muude satelliitrühma loomade puhul võib uuringu juht konkreetsel juhul otsustada, kas lahkamine on vajalik. Organite massi kantserogeensuse uuringutes tavaliselt ei määrata, kuna geriaatrilised 
muutused ja hilisematel etappidel kasvajate areng piirab organite massi 
andmete kasulikkust. Kõnealused andmed võivad siiski olla üliolulised tõen ­
dusmaterjali kaalukuse hindamisel ja eelkõige toimeviisi hindamisel. Kui satelliituuringus seda määratakse, tuleks kõnealused andmed koguda hilje ­
malt aasta möödumisel uuringu algusest.
 
55. Järgmisi kudesid tuleks hoida koetüübi ja kavandatava histopatoloogilise 
uuringu (vt punkt 40) seisukohast kõige sobivamas fikseerimiskeskkonnas 
(kandilistes sulgudes esitatud organite uuring ei ole kohustuslik): 
Kõik silmaga nähtavad 
kahjustused Süda Kõhunääre Magu (eesmagu, mao näär ­
meline osa) 
Neerupealis Niudesool Kõrvalkilpnääre [Hambad] 
Aort Tühisool Perifeerne närv Munandid Aju (sh suuraju osad, 
väikeaju ning piklikaju/sild) Neerud Ajuripats Harknääre 
Umbsool Pisaranääre (eksorbi ­
taalne) Eesnääre Kilpnääre 
Emakakael Maks Pärasool [Keel] 
Koagulatsiooninääre Kops Süljenääre Hingetoru Käärsool Lümfisõlmed (nii pealis ­
pinnalt kui ka sügavalt) Seemnepõiekesed Kusepõis
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
Kaksteistsõrmiksool Piimanääre (kohustuslik 
emaste puhul ja kui see 
on nähtavalt lõigatav, siis isaste puhul) Skeletilihas Emakas (sh emakakael) 
Munandimanus [Ülemised hingamisteed, 
sh nina, ninakarbikud ja 
nina kõrvalkoopad] Nahk [Kusejuha] 
Silm (sh võrkkest) Söögitoru Seljaaju (kolmel 
tasandil: kaela-, rinna- 
ja nimmepiirkond) [Kusiti] 
[Reieluu koos liigesega] [Haistmissibul] Põrn Tupp 
Sapipõis (muud liigid kui 
rott) Munasarjad [Rinnak] Luuüdi lõige ja/või värske 
luuüdi aspiraat 
Harderi nääre
 
Paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks säilitada 
mõlemad organid. Kliinilised ja muud leiud võivad osutada vajadusele uurida ka muid kudesid. Säilitada tuleks ka muud organid, mis uuritava kemikaali teadaolevatest omadustest tulenevalt võivad tõenäoliselt olla 
sihtorganid. Nahakaudse manustamise uuringute puhul tuleks uurida neid 
organeid, mis on ette nähtud suukaudse manustamise puhul, ning väga vajalik on manustamiskohast nahaproovide võtmine ja säilitamine. Inhalat ­
siooniuuringute korral tuleks hingamisteedest säilitatavate ja uuritavate 
kudede puhul järgida käesoleva lisa peatükkide B.8 (8) ja B.29 (9) soovitusi. 
Muude organite/kudede puhul (ja lisaks hingamisteedest pärit konkreetselt säilitatavatele kudedele) tuleks järgida suukaudse manustamise puhul esitatud organite nimekirja.
 
Histopatoloogia  
56. On avaldatud juhendid toksikoloogilise patoloogia uuringute tegemise pari ­
mate tavade kohta (40). Tuleb teha vähemalt järgmised histopatoloogilised uuringud:
 
— suure annuse ja kontrollrühma loomade kõik koed;  
— uuringu vältel surnud või surmatud loomade kõik koed;  
— kõik koed, milles täheldatakse makroskoopilisi anomaaliaid, kaasa 
arvatud kasvajad;  
— kui suure doosi rühmas täheldatakse uuritava kemikaaliga kokkupuutest 
tingitud histopatoloogilisi muutusi, kontrollitakse kõikide muude doosi ­
rühmade loomadel samu kudesid;  
— paarisorganite puhul (näiteks neerud, neerupealised) tuleks uurida 
mõlemat organit.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE (KANTSERO ­
GEENSUS JA KROONILINE MÜRGISUS)  
Andmed  
57. Kõigi hinnatavate parameetrite kohta tuleks esitada iga looma andmed. 
Lisaks sellele tuleks kõik andmed koondada tabelisse, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, katse ajal surnud 
või humaansetel põhjustel surmatud loomade arv, mürgistusnähtudega 
loomade arv, täheldatud mürgistusnähtude kirjeldus, sealhulgas mürgise toime ilmnemine, kestus, raskusaste, kahjustustega loomade arv, kahjustuste liik ja iga liiki kahjustuse kohta nende loomade protsent, kellel seda esines. 
Kokkuvõtlikes tabelites tuleks esitada (pidevalt mõõdetud katseandmete 
puhul) nende loomade keskmised ja standardhälbed, kellel täheldati mürgi ­
suse mõju või kahjustusi, lisaks kahjustuse raskusastme määramisele.
 
58. Varasemad kontrolli andmed võivad aidata uuringu tulemusi tõlgendada, 
näiteks kui samaaegse kontrolli andmed erinevad oluliselt sama katsekorral ­
duse juures kontrollrühma loomadelt saadud hiljutistest andmetest. Hinda ­
miseks võetud varasemad kontrolli andmed peaksid pärinema samast labo ­
rist, olema saadud sama vanuserühma ja sama liini loomadega ning olema kogutud kõnealusele uuringule eelneva viie aasta jooksul.
 
59. Võimaluse korral tuleks numbrilisi tulemusi hinnata asjakohase ja üldiselt 
tunnustatud statistilise meetodiga. Statistilised meetodid ja analüüsitavad 
andmed tuleks valida uuringu kavandamise etapis (punkt 9). Sellisel vali ­
misel tuleks vajaduse korral ette näha, et tulemusi tuleb kohandada ellujää ­
mise määra arvestamiseks.  
60. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav kemikaal:  
— füüsikaline olemus, puhtus ja füüsikalis-keemilised omadused;  
— tunnusandmed;  
— kemikaali päritolu;  
— partii number;  
— keemilise analüüsi sertifikaat.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valimise põhjendus (kui kandeaine on muu kui vesi).  
Katseloomad:  
— kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;  
— loomade arv, vanus ja sugu katse alguses;  
— päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Katsetingimused:  
— manustamistee ja annuse valiku põhjendus;  
— kui see on kohaldatav, siis andmete analüüsimiseks valitud statistilised 
meetodid;  
— andmed uuritava kemikaali preparaadi/sööda valmistamise kohta;  
— analüüsiandmed preparaadis saavutatud kontsentratsiooni, preparaadi 
stabiilsuse ja homogeensuse kohta;  
— manustamistee ja uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;  
— inhalatsiooniuuringute puhul: kas manustamine toimub ainult nina või 
kogu keha kaudu;  
— tegelik doos (mg kehakaalu kg kohta päevas) ja vajaduse korral ümbe ­
rarvestustegur söödas või joogivees oleva uuritava kemikaali kontsen ­
tratsiooni (mg/kg või ppm) ja tegeliku doosi vahel;  
— sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad.  
Tulemused (tuleks esitada kokkuvõtlikud tabelandmed ja andmed eraldi iga 
looma kohta)  
Üldosa:  
— ellujäämuse andmed;  
— kehamass / kehamassi muutused;  
— sööda tarbimine, söödakasutuse tõhususe arvutused (kui need tehti) ja 
vee tarbimine (kui on kohaldatav);  
— toksiko-kineetilised andmed võimaluse korral;  
— oftalmoskoopia võimaluse korral;  
— hematoloogia andmed võimaluse korral;  
— kliinilise keemia andmed võimaluse korral.  
Kliinilised leiud:  
— toksilisuse tunnused;  
— iga anomaalia esinemissagedus (ja kui määrati, siis raskusaste);  
— kliiniliste ilmingute laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas ilmingud 
on ajutised või püsivad).  
Lahanguandmed:  
— kehamass surmamisel;  
— organite mass (ja kui võimalik, siis organi massi / kehamassi suhe);  
— lahkamise leiud; anomaaliate esinemissagedus ja raskusaste.  
Histopatoloogia:  
— uudismoodustistega mitteseotud histopatoloogilised leiud;  
— uudismoodustistega seotud histopatoloogilised leiud;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— korrelatsioon makroskoopiliste ja mikroskoopiliste leidude vahel;  
— kõigi kemikaaliga kokkupuutest tingitud histopatoloogiliste leidude üksi ­
kasjalik kirjeldus koos raskusastme hindamisega;  
— aruanne mikroskoobipreparaatide võimalike vastastikuste hindamiste 
kohta.  
Vajaduse korral tulemuste statistiline töötlus.  
Tulemuste arutelu:  
— võimaliku modelleerimislähenemisviisi arutelu;  
— toime sõltuvus doosist;  
— varasemad kontrolli andmed;  
— võimalikku toimeviisi käsitleva teabe analüüsimine;  
— võrdlusdoosi (BMD), täheldatava kahjuliku toimeta doosi (NOAEL) või 
vähima täheldatava kahjuliku toimega doosi (LOAEL) kindlaksmäära ­
mine;  
— asjakohasus inimeste puhul.  
Järeldused  
KIRJANDUS  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163–208.
 
4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.  
5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
 
6) Käesoleva lisa peatükk B.27 „Korduvdoosi suukaudse mürgisuse 90- 
päevane uuring mittenäriliste puhul”.  
7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.or ­
g/env/testguidelines.
 
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9) Käesoleva lisa peatükk B.8 „Subakuutne mürgisus sissehingamisel: 28- 
päevane uuring”.  
10) Käesoleva lisa peatükk B.29 „Subkrooniline mürgisus sissehingamisel: 90- 
päevane uuring”.  
11) Käesoleva lisa peatükk B.9 „Kordusdoosi mürgisus (28 päeva, naha ­
kaudne)”.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
 
13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589.  
14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56.
 
15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653.
 
16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1–7.
 
17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9–35.  
18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al . (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 37–68.  
19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69–98.
 
20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/ ­
MONO(2000)7, OECD, Paris.  
22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279–284.  
26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196–1203.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
27) Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 2010, 
teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 
20.10.2010, lk 33).  
28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and 
Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. 
ISBN 3-906255-06-9.  
30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15–23.  
32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
 
33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.  
35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
 
36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
 
37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
 
38) Weingand K, Brown G, Hall R  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
39) EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
1. liide  
MÕISTE  
Uuritav kemikaal –  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  ÜHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONITOKSILISUSE 
UURING  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritavat ainet manustatakse gradueeritud annustes mitmele isas- ja 
emasloomade rühmale. Isasloomadele tuleks ainet manustada kasvu ­
perioodil ja vähemalt ühe täieliku spermatogeneesi tsükli (ligikaudu 
56 päeva hiirel ja 70 päeva rotil) vältel, et võimaldada ükskõik milliste uuritava aine poolt tekitatavate ebasoovitavate kõrvalmõjude toimimist spermatogeneesile.
 
Emasloomadele tuleks uuritavat ainet manustada vähemalt kahe täie ­
liku innatsükli vältel, et võimaldada ükskõik milliste uuritava aine 
poolt tekitatavate ebasoovitavate kõrvalmõjude toimimist östrusele. Seejärel loomad paaritatakse. Uuritavat ainet manustatakse mõlemast soost loomadele paaritumisperioodi jooksul, seejärel ainult emasloo ­
madele tiinuse ja imetamisperioodi vältel. Uuritava aine manustami ­
seks inhalatsioonina tuleb meetodit modifitseerida.
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Puuduvad.  
1.6. UURINGUMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistused  
Enne uuringu algust jagatakse terved katseloomad juhuslikkuse 
alusel kontroll- ja katserühmadesse. Loomi peetakse eksperimentaal ­
setes söötmis- ja pidamistingimustes vähemalt viie päeva vältel enne uuringu algust. On soovitatav, et uuritavat ainet manustatakse söödas 
või joogivees. Teised manustamisviisid on samuti aktsepteeritavad. 
Kõigile loomadele tuleks manustada uuritavat ainet kogu katsepe ­
rioodi vältel samal meetodil. Kui manustamise lihtsustamiseks kasu ­
tatakse vehiiklit või mõnda muud lisandit, peaks olema teada, et 
need ei oma toksilisi toimeid. Aine manustamine peaks toimuma 
kõigil seitsmel nädalapäeval.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
1.6.2. K a t s e l o o m a d  
Liikide valik  
Eelistatud liikideks on rott ja hiir. Kasutada tuleks terveid loomi, 
keda pole varem rakendatud mingites katseprotseduurides. Madala viljakusega liine ei tohiks kasutada. Katseloomi iseloomustatakse 
liigi, liini, soo, kaalu ja/või vanuse järgi.
 
Viljakuse adekvaatseks hindamiseks tuleks uurida nii isas- kui emas ­
loomi. Kõik katse- ja kontroll-loomad peaksid olema enne uuringu 
algust võõrutatud.  
Arv ja sugu  
Igas katse- ja kontrollrühmas peaks olema piisavalt loomi, et tule ­
museks oleks umbes 20 lõpptiinet emaslooma.  
Eesmärgiks on piisava hulga tiinuste ja järglaste saamine, et kind ­
lustada aine potentsiaalsete mõjude tähendusrikas hindamine viljaku ­
sele, tiinusele, emaslooma käitumisele P generatsioonis, imetamisele, ning F
 1 järglaste kasvule ja arengule viljastumisest suguküpsuseni.  
1.6.3. K a t s e t i n g i m u s e d  
Sööta ja vett peaks katseloomadele võimaldama  ad libitum.  Poegi­
mise lähenedes tuleks tiined emased paigutada eraldi poegimis- või 
pesapuuridesse, kuhu neile võib paigutada ka pesategemiseks sobi ­
vaid materjale.  
1.6.3.1. A n n u s e d  
Uuringus tuleks kasutada vähemalt kolme katserühma ja kontroll ­
rühma. Kui uuritava aine annustamiseks kasutatakse vehiiklit, tuleks seda kontrollrühmale manustada selle kõige suuremas kasutatavas koguses. Kui uuritav aine põhjustab söödatarbimise või söödakasu ­
tuse langust, võib osutuda vajalikuks paralleelselt söödetava kontroll ­
rühma kasutamine. Ideaalselt, kui seda ei piira uuritava aine keemi ­
lised, füüsikalised või bioloogilised omadused, peaks kõrgeim doos 
põhjustama toksilisuse nähte, kuid mitte suremust vanemate (P) põlv ­
konna loomadel. Keskmine annus või annused peaksid põhjustama minimaalseid uuritavale ainele omistatavaid toksilisuse nähte ja madalaim annus ei tohiks põhjustada mingeid märgatavaid ebasoo ­
vitavaid uuritavale ainele omistatavaid toimeid ei vanematel ega 
järglastel. Kui manustamine toimub soni abil või kapslitena, peaks iga looma individuaalne annus põhinema tema kehamassil ja seda tuleks igal nädalal kohandada vastavalt kehakaalu muutustele. Emas ­
loomade annus võib tiinuse ajal soovi korral põhineda nende keha ­
massil tiinuse 0- või 6. päeval.
 
1.6.3.2. P i i r s i s a l d u s k a t s e  
Madala toksilisusega ainete puhul ei pruugi katsed teiste annustega 
vajalikuks osutuda, kui vähemalt 1 000 mg/kg annuse juures ei ilmne mingeid tunnuseid reproduktiivfunktsioonide häirumisest. Kui eelne ­
vast uuringust suurte annuste tasemel, kindlate toksilisuse tunnustega 
emasloomal, ei nähtu mingeid ebasoovitavaid toimeid viljakusele, ei 
pruugi katsed teiste annustega vajalikuks osutuda.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3.  Katse tegemine  
K a t s e g r a a f i k u d  
Uuritava aine igapäevast manustamist vanemate (P) põlvkonna isas ­
loomadele tuleks alustada, kui nad on umbes viie kuni üheksa nädala vanused, pärast võõrutamist ja aklimatiseerimist vähemalt viie päeva 
vältel. Rottide puhul jätkatakse manustamist 10 nädala jooksul enne 
paaritamisperioodi (hiirte puhul 8 nädalat). Isasloomad tuleks hukata ja uurida pärast paaritusperioodi lõppu, või, teise võimalusena, võib isasloomi pidada katseratsioonil võimaliku teise pesakonna produt ­
seerimiseni ning hukata ja uurida mingil ajaperioodil enne uuringu 
lõppu. Uuritava aine manustamine vanemate (P) põlvkonna emasloo ­
madele peaks algama pärast vähemalt viie päeva pikkust aklimatisat ­
siooniperioodi ja vältama paaritamise eelselt vähemalt kaks nädalat. 
Uuritava aine igapäevane manustamine P emasloomadele peaks 
jätkuma kolmenädalase paaritumisperioodi, tiinuse ja imetamise vältel kuni F
 1 järglaste võõrutamiseni. Annustamisskeemi modifitsee ­
rimist tuleks kaaluda juhtudel, kui uuritava aine kohta on lisaand ­
meid, näiteks aine metabolismi või bioakumulatsiooni puudutavat 
teavet.  
P a a r i t u s p r o t s e d u u r  
Viljakust mõjutava toksilisuse uurimustes võib kasutada kas 1:1 
(üks isane ühe emase kohta) või 1:2 (üks isane kahe emase 
kohta) paaritusi.  
1:1 paaritusel korral tuleks üks emane panna kokku sama isasega 
kuni tiinuse ilmnemise või kolme nädala möödumiseni. Igal hommikul tuleks emasloomi uurida sperma või tupekorkide avasta ­
miseks. Tiinuse 0-päevaks loetakse päeva, mil leitakse sperma või 
tupekork.
 
Katseloomi, kes ei paaritu, tuleks uurida eeldatava viljatuse põhjuste 
kindlaks tegemiseks.  
See võib hõlmata selliseid protseduure, nagu lisavõimalused paaritu ­
miseks teiste tõestatud viljakusega emas- või isasloomadega, suguor ­
ganite mikroskoopiline uurimine ja innatsüklite või spermatogeneesi uurimine.
 
P e s a k o n d a d e s u u r u s e d  
Viljakuse uurimuses kasutatavatel loomadel võimaldatakse poegida 
normaalsel viisil ja kasvatada järglasi kuni võõrutamiseni ilma pesa ­
kondade standardiseerimiseta.  
Kui kasutatakse standardiseerimist, on soovitav rakendada allpool 
toodud protseduuri. 1. ja 4. poegimisjärgse päeva vahel võib iga 
pesakonna suurust korrigeerida, eemaldades valikuliselt liigsed 
pojad nii, et tulemuseks oleks võimalikult täpselt neli emast ja neli isast pesakonna kohta.
 
Kui emaste või isaste poegade arv ei võimalda koostada pesakonda 
neljast kummastki soost pojast, on sobiv ka osaline korrigeerimine 
(nt viis isast ja kolm emast). Korrigeerimine ei ole kohaldatav pesa ­
kondadele, kus on vähem kui kaheksa poega.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1.6.4. J ä l g i m i n e  
Kogu uurimisperioodi vältel tuleks katseloomi jälgida vähemalt kord 
päevas. Registreerida tuleks asjakohased käitumise muutused, raske või pika poegimise tunnused ja kõik toksilisusele viitavad tunnused, 
sealhulgas suremus. Paaritamiseelse ja paaritamisperioodi vältel 
tuleks söödatarbimist mõõta kord nädalas. Soovi korral võib tiinuse jooksul iga päev mõõta söödatarbimist. Pärast poegimist ja imeta ­
mise jooksul tuleks söödatarbimist mõõta samal päeval, kui toimub 
pesakondade kaalumine. P emaseid ja isaseid loomi tuleks kaaluda 
annustamise esimesel päeval ja seejärel kord nädalas. Need tähele ­
panekud tuleks registreerida iga looma kohta individuaalselt.
 
Tiinusperioodi kestus tuleks arvutada tiinuse 0-päeva aluseks võttes. 
Iga pesakonda tuleks pärast sündi võimalikult ruttu uurida, et teha 
kindlaks poegade arv ja sugu, surnultsünnid, elussünnid ja tugevate 
kõrvalekallete olemasolu.  
Surnud ja 4. päeval hukatud pojad tuleks säilitada ja uurida võima ­
like defektide avastamiseks. Elusad pojad tuleks loendada ja pesa ­
konnad kaaluda sünnijärgsel hommikul, 4. ja 7. päeval ja seejärel kord nädalas kuni uuringu lõpuni, mil loomi kaalutakse individuaal ­
selt.
 
Emasloomal ja poegadel täheldatud käitumuslikud või füüsilised 
kõrvalekalded tuleb registreerida.  
1.6.5. P a t o l o o g i a  
1.6.5.1. L a h a n g  
Pärast surma või hukkamist tuleks kõiki P generatsiooni loomi 
mikroskoopiliselt uurida tuvastamaks mistahes ehituslikke kõrvale ­
kaldeid või patoloogilisi muutusi, pöörates erilist tähelepanu sigimi ­
sorganitele. Surnud või surevaid poegi tuleks uurida defektide tuvas ­
tamiseks.  
1.6.5.2. H i s t o p a t o l o o g i a  
Kõigi P generatsiooni katseloomade munasarjad, emakas, emakakael, 
tupp, munandid, munandimanused, seemnepõied, teised lisasugu ­
näärmed, eesnääre, hüpofüüs ja sihtorgan(id) tuleb säilitada mikro ­
skoopiliseks uurimiseks. Juhul, kui neid organeid pole uuritud teistes 
hulgiannustega uuringutes, tuleks neid mikroskoopiliselt uurida kõigil suurimat annust saanud ja kontrollrühma loomadel, paaritami ­
seks valitud loomadel, ja kui see on teostatav, siis ka loomadel, kes 
surid uuringu vältel.
 
Kõrvalekallete avastamisel organites, tuleks samu organeid uurida ka 
teistesse annuserühmadesse kuulunud loomadel. Nendel juhtudel 
tuleks mikroskoopiline uurimine läbi viia kõigi kudede puhul, milles ilmnevad makroskoopilised patoloogilised muutused. Nagu on soovi ­
tatud alajaotuses „Paaritusprotseduur”, võib mikroskoopilisele uuri ­
misele allutada ka sigimatuses kahtlustatavate katseloomade sigimi ­
sorganid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. ANDMED  
Andmed tuleks võtta kokku tabeli vormis, näidates iga katserühma 
kohta loomade arvu uuringu alguses, tiinete loomade arvu, muutuste tüübi ja iga tüüpi muutuse puhul nende loomade suhtarv, kellel see 
esines.
 
Võimaluse korral tuleks arvuliste tulemuste hindamiseks kasutada 
sobivat statistilist meetodit. Kasutada võib ükskõik millist üldiselt aktsepteeritud statistilist meetodit.
 
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmisi andmeid:  
— kasutatud liik/liin;  
— toksilise mõju andmed soo ja annuste kaupa, kaasa arvatud vilja ­
kuse, tiinuse ja elulemuse indeksid;  
— surmaaeg uuringu ajal või kas loomad elasid kuni uuringu lõpe ­
tamiseni;  
— tabelina esitatud iga pesakonna kaal, poja keskmine kehamass ja 
poegade individuaalsed kehamassid hukkamisel;  
— toksilised või muud mõjud sigivusele, järglastele ja sünnijärgsele 
kasvule;  
— iga kõrvalekalde täheldamise päev ja selle edasine areng;  
— paaritamiseks valitud P loomade kehamassi andmed;  
— lahanguleiud;  
— kõigi mikroskoopiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— tulemuste statistiline töötlus, vajaduse korral;  
— tulemuste arutelu;  
— tulemuste tõlgendamine.  
3.2. HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
4. VIITED  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  KAHE PÕLVKONNA REPRODUKTSIOONI TOKSILISUSE 
UURING  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 416 (2001).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev kahe põlvkonna reproduktsiooni uurimise meetod on välja 
töötatud selleks, et pakkuda üldist teavet katseaine mõjude kohta 
isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatusele ja toimi ­
misele, kaasa arvatud sugunäärmete funktsioonile, innatsüklile, paari ­
tumiskäitumisele, viljastumisele, tiinusele, poegimisele, imetamisele ja võõrutamisele, ning teavet järglase kasvu ja arengu kohta. 
Uurimus võib pakkuda teavet ka katseaine mõjude kohta vastsündinu 
haigestumisele, suremusele ning anda esialgseid andmeid sünnieelse ja sünnijärgse arengutoksilisuse kohta ja võib juhendada järgmiste katsete tegemist. Lisaks F
 1 -põlvkonna kasvu ja arengu uurimisele on 
käesolev katsemeetod samuti mõeldud nii F  2 -põlvkonna isas- ja 
emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatuse ja toimimise kui ka kasvu ja arengu hindamiseks. Arengutoksilisust ja funktsionaal ­
seid puudujääke käsitleva täiendava teabe puhul saab käesolevasse 
protokolli lisada kas täiendavaid osauurimusi, vajadusel pidada nõu 
arengutoksilisust ja/või arenguga seotud neurotoksilisust käsitlevate meetodite üle või saab neid lõpp-punkte uurida eraldi uurimustes, kasutades sobivaid katsemeetodeid.
 
1.2. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Katseainet manustatakse gradueeritud annustena mitmetele isas- ja 
emasloomade rühmadele. P-põlvkonna isasloomadele tuleks annus ­
tada kasvu ajal ja vähemalt ühe täieliku spermatogeneesi tsükli 
jooksul (hiirtel ligikaudu 56 päeva ja rottidel 70 päeva), et tekitada spermatogeneesile kahjulikke mõjusid. Mõju spermale määratakse kindlaks mitmete spermaparameetrite (nt sperma morfoloogia ja liik ­
uvus) ning koepreparaatide ja üksikasjalike histopatoloogiliste uuri ­
muste abil. Kui spermatogeneesi käsitlevad andmed on olemas vara ­
semast, korduvaid annuseid kasutavast uurimusest, mille kestus on piisav, nt 90päevane uurimus, ei ole vaja lisada hindamisse P-põlv ­
konna isasloomi. On siiski soovitav, et P-põlvkonna spermaproove 
või digitaalseid salvestusi säilitatakse hilisema hindamise tarbeks. P- põlvkonna emasloomadele tuleks annustada katseainet kasvu ajal ja mitme täieliku innatsükli käigus, et tuvastada katseaine võimalikud 
kahjulikud mõjud tavapärasele innatsüklile. Katseainet manustatakse 
järglaste vanematele (P) nende paaritumise ajal, tiinuste ajal ja kuni F
 1 -järglase võõrutamiseni. Võõrutamise ajal jätkatakse aine manusta ­
mist F  1 -järglastele ajal, mil nad arenevad täiskasvanuteks, paaritu ­
mise ajal ja F  2 -põlvkonna poegimise järel kuni võõrutamiseni.  
Kliinilisi vaatlusi ja patoloogilisi uuringuid viiakse läbi kõikidel 
loomadel mürgisuse sümptomite tuvastamiseks, eriline tähelepanu 
on mõjudel isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemide rikkumatu ­
sele ja toimimisele ning järglase kasvule ja arengule.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.3.1.  Loomaliikide valik  
Eelistatud loomaliik on rott. Kui kasutatakse muid liike, tuleks seda 
põhjendada ja asjaomased mugandused on vajalikud. Liine, kellel on 
madal sigivus või kellel teatakse olevat arenguhäireid, ei tohiks kasu ­
tada. Uuringut alustades peaks loomade massi muutus olema mini ­
maalne ja ei tohiks ületada 20 % kummagi soo keskmisest massist.  
1.3.2.  Loomade pidamise ja toitmise tingimused  
Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22  o C (± 3  o ). Kuigi 
suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei tohiks ületada 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, siis eesmärgiks on hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, 
järjestus on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Toitmisel 
võib kasutada tavapärast labori toiduvalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Toiduvalikut võib mõjutada vajadus tagada katseaine sobiv lisamine, kui katseainet manustatakse käesoleva meetodi abil.
 
Loomi võib hoida eraldi või väikestes, samast soost loomade 
rühmades. Paaritumine peab toimuma selleks ettenähtud puurides. Kui võib tõdeda, et suguühe on toimunud, pannakse paaritunud emasloomad oma poegimis- või poegimispuuridesse. Paaritunud 
rotte võib samuti pidada väikestes rühmades ja eraldatakse üksteisest 
üheks või kaheks päevaks enne sünnitamist. Paaritunud loomadele antakse sünnituse lähenedes sobivad ja kindlaksmääratud pesapunu ­
mismaterjalid.
 
1.3.3.  Loomade ettevalmistamine  
Tuleks kasutada terveid täiskasvanud loomi, keda on harjutatud labo ­
ritingimustega vähemalt 5 päeva ja keda ei ole varem katsetes kasu ­
tatud. Katseloomade liik, liin, päritolu, sugu, kaal ja/või vanus on äratuntavad. Teadma peaks õe-venna suhteid loomade vahel, et 
vältida õdede-vendade paaritamist. Loomad määratakse juhuvaliku 
teel kontroll- ja katserühmadesse (kihistamine kehamassi järgi on soovitav). Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Igale loomale tuleks anda ainulaadne 
tunnusnumber. P-põlvkonna puhul tuleks seda teha enne annustamise 
algust. F
 1 -põlvkonna puhul tuleks seda teha paaritumiseks valitud 
loomade võõrutamisel. F  1 -sugupõlve kõikide valitud loomade puhul 
säilitatakse andmed pesakonna kohta, millest nad pärit on. Lisaks 
sellele soovitatakse identifitseerida pojad individuaalselt nii ruttu 
pärast sündi kui võimalik, kui poegi kaalutakse või tehakse muid funktsionaalseid katseid.
 
P-põlvkonna vanemad on ligikaudu 5–9 nädalat vanad annustamise 
alguses. Kõikide katserühmade loomad peaksid niipalju kui võimalik 
olema ühesuguse kaalu ja vanusega.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. KATSE KÄIK  
1.4.1.  Loomade arv ja sugu  
Igas katse- ja kontrollrühmas on piisav arv loomi, et katsesse 
saadakse eelistatult mitte vähem kui 20 tiinet emaslooma, kes on 
poegimas või hakkavad varsti poegima. Ainete puhul, mis põhjus ­
tavad käsitlemisega seotud soovimatuid mõjusid (nt steriilsus, liigne mürgisus suure annuse juures), ei ole see võimalik. Eesmärgiks on luua piisavalt tiinuse juhtumeid, et kindlustada sellise aine tähendus ­
rikas hindamine, millel on võime mõjutada viljakust, tiinust ja ema 
käitumist ning imetamist, F
 1 -järglase kasvu ja arengut viljastumisest 
kuni suguküpseks saamiseni ning nende järglaste (F  2 ) arengut kuni 
võõrutamiseni. Seetõttu, kui ei saada soovitud arvu tiineid loomi (s.t 
20 looma), ei tähenda see, et katse on ilmtingimata invaliidne. Katse valiidsust hinnatakse iga üksikjuhtumi puhul eraldi.
 
1.4.2.  Dooside valmistamine  
On soovitav, et katseainet manustatakse suu kaudu (toidu ja joogivee 
kaudu või sondi abil), välja arvatud juhul, kui muud manustamisviisi (nt naha kaudu või sissehingamine) peetakse sobivamaks.
 
Vajadusel lahustatakse või suspendeeritakse katseaine sobivas 
kandeaines. On soovitav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt 
vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-emulsiooni 
(nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku muude kandealuste lahust. Veest erinevate kandeainete puhul peaks kandeaine toksikoloogilised 
omadused teada olema. Katseaine stabiilsus kandeaines määratakse 
kindlaks.
 
1.4.3.  Annustamine  
Tuleks kasutada vähemalt kolme annusemäära ja samaaegset kont ­
rolli. Kui katseaine füüsikalis-keemiline laad või bioloogilised mõjud ei sea piiranguid, valitakse suurim annusemäär selliselt, et põhjustab mürgisust, kuid ei põhjusta surma ega raskeid kannatusi. Ootamatu 
suremuse korral on tavaliselt siiski aktsepteeritavad sellised 
uuringud, milles P-sugupõlve vanemate suremus on ligikaudu alla 10 %. Tuleks valida annusemäärade alanev järjestus, et näidata annu ­
sega seotud reaktsiooni ja täheldamata kahjuliku mõju taset 
(NOAEL). Kahe- või neljakordsed vahemikud on sageli optimaalsed 
alanevate annusemäärade kehtestamisel ja sageli on eelistatud nelj ­
anda katserühma lisamine väga suurte vahemike (nt üle kümne ­
kordne tegur) annuste vahel. Toitumisuuringute puhul ei tohiks 
annuste vahemik olla mitte suurem kui kolmekordne. Annusemäärad 
tuleks valida varasemaid mürgisust käsitlevaid andmeid, eriti annu ­
seid käsitlevate kordusuuringute tulemusi arvesse võttes. Mis tahes kättesaadavat teavet metabolismi ja katseühendi või sellega seotud 
ainete kineetika kohta tuleks samuti arvesse võtta. Selline teave aitab 
samuti viidata sellele, et annustamisrežiim on adekvaatne.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Kontrollrühmaks on rühm, kellega katseid ei tehta, või 
kandeainet saav kontrollrühm, kui kandeainet kasutatakse katse ­
aine manustamisel. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neile ei anta uuritavat ainet. Kui kasutatakse kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet suuremas 
mahus. Kui katseainet manustatakse toidu kaudu ja seetõttu 
väheneb toidu võtmine või ärakasutamine, siis võib pidada vaja ­
likuks paariskontrollrühma kasutamist. Teise võimalusena võib kasutada samaaegsete paariskontrollrühmade asemel andmeid, 
mis on saadud sellistest kontrollitud uuringutest, mis on välja 
töötatud selliste mõjude hindamiseks, mille on vähenenud toidu ­
tarbimine põhjustanud reproduktiivsetele parameetritele.
 
Arvesse võetakse kandeaine ja muude lisandite järgmiseid omadusi: 
katseaine absorbtsiooni, jaotamist, metabolismi või peetumist käsit ­
levad mõjud; katseaine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi omadusi; ning toidu- või veetarbimist või toitumust käsitlevad mõjud.
 
1.4.4.  Piirsisalduskatse  
Kui suukaudne uuring ühe annusemääraga, mis on vähemalt 1 000 
mg kg kehamassi kohta päevas või vastav protsendimäär toidus või joogivees, kui manustatakse toidu või joogivee kaudu, kasutades 
käesolevas uuringus kirjeldatud protseduure, ei tekita täheldatavaid 
toksilisi mõjusid vanematele või nende järglastele ja kui mürgisus eeldatavasti ei põhine struktuurselt ja/või metaboolselt sarnaste ühen ­
dite kohta käivatel andmetel, siis ei peeta vajalikuks täieliku uuringu 
tegemist, kus kasutatakse mitmeid annusemäärasid. Piirsisalduskatset 
kohaldatakse, välja arvatud siis, kui inimese kokkupuude viitab vaja ­
dusele kasutada suuremat suukaudset annusemäära. Muude manusta ­
misviiside korral, nagu näiteks sissehingamine või naha kaudu 
manustamine, võivad katseaine füüsikalis-keemilised omadused 
nagu lahustuvus tihti viidata suurimale kokkupuutetasemele ja seada sellele piiranguid.
 
1.4.5.  Annuste manustamine  
Loomadele annustatakse katseainet 7 päeva nädalas. Eelistatakse 
suukaudset manustamist (toit, joogivesi või sond). Kui kasutatakse muud manustamisviisi, tuleks seda põhjendada ning asjaomased muudatused võivad osutuda vajalikuks. Kõikidele loomadele annus ­
tatakse ainet sama meetodi järgi asjaomase katseperioodi jooksul. 
Kui katseainet manustatakse sondi abil, tehakse seda läbi söögitoru. Korraga manustatava vedeliku maht ei ületa 1 ml 100 g kehamassi kohta (0,4 ml 100 g kehamassi koha on maksimum maisiõli puhul), 
välja arvatud vesilahuste puhul, kui võib kasutada 2 ml 100 g keha ­
massi kohta. Välja arvatud ärritavad või söövitavad ained, mille mõjud tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katses kasutatavate mahtude varieeruvust, regulee ­
rides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks 
samaks. Sundsöötmisega seotud uuringutes saavad pojad tavaliselt katseainet üksnes kaudselt piimast, vahetu annustamine algab nende jaoks võõrutuse ajal. Toidu või joogiveega seotud uuringutes 
saavad pojad täiendavalt katseainet vahetult, kui nad hakkavad ise 
sööma imetamisperioodi viimasel nädalal.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
Toidu või joogivee kaudu manustatud ainete puhul on oluline tagada, 
et hõlmatud katseaine kogused ei häiriks tavapärast toitumist või 
veetasakaalu. Kui katseainet manustatakse toidus kas püsiva toidu ­
kontsentratsioonina (ppm) või võidakse kasutada püsivat annuse ­
määra looma kehamassi suhtes, siis tuleb täpsustada kasutatud alter ­
natiivi. Sondi kaudu manustatud aine puhul tuleks annus anda samal 
kellaajal iga päev ja kohandada vähemalt igal nädalal, et säilitada konstantset annusemäära looma kehamassi suhtes. Sondiannuse kohandamisel kaalu järgi tuleks arvesse võtta teavet katseaine plat ­
senta kaudu levimise kohta.
 
1.4.6.  Katsete ajakava  
P-põlvkonna isas- ja emasloomade puhul algab igapäevane annusta ­
mine siis, kui nad on 5–9 nädalat vanad. F  1 -isas- ja emasloomade 
puhul algab igapäevane annustamine võõrutamise ajal, tuleb meeles 
pidada, et katseaine toidu või joogivee kaudu manustamise korral võib toimuda F
 1 -põlvkonna poegade vahetu kokkupuude katseainega 
juba imetamise ajal. Mõlema soo puhul (P ja F  1 ) jätkatakse annusta ­
mist vähemalt 10 nädalat enne paaritamist. Annustamist jätkatakse 
mõlemast soost loomade puhul kahenädalase paaritumisperioodi jooksul. Isasloomad surmatakse humaanselt ja uuritakse neid siis, kui neid ei ole enam vaja reproduktiivsuse mõjude hindamiseks. P- 
põlvkonna emasloomade puhul jätkatakse annustamist kogu tiinuse 
aja ja kuni F
 1 -järglaste võõrutamiseni. Arvesse tuleks võtta muuda ­
tusi annustamise ajakavas, mis põhinevad katseaine, sh varasematel mürgisuse, metabolismi või bioakumulatsiooni tekke kohta käivatel 
kättesaadavatel andmetel. Iga looma annus peab tavaliselt põhinema 
looma kõige viimase individuaalse kehamassi kindlaksmääramisel. Annuse määramisel tuleks siiski olla ettevaatlik tiinuse viimasel 
trimestril.
 
P- ja F  1 -põlvkonna isas- ja emasloomade käsitlemist jätkatakse kuni 
surmamiseni. Kõik P- ja F  1 -põlvkonna täiskasvanud isas- ja emas ­
loomad surmatakse humaanselt, kui neid enam ei vajada reproduk ­
tiivsuse mõjude hindamiseks. F  1 -järglased, keda ei ole valitud paari ­
tumiseks, ning kõik F  2 -järglased surmatakse humaanselt pärast 
võõrutamist.  
1.4.7.  Paaritumisprotseduur  
1.4.7.1.  P-põlvkonna paaritumine  
Iga paaritumise korral pannakse emasloom ühte puuri ühe sama 
annusemääraga isasloomaga (1:1 paaritumine) kuni suguühte toimu ­
miseni või kaheks nädalaks. Iga päev uuritakse emasloomadel 
sperma või tupekorgi olemasolu. Tiinuse 0. päevaks peetakse päeva, mil leitakse tupekork või sperma. Kui paaritumine ei õnnes ­
tunud, saab kaaluda emaslooma uuesti paaritamist sama rühma vilja ­
kaks peetava isasloomaga. Paarituvad paarid tuleks selgesti andmetes 
ära näidata. Õdede-vendade paaritumist tuleks vältida.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  F  1 -põlvkonna paaritumine  
F 1 -järglaste paaritumise korral valitakse vähemalt üks isasloom ja 
üks emasloom võõrutamise ajal igast pesakonnast paaritumiseks muude sama annusemääraga, kuid erinevast pesakonnast poegadega, 
et sünniks F
 2 -põlvkond. Poegade valimine igast pesakonnast peaks 
olema juhuslik, kui poegade kehamassis või välimuses olulisi erine ­
vusi ei ole täheldatud. Juhul kui on täheldatud nimetatud erinevusi, valitakse iga pesakonna parimad esindajad. Pragmaatiliselt on seda 
kõige parem teha kehamassi põhjal, kuid seda võib teha ka välimuse 
põhjal. F
 1 -järglasi ei paaritata enne, kuni nad on saanud täiesti sugu ­
küpseks.  
Poegimata paare tuleks hinnata, et kindlaks määrata viljatuse näiv 
põhjus. See võib hõlmata selliseid protseduure nagu lisavõimalused 
paaritumiseks muude viljakaks peetavate isade või emadega, sugue ­
lundite mikroskoopiline uurimine ning innatsüklite või spermatoge ­
neesi uurimine.  
1.4.7.3.  Teine paaritumine  
Teatavatel juhtudel, nagu käsitlemisega seotud muutused pesakonna 
suuruses või ebaselge mõju täheldamine esimesel paaritumisel, on 
soovitav, et P- või F  1 -sugupõlve täiskasvanud loomad paarituksid 
uuesti teise pesakonna saamiseks. On soovitav uuesti paaritada emas- ja isasloomi, kellel ei ole varem pesakonda olnud, viljakaks 
peetavate erinevast soost loomadega. Kui teise pesakonna saamist 
peetakse mõlemas põlvkonnas vajalikuks, tuleks loomad uuesti paari ­
tada ligikaudu nädal pärast eelmise pesakonna võõrutamist.
 
1.4.7.4.  Pesakonna suurus  
Loomadel lubatakse poegida tavaliselt ja kasvatada järglased üles 
kuni võõrutamiseni. Pesakonna suuruse ühtlustamine ei ole kohus ­
tuslik. Kui seda on ühtlustatud, tuleks üksikasjalikult kirjeldada kasu ­
tatud meetodit.  
1.5. VAATLUSED  
1.5.1.  Kliinilised vaatlused  
Iga päev tuleks teha üldine kliiniline vaatlus ja sondi kaudu annus ­
tamise korral peaks selle ajastamisel arvesse võtma mõjude oodatavat 
kõrghetke pärast annustamist. Käitumise muutused, raske või pikale ­
veninud poegimise märgid ja kõik mürgisuse tunnused tuleks regis ­
treerida. Üksikasjalikum lisauuring iga looma kohta tuleks teostada vähemalt iga nädal ja kõige parem oleks seda teha siis, kui looma 
kaalutakse. Kõiki loomi tuleks jälgida haigestumise ja suremuse osas 
kaks korda päevas ja vajadusel nädalavahetusel kord päevas.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2.  Poeginud loomade kehamass ja toidu/vee tarbimine  
P- ja F  1 -põlvkonna poeginud loomi kaalutakse annustamise esimesel 
päeval ja seejärel vähemalt kord nädalas. Poeginud emasloomi (P-ja F
 1 -põlvkond) kaalutakse vähemalt tiinuse 0-, 7., 14. ja 20. või 21. 
päeval ning imetamise ajal samadel päevadel poegade kaalumisel ja 
loomade surmamispäeval. Nimetatud vaatlustest tuleks teatada ükshaaval iga täiskasvanud looma kohta. Paaritumisele eelneval ajal ja tiinusperioodil mõõdetakse toidu tarbimist vähemalt iga 
nädal. Vee tarbimist mõõdetakse vähemalt iga nädal, kui katseainet 
manustatakse vees.
 
1.5.3.  Innatsükkel  
Innatsükli pikkuse ja normaalsust hinnatakse P- ja F  1 -põlvkonna 
emasloomadel tupeäiete abil enne paaritumist ja valikuliselt paaritu ­
mise ajal, kuni leitakse tõendeid paaritumise toimumise kohta. Tupe- /emakakaelarakke võttes tuleks olla ettevaatlik, et vältida limaskesta kahjustamist ja seejärel pseudotiinuse teket (1).
 
1.5.4.  Spermaparameetrid  
Kõikide P- ja F  1 -põlvkonna isasloomade surmamisel registreeritakse 
munandite ja munandimanuse mass ning üks kummastki elundist säilitatakse histopatoloogiliseks uurimiseks (vt punkte 1.5.7, 
1.5.8.1). P- ja F
 1 -põlvkonna igast rühmast eraldatakse vähemalt 
kümne isaslooma suurune osarühm, allesjäänud munanditest ja munandimanustest loendatakse homogeenimisele resistentsed sper ­
matiidid ja munandimanuse sabas säilinud sperma hulk. Sama 
osarühma isasloomade puhul tuleks koguda munandimanuse sabas 
või seemnejuhas olev sperma liikuvuse ja sperma morfoloogia hinda ­
miseks. Kui täheldatakse käsitlemisega seotud mõjusid või kui on tõendeid muude uuringute võimalike mõjude kohta spermatogenee ­
sile, tuleks hinnata iga annusrühma kõikide isasloomade spermat; 
vastasel juhul võib loendamine piirduda kontrollrühma ning suure annusega rühma P- ja F
 1 -põlvkonna isasloomadega.  
Homogeenimisele resistentsete munandites olevate spermatiidide ja 
munandimanuse sabas oleva sperma koguhulk tuleks arvutada (2, 3). 
Munandimanuse sabas säilinud seemnerakkude arv võib lähtuda kvalitatiivseteks hindamisteks kasutatud suspensioonis olevate seem ­
nerakkude kontsentratsioonist ja mahust ning järelejäänud munandi ­
manuse sabakoe jahvatamisel ja/või homogeenimisel saadud seemne ­
rakkude arvust. Arvutamised tuleks teha kõikide valitud isasloomade osarühmade kõikides annuserühmades pärast loomade surmamist, välja arvatud juhul, kui tehakse video- või digitaalsalvestusi või 
kui proovid külmutatakse ja analüüsitakse hiljem. Sellistel juhtudel 
võib esmalt analüüsida kontrollrühma ja suure annusega rühma. Kui käsitlemisega ei kaasne mõjusid (nt mõjud seemnerakkude arvule, sperma liikuvusele ja morfoloogiale), ei ole vaja analüüsida muid 
annuserühmasid. Kui on täheldatud käsitlemisega kaasnevaid 
mõjusid, siis tuleks samuti hinnata väiksema annusega rühmasid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Munandimanuse (või seemnejuha) sperma liikuvust tuleks hinnata 
või videosalvestada kohe pärast surmamist. Sperma tuleks koguda, 
minimiseerides kahju, ning lahjendada liikuvusanalüüsi jaoks vastu ­
võetavaid meetodeid kasutades (4). Progressiivselt liikuva sperma protsendimäär tuleks kindlaks määrata kas subjektiivselt või objek ­
tiivselt. Kui arvutipõhine liikuvusanalüüs sooritatakse (5, 6, 7, 8, 9, 
10), sõltub progressiivne liikumine kasutaja määratud keskmise liik ­
umiskiiruse ja otsesuse künnisest või lineaarsest indeksist. Kui proove filmitakse (11) või kujundid salvestatakse muul moel lahangu 
ajal, võib jätkuanalüüsi teha üksnes kontrollrühma ja suure annusega 
rühma P- ja F
 1 -põlvkonna isasloomadega, välja arvatud juhul, kui 
täheldatakse käsitlemisega kaasnevaid mõjusid; sellisel juhul tuleks samuti hinnata väikese annusega rühmasid. Video- või digitaalpildi 
puudumisel tuleks analüüsida kõikide katserühmade kõiki proove 
lahangu ajal.
 
Munandimanuse (või seemnejuhade) spermaproovi tuleks morfoloo ­
giliselt hinnata. Spermat (vähemalt 200 seemnerakku proovi kohta) 
tuleks uurida fiksatiiviga käsitletud märgpreparaatidena (12) ja liigi ­
tada kas tavaliseks või ebatavaliseks. Morfoloogiliste sperma kõrva ­
lekallete näidete hulka kuuluvad kokkusulamine, isoleeritud pead 
ning peade ja/või sabade ebamoodustised. Hinnata tuleks kõikidest 
annuserühmadest valitud isasloomade osarühma kas vahetult pärast loomade surmamist või video- ja digitaalsete salvestuste põhjal hiljem. Äigeid, mis on juba fikseeritud, võib uurida hiljem. Sellistel 
juhtudel võib esmalt analüüsida kontrollrühma ja suure annusega 
rühma. Kui käsitlemisega ei kaasne mõjusid (nt mõjud sperma morfoloogiale), ei ole vaja analüüsida muid annuserühmasid. Kui on täheldatud käsitlemisega kaasnevaid mõjusid, siis tuleks samuti 
hinnata väiksema annusega rühmasid.
 
Kui mõnda eespool nimetatud sperma hindamisparameetritest on 
juba uuritud süsteemse toksilisuse uuringu osana vähemalt 90 
päeva, ei ole neid vaja tingimata korrata kahe põlvkonna uuringus. 
On siiski soovitav, et P-põlvkonna spermaproovid või digitaalsed salvestused säilitatakse hilisema hindamise tarbeks.
 
1.5.5.  Järglane  
Iga pesakonda uuritakse nii ruttu kui võimalik pärast poegimist 
(imetamise 0-päev), et kindlaks määrata poegade arv ja sugu, surnult sünnid, elussünnid ja kõikide anomaaliate olemasolu. 0-päeval surnult leitud poegi (kui nende laibad on leotamata) tuleks soovita ­
valt uurida võimalike defektide ja surmapõhjuse osas ning laibad 
tuleks säilitada. Elusad pojad tuleks kokku lugeda ja ükshaaval kaaluda sünni hetkel (imetamise 0-päev) või 1. päeval, ning seejärel regulaarsetel kaalumispäevadel, nt imetamise 4., 7., 14. ja 21. päeval. 
Füüsilised või käitumuslikud kõrvalekalded, mida on täheldatud 
emadel või järglastel, tuleks registreerida.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Järglase füüsiline areng tuleks registreerida peamiselt kehamassi 
lisandumise teel. Muud füüsilised parameetrid (nt kõrva ja silma 
avanemine, hammaste teke, karvakasv) võivad anda täiendavat teavet, kuid nimetatud andmeid peaks soovitavalt hindama seksuaalset küpsust käsitlevate andmete kontekstis (nt vanus ja keha ­
mass tupe avanemisel või suguti ja eesnaha eraldumisel) (13). Soovi ­
tatakse F
 1 -põlvkonna järglaste funktsionaalseid uuringuid (nt 
motoorne tegevus, sensoorne funktsioon, reflekside ontogenees) enne ja/või pärast võõrutamist, eelkõige neid uuringuid, mis on 
seotud seksuaalse küpsusega, juhul kui selliseid uuringuid ei käsitleta 
eraldi katsetes. Tupe avanemise ja eesnaha eraldumise iga määra ­
takse kindlaks paaritumiseks valitud F
 1 -põlvkonna võõrutatud 
poegade puhul. Anogenitaalset vahemaad mõõdetakse sünnijärgsel 
0. päeval F  2 -põlvkonna poegade puhul, kui F  1 -põlvkonna sooline 
jagunemine või seksuaalse küpsuse saavutamise ajastus selleks põhjust annavad.
 
Funktsionaalsed vaatlused võib ära jätta rühmades, millel vastasel 
juhul ilmneksid negatiivsete mõjude selged tunnused (nt oluline 
massi vähenemine jne). Kui funktsionaalseid uuringuid tehakse, ei 
peaks neid tegema paaritumiseks valitud poegadega.  
1.5.6.  Üldlahang  
Surmamise või uuringu käigus suremise korral uuritakse makroskoo ­
piliselt kõiki poeginud loomi (P- ja F  1 -põlvkond), kõiki väliste 
kõrvalekalletega või kliiniliste tunnustega poegi ja juhuslikult valitud 
F 1 - ja F  2 -põlvkonna mõlemast soost ja igast pesakonnast poegi mis 
tahes strukturaalsete kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivsüsteemi elundi ­
tele. Tuleks uurida humaanselt surmatud suremisseisundis poegade 
või surnud poegade (kui nende laibad on leotamata) võimalikke defekte ja/või surmapõhjust ning nende laibad tuleks säilitada.
 
Kõikide esimest korda poegivate emasloomade emakat tuleks uurida 
implantatsioonikohtade olemasolu ja arvu suhtes viisil, mis ei sisalda 
histopatoloogilist hindamist.  
1.5.7.  Elundite massid  
Surmamise ajal määratakse kindlaks kõikide P- ja F  1 -põlvkonna 
poeginud loomade kehamass ja järgmiste elundite mass (paarise ­
lundid peaks kaaluma ükshaaval):  
— emakas, munasarjad;  
— munandid, munandimanused (kogumass ja sabaosa mass);  
— eesnääre;  
— seemnepõiekesed koos näärmete ja nendes olevate vedelikega 
ning eesnäärmega (tervikuna);  
— aju, maks, neerud, põrn, ajuripats, kilpnäärmed ja neerupealised 
ning määratud sihtelundid.  
Lahanguks valitud F  1 – ja F  2 -põlvkonna poegade kehamassid tuleks 
määrata kindlaks surmamisel. Kaalutakse järgmiseid elundeid, mis 
on juhuslikult valitud ühest pojast/soost/pesakonnast (vt punkt 
1.5.6): aju, põrn ja harknääre.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Üldlahangu ja elundite kaalumise tulemusi tuleks hinnata muudes, 
korduvate annustega uuringutes tehtud vaatluste kontekstis, kui see 
on teostatav.  
1.5.8.  Histopatoloogia  
1.5.8.1.  Poeginud loomad  
P- ja F  1 -põlvkonna poeginud loomadelt eemaldatakse järgmised 
elundid ja koed või nende representatiivsed proovid ja neid säilita ­
takse sobivas kasvukeskkonnas histopatoloogilise uuringu tarbeks:  
— tupp, emakas koos emakakaelaga ning munasarjad (säilitatakse 
sobivas kinnitis);  
— üks munand (säilitatakse Bouini või võrreldavas kinnitis), üks 
munandimanus, seemnepõiekesed, eesnääre ja selle eesosa;  
— eelnevalt identifitseeritud sihtelund(id) kõikidelt paaritumiseks 
valitud P- ja F  1 -põlvkonna loomadelt.  
Eespool loetletud säilitatud elundite ja kudede täielik histopatoloogi ­
line uuring tehakse kõikide paaritumiseks valitud ning suure annu ­
sega ja kontrollrühma kuuluvate P-ja F  1 -põlvkonna loomade kohta. 
P-põlvkonna loomade munasarjade uurimine ei ole kohustuslik. 
Käsitlemisega seotud muutustega elundeid tuleks samuti uurida 
väikese ja keskmise annusega rühmades, et aidata NOAELi välja selgitada. Lisaks sellele tuleks selliste väikese ja keskmise annusega loomade, kellel kahtlustatakse vähenenud viljakust, nt need, kellel ei 
õnnestunud paarituda, viljastuda, sigitada või sünnitada terveid 
järglasi, või need, kelle innatsüklit või sperma hulka, liikuvust või morfoloogiat mõjutati, suguelundeid hinnata histopatoloogiliselt. Kõiki üldkahjustusi, nagu atroofia või kasvajad, tuleks uurida.
 
Munandeid tuleks üksikasjalikult histopatoloogiliselt uurida (nt kasu ­
tades Bouini kinnitit, parafiinilõike või 4–5 μm paksuseid läbilõi ­
keid), et kindlaks teha käsitlemisega seotud mõjud nagu paigale jäänud spermatiidid, puuduvad sugurakukihid või -liigid, hulk ­
tuumsed hiidrakud või spermatogeensete rakkude irdumine luume ­
nisse (14). Puutumatu munandimanuse puhul tuleb uurida pead, keha ja saba, mida saab teha pikilõigete hindamise teel. Munandimanuse puhul tuleks hinnata leukotsüüdi infiltratsiooni, rakutüüpide esine ­
missageduse muutusi, hälbivaid rakutüüpe ja sperma fagotsütoosi. 
PAS- ja hematoksüliiniga värvimist võib kasutada isasloomade suguelundite uurimisel.
 
Imetamisjärgne munasari peaks sisaldama alg- ja kasvavaid muna ­
rakke ning imetamisaegseid suuri kollakehasid. Histopatoloogiline uurimine peaks tuvastama algmunarakkude populatsiooni kvalita ­
tiivse vähenemise. Algmunarakkude kvantitatiivne hindamine tuleks 
teha F
 1 -põlvkonna emasloomadele; loomade arv, munasarjalõigete 
valik ja lõikeproovi suurus peaksid statistiliselt sobima kasutatava hindamisprotseduuriga. Uurimisel peaks arvutama algmunarakkude arvu, mida saab kombineerida väikeste kasvavate munarakkudega, 
katse- ja kontrollrühma kuuluvate munasarjade võrdlemiseks (15, 
16, 17, 18, 19).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Võõrutatud pojad  
Kõikide väliste kõrvalekalletega või kliiniliste tunnustega poegade, 
samuti paaritumiseks mittevalitud F  1 - ja F  2 -põlvkonnast juhuslikult 
valitud ühe poja/soo/pesakonna selgete kõrvalekalletega kude ja 
sihtelundid fikseeritakse ja säilitatakse sobivas kasvukeskkonnas 
histopatoloogilise uurimise tarbeks. Säilitatud kudedele tehakse täielik histopatoloogiline määramine, milles pearõhk on reproduktiiv ­
süsteemi elunditel.
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Andmed edastatakse kokkuvõtlikult iga emaslooma ja nende järglase 
kohta tabeli kujul, näidates iga katserühma ja põlvkonna kohta 
loomade arvu katse alguses, katse käigus surnud või humaansetel 
kaalutlustel surmatud loomade arvu, surma ja humaanse surmamise ajad, viljakate emasloomade arvu, tiinete emasloomade arvu, mürgis ­
tusnähtudega loomade aru, mürgistusnähtude kirjelduse, sh toksiliste 
mõjude algusaja, kestuse ja raskuse, embrüot/loodet käsitlevate vaat ­
luste liigid ja kogu asjaomane teave pesakonna kohta.
 
Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata sobiva, üldiselt heakskiidetud 
statistilise meetodi abil; statistilised meetodid tuleks valida uurimuse kavandamisel ja neid tuleks põhjendada. Annuse ja sellele reageeri ­
mise statistilised mudelid võivad olla andmete analüüsimisel vaja ­
likud. Protokoll peaks hõlmama piisavalt teavet analüüsimeetodi kohta ja kasutatava arvutiprogrammi kohta, nii et sõltumatu 
arvestaja/statistik võib uuesti hinnata ja rekonstrueerida analüüsi.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE  
Kahe põlvkonna reproduktsiooni toksilisuse uuringu avastusi tuleks 
hinnata täheldatud mõjude, kaasa arvatud lahangu- ja mikroskoopi ­
lised leiud, suhtes. Hindamine hõlmab katseaine annuse ja kõrvale ­
kallete – sh üldkahjustused, identifitseeritud sihtelundid, mõjutatud 
viljakus, kliinilised kõrvalekalded, mõjutatud paljunemisvõime ja pesakonna suurus/laad, kehamassi muutused, mõjud suremusele ja mis tahes muud toksilised mõjud – olemasolu või puudumise, esine ­
missageduse ja raskusastme vahelist seost või selle puudumist. 
Katseaine füüsikalis-keemilisi omadusi ja vajaduse korral toksikoki ­
neetilisi andmeid tuleks võtta arvesse katsetulemuste hindamisel.
 
Nõuetekohaselt tehtud reproduktsiooni toksilisuse uuring hindab 
rahuldavalt mõjuta määrasid ja mõistab reproduktsioonile, poegimi ­
sele, imetamisele, sünnijärgsele arengule, kaasa arvatud kasv ja 
seksuaalne areng, kahjulikke mõjusid.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Kahe põlvkonna reproduktsiooni toksilisuse uuring annab teavet 
korduvate ainega kokkupuudete mõjude kohta reproduktiivtsükli kõikidel etappidel. Eelkõige annab uuring teavet reproduktiivpara ­
meetrite kohta ning järglaste arengu, kasvu, suguküpseks saamise 
ja ellujäämise kohta. Uuringu tulemusi tõlgendatakse koostoimes subkroonilisel, sünnieelse arengu ja toksikokineetilisel ning muudel uuringutel tehtud avastustega. Käesoleva uuringu tulemusi võib kasu ­
tada kemikaali täiendava uurimise vajaduse hindamisel. Uuringu 
tulemuste ekstrapoleerimine on kehtiv piiratud ulatuses. Neid saab kõige paremini kasutada teabe andmiseks mõjuta määrade ja inimeste 
lubatud kokkupuudete kohta (20, 21, 22, 23).
 
3. PROTOKOLL  
3.1. KATSEPROTOKOLL  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Katseaine:  
— füüsiline laad ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;  
— tunnusandmed;  
— puhtus.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valiku põhjendus, kui see on veest erinev.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/tüved;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, toitumine, pesamaterjalid jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  
Katsetingimused:  
— annuste valiku põhjendus;  
— katseaine valmistise/toidupreparaadi üksikasjad, saadud kontsen ­
tratsioonid;  
— preparaadi stabiilsus ja homogeensus;  
— katseaine manustamise üksikasjad;  
— toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni 
(ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg kg kehamassi kohta 
päevas), vajaduse korral;  
— üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Tulemused:  
— toidu tarbimine ja vajaduse korral vee tarbimine, toidu tõhusus 
(kehamassi lisandumine tarbitud toidu grammi kohta) ning katse ­
aine tarbimine P- ja F  1 -põlvkonna loomadel, välja arvatud 
perioodil, mil loomi hoitakse koos, ja vähemalt imetamise viimasel kolmandikul;
 
— andmed absorbtsiooni kohta (kui seda on mõõdetud);  
— paaritumiseks valitud P- ja F  1 -põlvkonna loomade kehamassi 
andmed;  
— pesakonna ja poegade massi andmed;  
— andmed poeginud loomade kehamassi kohta surmamisel ning 
elundite täieliku ja suhtelise massi kohta;  
— kliiniliste vaatluste laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas 
kahjud on pöörduvad või mitte);  
— surmaaeg katse ajal või andmed loomade ellujäämise kohta kuni 
surmamiseni;  
— andmed toksilise reaktsiooni kohta sooti ja annuste kaupa, kaasa 
arvatud paaritumis-, viljakus-, tiinus-, sünni-, elujõulisus- ja 
imetamisindeksid; protokoll peaks viitama nende indeksite arvu ­
tamisel kasutatud arvudele;  
— toksilised või muud mõjud reproduktsioonile, järglastele, sünni ­
järgsele kasvule jne;  
— lahangu leiud;  
— kõikide histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— tavalise innatsükliga P- ja F  1 -põlvkonna emasloomade arv ning 
tsükli pikkus;  
— munandimanuse sabaosas oleva sperma koguarv, progressiivselt 
liikuva sperma protsendimäär, morfoloogiliselt normaalse sperma 
protsendimäär ning tuvastatud kõrvalekaldega sperma protsendi ­
määr;  
— aega paaritumiseni, sh päevade arv paaritumiseni;  
— tiinuse pikkus;  
— implantatsioonide arv, kollakehad, pesakonna suurus;  
— elussündide arv ja implantatsioonide järel toimunud abordid;  
— selgelt nähtavate arenguhälvetega poegade arv, kui see on kind ­
laks määratud, tuleks teatada kängujäänud loomade arv;  
— andmed poegade füüsilise arengu järkude kohta ja andmed 
muude sünnijärgsete arengute kohta; hinnatud füüsilise arengu 
järke tuleks põhjendada;  
— andmed poegade ja täiskasvanud loomade funktsionaalsete vaat ­
luste kohta;  
— vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Tulemuste arutelu.  
Järeldused, sh NOAEL-väärtused mõjude kohta emadele ja järglas ­
tele. 
4. VIITED  
1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Reprodudion 
in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and 
R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Metho ­
xychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat.  Fundamental and Applied  Toxicology 
12:92-108.  
3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54:103-107.  
4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reprodudive  Toxicology 5:39-44.  
5) Seed, J. et al. (19 9 6). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a 
Consensus Report.  Reproductive  Toxicology 10(3):237-244.  
6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reprodudive  Toxicology 6:267-273.  
7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dime ­
thanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration.  journal of Andrology  13:409-421.  
8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive  Toxicology 5:449-458.  
9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in  Toxico­
logy, Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319-333.
 
10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm 
Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andro ­
logy 10: 401-415.
 
11) Working, P.K. and M. Hurtt (1987). Computerized Videomic ­
rographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.
 
12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.
 
13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction 17:298303.  
14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.  
15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, 
Orlando, Florida.  
16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, 
New York, pp. 421-426.  
17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5:379-383.  
19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and CA. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
 
20) Thomas, J. A. (19 91). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. 
Doull, and CD. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.  
21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Repro ­
ductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, 
New York.
 
22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
23) (23) Palmer, A.K. (19 78). In Handbook of Teratology, Vol. 4, 
J.G. Wilson and F.C Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOKSIKOKINEETIKA  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 417 (2010). 
Uuritava kemikaali toksikokineetika uuringud tehakse selleks, et saada tõest teavet kemikaali imendumise, jaotumise, biotransformatsiooni (metabolisee ­
rimise) ja väljutamise kohta, et aidata kaasa kontsentratsiooni või doosi 
seostamisele täheldatud mürgisusega ning aidata mõista selle mürgisuse mehhanismi. Toksikokineetika võib aidata mõista toksikoloogiauuringuid, kuna sel viisil näidatakse, et katseloomad puutuvad uuritava kemikaaliga 
kokku süsteemselt, ning selgitatakse välja, millised struktuuriühikud (lähte ­
kemikaal/metaboliidid) ringlevad katselooma organismis. Kõnealustest uuringutest saadavad toksikokineetika põhiparameetrid annavad teavet ka uuritava kemikaali võimaliku akumulatsiooni kohta kudedesse ja/või orga ­
nitesse ning uuritava kemikaaliga kokkupuute tõttu võimaliku biotransfor ­
matsiooni põhjustamise kohta.
 
2. Toksikokineetika andmed võivad aidata hinnata, kuivõrd adekvaatne ja asja ­
kohane on ekstrapoleerida loomadel avalduva mürgisuse andmeid inimes ­
tega seotud ohtude ja/või riskide hindamisele. Lisaks sellele võivad toksiko-kineetilised uuringud anda kasulikku teavet mürgisuse uuringute 
doositasemete (lineaarne  vs. mittelineaarne kineetika), manustamistee mõju 
ja biokättesaadavuse kindlakstegemiseks ning uuringu kavandamise küsi ­
muste lahendamiseks. Teatavat tüüpi toksikokineetika andmeid on võimalik kasutada füsioloogial põhineva toksikokineetika (PBTK) mudeli arenda ­
miseks.
 
3. Metaboliitide/toksikokineetika andmetel on tähtsaid kasutusvaldkondi, 
näiteks aitavad need ennustada kemikaalide võimalikku mürgisust ja toime ­
viisi ning mõista mürgisuse ja toimeviisi seoseid doositaseme ja kokkupuu ­
tumisteega. Lisaks sellele võib kemikaalide metaboliseerumise andmetest saada teavet, mis aitab hinnata uuritava kemikaali eksogeenselt tekkinud/ ­
valmistatud metaboliitidega kokkupuute toksikoloogilist tähtsust.
 
4. Head toksiko-kineetilised andmed aitavad teha järeldusi, kuivõrd usaldus ­
väärsed ja kasutatavad on kemikaalide ohutuse hindamisel kvantitatiivsed 
struktuuri-aktiivsuse sõltuvused, analoogmeetod ja grupeerimismeetod. Kineetika andmeid võib kasutada ka muude uuringute (näiteks  in vivo  / in 
vitro ) toksikoloogilise asjakohasuse hindamiseks.
 
5. Kui ei ole nimetatud muud manustamisteed (vt eelkõige punktid 74–78), 
kasutatakse käesolevat katsemeetodit uuritava kemikaali suukaudse manus ­
tamise puhul.  
LÄHTEKAALUTLUSED  
6. Õigussüsteemides on eri kemikaaliklasside (näiteks pestitsiidid, biotsiidid, 
tööstuskemikaalid) toksikokineetika näitajate ja parameetrite mõõtmisega seoses sätestatud erinevad nõuded ja vajadused. Erinevalt enamikust katse ­
meetoditest kirjeldatakse käesolevas katsemeetodis toksikokineetika katseid, 
mis hõlmavad mitmeid mõõtmisi ja näitajaid. Tulevikus töötatakse arvata ­
vasti välja mitu uut katsemeetodit ja/või juhenddokumenti, et kirjeldada eraldi ja täpsemalt iga näitajat. Käesoleva katsemeetodi puhul määratakse 
tehtavad katsed või hindamised kindlaks iga õigussüsteemi nõuete ja/või 
vajadustega.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Regulatiivseks otstarbeks võib uuritava kemikaali toksiko-kineetilist käitu ­
mist hinnata paljude uuringutega. Kõik kõnealused võimalikud uuringud ei 
pruugi uuritava kemikaali hindamiseks olla siiski vajalikud, kõik oleneb konkreetsetest regulatiivsetest vajadustest või olukorrast. Toksiko-kineetiliste uuringute kavandamiseks on vaja paindlikkust ja uuri ­
tava kemikaali omaduste arvestamist. Mõnikord tuleb uurida ainult teatavaid 
küsimusi, et teha kindlaks uuritava kemikaaliga seotud ohud ja riskid. Mõni ­
kord võib toksiko-kineetilisi andmeid koguda muus toksikoloogiauuringus kemikaali hindamise osana. Muus olukorras võivad olla vajalikud ulatus ­
likud täiendavad toksiko-kineetilised uuringud, kui selleks on regulatiivne 
vajadus või tekib uuritava kemikaali hindamisel uusi küsimusi.
 
8. Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi 
vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali ja asjakohaste metabo ­
liitide ning analoogide kohta, et parandada uuringu kvaliteeti ja vältida loomade tarbetut kasutamist. See võib hõlmata muude asjakohaste katsemee ­
todite andmete kasutamist ( in vivo  uuringud,  in vitro  uuringud ja/või  in 
silico  hindamised). Füüsikalis-keemilised omadused, näiteks kemikaali 
jaotustegur süsteemis oktanool-vesi (log P
 OW ), pKa, lahustuvus vees, auru ­
rõhk ja molekulmass võivad olla kasulikud uuringu planeerimisel ning tule ­
muste tõlgendamisel. Need on võimalik kindlaks määrata sobivate meetodite 
abil, nagu on kirjeldatud asjakohastes katsemeetodites.  
PIIRANGUD  
9. Käesolev katsemeetod ei ole ette nähtud tegelemiseks eriolukordadega 
(näiteks tiined või poegi imetavad loomad ja noorloomad) või võimalike 
jääkide hindamiseks kemikaalidega kokku puutunud loomades, keda 
inimene tarbib toiduks. Katsemeetodi B.36 kohase uuringu andmed võivad siiski anda taustteavet, mis aitab kavandada eriuuringuid selliste küsimuste lahendamiseks. Käesolev katsemeetod ei ole ette nähtud nanomaterjalide 
katsetamiseks. OECD katsejuhendite esialgse läbivaatamise aruandes, milles 
käsitletakse nende kohaldatavust nanomaterjalide uurimisele, on märgitud, et katsejuhend nr 417 (mis on samaväärne käesoleva katsemeetodiga B.36) ei pruugi olla kohaldatav nanomaterjalide uurimisele (1).
 
MÕISTED  
10. Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted on esitatud liites.  
LOOMADE HEAOLU KAALUTLUSED  
11. Suunised loomade humaanse kohtlemise kohta on esitatud OECD juhend ­
dokumendis nr 19 (2). OECD juhenddokumenti nr 19 soovitatakse kasutada 
kõigi käesolevas katsemeetodis kirjeldatud  in vivo  ja in vitro  uuringute 
puhul.  
MEETODITE KIRJELDUS  
Prooviuuringud  
12. Soovitatakse kasutada prooviuuringuid, et valida toksiko-kineetilistel uurin ­
gutel jälgitavad parameetrid (näiteks kemikaali metaboliseerimine, massibi ­
lanss, analüüside tegemine, dooside valimine, CO  2 väljahingamine jne). 
Mõnda kõnealustest parameetritest saab määrata ka ilma radiomärgistatud 
kemikaali kasutamata.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Loomade valimine  
Liik 
13. Toksikokineetika katsetes kasutatav loomaliik (ja liin) peaks eelistatavalt 
olema sama kui asjakohase uuritava kemikaaliga tehtud muudes toksikoloo ­
gilistes uuringutes. Üldiselt tuleks kasutada rotti, kuna seda liiki on toksi ­
koloogilistes uuringutes palju kasutatud. Muu või täiendava liigi kasutamine 
võib olla põhjendatud, kui asjakohased toksikoloogilised uuringud näitavad 
märkimisväärset mürgisust kõnealuse liigi suhtes või kui mürgisus kõnealuse liigi suhtes või liigi isenditel avalduv toksikokineetika on näidatud olevat inimeste jaoks asjakohasem. Loomaliigi ja liini valikut tuleks põhjendada.
 
14. Kui ei ole öeldud teisiti, viidatakse käesolevas katsemeetodis katseliigina 
rotile. Muu katseliigi kasutamise korral võib meetodi teatavaid aspekte 
muuta.  
Vanus ja liin  
15. Tuleks kasutada noori terveid täiskasvanud loomi, kes on annustamise ajal 
tavaliselt 6–12 nädala vanused (vt ka punktid 13 ja 14). Muude kui noorte täiskasvanud loomade kasutamise korral tuleks seda põhjendada. Kõik 
loomad peaksid uuringu alguses olema sarnases vanuses. Üksiku looma 
kehamass ei tohiks erineda rohkem kui ±20 % katserühma keskmisest keha ­
massist. Kõige parem oleks kasutada sama liini, mida kasutati uuritava 
kemikaali toksikoloogilise andmebaasi koostamisel.
 
Loomade arv ja sugu  
16. Iga uuritava doosi korral tuleks kasutada vähemalt nelja samast soost looma. 
Kasutatud loomade soo valikut tuleks põhjendada. Kui on tõendeid, et kummagi soo puhul avaldub mürgisus erinevalt, tuleks kaaluda mõlema 
soo kasutamist (neli isas- ja neli emaslooma).
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
17. Loomi tuleks katse ajal üldjuhul eraldi pidada. Eriolukorras võib olla 
põhjendatud rühmas pidamine. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi 
valgust ja 12 tundi pimedust. Katseloomade pidamise ruumi temperatuur 
peaks olema 22 °C (±3 °C) ja suhteline õhuniiskus 30–70 %. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata.
 
Uuritav kemikaal  
18. Uuringu kõigi massibilansi ja metaboliitide tuvastamise andmete saamiseks 
tuleks kasutada  14 C abil radiomärgistatud uuritavat kemikaali. Kui on aga 
võimalik tõendada, et  
— massibilanssi ja metaboliite on võimalik õigesti hinnata märgistamata 
uuritava kemikaaliga,  
— mitteradioaktiivse uuritava kemikaaliga kasutatud meetodi analüütiline 
täpsus ja tundlikkus on radiomärgistatud uuritava kemikaali kasutami ­
sega võrreldes samaväärne või suurem,  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
ei ole radiomärgistatud uuritavat kemikaali vaja kasutada. Samuti võib kasu ­
tada muid radioaktiivseid ja stabiilseid isotoope, eelkõige juhul, kui kõne ­
alune element põhjustab uuritava kemikaali mürgisuse või on selle osa. Kui võimalik, peaks radiomärgis asuma molekuli metaboliseerimise suhtes stabiilses põhiosas (osa, mis ei ole vahetatav, mida ei eemaldata metaboli ­
seerimisel CO
 2 -na ja mis organismis ei lähe ühe süsinikuaatomiga ühendite 
puuli). Uuritava kemikaali metaboliseerimise käigu väljaselgitamiseks võib olla vajalik märgistada molekulis mitu aatomit või konkreetset piirkonda.
 
19. Radiomärgisega ja radiomärgiseta uuritavat kemikaali tuleks asjakohaste 
meetodite abil analüüsida, et veenduda kemikaali puhtuses ja vastavuses keemilisele määratlusele. Radioaktiivse uuritava kemikaali radioloogiline 
puhtus peaks olema nii suur, kui konkreetse uuritava kemikaali puhul on 
võimalik saavutada (ideaaljuhul üle 95 %), ning tuleks teha mõistlikud jõupingutused, et tuvastada kõik lisandid, mida on 2 % või rohkem. Tuleb esitada andmed uuritava kemikaali puhtuse kohta ja kõikide kindlakstehtud 
lisandite keemilise määratluse ja osakaalu kohta. Igas regulatiivses kavas 
võidakse otsustada anda täiendavaid suuniseid, kuidas määratleda ja kirjel ­
dada uuritavat kemikaali, mis kujutab endast segu, ning milliseid meetodeid tuleb kasutada selle puhtuse määramiseks.
 
Doosi valik  
Prooviuuring  
20. Üldjuhul on prooviuuringuks piisav üks suukaudne doos. Doos ei tohiks olla 
mürgine, kuid peaks olema piisavalt suur, et võimaldada metaboliitide tuvas ­
tamist väljaheidetes ja väljahingatud õhus (ja plasmas, kui see on asjako ­
hane) ning saavutada prooviuuringu nimetatud eesmärk, mis on märgitud käesoleva katsemeetodi punktis 12.
 
Põhiuuring  
21. Põhiuuringu puhul eelistatakse vähemalt kahe doosi kasutamist, kuna vähe ­
malt kahest doosirühmast kogutud teave võib aidata määrata doosi muudes mürgisuse uuringutes ja hinnata juba olemasolevate mürgisuse katsete mõju 
sõltuvust doosist.
 
22. Kui manustatakse kahte doosi, peaksid mõlemad doosid olema piisavalt 
suured selleks, et võimaldada metaboliitide tuvastamist väljaheidetes (ja 
plasmas, kui see on asjakohane). Doosi valimisel tuleks arvesse võtta olema ­
solevatest toksilisuse andmetest saadud teavet. Kui teavet (näiteks ägeda suukaudse mürgisuse või korduvdoosi mürgisuse uuringute teavet kliiniliste 
mürgistusnähtude kohta) ei ole, võib kaaluda suuremat annust, mis on 
allpool LD
 50 (suukaudsel ja nahakaudsel manustamisel) või LC  50 (sissehin­
gamise kaudu manustamisel) hinnangulist väärtust või allpool ägeda mürgi ­
suse hinnangulise vahemiku alumist väärtust. Väiksem annus peaks olema 
suurema doosi mingi murdosa.  
23. Ainult ühe doositaseme uurimise korral peaks doos ideaaljuhul olema piisa ­
valt suur, et võimaldada metaboliitide tuvastamist väljaheidetes (ja plasmas, 
kui see on asjakohane), põhjustamata ilmset mürgistust. Teise doositaseme lisamata jätmist tuleks põhjendada.
 
24. Kui on vaja määrata doosi mõju kineetilistele protsessidele, ei pruugi kahest 
doosist piisata ja vähemalt üks neist peaks olema piisavalt suur, et saavutada kõnealuses protsessis küllastumist. Kui plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala (AUC) ei ole põhiuuringus kasutatud kahe 
doositaseme vahel lineaarne, on see oluline tõend, et ühe või enama kinee ­
tilise protsessi küllastumine toimub kusagil kahe doositaseme vahel.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Vähese mürgisusega uuritavate kemikaalide puhul tuleks (suu- ja naha ­
kaudse manustamise korral) kasutada maksimumdoosi 1 000 mg kehakaalu 
kg kohta (sissehingamise teel manustamise puhul vt suunised, käesoleva lisa peatükk B.2; üldjuhul ei ületa see doos 2 mg/l). Kemikaalist olenevalt võib regulatiivsete nõuete täitmiseks osutuda vajalikuks suurema doosi kasuta ­
mine. Doosi valik peaks olema alati põhjendatud.
 
26. Ühe doosi toksiko-kineetilised ja kudedes jaotumise andmed võivad olla 
piisavad bioakumuleerumise ja/või püsivuse võimalikkuse kindlaksmäära ­
miseks. Mõnel juhul võib siiski olla vajalik korduvdoosi manustamine, i) 
et käsitleda täpsemalt bioakumuleerumise ja/või püsivuse võimalikkust või 
muutusi toksikokineetikas (s.o näiteks ensüümide induktsioon ja inhibeeri ­
mine), või ii) kui seda nõuab kohaldatav õigussüsteem. Kuigi üldjuhul piisab väikese doosi korduvast manustamisest, võib korduvdoosiuuringute 
puhul olla mõnedel tingimustel vajalik ka suure doosi korduv manustamine 
(vt punkt 57).
 
Uuritava kemikaali manustamine  
27. Uuritav kemikaal tuleks lahustada või tekitada selle ühtlane suspensioon 
samas kandeaines, mida on kasutatud muude suukaudse mürgisuse sund ­
söötmisega manustamisega uuringutes, kui kõnealune teave kandeaine 
kohta on olemas. Kandeaine valikut tuleks põhjendada. Kandeaine ja dosee ­
rimiskoguse valimist tuleks käsitleda juba uuringu koostamisel. Tavaline manustamismeetod on sundsöötmisega; manustamine želatiinkapslis või söödasegu osana võib siiski olla konkreetses olukorras kasulikum (mõlemal 
juhul tuleks valitud meetodit põhjendada). Igale loomale tegelikult manus ­
tatud doosi tuleks kontrollida.
 
28. Suukaudsel sundsöötmisel korraga manustatava vedeliku maksimaalne 
kogus oleneb katselooma suurusest, doosi kandeaine tüübist ja sellest, kas 
loomi enne uuritava kemikaali manustamist näljutatakse või mitte. Enne 
manustamist sööda andmist või mitteandmist tuleks põhjendada. Üldiselt peaks manustatav maht nii veepõhiste kui ka muude kandeainete puhul olema nii väike, kui praktiliselt võimalik. Doosi kogus näriliste puhul ei 
tohiks üldiselt ületada 10 ml kehakaalu kg kohta. Lipofiilsema uuritava 
kemikaali puhul kasutatav kandeaine kogus võiks alata 4 ml-st kehakaalu kg kohta. Korduvdoosiuuringutes, kus igapäevane näljutamine on vastunäidus ­
tatud, tuleks kaaluda väiksema doosikoguse (näiteks 2–4 ml kehakaalu kg 
kohta) kasutamist. Kui võimalik, tuleks püüda kasutada sellist doosikogust, 
mis on kooskõlas uuritava kemikaaliga tehtud muude suukaudse sundsööt ­
mise uuringutega.
 
29. Uuritava kemikaali intravenoosset manustamist ning uuritava kemikaali 
mõõtmist veres ja/või väljaheidetes võib kasutada biosaadavuse või suhtelise 
suukaudse imendumise määramiseks. Intravenoosse manustamise uuringu puhul manustatakse asjakohase kandeaine abil üks doos uuritavat kemikaali (mis on üldiselt võrdväärne väikese suukaudse doosiga, aga ei tohi seda 
ületada, vt doosi valimine). Seda materjali tuleks manustada sobiv kogus 
(näiteks 1 ml kehakaalu kg kohta) valitud manustamiskohas vähemalt neljale asjakohasest soost loomale (kui see on põhjendatud, siis võib kasutada mõlemat sugu, vt punkt 16). Intravenoosseks manustamiseks tuleb ette 
valmistada uuritava kemikaali täielikult lahustatud või suspendeeritud 
doos. Intravenoosse manustamise kandeaine ei tohiks mõjutada vere koostist
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
ega voolamist. Kui uuritav kemikaal kanti üle infusioonipumbaga, tuleks 
katseprotokollis teatada ülekandmise kiirus, mis peaks kõigi loomade 
puhul olema standardne. Kanüüli viimisel jugulaarveeni (uuritava kemikaali manustamiseks ja/või vere kogumiseks) või reiearterisse (uuritava kemikaali manustamiseks) tuleks kasutada tuimestust. Tuimestuse tüüpi tuleks hoolega 
kaaluda, kuna see võib toksikokineetikat mõjutada. Loomad peaksid saama 
enne uuritava kemikaali ja kandeaine manustamist piisavalt toibuda.
 
30. Teatava uuritava kemikaali puhul võib olla asjakohane muu manustamistee, 
näiteks nahakaudne või sissehingamise teel manustamine (vt punktid 74–78), olenevalt kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest ja eeldatavast kasutamisest inimeste poolt või inimestega kokkupuute teest.
 
Mõõtmised  
Massibilanss  
31. Massibilansi määramiseks liidetakse manustatud (radioaktiivse) doosi 
kogused (protsent esialgsest doosist), mis leitakse uriinis, väljaheites ja väljahingatud õhus ning tehakse kindlaks kudedes, korjusejääkides ja puuri ­
pesuvedelikus (vt punkt 46). Üldiselt peetakse piisavaks, kui manustatud 
uuritavast kemikaalist (radioaktiivsusest) suudetakse liitmisega koguda > 90 %.
 
Imendumine  
32. Esialgne imendumise hinnang saadakse sel teel, et massibilansi arvutusest 
lahutatakse seedetraktis ja/või väljaheites oleva doosi osakaal. Imendumise protsendi arvutus on esitatud punktis 33. Väljahingatava õhu, väljaheite ja uriini uurimise kohta vt punktid 44–49. Kui pärast suukaudset manustamist 
ei ole imendumise täpset ulatust võimalik massibilansi abil kindlaks määrata 
(näiteks kui üle 20 % manustatud doosist leitakse väljaheitest), võib vajalik olla täpsem uuring. Kõnealune uuring võib seisneda kas 1) uuritava kemi ­
kaali suukaudses manustamises ja määramises, kui palju uuritavat kemikaali 
leidub sapis, või 2) uuritava kemikaali suukaudses ja intravenoosses manus ­
tamises ning uriinis leiduva uuritava kemikaali netosisalduse mõõtmises, millele liidetakse väljahingatud õhus ja korjuses leiduv uuritava kemikaali 
sisaldus kummagi manustamistee puhul. Mõlemas uuringuprojektis mõõde ­
takse radioaktiivsust uuritava kemikaali ja metaboliitide keemilise analüüsi asendusmeetodina.
 
33. Sapi kaudu eritamise uuringu tegemisel kasutatakse üldiselt suukaudset 
manustamist. Kõnealuses uuringus viiakse vähemalt nelja asjakohasest soost (vajaduse korral kummastki soost) looma sapijuhasse kanüül ja manus ­
tatakse üks doos uuritavat kemikaali. Pärast uuritava kemikaali manustamist 
tuleks jälgida radioaktiivsuse / uuritava kemikaali eritumist sapiga nii kaua, kui on vaja sapi kaudu erituva manustatud doosi protsendi hindamiseks, mida saab otseselt kasutada suukaudse imendumise ulatuse arvutamiseks 
järgmiselt:
 
imendumise protsent  ¼ ðkogus sapis þ uriinis þ väljahingatud õhus  
þ korjuses ilma seedetrakti sisalduseta Þ= 
manustatud kogus Ü 100 
34. Mõne uuritavate kemikaalide klassi puhul võib imendunud doos sekretee ­
ruda otse läbi soolestiku membraanide. Sellisel juhul loetakse, et sapijuhasse 
sisestatud kanüüliga rotile suukaudselt manustatud doosi väljaheites sisal ­
duva protsendi mõõtmine ei näita imendumata doosi protsenti. Kui oleta ­
takse sekretsiooni otse soolestikku, soovitatakse imendunud doosi protsendi 
arvutamisel toetuda imendumisele, mis arvutatakse suukaudse manustamise 
puhul väljutamise ja intravenoosse manustamise puhul väljutamise (intaktne rott või rott, kelle sapijuhasse on viidud kanüül) võrdluse alusel (vt punkt 35). Samuti soovitatakse, et kui peetakse vajalikuks soolestiku sekretsiooni 
arvulist määramist, tuleks mõõta doosi väljutamist pärast doosi intrave ­
noosset manustamist rotile, kelle sapijuhasse on viidud kanüül.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biosaadavus  
35. Biosaadavust on võimalik kindlaks määrata suukaudse ja intravenoosse 
manustamise rühmade plasma/vere kineetika alusel, nagu on kirjeldatud punktides 50–52, tuginedes uuritava kemikaali ja/või asjakohase metaboliidi 
(asjakohaste metaboliitide) keemilisele määramisele; sel juhul ei ole vaja 
kasutada radiomärgistatud uuritavat kemikaali. Uuritava kemikaali või asja ­
kohase metaboliidi (asjakohaste metaboliitide) biosaadavuse (F) võib siis arvutada järgmiselt:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDose  IV=Dose  exp Þ 
kus AUC on plasmas sisalduva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera 
alune pindala, IV on intravenoosne ja exp on eksperimentaalne manusta ­
mistee (suukaudne, nahakaudne või sissehingamise teel).  
36. Süsteemsete mõjude riski hindamisel eelistatakse üldjuhul kasutada toksilise 
osa biosaadavust imendumise protsendi asemel, kui võrreldakse loomade 
uuringute süsteemseid kontsentratsioone analoogsete bioseire andmetega, 
mis saadakse töötajate kokkupuute uuringutest. Olukord võib olla keerukam, kui doosid on mittelineaarses vahemikus, seepärast on tähtis, et toksiko-kineetilise sõelumise raames määratakse kindlaks lineaarse vahe ­
miku doosid.
 
Jaotumine kudedes  
37. Teadmised uuritava kemikaali ja/või selle metaboliitide kudedes jaotumise 
kohta on olulised sihtkudede määramiseks ning mürgisuse aluseks olevate 
mehhanismide mõistmiseks, samuti teabe saamiseks uuritava kemikaali ja metaboliitide bioakumulatsiooni ja püsivuse võimalikkuse kohta. Summaarse (radioaktiivse) doosi protsenti kudedes ning samuti korjusejääkides tuleks 
mõõta vähemalt väljutamiskatse lõpus (näiteks üldjuhul seitse päeva pärast 
doosi või vähem, olenevalt uuritava kemikaali konkreetsest käitumisest). Kui uuringu lõpus uuritavat kemikaali kudedes ei tuvastata (näiteks kuna uuritav kemikaal võib olla enne uuringu lõppu lühikese poolestusaja tõttu juba 
kadunud), siis tuleks olla hoolikas, et vältida andmete väärtõlgendamist. 
Sellises olukorras tuleks uurida uuritava kemikaali (ja/või metaboliidi) jaotu ­
mist kudedes sel ajal, kui selle kontsentratsioon plasmas/veres on maksi ­
maalne (T
 max ) või kui selle väljutamine uriini kaudu on kõige kiirem, nagu 
on asjakohane (vt punkt 38). Lisaks sellele võib olla vajalik kudede kogu ­
mine täiendavatel ajahetkedel, et hinnata uuritava kemikaali ja/või selle metaboliitide kudedes jaotumise sõltuvust ajast (kui see on asjakohane), et hõlbustada massibilansi määramist ja/või täita pädeva ametiasutuse esitatud 
nõudeid. Kogutavate kudede hulka kuuluvad maks, rasvkude, magu ja 
soolestik, neerud, põrn, täisveri, korjusejäägid, sihtorgani koed, samuti tuleks koguda uuritava kemikaali toksikoloogilise hindamise jaoks võima ­
likku tähtsust omavaid muid kudesid (näiteks kilpnääre, erütrotsüüdid, 
suguelundid, nahk, silm (eelkõige pigmenteerunud loomade puhul)). Tuleks 
kaaluda täiendavate kudede analüüsi samadel ajahetkedel, et kasutada loomi maksimaalselt, samuti juhul, kui subkroonilise või kroonilise mürgisuse uuringutes täheldatakse mürgisust sihtorgani suhtes. Samuti tuleks teatada 
(radioaktiivsete) jääkide kontsentratsioon ning kudede ja plasma (vere) 
radioaktiivsuse suhtarvud.
 
38. Kudedes jaotumise hindamine täiendavatel ajahetkedel, näiteks siis, kui 
kontsentratsioon plasmas/veres on maksimaalne (näiteks T  max ) või kui välju ­
tamine uriini kaudu toimub suurima kiirusega, mis on kindlaks tehtud vasta ­
vate plasma/vere kineetika või väljutamise katsetega, võib samuti olla 
vajalik või seda võib nõuda pädev asutus. See teave võib olla vajalik mürgisuse mõistmiseks ning uuritava kemikaali ja metaboliidi bioakumulat ­
siooni ja püsivuse võimalikkuse hindamiseks. Tuleks esitada proovide valiku 
põhjendused; analüüsiproovid peaksid üldjuhul olema samad kui eespool 
nimetatud (vt punkt 37).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Kudedes jaotumise uuringutes võidakse radioaktiivsuse arvuline määramine 
teha vedelik-stsintillatsiooniloenduri (VSL) abil pärast seda, kui organid on 
välja lõigatud, homogeenitud, põletatud ja/või solubiliseeritud ning nende jäägid on kogutud ja viidud loendurisse. Praegu arendatakse mitut tehnilist meetodit, nagu kvantitatiivne kogu keha autoradiograafia ja retseptori 
mikroskoop-autoradiograafia, mis võivad osutuda kasulikuks uuritava kemi ­
kaali organites ja/või kudedes jaotumise määramisel (3, 4).
 
40. Muu kui suukaudse kokkupuute puhul tuleks koguda ja analüüsida 
konkreetseid kudesid, näiteks inhalatsiooniuuringute puhul kopse ja naha ­
kaudsete uuringute puhul nahka. Vt punktid 74–78.  
Metaboliseerimine  
41. Väljaheited (ja plasma, kui see on asjakohane) tuleks koguda muutumata 
uuritava kemikaali ja metaboliitide tuvastamiseks ja arvuliseks määramiseks, nagu on kirjeldatud punktides 44–49. Metaboliitide tuvastamise lihtsustami ­
seks on lubatav koondada ühe doosirühma väljaheited. Soovitatav on iga 
ajahetke jaoks määrata metaboliidiprofiil. Kui proovide ja/või radioaktiiv ­
suse puudumine seda ei võimalda, siis on lubatud koondada mitme ajahetke uriin ja fekaalid, kuid sugude- ja doosidevaheline koondamine ei ole lubatud. Uuritava kemikaaliga töödeldud loomade uriini, fekaalide, väljahin ­
gatud radioaktiivsuse ja sapi (kui see on asjakohane) analüüsimiseks tuleks 
kasutada sobivaid kvalitatiivseid ja kvantitatiivseid meetodeid.
 
42. Tuleks teha mõistlikud jõupingutused, et määrata kindlaks kõik metabo ­
liidid, mille kogus on vähemalt 5 % manustatud doosist, ning esitada uuri ­
tava kemikaali metaboliseerimise skeem. Tuleks kindlaks teha uuritavad 
kemikaalid, mida on väljaheidetes vähemalt 5 % manustatud doosist. Tuvas ­
tamine tähendab siin koostisainete täpse struktuuri määramist. Üldiselt toimub keemilise struktuuri määramine nii, et metaboliiti ja teadaolevaid 
võrdlusaineid kromatografeeritakse kahes erinevas süsteemis, või kasuta ­
takse meetodeid, mille abil on võimalik otse määrata keemilist struktuuri, näiteks massispektromeetria, tuumamagnetresonants jne. Kromatograafia puhul ei peeta metaboliidi struktuuri kahe meetodi abil tõendamisel piisa ­
vaks seda, kui kromatograafiat tehakse kahe erineva lahustisüsteemiga, kuid 
sama statsionaarse faasiga, kuna need meetodid ei ole sõltumatud. Kroma ­
tograafiline tuvastamine peaks toimuma kahe sõltumatu analüüsisüsteemiga, näiteks tavaline ja pöördfaasi õhukese kihi kromatograafia ning kõrgefek ­
tiivne vedelikkromatograafia (HPLC). Kui kromatograafiline eraldamine on 
piisava kvaliteediga, ei ole täiendav spektroskoopiline kinnitamine vajalik. Alternatiivselt võib ühese tuvastamise saavutada struktuuriteavet andvate meetoditega, näiteks vedelikkromatograafia pluss massispektromeetria (LC- 
MS) või vedelikkromatograafiaga tandemisse ühendatud massispektro ­
meetria (LC-MS/MS), gaaskromatograafia pluss massispektromeetria (GC- MS) ning tuumamagnetresonantsspektromeetria.
 
43. Kui ei ole võimalik tuvastada metaboliite, mida on vähemalt 5 % manus ­
tatud doosist, tuleks lõpparuandes seda põhjendada või selgitada. Võib olla 
asjakohane tuvastada sellised metaboliidid, mille kogus on vähem kui 5 % manustatud doosist, et ohu ja/või riski hindamiseks mõista paremini uuritava kemikaali metaboliseerimisteed. Võimaluse korral tuleks esitada struktuuri 
kinnitus. See võib hõlmata plasmas, veres või muudes kudedes tekkivate 
metaboliidiprofiilide esitamist.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Eritumine  
44. Tuleks kindlaks teha manustatud doosi eritumise kiirus ja ulatus; selleks 
mõõdetakse uriinis, fekaalides ja väljahingatud õhus leitud (radioaktiivse) doosi protsent. Neid andmeid saab kasutada ka massibilansi määramiseks. 
Uriini, fekaalide ja väljahingatud õhuga organismist väljunud uuritava kemi ­
kaali (radioaktiivsuse) kogused tuleks kindlaks määrata sobivate ajavahe ­
mike järel (vt punktid 47–49). Korduvdoosi katsed tuleks asjakohaselt kavandada, et eritumise andmete kogumisel oleks võimalik järgida punktis 
26 sätestatud eesmärke. See võimaldab võrdlemist ühe doosi katsetega.
 
45. Kui prooviuuringust selgub, et uuritavat kemikaali (radioaktiivsust) (punkti 
49 kohaselt) ei ole väljahingatud õhuga märkimisväärses koguses väljutatud, 
ei ole lõpliku uuringu ajal vaja väljahingatud õhku koguda.  
46. Iga loom tuleb paigutada eraldi metaboolsesse üksusesse väljaheidete (uriini, 
fekaalide) ja väljahingatud õhu kogumiseks. Iga kogumisajavahemiku lõpus (vt punktid 47–49) tuleks metaboolsed üksused asjakohase lahustiga lopu ­
tada (seda nimetatakse puuri loputamiseks), et tagada uuritava kemikaali 
(radioaktiivsuse) maksimaalne kogumine. Väljaheidete ja väljahingatud õhu kogumine tuleks lõpetada seitsme päeva möödudes või kui vähemalt 90 % manustatud doosist on kogutud, olenevalt sellest, kumb kriteerium 
enne täidetakse.
 
47. Uuritava kemikaali (radioaktiivsuse) summaarsed kogused uriinis määratakse 
kindlaks vähemalt kahel ajahetkel kogumise 1. päeva kohta, millest üks 
peaks olema 24 tundi pärast doseerimist, ja seejärel üks kord päevas kuni 
uuringu lõpuni. Soovitatav on 1. päeval kasutada rohkem kui kahte proovi kogumise ajahetke (näiteks 6, 12 ja 24 tundi pärast doseerimist) valimist. Prooviuuringute tulemusi tuleks analüüsida, et saada teavet proovi kogumise 
alternatiivsete või täiendavate ajavahemike kohta. Kogumise ajakava tuleks 
põhjendada.
 
48. Uuritava kemikaali (radioaktiivsuse) summaarsed kogused fekaalides tuleks 
kindlaks määrata iga päev pärast 24 tunni möödumist manustamisest kuni 
uuringu lõpuni, v.a juhul, kui prooviuuringutest tuleneb, et kogumiseks tuleb 
kasutada muid või täiendavaid ajavahemikke. Kogumise alternatiivset ajakava tuleks põhjendada.
 
49. Väljahingatud CO  2 ja muude lenduvate materjalide kogumise võib 
konkreetses uuringus peatada, kui väljahingatud õhus leitakse pärast 24- tunnist kogumist vähem kui 1 % manustatud doosist.
 
Mõju ajast sõltuvuse uuringud  
Plasma/vere kineetika  
50. Kõnealuste uuringute eesmärk on hinnata uuritava kemikaali peamised 
toksiko-kineetilised parameetrid (näiteks C  max , T  max , poolestusaeg (t  1/2 ), 
plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune 
pindala (AUC)). Kõnealused uuringud võib teha ühe doosiga või tõenäoli ­
semalt kahe või enama doosiga. Doosid tuleks valida eksperimendi laadi ja/või uuritava probleemküsimuse alusel. Kineetilised andmed võivad olla vajalikud, et lahendada selliseid küsimusi nagu uuritava kemikaali biosaa ­
davus ja/või selgitada, kuidas kehast väljutamine sõltub doosist (näiteks 
selgitada, kas väljutamisel esineb küllastumine alates mingist doosist).
 
51. Kõnealuste uuringute puhul tuleks kasutada doosirühmas vähemalt nelja 
ühest soost looma. Kasutatud loomade soo valikut tuleks põhjendada. 
Tuleks kaaluda mõlema soo kasutamist (neli isas- ja neli emaslooma), kui 
on tõendeid, et mürgisus oleneb oluliselt soost.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Pärast (radiomärgistatud) uuritava kemikaali manustamist tuleks igalt 
loomalt võtta sobival ajal vereproovid, kasutades asjakohast proovivõtu 
metoodikat. Loomalt võetavate vereproovide kogus ja arv võib olla piiratud korduva proovivõtu võimaliku mõjuga looma tervisele/füsioloogiale ja/või analüüsimeetodi tundlikkusega. Iga looma proove tuleks analüüsida eraldi. 
Mõnikord (näiteks metaboliidi iseloomustamine) võib olla vajalik rohkem 
kui ühe looma proovide koondamine. Koondatud proovid tuleks selgelt märgistada ja esitada koondamise selgitus. Kui kasutatakse radiomärgistatud uuritavat kemikaali, siis võib olla vajalik esineva koguradioaktiivsuse 
analüüs. Kui see on nii, tuleks radioaktiivsust analüüsida täisveres ja 
plasmas või plasmas ja punastes verelibledes, et oleks võimalik arvutada vere ja plasma omavahelist suhet. Muudel juhtudel võivad olla vajalikud täpsemad uuringud, mille puhul on vaja määrata lähteühendit ja/või meta ­
boliite või hinnata nende seostumist valkudega.
 
Muude kudede kineetika  
53. Kõnealuste uuringute eesmärk on hankida teavet mõju ajast sõltuvuse kohta, 
et saada vastused sellistele küsimustele nagu mürgisuse mehhanism, bioa ­
kumulatsioon ja biopüsivus, milleks määratakse kindlaks uuritava kemikaali 
sisaldus eri kudedes. Kudede ja hindamisajavahemike valik oleneb käsitle ­
tavast küsimusest ning uuritava kemikaali toksikoloogilisest andmebaasist. Kõnealuse täiendavate kudede kineetikauuringu kavandamisel tuleks võtta arvesse kogutud teavet, nagu on kirjeldatud punktides 37–40. Kõnealused 
uuringud võivad hõlmata ühe või mitme doosi manustamist. Kasutatavat 
lähenemisviisi tuleks üksikasjalikult põhjendada.
 
54. Muude kudede kineetiliste uuringute tegemise võimalikud põhjused on järg ­
mised:  
— tõendid pikendatud poolestusaja kohta veres, mis viitab uuritava kemi ­
kaali võimalikule kogunemisele mitmesugustes kudedes, või  
— vajadus kindlaks teha, kas konkreetses koes on saavutatud statsionaarne 
olek (näiteks korduvdoosi uuringutes; kuigi veres võib uuritava kemi ­
kaali kontsentratsiooniga olla saavutatud statsionaarne olek, võib pakkuda huvi küsimus, kas statsionaarne olek on saavutatud ka sihtku ­
dedes).
 
55. Seda tüüpi mõju ajast sõltuvuse uuringutes tuleks asjakohane uuritava kemi ­
kaali doos manustada suukaudselt vähemalt neljale loomale iga doosi ja iga määratud ajahetke kohta ning tuleks jälgida valitud kudedes jaotumise ajalist 
kulgu. Võib kasutada ainult ühte sugu, v.a juhul, kui on täheldatud mürgi ­
suse sõltuvust soost. See, kas analüüsitakse summaarset radioaktiivsust või lähtekemikaali ja/või metaboliite, oleneb ka probleemküsimusest, millega tegeldakse. Kudedes jaotumist tuleks hinnata asjakohaste meetodite abil.
 
Ensüümide induktsioon või inhibeerimine  
56. Ensüümide induktsiooni (sünteesi esilekutsumise) või inhibeerimise võima ­
liku mõju uurimine või uuritava kemikaali biotransformatsiooni uurimine võib olla vajalik järgmistel juhtudel:
 
1) olemasolevad tõendid osutavad, et uuritava kemikaali mürgisust 
suurendab biotransformatsioon;  
2) olemasolevad tõendid osutavad, et metaboliseerimine ei sõltu doosist 
lineaarselt;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3) metaboliitide määramise uuring näitab võimaliku mürgise metaboliidi 
olemasolu, mis võib olla tekkinud uuritava kemikaali poolt indutseeritud 
ensümaatilise raja kaudu;  
4) on vaja kontrollida hüpoteesi, et uuritava kemikaali mõju on seotud 
ensüümi induktsiooni nähtustega;  
5) kui uuritava kemikaali metaboliseerimise profiilis täheldatakse kas märki ­
misväärseid toksikoloogilisi muutusi  in vitro  või in vivo  katsetes muude 
liikidega või muudes tingimustes, võib olla vajalik asjakohas(t)e ensüü ­
mi(de) iseloomustamine (näiteks I faasi ensüümid, nagu tsütokroom P450-sõltuva monooksügenaasi süsteemi isoensüümid, II faasi ensüümid, nagu sulfotransferaasi isoensüümid või uridiindifosfaat-glükuronosüül- 
transferaasi isoensüümid või muud asjakohased ensüümid). Seda teavet 
võib kasutada, et hinnata mehhanismide liigilt liigile ülekandmise luba ­
tavust.
 
57. Uuritava kemikaaliga seotud toksiko-kineetiliste muutuste hindamiseks 
tuleks kasutada sobilikke nõuetekohaselt valideeritud ja põhjendatud katse-eeskirju. Näidisuuringuprojekt hõlmab märgistamata uuritava kemikaa ­
liga korduvdoosi manustamist, millele järgneb ühekordne radiomärgistatud 
doos 14. päeval või radiomärgistatud uuritava kemikaaliga korduvdoos ning 
proovide võtmine 1., 7. ja 14. päeval metaboliidiprofiilide kindlaksmäära ­
miseks. Radiomärgistatud uuritava kemikaali dooside korduv manustamine võib anda teavet ka bioakumulatsiooni kohta (vt punkt 26).
 
TÄIENDAVAD LÄHENEMISVIISID  
58. Muud lähenemisviisid, mis täiendavad käesolevas katsemeetodis kirjeldatud  
in vivo  katseid, võivad teatavate liikide puhul anda kasulikku teavet uuritava 
kemikaali imendumise, jaotumise, metaboliseerimise või organismist kõrval ­
damise kohta.  
In vitro  teabe kasutamine  
59. Mitmeid uuritava kemikaali metaboliseerimise küsimusi on võimalik käsit ­
leda in vitro  uuringutes, kasutades asjakohaseid katsesüsteeme. Võimalike 
metaboliitide uurimiseks võib kasutada maksa subtsellulaarse tasandi osakesi (näiteks mikrosoome ja tsütosooli või S9-fraktsiooni) ja värskelt eraldatud 
või kultuuris kasvatatud hepatotsüüte. Riskihindamisel võib huvi pakkuda 
lokaalne metaboliseerimine sihtorganis, näiteks kopsus. Selleks otstarbeks võib olla kasulik sihtkoe mikrosoomide fraktsioon. Mikrosoomiuuringud võivad olla kasulikud võimalike sooliste ja vanuseliste erinevuste selgitami ­
seks ning aidata leida ensüümiparameetreid (K
 m ja V  max ), mis võivad aidata 
hinnata metaboliseerimise sõltuvust doosist, arvestades kokkupuutetasemeid. Lisaks võivad mikrosoomiuuringud aidata määrata konkreetseid mikrosoo ­
miensüüme, mis osalevad uuritava kemikaali metaboliseerimises ja mille 
mõju võib vahest oletada ka muude liikide puhul (vt ka punkt 56). Biotrans ­
formatsiooni induktsiooni võimalust võib samuti uurida, kasutades selliste loomade maksa subtsellulaarseid fraktsioone (näiteks mikrosoome ja tsüto ­
sooli), keda on eelnevalt töödeldud asjakohase uuritava kemikaaliga, tehes 
hepatotsüütide induktsiooni  in vitro  uuringuid või kasutades teatavaid raku ­
liine, milles sünteesitakse asjaomaseid ensüüme. Teatavatel asjaoludel ja sobivates tingimustes võib kaaluda inimkudedest pärinevate subtsellulaarsete fraktsioonide kasutamist biotransformatsiooni võimalike liigierinevuste kind ­
lakstegemiseks.  In vitro  uuringud võivad olla kasulikud ka füsioloogial 
põhinevate toksikokineetika mudelite koostamiseks (5).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Nahakaudse imendumise  in vitro  uuringutest võib saada lisateavet imendu ­
mise iseloomustamiseks (6).  
61. Samasuguste küsimuste lahendamiseks, milleks kasutatakse maksa mikro ­
soome, võib kasutada ka maksa primaarsete rakkude kultuure ja värske koe lõikeid. Mõnikord võib konkreetsele küsimusele vastuse leidmiseks 
kasutada rakuliini, mille puhul asjakohase ensüümi ekspressioon on tõen ­
datud, või insenergeneetilist rakuliini. Mõnel juhul võib olla kasulik uurida  
in vitro  konkreetsete tsütokroomi P450 isosüümide (näiteks CYP1A1, 2E1, 
1A2 ja muud) ja/või II faasi ensüümide induktsiooni ja inhibeerimist lähteü ­
hendi poolt. Saadud teave võib olla kasulik samalaadse struktuuriga ühen ­
dite puhul.
 
Mürgisusuuringute toksiko-kineetiliste andmete kasutamine lisateabena  
62. Muude mürgisuse uuringute käigus saadud vere, kudede ja/või väljaheidete 
proovide analüüsist võib saada andmeid biosaadavuse, plasma kontsentrat ­
siooni ajast sõltuvuse (plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse 
kõvera alune pindala (AUC), C  max ), bioakumulatsiooni võimalikkuse, klii ­
rensi kiiruse ning metaboliseerimise ja kineetika sooliste erinevuste või vanuseliste muutuste kohta.
 
63. Uuringu projekti kavandamist võib kasutada vastuste leidmiseks küsimus ­
tele, mis on seotud järgmisega: imendumise küllastumine, biotransformat ­
sioon või väljutamise teed suuremate dooside korral; uute metaboliseerimis ­
radade sisselülitumine suurematel doosidel ning mürgiste metaboliitide 
esinemine vaid suurematel doosidel.  
64. Muud ohu hindamisega seotud küsimused võivad olla näiteks järgmised:  
— tundlikkuse sõltuvus vanusest seoses hematoentsefaalse barjääri, neerude 
ja/või detoksifitseerimisvõime ealiste muutustega;  
— erinev tundlikkus alampopulatsioonides biotransformatsioonivõime või 
muude toksiko-kineetiliste erinevuste tõttu;  
— kokkupuute ulatus loote puhul, kuna kemikaal suudab läbida platsentat, 
või vastsündinu puhul, kuna kemikaal läheb rinnapiima sisse.  
Toksiko-kineetilise modelleerimise kasutamine  
65. Toksiko-kineetilised mudelid võivad olla kasulikud ohu ja riski hindamise 
erinevate tahkude jaoks, näiteks süsteemse kokkupuute ning koesisese doosi ennustamine. Lisaks sellele võidakse käsitleda toimeviisiga seotud konkreet ­
seid küsimusi ja need mudelid võivad olla aluseks andmete ekstrapoleeri ­
misel muudele liikidele, kokkupuuteteedele ja doseerimismustritele ning 
aidata hinnata inimest ohustavat riski. Uuritava kemikaali füsioloogial põhi ­
neva toksiko-kineetilise mudeli koostamiseks kasulikud andmed on iga liigi puhul järgmised: 1) jaotuskoefitsiendid, 2) biokeemilised konstandid ja 
füsioloogilised parameetrid, 3) manustamisteest sõltuvad imendumise para ­
meetrid ning 4)  in vivo  kineetilised andmed mudeli hindamiseks (näiteks 
asjakohaste (> 10 %) väljutamisteede kaudu organismist väljaviimise (klii ­
rensi) parameetrid, metaboliseerimise K
 m ja V  max ). Mudeli koostamisel 
kasutatavad katseandmed tuleks saada teaduslikult põhjendatud meetodeid 
kasutades ning mudeli tulemused tuleks valideerida. Sageli määratakse uuri ­
tava kemikaali ja liigipõhised parameetrid, näiteks imendumise kiirused, veres ja kudedes jaotumise ning metaboliseerimise kiiruse konstandid, et 
lihtsustada mittekompartmentaalsete või füsioloogial põhinevate mudelite 
koostamist (7).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
66. Uuringu protokoll soovitatakse varustada sisukorraga.  
Protokolli tekstiosa  
67. Protokolli tekstiosa peaks sisaldama kõnealuse katsemeetodiga hõlmatud 
teavet, mis on jaotatud osadesse ja lõikudesse järgmiselt.  
Kokkuvõte  
68. See uuringuprotokolli osa peaks sisaldama uuringuprojekti ülevaadet ja 
kasutatud meetodite kirjeldust. Selles tuleks samuti tuua esile peamised tulemused, mis on seotud massibilansi, metaboliitide laadi ja olulisuse, kudedes olevate jääkide, kliirensi kiirusega, bioakumulatsiooni võimalik ­
kuse, sooliste erinevustega jne. Ülevaade tuleks esitada piisavalt üksikasja ­
likult, et uuringu tulemusi oleks võimalik hinnata.
 
Sissejuhatus  
69. See uuringuprotokolli osa peaks sisaldama uuringu eesmärke, põhjendust ja 
kava ning asjakohaseid viiteid ja taustteavet.  
Materjalid ja meetodid  
70. Selles uuringuprotokolli osas tuleks esitada kogu asjakohase teabe üksikas ­
jalik kirjeldus, mis hõlmab järgmist.  
a) Uuritav kemikaal  
Selles jaotises tuleks esitada uuritava kemikaali tunnusandmed: keemiline 
nimetus, molekuli struktuur, keemilise koostise kvalitatiivne ja kvantita ­
tiivne määramine, keemiline puhtus ja võimaluse korral lisandite tüüp ja kogused. Samuti esitatakse teave füüsikaliste ja keemiliste omaduste 
kohta, sh füüsikaline olek, värvus, lahustuvus ja/või jaotuskoefitsient, 
stabiilsus ja vajaduse korral söövitav toime. Kui see on kohaldatav, tuleks esitada isomeere käsitlev teave. Radiomärgistatud uuritava kemi ­
kaali kohta tuleks selles jaotises esitada järgmine teave: radionukliidi 
tüüp, märgise asukoht, eriaktiivsus ja radiokeemiline puhtus.
 
Tuleks esitada kandeaine, lahjendusvedeliku, suspendeerimisvahendi ja 
emulgaatori või muude uuritava kemikaali manustamisel kasutatavate 
materjalide tüüp või kirjeldus.  
b) Katseloomad  
Selles jaotises peaks olema teave katseloomade, sh nende valimise kohta; 
tuleks põhjendada, miks valiti konkreetne liik, liin ja loomade vanus uuringu alguses, sugu, ning esitada andmed kehakaalu, tervisliku 
seisundi ja loomade pidamise tingimuste kohta.
 
c) Meetodid  
See jaotis peaks sisaldama andmeid uuringu kava ja kasutatud meetodi 
kohta. Tuleks kirjeldada järgmist:  
1) kokkupuutetee ja -tingimuste kõigi muudatuste põhjendus, kui see 
on kohaldatav;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2) doositasemete valiku põhjendus;  
3) põhiuuringu eksperimentaalse osa kavandamiseks tehtud prooviuu ­
ringute kirjeldus, kui see on kohaldatav. Tuleks esitada prooviuu ­
ringu alusandmed;  
4) kuidas valmistati doseerimislahus ning lahusti või kandeaine tüüp, 
kui seda kasutati;  
5) katserühmade arv ja loomade arv rühmas;  
6) doositasemed ja kogus (ning doosi eriaktiivsus, kui kasutati radio ­
aktiivset märgist);  
7) manustamistee(d) ja -meetodid;  
8) manustamise sagedus;  
9) näljutamise ajavahemik (kui loomi näljutati);  
10) summaarne radioaktiivsus looma kohta;  
11) loomade kohtlemine;  
12) proovide kogumine ja ettevalmistamine;  
13) metaboliitide eraldamiseks, koguse määramiseks ja kindlakstege ­
miseks kasutatud analüüsimeetodid;  
14) kasutatud meetoditega tuvastamise piir;  
15) muud kasutatud eksperimentaalsed mõõtmised ja protseduurid (sh 
metaboliitide analüüsi meetodite valideerimine).  
d) Statistiline analüüs  
Kui uuringutulemuste analüüsimiseks kasutati statistilist analüüsi, tuleks 
lisada piisav teave kasutatud analüüsimeetodi ja arvutiprogrammi kohta, 
et sõltumatu hindaja või statistik saaks analüüsi uuesti hinnata ja rekons ­
trueerida.  
Kui tehakse süsteemi modelleerimise uuringuid, nagu füsioloogial põhi ­
neva toksikokineetika mudeli uuring, tuleks mudel esitada koos täieliku kirjeldusega, et mudelit saaks sõltumatult rekonstrueerida ja valideerida (vt punkt 65 ja liide „Mõisted”)
 
Tulemused  
71. Kõik andmed tuleks esitada tabelites koos asjakohase statistilise töötlusega, 
andmete kokkuvõte tuleks esitada kõnealuse jaotise tekstiosas. Uuringu jaoks asjakohasel viisil tuleks esitada radioaktiivsuse loendusandmete 
kokkuvõte; üldiselt esitatakse andmed mikro- või milligrammekvivalenti ­
dena proovi massiühiku kohta, kuid võib kasutada ka muid ühikuid. Selles jaotises tuleks tulemused esitada graafiliselt, lisada tüüpilised kromatograafia ja spektromeetria graafilised andmed, metaboliitide tuvastamise ja kvantita ­
tiivse määramise graafikud, oletatavad metaboliseerimisteed, sh metabolii ­
tide molekulaarne struktuur. Kõnealuses jaotises esitatakse veel järgmine teave, kui see on kohaldatav:
 
1) radioaktiivsuse kogus ja taasleitud radioaktiivsuse protsent uriinis, fekaa ­
lides, väljahingatud õhus ning uriini ja fekaale sisaldavas puuriloputus ­
vedelikus.  
— Nahakaudse uuringu puhul tuleks samuti lisada andmed manustamis ­
koha nahast ja nahaloputusest uuritava kemikaali taasleidmise kohta ning jääkradioaktiivsuse kohta nahka katnud seadmetes ja metaboli ­
seerimise uurimise üksuses ning samuti nahaloputusuuringu tule ­
mused. Üksikasjalikuma käsitluse kohta vt punktid 74–77.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— Inhalatsiooniuuringute puhul lisage samuti andmed uuritava kemi ­
kaali taasleidmise kohta kopsudes ja nina kudedes (8). Üksikasjali ­
kuma käsitluse kohta vt punkt 78;  
2) jaotus kudedes protsendina manustatud doosist ja kontsentratsioonina 
(mikrogramm-ekvivalente koe grammi kohta) ning koes ja veres leiduva kemikaali või koes ja plasmas leiduva kemikaali suhtena;
 
3) materjalibilanss, mis on arvutatud igast uuringust, mis hõlmab kehaku ­
dede ja väljaheidete analüüsimist;  
4) plasmakontsentratsioonid ja toksiko-kineetilised parameetrid (biosaa ­
davus, plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala (AUC), Cmax, Tmax, kliirens, poolestusaeg) pärast asjakohas(t)e 
kokkupuutetee(de) kaudu manustamist;
 
5) uuritava kemikaali imendumise kiirus ja ulatus pärast asjakohas(t)e 
kokkupuutetee(de) kaudu manustamist;  
6) väljaheidetest kogutud uuritava kemikaali ja metaboliitide kogused 
(väljendatuna manustatud doosi protsendina);  
7) viide liite andmetele, mis sisaldavad kõiki mõõdetud näitajate andmeid 
iga üksiku looma kohta (näiteks doosi manustamine, taasleitud koguse 
protsent, kontsentratsioonid, toksiko-kineetilised parameetrid jne);  
8) väljapakutud metaboliseerimisteede joonis ning metaboliidimolekulide 
struktuurid.  
Arutelu ja järeldused  
72. Selles jaotises peaks(id) autor(id)  
1) esitama uuritava kemikaali metaboliseerimistee, toetudes metaboliseeri ­
mise ja organismist kõrvaldamise tulemustele;  
2) käsitlema uuritava kemikaali organismist kõrvaldamise ja/või biotransfor ­
matsiooni kõiki võimalikke liikide- ja sugudevahelisi erinevusi;  
3) esitama tabelina andmed metaboliitide tuvastamise ja koguste, kliirensi ja 
bioakumulatsiooni võimalikkuse kohta, lähteaine ja/või metaboliidi/meta ­
boliitide jääkide taseme kohta kudedes ning toksikokineetika parameetrite võimaliku doosist sõltuva muutumise kohta, nagu on asjakohane, ja arutama kõike nimetatut;
 
4) lisama kõnealusesse jaotisesse kõik asjakohased mürgisuse uuringutest 
saadud toksiko-kineetilised andmed;  
5) esitama lühikese järelduse, mida toetavad kõnealuse uuringu tulemused;  
6) lisama jaotisi (kui see on vajalik või asjakohane).  
73. Kirjanduse andmete, tabelite, jooniste, liidete jne lisamiseks tuleks kasutada 
täiendavaid jaotisi.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATIIVSED KOKKUPUUTETEED  
Nahakaudne  
Nahakaudne töötlemine  
74. Selles jaotises esitatakse üksikasjalik teave uuritava kemikaali toksikokinee ­
tika uurimise kohta nahakaudse kokkupuute korral. Nahakaudse imendumise 
kohta tuleks vaadata käesoleva lisa peatükki B.44 („Nahakaudne imendu ­
mine:  in vivo  meetod” (9)). Muude näitajate puhul, näiteks jaotumine ja 
metaboliseerimine, võib kasutada käesolevat katsemeetodit B.36. Naha ­
kaudsel töötlemisel tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte või enamat 
doositaset. Uuritav kemikaal (st puhas, lahjendatud või segu koostisse viidud materjal, mis sisaldab nahale kantavat uuritavat kemikaali) peaks olema sama, millega inimene või muu loomaliigi esindaja võib kokku puutuda 
(või selle lähedane aseaine). Doositase(med) tuleks valida kooskõlas käes ­
oleva katsemeetodi punktidega 20–26. Asjaolud, mida võiks nahakaudse doosi valimisel arvesse võtta, on eeldatav inimeste kokkupuude ja/või doosid, mille juures muudes nahakaudsete mürgisuse uuringutes täheldati 
mürgisust. Nahakaudne (nahakaudsed) doos(id) tuleks vajaduse korral lahus ­
tada sobivas kandeaines ning peale kanda mahus, mis on piisav doosi manustamiseks. Vahetult enne katset eemaldatakse pügamise teel katse ­
looma keha seljaosalt karvkate. Võib kasutada raseerimist, kuid seda tuleb 
teha umbes 24 tundi enne uuringu algust. Karvkatte pügamisel või raseeri ­
misel tuleks vältida naha marrastamist, kuna see võib mõjutada naha läbi ­
laskvust. Uuritava kemikaali manustamiseks tuleks paljastada ligikaudu 10 % keha pinnast. Väga toksilise aine puhul võib kasutada väiksemat 
nahapinda kui ligikaudu 10 %, kuid võimalikult suur osa alast tuleks katta 
õhukese ja ühtlase kihiga. Kõigi nahakaudse kokkupuute katserühmade puhul tuleks kasutada sama töötlemise pindala. Doosiga kaetud alasid tuleb kaitsta sobiva kattega, mis kinnitatakse paigale. Loomi tuleks pidada 
eraldi.
 
75. Tuleks teha naha pesemise uuring, et hinnata pealekantud uuritava kemikaali 
kogust, mida on võimalik töödeldud nahalt pehmetoimelise seebi ja veega 
pesemise teel eemaldada. Uuritava kemikaali nahakaudse manustamise 
korral võib kõnealune uuring aidata koostada ka massibilanssi. Kõnealuse naha pesemise uuringu jaoks tuleks kahele loomale kanda peale üks doos uuritavat kemikaali. Doositase valitakse vastavalt käesoleva katsemeetodi 
punktile 23 (vt ka nahaga kokkupuute aja käsitlus, punkt 76). Pesemisel 
maha tulevad uuritava kemikaali kogused tuleks määrata, et hinnata, kui tõhus on uuritava kemikaali eemaldamine pesemise teel.
 
76. Uuritav kemikaal tuleks kanda nahale ja hoida seda nahal vähemalt kuus 
tundi, kui seda ei välista kemikaali söövitav toime. Pärast katte eemaldamist tuleks töödeldud pinda pesta, järgides naha pesemise uuringu jaoks kirjel ­
datud korda (vt punkt 75). Nii katet kui ka pesuvedelikku tuleks analüüsida 
uuritava kemikaali jääkide kindlakstegemiseks. Uuringu lõpus tuleks iga 
loom kooskõlas punktiga 2 humaansel viisil surmata ja töödeldud nahk tuleks eemaldada. Töödeldud naha asjakohast osa tuleks analüüsida, et määrata kindlaks uuritava kemikaali jäägid (radioaktiivsus).
 
77. Ravimite toksiko-kineetiliseks hindamiseks võivad vajalikud olla erinevad 
protseduurid kooskõlas asjakohase õigusraamistikuga.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Hingamisteede kaudu  
78. Tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte kontsentratsiooni (või vajaduse 
korral mitut kontsentratsiooni). Kontsentratsioon(id) tuleks valida kooskõlas käesoleva katsemeetodi punktidega 20–26. Sissehingamise teel manustamine 
tehakse nn ninakoonuse või ainult peaseadme abil, et vältida imendumist 
muude kokkupuuteteede kaudu (8). Kui kasutatakse muid sissehingamise teel toimuva kokkupuute tingimusi, tuleks tingimuste muutmine dokumen ­
teerida. Sissehingamise teel toimuva kokkupuute kestus tuleks kindlaks 
määrata; tavaline kokkupuuteaeg on 4–6 tundi.
 
KIRJANDUS  
1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manu ­
factured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.  
2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series 
on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the 
pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regu ­
latory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81.  
4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25–40.
 
5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt 
W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411.
 
6) Käesoleva lisa peatükk B.45 „Nahakaudne imendumine:  in vitro  meetod”.  
7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organiza ­
tion, International Programme on Chemical Safety.  
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9) Käesoleva lisa peatükk B.44 „Nahakaudne imendumine:  in vivo  meetod”.  
10) Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural 
Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.  
11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Liide  
MÕISTED  
ADME  – lühend sõnadest  Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion  
(imendumine, jaotumine, metaboliseerimine ja väljutamine).  
Akumulatsioon  (bioakumulatsioon) – uuritava kemikaali koguse suurenemine 
aja jooksul kudedes (tavaliselt rasvkoes, korduva kokkupuute korral); kui uuri ­
tava kemikaali kehasse sisenemise kiirus on suurem kui kehast väljaviimise kiirus, siis organism akumuleerib uuritavat kemikaali ja võib tekkida uuritava 
kemikaali toksiline kontsentratsioon.
 
Analoogmeetod  – ühe või enama kemikaali näitajaid käsitleva teabe kasutamine 
sihtkemikaali näitajate prognoosimiseks.  
AUC  (plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala) – 
plasmas oleva uuritava aine kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alune pindala. See vastab eelnevalt kindlaks määratud aja jooksul kehasse imendunud uuritava kemikaali üldkogusele. Lineaarsetes tingimustes on AUC (aja nullpunk ­
tist lõpmatuseni) võrdelises sõltuvuses kehasse imendunud uuritava kemikaali 
summaarsest kogusest, olenemata imendumise kiirusest.
 
Autoradiograafia  (kogu keha autoradiograafia) – seda kasutatakse koes radio ­
aktiivse uuritava kemikaali asukoha kvalitatiivseks ja/või kvantitatiivseks kind ­
laksmääramiseks; selle meetodi puhul kasutatakse röntgenfilmi või viimasel ajal digitaalseid fosforkujutisi, et visualiseerida radioaktiivselt märgistatud molekule 
või molekuliosi, salvestades uuritava objekti kiiratud radioaktiivsuse. Kvantita ­
tiivsel kogu keha autoradiograafial võivad uuritava kemikaali jaotumise hinda ­
misel ning kudedes radioaktiivse aine taasleitud üldkoguse ja lahutusvõime 
hindamisel olla mõned eelised võrreldes organite lahkamisega. Üks oluline 
eelis näiteks on võimalus kasutada seda pigmenteeritud loomamudeli puhul, et hinnata uuritava kemikaali võimalikku sidumist melaniiniga, mis võib teatavaid molekule siduda. Kuigi see meetod võib suure mahu ja vähese afiinsusega sidu ­
miskohtadest kogu kehas ülevaate saamiseks olla kasulik, võib meetod olla 
piiratud konkreetsete sihtobjektide tuvastamisega, näiteks retseptorsidumiskoh ­
tade tuvastamisega, mille puhul tuvastamiseks on vaja suhteliselt suurt eraldus ­
võimet ja tundlikkust. Kui kasutatakse autoradiograafiat, tuleks manustatud 
ühendi massibilansi määramiseks kavandatud katsed teha eraldi rühmas või eraldi 
uuringuna kudedes jaotumise katsest, kus kõik väljaheited (mis võivad samuti hõlmata väljahingatud õhku) ja terved korjused homogeenitakse ja neid analüü ­
sitakse vedelik-stsintillatsiooniloenduri abil.
 
Bioakumulatsioon  – vaata „akumulatsioon”.  
Biopüsivus  – vt „püsivus”.  
Biosaadavus  – manustatud doosi osa, mis jõuab süsteemsesse ringlusse või mis 
on füsioloogilise aktiivsuse kohas kättesaadav. Tavaliselt viitab uuritava kemi ­
kaali biosaadavus lähteühendile, kuid see võib viidata ka lähteühendi metabolii ­
dile. Tegemist on ainult ühe keemilise vormiga.  Tähelepanu!  Biosaadavus ei ole 
sama, mis imendumine. Erinevus näiteks suukaudse imendumise (s.o olemasolu soolestiku seintes ja portaalringes) ja biosaadavuse (s.o olemasolu üldises vere ­
ringes ja kudedes) vahel võib muude tegurite hulgas (10) tekkida sellest, et soolte 
seinad metaboliseerivad (lagundavad) kemikaali, et kemikaal liigub väljavoolu ­
transpordiga tagasi soolevalendikku või et kemikaal metaboliseeritakse maksas enne üldisse vereringesse sattumist. Mürgise komponendi (lähteühend või meta ­
boliit) biosaadavus on inimest ohustava riski hindamisel ülioluline näitaja (suurelt 
väikesele doosile ekstrapoleerimine, ühelt kokkupuuteviisilt teisele ekstrapoleeri ­
mine), mida kasutatakse välise täheldatava kahjuliku toimeta doosi või võrdlus ­
doosi (kasutatud doos) alusel sisemise väärtuse tuletamiseks. Maksa mõju uuri ­
miseks suukaudsel manustamisel piisab suukaudsest imendumisest. Kõigi muude 
mõjude puhul peale sisenemistee mõju on biosaadavus üldiselt usaldusväärsem 
näitaja edasises riskihindamises kasutamiseks kui imendumine.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Biotransformatsioon  – asjakohase uuritava kemikaali (tavaliselt ensüümide 
toimel) keemiline muundamine kehas teiseks kemikaaliks. Sünonüümne metabo ­
liseerimisega.  
C max – kas maksimaalne (tipp)kontsentratsioon veres (plasma/seerum) pärast 
manustamist või maksimaalne (tipp)kontsentratsioon väljutamisel (uriinis või fekaalides) pärast manustamist.
 
Detoksifitseerimise teed  – etapid, mis viivad mürgiste kemikaalide kehast 
kõrvaldamisele kas metaboliseerimise või väljutamise teel.  
Eksogeenselt  – manustatud väljastpoolt organismi või süsteemi, tekkinud väljas ­
pool organismi või süsteemi.  
Ekstrapoleerimine  – ühe või enama tundmatu väärtuse tuletamine selle alusel, 
mis on juba teada või mida on täheldatud.  
Ensüümide parameetrid  – K  m : Michaelise konstant ning V  max : maksimum ­
kiirus.  
Ensüümid/isosüümid  – valgud, mis toimivad keemiliste reaktsioonide katalü ­
saatoritena. Isosüümid on ensüümid, mis katalüüsivad samalaadseid keemilisi 
reaktsioone, kuid mille aminohapete järjestus on erinev.  
Imendumine  – protsess(id), mille kaudu kemikaal tungib kudedesse või läbi 
kudede. Imendumisel peetakse silmas lähteühendit ja selle kõiki metaboliite. Seda ei tohiks segi ajada biosaadavusega.
 
Induktsioon / ensüümi induktsioon  – ensüümi süntees keskkonnastiimuli või 
esilekutsuva molekuli tõttu.  
Jaotumine  – uuritava kemikaali ja selle derivaatide hajumine organismis.  
Jaotumine kudedes  – uuritava kemikaali pöörduv liikumine ühest asukohast 
kehas teise. Jaotumist kudedes on võimalik uurida organite lahkamise, homogee ­
nimise, põletamise ja vedelik-stsintillatsiooniloenduri abil või kvalitatiivse ja/või kvantitatiivse kogu keha autoradiograafia abil. Esimene nimetatud meetod võimaldab leida kudedes ja sama looma korjusejääkides kontsentratsiooni ning 
sealt taasleidmise protsendi, kuid selle eraldusvõime ei pruugi olla piisav kõigi 
kudede jaoks ning summaarse taasleidmise jaoks (< 90 %) ei pruugi see parim lahendus olla. Vt summaarse taasleidmise selgitus eespool.
 
Jaotuskoefitsient  – see näitaja iseloomustab kemikaali erinevat lahustuvust 
kahes lahustis.  
Kliirens  – selle kiiruse kvantitatiivne näitaja, millega uuritav kemikaal verest, 
plasmast või teatavast koest ajaühiku kohta kõrvaldatakse.  
Kompartment  – keha, koe või raku struktuurne või biokeemiline osa (või 
üksus), mis asub ülejäänust eraldi.  
Küllastatus  – seisund, milles üks või mitu kineetilist protsessi (näiteks imendu ­
mine, metaboliseerimine või kliirens) on maksimumis („küllastatud”).  
Lineaarsus / lineaarne kineetika  – protsessi kineetika on lineaarne, kui kõik 
kompartmentidevahelise ülekande kiirused on võrdelised olemasoleva koguse või 
kontsentratsiooniga, s.o esimest järku. Sel juhul on uuritava kemikaali kliirensi ja 
jaotunud kogused, samuti poolestusajad, konstantsed. Saavutatud kontsentrat ­
sioonid on võrdelised annustamise määraga (kokkupuutega) ja akumulatsioon on kergemini ennustatav. Lineaarsust/mittelineaarsust on võimalik hinnata, kui 
võrreldakse omavahel asjakohaseid parameetreid, näiteks uuritava aine kontsen ­
tratsiooni plasmas ja plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera alust pindala (AUC) pärast erinevaid doose või pärast ühekordset ja korduvat kokku ­
puudet. Doosist sõltuvuse puudumine võib viidata ühendi metaboliseerimises 
osalevate ensüümide küllastatusele; plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltu ­
vuse kõvera aluse pindala (AUC) suurenemine pärast korduvat kokkupuudet, võrreldes ühekordse kokkupuutega, võib viidata metaboliseerimise inhibeerimi ­
sele ning plasmas oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse kõvera aluse 
pindala (AUC) vähenemine võib viidata metaboliseerimise induktsioonile (vt ka 
punkt 11).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Manustamistee  (suukaudne, intravenoosne, nahakaudne, sissehingamine jne) – 
viitab viisile, kuidas kemikaali kehasse manustatakse (näiteks suukaudselt sund ­
söötmisega, suukaudselt söödaga, nahakaudselt, sissehingamise teel, intravenoos ­
selt jne).  
Massibilanss  – uuritava kemikaali süsteemi sisenemise ja sealt väljumise 
arvestus.  
Materjalibilanss  – vt „massibilanss”.  
Metaboliidid  – metaboliseerimise või metaboliseerimisprotsesside saadused.  
Metaboliseerimine  – sünonüümne „biotransformatsiooniga”.  
Mudelite valideerimine  – protsess, millega hinnatakse mudeli sobivust olema ­
solevate toksiko-koneetiliste andmete järjepidevaks kirjeldamiseks. Mudeleid võib hinnata sel viisil, et mudeli prognoose võrreldakse statistiliselt ja visuaalselt katses saadud väärtustega ühise sõltumatu näitaja (näiteks aja) eri väärtuste 
juures. Hindamise ulatust tuleks mudeli kavandatava kasutusvaldkonna alusel 
põhjendada.
 
Mürgisuse (toimeviis) mehhanism / toimemehhanism (toimeviis)  – toimemeh ­
hanism viitab konkreetsetele biokeemilistele mõjudele, mille kaudu tekib uuritava kemikaali mõju. Toimeviis viitab üldisematele teedele, mis põhjustavad uuritava kemikaali mürgisuse.
 
Poolestusaeg (t  1/2 ) – aeg, mille jooksul uuritava kemikaali kontsentratsioon 
väheneb kompartmendis poole võrra. Tavaliselt peetakse silmas uuritava kemi ­
kaali kontsentratsiooni plasmas või kogust kogu kehas.  
Püsivus (biopüsivus)  – kemikaali pikaajaline olemasolu (bioloogilises 
süsteemis) lagunemisele/kõrvaldamisele vastupidavuse tõttu.  
Retseptori mikroskoopne autoradiograafia  (või retseptori mikroautoradio ­
graafia) – seda meetodit võib kasutada selleks, et uurida ksenobiootikumide 
sidumist konkreetsete koeelementide või rakupopulatsioonide poolt näiteks 
retseptorite sidumise või konkreetse toimeviisi uuringutes, mis võivad nõuda suurt eraldusvõimet ja suurt tundlikkust, mis ei pruugi olla saavutatavad muu meetodi, näiteks kogu keha autoradiograafia puhul.
 
Sapieritus  – eritumine sapijuhade kaudu.  
Sihtkude  – kude, milles avaldub mürgise aine peamine kahjulik mõju.  
Suukaudne imendumine  – manustatud uuritava kemikaali doosi manustamise 
kohast (näiteks seedetraktist) imendumise protsent. Seda üliolulist parameetrit 
saab kasutada selleks, et määrata manustatud uuritava kemikaali osa, mis jõuab portaalveeni ja seejärel maksa.
 
Süsteemide modelleerimine  (füsioloogial põhinev toksikokineetika, farmakoki ­
neetikal põhinev, füsioloogial põhinev farmakokineetika, bioloogial põhinev jne) – abstraktne mudel, milles süsteemi käitumist kirjeldatakse matemaatiliselt.
 
T max – C  max -i saavutamiseks vajalik aeg.  
Toksikokineetika  (farmakokineetika) – kemikaalide imendumise, jaotumise, 
metaboliseerimise ja väljutamise ajast sõltuvuse uurimine.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Tundlikkus  – meetodi või mõõtevahendi suutlikkus eristada mõõdetavaid 
signaale, mis vastavad huvipakkuva muutuja erinevale sisaldusele.  
Uuritav kemikaal  – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. 
Vere (plasma/seerumi) maksimaalsed tasemed  – maksimaalne (tipp)kontsen ­
tratsioon veres (plasmas/seerumis) pärast manustamist (vt ka „C  max ”). 
Veres (plasmas) oleva kontsentratsiooni statsionaarne olek  – avatud süsteemi 
mittetasakaaluline olek, mille puhul kõik süsteemile avalduvad mõjud on täpselt tasakaalustatud vastupidiste mõjude poolt selliselt, et kõigi selle komponentide kontsentratsioon on püsiv, kuigi ained voolavad läbi süsteemi.
 
Väljutamine  – protsess(id), millega manustatud uuritav kemikaal ja/või selle 
metaboliidid kehast kõrvaldatakse.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD 
VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUS PÄRAST ÄGEDAT 
KOKKUPUUTUMIST  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Ainete toksilise toime iseloomustamisel ja hindamisel on oluline 
vaadelda teatavate aineklasside potentsiaali põhjustada spetsiifilist neurotoksilisust, mida ei pruugi olla võimalik teiste toksilisuse uurin ­
gutega tuvastada. Teatavad fosfororgaanilised ained põhjustavad 
viivistoimega neurotoksilisust ja neid tuleks pidada võimalikeks uuri ­
misobjektideks.
 
Viivistoimega polüneuropaatiat põhjustada võivate ainete tuvastami ­
seks tuleks kasutada  in vitro  sõelumiskatseid;  in vitro  uuringute 
negatiivsed leiud ei tõenda, et uuritav aine ei ole neurotoksiline.  
Vt B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Fosfororgaanilised ained sisaldavad laenguta fosfororgaanilisi estreid 
või fosfororgaaniliste või fosfoonorgaaniliste või orgaaniliste fosfo ­
ramidohapete või analoogsete fosfortio, fosfoontio või fosfortioami ­
dohapete tioestrid või anhüdriide, mis võivad põhjustada selle aine ­
klassi puhul täheldatavat viivistoimega neurotoksilisust.  
Viivistoimega neurotoksilisus on sündroom, mis on seotud pika 
viivitusega ataksia, seljaaju ja perifeerse närvi distaalse aksonopaatia 
ilmnemisel ja närvikoes neuropaatia sihtesteraasi (NTE) takistamise ja vananemisega.
 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Võrdlusaineid võib uurida positiivse võrdlusrühmaga tõestamaks, et 
uuritava liigi vastus ei ole laboratoorsetel katsetingimustel märkimis ­
väärselt muutunud.  
Üks näide laialdaselt kasutatud neurotoksilisest ainest on tri-o-tolüül- 
3-fosfaat (CASi nr 78-30-8, EINECSi nr 201-103-5, CASi nomen ­
klatuur: fosforhape, tris(2-metüülfenüül)ester), samuti tuntud kui tris- 
o-kresüülfosfaat.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritav aine manustatakse suu kaudu ühekordse doosina kanadele, 
keda on vajaduse korral kaitstud ägedate kolinergiliste mõjude eest. Loomi vaadeldakse käitumuslike kõrvalekallete, ataksia ja paralüüsi 
tuvastamiseks 21 päeva. Biokeemilised mõõtmised, eelkõige neuro ­
paatia sihtesteraasi pidurdamine (NTE), tehakse tavaliselt 24 ja 48 tundi pärast doosi andmist igast rühmast juhuslikkuse printsiibil valitud kanadel. 21 päeva pärast kokkupuudet tapetakse ülejäänud 
kanad ning seejärel viiakse läbi valitud närvikudede histopatoloogi ­
line uuring.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.5.1.  Ettevalmistused  
Noored terved täiskasvanud kanad, kellel ei esine takistavaid viirus ­
haigusi, kellele ei manustata ravimeid ja kelle kõnnakus ei esine 
kõrvalekaldeid, jagatakse juhuslikkuse printsiibil katse- ja võrdlus ­
rühmadesse ning seejärel lastakse neil vähemalt viis päeva enne uuringu algust laboritingimustega kohaneda.
 
Kasutada tuleks puure või piirdeaedu, mis on piisavalt suured, et 
kanad saaksid vabalt liikuda ja et neid saaks kergesti vaadelda.  
Uuritav aine tuleks tavaliselt manustada sondi, želatiinikapslite või 
mõne samaväärse meetodi abil suu kaudu. Vedelikke võib anda lahjendamata kujul või sobivas vehiikelis (nt maisiõli) lahustatuna; 
tahked ained tuleks võimaluse korral lahustada, kuna suured kogused 
ei pruugi želatiinikapslites täielikult absorbeeruda. Mitte-vesilahuse ­
liste vehiikelite puhul peaksid olema teada vehiikeli toksilised omadused ning kui need ei ole teada, tuleks need enne katse läbi ­
viimist kindlaks teha.
 
1.5.2.  Katsetingimused  
1.5.2.1.  Katseloomad  
Soovitatakse kasutada noori, 8–12 kuu vanuseid täiskasvanud muna ­
kanu  (Gallus gallus domesticus).  Kasutada tuleks normaalsuuruses ja 
-aretusliini kanu ning kanad peaksid üldjuhul olema kasvatatud tingi ­
muses, kus neil oli võimalik vabalt liikuda.  
1.5.2.2.  Arv ja sugu  
Lisaks katserühmale tuleks kasutada nii võrdlusrühma, millele 
antakse vehiikelit, kui ka positiivset võrdlusrüh-ma. Võrdlusrühma, 
millele antakse vehiikelit, tuleks käsitada samal viisil kui katse ­
rühma, välja arvatud uuritava aine manustamise osas.  
Igas lindude rühmas peab olema piisav arv kanu, et biokeemiliste 
määramiste tegemiseks oleks võimalik tappa vähemalt kuus lindu 
(kolm lindu kahel eri ajahetkel) ja et kuus lindu jääksid ellu 21 
päevase vaatlusperioodi ajaks patoloogiauuringu läbiviimiseks.  
Positiivset võrdlusrühma võib uurida samaaegselt või hilisema võrd ­
lusrühmana. Positiivses võrdlusrühmas peaks olema vähemalt kuus 
kana, kellele on manustatud tuntud viivistoimega neurotoksilist ainet, 
kolme kana puhul tehakse biokeemiline uuring ja kolmel kanal pato ­
loogiline uuring. Varasemaid andmeid tuleks korrapäraselt ajakohas ­
tada. Uued positiivse võrdlusrühma andmed on vajalikud siis, kui 
katset tegev laboratoorium on mõnda katse tegemiseks olulist 
elementi (aretusliin, toit, pidamistingimused) muutnud.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Annused  
Põhiuuringus kasutatav doositase tuleb määrata kindlaks eeluuringus, 
milles kasutatakse asjakohasel arvul kanu ja doositasemerühmasid. Selleks et määrata kindlaks piisav doos põhiuuringu jaoks, peab 
eeluuringus tavaliselt mõni lind surema. Vältimaks surma ägedate 
kolinergiliste mõjude tagajärjel, võib siiski kasutada atropiini või mõnda teist uuritavat ainet, mis teadaolevalt ei mõjuta viivistoimega neurotoksilisi reaktsioone. Uuritava aine mittesurmava maksimaalse 
doosi (vt meetod B.1a) määramiseks võib kasutada erinevaid uuri ­
mismeetodeid. Doosi valikul võib abi olla varasematest andmetest või muust toksikoloogilisest teabest.
 
Uuritava aine doositase peaks põhiuuringus olema võimalikult kõrge, 
võttes võimaluse korral arvesse doosivaliku eeluuringu tulemusi ja 
ülemist piirdoosi 2 000 mg kehakaalu kg kohta. Suremus ei tohiks 
olla nii suur, et see takistaks 21. päeval allesjäävate loomadega läbi viia biokeemilist uuringut (kuus katselooma) ja histoloogilist uuringut (kuus katselooma). Vältimaks surma ägedate kolinergiliste 
mõjude tagajärjel, võib kasutada atropiini või mõnda teist kaitseainet, 
mis teadaolevalt ei mõjuta viivistoimega neurotoksilisi reaktsioone.
 
1.5.2.4.  Piirsisalduskatse  
Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega 
päevadoosil 2 000 mg kehakaalu kg kohta täheldatavat toksilist toimet ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga ainete osas 
saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta suurema doosiga 
uuringut vajalikuks. Läbi võib viia piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
 
1.5.3.  Vaatlusperiood  
Vaatlusperiood peaks olema 21 päeva.  
1.5.4.  Katse käik  
Pärast kaitseaine manustamist ägedast kolinergilisest toimest tuleneva 
surma vältimiseks manustatakse uuritav aine ühekordse doosina.  
Üldine vaatlus  
Vaatlused peaksid algama kohe pärast kokkupuudet. Kõiki kanu 
tuleks esimese kahe päeva jooksul mitu korda hoolikalt vaadelda 
ning seejärel 21 päeva jooksul või kuni kavandatud tapmiseni vähe ­
malt kord päevas. Kõik toksilisuse märgid tuleks üles märkida, seal ­
hulgas ilmnemise aeg, liik, raskusaste ja käitumuslike kõrvalekallete kestus. Ataksiat tuleks mõõta ordinaalse hindamisskaalaga, milles on 
vähemalt neli taset, ja paralüüsi esinemine tuleks registreerida. Pato ­
loogilise uuringu jaoks välja valitud kanu tuleks vähemalt kaks korda nädalas puurist välja lasta ning neid tuleks väiksemate toksiliste mõjude hindamise hõlbustamiseks liikuma sundida (näiteks redelil 
ronimine). Haigestunud loomad ja loomad, kellel esineb suurt stressi 
või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse humaanselt ja lahatakse.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
Kehakaal  
Kõiki kanu tuleks kaaluda vahetult enne uuritava aine manustamist 
ning seejärel vähemalt kord nädalas.  
Biokeemia  
Kuus juhuslikult valitud kana igast katserühmast ja võrdlusrühmast, 
millele antakse vehiikelit, ja kolm kana positiivsest võrdlusrühmast 
(kui katse viiakse läbi samaaegselt) tuleks tappa mõne päeva jooksul pärast viimase doosi manustamist ning ajust ja nimmelülidest valmis ­
tatud valmistist hinnatakse neuropaatia sihtesteraasi (NTE) pidurda ­
misaktiivsuse osas. Lisaks sellele tuleks neuropaatia sihtesteraasi 
pidurdamisaktiivsuseks ette valmistada ja analüüsida istmikunärvi kude. Tavaliselt tapetakse 24 ja 48 tunni pärast kolm võrdlusrühma ja iga katserühma lindu ning 24 tunni pärast tuleks tappa ka kolm 
positiivsesse võrdlusrühma kuuluvat lindu. Kui toksilisuse kliiniliste 
märkide vaatlus (mida on võimalik hinnata kolinergiliste märkide ilmnemise aja vaatlemisel) viitab toksilise aine eriti aeglasele kõrval ­
damisele, on soovitav võtta kahel erineval ajahetkel 24–72 tunni 
jooksul pärast manustamist kolmelt linnult koeproov.
 
Vajaduse korral võib nende proovidega teha ka atsetüülkoliineste ­
raasi analüüsi (AChE). AChE võib siiski spontaanselt  in vivo  reak­
tiveeruda ja tuua kaasa selle, et aine potentsiaali AChE inhibiitorina alahinnatakse.
 
Täielik lahang  
Kõikide loomade (kelle tapmine oli kavatsetud ja kes olid 
suremas) täielik lahang peaks hõlmama aju ja seljaaju väliste tunnuste vaatlemist.
 
Histopatoloogiline uuring  
Vaatlusperioodil ellujäänud ja biokeemilistes uuringutes kasutamata 
loomade närvikude tuleks mikroskoopiliselt uurida. Koed tuleks kinnitada perfusiooni abil kohapeal. Lõiked tuleks võtta väikeajust 
(keskmiselt pikitasandilt), piklikajust, seljaajust ja perifeersetest 
närvidest. Seljaaju puhul tuleb lõiked võtta ülemistest kaelalülidest, kesktorakaalosast ja lumbosakraalosast. Tuleks võtta lõiked ka tibiaalnärvi distaalsest osast ja selle kaksiksääre-marjalihase harudest 
ja istmikunärvist. Lõiked tuleks katta sobivate müeliini- ja aksonis ­
petsiifiliste ainetega.
 
2. ANDMED  
Käesolevas meetodis valitud lõpp-punktide (biokeemia, histopato ­
loogia ja käitumuslik vaatlus) negatiivsed tulemused ei nõua tavapä ­
raselt täiendavat uurimist viivistoimega neurotoksilisuse osas. 
Nendes lõpp-punktides saadud ebaselged või poolikud tulemused 
võivad nõuda täiendavat hindamist.  
Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Kõik andmed 
tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga katserühma kohta märgitud loomade arv katse alguses, vigastustega loomade arv, toime käitumisele või biokeemiline toime, kahjustuste või 
toime liik ja raskusaste, loomade protsent iga tüüpi vigastuste ja 
raskusastmete kohta.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Käesoleva uuringu tulemusi tuleks hinnata käitumuslike, biokeemi ­
liste ja histopatoloogiliste mõjude esinemise, raskusastme ja korrelat ­
siooni põhjal ja katse- või võrdlusrühmas täheldatud muude mõjude suhtes.
 
Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud 
statistiliste meetoditega. Kasutatavad statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.
 
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet  
3.1. Katseloomad:  
— kasutatud aretusliin;  
— loomade arv ja vanus;  
— päritolu, pidamistingimused, toit jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  
3.2. Katsetingimused:  
— uuritava aine ettevalmistamise, stabiilsuse ja homogeensuse ük ­
sikasjad; vajaduse korral;  
— vehiikeli valiku põhjendus;  
— uuritava aine manustamise üksikasjad;  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad;  
— doosi valimise põhjendused;  
— manustatud dooside üksikasjad, sealhulgas andmed vehiikeli, 
mahu ja manustatud aine füüsilise vormi kohta;  
— võimalike kaitseainete identifitseerimine ja nende manustamise 
üksikasjad.  
3.3. Tulemused:  
— kehakaalu andmed;  
— toksilise reaktsiooni andmed vastavalt rühmale, sealhulgas 
suremus;  
— kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või 
mitte);  
— biokeemiliste meetodite ja leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— lahkamise tulemused;  
— histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 418.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  FOSFORORGAANILISTEST AINETEST PÕHJUSTATUD 
VIIVISTOIMEGA NEUROTOKSILISUSE 28PÄEVANE 
KORDUSDOOSI UURING  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Ainete toksilise toime iseloomustamisel ja hindamisel on oluline 
vaadelda teatavate aineklasside potentsiaali põhjustada spetsiifilist neurotoksilisust, mida ei pruugi olla võimalik teiste toksilisuse uurin ­
gutega tuvastada. Teatavad fosfororgaanilised ained põhjustavad 
viivistoimega neurotoksilisust ja neid tuleks pidada võimalikeks uuri ­
misobjektideks.
 
Nende ainete tuvastamiseks, mis võivad põhjustada viivistoimega 
polüneuropaatiat, tuleks kasutada  in vitro  sõelumiskatseid;  in vitro  
uuringute negatiivsed leiud ei tõenda, et uuritav aine ei ole neuro ­
toksiline.  
Käesolev 28päevane viivistoimega neurotoksilisuse katse annab 
teavet võimalike ohtude kohta tervisele, mis võivad tõenäoliselt tule ­
neda korduvatest kokkupuudetest piiratud ajavahemiku jooksul. Nimetatud uuringuga saab teavet doosireaktsiooni kohta ning selle 
abil on võimalik hinnata täheldatava kahjuliku toimeta doosi taset, 
mis aitaks määrata kokkupuute ohutuskriteeriumeid.
 
Vt samuti B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Fosfororgaanilised ained sisaldavad laenguta fosfororgaanilisi estreid 
või fosfororgaaniliste või fosfoonorgaaniliste või orgaaniliste fosfo ­
ramidohapete või analoogsete fosfortio, fosfoontio või fosfortioami ­
dohapete tioestreid või anhüdriide, mis võivad põhjustada selle aine ­
klassi puhul täheldatavat viivistoimega neurotoksilisust.  
Viivistoimega neurotoksilisus on sündroom, mis on seotud pika 
viivitusega ataksia, seljaaju ja perifeerse närvi distaalse aksonopaatia 
ilmnemisel ja närvikoes neuropaatia sihtesteraasi (NTE) takistamise ja vananemisega.
 
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritava aine päevaseid doose manustatakse kanadele suu kaudu 28 
päeva jooksul. Loomi vaadeldakse vähemalt kord päevas käitumus ­
like kõrvalekallete, ataksia ja paralüüsi tuvastamiseks 14 päeva 
jooksul pärast viimase doosi manustamist. Biokeemilised mõõtmised, 
eelkõige neuropaatia sihtesteraasi pidurdamine (NTE), tehakse igast rühmast juhuslikkuse printsiibil valitud kanadel tavaliselt 24 ja 48 tundi pärast viimase doosi andmist. Kaks nädalat pärast kokkupuudet 
tapetakse ülejäänud kanad ning viiakse läbi valitud närvikudede 
histopatoloogiline uuring.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Ettevalmistused  
Noortel tervetel täiskasvanud kanadel, kellel ei esine takistavaid 
viirushaigusi, kellele ei manustata ravimeid ja kelle kõnnakus ei 
esine kõrvalekaldeid, jagatakse juhuslikkuse põhimõtte alusel katse- 
ja võrdlusrühmadesse ning seejärel lastakse neil vähemalt viis päeva enne uuringu algust laboritingimustega kohaneda.
 
Kasutada tuleks puure või piirdeaedu, mis on piisavalt suured, 
võimaldades kanadel vabalt liikuda ja neid kergesti vaadelda.  
Doosid tuleks manustada suu kaudu seitsmel päeval nädalas ning 
eelistatult sondi või želatiinikapslite abil. Vedelikke võib anda 
lahjendamata kujul või sobivas vehiikelis (nt maisiõli) lahustatuna; tahked ained tuleks võimaluse korral lahustada, kuna suured kogused ei pruugi želatiinikapslites täielikult absorbeeruda. Mitte-vesilahuse ­
liste vehiikelite puhul peaksid olema teada vehiikeli toksilised 
omadused ning kui need ei ole teada, tuleks need enne katse läbi ­
viimist kindlaks teha.
 
1.4.2.  Katsetingimused  
1.4.2.1.  Katseloomad  
Soovitatakse kasutada noori, 8–12 kuu vanuseid täiskasvanud muna ­
kanu  (Gallus gallus domesticus).  Kasutada tuleks normaalsuuruses ja 
-aretusliini kanu ning kanad peaksid üldjuhul olema kasvatatud tingi ­
muses, kus neil oli võimalik vabalt liikuda.  
1.4.2.2.  Arv ja sugu  
Üldiselt tuleks kasutada kolme katserühma ja ühte vehiikeli võrdlus ­
rühma. Võrdlusrühma, millele antakse vehiikelit, tuleks käsitada 
samal viisil kui katserühma, välja arvatud uuritava aine manustamise osas.
 
Igas lindude rühmas peab olema piisav arv kanu selleks, et biokee ­
miliste määramiste tegemiseks oleks võimalik tappa vähemalt kuus 
lindu (kolm lindu kahel eri ajahetkel) ja et kuus lindu jääksid ellu 
14päevase vaatlusperioodi ajaks patoloogiauuringu tegemiseks.  
1.4.2.3.  Annused  
Annuste valimisel tuleks arvesse võtta kolme viivistoimega neuro ­
toksilisuse ägeda toksilisuse katse tulemusi ja teisi uuritava ühendi toksilisi või kineetilisi andmeid. Tuleks valida kõrgeim doositase, 
mille eesmärgiks oleks toksilise toime esilekutsumine, eelistatult 
viivistoimega neurotoksilisus, kuid vältida tuleks doositaset, mis kutsub esile surma või tõsised kannatused. Seejärel tuleks valida aste-astmelt vähenevad doositasemed doosist tuleneva reaktsiooni ja 
madalaimal doositasemel täheldatava kahjuliku toimeta doosi 
(NOAEL) demonstreerimiseks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4.  Piirsisalduskatse  
Kui katses ei tuvastata käesolevas uuringus kirjeldatud menetlusega 
päevadoosil 1 000 mg kehakaalu kg kohta täheldatavat toksilist toimet ja kui toksilisus ei ole samalaadse struktuuriga ainete osas 
saadud andmete põhjal ootuspärane, ei loeta suurema doosiga 
uuringut vajalikuks. Teha võib piirsisalduskatse, välja arvatud juhul, kui inimese eeldatav kokkupuude viitab vajadusele kasutada suuremat doositaset.
 
1.4.2.5.  Vaatlusperiood  
Kõiki loomi tuleks kokkupuuteperioodi ajal vaadelda vähemalt kord 
päevas ja pärast seda 14 päeva jooksul kuni kavandatava lahkami ­
seni. 
1.4.3.  Katse käik  
Loomadele doseeritakse uuritavat ainet seitsmel päeval nädalas ja 28 
päeva jooksul.  
Üldised märkused  
Vaatlused peaksid algama kohe pärast katse algust. Kõiki kanu 
tuleks põhjalikult vaadelda 28päevase katseaja jooksul vähemalt kord päevas ja seejärel 14 päeva jooksul pärast manustamist või 
kuni kavandatava tapmiseni. Kõik toksilisuse märgid tuleks üles 
märkida, sealhulgas ilmnemise aeg, liik, raskusaste ja kestus. Vaat ­
luste käigus tuleks vaadelda lisaks muule kõrvalekaldeid käitumises. Ataksiat tuleks mõõta ordinaalse hindamisskaalaga, milles on vähe ­
malt neli taset ja paralüüsi esinemine tuleks registreerida. Kanad 
tuleks vähemalt kaks korda nädalas puurist välja lasta ning neid tuleks väiksemate toksiliste mõjude hindamise hõlbustamiseks liikuma sundida (näiteks redelil ronimine). Haigestunud loomad, 
kellel esineb suurt stressi või valu, eemaldatakse katsest, tapetakse 
humaanselt ja lahatakse.
 
Kehakaal  
Kõiki kanu tuleks kaaluda vahetult enne uuritava aine esmakordset 
manustamist ning seejärel iga nädala järel.  
Biokeemia  
Kuus juhuslikult valitud kana igast katserühmast ja võrdlusrühmast, 
millele antakse vehiikelit, tuleks tappa mõne päeva jooksul pärast 
viimase doosi manustamist ning ajust ja nimmelülidest valmistatud valmistist hinnatakse neuropaatia sihtesteraasi (NTE) pidurdamisak ­
tiivsuse osas. Lisaks sellele tuleks ette valmistada ja analüüsida 
istmikunärvi kude neuropaatia sihtesteraasi (NTE) pidurdamisaktiiv ­
suse osas. Tavaliselt tapetakse kolm võrdlusrühma ja katserühma kuuluvat lindu 24 tunni pärast ja kolm lindu pärast viimase doosi manustamist. Kui ägeda toksilisuse uuringute või muude uuringute 
(nt toksikokineetika) andmed osutavad sellele, et loomade tapmine 
peaks toimuma muul ajal kui pärast viimase doosi andmist, tuleks neid aegu järgida ning põhjendused dokumenteerida.
 
Vajaduse korral võib nende proovidega läbi viia ka atsetüülkoliines ­
teraasi analüüsi (AChE). AChE võib siiski spontaanselt in  vivo  reak­
tiveeruda ja tuua kaasa selle, et aine potentsiaali AChE inhibiitorina 
alahinnatakse.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
Täielik lahang  
Kõikide loomade (kelle tapmine oli kavatsetud ja kes olid suremas) 
täielik lahang peaks hõlmama aju ja seljaaju väliste tunnuste vaatle ­
mist.  
Histopatoloogiline uuring  
Vaatlusperioodil ellujäänud ja biokeemilistes uuringutes kasutamata 
loomade närvikude tuleks mikroskoopiliselt uurida. Koed tuleks 
kinnitada kohapeal perfusiooni abil. Lõiked tuleks võtta väikeajust (keskmiselt pikitasandilt), piklikajust, seljaajust ja perifeersetest närvidest. Seljaaju puhul tuleb lõiked võtta ülemistest kaelalülidest, 
kesktorakaalosast ja lumbosakraalosast. Tuleks võtta lõiked ka 
tibiaalnärvi distaalsest osast ja selle kaksiksääre-marjalihase harudest ja istmikunärvist. Lõiked tuleks katta sobivate müeliini- ja aksonis ­
petsiifiliste ainetega. Alguses tuleks kõikide võrdlusrühma ja kõrge 
doosiga rühmade loomade säilitatud kudesid mikroskoopiliselt 
uurida. Kui kõrge doosiga rühmade puhul on toime kohta tõendid olemas, tuleks mikroskoopiline uuring viia läbi ka keskmise ja madala doosiga rühmade puhul.
 
2. ANDMED  
Käesolevas meetodis valitud lõpp-punktide (biokeemia, histopato ­
loogia ja käitumuslik vaatlus) negatiivsed tulemused ei nõua tavapä ­
raselt täiendavat uurimist viivistoimega neurotoksilisuse osas. Nendes lõpp-punktides saadud ebaselged või poolikud tulemused võivad nõuda täiendavat hindamist.
 
Loomade kohta tuleks esitada andmed individuaalselt. Kõik andmed 
tuleks esitada kokkuvõtvalt tabelis, milles oleks iga katserühma 
kohta märgitud loomade arv katse alguses, vigastustega loomade 
arv, toime käitumisele või biokeemiline toime, kahjustuste või toime liik ja raskusaste, loomade protsent iga tüüpi vigastuste ja raskusastmete kohta.
 
Käesoleva uuringu tulemusi tuleks hinnata käitumuslike, biokeemi ­
liste ja histopatoloogiliste mõjude esinemise, raskusastme ja korrelat ­
siooni põhjal ja katse või võrdlusrühmas täheldatud muude mõjude suhtes.
 
Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata asjakohaste ja üldiselt tunnustatud 
statistiliste meetoditega. Statistilised meetodid tuleks valida uuringu kavandamise etapis.
 
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab võimaluse korral sisaldama järgmist teavet.  
Katseloomad:  
— kasutatud aretusliin;  
— loomade arv ja vanus;  
— päritolu, pidamistingimused, toit jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
Katsetingimused:  
— uuritava aine ettevalmistamise, stabiilsuse ja homogeensuse ük ­
sikasjad, kui see on asjakohane;  
— vehiikeli valiku põhjendus;  
— uuritava aine manustamise üksikasjad;  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad;  
— doosi valimise põhjendused;  
— manustatud dooside üksikasjad, sealhulgas andmed vehiikeli, 
mahu ja manustatud aine füüsilise vormi kohta;  
— teiste biokeemiliste määramiste aegade valimise põhjendus, kui 
selleks ei ole 24 või 48 tundi.  
Tulemused:  
— kehakaalu andmed;  
— toksilise reaktsiooni andmed vastavalt doositasemele, sealhulgas 
suremus;  
— täheldatava kahjuliku toimeta doos;  
— kliiniliste vaatluste iseloom, raskusaste ja kestus (pöördumatu või 
mitte);  
— biokeemiliste meetodite ja leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— lahkamise tulemused;  
— histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.  
Tulemuste üle arutlemine.  
Järeldused.  
4. VIITED  
Käesolev meetod on analoogne meetodiga OECD TG 419.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  PLAANIVÄLISE DNA SÜNTEESI (UDS) KATSE IMETAJATE 
MAKSARAKKUDEGA  IN VIVO  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 486, Unscheduled 
DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells  In Vivo  
(1997).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Plaanivälise DNA sünteesi (UDS) katse imetajate maksarakkudega  in 
vivo eesmärk on identifitseerida katseained, mis põhjustavad DNA 
parandust katseloomade maksarakkudes (1, 2, 3, 4).  
Käesolev  in vivo  katse on meetod keemiliste ainete genotoksiliste 
mõjude uurimiseks maksas. Mõõdetud lõpp-punkt ilmneb DNA 
kahjustuses ja selle hilisemas parandamises maksarakkudes. Maks on tavaliselt imendunud ühendite ainevahetuse peamine koht. See 
on seega sobiv koht DNA kahjustuse mõõtmiseks  in vivo.
 
Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav aine ei pääse sihtkoesse, siis 
ei ole vaja kasutada käesolevat katset.  
Plaanivälise DNA sünteesi (UDS) lõpp-punkt mõõdetakse määrates 
märgistatud nukleosiidide ühinemist S-faasi DNA sünteesi väliste rakkudega. Enimkasutatav meetod on triitiumiga märgistatud tümi ­
diini (
 3 H-TdR) ühinemise määramine autoradiograafiliselt.  In vivo  
UDS-katsetes kasutatakse eelistatult rotimaksasid. Võib kasutada ka 
muid kudesid peale maksa, kuid neid ei kirjeldata käesolevas meetodis.
 
UDS-vastuse avastamine sõltub väljalõigatud ja asendatud DNA 
aluste arvust kahjustuse kohas. Seega on UDS-katse eriti väärtuslik 
ainetest põhjustatud „pikkade DNA osade paranduse” ( longpatch 
repair ) avastamiseks (20–30 alust). „Lühikeste osade parandus” 
(shortpatch repair ) (1–3 alust) avastatakse palju väiksema tundlikku ­
sega. Lisaks võivad mutageensed muutused aset leida DNA kahjus ­
tuste parandamata jätmisel, parandamisvigade või replikatsioonivi ­
gade tegemisel. UDS-vastuse ulatus ei viita parandusprotsessi usal ­
dusväärsusele. Lisaks on võimalik, et mutageen reageerib DNAga, aga DNA kahjustust ei parandata lõikamis-parandamisprotsessi 
kaudu. Kuna lõpp-punkt mõõdetakse kogu genoomist, siis potentsi ­
aalne tundlikkus korvab selle, et UDS-katse ei anna spetsiifilist teavet mutageense aktiivsuse kohta.
 
Vt ka B osa üldist sissejuhatust.  
1.2. MÕISTED  
Parandatavad rakud –  osakeste netoarv tuumas ehk NNG-väärtus 
on suurem kui arvestuslik väärtus, mida on põhjendatud katset 
tegevas laboris.  
NNG-väärtus ( net nuclear grains ) – rakkude UDS-aktiivsuse kvan ­
titatiivne mõõtmine autoradiograafilistes UDS-katsetes, arvutatuna tuumale vastavatel tsütoplasma aladel (CG) tsütoplasma osakeste keskmise arvu mahaarvamisel tuumaosakeste arvust (NG): NNG = 
NG – CG. NNG-arvud arvutatakse üksikute rakkude kohta ja seejärel 
pannakse rakud kultuuris, paralleelsetes kultuurides jm kokku.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Plaaniväline DNA süntees (UDS) –  DNA parandussüntees pärast 
seda, kui keemiliste ainete või füüsikaliste mõjurite põhjustatud 
kahjustuse alal sisalduva DNA osa on lahti lõigatud ja eemaldatud kromosoomist.
 
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
UDS-katse imetajate maksarakkudega  in vivo  viitab DNA parandus ­
sünteesile pärast seda, kui keemiliste ainete või füüsikaliste mõjurite 
põhjustatud kahjustuse alal sisalduva DNA osa on lahti lõigatud ja eemaldatud kromosoomist. Katse põhineb enamasti
 3 H-TdR lisamisel 
maksarakkude DNA-sse, millel on üksnes väike rakutsükli S-faasis 
olevate rakkude esinemissagedus.  3 H-TdR lisamine määratakse tava ­
liselt autoradiograafiliselt, kuna kõnealune tehnika ei ole vastuvõtlik S-faasis olevatele rakkudele, nagu nt vedeliktsintsillatsiooniloendus.
 
1.4. MEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Preparaadid  
1.4.1.1.  Loomaliikide valik  
Tavaliselt kasutatakse rotte, kuigi võib kasutada mis tahes sobivaid 
imetajate liike. Rakendatakse noorte tervete loomade enimkasutata ­
vaid laboritüvesid. Uuringut alustades peaks loomade kaalumuutus 
olema minimaalne ja ei tohiks ületada ± 20 % iga soo keskmisest kaalust.
 
1.4.1.2.  Elamis- ja söötmistingimused  
Üldise sissejuhatuse B osas toodud üldtingimusi kohaldatakse, kuigi 
niiskuse eesmärk peaks olema 50–60 %.  
1.4.1.3.  Loomade ettevalmistamine  
Terved noored täiskasvanud loomad määratakse juhuvaliku alusel 
kontroll- ja katserühma. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest 
tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse individuaalselt ja hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne uurimuse alustamist, et võimaldada labori tingimustega kohanemist.
 
1.4.1.4.  Uuritav aine/preparaat  
Tahked uuritavad ained tuleb lahustada või suspendeerida sobivates 
lahustites või kandjaainetes ja vajadusel lahjendada enne loomadele andmist. Vedelaid uuritavaid aineid võib doseerida vahetult või 
lahjendatakse enne doseerimist. Tuleks kasutada uuritava aine värs ­
keid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
 
1.4.2.  Katsetingimused  
1.4.2.1.  Lahusti/kandjaaine  
Lahusti/kandjaaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatavate 
annuste korral ja ei tohi astuda keemilise reaktsiooni uuritava ainega. Kui kasutatakse muud kui tuntud lahustit/kandjaainet, peab nende kasutamine toetuma ühtesobivuse kohta käivatele andmetele. Soovi ­
tatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahustite/-kandjaai ­
nete kasutamist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Kontrollid  
Igasse sõltumatult läbiviidud katseossa kaasatakse paralleelsed posi ­
tiivsed ja negatiivsed (lahusti/kandjaaine) kontrollid. Kontrollrühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid neid ei 
töödelda uuritava ainega.
 
Positiivsed kontrollid peaksid olema ained, mis teatavasti põhjus ­
tavad UDS-i, kui neid antakse annustena, mis ootuspäraselt põhjus ­
tavad avastatavat suurenemist taustaga võrreldes. Metaboolset akti ­
veerimist vajavaid positiivseid kontrolle tuleks kasutada annustena, mis annavad mõõduka vastuse (4). Annused valitakse nii, et mõjud on selged, kuid need ei paljasta lugejale koheselt kodeeritud objek ­
tiklaaside identiteeti. Positiivsete kontrollainete näited:
 
Proovivõtuaeg Aine CASi nr EINECSi nr  
Varane proovivõtuaeg (2–4 tundi) Dimetüülnitrosoamiin 62-75-9 200-249-8 
Hiline proovivõtuaeg (12–16 tundi) N-2-atsetamiidfluor (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Võidakse kasutada muid sobivaid positiivseid kontrollaineid. Posi ­
tiivseid kontrollaineid võib manustada uuritavast ainest erineva 
manustamistee kaudu.  
1.5. MENETLUS  
1.5.1.  Loomade arv ja sugu  
Katseloomade arv peaks olema piisav katsevastuses loodusliku 
bioloogilise varieerumise arvessevõtmiseks. Analüüsitavaid loomi 
peaks olema vähemalt kolm rühma kohta. Kui märkimisväärne 
andmebaas on kogutud juba varem, paralleelsete negatiivsete või positiivsete kontrollrühmade jaoks on vaja üksnes üks või kaks 
looma.
 
Üksnes üht sugupoolt, eelistatult isasloomasid, võidakse kasutada, 
kui uurimuse ajal on kättesaadavad tulemused samas liigis ja sama vastuvõtlikkuse liini kasutades tehtud uurimuste kohta, mille tule ­
mused näitavad, et toksilisuse osas ei ole märkimisväärseid erinevusi 
sugupoolte vahel. Kui inimese vastuvõtlikkus kemikaalidele on soos ­
petsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse sobi ­
vast soost loomadega.
 
1.5.2.  Manustamiskava  
Uuritavaid ained tuleb üldiselt anda ühekordse annusena.  
1.5.3.  Annused  
Normaalselt kasutatakse vähemalt kaht erinevat annust. Suurim 
annus määratletakse annusena, mis põhjustab sarnaseid mürgisuse ­
nähte, et samale manustamiskavale põhinevate suuremate annuste 
puhul võib tulemuseks olla surm. Üldiselt peaksid väiksemad 
annused olema 50–25 % suurest annusest.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Ained, millel on spetsiifilised bioloogilised mõjud väikeste mittetok ­
siliste annustena (nt hormoonid ja mitogeenid), võivad olla erandiks 
annuse määramise kriteeriumidele ja neid tuleks hinnata iga üksik ­
juhtumi puhul eraldi. Kui tehakse annuse määramiseks uurimus sobi ­
vate andmete puudumisel, siis tehakse uurimus samas laboris, kasu ­
tades samu liike, tüvesid, sugu ja manustamiskava, mida kasutatakse 
põhiuurimuses.  
Suurim annus võidakse samuti määratleda annusena, mis viitab toksi ­
lisusele maksas (nt püknootiline tuum).  
1.5.4.  Piirsisalduskatse  
Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 2 000 mg/kg kehakaalu 
kohta päevas ja mida manustatakse ühekordse annusena või kahe 
annusena samal päeval, ei põhjusta täheldatavaid toksilisi mõjusid ja kui genotoksilisus ootuspäraselt põhineb struktuurselt seotud ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku 
uurimust vajalikuks. Inimeste ootuspärane vastuvõtlikkus võib 
viidata piirkatses kasutavatest annustest suuremate annuste kasuta ­
mise vajadusele.
 
1.5.5.  Manustamine  
Uuritavat ainet manustatakse tavaliselt söögitoru kaudu või sobiva 
intubeerimise kanüüli abil. Samuti võib muid manustamisteid kasu ­
tada, kui need on põhjendatud. Kõhukelmesisest teed siiski ei soovi ­
tata, kuna maks on sel juhul uuritavale ainele vahetult vastuvõtlikum 
kui vereringe kaudu. Vedeliku suurim kogus, mida saab söögitoru kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suuru ­
sest. Kogus ei tohiks ületada 2 ml/100 g kehakaalu kohta. Suurimate 
koguste kasutamine peab olema põhjendatud. Arvesse võtmata ärri ­
tavaid või söövitavaid aineid, mille mõjud tavaliselt halvenevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada katsekoguse 
varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide 
annuste korral jääks samaks.
 
1.5.6.  Maksarakkude preparaadid  
Maksarakud prepareeritakse uuritavat ainet saanud loomadelt tavali ­
selt 12–16 tundi pärast annustamist. Täiendav varasem proovivõ ­
tuaeg (tavaliselt kaks kuni neli tundi manustamisjärgselt) on üldiselt vajalik, välja arvatud juhul, kui on saadud selge positiivne vastus 
12–16 tunni jooksul. Muid proovivõtuaegasid võib kasutada, kui 
need on põhjendatud toksokineetiliste andmete põhjal.
 
Imetajate maksarakkude lühiajalised kultuurid tehakse tavaliselt 
selleks, et perforeerida maksa kollagenaa-siga in situ ja võimaldada 
värskelt eraldunud maksarakkudel end kinnitada sobivale pinnasele. Negatiivsetelt kontroll-loomadelt pärit maksarakkudel peaks olema elujõulisus (5) vähemalt 50 %.
 
1.5.7.  UDS-määramine  
Värskelt isoleeritud imetajate maksarakud inkubeeritakse tavaliselt 
keskkonnas, mis sisaldab  3 H-TdR-i, sobiva pikkusega aja jooksul, 
nt kolm kuni kaheksa tundi. Inkubatsiooniperioodi lõpus tuleks 
sööde eraldada rakkudest, mida võidakse seejärel inkubeerida söötmes, mis sisaldab liiga palju märgistamata tümidiini inkorporee ­
rimata radioaktiivsuse vähendamiseks  (cold chase).  Seejärel rakud 
loputatakse, fikseeritakse ja kuivatatakse. Pikema inkubatsiooniaja 
jooksul ei pruugi märgistamata tümidiiniga töötlemine olla vajalik. Objektiklaasid kastetakse autoradiograafilise emulsiooni sisse, valgustatakse pimedas (säilitatakse külmkapis 7–14 päeva), ilmuta ­
takse, värvitakse ning arvutatakse valgustatud hõbeosakesed. Kaks 
kuni kolm objektiklaasi valmistatakse iga looma kohta.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Analüüs  
Objektiklaasi preparaadid peaksid sisaldama piisavalt rakke, mille 
morfoloogia on normaalne, milles võimaldatakse teha UDSi tähen ­
dusrikast hindamist. Preparaate uuritakse mikroskoopiliselt ilmsete 
tsütotoksiliste tunnuste suhtes (nt püknoos, radiomärgistuse vähene ­
mine).  
Objektiklaasid kodeeritakse enne osakeste kokkulugemist. Tavaliselt 
igast loomast loetletakse 100 rakku vähemalt kahelt objektiklaasilt. 
Vähem kui 100 rakku/loom loendamine peab olema põhjendatud. 
Osakeste arvu ei arvutata S-faasis olevast tuumast, kuid S-faasi rakkude osa registreeritakse.
 
Morfoloogiliselt normaalsete rakkude tuuma ja tsütoplasmasse inkor ­
poreeritud  3 H-TdR hulk, mida nähakse hõbeosakeste sadestumisel, 
määratakse sobivate meetodite abil.  
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Tuleb esitada individuaalsed objektiklaasi ja loomade andmed. 
Lisaks esitatakse kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul. 
NNG-arvud arvutatakse iga raku, iga looma, iga annuse ja aja kohta CG-arvude mahaarvamisel NG-arvudest. Kui arvutatakse „parandatavate rakkude” arvu, peaks „parandatavate rakkude” 
määratlemine olema põhjendatud ja põhinema varasemate ja paral ­
leelsete negatiivsete kontrollide andmetel. Numbrilisi tulemusi hinna ­
takse statistiliste meetodite abil. Kui statistilisi katseid kasutatakse, valitakse ja põhjendatakse neid enne uurimuse läbiviimist.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Positiivsete/negatiivsete vastuste kriteeriumide näited hõlmavad: 
positiivne i) NNG-väärtused on suuremad kui arvestuslik 
lävi, mis on õigustatud varasemate laboriand ­
mete põhjal; 
või ii) NNG väärtused on oluliselt suuremad kui 
paralleelsetes kontrollkatsetes; 
negatiivne i) NNG väärtused on varasema kontroll-läve 
piires või sellest väiksemad; 
või ii) NNG väärtused ei ole oluliselt suuremad kui 
paralleelsetes kontrollkatsetes.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Tulemuste bioloogilist olulisust arutatakse: nt loomade väliste variee ­
rumiste, doosi ja toime suhte ja tsütotoksilisuse parameetreid tuleks 
arvesse võtta. Statistilisi meetodeid võidakse kasutada abivahendina katsetulemuste hindamisel. Statistiline olulisus ei saa olla ainus määrav tegur positiivse vastuse saamiseks.
 
Kuigi enamikul katsetest on selged positiivsed või negatiivsed tule ­
mused, välistavad saadud tulemused harvadel juhtudel kindlate 
otsuste tegemise uuritava aine aktiivsuse kohta. Tulemused jäävad ebaselgeks või küsitavaks tehtud katsete kordamisest sõltumata.
 
UDS-katse imetajate maksarakkudega  in vivo  positiivne tulemus 
viitab sellele, et uuritav aine põhjustab DNA kahjustuse imetajate 
maksarakkudes  in vivo,  mida saab parandada plaanivälise DNA 
sünteesi  in vitro  abil. Negatiivne tulemus viitab sellele, et uuritav 
aine ei põhjusta katsetingimustes DNA kahjustust, mis oleks käes ­
olevas katses avastatav.  
Tõenäosust, et uuritav aine jõuab üldisesse vereringesse või eriti 
sihtkoesse (nt süsteemne toksilisus), tuleks arutada.  
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne sisaldab järgmisi andmeid.  
Kandjaaine:  
— kandjaaine valiku põhjendamine;  
— uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandjaaines, kui on 
teada.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/tüved;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, elamistingimused, toitumine jne;  
— loomade individuaalne kaal katse alustamisel, sh kehakaalu 
vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta;  
Katsetingimused:  
— positiivsed ja negatiivsed (kandjaaine/lahus) kontrollid;  
— annuse määramise katse tulemused, kui need on läbi viidud;  
— annuste valiku põhimõtted;  
— uuritava aine ettevalmistamise üksikasjad;  
— uuritava aine manustamise üksikasjad;  
— manustamistee;  
— meetodid, mis kinnitavad, et uuritav aine jõuab üldvereringesse 
või sihtkoesse, vajaduse korral;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni 
(ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kg kehakaalu kohta 
päevas), vajaduse korral;  
— üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta;  
— manustamis- ja proovivõtukavade detailne kirjeldus;  
— toksilisuse mõõtmise meetodid;  
— maksarakkude preparaatide ja kultuuride valmistamise meetod;  
— kasutatud autoradiograafiline tehnika;  
— prepareeritud objektiklaaside arv ja loendatud rakkude arv;  
— hindamiskriteeriumid;  
— kriteeriumid, mille alusel uurimusi liigitatakse positiivseteks, 
negatiivseteks või ebaselgeteks.  
Tulemused:  
— tuumas olevate osakeste, tsütoplasmas olevate osakeste ja 
osakeste koguarvu tuumas keskväärtused üksikute objektiklaa ­
side, loomade ja rühma kohta;  
— doosi ja toime suhe, võimaluse korral;  
— võimalikud statistilised analüüsid;  
— toksilisuse tunnused;  
— paralleelsete negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kont ­
rollide tulemused;  
— varasemate negatiivsete (lahusti/kandjaaine) ja positiivsete kont ­
rollide andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;  
— „parandatavate rakkude” arv, kui see on määratud;  
— S-faasi rakkude arv, kui see on määratud;  
— rakkude elujõulisus.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused  
4. VIITED  
(1) Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the In Vivo Rat. Hepatocyte DNA 
Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.  
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol 
and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair 
Assay, Mutation Res., 189, pp. 123-133.  
(3) Kennelly, J. C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, 
B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993), In 
Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., 
(eds),  Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended 
Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report. Part II revised,  Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 52-77.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, 
B., Doolittle, D. J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C. A. 
and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutation Res., 312, pp. 263-285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viabi ­
lity and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes 
Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Muta ­
tion Res., 291, pp. 21-27.  
(6) Mirsalis, J. C, Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), 
Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro 
Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 
553-562.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  NAHASÖÖVITUSKATSE  IN VITRO:  TRANSKUTAANSE 
ELEKTRITAKISTUSE (TER) MÕÕTMINE  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 430 (2004).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Nahasöövitus tähendab pöördumatu koekahjustuse tekitamist nahas 
uuritava ainega (vastavalt keemiliste ainete ja segude liigitamise ja märgistamise ülemaailmselt harmoneeritud süsteemi (GHS) määratlu ­
sele) (1). Käesoleva meetodi puhul ei kasutata söövitava toime 
hindamiseks elusloomi.
 
Nahka söövitava toime hindamisel on tavaliselt kasutatud labori ­
loomi (2). Kuna selline määramine põhjustas loomadele valu ja 
kannatusi, töötati välja katsemeetodi B.4 uus versioon, mille kohaselt 
on nahka söövitavat toimet võimalik hinnata alternatiivsete  in vitro  
meetoditega, vältides valu ja kannatusi.  
Esimene samm muude katsete määratlemisel, mida saaks kasutada 
nahka söövitava toime uurimiseks õigusliku reguleerimise eesmärgil, 
oli eelvalideerimisuuring (3). Seejärel viidi läbi nahasöövituse hinda ­
mise  in vitro  meetodite (4 ja 5) vormikohane valideerimine (6, 7 ja 
8). Kõnealuste uuringute ja muude kirjandusandmete alusel soovita ­
takse  in vivo  nahka söövitava toime määramiseks kasutada järgmisi 
katseid (9, 10 ja 11): katse inimnaha mudeliga (vt katsemeetod B.40a) ja transkutaanse elektritakistuse mõõtmine (käesolev meetod).
 
Valideerimisuuring ja muud avaldatud uuringud on näidanud, et 
rotinaha transkutaanse elektritakistuse (TER) mõõtmisega (12 ja 
13) saab usaldusväärselt eristada teadaolevaid nahka söövitavaid ja mittesöövitavaid aineid (5 ja 9).
 
Käesolevas metoodikas kirjeldatud katse võimaldab kindlaks teha 
söövitavad keemilised ained ja segud. Samuti võimaldab see kindlaks 
määrata mittesöövitavad ained ja segud, kui seejuures arvestatakse ka muid kaalukaid tõendeid (nt pH, struktuuri-aktiivsuse seos, inim- ja/või loomkatsete andmed) (1, 2, 11 ja 14). Katse ei anna teavet 
nahaärrituse kohta, samuti ei võimalda see söövitavate ainete liigita ­
mist ülemaailmselt harmoneeritud liigitus süsteemi (GHS) (1) luba ­
tavuskriteeriumide alusel alamkategooriatesse.
 
Lokaalse nahatoime põhjalikuks hindamiseks pärast naha ühekordset 
kokkupuudet ainega on soovitatav järgida järjestikuste katsete stra ­
teegiat, mis on esitatud katsemeetodi B.4 (2) lisas ja ülemaailmselt harmoneeritud süsteemis (1). Nimetatud katsestrateegia näeb ette  in 
vitro  katsete läbiviimise nahasöövituse (nagu kirjeldatud käesolevas 
meetodis) ja nahaärrituse uurimiseks, enne kui hakatakse kaaluma 
katsete läbiviimist elusloomadega.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. MÕISTED  
Nahasöövitus  in vivo  – pöördumatu kahjustuse tekitamine nahas: 
läbi epidermise pärisnahka (dermasse) ulatuv nähtav nekroos, mis tekib kuni neljatunnisel kokkupuutel katseainega. Söövitusreaktsioo ­
nide tüüpilised avaldumisvormid on haavandid, verejooks, verised 
kärnad ning 14päevase vaatlusperioodi lõpuks värvimuutus naha valastumise tõttu, täielikult karvavabad alad ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilisi uuringuid.
 
Transkutaanne elektritakistus (TER)  – naha elektrilise impedantsi 
mõõt, takistuse väärtus väljendatuna kilo-oomides. Lihtne ja 
töökindel meetod kaitsefunktsiooni hindamiseks, salvestades Wheats ­
tone’i silla abil nahka läbivad ioonivood.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Tabel 1  
Etalonkemikaalid  
Nimetus EINECSi number CASi nr  
1,2-diaminopropaan 201-155-9 78-90-0 tugevalt söövitav 
akrüülhape 201-177-9 79-10-7 tugevalt söövitav 
2-tert-butüülfenool 201-807-2 88-18-6 söövitav 
kaaliumhüdroksiid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 söövitav väävelhape (10 %) 231-639-5 7664-93-9 söövitav oktaanhape (kaprüülhape) 204-677-5 124-07-02 söövitav 4-amino-1,2,4-triasool 209-533-5 584-13-4 mittesöövitav eugenool 202-589-1 97-53-0 mittesöövitav 
fenetüülbromiid 203-130-8 103-63-9 mittesöövitav 
tetrakloroetüleen 204-825-9 27-18-4 mittesöövitav isosteariinhape 250-178-0 30399-84-9 mittesöövitav 4-(metüültio)-bensaldehüüd 222-365-7 3446-89-7 mittesöövitav
 
Enamik loetletud kemikaale on võetud ECVAMi rahvusvahelise vali ­
deerimisuuringu (4) jaoks valitud kemikaalide loetelust. Nende vali ­
mine põhineb järgmistel kriteeriumidel:  
i) söövitavate ja mittesöövitavate ainete võrdne arv;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) kaubanduslikult kättesaadavad ained, millega on hõlmatud oluli ­
semad keemiliste ainete klassid;  
iii) tugevalt söövitavate ja vähem söövitavate ainete lisamine 
loetellu, et võimaldada vahetegemist söövitusvõime alusel;  
iv) kemikaalid, mis ei kujuta laboris kasutamisel muud tõsist ohtu 
peale söövitava toime.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritav aine kantakse kuni 24 tunniks nahaliistakute epidermisele 
kahekambrilises katsesüsteemis, milles nahaliistakud toimivad vahe ­
seinana kambrite vahel. Nahaliistakud võetakse humaansel viisil surmatud 28–30 päeva vanustelt rottidelt. Söövitavad ained tehakse 
kindlaks nende võime järgi põhjustada normaalse sarvkihi  (stratum 
corneum)  terviklikkuse ja kaitsefunktsiooni kadumist, mida näitab 
TERi vähenemine allapoole läviväärtust (12). Roti TERi kriitiliseks väärtuseks on valitud 5 k Ω, selle valiku aluseks on suur hulk 
andmeid mitmesuguste kemikaalide kohta, kus enamik väärtusi olid 
kas tuntavalt üle (sageli rohkem kui 10 k Ω) või alla (sageli vähem 
kui 3 kΩ) selle väärtuse (12). Ained, mis ei ole loomadele mitte ­
söövitavad, kuid on ärritavad või mitteärritavad, üldiselt ei vähenda 
TERi sedavõrd, et see langeb alla kõnealuse kriitilise väärtuse. Muude nahapreparaatide või muu aparatuuri kasutamine võib seejuures muuta seda kriitilist väärtust ning sel juhul on vajalik 
täiendav valideerimine.
 
Meetodile on lisatud värvaine sidumise etapp, et kinnitada katseta ­
misel saadavaid TERi positiivseid tulemusi, sealhulgas 5 k Ω lähedal 
olevaid väärtusi. Värvaine sidumisega määratakse kindlaks, kas 
ioonilise läbitavuse suurenemine on tingitud sarvkihi füüsilisest hävi ­
misest. TERi meetodiga suudeti rotinahka kasutades prognoosida  in 
vivo söövitavat toimet jänesel, mida hinnati katsemeetodiga B.4 (2). 
Tuleb märkida, et  in vivo  katse jänesega on äärmiselt konservatiivne, 
nii naha söövitamise kui ka nahaärrituse seisukohast, võrreldes inim ­
naha tükikese katsega (15).  
1.5. MEETODI KIRJELDUS  
1.5.1.  Katseloomad  
Valitud liigiks on rott, kuna eelnevalt on tõendatud roti naha tund ­
likkus kemikaalide suhtes selles katses (viide 10). Roti vanus (naha võtmise hetkel) ja aretusliin on eriti tähtsad, kuna peab olema 
tagatud, et karvanääpsud on uinuvas faasis enne täiskasvanu karva ­
kasvu algust.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Väikeste kääridega eemaldatakse hoolikalt noorte, umbes 22päevaste 
(Wistar-päritolu või võrreldava aretusliiniga) emas- või isasrottide 
selja- ja küljekarv. Seejärel pestakse loomad hoolikalt pühkides ning pügatud piirkond kastetakse üleni antibiootikumilahusesse (mis sisaldab näiteks streptomütsiini, penitsilliini, klooramfenikooli 
ja amfoteritsiini kontsentratsioonis, mis pidurdab bakterite kasvu). 
Loomi pestakse antibiootikumidega uuesti kolmandal või neljandal päeval pärast esimest puhastust ning kasutatakse kolme päeva jooksul pärast teist puhastust, kui sarvkiht on karvade eemaldamisest 
paranenud.
 
1.5.2.  Nahaliistakute ettevalmistamine  
Loomad surmatakse humaansel viisil 28–30 päeva vanuses; see 
vanus on väga oluline. Seejärel eemaldatakse iga looma selja- ja 
küljenahk ning tõmmatakse sellelt ettevaatlikult maha liigne naha ­
alune rasvakiht. Nahast võetakse ümmargused liistakud läbimõõduga umbes 20 mm. Nahka võib enne liistakute kasutamist säilitada, kui on tõendatud, et positiivsed ja negatiivsed kontrollandmed on sama ­
väärsed värsket nahka kasutades saadud andmetega.
 
Iga nahaliistak asetatakse polütetrafluoroetüleentoru (edaspidi: 
PTFE-toru) ühele otsale, nii et toruga on kontaktis epidermise ­
poolne pind. Toru otsa surutakse naha paigal hoidmiseks kummist rõngastihend ja liigne kude lõigatakse ära. Toru ja rõngastihendi mõõtmed on esitatud joonisel 2. Seejärel ühendatakse kummist 
rõngastihendi ja PTFE-toru ühenduskoht hoolikalt vaseliiniga. 
Toru kinnitatakse vedruklambriga vastuvõtunõus, mis sisaldab magneesiumsulfaadi (MgSO
 4 ) lahust (154 mM) (joonis 1). Kogu 
nahaliistak peab asuma MgSO  4 lahuses. Ühe roti nahast võib saada 
10–15 nahaliistakut.  
Enne katse algust mõõdetakse iga looma naha kvaliteedi kontrolli ­
miseks kahe nahaliistaku elektritakistus. Mõlema liistaku elektrita ­
kistus peaks olema suurem kui 10 k Ω, ainult siis tohib ülejäänud 
liistakuid kasutada. Kui takistus on väiksem kui 10 k Ω, tuleb kõik 
sellest nahast saadud liistakud ära visata.  
1.5.3.  Uuritavate ja kontrollainete pealekandmine  
Uurimismudeli adekvaatse toimimise tagamiseks tuleks igas uuringus 
kasutada paralleelselt nii positiivseid kui ka negatiivseid kontrollai ­
neid. Tuleks kasutada ühelt ja samalt loomalt saadud nahaliistakuid. 
Soovitatavad positiivsed ja negatiivsed kontrollained on vastavalt 10 
M soolhape ja destilleeritud vesi.  
Vedelad katseained (150 μl) kantakse ühtlaselt toru sees olevale 
epidermisele. Tahke aine uurimisel kantakse piisav kogus tahket 
ainet ühtlaselt nahaliistakule, nii et kogu epidermise pind on kaetud. Tahkele ainele valatakse deioniseeritud vett (150 μl) ja toru raputa ­
takse ettevaatlikult. Nahaga maksimaalse kontakti saavutamiseks 
võib tahke aine olla sulamiseks või pehmenemiseks soojendatud 
kuni 30
 o C-ni või peenestatud teralise materjali või pulbri saamiseks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Iga uuritava ja kontrollaine puhul kasutatakse kolme nahaliistakut. 
Uuritav aine kantakse liistakule 20–23  o C juures 24 tunniks. Uuritav 
aine kõrvaldatakse pesemisega kuni 30kraadise kraanivee joa all, kuni täiendavat materjali maha pesta enam ei õnnestu.
 
1.5.4.  TER i mõõtm ine  
Naha impedantsi – TERi – mõõdetakse madalpingel töötava 
Wheatstone'i vahelduvvoolusilla abil (13). Mõõtesilla üldised tehni ­
lised näitajad on järgmised: tööpinge 1–3 V, siinus- või ristkülikva ­
helduvvool sagedusega 50–1 000 Hz ja mõõtediapasoon vähemalt 0,1–30 k Ω. Valideerimisel kasutatud mõõtesillaga mõõdetakse 
induktiivsust, mahtuvust ja takistust kuni väärtusteni vastavalt 
2 000 H, 2 000 μF ja 2 MD sagedustel 100 Hz või 1 kHz, kasutades 
jada- või rööpühenduse puhul saadud näitusid. TERi määramiseks söövitavuskatses registreeritakse takistuse väärtused sagedusel 100 Hz, kasutades jadaühenduse puhul saadud näitusid. Enne elek ­
tritakistuse mõõtmist vähendatakse naha pindpinevust, lisades epider ­
mise katmiseks piisavas koguses 70 %list etanooli. Mõne sekundi pärast eemaldatakse etanool torust ja kude niisutatakse 3 ml MgSO
 4 
lahuse (154 mM) lisamisega. Nahaliistaku mõlemale küljele paiguta ­
takse mõõtesilla elektroodid, et mõõta takistust ühikutes k Ω/­
nahaliistak (joonis 1). Elektroodi mõõtmed ja hammasklambrist alla ­
poole ulatuva elektroodiosa pikkus on esitatud joonisel 2. Sisemisele elektroodile kinnitatav klamber toetub takistuse mõõtmise ajal PTFE- 
toru otsale, nii et elektrood on ettenähtud pikkuses sukeldatud 
MgSO
 4 lahusesse. Välimine elektrood paigutatakse vastuvõtunõusse 
nii, et see toetub nõu põhjale. Vedruklambri ja PTFE-toru põhja 
vaheline kaugus hoitakse konstantne (joonis 2), sest see kaugus 
mõjutab saadud takistuse väärtust. Seega peaks vahemaa sisemise elektroodi ja nahaliistaku vahel olema konstantne ja minimaalne (1–2 mm).
 
Kui mõõdetud takistuse väärtus on üle 20 k Ω, võib see olla tingitud 
nahaliistaku epidermist katva katseaine jääkidest. Võib proovida seda 
kihti veel kord eemaldada, näiteks sulgedes PTFE-toru kinnastatud pöidlaga ja loksutades seda umbes kümne sekundi jooksul; MgSO
 4 
lahus valatakse ära ja takistuse mõõtmist korratakse värske MgSO  4 
lahusega.  
Katseseadme omadused ja mõõtmed ning katse läbiviimise kord 
võivad mõjutada saadud TERi väärtusi. Söövituse läviväärtus 5 k Ω 
töötati välja käesolevas metoodikas kirjeldatud konkreetse seadme ja mõõtmismeetodiga saadud andmete põhjal. Katsetingimuste muut ­
misel või teistsuguse seadme kasutamisel võivad lävi- ja kontroll ­
väärtused olla teised. Seepärast on vaja metoodika ja takistuse lävi ­
väärtused kalibreerida, tehes mõõtmisi valideerimisel kasutatud kemi ­
kaalide (4 ja 5) või uuritavate kemikaalidega sarnaste keemiliste 
klasside hulgast valitud etalonkemikaalidega. Sobivate etalonkemi ­
kaalide loetelu on esitatud tabelis 1.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Värvaine sidumisel põhinevad meetodid  
Teatavate mittesöövitavate ainetega kokkupuutumise tulemusel võib 
takistus väheneda alla kriitilise väärtuse 5 k Ω, võimaldades iooni ­
voogudel liikuda läbi sarvkihi ja vähendades niimoodi elektritakistust 
(5). Näiteks võivad pinnakihti mõjutavate omadustega neutraalsed 
orgaanilised ühendid ja kemikaalid (sealhulgas detergendid, emulgaa ­
torid ja muud pindaktiivsed ained) eemaldada nahast lipiidid, muutes kaitsekihi ioonidele paremini läbitavaks. Kui uuritavate ainete TERi 
väärtused nähtavate kahjustuste puudumise korral on väiksemad kui 
5 kΩ või sellega võrdsed, tuleks seepärast nii kontroll- kui ka katse ­
koega viia läbi värvaine sissetungimise määramine, mis võimaldab 
otsustada, kas saadud TERi väärtused olid põhjustatud naha suure ­
nenud läbilaskevõimest või söövitusest (3 ja 5). Viimasel juhul tungib värvaine sulforodamiin B nahapinnale kantuna vigastatud sarvkihi kohalt kiiresti läbi naha ja värvib nahaalused koed. See 
konkreetne värvaine on püsiv paljude kemikaalide suhtes ning seda 
ei mõjuta allpool kirjeldatud ekstraheerimine.
 
1.5.5.1.  Värvaine sulforodamiin B pealekandmine ja kõrvaldamine  
Pärast TERi määramist valatakse magneesiumsulfaat torust välja ja 
nahka uuritakse hoolikalt märgatavate kahjustuste suhtes. Kui märga ­
tavaid kahjustusi ei ole, kantakse iga nahaliistaku epidermiseküljele kaheks tunniks 150 μl värvaine sulforodamiin B (happeline punane 
52; C.I. 45100; EINECSi number 222-529-8; CASi number 3520-42- 
1) 10 %list (mass/maht) lahust destilleeritud vees. Seejärel pestakse 
nahaliistakuid mitte soojema kui toatemperatuuril kraaniveega ligi ­
kaudu kümme sekundit liigse/mitteseotud värvaine eemaldamiseks. Iga nahaliistak eemaldatakse ettevaatlikult PTFE-torult ja asetatakse 
väiksesse pudelisse (nt 20 ml klaasist stsintillatsioonianum), mis 
sisaldab deioniseeritud vett (8 ml). Pudelikesi loksutatakse ettevaat ­
likult viis minutit, et eemaldada kogu mitteseotud värvaine. Seejärel loputusprotseduuri korratakse ning pärast seda eemaldatakse nahaliis ­
takud ja pannakse väikestesse pudelitesse, mis sisaldavad 5 ml 
30 %list (mass/maht) naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) lahust destil ­
leeritud vees ning inkubeeritakse temperatuuril 60
 o C hommikuni.  
Pärast inkubeerimist eemaldatakse nahaliistakud ja visatakse ära 
ning järelejäänud lahust tsentrifuugitakse kaheksa minutit tempera ­
tuuril 21  o C (suhteline tsentrifugaaljõud ~175 g). Seejärel lahjenda ­
takse supernatandist võetud 1 ml proovi viis korda (maht/maht) (st 
1 ml + 4 ml) 30 %lise (massi/mahuprotsent) SDSiga destilleeritud 
vees. Mõõdetakse lahuse optiline tihedus lainepikkusel 565 nm.  
1.5.5.2.  Värvaine sisalduse arvutamine  
Värvaine sulforodamiin B sisaldus liistakus arvutatakse optilise tihe ­
duse väärtustest (5) (värvaine sulforodamiin B molaarne ekstinkt ­
sioonikoefitsient lainepikkusel 565 nm on 8,7 x 10  4 ; molekulmass 
on 580). Sobiva kalibreerimiskõvera abil määratakse värvainesisaldus igas nahaliistakus ning seejärel arvutatakse värvaine keskmine 
sisaldus paralleelkatsetes.
 
2. ANDMED  
Takistuse väärtused (k Ω) ja värvainesisalduse keskmised väärtused 
(μg/liistak) tuleks võimaluse korral esitada tabelina nii uuritava aine 
kui ka positiivse ja negatiivse kontrollproovi kohta (üksikkatsete 
tulemused ja keskmised ± standardhälve); esitatakse kõigi paralleel- 
või korduskatsete tulemused, keskmised ja individuaalsed väärtused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
TERi keskmised tulemused on aktsepteeritavad, kui samaaegsete 
positiivsete ja negatiivsete kontrollkatsete väärtused langevad väär ­
tuste lubatud vahemikku, mis on mõõtmist läbiviivas laboris saadud 
käesoleva meetodi puhul. Lubatud takistuse piirväärtused eespool 
kirjeldatud metoodika ja seadme puhul on esitatud järgmises tabelis:  
Kontrollkatse Aine Takistuse 
vahemik (k Ω) 
positiivne 10 M soolhape 0,5–1,0 
negatiivne destilleeritud vesi 10–25  
Värvaine sidumise keskmised tulemused on aktsepteeritavad tingi ­
musel, et samaaegsed kontrollväärtused jäävad meetodi jaoks lubatud 
piiridesse. Soovitatavad aktsepteeritavad värvainesisalduse vahe ­
mikud kontrollainete jaoks eespool kirjeldatud metoodika ja seadme puhul on järgmised:
 
Kontrollkatse Aine  Värvainesisal ­
duse vahemik 
(μg/liistak)  
positiivne 10 M soolhape 40–100 
negatiivne destilleeritud vesi 15–35  
Katseainet peetakse nahka mitte söövitavaks, kui  
i) uuritava aine jaoks saadud TERi keskmine väärtus on üle 
5 kΩ või  
ii) TERi keskmine väärtus on väiksem kui 5k Ω või sellega võrdne ja  
— nahaliistakul ei näi olevat silmanähtavat kahjustust;  
— nahaliistaku keskmine värvainesisaldus on palju väiksem liis ­
taku keskmisest värvainesisaldusest samaaegselt tehtud posi ­
tiivses kontrollkatses 10 M HCl-ga.  
Katseaine loetakse nahka söövitavaks, kui:  
i) TERi keskmine väärtus on väiksem kui 5 k Ω või sellega võrdne 
ja nahaliistak on märgatavalt kahjustatud või  
ii) TERi keskmine väärtus on väiksem kui 5 k Ω või sellega 
võrdne ja  
— nahaliistakul ei paista märgatavat kahjustust, aga  
— nahaliistaku keskmine värvainesisaldus on suurem kui liistaku 
keskmine värvainesisaldus samaaegselt läbiviidud positiivses 
kontrollkatses 10 M HCl-ga või sellega võrdne.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuandes esitatakse järgmine teave.  
Uuritav aine ja kontrollaine:  
— keemiline nimetus või nimetused, nagu IUPACi või CASi 
nimetus ja CASi number, kui on teada;  
— aine puhtus või valmisuse koostis (massiprotsendina), füüsika ­
lised omadused;  
— füüsikalis-keemilised omadused nagu füüsiline olek, pH, püsivus, 
lahustuvus vees, mis on olulised katse  
— läbiviimise seisukohast;  
— uuritava/kontrollaine töötlemine enne katset, kui see on asjako ­
hane (nt soojendamine, peenestamine);  
püsivus, kui on teada.  
— Katseloomad:  
— kasutatud aretusliinid ja sugu;  
— looma vanus doonorloomana kasutamise hetkel;  
— päritolu, pidamistingimused, toit jms;  
naha ettevalmistamise üksikasjad.  
— Katsetingimused:  
— katseseadme kalibreerimiskõverad;  
— kalibreerimiskõverad värvaine sidumise katse läbiviimiseks;  
— TERi mõõtmise meetodi üksikasjad;  
— värvaine sidumise määramismeetodi üksikasjad (vajaduse korral);  
— kõigi metoodikas tehtud muudatuste kirjeldus;  
kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus.  
— Tulemused:  
— andmetabelid TERi ja värvaine sidumise katsete kohta (kui 
sellised katseid tehti) üksikute loomade ja üksikute nahaproovide kaupa; mis tahes täheldatud muutuste kirjeldus.
 
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. 
http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- 
mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ 
Corrosion.  
3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and 
Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
 
4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., 
Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM inter ­
national validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471-482.
 
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483-524.
 
6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62pp.  
7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and 
Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH 
Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
 
9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.  
10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcu ­
taneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods 
for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publi ­
cation No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, 
National Institute of Environmental Health Sciences, Research 
Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ epiddocs/epis_brd.pdf.
 
11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat  
12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  in 
vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic. in Vitro 6, 191-194.  
14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: 709-720.
 
15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., 
Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
 
16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7-17.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Joonis 1  
Rotinaha TERi mõõtmisel kasutatav seade
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Joonis 2  
Polütetrafluoroetüleentoru (PTFE-toru) j a vastuvõtunõu ning kasutatud 
elektroodide mõõtmed
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Olulised tegurid eespool kujutatud seadme puhul:  
— PTFE-toru siseläbimõõt;  
— elektroodide pikkus PTFE-toru ja vastuvõtunõuga võrreldes on 
selline, et nahaliistak ei puutuks elektroodide vastu ning et elek ­
troodi teatav standardpikkus oleks kokkupuutes MgS0  4 lahusega;  
— MgSO  4 lahuse hulk vastuvõtunõus peaks vedeliku tasemega 
PTFE torus võrreldes olema selline, et vedeliku sügavus vastaks 
joonisel 1 näidatule;  
— nahaliistak peaks olema kinnitatud PTFE-toru külge nii hästi, et 
elektritakistus iseloomustaks tõepoolest naha omadusi.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40b.  NAHASÖÖVITUS  IN VITRO:  KATSE INIMNAHA MUDELIGA  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 431 (2004).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Nahasöövitus tähendab pöördumatu koekahjustuse tekitamist nahas 
uuritava ainega (vastavalt keemiliste ainete ja segude liigitamise ja märgistamise ülemaailmselt harmoneeritud süsteemi (GHS) määratlu ­
sele) (1). Käesoleva meetodi puhul ei kasutata nahka söövitava toime 
hindamiseks elusloomi ega loomset kudet.
 
Nahka söövitava toime hindamisel on tavaliselt kasutatud labori ­
loomi (2). Kuna selline määramine põhjustab loomadele valu ja kannatusi, töötati välja katsemeetodi B.4 uus versioon, millega 
saab nahka söövitavat toimet hinnata alternatiivsete  in vitro  meeto­
ditega, vältides loomadele valu ja kannatuste tekitamist.
 
Esimene samm muude katsete määratlemisel, mida saaks kasutada 
nahka söövitava toime uurimiseks õigusliku reguleerimise eesmärgil, 
oli eelvalideerimisuuring (3). Seejärel viidi läbi nahasöövituse hinda ­
mise  in vitro  meetodite (4 ja 5) vormikohane valideerimine (6, 7 ja 
8). Kõnealuste uuringute ja muude kirjandusandmete (9) alusel soovitatakse  in vivo  nahka söövitava toime määramiseks kasutada 
järgmisi katseid (10–13): katse inimnaha mudeliga (käesolev meetod) 
ja transkutaanse elektritakistuse mõõtmine (vt katsemeetod B.40).
 
Valideerimisuuringutega on näidatud, et katsetega inimnaha mudelil 
(3, 4, 5 ja 9) saab usaldusväärselt eristada teadaolevaid nahka söövi ­
tavaid ja mittesöövitavaid aineid. Katseprotokolli alusel võib samuti 
teha järeldusi, kas aine kuulub nahka tugevalt või nõrgalt söövitavate ainete hulka.
 
Käesolevas metoodikas kirjeldatud katse võimaldab kindlaks teha 
söövitavad keemilised ained ja segud. Samuti võimaldab see kindlaks 
määrata mittesöövitavad ained ja segud, kui seejuures arvestatakse ka muid kaalukaid tõendeid (nt pH, struktuuri-aktiivsuse seos, inim- või loomkatsete andmed) (1, 2, 13 ja 14). Katse ei anna üldiselt piisavat 
teavet nahaärrituse kohta, samuti ei võimalda see söövitavate ainete 
liigitamist ülemaailmselt harmoneeritud liigitus süsteemi (GHS) (viide 1) lubatavuskriteeriumide alusel alamkategooriatesse.
 
Lokaalse nahatoime täielikul hindamisel pärast naha ühekordset 
kokkupuudet ainega on soovitatav järgida järjestikuste katsete stra ­
teegiat, mis on esitatud katsemeetodi B.4 (2) lisas ja ülemaailmselt harmoneeritud süsteemis (1). Nimetatud strateegia hõlmab  in vitro  
katsete läbiviimist nahasöövituse (nagu kirjeldatud käesolevas 
meetodis) ja nahaärrituse uurimiseks, enne kui hakatakse kaaluma 
katsete läbiviimist elusloomadega.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. MÕISTED  
Nahasöövitus  in vivo  – pöördumatu kahjustuse tekitamine nahas: 
läbi epidermise pärisnahka (dermasse) ulatuv nähtav nekroos, mis tekib kuni neljatunnisel kokkupuutel katseainega. Söövitusreaktsioo ­
nide tüüpilised avaldumisvormid on haavandid, verejooks, verised 
kärnad ning 14päevase vaatlusperioodi lõpuks värvimuutus naha valastumise tõttu, täielikult karvavabad alad ja armid. Küsitavate kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilisi uuringuid.
 
Rakkude eluvõimelisus  – rakupopulatsiooni üldist aktiivust (nt raku 
mitokondrite dehüdrogenaaside võime taandada vitaalvärvainet MTT) väljendav parameeter, mis olenevalt mõõdetavast muutujast 
ja katseplaanist korreleerub rakkude koguarvu ja/või vitaalsusega.
 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Tabel 1  
Etalonkemikaalid  
Nimetus EINECSi number CASi nr  
1,2-diaminopropaan 201-155-9 78-90-0 tugevalt söövitav 
akrüülhape 201-177-9 79-10-7 tugevalt söövitav 2-tert-butüülfenool 201-807-2 88-18-6 söövitav 
kaaliumhüdroksiid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 söövitav 
väävelhape (10 %) 231-639-5 7664-93-9 söövitav oktaanhape (kaprüülhape) 204-677-5 124-07-02 söövitav 4-amino-1,2,4-triasool 209-533-5 584-13-4 mittesöövitav eugenool 202-589-1 97-53-0 mittesöövitav fenetüülbromiid 203-130-8 103-63-9 mittesöövitav 
tetrakloroetüleen 204-825-9 27-18-4 mittesöövitav 
isosteariinhape 250-178-0 30399-84-9 mittesöövitav 4-(metüültio)-bensaldehüüd 222-365-7 3446-89-7 mittesöövitav
 
Enamik loetletud kemikaale on võetud ECVAMi rahvusvahelise vali ­
deerimisuuringu (4) jaoks valitud kemikaalide loetelust. Nende vali ­
mine põhineb järgmistel kriteeriumidel:  
i) söövitavate ja mittesöövitavate ainete võrdne arv;  
ii) kaubanduslikult kättesaadavad ained, millega on hõlmatud oluli ­
semad keemiliste ainete klassid;  
iii) tugevalt söövitavate ja vähem söövitavate ainete lisamine 
loetellu, et võimaldada vahetegemist söövitusvõime alusel;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) kemikaalid, mis ei kujuta laboris kasutamisel muud tõsist ohtu 
peale söövitava toime.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritav aine kantakse paikselt kolmemõõtmelisele inimnaha mude ­
lile, mis sisaldab vähemalt talitleva sarvkihiga  (stratum corneum)  
rekonstrueeritud epidermist. Söövitavad ained tehakse kindlaks 
nende võime järgi vähendada rakkude eluvõimelisust (mis määra ­
takse näiteks MTT taandamise katse abil (15)) alla kindlaksmääratud läviväärtuse kindla toimeaja jooksul. Inimnaha mudeli katse põhineb hüpoteesil, et söövitavad kemikaalid suudavad difusiooni või 
erosiooni teel tungida läbi sarvkihi ja on tsütotoksilised allpool 
asuvatele rakukihtidele.
 
1.4.1.  Katse käik  
1.4.1.1.  Inimnaha mudelid  
Võib kasutada tööstuslikult konstrueeritud või saadud inimnaha 
mudelit (nt mudelid EpiDerm™ ja EPISKIN™) (16–19) või mudelit, mis on välja töötatud või konstrueeritud oma laboris (20 ja 21). Inimese naha kasutamine toimub muidugi vastavalt iga riigi ja 
rahvusvahelistele eetilistele tõekspidamistele ja tingimustele. Iga 
uus mudel tuleks valideerida (vähemalt sel määral, nagu kirjeldatud punktis 1.4.1.1.2). Käesolevas katses kasutatavad inimnaha mudelid peavad vastama järgmistele tingimustele:
 
1.4.1.1.1. M u d e l i ü l d i s e d t i n g i m u s e d  
Epiteelkoe ehitamiseks tuleb kasutada inimese epiteelrakke (kerati ­
notsüüte). Talitleva sarvkihi all peab olema mitu kihti eluvõimelisi 
epiteelrakke. Nahamudelis võib olla ka stroomakiht. Sarvkiht peab olema mitmekihiline ja vajaliku lipiidse koostisega, et tekiks sellise tugevusega funktsionaalne kaitsekiht, mis suudab takistada tsütotok ­
siliste markerite kiiret läbitungimist. Mudel peab olema selline, et 
aine ei saaks tungida eluskudedesse sarvkihist mööda minnes. Kui uuritav aine pääseb sarvkihist mööda, siis ei modelleeri see süsteem enam uuritava aine kokkupuutumist nahaga. Nahamudel ei tohi olla 
saastunud bakterite (sealhulgas mükoplasma) ega seentega.
 
1.4.1.1.2. M u d e l i f u n k t s i o n a a l s e d t i n g i m u s e d  
Eluvõimelisust mõõdetakse tavaliselt MTT või muude metaboolselt 
muundatavate vitaalvärvainete abil. Sellisel juhul peab negatiivse 
kontrolli koest ekstraheeritud (lahustatud) värvaine optiline tihedus (OD) olema vähemalt 20 korda suurem kui ekstraheerimislahuse OD (vt ülevaade, 22). Negatiivse kontrolli kude peaks olema kasvata ­
misel stabiilne (eluvõimelisuse näitajad ei tohiks muutuda) kogu 
katseaja jooksul. Sarvkiht peaks olema piisavalt tugev, et teatavad tsütotoksilised markerkemikaalid (nt 1 % Triton X-100) ei saaks sellest kiiresti läbi tungida. Seda omadust saab hinnata kokkupuu ­
teaja järgi, mis on vajalik rakkude eluvõimelisuse vähendamiseks 
50 % võrra (ET
 50 ) (nt EpiDerm™ ja EPISKIN™ mudelite puhul 
on see üle kahe tunni). Kudet peaks saama reprodutseerida ajas ja eelistatavalt ka eri laborites. Lisaks peaks koega saama valitud katse ­
meetodit kasutades prognoosida võrdluskemikaalide (vt tabel 1) 
söövitusvõimet.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Uuritavate ja kontrollainete pealekandmine  
Iga töötlemise (kokkupuuteaja), sealhulgas kontrollproovide puhul 
kasutatakse kahte ühesugust koeproovi. Vedela aine korral tuleb nahale kanda piisav kogus uuritavat ainet, et see kataks naha ühtla ­
selt: tuleks kasutada vähemalt 25 μl/cm
 2 . Tahket uuritavat ainet tuleb 
nahale kanda piisav kogus, et see kataks kogu naha ühtlaselt, ja niisutada deioniseeritud või destilleeritud veega, et tagada hea kontakt nahaga. Tahked ained tuleks enne pealekandmist peenestada 
vajaduse korral pulbriks. Tuleb valida uuritava aine kohane peale ­
kandmise meetod (vt nt viidet 5). Kokkupuuteperioodi lõpus tuleb katseaine nahapinnalt hoolikalt maha pesta sobiva puhverlahusega 
või 0,9 %lise NaCl lahusega.
 
Uurimismudeli adekvaatsuse tõendamiseks tuleks igas uuringus kasu ­
tada paralleelselt nii positiivseid kui ka negatiivseid kontrollaineid. Soovitatavad positiivsed kontrollained on jää-äädikhape või 8N KOH. Soovitatavad negatiivsed kontrollained on 0,9 %line NaCl 
või vesi.
 
1.4.1.3.  Rakkude eluvõimelisuse mõõtmine  
Rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks võib kasutada ainult kvantita ­
tiivseid valideeritud meetodeid. Lisaks peab eluvõimelisuse mõõt sobima kasutamiseks kolmemõõtmelises koekonstruktsioonis. Värv ­
aine mittespetsiifiline sidumine ei tohi segada eluvõimelisuse mõõt ­
mist. Seepärast ei sobi valku siduvad värvained ja ained, mida meta ­
boolselt ei muundata (nt neutraalpunane). Kõige sagedamini kasu ­
tatav katse on MTT [3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetra ­
sooliumbromiid, tiasolüülsinine: EINECSi number 206-069-5, CASi 
number 298-93-1)] taandamine, mille kohta on näidatud, et tule ­
mused on täpsed ja reprodutseeritavad (5), kuid kasutada võib ka muid. Nahaproov asetatakse sobiva kontsentratsiooniga (nt 
0,3–1 mg/ml) MTT lahusesse sobival inkubatsioonitemperatuuril 
kolmeks tunniks. Sadestunud sinine formasaan ekstraheeritakse seejärel lahustiga (isopropanool) ja formasaani kontsentratsioon määratakse OD mõõtmisega lainepikkusel 540–595 nm.
 
Uuritava aine keemiline toime vitaalvärvile võib jäljendada raku 
ainevahetust, mille tagajärjel hinnatakse eluvõimelisust valesti. See juhtub siis, kui uuritavat ainet ei ole loputamisega nahalt täielikult eemaldatud (9). Kui uuritav aine reageerib otse vitaalvärviga, tuleks 
kasutada täiendavaid kontrollproove, et avastada ja parandada uuri ­
tava aine segavat mõju eluvõimelisuse määramisele (9 ja 23).
 
2. ANDMED  
Iga koe puhul esitatakse OD väärtused ja rakkude eluvõimelisuse 
andmed (protsentides) uuritava aine ning positiivsete ja negatiivsete kontrollproovide kohta tabelina; tabelis esitatakse ka andmed dublee ­
ritud korduskatsetest, kui neid tehti, ning keskmised ja individuaal ­
väärtused.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Iga uuritava proovi kohta saadud OD väärtusi saab kasutada selleks, 
et arvutada rakkude eluvõimelisuse protsent, võrreldes negatiivse kontrollprooviga, mille eluvõimelisus on võetud võrdseks 100 %ga. 
Rakkude eluvõimelisuse protsendi kriitiline väärtus, mille alusel 
jagatakse ained söövitavateks ja mittesöövitavateks (või erineva söövitusvõimega ainete klassidesse), ning statistikameetodid, mida kasutatakse tulemuste hindamiseks ja söövitavate ainete kindlaks ­
määramiseks, tuleb selgesti määratleda ja dokumenteerida ning 
nende valik peab olema põhjendatud. Üldiselt määratakse need krii ­
tilised väärtused katse optimeerimise käigus, neid katsetatakse eelva ­
lideerimise etapis ja kinnitatakse valideerimisuuringuga. Näiteks 
söövitava toime ennustamine EpiDerm™ mudeliga tehtud katse alusel toimub järgmiselt (9).
 
Uuritav aine loetakse nahka söövitavaks, kui  
i) eluvõime pärast kolmeminutilist kokkupuudet on alla 50 % või  
ii) eluvõime pärast kolmeminutilist kokkupuudet on suurem kui 
50 % või sellega võrdne ja eluvõime pärast ühetunnist kokku ­
puudet on alla 15 %.  
Uuritav aine loetakse nahka mittesöövitavaks, kui  
i) eluvõime pärast kolmeminutilist kokkupuudet on suurem kui 50 % 
või sellega võrdne ja eluvõime pärast ühetunnist kokkupuudet on 
15 % või üle selle.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuandes tuleb esitada järgmine teave.  
Uuritav ja kontrollaine:  
— keemiline nimetus või keemilised nimetused, nagu IUPACi või 
CASi nimetus ja CASi number, kui on teada;  
— aine puhtus või valmisuse koostis (massiprotsendina);  
— füüsikalis-keemilised omadused, nagu füüsiline olek, pH, 
püsivus, lahustuvus vees, mis on olulised katse läbiviimise seisu ­
kohast;  
— uuritava/kontrollaine töötlemine enne katset, kui see on asjako ­
hane (nt soojendamine, peenestamine);  
— püsivus, kui on teada.  
Kasutatud nahamudeli ja katse tegemise käigu põhjendus.  
Katsetingimused:  
— kasutatud rakusüsteem;  
— rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks kasutatud mõõteriista (nt 
spektrofotomeetri) kaliibrimist käsitlev teave;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— kogu täiendav teave kasutatud konkreetse nahamudeli ja selle 
valideerimise kohta;  
— katsemetoodika üksikasjad;  
— kasutatud uuritavad annused;  
— kõigi metoodikas tehtud muudatuste kirjeldus;  
— viide varasematele andmetele mudeli kohta;  
— kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus.  
Tulemused:  
— andmetabelid individuaalsete uuritavate proovide kohta;  
— mis tahes täheldatud toimete kirjeldus.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assess ­
ment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:// 
www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- mono(2001)6.
 
2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion.  
3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., 
Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report recommendations of ECVAM 
Workshop 6 ATLA 23, 219-255.
 
4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). TheECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471- 482.
 
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team  Toxic. In Vitro 12, 483-524.
 
6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62pp.  
7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. MH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http:// ­
iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371-401.
 
10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.  
11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.  
12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin Transcu ­
taneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. 
NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicolo ­
gical Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.ni 
ehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf
 
13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat  
14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
 
15) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55-63.  
16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and 
Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy 
testing. Toxic. In Vitro 8, 889-891.  
17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characte ­
rization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211-225.
 
18) Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Poura ­
dier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133-140.
 
19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, 
Thivolet J (1991). In vitro and post -transplantation differentia ­
tion of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental 
Cell Research 193: 310-319.
 
20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosen ­
berg, H. (1992). The organotypic culture of human skin kera ­
tinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cyto ­
technology 9, 163-171.  
21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, 747-756.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical 
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to 
measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84.  
23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R, Harbell, J.W., 
Heylings, J.R, Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. In Vitro J15, 57-93.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  IN VITRO  3T3 NRU FOTOTOKSILISUSE KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev meetod vastab suunisele OECD TG 432 (2004).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Fototoksilisust määratletakse kui kehale kantud aine toksilist reakt ­
siooni, mis tekib või (madalama doosi puhul) ägeneb pärast järg ­
nevat kokkupuudet valguskiirgusega või mille kutsub esile naha kiiritamine pärast aine süsteemset manustamist.
 
In vitro  3T3 NRU fototoksilisuse katset kasutatakse selleks, et teha 
kindlaks kokkupuutel valgusega ergastanud uuritava aine fototoksi ­
lisus. Katsega hinnatakse fototsütotoksilisust: kuivõrd sõltub rakkude 
eluvõime vähenemine kemikaaliga kokkupuutumisel sellest, kas see 
toimub valguse käes või pimedas. Selles katses positiivseks osutunud ained on tõenäoliselt fototoksilised  in vivo  pärast süsteemset manus ­
tamist ja naha sisse jõudmist või pärast paikset kasutamist.
 
Fototoksiline mõju on leitud paljudel kemikaaliliikidel (viited 1–4). 
Nende ühine omadus on võime neelata valgusenergiat päikeseval ­
guse lainepikkustel. Fotokeemia esimese seaduse (Grotthausi-Draperi 
seadus) kohaselt on fotoreaktsiooni toimumiseks vajalik piisava 
hulga valguskvantide neeldumine. Seepärast tuleb enne bioloogilise katse sooritamist määrata uuritava kemikaali UV ja nähtava valguse neeldumisspekter vastavalt OECD katsejuhendile 101. Väidetakse, et 
kui molaarse ekstinktsiooni/neeldumise koefitsient on väiksem kui 10 
l × mol
 -1 × cm  -1 , ei ole kemikaal tõenäoliselt valgustundlik. Sellisele 
kemikaalile ei ole vaja teha  in vitro  3T3 NRU fototoksilisuse katset 
või muud bioloogilist katset kahjuliku fotokeemilise toime kindlaks ­
tegemiseks (1 ja 5). Vt ka lisa 1.  
Hiljuti hinnati  in vitro  3T3 NRU fototoksilisuse katse usaldus ­
väärsust ja asjakohasust (6–9). Näidati, et  in vitro  3T3 NRU 
fototoksilisuse katsega saab prognoosida ägedat fototoksilist reakt ­
siooni loomadel ja inimestel  in vivo.  Katse eesmärk ei ole prog ­
noosida muid kahjulikke toimeid, mis võivad ilmneda kemikaali ja valguse koostoimel, nagu fotogenotoksilisus, fotoallergia või fotokantserogeensus, samuti ei võimalda see hinnata fototoksilist 
potentsiaali. Lisaks ei ole katse ette nähtud fototoksilisuse kaud ­
sete mehhanismide, uuritava aine metaboliitide mõju või segude mõju kontrollimiseks.
 
Kuigi kõigi genotoksilise ja kantserogeense potentsiaali ennustami ­
seks tehtavate  in vitro  katsete korral on üldiselt nõutav metabolisee ­
riva süsteemi kasutamine, on seni vähe näiteid, kus kemikaali  in vivo  
või in vitro  fototoksilise toime avaldumiseks on vaja metaboolset 
transformatsiooni. Seega ei peeta vajalikuks ega teaduslikult põhjen ­
datuks, et käesolevat katset tuleks läbi viia metaboolse aktiveerimis ­
süsteemi abil.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. MÕISTED  
Kiiritustihedus  – pinnale langeva ultraviolett- (UV) või nähtava 
valguse intensiivsus, mida mõõdetakse ühikutes W/m  2 või W/cm  2 . 
Kiiritusannus  – pinnale langeva ultraviolett- või nähtava kiirguse 
hulk (s.o intensiivsus × aeg), mida väljendatakse džaulides (Ws) 
pinnaühiku kohta, näiteks  J/m  2 või J/cm  2 . 
UV-valguse lainealad  – CIE (Rahvusvaheline Valgustuskomisjon) 
soovitatud tähistused on järgmised: UVA (315–400 nm), UVB 
(280–315 nm) ja UVC (100–280 nm). Kasutatakse ka teisi nimetusi; piiriks UVB ja UVA vahel võetakse sageli 320 nm ja UVA võib jagada aladeks UV-A1 ja UV-A2 piiriga umbes 340 nm juures.
 
Rakkude eluvõimelisus  – rakupopulatsiooni üldist aktiivsust 
(näiteks vitaalvärvi neutraalpunase neeldumist raku lüsosoomidesse) 
väljendav parameeter, mis olenevalt mõõdetavast muutujast ja katse ­
plaanist korreleerub rakkude koguarvu ja/või vitaalsusega.  
Rakkude suhteline eluvõimelisus  – rakkude eluvõimelisus, mida 
väljendatakse lahusti (negatiivsete) kontrollproovide suhtes, millega tehakse läbi kogu katse (kas +Irr või –Irr), välja arvatud uuritava 
kemikaaliga töötlemine.
 
PIF (  Photo-Irritation-Factor  – fotoärrituvustegur)  – tegur, mis 
põhineb sellel, et võrreldakse uuritava kemikaali kahte võrdselt tsüto ­
toksilist kontsentratsiooni (IC  50 ): valguse puudumisel (–Irr) ja kiiri ­
tamisel mittetsütotoksilise UVA või nähtava valgusega (+Irr).  
IC 50 – uuritava kemikaali kontsentratsioon, mis vähendab rakkude 
elujõulisust 50 %.  
MPE  (Mean-Photo-Effect  – keskmine fotoefekt)  – mõõdetav 
suurus, mis saadakse kontsentratsiooni-mõju sõltuvuste matemaatilise 
analüüsiga, võrreldes mõju valguse puudumisel (–Irr) ja kiiritamisel mittetsütotoksilise UVA või nähtava valgusega (+Irr).
 
Fototoksilisus  – äge toksiline reaktsioon, mis tekib pärast naha 
kokkupuudet teatava kemikaaliga ja sellele järgnevat kiiritamist või mida sarnasel viisil tekitab naha kiiritamine pärast kemikaali 
süsteemset manustamist.
 
1.3. MEETODI PÕHIMÕTE  
In vitro  3T3 NRU fototoksilisuse katses võrreldakse kemikaali tsüto ­
toksilisust pimeduses ja päikesevalgusele samase valguse mittetsüto ­
toksilise annusega kiiritamisel. Tsütotoksilisus avaldub käesolevas katses vitaalvärvi neutraalpunase rakkudes neeldumise vähenemi ­
sena, sõltuvalt uuritava aine kontsentratsioonist; seda mõõdetakse 
24 tundi pärast uuritava kemikaaliga töötlemist ja kiiritamist (10). Neutraalpunane on nõrk katioonne värvaine, mis tungib mittedifu ­
sioonilisel teel kergesti läbi rakumembraani ja koguneb rakus lüso ­
soomidesse. Tundliku lüsosoomimembraani muutused muudavad 
lüsosoomid hapraks ja põhjustavad muid muutusi, mis lõpuks osutuvad pöördumatuks. Sellised võõrainete toimel tekkivad muutused vähendavad neutraalpunase neelamist ja sidumist. Nii 
saab eristada elujõulisi, kahjustatud ja surnud rakke, mis ongi käes ­
oleva katse aluseks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Monokihtide saamiseks hoitakse Balb/c 3T3 rakke 24 tundi kasvu ­
keskkonnas. Kaht 96 süvendiga plaati uuritava kemikaali kohta inku ­
beeritakse uuritava aine kaheksa kontsentratsiooniga 1 tunni vältel. Seejärel kiiritatakse üht kahest plaadist kõrgeima mittetsütotoksilise kiirituse kogusega, samas kui teist plaati hoitakse pimedas. Seejärel 
asendatakse mõlemal plaadil töötlemiskeskkond kasvukeskkonnaga 
ja pärast edasist 24tunnist inkubeerimist määratakse raku elujõulisus kindlaks neutraalpunase neeldumise kaudu. Rakkude elujõulisus väljendatakse protsendina uuritava ainega töötlemata, kuid lahustit 
sisaldavate kontrollproovide suhtes ning see arvutatakse uuritava 
aine iga kontsentratsiooni puhul. Fototoksilise potentsiaali prognoo ­
simiseks võrreldakse kontsentratsiooni-mõju sõltuvusi, mis on saadud pimedas hoitud ja valgusega kiiritatud katsetes, tavaliselt 
IC
 50 tasemel, st kontsentratsiooni kaudu, mis vähendab raku eluvõi ­
melisust 50 %, võrreldes uuritava ainega töötlemata kontrollproovi ­
dega.  
1.4. MEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Ettevalmistused  
1.4.1.1.  Rakud  
Valideerimisel kasutati hiire fibroblasti püsivat rakuliini Balb/c 3T3, 
kloon 31, mis pärines kas USA kollektsioonist (American Type 
Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA) või Euroopa 
kollektsioonist (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK), ning rakuliin soovitatakse hankida hea tasemega rakuhoidlast. Uurimiseks võib kasutada teisi rakke või 
rakuliine, kui kasvatamistingimused kohandatakse rakkude erivaja ­
dustele, kuid siis on vaja tõendada tulemuste samaväärsust.
 
Rakke tuleks regulaarselt kontrollida mükoplasma nakkuse suhtes ja 
kasutada vaid siis, kui seda ei esine (11).  
On oluline, et rakkude UV-tundlikkust kontrollitakse regulaarselt 
vastavalt käesolevas metoodikas kirjeldatud kvaliteedikontrolli eeskirjale. Kuna rakud võivad passaažide arvu suurenemisega 
muutuda UVA-tundlikumaks, tuleks kasutada Balb/c 3T3 rakke, 
mille passaažide arv on võimalikult väike, eelistatavalt alla 100 (vt punkti 1.4.2.2.2 ja 2. lisa).
 
1.4.1.2.  Kasvukeskkonnad ja kultiveerimistingimused  
Rutiinseks rakupassaažiks ja mõõtmiste ajal tuleb kasutada sobivat 
kasvukeskkonda ja inkubeerimistingimusi, näiteks Balb/c 3T3 rakkude puhul on need DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), millele on lisatud 10 % vastsündinud vasika seerumit, 
4 mM glutamiini, penitsilliini (100 IU) ja streptomütsiini 
(100 μg/ml), ning niisutatud inkubatsioon 37
 o C ja 5–7,5 % CO  2 
juures, olenevalt puhvrist (vt punkti 1.4.1.4 teist lõiku). On väga 
oluline, et rakukultuuri tingimustega oleks tagatud rakkude olek 
rakutsükli perioodis, mis on kasutatavate rakkude või kasutatava 
rakuliini jaoks normaalses ajaloolises vahemikus.  
1.4.1.3.  Kultuuride ettevalmistamine  
Külmutatud varukultuuridest pärit rakud külvatakse kasvukeskkonda 
sobiva tihedusega ja külvatakse ümber vähemalt korra, enne kui neid 
kasutatakse  in vitro  3T3 NRU fototoksilisuse katses.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Fototoksilisuse katses kasutatavad rakud külvatakse kasvukeskkonda 
sobiva tihedusega, nii et kultuurid ei laatu katse lõpuks, st selleks 
ajaks, kui 48 tundi pärast rakkude külvamist määratakse rakkude elujõulisust. Rakkude Balb/c 3T3 kasvatamisel 96 süvendiga plaa ­
tidel on soovitatav külvamistihedus 1 × 10
 4 rakku süvendi kohta.  
Igas kemikaali uurimise katses külvatakse rakud ühtemoodi kahele 
eraldi 96 süvendiga plaadile, mida hoitakse seejärel kogu katse ajal 
ühesugustes kasvutingimustes, välja arvatud ajavahemik, mil üht plaati kiiritatakse (+Irr) ja teist hoitakse pimedas (–Irr).
 
1.4.1.4  Uuritava aine ettevalmistamine  
Uuritav aine peab olema valmistatud vahetult enne kasutamist, välja 
arvatud juhul, kui andmed näitavad, et aine on hoidmisel püsiv. Soovitav on kemikaale käsitseda ja rakke esialgselt töödelda sellistes valgustustingimustes, et uuritava aine fotoaktivatsioon või lagune ­
mine enne kiiritamist oleks välistatud.
 
Uuritavad kemikaalid lahustatakse puhvriga soolalahuses, näiteks 
Earle'i tasakaalustatud soolalahuses (EBSS:  Earle's Balanced Salt 
Solution)  või muus füsioloogiliselt tasakaalustatud puhvri lisandiga 
soolalahuses, mis ei tohi sisaldada valke, valgust neelavaid kompo ­
nente (näit pH-indikaatorvärvid ja vitamiinid), mis võiksid segada kiiritamist. Kuna kiiritamise ajal hoitakse rakke umbes 50 minutit CO
 2 -inkubaatorist väljas, tuleb olla ettevaatlik, et ei toimuks leelis ­
tumist. Nõrga puhvri nagu EBSSi kasutamisel saab leelistumist 
vältida rakkude inkubeerimisega 7,5 % CO  2 juures. Kui rakke inku ­
beeritakse kõigest 5 % CO  2 juures, tuleks valida tugevam puhver.  
Halvasti vees lahustuvad uuritavad kemikaalid tuleks lahustada 
sobivas lahustis. Lahusti kasutamisel peab seda olema ühesugune 
kogus kõikides kultuurides, st nii negatiivsetes (lahusti) kontrollkat ­
setes kui ka uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni juures, ja lahusti kasutatav kontsentratsioon ei tohi olla tsütotoksiline. Uuritava kemi ­
kaali kontsentratsioon tuleb valida nii, et aine ei sadeneks ja et 
lahuses ei tekiks hägu.
 
Lahustina soovitatakse kasutada dimetüülsulfoksiidi (DMSO) või 
etanooli (ETOH). Võib kasutada ka muid madala tsütotoksilisusega 
lahusteid. Enne kasutamist tuleb hinnata iga lahusti sobivust, arves ­
tades lahusti konkreetseid omadusi, näiteks reageerimine uuritava kemikaaliga, fototoksilise toime nõrgendamine, radikaalide sidumine ja/või kemikaali stabiilsus lahustis.
 
Lahustamise hõlbustamiseks võib kasutada keerissegamist, ultrahe ­
liga töötlemist ja/või soojendamist sobiva temperatuurini, kui see ei 
mõjuta uuritava kemikaali stabiilsust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5  Kiiritamise tingimused  
1.4.1.5.1. V a l g u s a l l i k a s  
Sobiva valgusallika ja filtrite valimine on fototoksilisuse katse 
puhul ülioluline tegur. UVA ja nähtav valgus on tavaliselt seotud fototoksiliste reaktsioonidega  in vivo  (3 ja 12), samas 
kui UVB on üldiselt vähem oluline; UVB on aga väga tsüto ­
toksiline – lainepikkuse vahemikus 313–280 nm suureneb tsüto ­
toksilisus 1 000 korda (viide 13). Sobiva valgusallika valimise kriteeriumid peavad hõlmama nõuet, et valgusallikas kiirgaks 
lainepikkusi, mis neelduvad uuritavas kemikaalis (neeldumiss ­
pekter), ja et (mõistliku aja jooksul saavutatav) kiiritusannus oleks piisav tuntud fototsütotoksiliste kemikaalide avastamiseks. Lisaks ei tohi kasutatav lainepikkus ja kiiritusannus liigselt 
kahjustada katsesüsteemi, näit soojuse eraldumise tõttu (infrapu ­
napiirkond).
 
Sobivaimaks tehisvalguse allikaks peetakse päikesevalgust järgiai ­
mavat „kunstlikku päikest”. „Kunstliku päikese” kiirguse inten ­
siivsuse jaotumine pärast filtrimist peaks olema lähedane päike ­
sevalguse omale vabas looduses (14). „Kunstliku päikesena” kasutatakse nii ksenoonkaarlampe kui (dopeeritud) elavhõbe- 
metallhalogeniid-kaarlampe (15). Viimaste eelis on nõrgem 
soojuskiirgus ja odavus, kuid nende valgus ei ole päikesevalgu ­
sega nii sarnane kui ksenoonkaarlambi oma. Kuna kõik „kunst ­
likud päikesed” kiirgavad palju UVBd, tuleks nende valgust 
filtrida, et vähendada ülimalt tsütotoksilist UVB-lainepikkusega 
kiirgust. Kuna rakukultuuri plastmaterjalid sisaldavad UV-stabili ­
saatoreid, tuleks spektrit mõõta läbi 96 süvendiga plaadi kaane, mis on sama tüüpi kui analüüsis kasutatav. Sõltumata sellest, kas 
mõnd spektri osa nõrgendatakse filtrimise abil või seadmete 
vältimatu filtrimistoimega, ei tohiks pärast nende filtrite läbimist registreeritud spekter erineda standardsest päevavalgusest vabas looduses (14). Viidetes 8 ja 16 on näidatud „kunstliku päikese” 
filtritud kiirgusvoo spektraalne jaotus; sellist valgust kasutati 3T3 
NRU fototoksilisuse  in vitro  katse valideerimisel. Vt ka lisa 2 
joonist 1.
 
1.4.1.5.2. K i i r i t u s a n n u s e m õ õ t m i n e  
Valguse intensiivsust (kiiritustihedust) tuleb regulaarselt kontrollida 
enne iga fototoksilisuse katset, kasutades sobivat lairiba-UV- 
mõõturit. Intensiivsust tuleb mõõta läbi sama tüüpi 96 süvendiga 
plaadi kaane, nagu kasutatakse analüüsis. UV-mõõtur peab olema kaliibritud konkreetse allika järgi. UV-mõõturi mõõtmiskvaliteeti tuleb kontrollida ja selleks on soovitatav kasutada teist, võrdlus- 
UV-mõõturit, mis on sama tüüpi ja identselt kaliibritud. Pikemate 
ajavahemike järel oleks väga hea kasutada spektroradiomeetrit valgu ­
sallika filtritud kiirguse spektri mõõtmiseks ja lairiba-UV-mõõturi kalibreeringu kontrollimiseks.
 
On näidatud (6 ja 17), et annus 5 J/cm  2 (mõõdetud UVA piires) ei 
ole tsütotoksiline Balb/c 3T3 rakkude suhtes, kuid on piisav, et ergastada kemikaale ja kutsuda esile fototoksilisi reaktsioone; annuse 
5 J/cm
 2 saavutamiseks 50 minutiga kasutati kiiritustihedust 1,7 
mW/cm  2 . Vt lisa 2 joonist 2. Kui kasutatakse muud rakuliini või 
valgusallikat, tuleb kiiritusannus kaliibrida nii, et saaks valida kiiri ­
tusrežiimi, mis ei ole rakkude jaoks kahjulik, kuid on piisav stan ­
dardfototoksiinide ergastamiseks. Valgusega kokkupuute aeg arvuta ­
takse järgmiselt:  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
t ðminÞ ¼ kiiritusannus ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
kiiritustihedus ðmW=cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Wsec)  
1.4.2.  Katsetingimused  
1.4.2.1.  Uuritava aine kontsentratsioon  
Annuse vahemiku määramise eelkatsetes määratakse uuritava aine 
kontsentratsiooni vahemik, mida kasutatakse kõnealuse aine toime uurimiseks valgustatud (+Irr) ja pimedas hoitud (–Irr) katsetes. Kuna lahustuvus võib aja jooksul või valgustamise ajal muutuda, 
võib olla kasulik hinnata lahustuvust katse alguses ja siis uuesti 
60 minuti (või muu kasutatava töötlemisaja) pärast. Ebasobivate kasvutingimuste või liiga happeliste või aluseliste kemikaalide põhjustatud toksilisuse vältimiseks peab rakukultuuri pH pärast uuri ­
tava kemikaali lisamist jääma vahemikku 6,5–7,8.
 
Uuritava aine suurim kontsentratsioon peaks jääma füsioloogiliste 
katsetingimuste piiridesse, tuleks vältida rakkude osmootset või 
pH-stressi. Konkreetse uuritava kemikaali puhul võib osutuda vaja ­
likuks võtta arvesse muid füüsikalisi ja keemilisi omadusi, mis võivat piirata uuritava aine kontsentratsiooni suurendamist katses. Raskesti 
lahustuvate ainete puhul, mis ei ole kuni lahustuvuse piirini toksi ­
lised, tuleks uurida kõige kõrgemat kontsentratsiooni, mida on võimalik saavutada. Üldiselt ei tohiks uuritav kemikaal sadeneda ühelgi uuritaval kontsentratsioonil. Uuritava aine maksimaalne kont ­
sentratsioon ei tohiks ületada 1 000 μg/ml; osmolaarsus ei tohiks olla 
suurem kui 10 mmol/l. Tuleks kasutada kaheksat lahust uuritava aine kontsentratsioonidega, mis moodustavad konstantse lahjendustegu ­
riga geomeetrilise jada (vt punkti 2.1 teist lõiku).
 
Kui annuse vahemiku kindlakstegemise katse näitas, et uuritav kemi ­
kaal ei ole kuni kõrgeima kontsentratsioonini tsütotoksiline pimedas 
(–Irr), kuid on väga tsütotoksiline kiiritatuna (+Irr), võivad (+Irr) katseteks valitavad kontsentratsioonid erineda nendest, mis valitakse (–Irr) katseteks, et saadavad andmed oleksid nõutava kvaliteediga.
 
1.4.2.2.  Kontrollkatsed  
1.4.2.2.1. R a k k u d e k i i r g u s t u n d l i k k u s : v a r a s e m a a r e n g u 
a n d m e t e k i n d l a k s t e g e m i n e :  
Rakkudel tuleb regulaarselt (umbes iga viienda passaaži järel) kontrol ­
lida tundlikkust valgusallika suhtes, hinnates nende elujõulisust pärast 
nende kokkupuudet suurenevate kiirgusdoosidega. Kõnealuse hinda ­
mise puhul tuleks kasutada mitut kiiritusannust, sealhulgas annuseid, mis on palju suuremad 3T3 NRU fototoksilisuse katses kasutatavatest. Nende dooside suurust on kõige kergem määrata valgusallika spektri 
UV-osade mõõtmistega. Rakud külvatakse tihedusel, mida kasutatakse  
in vitro  3T3 NRU fototoksilisuse katses, ja neid kiiritatakse järgmisel 
päeval. Rakkude elujõulisus määratakse veel üks päev hiljem neutraal ­
punase sidumise järgi. Tuleb tõendada, et tulemuseks saadud suurim 
mittetsütotoksiline annus (näiteks valideerimisel: 5 J/cm
 2 [UVA]) oli 
piisav võrdluskemikaalide (tabel 1) õigeks klassifitseerimiseks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. K i i r g u s t u n d l i k k u s : j o o k s v a k a t s e k o n t r o l l  
Katse vastab kvaliteedikriteeriumidele, kui kiiritatud negatiivsetes või 
lahusti kontrollproovides on rakkudel alles üle 80 % elujõulisusest, 
võrrelduna mittekiiritatud negatiivsete või lahusti kontrollproovidega.  
1.4.2.2.3. L a h u s t i k o n t r o l l p r o o v i d e e l u j õ u l i s u s  
Lahusti kontrollproovidest eraldatud neutraalpunase absoluutne opti ­
line tihedus (OD  540 NRU  ) näitab, kas igasse süvendisse külvatud 
1 × 10  4 rakku on kasvanud normaalse kahekordistumisajaga analüüsi 
kahe päeva jooksul. Katse vastab nõuetekohasuse tingimustele, kui töötlemata kontrollide keskmine OD
 540 NRU  on > 0,4 (st umbes 
20 korda suurem lahusti taustneeldumisest).  
1.4.2.2.4. P o s i t i i v n e k o n t r o l l p r o o v  
Teadaolevat fototoksilist kemikaali katsetatakse samaaegselt iga  in 
vitro  3T3 NRU fototoksilisuse katsega. Selleks soovitatakse kloorpro ­
masiini (CPZ). Standardeeskirja järgi  in vitro  3T3 NRU fototoksilisuse 
katses uuritud CPZ puhul määrati järgmised katse nõuetekohasuse 
tingimused: kiiritatud (+Irr) CPZ: IC  50 = 0,1–2,0 μg/ml, mittekiiritatud 
(–Irr) CPZ: IC  50 = 7,0–90,0 μg/ml. Fotoärrituvustegur (PIF) peaks 
olema > 6. Jälgida tuleks positiivse kontrolli varasemat tegemist.  
Kloorpromasiini asemel võib samaaegsete positiivsete kontrollproo ­
videna kasutada muid fototoksilisi kemikaale, mis kuuluvad uuritava 
kemikaaliga ühte kemikaalide klassi või on sarnase lahustuvusega.  
1.4.3.  Katse käik (6–8, 16 ja 17):  
1.4.3.1.  Esimene päev  
96 süvendiga koekultuuri mikrotiiterplaadi välimistesse süvenditesse 
kantakse 100 μl kasvukeskkonda (pimekatse). Ülejäänud süvendi ­
tesse kantakse 100 μl rakususpensiooni kontsentratsiooniga 1 × 10  5 
rakku kasvukeskkonna milliliitris (see tähendab 1 × 10  4 rakku 
süvendi kohta). Uuritava aine iga kontsentratsiooniseeria jaoks ning lahusti- ja positiivse kontrolli jaoks tuleks ette valmistada kaks plaati.
 
Rakke inkubeeritakse 24 tunni jooksul (vt punkti 1.4.1.2), kuni need 
moodustavad pooleldi laatunud monokihi. Kõnealune inkubeerimis ­
periood võimaldab rakkudel taastuda, kinnituda põhjale ja eksponent ­
siaalselt kasvada.  
1.4.3.2.  Teine päev  
Pärast inkubeerimist dekanteeritakse kasvukeskkond rakkudelt ja 
rakke pestakse hoolikalt 150 μl inkubeerimiseks kasutatud puhverla ­
husega. Lisatakse 100 μl puhverlahust, mis sisaldab vajalikus kont ­
sentratsioonis uuritavat kemikaali või lahustit (lahustiga kontroll ­
proov). Kasutatakse uuritava kemikaali 8 kontsentratsiooni. Rakke 
inkubeeritakse uuritava ainega pimedas 60 minutit (vt punkti 1.4.1.2 ja punkti 1.4.1.4 teist lõiku).
 
Kahest plaadist, mis on ette valmistatud uuritava aine iga kontsen ­
tratsiooni ja kontrollproovide seeria jaoks, valitakse üks, tavaliselt juhuslikkuse alusel, tsütotoksilisuse (–Irr) määramiseks (see on kont ­
rollplaat) ja teine fototsütotoksilisuse (+Irr) määramiseks (uuritav 
plaat).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Katse +Irr-osa läbiviimiseks kiiritatakse rakke toatemperatuuril 
50 minutit läbi 96 süvendiga plaadi kaane suurima kiiritusdoosiga, 
millel ei ole veel tsütotoksilist mõju (vt ka lisa 2). Kiiritamata plaate (–Irr) hoitakse toatemperatuuril 50 minutit (s.o kogu kiiritamise aja) pimedas kastis.
 
Katselahus dekanteeritakse ja rakke pestakse hoolikalt kaks korda 
150 μ1 inkubeerimiseks kasutatud, kuid uuritavat ainet mitte sisal ­
dava puhverlahusega. Puhverlahus asendatakse kasvukeskkonnaga ja 
inkubeeritakse (vt punkti 1.4.1.2) hommikuni (18–22 tundi).  
1.4.3.3.  Kolmas päev  
1.4.3.3.1. U u r i m i n e m i k r o s k o o b i g a  
Rakke vaadeldakse kasvu, morfoloogia ja monokihi terviklikkuse 
hindamiseks faasikontrastmikroskoobiga. Märgitakse üles kõik 
muutused rakkude morfoloogias ja mõjud rakkude kasvule.  
1.4.3.3.2. N e u t r a a l p u n a s e s i d u m i s e k a t s e  
Rakke pestakse 150 μl eelsoojendatud puhvriga. Pesemislahus 
eemaldatakse ettevaatliku koputamisega. Lisatakse 100 μl neutraal ­
punase (3-amino-7-dimetüülamino-2-metüülfenasiinhüdrokloriid, 
EINECSi number 209-035-8; CASi number 553-24-2; C.I. 50040) lahust kontsentratsiooniga 50 μg/ml seerumit mittesisaldavas kesk ­
konnas (16) ja inkubeeritakse 3 tundi, nagu on kirjeldatud punktis 
1.4.1.2. Pärast inkubeerimist eemaldatakse neutraalpunase keskkond 
ja rakke pestakse 150 μl puhverlahusega. Liigne puhver dekanteeri ­
takse ja eemaldatakse kuivatamise või tsentrifuugimisega.
 
Lisatakse täpselt 150 μl neutraalpunase desorbeerimislahust (mis on 
värskelt valmistatud 49 osast veest, 50 osast etanoolist ja 1 osast äädikhappest).
 
Mikrotiiterplaati loksutatakse ettevaatlikult mikrotiiterplaadi loksutil 
10 minutit, kuni neutraalpunane on väljunud rakkudest ja moodus ­
tanud homogeense lahuse.  
Spektrofotomeetriga mõõdetakse neutraalpunase ekstrakti optiline 
tihedus 540 nm jumes, kasutades võrdlusena pimekatse süvendeid. Andmed salvestatakse sobivas elektroonilise faili formaadis edaspi ­
diseks analüüsiks.
 
2. ANDMED  
2.1. ANDMETE KVALITEET JA HULK  
Katseandmete alusel peaks saama analüüsida kiiritatud ja kiiritamata 
proovides avaldunud mõju sõltuvust kontsentratsioonist ja võimaluse 
korral määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon, millel rakkude elujõulisus väheneb 50 % (IC
 50 ). Tsütotoksilisuse esinemisel vali ­
takse nii kontsentratsioonide vahemik kui ka üksikud kontsentrat ­
sioonid selliselt, et sõltuvust saaks sobitada katseandmetega.  
Nii selgelt positiivsete kui ka selgelt negatiivsete tulemuste (vt punkti 
2.3 esimest lõiku) puhul võib piisata esmasest katsest, millele on 
toeks üks või mitu annuste vahemiku määramiseks tehtud eelkatset.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Raskesti tõlgendatavat, piiripealset või ebaselget tulemust tuleks 
selgitada edasiste katsete abil (vt ka punkt 2.4 teine lõik). Sel 
juhul tuleks kaaluda katsetingimuste muutmist. Katsetingimustes võib muuta kontsentratsioone või nende intervalle, inkubeerimi ­
seelset aega ja kiiritamisaega. Vees ebapüsivate kemikaalide puhul 
võib sobida lühem kokkupuuteaeg.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE  
Andmete hindamise võimaldamiseks võib arvutada fotoärrituvuste ­
guri ( Photo-Irritation-Factor,  PIF) või keskmise fotoefekti ( Mean 
Photo Effect,  MPE).  
Fototsütotoksilisuse näitajate arvutamiseks (vt allpool) on vaja lähen ­
damisega panna läbi kontsentratsiooni ja mõju määratud väärtuste mingi sobiv pidev kontsentratsiooni-mõju kõver (mudel). Kõvera 
sobitamine andmetega toimub tavaliselt mittelineaarse regressiooni 
meetodil (18). Selleks et hinnata, kuidas andmete varieerumus mõjutab sobitatud kõvera parameetreid, soovitatakse kasutada  boots­
trap-meetodit.
 
Fotoärrituvustegur (PIF) arvutatakse järgmise valemi abil:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Kui kiiritatud või kiiritamata proovides ei saa IC  50 arvutada, siis ei 
saa katsematerjali PIFi määrata.Keskmine fotoefekt (MPE) põhineb 
täielike kontsentratsiooni-mõju sõltuvuste võrdlemisel (19). See on fotoefekti väärtuste esindusliku hulga kaalutud keskmine:
 
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Fotoefekt PE  C igal kontsentratsioonil C on võrdne mõjuefekti RE  C ja 
annuseefekti DE  C korrutisega s.t PE  c = RE  c × DE  C . Mõjuefekt RE  C 
on kiiritatud ja kiiritamata proovides avaldunud mõju vahe, s.t RE  c = 
R c (—Irr) – R  c (+Irr). Annuseefekt leitakse järgmiselt:  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
kus C* on ekvivalentsuskontsentratsioon, s.o kontsentratsioon, mille 
puhul +Irr-mõju võrdub –Irr-mõjuga kontsentratsioonil C. Kui C* ei 
ole võimalik määrata, kuna mõju väärtused +Irr-kõveral on süste ­
maatiliselt kõrgemad või madalamad kui R  c (–Irr), loetakse annusee ­
fekt võrdseks ühega. Kaalutegurid W  i on määratud kõrgeima mõju 
väärtusega, st W  i = MAX {R  i (+Irr), R  i (–Irr) }. Kontsentratsioonide 
võrk C  i valitakse nii, et ühepalju punkte langeks igasse kontsentrat ­
siooniintervalli, mis on määratud katses kasutatud kontsentratsiooni väärtustega. MPE arvutamine on piiratud maksimaalse kontsentrat ­
siooni väärtusega, mille puhul vähemalt ühel kahest kõverast on veel 
näha vähemalt 10 %list mõju. Kui see maksimaalne kontsentratsioon 
on kõrgem kui +Irr-katses kasutatud kõrgeim kontsentratsioon, loetakse +Irr-kõvera ülejäänud osas mõju väärtus võrdseks nulliga. Sõltuvalt sellest, kas MPE väärtus on suurem kui nõuetekohaselt 
valitud piirväärtus (MPE
 c = 0,15) või mitte, liigitatakse kemikaal 
fototoksiliseks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Tarkvarapaketi PIF ja MPE arvutamiseks võib leida viite 20 veebi ­
lehel.  
2.3. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Valideerimisuuringu (8) põhjal võib öelda, et uuritava aine PIF < 2 
või MPE < 0,1 puhul võib ennustada, et aine ei ole fototoksiline. Kui 
PIF > 2 ja < 5 või MPE > 0,1 ja < 0,15, siis on võimalik, et aine on 
fototoksiline; kui PIF > 5 või MPE > 0,15, siis võib ennustada, et aine on fototoksiline.
 
Igas laboris, kus seda analüüsi esmakordselt läbi viiakse, tuleks enne 
uuritavate ainete fototoksilisuse hindamisele asumist mõõta tabelis 1 osutatud etalonaineid. Leitavad PM või MPE väärtused peaksid olema lähedased tabelis 1 esitatud väärtustele.
 
Tabel 1  
Keemiline nimetus EINECSi nr CASi nr PIF MPE Neeldumismak ­
simum Lahusti (  1 ) 
amiodaroon 
HCL 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27–0,54 242 nm 
300 nm 
(õlg) etanool 
kloorpromasiin 
HCL 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33–0,63 309 nm etanool 
norfloksatsiin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34–0,90 316 nm atsetonitriil 
antratseen 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19–0,81 356 nm atsetonitriil 
Dinaatriumpro ­
toporfüriin IX 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54–0,74 402 nm etanool 
L-histidiin [7006-35-1] PIFi ei 
esine 0,05–0,10 211 nm vesi 
heksaklorofeen 200-733-8 [70-30-4] 1,1–1,7 0,00–0,05 299 nm 
317 nm 
(õlg) etanool 
naatriumlaurüül ­
sulfaat 205-788-1 [151-21-3] 1,0–1,9 0,00–0,05 neeldumist 
ei esine vesi 
( 1 ) Neeldumise mõõtmiseks kasutatav lahusti.  
2.4. ANDMETE TÕLGENDAMINE  
Kui fototoksiline mõju avaldub ainult kõige kõrgemal uuritud kont ­
sentratsioonil (eriti vees lahustuvate uuritavate ainete puhul), tuleb ohu hindamisel lisaks arvestada veel muid asjaolusid. Nende hulka võivad kuuluda neeldumine nahas ja kemikaali kogunemine nahas 
ning muude katsete andmed, näiteks uuringud, kuidas kemikaal 
mõjub looma või inimese nahale  in vitro  või naha mudelitele.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Kui toksilisust ei ilmne (+Irr ja –Irr) ja kui halb lahustuvus ei luba 
uurida kõrgemaid kontsentratsioone, võib küsida, kas käesolev 
meetod sobib aine uurimiseks; sel juhul tuleb kaaluda kinnitavate uuringute läbiviimist, näiteks teise mudeliga.
 
3. ARUANDLUS  
KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama vähemalt järgmist teavet.  
Uuritav aine:  
— andmed aine määratlemiseks, tavanimetused ning IUPACi ja 
CASi numbrid, kui need on teada;  
— füüsikaline olek ja puhtus;  
— uuringu tegemisel olulised füüsikalis-keemilised omadused;  
— UV/nähtava valguse neeldumisspekter;  
— stabiilsus ja fotostabiilsus, kui need on teada.  
Lahusti:  
— lahusti valiku põhjendus;  
— uuritava kemikaali lahustuvus lahustis;  
— lahusti protsendiline sisaldus töötlemiskeskkonnas.  
Rakud:  
— rakkude tüüp ja päritolu;  
— mükoplasma puudumine;  
— raku passaaži number, kui see on teada;  
— rakkude kiirgustundlikkus, mis on määratud kiiritusseadmete abil, 
mida kasutatakse  in vitro  3T3 NRU fototoksilisuse katses.  
Katse tingimused (1):  inkubeerimine enne ja pärast töötlust:  
— kasvukeskkonna tüüp ja koostis;  
— inkubeerimistingimused (CO  2 kontsentratsioon, temperatuur, 
niiskus);  
— inkubeerimise kestus (enne töötlust, pärast töötlust).  
Katse tingimused (2):  töötlemine kemikaaliga:  
— kiiritatud ja kiiritamata proovides kasutatud uuritava kemikaali 
kontsentratsioonide valiku põhjendus;  
— uuritava kemikaali piiratud lahustuvuse ja tsütotoksilisuse puudu ­
mise puhul: kõrgeima uuritud kontsentratsiooni valiku põhjendus;  
— töötlemiskeskkonna tüüp ja koostis (soolasisaldusega puhver ­
lahus);  
— kemikaaliga töötlemise kestus.  
Katse tingimused (3):  kiiritamine:  
— kasutatud valgusallika – valiku põhjendus;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— valgusallika ja kiirgusmõõtja valmistaja ja tüüp;  
— valgusallika kiirguse spektri näitajad;  
— kasutatud filtri(te) läbilaskvuse ja neeldumise näitajad;  
— kiirgusmõõtja iseloomustus ja kaliibrimise üksikasjad;  
— valgusallika kaugus katsesüsteemist;  
— UVA-kiirgus kõnealuse kauguse puhul, väljendatuna mW/cm  2 ; 
— UV/nähtava valgusega kiiritamise kestus;  
— UVA-annus (kiiritustihedus × aeg), väljendatuna J/cm  2 ; 
— rakukultuuride temperatuur kiiritamise ajal ja samaaegselt 
pimedas hoitud rakukultuuride temperatuur.  
Katse tingimused (4):  elujõulisuse määramine neutraalpunase abil:  
— neutraalpunasega töötlemise keskkonna koostis;  
— neutraalpunasega inkubeerimise kestus;  
— inkubeerimistingimused (CO  2 kontsentratsioon, temperatuur, 
niiskus);  
— neutraalpunase ekstraheerimise tingimused (ekstrahent; kestus);  
— neutraalpunase optilise tiheduse spektrofotomeetriliseks määrami ­
seks kasutatud lainepikkus;  
— teine (võrdlus)lainepikkus, kui seda kasutati;  
— mida kasutati spektrofotomeetrilise pimekatsena (kui kasutati).  
Tulemused:  
— rakkude mõõdetud elujõulisus uuritava kemikaali igal kontsen ­
tratsioonil, võrreldes samaaegsete lahustikontrollproovide kesk ­
mise elujõulisusega, protsentides;  
— kontsentratsiooni-mõju sõltuvused (rakkude suhtelise elujõulisuse 
sõltuvus uuritava kemikaali kontsentratsioonist), mis on saadud samaaegsete +Irr- ja –Irr-katsetega;
 
— kontsentratsiooni-mõju sõltuvuste analüüs: võimaluse korral IC  50 
(+Irr) ja IC  50 (–Irr) arvutamine;  
— kiiritatud ja kiiritamata proovidest mõõdetud kahe kontsentrat ­
siooni-mõju sõltuvuse võrdlus kas fotoärrituvusteguri (PIF) või keskmise fotoefekti (MPE) arvutamisega;
 
— katse nõuetekohasuse tingimused; samaaegsed lahustikontroll ­
proovid:  
— kiiritatud ja kiiritamata rakkude absoluutne elujõulisus (neutraal ­
punase ekstrakti optiline tihedus);  
— varasemad negatiivsete ja lahustikontrollproovide andmed; 
keskväärtused ja standardhälbed;  
— katse nõuetekohasuse tingimused; samaaegne positiivne kontroll ­
proov;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— positiivse kontrollina kasutatud kemikaali IC  50 (+Irr) ja IC  50 
(–Irr) ning PIF/MPE;  
— varasemad andmed positiivse kontrolli kemikaali kohta: IC  50 
(+Irr) ja IC  50 (–Irr) ja PIF/MPE; keskväärtused ja standardhälbed.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of subs ­
tances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 95–102.  
2) Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI–XXXV.
 
3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A, Pape, W.J.W., Sapora, O., and 
Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314–348.
 
4) Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New 
York. 2nd edition, p 79–110.  
5) OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.
 
6) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., 
Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and 
Willshaw, A. (1994). EEC/COLJPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8. 793–796.
 
7) Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7–8.
 
8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., 
Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannen ­
becker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EÜ/COLIPA IN  
vitro  phototoxicity validation study: results of phase II (blind 
trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 
12, 305–327.
 
9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 
30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
15 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat.  
10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119–124.  
11) Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, a. 225-237.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology”, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515–530.
 
13) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829.  
14) ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic 
colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
 
15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, 
Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275  
16) ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 
1998. 18 pgs.  
17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union  Directive 76/768/EEC,  
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679–708.
 
18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical mode ­
ling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127–138.
 
19) Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
445–462.  
20) http://ww.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377 
_2349687_l_l_l_l,00.html  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
1. Lisa  
3T3 NRU PT osa kemikaalide fototoksilisuse uuringu jadakäsitlusel
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
2. Lisa  
Joonis 1  
„Kunstliku päikese” filtritud kiirgusvoo spektraaljaotus
  
(vt punkti 1.4.1.5 teist lõiku)  
Joonisel 1 on esitatud näide, milline peaks olema „kunstliku päikese” flltritud kiirgusvoo spektraal ­
jaotus. Valgusallikas on dopeeritud metallhalogeniidkaarlamp, mida kasutati 3T3 NRU fototoksili ­
suse määramise valideerimisel (6, 8, 17). Joonisel on näidatud kahe erineva filtri toime ja 96 
süvendiga rakukultuuri plaadi kaane täiendav filtriv toime. Filtrit H2 kasutati ainult katsesüsteemide 
puhul, mis taluvad suuremat hulka UVB kiirgust (nahamudeli test ja vere punaliblede foto-hemo ­
lüüsi test). 3T3 NRU fototoksilisuse katses kasutati filtrit H1. Jooniselt on näha, et plaadi kaane täiendav filtriv toime ilmneb peamiselt UVB kiirguse alas; siiski jääb kiirgusspektrisse piisavalt 
UVB kiirgust, et ergastada selliseid kemikaale nagu amiodaroon, mille neeldumisspekter asub 
tavaliselt UVB kiirguse piirkonnas (vt tabelit 1).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Joonis 2  
Balb/c 3T3 rakkude kiirgustundlikkus (mõõdetud UVA kiirguse alas)  
Rakkude elujõulisus (neutraalpunase sidumise protsent kiiritamata kontrollproovides)
  
(vt punkti 1.4.1.5.2 teist lõiku ja punkte 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)  
Balb/c 3T3 rakkude tundlikkus 3T3 NRU fototoksilisuse katse valideerimisel kasutatud „kunstliku 
päikesega” kiiritamise suhtes, mõõdetuna UVA piirkonnas. Joonisel on näidatud seitsmes laboris saadud valideerimiseelsed tulemused (1). Kaks valgete sümbolitega sõltuvust saadi vananenud rakkudega (palju passaaže), need rakud tuli asendada uute varurakkudega; mustade sümbolitega 
sõltuvused iseloomustavad rakke, kelle kiirgustaluvus on lubatud piirides.
 
Nendest andmetest määrati kõrgeim mittetsütotoksiline kiirgusdoos 5 J/cm  2 . Vertikaalne katkend ­
joon näitab lisaks maksimaalset kiirgustaluvust, mida käsitletakse punktis 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕLMEDE 
KATSE  
SISSEJUHATUS  
1. OECD kemikaalide katsetamise juhendeid ja nendel põhinevaid ELi katse ­
meetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaolu. Varem on vastu 
võetud originaalkatsemeetod hiire naha sensibiliseerimise määramiseks 
lokaalsete lümfisõlmede katsega ( Local Lymph Node Assay  – LLNA; 
OECD katsejuhend 429; käesoleva lisa peatükk B.42) (1). Kirjanduses on avaldatud LLNA valideerimise üksikasjad ja ülevaade sellega seotud töödest 
(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Ajakohastatud LLNA põhineb katse- ja 
teaduslike andmete hindamisel (12). See on teine katsemeetod, mis on kavandatud selleks, et hinnata katseloomadel kemikaalide (ainete ja segude) võimet sensibiliseerida nahka. Teise meetodi puhul (OECD katsejuhend 
406, käesoleva lisa peatükk B.6) kasutatakse merisigu, nimelt merisigade 
maksimeerimise katset ja Buehleri katset (13). LLNA-l on B.6 ja OECD katsejuhendiga 406 (13) võrreldes loomade heaoluga seotud eeliseid. Käesolev LLNA juhend hõlmab tulemuslikkusnõudeid (1. liide), mida 
võib kasutada selliste uute ja/või modifitseeritud katsemeetodite valideeri ­
misolukorra hindamiseks, mis on tööpõhimõttelt ja teostuslikult sarnased LLNAga, vastavalt OECD katsejuhendi nr 34 (14) põhimõtetele.
 
2. LLNAga uuritakse naha sensibiliseerimise induktsioonifaasi ja saadakse 
kvantitatiivseid andmeid immuunvastuse annusest sõltuvuse hindamiseks. 
Tuleb märkida, et pehmed/mõõdukad sensibiliseerijad, mida soovitatakse 
sobivate positiivse kontrolli kemikaalidena merisigade katsemeetodite jaoks (need on B.6 ja OECD katsejuhend 406) (13), sobivad kasutamiseks ka LLNA puhul (6, 8, 15). Vähendatud LLNAd, mille puhul kasutatakse 
kuni 40 % vähem loomi, on kirjeldatud ühe võimalusena ka käesolevas 
katsemeetodis (16, 17, 18). Vähendatud LLNAd võib kasutada, kui on regulatiivne vajadus kinnitada naha sensibiliseerimise võime negatiivset ennustust; seejuures tuleb järgida kõiki muid LLNA katse-eeskirja üksikas ­
ju, nagu on kirjeldatud käesolevas katsemeetodis. Negatiivse tulemuse 
ennustus peab põhinema kogu kättesaadaval teabel, nagu on kirjeldatud punktis 4. Enne vähendatud LLNA lähenemisviisi kohaldamist tuleb esitada selged põhjendused ja selle meetodi kasutamise teaduslik alus. Kui vähen ­
datud LLNAga saadakse positiivne või kaheti tõlgendatav tulemus, võib 
vaja minna lisakatseid tulemuste tõlgendamiseks või selgitamiseks. Vähen ­
datud LLNAd ei tohiks kasutada ainete nahka sensibiliseeriva toime ohu uurimiseks sellisel juhul, kui on vaja teavet annuse-immuunvastuse seose 
kohta, näiteks alakategooriatesse klassifitseerimiseks vastavalt 
määrusele (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseeri ­
mist, märgistamist ja pakendamist, ning ÜRO ühtsele ülemaailmsele kemi ­
kaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemile.
 
MÕISTED  
3. Kasutatud mõisted on esitatud 2. liites.  
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
4. LLNA on alternatiivne meetod võimalike nahka sensibiliseerivate kemikaa ­
lide kindlakstegemiseks. See ei tähenda tingimata, et kõikidel juhtudel 
tuleks kasutada merisigadega tehtavate katsete (B.6 ja OECD katsejuhend 406) (13) asemel LLNAd, vaid pigem, et uuring on sama hea ja seda võib kasutada alternatiivina, mille positiivsed või negatiivsed tulemused üldiselt 
ei vaja täiendavat kinnitamist. Katselabor võtab arvesse kogu uuritava aine 
kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave hõlmab aine
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
nimetust ja keemilist struktuuri, füüsikalis-keemilisi omadusi, muude aine ­
tega in vitro  või in vivo  tehtud toksilisuskatsete tulemusi ja struktuurilt 
samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid. Osutatud teavet tuleb analüü ­
sida, et määrata kindlaks, kas LLNA sobib kõnealuse aine puhul (arvestades LLNA sobimatust teatavate piiratud kemikaalitüüpide puhul, vt punkt 5) 
ning valida sobivad annused.
 
5. LLNA on  in vivo  meetod ja seetõttu ei lõpeta see loomade kasutamist naha 
allergilise sensibiliseerimise hindamisel. Siiski võimaldab see vähendada 
selleks vajalike loomade arvu. Lisaks võimaldab LLNA oluliselt parandada viisi, kuidas loomi kasutatakse naha allergilise sensibiliseerimise määrami ­
seks (vähem tekitatakse valu ja kannatusi). LLNA põhineb sellel, et uuri ­
takse kemikaalide immunoloogilist mõju sensibiliseerimise induktsioonifaasi 
ajal. Erinevalt merisigadega tehtavatest katsetest (s.o B.6 ja OECD katseju ­
hend 406) (13) ei eelda LLNA, et naha ärritamisega tekitataks ülitundlik ­
kusreaktsioonid. Samuti ei eelda LLNA adjuvandi kasutamist, nagu seda 
tehakse merisigadega tehtava maksimeerimiskatse puhul (13). Seega 
vähendab LLNA loomadele valu ja kannatuste tekitamist. Hoolimata LLNA eelistest B.6 või OECD katsejuhendi 406 kohaste katsetega võrreldes tuleks tunnistada, et on teatud piirangud, mis võivad tingida B.6 või OECD 
katsejuhendi 406 (13) kohaste katsete kasutamise (nt LLNA valenegatiivid 
teatavate metallide puhul, valepositiivid teatavate nahaärritajate puhul (näiteks teatavat tüüpi pindaktiivsed kemikaalid) (19, 20) või probleemid uuritavate ainete lahustuvusega). Lisaks võib teatavate kemikaaliklasside või 
selliste ainete puhul, mis sisaldavad segavat toimet avaldada võivaid funkt ­
sionaalseid rühmi (21), olla vaja kasutada meriseakatseid (B.6 või OECD katsejuhend 406) (13). Kuna valideerimise andmebaas oli piiratud (eelkõige uuriti pestitsiidivorme), võib LLNA tõenäolisemalt kui meriseakatsed anda 
positiivse tulemuse sellist tüüpi uuritava aine puhul (22). Vormide uurimisel 
tuleks kaaluda seda, et võrdlusainena lisatakse samalaadseid aineid, mille tulemused on teada, et tõendada LLNAga saadavate tulemuste õigsust (vt punkt 16). Selliste teadaolevate piirangute arvestamisega peaks LLNA 
olema kohaldatav igasuguste ainete uurimiseks, millel ei ole omadusi, mis 
võiksid mõjutada LLNAga saadavate tulemuste õigsust.
 
KATSE PÕHIMÕTE  
6. LLNA põhimõte seisneb selles, et sensibilisaatorid kutsuvad esile lümfot ­
süütide vohamise lähimates lümfisõlmedes, mis dreenivad uuritava aine pealekandmise paika. Vohamine on võrdeline pealekantud allergeeni annuse 
ja allergiatekitamisvõimega ning see võimaldab lihtsa meetodiga sensibili ­
seerimist kvantitatiivselt mõõta. Vohamist mõõdetakse nii, et keskmist vohamist igas katserühmas võrreldakse keskmise vohamisega kandeaine-kontrollrühmas, mille liikmeid on töödeldud üksnes kandeainega 
(vehicle treated control  – VC). Määratakse igas uuritava ainega töödeldud 
rühmas leitud keskmise vohamise ja paralleelselt kontrollrühmas leitud keskmise vohamise suhtarv, mida nimetatakse stimulatsiooniindeksiks (SI); SI peab olema vähemalt 3 selleks, et uuritava aine võiks klassifitsee ­
rida võimalikuks naha sensibiliseerijaks. Siin kirjeldatud meetodid põhi ­
nevad radioaktiivse märgise kasutamisel  in vivo ; selle meetodiga mõõde ­
takse vohavate rakkude arvu suurenemist kõrvalesta dreenivates lümfisõl ­
medes. Kuid vohavate rakkude arvu hindamiseks võib kasutada ka muid 
väljundeid tingimusel, et need täielikult vastavad tulemuslikkusnõuetele 
(1. liide).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
KATSE KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
7. Käesoleva katse jaoks valitud liik on hiir. Kasutatakse CBA/Ca või CBA/J 
liini noori täiskasvanud emashiiri, kes ei ole poeginud ega tiined. Katse 
alguses peaksid loomad olema 8–12 nädalat vanad ning loomade kehamassi varieerumine peaks olema minimaalne ja mitte ületama 20 % keskmisest massist. Võib kasutada ka muid liine ja isasloomi, kui on olemas piisavalt 
andmeid selle tõendamiseks, et LLNA immuunvastuses ei ole olulisi liini- 
ja/või soospetsiifilisi erinevusi.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
8. Hiiri tuleks pidada rühmapuurides (23), kui ei esitata nõuetekohast teadus ­
likku põhjendust üksikpuuris pidamise kasuks. Loomade katseruumi tempe ­
ratuur peaks olema 22 ± 3 °C. Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähe ­
malt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, on eesmärk hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peab olema 
kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada 
tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata.
 
Loomade ettevalmistamine  
9. Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseeri ­
mise võimaldamiseks (kuid mitte kõrvamärkidega) ning hoitakse oma 
puurides vähemalt viis päeva enne annustamise algust, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega. Enne katse alustamist uuritakse kõiki loomi, et neil ei oleks nähtavaid nahakahjustusi.
 
Annustamislahuste valmistamine  
10. Tahke uuritav aine tuleb lahustada või suspendeerida lahustis või 
kandeaines ja vajaduse korral lahjendada enne hiire kõrvalestale määrimist. Vedelaid kemikaale võib annustada puhtal kujul või lahjendada enne annus ­
tamist. Lahustumatuid keemilisi aineid, näiteks aineid, mida kasutatakse 
meditsiiniseadmetes, tuleb enne hiire kõrvalestale kandmist sobiva solven ­
diga tõhusalt ekstraheerida, et teha kindlaks kõik ekstraheeritavad koosti ­
sained, mille mõju tuleks uurida. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid 
preparaate, kui ei ole stabiilsusandmetega tõendatud, et säilitamine on 
lubatav.
 
Usaldusväärsuse kontroll  
11. Positiivse kontrolli kemikaale kasutatakse selleks, et tõendada katsemeetodi 
vajalikku tulemuslikkust: sensibiliseerivate uuritavate ainetega, mille puhul 
immuunvastuse ulatus on hästi kirjeldatud, saadakse õige ja korratav 
tulemus. Soovitatakse teha paralleelselt positiivse kontrolli katse, kuna see tõendab labori võimet teha iga katse õigesti ning võimaldab hinnata labo ­
risisest ja laboritevahelist korratavust ja võrreldavust. Ka mõned regulee ­
rivad asutused nõuavad positiivset kontrolli iga uuringu puhul ja seepärast 
soovitatakse käesoleva meetodi kasutajatel konsulteerida enne LLNA tege ­
mist asjakohaste asutustega. Seepärast soovitatakse alati teha paralleelselt positiivse kontrolli katseid, et vältida vajadust teha täiendavaid loomkatseid, 
et täita nõudeid, mis võivad tekkida perioodilise positiivse kontrolli kasu ­
tamise puhul (vt punkt 12). Positiivne kontroll peaks andma positiivse LLNA immuunvastuse kokkupuutetasemel, mis eeldatavasti suurendab stimulatsiooniindeksit (SI) üle kolme korra, võrreldes negatiivse kontroll ­
rühmaga. Positiivse kontrolli annus tuleks valida nii, et see ei põhjustaks 
ulatuslikku nahaärritust või süsteemset mürgitust ja tekitatav mõju oleks
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
korratav, kuid mitte liiga suur (näiteks stimulatsiooniindeks üle 20 on liiga 
suur). Eelistatavad positiivse kontrolli ained on 25 % heksüülkaneelalde ­
hüüd (Chemical Abstracts Service’i (CASi) nr 101-86-0) atsetooni-oliiviõli segus (4: 1, v/v) ja 5 % merkaptobensotiasool (CASi nr 149-30-4)  N,N- 
dimetüülformamiidis (vt 1. liide, tabel 1). Võib olla olukordi, kus piisavalt 
põhjendatult võib kasutada muid positiivse kontrolli aineid, mis vastavad 
eespool esitatud kriteeriumidele.
 
12. Kuigi igas katses soovitatakse paralleelselt teha katsed ka positiivse kont ­
rolli rühmaga, võib esineda olukordi, kus labori jaoks, milles korrapäraselt 
(st vähemalt kord kuus) tehakse LLNAd ja on olemas varasemate positiivse 
kontrolli katsete andmebaas, mis tõendab labori võimet saada korratavaid ja õigeid positiivse kontrolli tulemusi, võib sobiv olla perioodiline positiivse kontrolli tegemine (näiteks kuni kuue kuu järel). Vajalikku oskuste taset 
LLNA alal võib tõendada vähemalt kümne sõltumatu ja omavahel koos ­
kõlas oleva positiivse kontrolli katsega, mis on tehtud mõistliku ajavahe ­
miku (vähem kui aasta) jooksul.
 
13. Paralleelset positiivse kontrolli rühma tuleb alati kasutada siis, kui muutub 
LLNA läbiviimine (näiteks uued väljaõppe saanud töötajad, katsemeetodi 
materjalide ja/või reaktiivide muutus, katsemeetodi läbiviimise tehniliste vahendite muutus, uus katseloomade tarnija) ja sellised muutused tuleb laboriprotokollis dokumenteerida. Tuleb analüüsida selliste muutuste mõju 
varasemate katsetega loodud andmebaasi järjepidevusele ja otsustada, kas 
on vaja teha uus andmebaas, et dokumenteerida kooskõla varasemate posi ­
tiivse kontrolli tulemustega.
 
14. Meetodi kasutajad peaksid teadma, et otsus kasutada positiivset kontrolli 
perioodiliselt, mitte paralleelselt, mõjutab perioodilise positiivse kontrolli 
vahepealsel ajal ilma positiivse kontrollita saadud negatiivsete uuringutule ­
muste adekvaatsust ja vastuvõetavust. Kui perioodilise positiivse kontrolli katses saadakse näiteks valenegatiiv, võib ajavahemikus viimasest vastu ­
võetavast positiivse kontrolli katsest kuni vastuvõetamatu kontrollkatseni 
uuritavate ainetega saadud negatiivsed tulemused panna kahtluse alla. Selliste tulemuste tähendust tuleks hoolikalt analüüsida, kui otsustatakse, kas teha positiivse kontrolli katseid paralleelselt või üksnes perioodiliselt. 
Mõelda tuleb ka, kuidas kasutada vähem loomi paralleelses positiivse kont ­
rolli rühmas, kui see on teaduslikult põhjendatud ja kui labor tõendab oma varasemate andmetega, et on võimalik kasutada vähem hiiri (12).
 
15. Kuigi positiivset kontrollainet tuleks uurida kandeaines, mis teatavasti annab 
teatava kindla immuunvastuse (nt atsetoon-oliiviõli, suhtes 4: 1, v/v), võib 
esineda teatavaid regulatiivseid olukordi, milles on vaja teha katseid ka ebatavalise kandeainega (kliiniliselt või keemiliselt asjakohane segu) (24). Kui paralleelset positiivse kontrolli katset tehakse muu kandeainega kui 
uuritava aine puhul, on vaja moodustada eraldi veel positiivse kontrolli 
kandeaine-kontrollrühm.
 
16. Kui uuritakse teatava keemiliste ühendite klassi aineid või mõõdetakse 
nende poolt esile kutsutava immuunvastuse vahemikku, võib olla kasulik 
mõõta teatavaid võrdlusaineid, millega tõendatakse, et katse võimaldab 
õigesti määrata kõnealuste ühenditüüpide võimet nahka sensibiliseerida. Sobival võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused:
 
— struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega;  
— teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused;  
— varasemad toetavad LLNA andmed;  
— toetavad andmed muude katseloomade ja/või inimese kohta.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
KATSE KÄIK  
Loomade arv ja annusemäärad  
17. Ühes annuserühmas on vähemalt neli looma, kasutatakse vähemalt kolme 
uuritava aine kontsentratsiooni ja paralleelselt negatiivset kontrollrühma, 
keda töödeldakse üksnes kandeainega, mida kasutatakse uuritava aine puhul, ning positiivse kontrolli rühma (kas paralleelne või hiljutine posi ­
tiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–14). Tuleb 
kaaluda positiivse kontrolli tegemist mitme annusega, eriti kui positiivset 
kontrolli tehakse aeg-ajalt. Kontrollrühma loomi koheldakse ja töödeldakse nii nagu katserühma loomi, välja arvatud töötlemine uuritava ainega.
 
18. Annuse ja kandeaine valik peaks põhinema viidetes 3 ja 5 antud soovitustel. 
Tavaliselt valitakse järjestikused annused sobivast kontsentratsioonide reast, näiteks 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. Kasutatava kontsentratsioonide rea valimisel peaks olema asjakohane teaduslik 
põhjendus. Tuleks arvesse võtta kõik olemasolevad toksikoloogiaandmed 
(nt ägeda toksilisuse ja nahaärrituse kohta) ning andmed uuritava aine struktuuri ja füüsikalis-keemiliste omaduste kohta ning valida kolm järjesti ­
kust kontsentratsiooni nii, et kõrgeim kontsentratsioon tagab maksimaalse 
võimaliku kokkupuute, kuid selle puhul ei avaldu süsteemset toksilisust ega 
liiga suurt paikset nahaärritust (3, 25). Sellise teabe puudumisel võib olla vajalik teha esialgne sõelkatse (vt punktid 21–24).
 
19. Kandeaine ei tohiks segada katse tegemist ega muuta katse tulemust ja 
tuleks valida nii, et viia lahustuvus maksimumini, et kasutada kõrgeimat 
võimalikku kontsentratsiooni ja saada ühtlasi uuritava aine pealekandmiseks sobiv lahus või suspensioon. Soovitatavad kandeained on atsetoon-oliiviõli (4: 1, v/v),  N,N-dimetüülformamiid, metüületüülketoon, propüleenglükool ja 
dimetüülsulfoksiid (19), kuid võib kasutada ka muid kandeaineid, kui 
esitada selleks piisav teaduslik põhjendus. Teatud olukorras võib osutuda vajalikuks kasutada täiendavaks kontrolliks kliiniliselt asjakohast lahustit või kaubanduslikku valmistist, milles uuritavat ainet turustatakse. Tuleks 
jälgida, et hüdrofiilsed uuritavad ained kantaks peale kandeainesüsteemi 
abil, mis märgab nahka ega voola nahalt kohe maha; selleks lisatakse sobi ­
vaid solubiliseerijaid (nt 1 % Pluronic® L92). Seepärast tuleks täielikku vesilahust vältida.
 
20. Iga üksiku hiire lümfisõlmede töötlemine võimaldab hinnata loomadevahe ­
list varieeruvust ja statistiliselt võrrelda uuritavate ainetega tehtud mõõtmiste ja kandeaine-kontrollrühma mõõtmiste erinevust (vt punkt 35). Lisaks saab 
positiivse kontrolli rühma hiirte arvu vähendamise võimalikkust hinnata siis, 
kui kogutakse iga üksiku hiire andmeid (12). Lisaks nõuavad mõned regu ­
leerivad asutused iga üksiku looma andmete kogumist. Mõned reguleerivad asutused peavad vastuvõetavaks katseloomade koondandmeid ja siis võivad 
meetodi kasutajad valida, kas koguda iga üksiku looma andmeid või koon ­
dandmeid
 
Esialgne sõelkatse  
21. Kui ei ole andmeid suurima uuritava annuse kindlaksmääramiseks (vt punkt 
18), tuleks teha esialgne sõelkatse, et leida LLNA jaoks sobiv annuste 
vahemik. Esialgse sõelkatse eesmärk on saada andmeid, mille järgi määrata 
suurim LLNA põhikatses kasutatav annus, kui ei ole teada kontsentratsioon, millel avaldub süsteemne toksilisus (vt punkt 24) ja/või tekib ülemäärane nahaärritus (vt punkt 23). Suurim uuritav annus peab olema 100 % vedela 
uuritava aine puhul või kõrgeim võimalik kontsentratsioon tahke aine või 
suspensiooni puhul.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Esialgne sõelkatse tehakse samades tingimustes kui LLNA põhikatse, kuid 
ei hinnata lümfisõlmede vohamist ja annuserühma kohta võidakse kasutada 
vähem katseloomi. Annuserühmas on soovitatavalt üks või kaks hiirt. Kõiki hiiri vaadeldakse iga päev, et leida süsteemse toksilisuse kliinilisi ilminguid või paikset nahaärritust pealekandmiskohas. Registreeritakse kehakaal enne 
katset ja enne katse lõppu (6. päev). Iga hiire kumbagi kõrvalesta uuritakse 
punetuse suhtes ja hinnatakse selle aste, kasutades tabelit 1 (25). Kõrvalesta paksust mõõdetakse paksusemõõtja (nt digitaalne mikromeeter või paksuse ­
mõõtja Peacock Dial) abil 1. päeval (enne annustamist), 3. päeval (ligikaudu 
48 tundi pärast esimest annust) ja 6. päeval. Lisaks võib 6. päeval mõõta 
kõrvalesta paksuse, milleks pärast looma humaanset surmamist lüüakse kõrvalestast mulgustajaga välja tükk ja kaalutakse. Ulatuslikku paikset nahaärritust näitab vähemalt hindele 3 vastav punetus ja/või kõrvalesta 
paksuse suurenemine vähemalt 25 % mõnel mõõtmispäeval (26, 27). 
LLNA põhikatse jaoks valitud kõrgeim annus on järgmine madalam annus esialgse sõelkatse kontsentratsioonide reas (vt punkt 18), millel ei avaldu süsteemne toksilisus ega teki ülemäärast nahaärritust.
 
Tabel 1  
Punetuse hinne  
Nähud Hinne  
Nahapunetust ei esine 0 
Väga nõrk (vaevumärgatav) nahapunetus 1 Selgesti nähtav nahapunetus 2 Mõõdukas kuni tugev nahapunetus 3 Tugev nahapunetus (meenutab peeti) kuni kooriku tekkimine, 
mis takistab nahapunetuse astme edasist täpsustamist 4
 
23. Lisaks kõrvalesta paksuse 25 % suurenemisele (26, 27) on ärritust tekitavate 
ainete kindlakstegemiseks LLNA abil kasutatud ka kõrvalesta paksuse statistiliselt olulist suurenemist töödeldud hiirtel, võrreldes kontrollrühma 
hiirtega (28, 29, 30, 31, 32, 33, 34). Ent kuigi statistiliselt oluline kõrvalesta 
paksuse suurenemine võib olla ka väiksem kui 25 %, ei ole selline paksuse suurenemine konkreetselt seotud ülemäärase nahaärritusega (30, 32, 33, 34).
 
24. Kui kliinilisi uuringuid kasutatakse LLNA põhikatses kasutatava suurima 
annuse hindamise osana, siis süsteemset toksilisust (35, 36) võivad näidata järgmised kliinilised tunnused: närvisüsteemi talitluse muutused (nt karva püstitõusmine, liigutuste koordinatsiooni kadu, värin ja krambid), käitumise 
muutused (nt agressiivsus, muutus oma karvkatte hooldamises, liikumisak ­
tiivsuse oluline muutus), hingamise muutused (s.o hingamissageduse ja -sügavuse muutused, nagu raskendatud hingamine, õhuahmimine, räginad) ning muutused toidu ja vee tarbimises. Lisaks tuleb hindamisel arvestada 
letargia ja/või mittereageerimise märke ning rohkem kui kerge või lühiaja ­
lise valu või ebamugavustunde kliinilisi tunnuseid, samuti rohkem kui 5 % kehakaalu vähenemist ajavahemikus 1. kuni 6. päevani ning suremust. Suremas olevad loomad ja loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või 
kellel ilmnevad tõsiste või kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaanselt 
surmata (37).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Põhiuuringu katse ajakava  
25. Katse ajakava on järgmine.  
— 1. päev:  määratakse iga üksiku looma mass ja registreeritakse koos 
kõigi võimalike kliiniliste tähelepanekutega. Kummagi kõrvalesta välis ­
küljele kantakse 25 μl sobivalt lahjendatud uuritavat ainet, üksnes 
kandeainet või positiivse kontrolli ainet (paralleelne või perioodiline positiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–15).
 
— 2. ja 3. päev:  korratakse 1. päeval tehtud pealekandmist.  
— 4. ja 5. päev:  loomi ei töödelda.  
— 6. päev:  registreeritakse iga looma mass. Igale katse- ja kontroll ­
rühma hiirele süstitakse sabaveeni kaudu 250 μl fosfaatpuhvriga 
soolalahust, mis sisaldab 20 μCi (7,4 × 10  5 Bq) triitiumiga märgis ­
tatud  3 H-metüültümidiini. Asendusvõimalusena süstitakse kõikidele 
hiirtele sabaveeni kaudu 250 μl fosfaatpuhvriga soolalahust, mis 
sisaldab 2 μCi (7,4 × 10  4 Bq)  125 I-jododesoksüuridiini ja 10  –5 M 
fluorodesoksüuridiini. Viis tundi hiljem loomad surmatakse humaan ­
selt. Igal katseloomal lõigatakse välja kumbagi kõrvalesta dreenivad 
lümfisõlmed ja töödeldakse neid koos fosfaatpuhvriga soolalahuses (üksiku katselooma lähenemisviis); asendusvõimalusena lõigatakse välja iga katseloomade rühma loomade kumbagi kõrvalesta dree ­
nivad lümfisõlmed ja pannakse need kõik koos fosfaatpuhvriga 
soolalahusesse (iga katserühma ühendatud proovide lähenemisviis). Lümfisõlmede leidmise ja väljalõikamise üksikasjad ja joonised on esitatud viites (12). Paiksete naha immuunvastuste edasiseks jälgi ­
miseks põhikatses võib katseprotokolli kanda ka täiendavad näitajad, 
nagu kõrvalesta punetuse hinnang või kõrvalesta paksuse mõõtmise andmed (mis saadakse kas paksusemõõtjaga või pärast surmamist kõrvalestast mulgustajaga välja löödud tüki massi mõõtmisega).
 
Rakususpensioonide valmistamine  
26. Valmistatakse iga üksiku looma mõlemalt poolelt (üksiku katselooma lähe ­
nemisviis) või katserühma loomadelt (katserühma ühendatud proovide lähe ­
nemisviis) välja lõigatud ühendatud lümfisõlmede üksikrakususpensioon, milleks rakud eraldatakse üksteisest ettevaatliku mehaanilise töötlemisega, 
filtrides läbi 200 μm avaga roostevabast terasest võrgu, või kasutatakse 
muud sobivat võtet üksikrakususpensiooni valmistamiseks. Lümfisõlme ­
rakke pestakse kaks korda suure koguse fosfaatpuhvriga soolalahusega ja sadestatakse DNA 5 % trikloroäädikhappega 4 °C juures 18 tunni jooksul 
(3). Põhja tsentrifuugitud sade kas suspendeeritakse uuesti 1 ml trikloroää ­
dikhappes ja kantakse 10 ml stsintillatsioonivedelikku sisaldavasse stsintil ­
latsioonipudelisse
 3 H-loendamiseks või pannakse otse gammaloenduri torru  
125 I-loendamiseks.  
Rakkude vohamise määramine imendunud radioaktiivsuse järgi  
27. 3 H-metüültümidiini imendumist mõõdetakse β-stsintillatsiooni loendamise 
teel lagunemiste arvuna minutis ( disintegrations per minute , DPM).  
125 I-jododesoksüuridiini imendumist mõõdetakse  125 I-loendamise teel ning 
väljendatakse samuti lagunemiste arvuna minutis. Sõltuvalt kasutatavast 
lähenemisviisist väljendatakse radioaktiivse märgise imendumist DPM-ides 
katselooma kohta (üksiku katselooma lähenemisviis) või DPM-ides katse ­
rühma kohta (katserühma ühendatud proovide lähenemisviis).  
Vähendatud LLNA  
28. Teatud juhtudel, kui on regulatiivne vajadus kinnitada, et aine ei sensibili ­
seeri nahka, võib valikuliselt kasutada vähendatud LLNA eeskirja (16, 17, 
18), milleks kulub vähem katseloomi; seejuures tuleb järgida kõiki käesole ­
vas katsemeetodis kirjeldatud muid LLNA katse-eeskirja üksikasju. Enne vähendatud LLNA lähenemisviisi kohaldamist tuleb esitada selged põhjen ­
dused ja selle meetodi kasutamise teaduslik alus. Kui saadakse positiivne 
või kaheti tõlgendatav tulemus, võib vaja minna lisakatseid tulemuste 
tõlgendamiseks või selgitamiseks.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Ainus erinevus LLNA ja vähendatud LLNA katse-eeskirjade vahel on 
vähendatud annuserühmade arv ja seepärast ei saada vähendatud LLNAga 
teavet immuunvastuse annusest sõltuvuse kohta. Seepärast ei saa vähen ­
datud LLNAd kasutada, kui on vaja teavet immuunvastuse annusest sõltu ­
vuse kohta. Nagu paljuannuselise LLNA puhul, nii ka vähendatud LLNA 
puhul peaks uuritava aine kontsentratsioon olema kõrgeim kontsentratsioon, 
millel ei avaldu selge süsteemne toksilisus hiire jaoks ega ülemäärane paikne nahaärritus (vt punkt 18).
 
TÄHELEPANEKUD  
Kliinilised tähelepanekud  
30. Vähemalt kord päevas tuleks igal loomal hoolikalt vaadelda kliiniliste 
tunnuste esinemist – kas annustamiskoha paikset ärritust või süsteemset toksilisust. Iga hiire kohta registreeritakse süstemaatiliselt kõik tähelepa ­
nekud. Jälgimiskavas tuleks ette näha kriteeriumid, mille alusel tehakse 
kiiresti kindlaks ja surmatakse valutult hiired, kellel avaldub süsteemne 
toksilisus, ülemäärane paikne nahaärritus või -söövitus (37).
 
Kehamass  
31. Vastavalt punktile 25 tuleks mõõta iga looma kehamass katse alguses ja 
pärast ettemääratud humaanset surmamist.  
TULEMUSTE ARVUTAMINE  
32. Iga katserühma tulemused väljendatakse stimulatsiooniindeksi (SI) kaudu. 
Üksiku katselooma lähenemisviisi puhul tuletatakse SI, jagades iga uuritava 
aine rühma ja positiivse kontrollrühma keskmise DPMi hiire kohta lahusti-/kandeaine-kontrollrühma keskmise DPM-iga hiire kohta. Keskmine SI kandeaine-kontrollrühmade puhul on seega 1. Katserühma ühendatud 
proovide lähenemisviisi korral saadakse SI, jagades iga katserühma ühen ­
datud radioaktiivsuse imendumise ühendatud kandeaine-kontrollrühma imendumisega; selle tulemuseks on keskmine SI.
 
33. Otsustamisel peetakse tulemust positiivseks, kui SI on vähemalt 3. 
Kuid piiripealse tulemuse positiivseks leiuks kuulutamise otsuse tege ­
misel võib kasutada ka annuse-immuunvastuse sõltuvuse tugevust, statis ­
tilist olulisust ja lahusti/kandeaine ning positiivse kontrolli tulemuste 
kooskõlalisust (4, 5, 6).  
34. Kui saadud tulemust on vaja selgitada, tuleks arvesse võtta uuritava aine 
omadusi, sealhulgas struktuurilist sarnasust teadaolevate naha sensibilisaa ­
toritega, omadust põhjustada hiirel tugevat paikset nahaärritust ning 
annuse-immuunvastuse sõltuvuse laadi. Neid ja muid kaalutlusi on arutatud üksikasjalikult viites 7.
 
35. Radioaktiivsusandmete kogumine üksiku hiire tasandil võimaldab statistili ­
selt analüüsida, kas andmetes on näha annuse-immuunvastuse vahelist sõltu ­
vust ja kui tugev see on. Iga statistiline hindamine peaks hõlmama annuse-immuunvastuse sõltuvuse hindamist ja katserühmade läbimõeldud 
võrdlemist (näiteks paariviisiline annuserühmade ja paralleelsete 
kandeaine-kontrollrühmade võrdlemine). Statistiline analüüs võib hõlmata näiteks lineaarset regressiooni või Williami testi annuse-immuunvastuse sõltuvuste hindamiseks ja Dunnetti paariviisiliste võrdluste testi. Statistilise 
analüüsi sobiva meetodi valimisel peaks uurija kogu aeg arvesse võtma 
võimalikku dispersioonide ebavõrdsust ja muid seonduvaid probleeme, mille tõttu võib vaja minna andmete teisendamist või mitteparameetrilist statistilist analüüsi. Igal juhul võib uurijal olla vaja teha SI arvutusi ja 
statistilist analüüsi kõigi andmepunktidega ja siis mõne andmepunkti kõrva ­
lejätmisega (nn võõrväärtused).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
36. Andmed tuleb koondada tabelisse. Üksiku katselooma lähenemisviisi puhul 
esitatakse üksiklooma DPMi väärtus, rühma keskmine suhte DPM/katse ­
loom väärtus, selle viga (näiteks standardhälve, standardviga) ja iga annu ­
serühma keskmine SI, võrrelduna paralleelse kandeaine-kontrollrühma SI-ga. Katserühma ühendatud proovide lähenemisviisi korral esitage kesk ­
mine DPM / mediaan-DPM ja keskmine SI iga annuserühma jaoks, võrrel ­
duna paralleelse kandeaine-kontrollrühma SI-ga.
 
Katseprotokoll  
37. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave:  
uuritav aine ja kontrollaine:  
— tunnusandmed (näiteks CASi ja EÜ numbrid, kui on teada; allikas; 
puhtus; teadaolevad lisandid; partii number);  
— füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt lenduvus, 
stabiilsus, lahustuvus);  
— kui tegemist on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsen ­
dimäärad;  
lahusti/kandeaine:  
— tunnusandmed (puhtus; kontsentratsioon (vajaduse korral); kasutatud 
ruumala);  
— kandeaine valiku põhjendus;  
katseloomad:  
— CBA-liini hiirte allikas;  
— loomade mikrobioloogiline staatus, kui see on teada;  
— loomade arv ja vanus;  
— loomade päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;  
katsetingimused:  
— uuritava aine ettevalmistamise ja annustamise üksikasjad;  
— annuse valiku põhjendus (sealhulgas esialgse sõelkatse tulemused, kui 
see tehti);  
— kandeaine ja uuritava aine kontsentratsioonid ning uuritava aine manus ­
tatud üldkogus;  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);  
— annustamis- ja proovivõtukava üksikasjalik kirjeldus;  
— toksilisuse mõõtmise meetodid;  
— kriteeriumid, mille järgi uuringutulemus loeti positiivseks või negatiiv ­
seks;  
— kõikide katse-eeskirjast kõrvalekaldumiste üksikasjad ja selgitus, kuidas 
kõrvalekaldumine mõjutab uuringu korraldust ja tulemusi;  
usaldusväärsuse kontroll:  
— kokkuvõte viimase usaldusväärsuskontrolli tulemustest, sealhulgas teave 
kasutatud aine, kontsentratsiooni ja kandeaine kohta;  
— katselabori paralleelselt saadud ja/või varasemad positiivse kontrolli ja 
negatiivse kontrolli andmed;  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— kui paralleelset positiivse kontrolli katset ei tehtud, siis kõige viimase 
korrapärase positiivse kontrolli uuringu kuupäev ja laboriprotokoll ning 
aruanne, milles esitatakse labori varasemad positiivse kontrolli andmed, mis põhjendavad paralleelse positiivse kontrolli katse tegematajätmist;
 
tulemused:  
— iga looma mass annustamise alguses ja pärast ettemääratud surmamist; 
samuti iga katserühma keskväärtus ja selle viga (näiteks standardhälve, standardviga);
 
— iga looma puhul toksilisuse ilmnemise algus ja nähud, sealhulgas 
võimalik nahaärritus annustamiskohas;  
— iga katserühma DPMi väärtused ja SI väärtused tabelina iga üksiku hiire 
kohta (üksiku katselooma lähenemisviis) või keskväärtus/mediaan (katserühma ühendatud proovide lähenemisviis);
 
— iga katserühma DPMi/hiire keskväärtus ja selle viga (näiteks standard ­
hälve, standardviga) ning iga katserühma võõrväärtuste analüüsi tule ­
mused üksiku katselooma lähenemisviisi puhul;  
— arvutatud SI ja sobiv hajuvuse näitaja, millega võetakse arvesse eri 
loomadega saadud tulemuste hajuvust uuritava aine rühmas ja kontroll ­
rühmas üksiku katselooma lähenemisviisi puhul;  
— annuse-immuunvastuse sõltuvus;  
— vajaduse korral statistilised analüüsid;  
tulemuste arutelu:  
— lühike kommentaar tulemuste, annuse-immuunvastuse sõltuvuse 
analüüsi ja vajaduse korral statistilise analüüsi kohta ning järeldused 
selle kohta, kas uuritud ainet tuleks pidada naha sensibilisaatoriks.  
KIRJANDUS  
1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guide ­
line for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Vt http://www.oecd.or ­
g/env/testguidelines  
2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. 
Toxicol ., 30, 165–169.  
3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 13–31.  
4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments 
using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. Toxicol. 
Environ. Health , 53, 563–79.
 
5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999-1002.  
6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985–997.
 
7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327–33.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins,  Toxicol ., 146, 49–59.
 
9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258–273.  
10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274–286.
 
11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249–257.
 
12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf
 
13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemicals 
No 406, OECD, Paris. Vt http://www.oecd.org/env/testguidelines  
14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Vt http://www.oecd.or ­
g/env/testguidelines
 
15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses 
to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281–284.  
16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181–185.
 
17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, 
Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Vali ­
dation of Alternative Methods, April 2007. Vt http://ecvam.jrc.it/ft_doc/E ­
SAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf  
18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The 
Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
Vt http://iccvam.niehs.nih.gov/
 
19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated 
by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, 
C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensi ­
tisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 
90–96.
 
22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences. Vt http://iccvam.niehs.nih.gov/
 
23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71–89.  
25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing 
of Chemicals No. 404, Paris, France. Vt http://www.oecd.org/document/40/ 0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html
 
26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.
 
27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Vt http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/im ­
munotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf  
28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206.
 
29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  
Toxicol. Appl. Pharmacol ., 153, 83–94.
 
30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245–256.  
31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491–506.  
32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60–68.
 
33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Vt http://www.oecd.org/env/testguidelines  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm
 
37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, Series on 
Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Vt http://www.oecd.org/env/testguidelines
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
1. liide  
Naha sensibiliseerimise määramiseks pakutava samalaadse või muudetud 
LLNA katsemeetodi tulemuslikkusnõuded  
SISSEJUHATUS  
1. Tulemuslikkusnõuete eesmärk on esitada alus, mille põhjal uusi katsemeeto ­
deid, nii kaitstud (autoriõiguse või kaubamärgiga või registreeritud) meeto ­
deid kui ka kaitsmata meetodeid, saaks tunnistada konkreetse uuringu jaoks piisava täpsuse ja usaldusväärsusega meetodiks. Selliseid valideeritud ja tunnustatud meetoditel põhinevaid tulemuslikkusnõudeid saab kasutada 
selleks, et hinnata muude samalaadsete, samadele teaduslikele põhimõtetele 
tuginevate ja samade bioloogiliste või toksiliste mõjude mõõtmiseks või ennustamiseks kasutatavate, nn mina-kah-meetodite usaldusväärsust ja täpsust (14).
 
2. Enne muudetud meetodi, s.o kinnitatud meetodi võimaliku täiustatud 
variandi vastuvõtmist peaks toimuma hindamine, et teha kindlaks kavan ­
datud muudatuste mõju katse tulemuslikkusele ja millisel määral sellised 
muudatused mõjutavad teavet muude valideerimisprotsessi osade kohta. Olenevalt pakutavate muudatuste arvust ja laadist, muudatuste kohta saadud andmetest ja muudatusi toetavatest dokumentidest tuleks nende suhtes kohal ­
dada kas sama valideerimisprotsessi kui uue katsemeetodi puhul või usal ­
dusväärsuse ja asjakohasuse piiratud hindamist kehtestatud tulemuslikkus ­
nõuete alusel (14).
 
3. Käesoleva katsemeetodi alusel kavandatud ja kasutamiseks esitatud menet ­
lusi tuleks hinnata, et määrata kindlaks nende usaldusväärsus ja täpsus 
kõikide ainete puhul, mis esindavad kogu LLNA hinneteskaalat. Katseloo ­
made põhjendamatu kasutamise vältimiseks soovitatakse tungivalt, et mude ­
lite väljatöötajad peaksid nõu asjaomaste asutustega, enne kui alustavad käesolevas katsemeetodis esitatud tulemuslikkusnõuete ja suuniste kohaseid 
valideerimisuuringuid.
 
4. Tulemuslikkusnõuded põhinevad USA alternatiivmeetodite valideerimise 
ametitevahelise koordineerimiskomitee (US-ICCVAM), alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskuse (EC-ECVAM) ja alternatiivmeetodite vali ­
deerimise Jaapani keskuse (JaCVAM) ühtlustatud tulemuslikkusnõuetel 
(12), mille alusel hinnatakse LLNA samalaadsete või muudetud versioonide 
valideeritust. Tulemuslikkusnõuded koosnevad katsemeetodite olulisematest osadest, soovitatavatest võrdluskemikaalidest ning täpsus- ja usaldatavus ­
nõuetest, millele pakutav meetod peaks vastama või mida ta peaks ületama.
 
I. Katsemeetodi olulised osad  
5. Samalaadse või muudetud LLNA-meetodi tööpõhimõttelise ja teostusliku 
analoogia tagamiseks LLNAga ning sama bioloogilise mõju mõõtmiseks 
peaksid katse-eeskirjas olema järgmised osad:  
— uuritavat ainet tuleks paikselt kanda hiire mõlemale kõrvalestale;  
— tuleks mõõta lümfotsüütide vohamist lümfisõlmedes, mis dreenivad uuri ­
tava aine pealekandmise kohta;  
— lümfotsüütide vohamist tuleks mõõta naha sensibiliseerimise induktsioo ­
nifaasi ajal;  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— uuritavate ainete puhul peaks valitav annus olema kõrgeim kontsentrat ­
sioon, millel ei avaldu hiire jaoks süsteemne toksilisus ega ülemäärane 
paikne nahaärritus. Positiivsete võrdluskemikaalide puhul peaks suurim annus olema vähemalt sama suur kui asjaomase võrdluskemikaali EC3 väärtus LLNA puhul (vt tabel 1), mille puhul ei avaldu hiire jaoks 
süsteemne toksilisus ega ülemäärane paikne nahaärritus;
 
— igas uuringus peaks olema paralleelne kandeaine-kontrollrühm ja vaja ­
duse korral ka positiivse kontrolli rühm;  
— igas annuserühmas tuleks kasutada vähemalt nelja katselooma;  
— võib koguda andmeid kas üksiku katselooma kohta või katseloomade 
ühendatud andmeid.  
Kui mõni neist kriteeriumidest ei ole täidetud, ei saa siin esitatud tulemus ­
likkusnõudeid kasutada samalaadse või muudetud meetodi valideerimiseks.  
II. Võrdluskemikaalide miinimumloetelu  
6. US-ICCVAMi, EC-ECVAMi ja JaCVAMi ühtlustatud tulemuslikkusnõuetes 
(12) on esitatud 18 võrdluskemikaali kui miinimumhulk, mida tuleks kasu ­
tada, ja neli valikulist võrdluskemikaali (need on ained, mis andsid LLNAga kas valepositiivne või -negatiive, kui võrrelda neid inimesel ja meriseal 
saadud tulemustega (B.6 ehk OECD katsejuhend 406) (13), ning seepärast 
võimaldavad need näidata LLNAga võrreldavat või paremat tulemuslikkust), mis on võetud LLNA tulemuslikkusnõuetesse. Osutatud kemikaalide välja ­
valimise kriteeriumid olid järgmised:
 
— võrdluskemikaalide loendis on esindatud aineklassid, mida tavaliselt uuri ­
takse naha sensibiliseerimise suhtes ja mille immuunvastus on vahe ­
mikus, mida LLNAga saab mõõta või ennustada;  
— kõigi ainete keemiline ehitus on hästi teada;  
— iga aine jaoks on olemas meriseal saadud LLNA andmed (B.6 ja OECD 
katsejuhend 406) (13) ning (kus võimalik) inimesel saadud andmed ning  
— kõik ained on kaubanduses hästi kättesaadavad.  
Soovitatud võrdluskemikaalid on loetletud tabelis 1. Uuringutes, milles 
soovitatud võrdluskemikaale kasutatakse, tuleks hindamiseks kasutada võrd ­
luskemikaale samades kandeainetes, millega need on loetletud tabelis 1. Kui mõnda loetletud ainet ei ole saada, võib kasutada muid aineid, mis vastavad 
loetletud valikukriteeriumidele, ja tuleb esitada vajalik põhjendus.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabel 1  
LLNA tulemuslikkusnõuete jaoks soovitatud võrdluskemikaalid  
Jrk-nr Kemikaal (  1 ) CASi nr Vorm Veh (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Tegelik EC3 
vahemik LLNA vs GP LLNA vs 
inimene  
1 5-kloro-2-metüül-4-isotiasoliin-3-oon (CMI)/2- 
metüül-4-isotiasoliin-3-oon (MI) (  5 ) 26172- 
55-4/2682-20-4 Liq DMF 0,009 1 0,0045–0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Sol AOO 0,049 15 0,025–0,099 0,02–0,09 ­
4 +/+ +/+ 
3 4-fenüleendiamiin 106-50-3 Sol AOO 0,11 6 0,055–0,22 0,07–0,16 +/+ +/+ 
4 koobaltkloriid 7646-79-9 Sol DMSO 0,6 2 0,3–1,2 0,4–0,8 +/+ +/+ 
5 isoeugenool 97-54-1 Liq AOO 1,5 47 0,77–3,1 0,5–3,3 +/+ +/+ 
6 2-merkaptobensotiasool 149-30-4 Sol DMF 1,7 1 0,85–3,4 NC +/+ +/+ 7 tsitraal 5392-40-5 Liq AOO 9,2 6 4,6–18,3 5,1–13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Liq AOO 9,7 21 4,8–19,5 4,4–14,7 +/+ +/+ 9 eugenool 97-53-0 Liq AOO 10,1 11 5,05–20,2 4,9–15 +/+ +/+ 
10 fenüülbensoaat 93-99-2 Sol AOO 13,6 3 6,8–27,2 1,2–20 +/+ +/+ 
11 kaneelalkohol 104-54-1 Sol AOO 21 1 10,5–42 NC +/+ +/+ 
12 imidasolidinüülkarbamiid 39236-46-9 Sol DMF 24 1 12–48 NC +/+ +/+ 13 metüülmetakrülaat 80-62-6 Liq AOO 90 1 45–100 NC +/+ +/+ 14 klorobenseen 108-90-7 Liq AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15 isopropanool 67-63-0 Liq AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Jrk-nr Kemikaal (  1 ) CASi nr Vorm Veh (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Tegelik EC3 
vahemik LLNA vs GP LLNA vs 
inimene  
16 piimhape 50-21-5 Liq DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 metüülsalitsülaat 119-36-8 Liq AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 salitsüülhape 69-72-7 Sol AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Valikained, millega saab tõendada LLNAga võrreldes paremat tulemuslikkust 
19 naatriumlaurüülsulfaat 151-21-3 Sol DMF 8,1 5 4,05–16,2 1,5–17,1 +/– +/– 20 etüleenglükooldimetakrülaat 97-90-5 Liq MEK 28 1 14–56 NC +/– +/+ 21 ksüleen 1330-20-7 Liq AOO 95,8 1 47,9–100 NC +/ (**) +/– 22 nikkeldikloriid 7718-54–9 Sol DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Lühendid: AOO = atsetoon: oliiviõli (4: 1, v/v); CASi nr = Chemical Abstracts Service’i number; DMF =  N,N-dimetüülformamiid; DMSO = dimetüülsulfoksiid; DNCB = 2,4-dinitroklorobenseen; EC3 = hinnanguline 
kontsentratsioon, mille puhul stimulatsiooniindeks on 3; GP = merisea katse tulemus (s.o B.6 või OECD katsejuhis 406) (13); HCA  = heksüülkaneelaldehüüd; Liq = vedelik; LLNA = hiire paiksete lümfisõlmede katse 
tulemus (s.o B.42 või OECD katsejuhis 429) (1); MEK = metüületüülketoon; NA = ei ole kohaldatav, kuna stimulatsiooniindeks on v äiksem kui 3; NC = ei ole arvutatud, kuna andmed on saadud üheainsa uuringuga; 
Sol = tahke aine; Veh = kandeaine. 
(*) Oletatakse, et inimese puhul ei ole sensibilisaator, kuna inimnaha tükikese katsete kliinilisi tulemusi ei ole leitud, kõne alust ainet ei ole inimnaha tükikese allergeenide komplektis ja ei ole teatatud ühestki juhtumist, kus aine oleks 
sensibiliseerinud inimest. 
(**) Merisea andmed ei ole kättesaadavad. 
( 1 ) Kemikaalid tuleks valmistada iga päev, kui ei ole stabiilsusandmetega tõendatud, et säilitamine on lubatav. 
( 2 ) Kuna LLNA tulemuslikkust võib mõjutada erinev kandeaine, tuleb kasutada iga võrdluskemikaali jaoks soovitatud kandeainet (24,  32). 
( 3 ) Keskväärtus, kui kättesaadav on rohkem kui üks EC3 väärtus. Negatiivsete ainete (st mille stimulatsiooniindeks on väiksem kui  3) puhul on esitatud kõrgeim uuritud kontsentratsioon. 
( 4 ) Andmete allikana kasutatud LLNA uuringute arv. 
( 5 ) Kaubanduses kättesaadav nimetuse Kathon CG all (CASi nr 55965-84/9), mis on CMI ja MI segu vahekorras 3: 1. Komponentide suht elised kontsentratsioonid on vahemikus 1,1–1,25 % CMI ja 0,3–0,45 % MI. Inaktiivsed 
komponendid on magneesiumisoolad (21,5–24 %) ja vasknitraat (0,15–0,17 %), ülejäänud osa on vesi (74–77 %). Kathon CGd saab ost a Sigma-Aldrichi ning Rohm and Haas’i (nüüd Dow Chemical Corporation) kaudu.
III. Kindlaksmääratud usaldusväärsus- ja täpsusnõuded  
7. Samalaadse või muudetud LLNA-meetodi täpsus peaks vastama 18 kohus ­
tuslikult kasutatava võrdluskemikaali puhul LLNA tulemuslikkusnõuetele 
või ületama LLNA täpsust. Uus või muudetud meetod peaks võimaldama õige klassifitseerimise jah-või-ei-otsuse alusel. Kuid uus või muudetud meetod ei tarvitse võimaldada õigesti klassifitseerida kõiki kohustuslikku 
miinimumkogumisse kuuluvaid võrdluskemikaale. Kui näiteks üks nõrkadest 
sensibiliseerijatest klassifitseeritakse valesti, tuleks samaväärse tulemuslik ­
kuse tõendamiseks kaaluda vale klassifitseerimise põhjenduse ja sobivate lisaandmete esitamist (näiteks katsetulemused, millega saadakse õige klassi ­
fikatsioon muude ainete puhul, mille füüsikalised, keemilised ja sensibilisee ­
rivad omadused sarnanevad valesti klassifitseeritud aine omadega). Sellisel juhul hinnatakse uue või muudetud LLNA-meetodi valideerituse staatust konkreetsete juhtude alusel.
 
Laborisisene reprodutseeritavus  
8. Laborisisese reprodutseeritavuse määramiseks tuleks uut või muudetud 
LLNA-meetodit hinnata, kasutades sensibiliseerivat ainet, mida on 
LLNA-meetodiga hästi uuritud. Seepärast on LLNA tulemuslikkusnõuete saavutamise hindamisel aluseks heksüülkaneelaldehüüdi (HCA) korduva mõõtmise tulemuste varieeruvus. Laborisisese usaldusväärsuse hindamiseks 
tuleb saada HCA hinnangulise lävikontsentratsiooni (ECt) väärtused neljast 
eraldi katsest, mis tehakse vähemalt nädalase vahega katsete vahel. Labori ­
sisene reprodutseeritavus on vastuvõetav, kui laboris suudetakse iga HCA katse puhul saada ECt väärtused vahemikus 5–20 %, mis vastab 10 % HCA 
jaoks LLNAga kindlaks tehtud EC3 vahemikule poolest keskväärtusest kuni 
kahekordse keskväärtuseni (vt tabel 1).
 
Laboritevaheline reprodutseeritavus  
9. Laboritevahelise reprodutseeritavuse määramiseks tuleks uut või muudetud 
LLNA-meetodit hinnata, kasutades kahte sensibiliseerivat ainet, mida on LLNA-meetodiga hästi uuritud. LLNA tulemuslikkusnõuete saavutamise 
hindamisel on aluseks HCA ja 2,4-dinitroklorobenseeni (DNCB) mõõtmise 
tulemuste varieeruvus eri laborites. ECt väärtused tuleks määrata sõltumatult ühest uuringust, mis tehakse vähemalt kolmes eri laboris. Vastuvõetava laboritevahelise reprodutseeritavuse tõendamiseks peaks iga labor saama 
HCA puhul ECt väärtused vahemikus 5–20 % ja DNCB puhul vahemikus 
0,025–0,1 %, mis vastab kindlakstehtud EC3 vahemikule poolest keskväär ­
tusest kuni kahekordse keskväärtuseni; LLNAga määratud keskväärtus on HCA puhul 10 % ja DNCB puhul 0,05 % (vt tabel 1).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
2. liide  
Mõisted  
Täpsus:  katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. 
Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab 
katsemeetod õige tulemuse (14).
 
Võrdlusaine:  sensibiliseeriv või muu aine, mida kasutatakse standardina võrdle ­
miseks uuritava ainega. Võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused: i) 
pidev ja usaldusväärne tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuri ­
tava ainega; iii) teadaolevad füüsikalis-keemilised omadused; iv) täiendavad andmed teadaolevate mõjude kohta ja v) teadaolev mõjusus soovitavas immuun ­
vastuse tugevuse vahemikus.
 
Hinnanguline lävikontsentratsioon (ECt):  uuritava aine hinnanguline kontsentrat ­
sioon, mis põhjustab sellise stimulatsiooniindeksi, mis tõendab positiivse immuunvastuse olemasolu.
 
Hinnanguline SI 3 kontsentratsioon (EC3):  uuritava aine hinnanguline kontsen ­
tratsioon, mille puhul stimulatsiooniindeks on kolm.  
Valenegatiiv:  uuritav aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud negatiiv ­
seks või toimetuks, kui see tegelikult on positiivne või sensibiliseeriva toimega.  
Valepositiiv:  uuritav aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud positiiv ­
seks või sensibiliseerivat toimet omavaks, kui see tegelikult on negatiivne või 
sensibiliseeriva toimeta.  
Oht: kahjustava tervise- või ökoloogilise mõju võimalikkus. Kahjustav mõju 
avaldub üksnes piisaval tasemel kokkupuute puhul.  
Laboritevaheline reprodutseeritavus:  suurus, mis näitab, millisel määral 
suudavad erinevad kvalifitseeritud laborid, kasutades sama katse-eeskirja ja uurides samu uuritavaid aineid, saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt sarnaseid 
tulemusi. Laboritevaheline reprodutseeritavus määratakse valideerimiseelsete ja 
valideerimisega seotud menetlustega ja see näitab, millisel määral võib uurimis ­
meetodit edukalt üle viia ühest laborist teise (14).
 
Laborisisene reprodutseeritavus:  suurus, mis näitab, millisel määral suudavad 
sama labori kvalifitseeritud töötajad konkreetset katse-eeskirja kasutades saada kordusuuringutes eri aegadel samasuguseid tulemusi (14).
 
Mina-kah-meetod:  kõnekeelne väljend katsemeetodi kohta, mis on struktuuriliselt 
ja tööpõhimõttelt sarnane valideeritud ja aktsepteeritud võrdlusmeetodiga. Sellist katsemeetodit võib valideerida kiirendatud korras ( catch-up validation ). Kasuta ­
takse vaheldumisi samalaadsete katsemeetodite puhul (14).
 
Võõrväärtus:  võõrväärtus on katsetulemus, mis oluliselt erineb populatsiooni 
juhuvalimi muudest väärtustest.  
Tulemuslikkusnõuded:  valideeritud katsemeetodil põhinevad nõuded, mille alusel 
hinnatakse, kuivõrd saab esitatud katsemeetodit võrrelda tööpõhimõttelt ja teos ­
tuslikult sarnase meetodiga. Arvesse võetakse järgmist: i) katsemeetodi olulised osad; ii) valideeritud standardmeetodi tulemuslikkuse tõendamiseks kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdluskemikaalide miinimumloend ja iii) võrrel ­
davad täpsuse ja usaldusväärsuse tasemed, mis põhinevad valideeritud katsemee ­
todiga saadud tulemustel ja mis tuleks kavandatud katsemeetodi hindamisel saavutada võrdluskemikaalide miinimumloendi kasutamisel (14).
 
Kaitstud katsemeetod:  katsemeetod, mille kasutamine ja levitamine on piiratud 
patentide, autoriõiguse, kaubamärgi vm sellisega.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Kvaliteedi tagamine:  juhtimisprotsess, mille puhul katsete tegemises osalevatest 
isikutest sõltumatud isikud hindavad labori katsestandarditest, nõuetest ja tege ­
vuse registreerimise korrast kinnipidamist ning andmeedastuse õigsust.  
Võrdluskemikaalid:  valideerimisel kasutamiseks välja valitud kemikaalid, mille 
esilekutsutavad immuunvastused  in vitro  või in vivo  võrdlussüsteemis või huvi ­
pakkuva loomaliigi puhul on juba teada. Sellised kemikaalid peaksid esindama kemikaaliklasse, mille ainete puhul katsemeetodit eeldatavalt kasutatakse, ja 
samuti selliste ainete põhjustatava immuunvastuse kogu vahemikku, tugevast 
mõjust nõrga mõjuni ja mõju puudumiseni. Valideerimise eri staadiumide jaoks, samuti eri katsemeetodite ja kasutusalade puhul võidakse nõuda võrdlus ­
kemikaalide eri kogumite kasutamist (14).
 
Asjakohasus:  mõiste, millega väljendatakse seda, kas katsemeetod võimaldab 
uurida huvipakkuvat efekti, kas meetod on mõttekas ja sobib konkreetse eesmärgi 
jaoks. See näitab, millisel määral saab katsemeetodiga õigesti mõõta või ennus ­
tada huvipakkuvat bioloogilist efekti. Asjakohasus hõlmab ka katsemeetodi õigsuse (sisulise kooskõlalisuse) kaalutlusi (14).
 
Usaldusväärsus:  mõiste, mis iseloomustab katsemeetodi tulemuste reprodutseeri ­
tavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja 
eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse labo ­
risisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus (14).  
Naha sensibiliseerimine:  immunoloogiline protsess, mis avaldub, kui tundlik 
olend viiakse paikselt kokkupuutesse keemilise allergeeniga, mis kutsub esile naha immuunvastuse, mis võib areneda kontaktsensibiliseerimiseks.
 
Stimulatsiooniindeks (SI):  arvutatud väärtus, mis näitab uuritava aine võimet 
tekitada naha sensibiliseerimist ning mis on töödeldud rühmades ja paralleelselt 
uuritud kandeaine-kontrollrühmas jälgitud lümfotsüütide vohamise näitajate suhtarv.
 
Uuritav aine (uuritav kemikaal):  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva 
katsemeetodi abil.  
Valideeritud katsemeetod:  katsemeetod, mille valideerimisuuringud on lõpule 
viidud, st on määratud selle asjakohasus (sealhulgas täpsus) ja usaldusväärsus 
konkreetse eesmärgi puhul. Oluline on märkida, et valideeritud katsemeetod ei 
tarvitse olla piisavalt kasutuskõlblik täpsuse ja usaldusväärsuse osas, et seda saaks lugeda vastuvõetavaks konkreetse eesmärgi puhul (14).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  NEUROTOKSILISUSE UURING NÄRILISTEL  
1. MEETOD  
Käesolev meetod on samaväärne OECD TG 424ga (1997).  
Käesolev katsemeetod on välja töötatud sellise teabe saamiseks, mis 
on vajalik kemikaalide võimaliku neurotoksilisuse kinnitamiseks või 
täiendavaks iseloomustamiseks täiskasvanud loomadel. Seda saab kombineerida olemasolevate, korduva annusega toksilisuse uuringute katsemeetoditega või sooritatakse eraldi uuringuna. On soovitav, et 
OECD neurotoksilisuse uurimise strateegiaid ja meetodeid käsitleva 
juhisdokumendi (1) osas peetaks nõu, et aidata välja töötada käes ­
oleval katsemeetodil põhinevaid uuringuid. See on eriti tähtis siis, kui võetakse arvesse käesoleva meetodi rutiinseks kasutamiseks 
soovitatud vaatluste ja katsemenetluste muudatusi. Juhisdokument 
on koostatud, et hõlbustada muude, teatavates olukordades kasutata ­
vate katsemenetluste valikut.
 
Käesoleva meetodi abil ei hinnata arenguga seotud neurotoksilisust.  
1.1 SISSEJUHATUS  
Kemikaalide toksiliste omaduste hindamisel on oluline arvesse võtta 
võimalikke neurotoksilisi mõjusid. Juba korduvate annustega süsteemset toksilisust uuriv katsemeetod hõlmab vaatlusi, mis skrii ­
nivad võimalikku neurotoksilisust. Käesolevat katsemeetodit võib 
kasutada sellise uuringu väljatöötamiseks, mille abil saadakse lisa ­
teavet või kinnitust täheldatud neurotoksiliste mõjude kohta korduva annusega süsteemse toksilisuse uuringutes. Kemikaalide teatavate klasside võimaliku neurotoksilisuse arvessevõtmine võib viidata 
sellele, et neid võib sobivamalt hinnata, kasutades meetodid ilma 
eelnevalt korduva annusega neurotoksilisuse uuringutest saadud võimalike neurotoksilisuse märkideta. Selliste kaalutluste hulka kuuluvad nt:
 
— neuroloogiliste märkide või neuropatoloogiliste kahjustuste jälgi ­
mine muudes toksilisuse uuringutes kui korduva annusega süsteemse toksilisuse uuringud või
 
— struktuuriline samalaadsus või muu teave, mis seob kemikaalid 
tuntud neurotoksiliste ainetega.  
Lisaks sellele võib olla muid näiteid, kui käesoleva katsemeetodi 
kasutamine on vajalik, vt täiendavad üksikasjad viites (1).  
Käesolev meetod on välja töötatud selliselt, et seda saab kohandada 
vastavalt erilistele vajadustele, mis kinnitavad kemikaalide teatavat 
histopatoloogilist ja käitumusega seotud neurotoksilisust ning iseloo ­
mustavad ja kvantifitseerivad neurotoksilisi reaktsioone.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Varem võrdsustati neurotoksilisust neuropaatiaga, millega kaasnevad 
neuropatoloogilised kahjustused või neuroloogilised väärtalitlused 
nagu atakk, halvatus või värin. Kuigi neuropaatia on neurotoksilisuse tähtis ilming, on nüüd selge, et on palju muid närvisüsteemi mürgis ­
tusnähte (nt motoorse koordinatsiooni kadumine, sensoorsed puudu ­
jäägid, õppimis- ja mäluhäired), mida ei pruugita kajastada neuro ­
paatias või muud liiki uuringutes.
 
Käesolev neurotoksilisust uuriv katsemeetod on välja töötatud närvi ­
käitumis- ja neuropatoloogiliste häirete tuvastamiseks täiskasvanud närilistel. Kuigi käitumishäired, isegi juhul, kui morfoloogilised 
muutused puuduvad, võivad peegeldada negatiivset mõju organis ­
mile, ei ole mitte kõik käitumismuutused närvisüsteemile omased. Seetõttu tuleks täheldatud muutusi hinnata koostoimes nii korrelatiiv ­
sete histopatoloogiliste, hematoloogiliste või biokeemiliste andme ­
tega kui ka muud süsteemse toksilisuse liiki käsitlevate andmetega. 
Käesoleva meetodiga ettenähtud neurotoksiliste reaktsioonide iseloo ­
mustamiseks ja kvantifitseerimiseks tehtav uurimine hõlmab histopa ­
toloogilisi ja käitumisega seotud menetlusi, mida võivad toetada 
elektrofüsioloogilised ja/või biokeemilised uuringud (1, 2, 3, 4).
 
Neurotoksilised ained võivad toimida närvisüsteemi mitmetele 
osadele ja paljude mehhanismide kaudu. Kuna ükski katsesari ei ole võimeline põhjalikult hindama kõikide ainete neurotoksilist võimet, võib osutuda vajalikuks kasutada muid  in vivo  või in vitro  
katseid, mis on omased täheldatud või ootuspärase neurotoksilisuse 
liigile.
 
Käesolevat katsemeetodit võib samuti kasutada koostoimes OECD 
neurotoksilisuse uurimise strateegiat ja meetodeid käsitlevas juhisdo ­
kumendis (1) sätestatud juhistega, et töötada välja uuringud, mis on 
ette nähtud täiendavaks kirjeldamiseks või annus-reaktsiooni kvanti ­
fikatsiooni tundlikkuse suurendamiseks, et paremini hinnata tähelda ­
mata negatiivse mõju määra või kinnitaksid kemikaali teadaolevaid või kahtlustatavaid ohte. Näiteks võib välja töötada uuringud, 
millega neurotoksilisi mehhanisme identifitseeritakse ja hinnatakse 
või täiendatakse andmeid, mis on saadud juba põhiliste närvi- käitumis- ja neuropatoloogiliste vaatlusprotseduuride kasutamisel. Sellistes uuringutes ei ole vaja hankida andmeid, mis on saadud 
juba käesoleva meetodi poolt soovitatud standardmenetluste kasuta ­
misel, kui sellised andmed on juba olemas ja neid ei peeta vajalikuks uuringu tulemuste tõlgendamisel.
 
Käesolev neurotoksilisuse uuring, kas eraldi või millegagi koos kasu ­
tades, annab sellist teavet, mida saab:  
— kindlaks teha, kas närvisüsteem on alaliselt või pöörduvalt 
uuritud kemikaali tõttu kahjustatud;  
— aidata kaasa selliste närvisüsteemi muutuste iseloomustamisele, 
mis on seotud kemikaalidega kokkupuutega ja aluseks oleva 
mehhanismi mõistmisele;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— kindlaks määrata annuse ja selle reaktsiooni ning aja ja reakt ­
siooni suhted, et hinnata täheldamata negatiivse mõju määra 
(mida saab kasutada kemikaalide ohutuskriteeriumide loomisel).  
Käesolevas katsemeetodis manustatakse katseainet suu kaudu. Võib 
kasutada ka muid manustamisteid (nt naha kaudu või sisse hingates), kuid see võib eeldada soovitatud protseduuride muutmist. Manusta ­
mistee valiku kaalutlused sõltuvad inimeste kokkupuute profiilist ja 
olemasolevast toksikoloogilisest või kineetilisest teabest.
 
1.2. MÕISTED  
Kahjulik mõju  – selline töötlemisega seotud muutus algtasemest, 
mis vähendab organismi võimet ellu jääda, sigida või kohaneda 
keskkonnaga.  
Annus  – manustatava katseaine kogus. Annust väljendatakse 
massina (g, mg) või katseaine massina katselooma massiühiku kohta (nt mg kg kohta) või konstantsete toidukontsentratsioonidega (ppm).
 
Annustamine  – üldmõiste, mis hõlmab annust, annustamise sagedust 
ja kestust.  
Neurotoksilisus  – negatiivne muutus närvisüsteemi struktuuris ja 
funktsioonis, mis tuleneb kemikaali, bioloogilise või füüsilise mõju ­
ritega kokkupuutest.  
Neurotoksiline aine  – kemikaal, bioloogiline või füüsiline mõjur, 
mis võib põhjustada neurotoksilisust.  
NOAEL  – lühend täheldamata-kahjuliku-mõju määra kohta ja see on 
kõrgeim annusmäär, kus ei ole täheldatud kahjulikke, katse tegemi ­
sega seotud leide.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Katsekemikaali manustatakse suu kaudu erinevat annustena laborinä ­
riliste mitmele rühmale. Korduvad annused on tavaliselt eeldatud, ning annustamisrežiim võib olla 28 päeva, subkrooniline 90 päeva või krooniline üks aasta või kauemgi. Käesolevas katsemeetodis 
sätestatud menetlusi võib samuti kasutada ägeda neurotoksilisuse 
uuringuks. Loomi uuritakse, et tuvastata või iseloomustada käitumise ja/või neuroloogilisi kõrvalekaldeid. Igal vaatlusperioodil hinnatakse neurotoksiliste ainete mõjutatud hulka kattumisi. Katse lõpus osale 
loomadest (igas katserühmast, mõlemast soost) tehakse  in situ  perfu­
sioon ning ajust, seljaajust ja perifeersetest närvidest prepareeritakse lõiked ja neid uuritakse.
 
Kui uuring tehakse eraldi uuringuga neurotoksilisuse skriinimiseks 
või neurotoksiliste mõjude iseloomustamiseks, võib kasutada igast 
rühmast loomi, keda ei kasutatud perfusioonil ja hiljem histopatoloo ­
gilisel uuringul (vt tabel 1), teatavate närvi-käitumis-, neuropatoloo ­
gilistel, neurokeemilistel või elektrofüsioloogilistel protseduuridel käesoleva meetodi (1) poolt nõutavatest standarduuringutest saadud 
andmete täiendamiseks. Need täiendavad protseduurid võivad olla 
eriti kasulikud, kui empiirilised vaatlused või oodatavad mõjud viitavad kemikaali neurotoksilisuse teatavale liigile või sihtmärgile. Alternatiivselt võib kasutada allesjäänud loomi sellistel hindamistel, 
mis on ette nähtud närilistega tehtavate korduva annusega toksilisuse 
uuringute katsemeetodites.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Kui käesoleva katsemeetodi protseduure kombineeritakse muude 
katsemeetodite protseduuridega, on vaja piisavalt loomi mõlemate 
uuringute vaatluste nõuete rahuldamiseks.  
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Loomaliikide valik  
Eelistatud näriliste liik on rotid, kuigi võib põhjenduse korral kasu ­
tada ka näriliste teisi liike. Rakendatakse noorte täiskasvanute ja tervete loomade enimkasutatavaid laboritüvesid. Emasloomad ei tohi olla poeginud ega tiined. Annustamist tuleks alustada tavaliselt 
nii kiiresti kui võimalik pärast võõrutamist, soovitavalt mitte enne, 
kui loomad on kuuenädalased, ja igal juhul enne, kui loomad on üheksanädalased. Kui käesolevat uuringut siiski kombineeritakse muude uuringutega, on vaja kohandada vanusenõuet. Uuringut alus ­
tades peaks loomade massi muutus olema minimaalne ja ei tohiks 
ületada ± 20 % iga soo keskmisest massist. Kui tehakse korduva annusega lühiajaline uuring pikaajalise uuringu alguuringuna, tuleks kasutada mõlemas uuringus samast liinist ja sama päritolu loomi.
 
1.4.2.  Loomade pidamise ja toitmise tingimused  
Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22  o C (± 3  o C). Kuigi 
suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitavalt ei ületa 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal, siis eesmärgiks on seda 
hoida vahemikus 50–60 %. Valgustus peaks olema kunstlik, järjestus 
on selline – 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Valju katkendlikku heli tuleks vältida. Toitmisel võib kasutada tavapärast labori toidu ­
valikut koos piiramatu hulga joogiveega. Toiduvalikut võib mõjutada 
vajadus tagada katseaine sobiv lisamine, kui katseainet manustatakse 
käesoleva meetodi abil. Loomi võib hoida eraldi või väikestes samast soost loomade rühmades.
 
1.4.3.  Loomade ettevalmistamine  
Terved noored loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja 
katserühma. Puurid asetatakse nii, et puuri asetamisest tingitud mõjud on võimalikult väikesed. Loomad identifitseeritakse indivi ­
duaalselt ja hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne uuri ­
muse alustamist, et võimaldada laboritingimustega kohanemist.
 
1.4.4.  Manustamisviis ja annuste ettevalmistamine  
Käesolevas katsemeetodis manustatakse katseainet suu kaudu. Suu 
kaudu saab manustada sondi abil, toiduga, joogiveega või kapslitena. 
Võib kasutada ka muid manustamisviise (nt naha kaudu või sisse 
hingates), kuid see võib eeldada soovitatud protseduuride muutmist. Manustamisviisi valiku kaalutlused sõltuvad inimeste kokkupuute omadustest ja olemasolevast toksikoloogilisest või kineetilisest 
teabest. Tuleks ära märkida põhjendus manustamisviisi valimiseks 
ning käesoleva meetodi protseduuride muudatuste tegemiseks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Vajadusel lahustatakse või suspendeeritakse katseaine sobivas 
kandeaines. On soovitav, et võimaluse korral kaalutakse esmalt 
vesilahuse/-suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/-emulsiooni (nt maisiõli) kasutamist ja siis võimalikku muude kandealuste lahust/suspensiooni. Kandeaine toksilised omadused peaksid olema 
teada. Lisaks sellele tuleks arvesse võtta järgmisi kandeaine omadusi: 
katseaine absorbtsiooni, jaotamist, metabolismi või peetumist käsit ­
levad mõjud; katseaine keemilisi omadusi käsitlevad mõjud, mis võivad muuta toksilisi omadusi; ning loomade toidu- või veetarbi ­
mist või toitumust käsitlevad mõjud.
 
1.5. PROTSEDUURID  
1.5.1.  Loomade arv ja sugu  
Kui uuring tehakse eraldi uuringuga, tuleks kasutada vähemalt 20 
looma (10 emaslooma ja 10 isaslooma) igas annus- ja kontrollrühmas üksikasjalike kliiiniliste ja funktsionaalsete vaatluste hindamiseks. Vähemalt viiele isasloomale ja viiele emasloomale, kes on valitud 
nimetatud 10 isaslooma ja 10 emaslooma hulgast, teha perfusioon in 
situ ja kasutada neid üksikasjalikus neurohistopatoloogilises uuringus katse lõpus. Juhul, kui vaadeldakse üksnes piiratud arvu antud annusrühmas olevaid loomi neurotoksiliste mõjude tunnuste osas, 
tuleks arvesse võtta nimetatud loomade lisamist nende hulka, kes 
valitakse perfusiooniks. Kui uuring tehakse koos korduva annusega toksilisuse uuringuga, tuleks kasutada piisavalt loomi mõlema uuringu eesmärkide täitmiseks. Loomade minimaalne arv iga 
rühma kohta erinevate uuringute kombinatsioonides on toodud 
tabelis 1. Kui osa loomades surmatakse uuringu kestel või suuna ­
takse toibuvatest loomadest koosnevasse rühma toksiliste mõjude pöörduvuse, püsivuse või hilisema esinemise vaatlemiseks katse 
järel või kui kaalutakse täiendavaid vaatlusi, siis tuleks suurendada 
loomade arvu, tagamaks, et vaatluseks ja histopatoloogilisteks uurin ­
guteks oleks kättesaadav nõutav arv loomi.
 
1.5.2.  Katse- ja kontrollrühm  
Tuleks kasutada vähemalt kolme katse- ja kontrollrühma, kuid kui 
muude andmete hindamisel ei eeldata ühtegi mõju korduva annusega 
1 000 mg kg kehamassi kohta päevas, võib teha piirkatse. Kui 
puuduvad sobivad andmed, tuleks teha annuse piirkonna määramise katse, et aidata kindlaks määrata kasutatavaid annuseid. Kontroll ­
rühma loomi käsitletakse sarnaselt katserühma loomadega, kuid 
neile ei anta uuritavat ainet. Kui kandeainet kasutatakse katseaine 
manustamisel, peaks kontrollrühm saama kandeainet suurima kasu ­
tatud kogusena.
 
1.5.3.  Usaldusväärsuse kontroll  
Uuringut teostav labor peaks esitama andmed oma võime kohta 
teostada uuringut ja kasutatud protseduuride tundlikkuse kohta. Sellised andmed peaksid tõendama võimet tuvastada ja kvantifitsee ­
rida muutusi lõpp-punktides, mille vaatlemist soovitatakse. Nendeks 
on autonoomsed sümptomid, sensoorne reaktiivsus, jäseme haarde ­
jõud ja motoorne aktiivsus. Teave kemikaalide kohta, mis põhjus ­
tavad erinevat liiki neurotoksilisi reaktsioone ja mida võib kasutada 
positiivsete kontrollainetena, võib leida viidetes 2–9. Varasemaid 
andmeid võib kasutada, kui katsemenetluste olulised aspektid jäävad samaks. Varasemate andmete perioodiline ajakohastamine on soovitav. Protseduuride jätkuvat tundlikkust tõendavad uued andmed 
tuleks luua, kui katset sooritav labor on muutnud katse tegemise 
mõningaid olulisi osasid või menetlusi.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4.  Annuse valik  
Annusemäärade valimisel tuleks võtta arvesse kõiki katseühendi või 
sellega seotud ainete saadaolevaid varem saadud toksilisuse ja kinee ­
tilisi andmeid. Kõrgeim annusemäär tuleks valida eesmärgiga põhjus ­
tada neurotoksilisi mõjusid või selgeid süsteemseid toksilisi mõjusid. 
Tuleks valida annusmäärade alanev järjestus, eesmärgiga näidata annusega seotud reaktsiooni ja mittetäheldatud kahjulikku mõju (NOAEL) väikseima annusemäära puhul. Põhimõtteliselt tuleks 
annusemäärad kehtestada nii, et saaks eristada algseid toksilisi 
mõjusid närvisüsteemile süsteemse toksilisusega seotud mõjudest. Kahe- või kolmekordsed vahemikud on sageli optimaalsed ning 
sageli on eelistatud neljanda katserühma lisamine väga suurte vahe ­
mike (nt üle kümnekordne tegur) annuste vahel. Kui inimese vastu ­
võtlikkuse kohta on olemas mõistlik hinnang, tuleks seda arvesse võtta.
 
1.5.5.  Piirkatse  
Kui katse ühe annusega, milleks on vähemalt 1 000 mg kg keha ­
massi kohta, kasutades kirjeldatud protseduure, ei põhjusta tähelda ­
tavaid neurotoksilisi mõjusid ja kui toksilisus ootuspäraselt põhineb 
struktuurselt lähedaste ainete andmetel, siis ei peeta kolme annuse taset käsitlevat täielikku uuringut vajalikuks. Inimeste ootuspärane kokkupuude võib viidata piirkatses kasutavatest suukaudsetest annus ­
test suuremate annuste kasutamise vajadusele. Muude manustamis ­
viiside korral, nagu näiteks sissehingamine või naha kaudu manus ­
tamine, võivad katseaine füüsikalis-keemilised omadused tihti viidata suurimale kokkupuutetasemele. Ägeda suukaudse uuringu tegemi ­
seks peaks piirkatse annus olema vähemalt 2 000 mg/kg.
 
1.5.6.  Annuste manustamine  
Loomadele annustatakse katseainet kord päevas, seitse päeva 
nädalas, vähemalt 28 päeva; viiepäevase annustamisrežiimi või lühema kokkupuute perioodi kasutamist on vaja põhjendada. Katseainet manustatakse ühekordse annusena sondi abil söögitoru 
kaudu või sobiva intubeerimise kanüüli abil. Vedeliku suurim 
kogus, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suuru ­
sest. Kogus ei tohiks ületada 1 ml/100 g kehamassi kohta. Vesila ­
huste puhul võib siiski manustada 2 ml/100 g kehamassi kohta. 
Arvesse võtmata ärritavaid või söövitavaid aineid, mille mõjud tava ­
liselt halvenevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähen ­
dada katsekoguse varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide annuste korral jääks samaks.
 
Toidu või joogivee kaudu manustatud ainete puhul on oluline tagada, 
et hõlmatud katseaine kogused ei häiriks tavapärast toitumist või 
veetasakaalu. Kui katseainet manustatakse toiduga kas püsiva toidu ­
kontsentratsioonina (ppm) või võidakse kasutada püsivat annuse ­
määra looma kehamassi suhtes, siis tuleb täpsustada kasutatud alter ­
natiivi. Sondi kaudu manustatud aine puhul tuleks annus anda samal 
kellaajal iga päev ja kohandada vähemalt igal nädalal, et säilitada 
konstantne annusemäär looma kehamassi suhtes. Kui korduva annu ­
sega uuringut tehakse pikaajalise uuringu alguuringuga, tuleks kasu ­
tada mõlemas uuringus sama toitu. Erandkorras, kui ühekordne 
annus ei ole võimalik, manustatakse annust väiksemates osades 
kuni 24 tunni jooksul.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6. VAATLUSED  
1.6.1.  Vaatluste ja katsete sagedus  
Korduva annusega uuringutes peaks vaatlusperiood hõlmama annus ­
tamisperioodi. Akuutsetes uuringutes tehakse vaatlusi katse järel 14 
päeva. Satelliitrühma kuuluvate loomade puhul, keda hoitakse 
kokkupuutumise eest katsejärgsel perioodil, peaks vaatlused hõlmama sama perioodi.
 
Vaatlusi tuleks teha piisavalt sageli, et suurendada mis tahes käitu ­
misega seotud ja/või neuroloogiliste kõrvalekallete tuvastamise 
tõenäosust. Vaatlusi peaks tegema soovitavalt sama ajal iga päev, 
võttes arvesse oodatavate mõjude kõrghetke pärast annustamist. Klii ­
niliste vaatluste ja funktsionaalsete katsete sagedus on esitatud 
kokkuvõtlikult tabelis 2. Kui varasematest uuringutest saadud kinee ­
tilised või muud andmed viitavad vajadusele kasutada erinevaid vaatlus-, katse- või vaatlusjärgseid aja hetki, tuleks vastu võtta alter ­
natiivne ajakava maksimaalse teabe saamiseks. Ajakava muudatuste 
kohta tuleks esitada põhjendus.
 
1.6.1.1.  Üldise tervisliku seisundi ja suremuse/haigestumuse vaatlused  
Kõiki loomi tuleks hoolikalt vaadelda vähemal kord päevas nende 
tervisliku seisundit arvesse võttes ning vähemalt kaks korda päevas haigestumuse ja suremuse osas.
 
1.6.1.2.  Üksikasjalikud kliinilised vaatlused  
Üksikasjalikud kliinilised vaatlused tuleks teha kõikide loomade 
kohta, kes on valitud sel eesmärgil (vt tabel 1), üks kord enne 
esimest kokkupuudet (et võimaldada sama katselooma käsitlevaid 
võrdlusi) ja seejärel erinevate ajavahemike tagant, sõltuvalt uuringu kestusest (vt tabel 2). Üksikasjalikud kliinilised vaatlused toibuvate loomade satelliitrühmade kohta tuleks teha toibumisperioodi lõpus. 
Üksikasjalikud kliinilised vaatlused tuleks teha looma oma puurist 
väljaspool standardalal. Neid peaks hoolikalt registreerima, kasutades punktisüsteeme, mis hõlmavad kriteeriume või punktiskaalasid iga vaatluse käigus tehtava mõõtmise kohta. Kasutatavad kriteeriumid 
või skaalad tuleks selgesõnaliselt määratleda katselabori poolt. 
Tuleb püüda tagada, et muutused katsetingimustes oleksid mini ­
maalsed (mitte süsteemselt seotud katsega) ning et vaatlusi teeks koolitatud vaatlejad, kes ei ole teadlikud tegelikust käsitlemisest.
 
On soovitav, et vaatlusi tehtaks struktuurselt, et täpselt määratletud 
kriteeriume (kaasa arvatud määratlus „normaalne vahemik”) kohal ­
datakse süsteemselt iga looma suhtes igal vaatlusel. Normaalne vahemik tuleks adekvaatselt dokumenteerida. Kõik täheldatud sümp ­
tomid tuleks registreerida. Kui see on teostatav, tuleks registreerida 
ka täheldatud sümptomite suurus. Kliinilised vaatlused peaksid 
hõlmama, kuid mitte ainult, naha, karvkatte, silmade, limaskestade, eritiste esinemise ja autonoomse aktiivsuse (nt pisaravool, piloerekt ­
sioon, pupilli suurus, ebatavaline hingamismudel ja/või suu kaudu 
hingamine (lõõtsutamine), kõik urineerimise või roojamisega seotud 
ebatavalised sümptomid ning uriini värvumine) muutusi.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Kõik ebatavalised reaktsioonid seoses kehaasendi, aktiivsuse astme 
(nt standardala vähenenud või suurenenud uurimine) ning liigutuste 
koordinatsiooniga tuleks samuti üles märkida. Muutused kõnnakus (nt taarumine, ataksia), kehaasendis (nt küürus selg) ning käsitlemise, asetamise või muude keskkonnaga stiimulitega seotud reaktiivsuses 
ning klooniliste või tooniliste liigutuste, krampide või värinate esine ­
mine, stereotüübid (nt ülemäärane sugemine, ebatavalised pea liigu ­
tused, korduv tiirutamine) või veider käitumine (nt hammustamine või ülemäärane lakkumine, enesesandistamine, tagurpidi kõndimine, 
häälitsemine) või agressiivsus tuleks registreerida.
 
1.6.1.3.  Funktsionaalsed katsed  
Sarnaselt üksikasjalikele kliinilistele vaatlustele, tuleks funktsio ­
naalsed katsed samuti teostada üks kord enne kokkupuudet ja 
seejärel sageli kõiki loomadega, kes on sel eesmärgil välja valitud 
(vt tabel 1). Funktsionaalsete katsete tegemise sagedus on samuti sõltuv uuringu kestuses (vt tabel 2). Lisaks tabelis 2 sätestatud vaat ­
lusperioodidele tuleks funktsionaalsed vaatlused toibuvate loomade 
satelliitrühmade suhtes samuti teha võimalikult lähedal lõplikule 
surmamisele. Funktsionaalsetes katsetes peaks käsitlema sensoorset reaktiivsust erinevatele stiimulitele (nt kuulmis-, nägemis- ja propriotseptoorsed stiimulid (5, 6, 7)), jäseme haardejõu hindamine 
(8) ja motoorse tegevuse hindamine (9). Motoorset tegevust tuleks 
mõõta automaatseadme abil, mis on võimeline avastama nii tegevuse vähenemise kui suurenemise. Kui kasutatakse muud kindlaksmää ­
ratud süsteemi, peaks see olema kvantitatiivne ning selle tundlikkus 
ja usaldusväärsus peaksid olema tõendatud. Iga seadet tuleb testida 
selle usaldusväärsuse tagamiseks aja jooksul ja seadmete vastavuse tagamiseks. Järgitavate protseduuride täiendavad üksikasjad on toodud vastavates viidetes. Kui puuduvad andmed (nt struktuurak ­
tiivsus, epidemioloogilised andmed, muud toksikoloogilised 
uuringud), mis viitaksid võimalikele neurotoksiliste mõjudele, tuleks kaaluda sensoorseid ja motoorseid funktsioone või õppimist ja mälu uurivate täpsemate katsete lisamist nimetatud võimalike mõjude uuri ­
miseks üksikasjalikumalt. Viites 1 on esitatud rohkem teavet täpse ­
mate katsete ja nende kasutamise kohta.
 
Erandkorras, loomad, kel ilmnevad mürgistusnähud sellises ulatuses, 
et see oluliselt häiriks funktsionaalse katse sooritamist, võib katsest 
välja jätta. Tuleks esitada loomade funktsionaalsest katsest väljajät ­
mise põhjendus.  
1.6.2.  Kehamass ja toidu/vee tarbimine  
Kuni 90päevaste uuringute puhul tuleks loomi kaaluda vähemalt 
kord nädalas ja mõõtmisi tuleks teha toidu tarbimise kohta (vee 
tarbimine, kui katseainet manustatakse nimetatud keskkonnas) vähe ­
malt kord nädalas. Pikaajaliste uuringute puhul tuleks kaaluda kõiki loomi vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala jooksul ja seejärel 
vähemalt kord iga 4 nädala tagant. Mõõtmisi toidu tarbimise kohta 
(vee tarbimine, kui katseainet manustatakse nimetatud keskkonnas) tuleks teha vähemalt kord nädalas esimese 13 nädala jooksul ja seejärel ligikaudu kolmekuuliste intervallide tagant, välja arvatud 
juhul, kui tervislik seisundi või kehamassi muutumine näeb ette 
teisiti.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3.  Oftalmoloogia  
Pikemate kui 28päevaste uuringute puhul tuleks teha oftalmoloogi ­
line uuring, kasutades oftalmoskoopi või samalaadset sobivat instru ­
menti, enne katseaine manustamist ja katse lõpetamisel, eelistatavalt 
kõikide loomadega, kuid vähemalt loomadega, kes on suure annuse ­
määraga või kontrollrühmades. Kui avastatakse muutused silmades või kui kliinilised tunnused viitavad selle vajadusele, tuleks uurida kõiki loomi. Pikaajaliste uuringute puhul tuleks teha oftalmoloogiline 
uuring 13 nädala jooksul. Oftalmoloogilisi uuringuid ei ole vaja teha, 
kui selle kohta on juba olemas andmed, mis on saadud muudest, sarnase kestusega ja samalaadse annusemääraga uuringutest.
 
1.6.4.  Hematoloogia ja kliiniline biokeemia  
Kui neurotoksilisuse uuring tehakse koos korduva annusega 
süsteemse toksilisuse uuringuga, tuleks teha hematoloogilised uuringud ja kliinilise biokeemia määramised vastavalt süsteemse toksilisuse uuringu asjaomasele meetodile. Proove tuleks koguda 
selliselt, et vähendatakse kõiki võimalikke mõjusid neuroloogilisele 
käitumisele.
 
1.6.5.  Histopatoloogia  
Neuropatoloogiline uuring tuleks välja töötada uuringu in  vivo  etapis 
tehtud vaatluste täiendamiseks ja laiendamiseks. Proovid vähemalt 
viie looma kudedest soo ja rühma kohta (vt tabel 1 ja järgmine lõige) fikseeritakse in situ, kasutades üldtunnustatud perfusiooni- ja fiksatsioonitehnikat (vt 3. viite 5. peatükk ja 4. viite 50. peatükk). 
Kõik täheldatavad suured muutused tuleks registreerida. Kui uuringut 
teostatakse eraldi uuringuga neurotoksilisuse skriinimiseks või neuro ­
toksiliste mõjude iseloomustamiseks, võib kasutada ülejäänud loomi kas teatavate neuroloogilise käitumisega seotud (10, 11), neuropato ­
loogilistes (10, 11, 12, 13), neurokeemilistes (10, 11, 14, 15) või 
elektrofüsioloogilistes (10, 11, 16 17) protseduurides, mis võivad täiendada siin kirjeldatud protseduure ja uuringuid, või kasutada histopatoloogias uuritavate subjektide arvu suurendamiseks. Need 
täiendavad protseduurid võivad olla eriti kasulikud, kui empiirilised 
vaatlused või oodatavad mõjud viitavad kemikaali neurotoksilisuse (2, 3) teatavale liigile või sihtmärgile. Alternatiivselt võib ülejäänud loomi samuti kasutada rutiinsetes patoloogilistes hindamistes, nagu 
on kirjeldatud korduvate annustega uuringute meetodis.
 
Kõik parafiini valatud koeproovid värvitakse üldise värvimisprotse ­
duuri abil, nt hematoksüliin ja eosiin (H&E), ning neid uuritakse mikroskoopiliselt. Kui täheldatakse või kahtlustatakse perifeerse 
neuropaatia sümptomeid, tuleks uurida plastikusse valatud perifeerse 
närvikoe proove. Kliinilised tunnused võivad anda põhjust uute kohtade uurimisele või eriliste värvimismenetluste kasutamisele. Viidetes (3) ja (4) on antud juhised täiendavate uuringukohtade 
kohta. Samuti võivad sobivad erivärvid olla abiks teatud liiki pato ­
loogilistele muutustele viitamisel (18).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Kesk- ja perifeerse närvisüsteemi representatiivsed lõike tuleks 
uurida histoloogiliselt (vt 3. viite 5. peatükk ja 4. viite 50. peatükk). 
Uuritavad alad peaksid tavaliselt sisaldama järgmist: eesaju, suuraju keskosa, sh hipokampi läbiv lõige, keskaju, väikeaju, ajusild, pikli ­
kaju, silm koos nägemisnärviga ja võrkkestaga, seljaaju kaela- ja 
nimmetüve kohal, spinaalganglion, spinaal- ja ventraalnärvikiud, 
proksimaalne istmikunärv, proksimaalne säärenärv (põlves) ja sääre ­
närvipoolsed sääremarjalihase harud. Seljaajust ja perifeersest närvist tehtavate lõigete hulka kuuluvad nii rist- kui pikilõiked. Tähelepanu 
tuleks pöörata närvisüsteemi veresoonestikule. Samuti tuleks uurida 
skeletilihasest, eelkõige sääremarjalihasest võetud proovi. Erilist tähelepanu tuleks pöörata kesk- ja perifeerse närvisüsteemi kohta ­
dele, mille raku- ja kiustruktuur ja -tüüp on teatavasti eriti mõjutatud 
neurotoksiliste ainete poolt.
 
Viidetes 3 ja 4 on toodud selliseid neuropatoloogilisi muutusi 
käsitlev juhend, mida põhjustab kokkupuude toksiliste ainetega. Etapiviisiline koeproovide uuring on soovitav, milles võrreldakse esmalt suure annusega rühma lõikeid kontrollrühma lõigetega. Kui 
ei ole täheldatud neuropatoloogilisi muutusi nimetatud rühmade 
proovides, ei ole vaja teha hilisemaid analüüse. Kui neuropatoloogi ­
lisi muutusi on täheldatud suure annusega rühmas, tuleks seejärel keskmiste ja väikese annusega rühma igast võimalikust mõjutatud 
koest võetud proovid kodeerida ja hiljem neid uurida.
 
Kui leitakse tõendeid neuropatoloogiliste muutuste kohta kvalita ­
tiivses uuringus, siis tuleks teha teine uuring kõikides närvisüsteemi piirkondades, kus nimetatud muutused esinevad. Kõikide annuserüh ­
made igast võimalikust mõjutatud piirkonnast võetud lõiked tuleks 
kodeerida ja neid tuleks uurida juhuslikult ilma koodi teadmata. Iga kahjustuse sagedus ja raskusaste tuleks registreerida. Pärast seda, kui kõikide annuserühmade kõiki piirkondi on hinnatud, saab koodi 
murda ja teha statistilise analüüsi annuse ja sellele reageerimise 
suhte hindamiseks. Erineva raskusastmega kahjustuse näiteid tuleks kirjeldada.
 
Neuropatoloogilisi leide tuleks hinnata käitumisega seotud vaatluste 
ja mõõtmiste kontekstis ning katseaine varasematest ja praegustest 
süsteemse toksilisuse uuringutest saadud muude andmete põhjal.  
2. TULEMUSED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Tulemused esitatakse iga üksiku looma kohta. Lisaks sellele tuleks 
esitada kõik andmed kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katse- 
või kontrollrühma puhul ära loomade arvu katse alguses, katse 
käigus surnud või humaanselt surmatud loomade arvu ning kõikide surmade või humaansete tapmiste aja, mürgistusnähtude arvu, tähel ­
datud mürgistusnähtude kirjelduse, sh toksiliste mõjude algusaja, 
kestuse, liigi ja raskuse, kahjustustega loomade arvu, sh kahjustus(t)e 
liik ja raskus.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Uuringu avastusi peaks hindama neuroloogiliste käitumisega seotud 
ja neuropatoloogiliste mõjude (neurokeemilised või eletkrofüsioloo ­
gilised mõjud ning kui lisatakse täiendavad uuringud) esinemissage ­
duse, raskuse ja korrelatsiooni osas ning kõikide muude negatiivsete 
mõjude osas. Võimaluse korral tuleks hinnata numbrilisi tulemuse sobiva ja üldiselt heakskiidetud statistilise meetodi abil Statistilised meetodid tuleks valida uuringu väljatöötamise ajal.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Katseaine:  
— füüsiline laad (sh isomeersus, puhtus ja füüsikalis-keemilised 
omadused);  
— tunnusandmed.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valiku põhjendamine.  
Katseloomad:  
— kasutatud liigid/liinid;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, kohanemine, toitumine jne;  
— iga looma kaal katse alguses.  
Katsetingimused:  
— katseaine valmistise/toiduvalmistise üksikandmed, saavutatud 
kontsentratsioon, valmistise stabiilsus ja homogeensus;  
— manustatavate annuste täpsustamine, sh kandeaine, mahu ja 
manustatava aine füüsilise vormi üksikasjad;  
— katseaine manustamise üksikasjad;  
— annusemäärade valiku põhjendus;  
— põhjendus kokkupuute viise ja kestuse kohta;  
— toidu/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni 
(ppm) muutmine tegelikuks annuseks (mg/kg kehamassi kohta 
päevas), vajaduse korral;  
— üksikasjad toidu ja vee kvaliteedi kohta.  
Vaatlus ja katsemenetlused:  
— üksikasjad igast rühmast loomade määramise kohta perfusiooni 
alamrühmadesse;  
— punktisüsteeme käsitlevad üksikasjad, sh üksikasjalike kliiniliste 
vaatluste iga mõõtmise kriteeriumid ja punktiskaalad;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— üksikasjad funktsionaalsete katsete kohta, milles uuritakse 
sensoorset reaktiivsust erinevatele stiimulitele (nt kuulmis-, 
nägemis- ja propriotseptoorsed stiimulid); hinnatakse jäseme haardejõudu; hinnatakse motoorset tegevust (sh üksikasjad auto ­
maatseadmete kohta, mis avastavad tegevust); ja, muude käsuta ­
tavate menetluste kohta;
 
— üksikasjad oftalmoloogiliste uuringute kohta ja vajadusel hema ­
toloogiliste uuringute ning kliinilise biokeemia katsete kohta ning 
asjaomase lähtetaseme väärtuste kohta;  
— üksikasjad teatavate neuroloogiliste käitumisega seotud, neuropa ­
toloogiliste, neurokeemiliste või elektrofüsioloogiliste menetluste 
kohta.  
Tulemused:  
— kehamass/kehamassi muutused, sh kehamass surmamise hetkel;  
— toidu ja vee tarbimine vajadusel;  
— toksilist reaktsiooni käsitlevad andmed ja annusemäär, sh toksi ­
lisuse või suremuse sümptomid;  
— üksikasjalike kliiniliste vaatluste (pöörduvad või pöördumatud) 
olemuse, raskuse ja kestuse kohta (algusaeg ja edasine käik);  
— funktsionaalsete katsete tulemuste üksikasjalik kirjeldus;  
— lahangu leiud;  
— vajadusel kõikide neuroloogiliste käitumisega seotud, neuropato ­
loogiliste ja neurokeemiliste või elektrofüsioloogiliste leidude 
üksikasjalik kirjeldus;  
— andmed absorbtsiooni ja metabolismi kohta (kui seda on 
mõõdetud)  
— vajadusel tulemuste statistiline töötlemine.  
Tulemuste arutelu:  
— teave annuse ja sellele reageerimise kohta;  
— muude toksiliste mõjude seos uuritud kemikaali võimaliku neuro ­
toksilisuse kohta tehtud järeldusega;  
— täheldamata negatiivse mõju tase.  
Järeldused:  
— uuritava kemikaali üldist neurotoksilisust käsitlevat erimärget 
soositakse.  
4. VIITED  
1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies 
and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.  
2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the 
Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to 
Chemicals.  
4) Spencer, PS. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, PS. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 
999–1003.  
6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indus ­
trial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704.  
7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observa ­
tional Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, 267–283.  
8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (19 
79). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- 
limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol.,  1, 
233–236.  
9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599–609.
 
10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (19 9 2). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel 
Dekker, New York.  
12) Broxup, B. (19 91). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689–695.  
13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343–352.
 
14) O'Callaghan, J.P. (19 8 8). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 
10, 445–452.  
15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther.,  
244, 368–378.
 
16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp. 299–335.
 
17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and 
Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726–742.  
18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabel 1  
Minimaalne loomade arv rühmas, kui neurotoksilisuse uuringut tehakse eraldi või koos muude uuringutega  
NEUROTOKSILISUSE UURING, MIS ON TEHTUD: 
eraldi uuringuna kombineeritud 
28päevase uuringuga kombineeritud 
90päevase uuringuga kombineeritud 
kroonilise toksilisuse 
uuringuga  
Loomade koguarv rühma 
kohta  10 isaslooma ja 10 
emaslooma 10 isaslooma ja 10 
emaslooma 15 isaslooma ja 15 
emaslooma 25 isaslooma ja 25 
emaslooma 
Funktsionaalsete katsete, sh 
üksikasjalike kliiniliste 
vaatluste jaoks välja valitud loomade arv 10 isaslooma ja 10 
emaslooma 10 isaslooma ja 10 
emaslooma 10 isaslooma ja 10 
emaslooma 10 isaslooma ja 10 
emaslooma 
Perfusiooniks  in situ  ja 
neurohistopatoloogiaks valitud loomade arv 5 isaslooma ja 5 
emaslooma 5 isaslooma ja 5 
emaslooma 5 isaslooma ja 5 
emaslooma 5 isaslooma ja 5 
emaslooma 
Loomade arv, kes on välja 
valitud korduva annusega/ ­
subkroonilise/kroonilise mürgisuse vaatlustes, hema ­
toloogias, kliinilises biokee ­
mias, histopatoloogias jne, 
nagu on märgitud vastavates juhendites 5 isaslooma ja 5 
emaslooma 10 isaslooma † ja 
10 emaslooma † 20 isaslooma † ja 20 
emaslooma † 
Vajadusel täiendavad vaat ­
lused 5 isaslooma ja 5 
emaslooma
 
† Siia rühma kuulub viis looma, kes on valitud funktsionaalseks katseks ja üksikasjalilkeks kliinilisteks vaatlusteks neurotoks ilisuse 
uuringu osana.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabel 2  
Kliiniliste vaatluste ja funktsionaalsete katsete sagedus  
Vaatluste liik Uuringu kestus 
Äge 28päevane 90päevane Krooniline  
Kõikidel loomadel üldine tervislik 
seisund kord päevas kord päevas kord päevas kord päevas 
suremus/haiges ­
tumus kaks korda 
päevas kaks korda 
päevas kaks korda 
päevas kaks korda päevas  
Funktsionaalseteks 
vaatlusteks valitud loomadel üksikasjalikud 
kliinilised vaat ­
lused  — enne esimest 
kokkupuudet 
— 8 tunni 
jooksul 
pärast 
annustamist ajal, mil mõju on 
hinnanguli ­
selt suurim 
— 7. ja 14. 
päeval pärast 
annustamist — enne esimest 
kokkupuudet 
— seejärel kord 
nädalas — enne esimest 
kokkupuudet 
— kord esimese 
ja teise 
kokkupuute ­
nädala jooksul 
— seejärel kord 
kuus — enne esimest 
kokkupuudet 
— kord esimese 
kokkupuu ­
tekuu lõpus 
— seejärel iga 
kolme kuu tagant 
Funktsionaalsed 
katsed — enne esimest 
kokkupuudet 
— 8 tunni 
jooksul 
pärast 
annustamist ajal, mil mõju on 
hinnanguli ­
selt suurim 
— 7. ja 14. 
päeval pärast 
annustamist — enne esimest 
kokkupuudet 
— neljandal 
annustamis ­
nädalal 
võimalikult lähedal kokkupuute ­
perioodi 
lõpule — enne esimest 
kokkupuudet 
— kord esimese 
ja teise 
kokkupuute ­
nädala jooksul 
— seejärel kord 
kuus — enne esimest 
kokkupuudet 
— kord esimese 
kokkupuu ­
tekuu lõpus 
— seejärel iga 
kolme kuu tagant
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  NAHAKAUDNE IMENDUMINE:  IN VIVO  MEETOD  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 427 (2004).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Paljude kemikaalidega puututakse kokku peamiselt naha kaudu, 
samas kui suurema osa toksikoloogiliste uuringute puhul manusta ­
takse uuritavaid aineid katseloomadele suu kaudu. Käesolevas 
juhendis kirjeldatud  in vivo  nahakaudse imendumise uuring annab 
vajaliku seose, millega suukaudse manustamise uuringutest saab teha oletusi aine ohutuse kohta naha kaudu kokkupuutumisel.
 
Aine peab enne vereringesse jõudmist läbima suure hulga naharak ­
kude kihte. Enamiku ainete puhul määrab sissetungimise kiiruse sarvkiht  (stratum corneum),  mis koosneb surnud rakkudest. Naha 
läbilaskvus sõltub kemikaali lipofiilsusest ja epidermise välimise 
kihi paksusest ning ka sellistest teguritest nagu aine molekulmass 
ja kontsentratsioon. Üldiselt on rottide ja küülikute nahk kergemini läbitav kui inimnahk, samas kui merisigade ja ahvide naha läbitavus 
sarnaneb inimnaha omale.
 
Nahakaudse imendumise mõõtmise meetodeid saab jagada kahte 
kategooriasse:  in vivo ja in vitro. In vivo  meetod võib anda usaldus ­
väärset teavet nahakaudse imendumise kohta eri liikide katseloo ­
madel. Viimasel ajal on välja töötatud  in vitro  meetodeid. Nende 
puhul uuritakse aine tungimist läbi looma või inimese osalise või täispaksusega naha vedelikureservuaari.  In vitro  meetodit on kirjel ­
datud eraldi teise katsemeetodi all (1). Soovitav on tutvuda OECD 
juhenddokumendiga nahakaudse imendumise uuringute läbiviimiseks (2); dokument aitab valida kõige sobivama meetodi igas konkreetses olukorras, kuna selles on esitatud rohkem üksikasju nii  in vivo  kui ka  
in vitro  meetodi sobivuse kohta.
 
Käesolevas metoodikas kirjeldatud  in vivo  meetod võimaldab 
määrata uuritava aine tungimist läbi naha süsteemsesse vereringesse. 
Kõnealust meetodit on laialdaselt kasutatud palju aastaid (3, 4, 5, 6 
ja 7). Kuigi paljudel juhtudel võivad sobida nahakaudse imendumise  
in vitro  uuringud, võib esineda ka olukordi, kus ainult  in vivo  
uuringuga on võimalik saada vajalikke andmeid.  
In vivo  meetodi eelis on füsioloogia ja metabolismi seisukohast täie ­
liku süsteemi kasutamine, ühe loomaliigi kasutamine paljude toksili ­
susuuringute läbiviimiseks ja võimalus meetodit modifitseerida teiste loomaliikidega kasutamiseks. Puudusteks on elusloomade kasuta ­
mine, vajadus kasutada usaldusväärsete tulemuste saamiseks radio ­
aktiivselt märgistatud materjali, raskused varase imendumise faasi 
kindlaksmääramisel ning eelistatava loomaliigi (rott) ja inimese naha läbilaskvuse erinevused. Loomade nahk laseb üldiselt aineid paremini läbi ja seetõttu võidakse imendumist läbi inimnaha üle 
hinnata (6, 8 ja 9). Leeliselisi/söövitavaid aineid ei tohiks elusloo ­
madel katsetada.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. MÄÄRATLUSED  
Imendumata kogus  – kogus, mis pestakse maha naha pinnalt pärast 
kokkupuudet ja mis leidub difusiooniraku peal asuval kattel, seal ­
hulgas kogus, mille kohta näidatakse, et see lendub nahalt kokku ­
puute ajal.  
Imendunud kogus  (in vivo)  – kogus, mis leitakse uriinis, puuri 
pesemise vedelikus, roojas, väljahingatud õhus (kui seda mõõde ­
takse), veres, kudedes (kui neid kogutakse) ja ülejäänud korjuses 
pärast pealekandmiskoha naha eemaldamist.  
Imenduv kogus  – kogus, mis jääb nahale või naha sisse pärast 
pesemist.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritav aine, eelistatavalt radioaktiivselt märgistatud, kantakse looma 
paljakspügatud nahale ühes või enamas sobivas annuses tavaliselt kasutatava preparaadi kujul. Uuritav valmistis jäetakse ettenähtud ajaks nahaga kokkupuutesse sobiva katte all (mis võib kokkupuute ­
kohta lihtsalt katta, pooltihedalt või tihedalt katta), et vältida uuritava 
valmistise allaneelamist. Kokkupuute lõppedes eemaldatakse kate ja nahk puhastatakse sobiva puhastusainega; kate ja puhastusmaterjal jäetakse analüüsimise jaoks alles ja pannakse uus kate. Loomi hoitakse 
enne kokkupuudet, selle ajal ja pärast seda metabolismi uurimise üksik ­
puurides ning nende perioodide väljaheited ja väljahingatud õhk kogu ­
takse analüüsimiseks. Väljahingatud õhu kogumise võib ära jätta, kui on piisavalt teavet selle kohta, et lenduvat radioaktiivset metaboliiti 
tekib vähe või üldse mitte. Iga uuringu jaoks võetakse tavaliselt mitu 
rühma loomi, kes viiakse kokkupuutesse uuritava valmistisega. Üks rühm surmatakse kokkupuuteperioodi lõpus. Teised rühmad surma ­
takse kindlaksmääratud ajavahemike järel pärast seda (2). Proovivõ ­
tuaja lõppedes surmatakse allesjäänud loomad, veri kogutakse analüü ­
simiseks, uuritava aine pealekandmise koht eemaldatakse analüüsimi ­
seks ja korjust analüüsitakse eritumata materjali määramiseks. Proove analüüsitakse sobivate meetoditega ning hinnatakse nahakaudse imen ­
dumise taset (6, 8 ja 9).
 
1.4. MEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Loomaliigi valimine  
Kõige sagedamini kasutatav loomaliik on rott, kuid kasutada võib ka 
karvavabasid liine ja liike, kellel nahakaudse imendumise kiirus 
sarnaneb enam inimese omale (viited 3, 6, 7, 8 ja 9). Kasutada 
tuleb noori terveid täiskasvanud loomi, kes on ühest soost (tavaliselt isased) ja kuuluvad tavaliselt kasutatavatesse laboriliinidesse. Uuringu alguses ei tohiks katselooma kehakaalu erinevus keskmisest 
kehakaalust ületada ± 20 %. Näiteks on sobivad 200–250 g kaaluvad 
isasrotid, eriti selle vahemiku ülemisse poolde kuuluvad loomad.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Loomade arv ja sugu  
Iga uuritava valmistise ja iga planeeritud lõpetamisaja kohta tuleb 
kasutada vähemalt nelja ühest soost looma. Iga loomade grupp surmatakse erinevate ajavahemike möödudes, näiteks kokkupuutepe ­
rioodi (tavaliselt 6 või 24 tundi) lõppedes ja sellele järgnevate ajava ­
hemike järel (nt 48 ja 72 tunni möödudes). Kui on andmeid, et nahakaudne toksilisus isas- ja emasloomade suhtes on oluliselt erinev, tuleb valida tundlikum sugu. Kui selliseid andmeid ei ole, 
võib kasutada ükskõik kumba sugu.
 
1.4.3.  Pidamis- ja söötmistingimused  
Temperatuur katseloomade ruumis peab olema 22  o C (± 3  o C). Kuigi 
suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema 50–60 %. 
Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pime ­
dust. Söötmiseks võib kasutada tavalist laborisööta ja see peab olema vabalt kättesaadav koos piiramatu joogivee varuga. Uuringu ajal ja eelistatavalt ka aklimatiseerumise ajal on loomad metabolismi uuri ­
mise üksikpuurides. Kuna sööda ja vee sattumine puuri põrandale 
võib tulemusi rikkuda, tuleb püüda seda võimalust minimeerida.
 
1.4.4.  Loomade ettevalmistamine  
Loomad märgistatakse, et iga looma saaks identifitseerida, ja neid 
hoitakse enne uuringu algust puurides vähemalt viis päeva, et nad 
harjuksid laboritingimustega.  
Pärast aklimatiseerumisperioodi ja umbes 24 tundi enne uuritava aine 
pealekandmist pügatakse igal loomal nahk õlgade ja selja piirkonnas paljaks. Kahjustatud naha läbilaskvus erineb terve naha omast, seepä ­
rast tuleb olla ettevaatlik ja vältida naha marrastamist. Pärast püga ­
mist ja umbes 24 tundi enne uuritava aine kandmist nahale (vt punkti 1.4.7) puhastatakse naha pinda atsetooniga rasu eemaldamiseks. Lisapesu seebi ja veega ei soovitata, kuna seebijäägid võivad soodus ­
tada katseaine imendumist. Ala peab olema piisavalt suur, et võimal ­
dada imendunud uuritava kemikaali koguse arvutamist naha cm
 2 
kohta, eelistatavalt vähemalt 10 cm  2 . Selline ala on saavutatav 
200–250 g kaaluvatel rottidel. Pärast loomade ettevalmistamist 
pannakse nad tagasi metabolismi uurimise puuridesse.  
1.4.5.  Uuritav aine  
Uuritav aine on aine, mille läbitungimisvõimet uuritakse. Väga hea 
oleks, kui uuritav aine oleks radioaktiivselt märgistatud.  
1.4.6.  Uuritav valmistis  
Uuritava aine valmistis (st puhas aine, lahjendatud aine või segu, mis 
sisaldab nahale kantavat uuritavat kemikaali) peab olema sama, 
millega inimesed või võimalikud sihtloomaliigid võivad kokku 
puutuda (või aimama seda tõetruult järele). Kõiki kõrvalekaldeid tegelikult kasutatavast valmistisest tuleb põhjendada. Vajadusel lahustatakse või suspendeeritakse uuritav aine sobivas kandjas. 
Muude kandeainete kui vee puhul peavad olema teada imendumiso ­
madused ja võimalik koostoime katseainega.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  Nahale kandmine  
Nahapinnal määratakse pealekandmise kohana kindlaks konkreetse 
suurusega ala. Teadaolev uuritava valmistise kogus kantakse seejärel ühtlaselt sellele alale. See kogus peaks reeglina järele aimama võima ­
likku kokkupuudet inimesel, tavaliselt 1–5 mg/cm
 2 tahkete ainete või 
kuni 10 μl/cm  2 vedelike puhul. Muid koguseid tuleb põhjendada 
eeldatavate kasutamistingimuste, uuringu eesmärkide või uuritava valmistise füüsikaliste omadustega. Pealekandmise järel tuleb seda 
kohta kaitsta, et loom ei saaks seda puhastada. Tüüpilise vahendi 
näide on esitatud joonisel 1. Tavaliselt kaitstakse pealekandmiskohta mittetiheda kattega (nt õhku läbilaskev nailonmarlist kate). Ent piira ­
matu annuse puhul tuleb pealekandmiskoht katta tiheda kattega. Kui 
pooleldi lenduva uuritava aine aurumine vähendab katseaine määra ­
missaagist liiga palju (vt ka punkti 1.4.10 esimest lõiku), on aurunud aine vaja kinni püüda pealekandmisvahendi aktiivsöest filtrisse (vt 
joonis 1). On oluline, et vahend ei kahjustaks nahka, seoks katseainet 
ega reageeriks sellega. Loomad pannakse tagasi metabolismi uuri ­
mise üksikpuuridesse väljaheidete kogumiseks.
 
1.4.8.  Kokkupuute kestus ja proovide võtmine  
Kokkupuute kestus on ajavahemik uuritava aine pealekandmise ja 
nahalt pesemise teel eemaldamise vahel. Tuleb kasutada sobivat 
kokkupuuteaega (tavaliselt 6 või 24 tundi), arvestades inimese 
kokkupuute eeldatavat kestust. Kokkupuuteaja järel hoitakse loomi metabolismi uurimise puurides kuni planeeritud lõpetamisajani. 
Loomi tuleb jälgida toksilisuse/ebanormaalsete reaktsioonide suhtes 
korrapäraste ajavahemike järel kogu uuringu jooksul. Kokkupuuteaja lõpus tuleb nahka vaadelda nähtavate ärritusnähtude suhtes.
 
Metabolismi uurimise puurid peavad võimaldama uriini ja rooja 
eraldi kogumist uuringu jooksul. Need peavad võimaldama ka  
14 C-süsinikdioksiidi ja lenduvate  14 C-süsinikühendite kogumist, 
mida tuleb analüüsida, kui neid tekib suures koguses (> 5 %). Uriin, roe ja kogumisseadmesse jäänud gaasid (nt
 14 C-süsinikdioksiid 
ja lenduvad  14 C-süsinikühendid) tuleb koguda eraldi igalt rühmalt 
igal proovide võtmise ajal. Kui on piisavalt teavet selle kohta, et 
lenduvat radioaktiivset metaboliiti tekib vähe või üldse mitte, võib kasutada avatud puure.
 
Väljaheiteid kogutakse kokkupuuteperioodi ajal, kuni 24 tundi pärast 
esmast nahakontakti ja seejärel iga päev kuni katse lõpuni. Kolmest 
väljaheidete kogumise ajavahemikust tavaliselt piisab, ent valmistise uurimise eesmärke või olemasolevaid kineetikaandmeid arvestades võib valida uuringu jaoks sobivamaid või täiendavaid aegu.
 
Kokkupuuteperioodi lõpus eemaldatakse igalt loomalt kaitsevahend 
ja säilitatakse eraldi analüüsimise jaoks. Uuritava valmistisega 
kokkupuutes olnud nahka pestakse kõikidel loomadel vähemalt 3 korda puhastusvahendiga, kasutades sobivaid tampoone. Tuleb olla ettevaatlik, et mitte saastada teisi kehaosasid. Puhastusaine peab 
olema tavaline hügieenis kasutatav aine, nt seebi vesilahus. Lõpuks 
tuleb nahk kuivatada. Kõik tampoonid ja pesuvesi tuleb säilitada analüüsimise jaoks. Seejärel tuleb paigaldada värske kate, et kaitsta kokkupuutes olnud pinda neil loomadel, kes kuuluvad hilisemale 
ajale vastavatesse rühmadesse, enne kui loomad pannakse tagasi 
üksikpuuridesse.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Katse lõpetamine  
Igas rühmas surmatakse loomad planeeritud ajal ja veri kogutakse 
analüüsimiseks. Kaitsevahend või kate tuleb analüüsimise jaoks eemaldada. Igalt loomalt eemaldatakse analüüsimiseks kokkupuute ­
koha nahkja sama suur pügatud nahapind, mis uuritava valmistisega 
kokku ei puutunud. Kokkupuutekoha naha võib jagada osadeks, eraldades sarvkihi selle all olevast epidermisest, et saada rohkem teavet uuritava kemikaali paiknemise kohta. Uuringud, kuidas kemi ­
kaali kogused naha osades muutuvad pärast kokkupuuteperioodi 
mööduva aja jooksul, peaksid andma ettekujutuse sellest, mis juhtub uuritava kemikaaliga sarvkihis. Naha osadeks jagamise hõlbustami ­
seks (pärast naha lõplikku pesemist ja looma surmamist) eemalda ­
takse kaitsekate. Kokkupuutekoha nahk koos rõngakujulise tüki ümbritseva nahaga lõigatakse roti seljast maha ja kinnitatakse alusele. Kleeplindiriba vajutatakse ettevaatlikult naha pinnale ja 
tõmmatakse siis ära koos osaga sarvkihist. Naha pinnale vajutatakse 
järjest üha uusi kleeplindiribasid ja tõmmatakse ära; kui kogu sarv ­
kiht on eemaldatud, ei jää riba enam nahapinnale kinni. Iga looma kõik ribad võib panna ühte anumasse, kuhu sarvkihi lahustamiseks 
lisatakse kudesid lahustavat ainet. Võimalikud sihtkoed võib eemal ­
dada eraldi mõõtmisteks, enne kui ülejäänud korjust analüüsitakse imendunud koguse määramiseks. Üksikloomade korjused säilitatakse analüüsimiseks. Tavaliselt piisab üldsisalduse määramisest. Sihtor ­
ganid võib eemaldada eraldi analüüsimiseks (kui see on näidustatud 
teiste uuringute alusel). Planeeritud surmamise ajal põies leiduv uriin tuleb lisada varem kogutud uriinile. Pärast väljaheidete kogumist metabolismi uurimise puuridest planeeritud surmamise ajal pestakse 
puurid ja kogumisseadmed sobiva lahustiga. Tuleb uurida ka muud 
varustust, mis võib olla saastunud uuritava ainega.
 
1.4.10.  Määramine  
Kõigis uuringutes tuleb püüda täieliku määramissaagise poole (st 
saagis peaks olema keskmiselt 100 ± 10 % radioaktiivsusest). Kui 
saagis jääb väljapoole seda vahemikku, siis tuleb seda põhjendada. Igas proovis kasutatud kogust tuleb analüüsida sobivalt valideeritud meetoditega.
 
Statistiliste arvutustega tuleb määrata iga pealekandmiskatse paral ­
leelkatsete dispersioon.  
2. ANDMED  
Iga looma puhul tuleb igal proovide võtmise ajal teha järgmised 
uuritava kemikaali ja/või metaboliitide mõõtmised. Lisaks indivi ­
duaalsetele andmetele tuleb esitada ka proovide võtmise aja alusel rühmitatud andmete keskväärtused.
 
— kaitsevahenditega seotud kogused;  
— nahalt eraldatavad kogused;  
— kogused nahas/nahal, mida ei saa nahalt ära pesta;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— kogus uurimiseks võetud veres;  
— kogus väljaheidetes ja väljahingatud õhus (vajadusel);  
— kogus, mis jääb korjusesse ja eraldi analüüsimise jaoks eemal ­
datud organitesse.  
Uuritava aine ja/või metaboliitide kogus väljaheidetes, väljahingatud 
õhus, veres ja korjuses võimaldab määrata igal ajahetkel imendunud 
aine üldkoguse. Samuti saab arvutada uuritava kemikaali koguse, mis 
absorbeerus uuritava ainega kokkupuutunud naha 1 cm  2 kohta 
kokkupuuteperioodi vältel.  
3. TULEMUSTE VORMISTAMINE  
3.1. KATSEPROTOKOLL  
Katseprotokollis tuleb esitada katse läbiviimisele seatud nõuded, 
sealhulgas kasutatud katsesüsteemi põhjendus, ning järgmine teave.  
Uuritav aine:  
— andmed aine määratlemiseks [nt CASi number, kui see on teada; 
aine tootja; puhtus (radiokeemiline puhtus); teadaolevad lisandid; partii number];
 
— füüsikaline iseloomustus, füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, 
lenduvus, lahustuvus, stabiilsus, molekulmass ja log P  ow ). 
Uuritav valmistis:  
— koostis ja kasutamise põhjendus;  
— üksikasjad uuritava valmistise kohta, pealekantud kogus, saavu ­
tatud kontsentratsioon, kandeaine, stabiilsus ja homogeensus.  
Katseloom:  
— kasutatud liik/aretusliin;  
— loomade arv, vanus ja sugu,  
— loomade päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;  
— üksikloomade kaal katse alguses.  
Katsetingimused:  
— uuritava valmistise manustamise üksikasjad (pealekandmiskoht, 
määramismeetod, katmine tihedalt või mittetihedalt, maht, ekstra ­
heerimine, määramine);  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad.  
Tulemused:  
— kõik toksilisuse nähud;  
— tabel imendumisandmete kohta (väljendatud kiiruse, koguse või 
protsendina);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— katse üldised määramissaagised;  
— tulemuste tõlgendamine, võrdlus katseaine nahakaudse imendu ­
mise seniste andmetega.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method.  
2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3) ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph 
No. 20.  
4) Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol.  8(5), 829–835.  
5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA  
6) EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and Envi ­
ronmental Assessment.  
7) EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
 
8) Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 369–373.  
9. Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  54, 
399–404.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Joonis 1  
Tüüpiline vahend nahakaudse kokkupuute koha määratlemiseks ja kaitsmiseks  in 
vivo nahakaudse imendumise uuringute ajal
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  NAHAKAUDNE IMENDUMINE:  IN VITRO  MEETOD  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 428 (2004).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesoleva meetodiga määratakse väljalõigatud nahatükile kantud 
uuritava aine imendumist läbi naha. Seda võib kasutada kas koos 
naha kaudu imendumise  in vivo  meetodiga (1) või iseseisvalt. Sel 
meetodil põhinevate uuringute kavandamise hõlbustamiseks soovita ­
takse kasutada OECD juhenddokumenti nahakaudse imendumise uuringute läbiviimiseks (2). Juhenddokument on ette valmistatud, 
et lihtsustada sobivate  in vitro  protseduuride valimist konkreetsete 
tingimuste puhul, et tagada selle meetodiga saadud tulemuste usal ­
dusväärsus.
 
Nahakaudse imendumise ja dermaalse jaotumise mõõtmise meetodid 
võib jagada kahte kategooriasse:  in vivo  ja in vitro.  Nahakaudse 
imendumise  in vivo  meetodeid kasutatakse laialdaselt ja nende abil 
saadakse farmakoloogilist teavet mitme loomaliigi kohta.  In vivo  
meetodit kirjeldatakse eraldi teise katsemeetodi juures (1). Ka  in 
vitro  meetodeid on juba palju aastaid kasutatud nahakaudse imendu ­
mise mõõtmiseks. Kuigi käesoleva katsemeetodiga hõlmatud  in vitro  
meetodeid pole ametlikult uuringutega valideeritud, leppisid OECD eksperdid 1999. aastal kokku, et hinnatud andmeid on  in vitro  
meetodi toetamiseks piisavalt (3). Täiendavad üksikasjad, mis seda 
kinnitavad, sealhulgas ka palju  in vitro  ja in vivo  meetodite otseseid 
võrdlusi, on esitatud juhenddokumendis (viide 2). Käesolevat teemat on käsitletud mitmes monograafia, milles on üksikasjalikult kirjel ­
datud  in vitro  meetodi kasutamise tausta (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ja 
12). In vitro  meetoditega mõõdetakse kemikaalide difusiooni nahasse 
ja läbi naha vedelikureservuaari ning seejuures võib kasutada kas mitteelujõulist nahka ainult difusiooni mõõtmiseks või värsket, meta ­
boolselt aktiivset nahka, et mõõta samaaegselt nii difusiooni kui ka 
metabolismi nahas. Selliseid meetodeid on kasutatud sõeluuringutes 
mitmesugustest segudest kemikaalide nahka ja läbi naha imendumise võrdlemisel ning need võivad olla ka kasulikeks mudeliteks läbi naha toimuva imendumise hindamiseks inimesel.
 
In vitro  meetod ei pruugi olla kohaldatav igas olukorras ja kõigi 
kemikaaliklasside puhul.  In vitro  meetod võib sobida naha läbitavuse 
esialgseks kvalitatiivseks hindamiseks. Mõnikord on neid andmeid vaja täiendada  in vivo  andmetega. Juhenddokumendis (2) on täpsus ­
tatud, millal võib kasutada  in vitro  meetodit. Viites 3 on esitatud 
täiendav üksikasjalik teave sellekohase otsuse põhjendamiseks.
 
Käesolevas meetodis esitatakse nahakaudse imendumise ja jaotumise 
mõõtmise üldpõhimõtted väljalõigatud nahatüki kasutamisel. Võib kasutada paljude imetajaliikide, kaasa arvatud inimese nahka. Naha läbitavusega seotud omadused säilivad pärast kehalt eemaldamist, 
kuna peamiseks difusioonibarjääriks on eluvõimetu sarvkiht  (stratum 
corneum);  aktiivset kemikaalide transporti läbi naha ei ole tähel ­
datud. On tõendatud, et nahal on võime metaboli seerida teatud kemikaale nahakaudse imendumise ajal (6); see protsess ei ole küll 
kiirust limiteeriv tegelikult imendunud kemikaalikoguse seisukohast, 
kuid võib mõjutada vereringesse sattuva materjali koostist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. MÕISTED  
Imendumata kogus –  kogus, mis pestakse maha naha pinnalt pärast 
kokkupuudet ja mis leidub difusiooniraku peal asuval kattel, seal ­
hulgas kogus, mille kohta näidatakse, et see lendub nahalt kokku ­
puute ajal.  
Imendunud kogus  (in vitro) –  katseaine mass, mis jõuab vastuvõt ­
vasse vedelikku või süsteemsesse ringesse konkreetse ajavahemiku 
jooksul.  
Imendatav kogus  (in vitro) –  kogus, mis jääb nahale või naha sisse 
pärast pesemist.  
1.3. KATSEEETODI PÕHIMÕTE  
Katseaine, mis võib olla radioaktiivselt märgistatud, kantakse kahte 
difusiooniraku kambrit eraldava nahatüki pinnale. Kemikaal jääb 
nahale katseprotokollis näidatud ajaks seal kirjeldatud tingimustes, misjärel see eemaldatakse sobiva puhastamisprotseduuriga. Vastuvõt ­
vast vedelikust võetakse katse käigus proovid teatud ajahetkedel ja 
analüüsitakse neid uuritava kemikaali ja/või metaboliitide suhtes.
 
Kui kasutatakse metaboolselt aktiivseid süsteeme, võib sobivate 
meetoditega analüüsida uuritava kemikaali metaboliite. Katse lõpus 
mõõdetakse vajadusel uuritava kemikaali ja selle metaboliitide jaotu ­
mine.  
Sobivates tingimustes, mis on kirjeldatud käesoleva meetodi juhendis 
ja juhenddokumendis (2), mõõdetakse uuritava aine imendumine teatava ajavahemiku vältel, analüüsides vastuvõtvat vedelikku ja 
nahka, millele oli kantud kemikaal. Naha sisse jäävat uuritavat 
ainet tuleb käsitada imendununa, välja arvatud juhtudel, kui saab näidata, et imendumist saab määrata ainult vastuvõtva vedeliku väär ­
tuste abil. Teiste komponentide (nahalt maha pestud ja nahakihti ­
desse jäänud materjal) analüüsimine võimaldab andmeid täiendavalt 
hinnata, sealhulgas määrata kogu uuritava aine jaotumise ja saagise protsendi.
 
Katse läbiviimise korrektsuse ja usaldusväärsuse tõendamiseks 
viiakse laboris läbi katsed asjaomaste võrdluskemikaalidega; saadud tulemused peavad vastama kasutatud meetodi kohta avaldatud kirja ­
ndusandmetele. Selleks võib mõõta sobivat võrdlusainet (mille lipo ­
fiilsus võiks olla lähedane uuritava aine omale) samaaegselt uuritava 
ainega või esitada piisav hulk varasemaid andmeid erineva lipofiil ­
susega võrdlusainete (nt kofeiin, bensoehape ja testosteroon) imen ­
dumise mõõtmise kohta.
 
1.4. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.4.1.  Difusioonirakk  
Difusioonirakk koosneb doonorkambrist ja vastuvõtukambrist, mille 
vahele paigutatakse nahk (tüüpilise kujundusega rakk on kujutatud 
joonisel 1). Rakuseina ja nahatüki ühenduskoht peab olema tihe, naha alumise pinnaga kontaktis olevast vastuvõtvast lahusest peab saama kergesti proove võtta ja seda lahust peab saama korralikult 
segada ning raku ja selle sisu temperatuur peab olema hästi kontrol ­
litav. Kasutada võib nii staatilist kui ka läbivooluga difusioonirakku. Tavaliselt jäetakse doonorkamber uuritava aine lõpliku kogusega kokkupuute ajal tihedalt sulgemata. Doonorkambri võib aga pideva 
pealekandmisega katse ja teatavate lõplike kogustega korraldatavate 
katsete ajal ka tihedalt sulgeda.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Vastuvõttev vedelik  
Eelistatakse füsioloogilisele keskkonnale lähedase vastuvõtva vede ­
liku kasutamist, kuid kasutada võib ka muid vedelikke, kui see on põhjendatud. Tuleb esitada vastuvõtva vedeliku täpne koostis. Tuleb 
näidata, et uuritav kemikaal on vastuvõtvas vedelikus piisavalt 
lahustuv, nii et see vedelik ise ei takistaks imendumist. Lisaks ei tohi vastuvõttev vedelik nahatükki kahjustada. Läbivooluga süsteemi puhul ei tohi voolukiirus takistada uuritava aine difusiooni vastu ­
võtvasse vedelikku. Staatilise rakuga süsteemis tuleb vedelikku pide ­
valt segada ja sealt regulaarselt proove võtta. Kui uuritakse metabo ­
lismi, peab vastuvõttev vedelik toetama naha elutegevust katse ajal.
 
1.4.3.  Nahapreparaadid  
Võib kasutada inimeselt või loomalt võetud nahka. Inimese naha 
kasutamine toimub muidugi vastavalt iga riigi ja rahvusvahelistele 
eetilistele tõekspidamistele ja tingimustele. Kuigi eelistatakse elusat 
nahka, võib kasutada ka mitteelusat nahka, kui saab näidata, et see ei ole kahjustatud. Lubatav on kasutada kas epidermaalmembraane (ensümaatiliselt, kuumusega või keemiliselt eraldatud) või derma ­
toomi abil saadud õhukest nahakihti (paksusega harilikult 
200–400 μm). Võib kasutada täispaksusega nahka, kuid liigset 
paksust  (ca >  1 mm) tuleb vältida, kui eesmärk ei ole määrata 
uuritavat kemikaali nahakihtides. Loomaliigi, anatoomilise lokalisat ­
siooni ja preparatsioonitehnika valik peab olema põhjendatud. 
Nõutavad on usaldusväärsed andmed vähemalt neljast paralleelproo ­
vist uuritava preparaadi kohta.
 
1.4.4.  Nahapreparaadi kahjustamatus  
On oluline, et nahk oleks õigesti prepareeritud. Vale prepareerimine 
võib kahjustada  stratum corneum ’i, seepärast tuleb kontrollida, et 
prepareeritud nahk ei oleks kahjustatud. Kui uuritakse naha metabo ­
lismi, tuleb kasutada värskelt lõigatud nahka võimalikult kiiresti 
pärast lõikamist ja tingimustes, mis teadaolevalt toetavad metaboolset aktiivsust. Üldreeglina tuleb värskelt lõigatud nahka kasutada 24 tunni jooksul, kuid vastuvõetav säilitusperiood võib oleneda metabo ­
liseerivast ensüümsüsteemist ja säilitustemperatuuridest (13). Kui 
nahapreparaate on enne kasutamist säilitatud, tuleb tõendada, et barjäärfunktsioon on alles.
 
1.4.5.  Uuritav aine  
Uuritav aine on aine, mille läbitungimisvõimet uuritakse. Väga hea 
oleks, kui uuritav aine oleks radioaktiivselt märgistatud.  
1.4.6.  Uuritav preparaat  
Uuritava aine preparaat (st puhas, lahjendatud või segu koostisse 
viidud materjal, mis sisaldab nahale kantavat uuritavat ainet) peab olema sama, millega inimene või muu loomaliigi esindaja võib 
kokku puutuda (või selle lähedane aseaine). Iga kõrvalekaldumine 
„kasutusel olevast” preparaadist peab olema põhjendatud.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  Uuritavate ainete kontsentratsioon ja segud  
Tavaliselt kasutatakse mitut uuritava aine kontsentratsiooni, mis on 
võrreldavad suurima kontsentratsiooniga, millega inimene võib kokku puutuda. Samuti tuleb kaaluda tüüpiliste segude imendumise 
uurimist.
 
1.4.8.  Kandmine nahale  
Inimese harilike kokkupuutetingimuste puhul on tavaliselt tegu 
lõplike kogustega. Seepärast tuleb nahale kanda kogus, mis model ­
leerib inimese kokkupuudet ainega, ja see on tavaliselt 1–5 mg/cm  2 
naha kohta tahkete ainete ja kuni 10 μl/cm  2 vedelike puhul. Kogus 
peaks olema põhjendatud eeldatavate kasutamistingimuste, uuringu 
eesmärkide või uuritava preparaadi füüsikaliste omadustega. Näiteks võib naha pinnale kantud koguse lugeda lõpmata suureks, kui uuri ­
tavat ainet kantakse pindalaühikule suures mahus.
 
1.4.9.  Temperatuur  
Temperatuur mõjutab kemikaalide passiivset difusiooni (ja seetõttu 
nende nahakaudset imendumist). Difusioonikambrit ja nahka tuleb 
hoida konstantsel temperatuuril, mis on sarnane naha normaalse temperatuuriga 32 ± 1
 o C. Erineva kujundusega mõõtmisrakkude 
puhul on vaja kasutada erinevaid veevanni või soojendatava ploki 
temperatuure, et tagada vastuvõtva lahuse/naha olek füsioloogilise 
normi juures. Niiskus peab eelistatavalt olema 30 % ja 70 % vahel.  
1.4.10.  Kokkupuute kestus ja proovide võtmine  
Nahk võib uuritava preparaadiga kokku puutuda kogu katse ajal või 
lühemate ajavahemike jooksul (et modelleerida inimese kokkupuute mõnd konkreetset tüüpi). Liigne uuritava preparaadi kogus pestakse nahalt sobiva puhastusainega ja loputusvesi kogutakse analüüsimi ­
seks. Uuritava preparaadi eemaldamise viis sõltub oodatavatest kasu ­
tustingimustest ning peab olema põhjendatud. Tavaliselt on imendu ­
misprofiili piisavaks kirjeldamiseks vaja võtta proove 24 tunni jooksul. Kuna naha kvaliteet võib 24 tunni pärast hakata langema, 
ei tohi proove tavaliselt võtta kauem kui 24 tunni jooksul. Kiiresti 
naha sisse tungivate uuritavate ainete puhul ei pruugi pikem mõõt ­
mine olla vajalikki, aeglasemalt naha sisse tungivate ainete puhul võib olla vaja kasutada pikemat aega. Vastuvõtvast vedelikust proo ­
vide võtmise sagedus peab olema piisav, et uuritava aine imendu ­
mise profiili saaks esitada graafiliselt.
 
1.4.11.  Katse lõpus tehtavad mõõtmised  
Kõik katsesüsteemi komponendid tuleb analüüsida ja määrata uuri ­
tava aine kogused. See hõlmab doonorkambrit, naha pinna loputus ­
vedelikku, nahapreparaati ja vastuvõtva vedeliku kambrit. Mõnel 
juhul võib eraldi analüüsimise jaoks jagada naha eksponeeritud naha ­
pinnaks ja nahaks, mis paiknes raku ääre all, ning  stratum corneu ­
m’iks, epidermiseks ja dermiseks.  
1.4.12.  Analüüsimine  
Kõigis uuringutes tuleb saavutada piisav saagis (eesmärk peaks 
olema, et keskmine saagis on 100 ± 10 % radioaktiivsusest ja kõrva ­
lekalded sellest peavad olema põhjendatud). Uuritava aine kogused 
vastuvõtvas vedelikus, naha pesemise vedelikus ja aparaadi loputa ­
mise vedelikus tuleb määrata sobiva meetodi abil.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. ANDMED  
Esitatakse vastuvõtva vedeliku analüüs, uuritava kemikaali jaotus 
katsesüsteemis ja imendumisprofiil sõltuvana ajast. Kui kasutatakse lõplikule kogusele vastavaid kokkupuutetingimusi, tuleb arvutada 
kogus, mis pesti nahalt ära, nahaga (sh eri nahakihtidega, kui neid 
analüüsitakse) seotud kogus ja vastuvõtvas vedelikus olev kogus (kiirus ja kogus või protsent pealekantud kogusest). Mõnikord saab nahakaudset imendumist väljendada ainult vastuvõtva vedeliku 
andmete kasutamisega. Kui katseaine jääb uuringu lõpus naha 
sisse, võib siiski olla vajalik arvestada ka see kogus imendunud koguse hulka (vt viide 3, punkt 66). Kui kasutatakse lõpmatule 
kogusele vastavaid kokkupuutetingimusi, võivad andmed võimaldada 
läbilaskvuskonstandi (Kp) arvutamist. Nende tingimuste puhul pole imendumise protsent oluline.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuandes tuleb esitada katse läbiviimisele seatud nõuded, seal ­
hulgas kasutatud katsesüsteemi põhjendus, ning lisaks järgmine teave.
 
Uuritav aine:  
— füüsikaline iseloomustus, füüsikalis-keemilised omadused (vähe ­
malt molekulmass ja log P  ow ), puhtus (radiokeemiline puhtus);  
— identifitseerimiseks vajalikud andmed (nt partii number);  
— lahustuvus vastuvõtvas vedelikus.  
Uuritav preparaat:  
— koostis ja kasutamise põhjendus;  
— homogeensus.  
Katse tingimused:  
— naha päritolu ja lokalisatsioon, prepareerimise meetod, säilitustin ­
gimused enne kasutamist, mis tahes eeltöötlus (puhastamine, anti ­
biootiline töötlus jne), naha kahjustamatuse mõõtmised, meta ­
boolne staatus, kasutamise põhjendus;  
— difusiooniraku ehitus, vastuvõtva vedeliku koostis, vastuvõtva 
vedeliku voolukiirus või proovide võtmise ajad ja meetod;  
— uuritava preparaadi pealekandmise üksikasjad ja pealekantud 
kogus;  
— kokkupuute kestus;  
— uuritava preparaadi nahalt eemaldamise, nt naha loputamise ük ­
sikasjad;  
— naha analüüsi üksikasjad ja millist fraktsioneerimistehnikat kasu ­
tati, et määrata jaotumine nahas;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— raku ja varustuse pesemise kord;  
— analüüsimeetodid, ekstraheerimistehnika, avastamispiirid ja 
analüüsimeetodi valideerimine.  
Tulemused:  
— uuritava aine üldised määratud kogused katses (pealekantud 
kogus = naha pesuvedelik + nahk + vastuvõttev vedelik + raku pesuvedelik);
 
— tabel mõõdetud koguste kohta raku igas kambris;  
— imendumisprofiil;  
— imendumist iseloomustavate andmete tabel (väljendatud kiiruse, 
koguse või protsendina).  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused.  
4. VIITED  
1) Testing Method B.44. Skin Absorption:  In vivo  Method.  
2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3) OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, 
Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.  
4) Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press, Boca Raton.  
5) Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications,  RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, 
pp. 237–241.  
6) Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton.  
7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, 
ECETOC, Brussels.  
8) Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). 
Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191–205.
 
9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
10) Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al.  (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11) Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
12) Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
13) Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlo ­
robenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356–365.  
Joonis 1  
Tüüpilise staatilise difusiooniraku ehitus nahakaudse imendumise  in vitro  
uuringute puhul
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IN VITRO  NAHAÄRRITUSKATSE: REKONSTRUEERITUD 
INIMEPIDERMISE MUDELI KATSEMEETOD  
SISSEJUHATUS  
1. Nahaärrituse all mõistetakse pöörduva nahakahjustuse tekitamist uuritava 
kemikaali pealekandmisega neljaks tunniks (nagu on määratletud ÜRO 
ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) ning Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude 
klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (edaspidi „CLP-määrus” 
(classification, labelling and packaging )] (1, 3)). Käesolevas katsemeetodis 
on kirjeldatud  in vitro  meetodit, mida võib kasutada ÜRO GHS-süsteemi ja 
ELi CLP-määruse 2. kategooriale vastavate ärritavate ainetega seotud 
ohtude kindlaksmääramiseks (1, 2, 3). ELis ja muudes piirkondades, milles 
ei ole vastu võetud vabatahtlikult kohaldatavat ÜRO GHSi 3. kategooriat (nõrgad ärritajad), võib käesolevat katsemeetodit kasutada ka selleks, et 
kindlaks teha klassifitseerimata, st ÜRO GHSi ja ELi CLP-määruse kohase 
kategooriata kemikaale (1, 3). Käesolevat katsemeetodit võib kasutada kemikaalide nahaärritust tekitava toime määramiseks kui iseseisvat meetodit, millega saab asendada  in vivo  nahaärrituse mõõtmise astmelise 
katsetamise strateegias (4 ja käesoleva lisa peatükk B.4).
 
2. Nahka ärritava toime hindamisel on tavaliselt kasutatud laboriloomi (OECD 
katsejuhend 404; käesoleva lisa peatükk B.4) (4). Loomade heaolu tagamise vajadust arvestades vaadati meetod B.4 2004. aastal läbi ja lubati nahka 
söövitavat või ärritavat toimet määrata astmelise katsetamise strateegiaga, 
milles kasutatakse valideeritud  in vitro  ja ex vivo  meetodeid, et vältida 
loomadele valu ja kannatuste põhjustamist. Kolm valideeritud  in vitro  katse­
meetodit on kinnitatud kui OECD katsejuhendid 430, 431 ja 435 (5, 6, 7) 
ning kaks neist kui käesoleva lisa peatükid B.40 ja B.40a, et neid kasutataks 
astmelise katsetamise strateegia B.4 või OECD katsejuhendi 404 (4) kasu ­
tamisel söövitust põhjustava toime määramiseks.
 
3. Käesolevas katsemeetodis on käsitletud inimtervise sellist aspekti nagu 
nahaärritus. Meetodis on kasutatud rekonstrueeritud inimepidermist (RhE), mis oma üldise ülesehituse poolest (rakkude allikana on nendes kasutatud inimepidermisest saadud transformeerimata keratinotsüüte, mudelil on 
epidermisesarnane kude ja rakuarhitektuur) jäljendab nii oma biokeemiliste 
kui ka füsioloogiliste omaduste poolest inimnaha ülemisi kihte, st epider ­
mist. Käesolev katsemeetod hõlmab tulemuslikkusnõudeid (2. liide), mille on välja töötanud alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskus 
(EC-ECVAM) (8) vastavalt OECD suunisdokumendile nr 34 (9) ja mille 
alusel hinnatakse samalaadseid või muudetud RhE-põhiseid meetodeid.
 
4. Käesolev katsemeetod hõlmab kolme valideeritud meetodit. Eelvalideeri ­
mine, optimeerimine ja valideerimine on lõpetatud  in vitro  meetodi jaoks 
(10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20), milles kasutatakse RhE-mudelit, 
mida müüakse nimetuse EpiSkin  TM all ja millele viidatakse kui valideeritud 
võrdlusmeetodile. Valideeritud võrdlusmeetodiga sarnaseid tulemusi on tule ­
muslikkusnõuetel põhineva hindamise (21) kohaselt saadud veel kahe 
müügil oleva nahaärrituse  in vitro  määramise RhE-põhise meetodiga ning 
need on RHE-meetodid EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ja SkinEthic  TM (22). ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Enne kui muud samalaadset või muudetud  in vitro  RhE-meetodit peale 
valideeritud võrdlusmeetodi ja RHE-meetodite EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
või SkinEthic  TM võib kasutada regulatiivsel eesmärgil, tuleks määrata selle 
usaldusväärsus, asjakohasus (õigsus) ja kavandatud kasutamise piirangud, et olla kindel, et seda võib pidada valideeritud võrdlusmeetodiga sarnaseks 
meetodiks vastavalt käesolevas katsemeetodis (2. liide) esitatud tulemuslik ­
kusnõuetele. Lisaks soovitatakse enne samalaadse või muudetud  in vitro  
RhE-meetodi väljatöötamist, valideerimist ja regulatiivseks kinnitamiseks pakkumist tutvuda  in vitro  nahaärrituse määramist käsitleva OECD selgitava 
taustdokumendiga (23).
 
MÕISTED  
6. Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.  
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
7. Valideerimisuuring (16) näitas, et üks katsemeetodi piiranguid on see, et 
sellega ei saa klassifitseerida kemikaale vabatahtlikult kohaldatavasse ÜRO 
GHSi kategooriasse 3 (nõrgad ärritajad) (1). Osaliselt asendava katsemee ­
todina kasutamisel võib vaja minna järgnevat  in vivo  katset, et täielikult 
iseloomustada kemikaali nahaärritust tekitavat toimet (4 ja käesoleva lisa 
peatükk B.4). Inimese naha kasutamine toimub muidugi vastavalt iga riigi ja 
rahvusvahelistele eetilistele tõekspidamistele ja tingimustele.  
8. Käesolevas katsemeetodis käsitletakse B.4 (OECD katsejuhend 404) naha ­
söövituse/nahaärrituse astmelise katsetamise strateegia (4)  in vitro  nahaärri­
tust tekitavat komponenti. Kuigi see katsemeetod ei anna adekvaatset teavet nahasöövituse kohta, tuleb märkida, et nahasöövituse määramise meetod 
B.40a (OECD katsejuhend 431) põhineb samal RhE katsesüsteemil, kuigi 
seal kasutatakse teistsugust eeskirja (peatükk B.40 a). Meetod põhineb RhE-mudelitel, milles kasutatakse inimese keratinotsüüte, mis sellega  in 
vitro  esindavad meid huvitava liigi sihtorganit. Lisaks hõlmab meetod otse ­
selt kemikaali toimel tekkiva põletiku kaskaadmehhanismi algstaadiumi 
(raku- ja koekahjustus, millest tekib piiratud ulatusega trauma), mis esineb nahaärrituse tekkimisel  in vivo . Käesoleva katsemeetodi valideerimiseks on 
katsetatud paljusid erinevaid kemikaale; valideerimisuuringute empiirilises 
andmebaasis on kokku 58 kemikaali (16, 18, 23). Meetodit saab kasutada 
tahkete ainete, vedelike, püdelate ainete ja vahade puhul. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahus ­
tuvad või lahustumatud. Tahked ained tuleks enne pealekandmist võimaluse 
korral peenestada peeneks pulbriks; uuritava aine muud eeltöötlust ei ole 
vaja. Gaase ja aerosoole ei ole valideerimisuuringuga veel hinnatud (24). Kuigi on mõeldav, et neidki saab uurida RhE-meetodiga, ei võimalda prae ­
gune katse-eeskiri gaaside ega aerosoolide uurimist. Tuleb märkida ka, et 
tugeva värvusega kemikaalid võivad segada rakkude eluvõimelisuse mõõt ­
mist ja siis on vaja kasutada sobivaid kontrollproove paranduste tegemiseks (vt punktid 24–26).
 
9. Üksainus katse kudede kolme paralleelprooviga peaks olema piisav uuritava 
kemikaali klassifitseerimiseks, kui tulemus on ühene. Piiripealse tulemuse puhul, nagu lahkuminevad tulemused paralleelide mõõtmisel ja/või kesk ­
mine eluvõimelisuse protsent 50 ± 5 %, võib vaja minna teist katset, samuti 
kolmandat katset, kui kaks esimest katset annavad vastuolulise tulemuse.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
KATSE PÕHIMÕTE  
10. Uuritav kemikaal kantakse kolmemõõtmelisele RhE mudelile, mis koosneb 
inimepidermisest saadud transformeerimata keratinotsüütidest, mida on 
kasvatatud nii, et need moodustavad inimepidermise mitmekihilise tugevalt diferentseerunud mudeli. See koosneb korrastatud basaalkihist, ogakihist ja sõmerkihist ning mitmekihilisest sarvkihist ( stratum corneum ), mis sisaldab 
rakkudevahelisi õhiklipiidkihte, mille paigutus sarnaneb paigutusega  in vivo .
 
11. Kemikaalide tekitatud nahaärritus, mis avaldub punetuse ja tursena, tekib 
sündmuste kaskaadi tulemusena; kaskaadi alguses tungib kemikaal läbi 
sarvkihi ja kahjustab selle all asuvaid keratinotsüüdikihte. Surevad kerati ­
notsüüdid vabastavad mediaatoreid, mis päästavad valla põletikureaktsioo ­
nide kaskaadi, mis mõjutab pärisnaha ( dermis ) rakke, eelkõige strooma- ja 
endoteeliumirakke. Endoteeliumirakkude paisumine ja läbilaskvuse suurene ­
mine põhjustab nähtava punetuse ja turse (24). RhE-põhiste meetoditega 
mõõdetakse kaskaadi vallapäästvaid sündmusi.  
12. RhE-mudelis mõõdetakse rakkude eluvõimelisust vitaalvärvaine MTT (3- 
(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine; 
CASi number 298-93-1)) ensümaatilise muundamise järgi siniseks forma ­
saansoolaks, mis pärast koest ekstraheerimist määratakse kvantitatiivselt (25). Ärritavad kemikaalid tehakse kindlaks nende võime järgi vähendada 
rakkude eluvõimelisust allapoole kindlaksmääratud läviväärtusi (see 
tähendab ≤ 50 % ÜRO GHS-süsteemi ja ELi CLP-määruse kohaste 2. 
kategooria ärritavate ainete puhul). Kemikaalid, millega rakkude eluvõime ­
lisus jääb kõrgemale kindlaksmääratud läviväärtusest (st üle 50 %), 
võidakse olenevalt regulatiivsest raamistikust, milles katsemeetodi tulemusi 
kasutatakse, tunnistada mitteärritavaks (kategooriata kemikaal).
 
PÄDEVUSE TÕENDAMINE  
13. Enne käesoleval katsemeetodil põhinevast kolmest valideeritud meetodist 
mõne meetodi igapäevast kasutuselevõttu peaksid laborid tõendama oma 
tehnilist pädevust, kasutades tabelis 1 soovitatud kümmet kemikaali. Käes ­
oleva katsemeetodi kolme valideeritud meetodi alusel välja töötatavate samalaadsete või muudetud katsemeetodite puhul tuleks tõendada käesoleva 
katsemeetodi 2. liites kirjeldatud tulemuslikkusnõuete täitmist, enne kui 
meetod võetakse kasutusele õigusnormides ette nähtud meetodina.
 
14. Pädevuse tõendamise osana soovitatakse kasutajal pärast kudede saamist 
kontrollida nende kaitsekihiomaduste vastavust RhE-mudeli tootja kirjeldu ­
sele. See on eriti oluline pärast kudede pikaajalist transporti või transporti suure vahemaa taha. Kui meetod on edukalt omandatud ja oskus seda kasutada on tõendatud, ei ole selle tavapärane kontrollimine vajalik. Kuid 
tavapärase kasutamise puhul soovitatakse jätkata kaitsekihiomaduste kont ­
rollimist korrapäraste ajavahemike järel.
 
Tabel 1  
Võrdluskemikaalid  ( 1 ) 
Kemikaal CASi nr  In vivo  hinne (  2 ) Füüsikaline olek ÜRO GHSi ja ELi 
CLP-määruse kohane 
kategooria  
naftüüläädikhape 86-87-3 0 tahke kat-ta 
isopropanool 67-63-0 0,3 vedelik kat-ta  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Kemikaal CASi nr  In vivo  hinne (  2 ) Füüsikaline olek ÜRO GHSi ja ELi 
CLP-määruse kohane 
kategooria  
metüülstearaat 112-61-8 1 tahke kat-ta 
heptüülbutüraat 5870-93-9 1,7 vedelik kat-ta 
(vabatahtlikult 
kohald. kat.  
3) (  3 ), ( 4 ) 
heksüülsalitsülaat 6259-76-3 2 vedelik kat-ta 
(vabatahtlikult 
kohald. kat.  
3) (  3 ), ( 4 ) 
3-p-kumenüül-2-metüülpropioonalde ­
hüüd 103-95-7 2,3 vedelik 2. kat. 
1-bromoheksaan 111-25-1 2,7 vedelik 2. kat. 
kaaliumhüdroksiid (5 % vesilahus) 1310-58-3 3 vedelik 2. kat. 1-metüül-3-fenüül-1-piperasiin 5271-27-2 3,3 tahke 2. kat. heptanaal 111-71-7 3,4 vedelik 2. kat.
 
( 1 ) Tabelis esitatud võrdluskemikaalid on osa valideerimisuuringus kasutatud võrdluskemikaalidest. 
( 2 ) Hinne  in vivo , vastavalt B.4-le ja OECD katsejuhendile 404 (4). 
( 3 ) Käesoleva katsemeetodi kohaselt käsitatakse ÜRO GHS-süsteemi 3. valikkategooriat (nõrgad ärritajad) (1) kategooria puudumisen a 
(kategooriata). 
( 4 ) ÜRO GHS-süsteemi 3. valikkategooria ei ole ELi CLP-määruse järgi kohaldatav.  
KATSE KÄIK  
15. Järgnevas osas kirjeldatakse nahaärrituse hindamiseks kasutatava 
RhE-meetodi katse osi ja teostust. Tuleb valmistada RhE-mudel; selle võib teha kas ise või osta. Avaldatud on standardtööeeskirjad kolme mudeli 
jaoks: EpiSkin
 TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ja SkinEthic  TM RHE (26, 27, 
28). Katse tuleks teha järgmiselt.  
RhE katsemeetodi osad  
Üldtingimused  
16. Epiteelkoe ehitamiseks tuleb kasutada inimese transformeerimata keratinot ­
süüte. Talitleva sarvkihi all peab olema mitu kihti (basaalkiht, ogakiht ja 
sõmerkiht) eluvõimelisi epiteelrakke. Sarvkiht peaks olema mitmekihiline ja vajaliku lipiidse koostisega, et tekiks sellise tugevusega funktsionaalne kait ­
sekiht, mis suudab takistada tsütotoksiliste markerkemikaalide, nagu 
naatriumdodetsüülsulfaat (SDS) või Triton X-100, kiiret läbitungimist. 
Nimetatud kaitsekihina toimimist tuleks tõendada kas sellise kontsentrat ­
siooni määramisega, mille juures markerkemikaal vähendab koe eluvõime ­
lisust 50 % võrra (IC
 50 ) pärast kindlaksmääratud kokkupuuteaega, või 
sellise kokkupuuteaja määramisega, mille juures markerkemikaal teatava 
kindla kontsentratsiooni juures vähendab koe eluvõimelisust 50 % võrra (ET
 50 ). RhE mudel peab olema selline, et aine ei saaks tungida eluskude ­
desse sarvkihist mööda minnes, vastasel korral ei oleks tegemist naha ja 
keemilise aine kokkupuute õige mudeliga. RhE mudel ei tohi olla saastunud 
bakterite, viiruste, mükoplasma ega seentega.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Funktsionaalsed tingimused  
Eluvõimelisus  
17. Eluvõimelisuse määramiseks kasutatakse värvaine MTT katset (25). 
RhE-mudeli kasutajad peaksid tagama, et iga kasutatav RhE partii vastab 
kindlaksmääratud negatiivse kontrolli kriteeriumidele. Puhta ekstraheerimis ­
lahusti optiline tihedus peab olema piisavalt madal, väiksem kui 0,1. Nega ­
tiivse kontrolli optilise tiheduse lubatav vahemik (ülem- ja alampiir) 
(nahaärrituse katsemeetodi tingimustes) määratakse RhE-mudeli valmistaja 
või tarnija poolt; kolme valideeritud meetodi lubatavad vahemikud on esitatud tabelis 2. Peaks olema tõendatud, et negatiivse võrdlusainega töödeldud kude on kultuuris stabiilne (võimaldab saada samalaadseid 
eluvõimelisuse mõõtmistulemusi) katses kasutatava kokkupuuteaja jooksul.
 
Tabel 2  
Negatiivse kontrolli optilise tiheduse lubatav vahemik  
Lubatav alampiir Lubatav ülempiir  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Toimimine kaitsekihina  
18. Sarvkiht ja selle lipiidne koostis peavad olema piisavad, et takistada tsüto ­
toksiliste markerkemikaalide, nagu SDS või Triton X-100, kiiret läbitungi ­
mist; seda hinnatakse IC  50 või ET  50 abil (tabel 3).  
Morfoloogia  
19. RhE-mudelit tuleb histoloogiliselt uurida ja tõendada, et sel on inimese 
epidermisega sarnane struktuur (sealhulgas mitmekihiline sarvkiht).  
Reprodutseeritavus  
20. Katsemeetodi positiivse kontrolli kemikaalide ja negatiivse kontrolli tule ­
mused peavad olema ajas reprodutseeritavad.  
Kvaliteedikontroll  
21. RhE-mudeli valmistaja või tarnija peaks tagama ja tõendama, et kasutatud 
RhE-mudelite iga partii vastab toote kvaliteedikriteeriumidele, mille hulgas 
kõige olulisemad on eluvõimelisuse (punkt 17), kaitsekihiomaduste (punkt 18) ja morfoloogiaga (punkt 19) seotud kriteeriumid. Sellised andmed tuleks anda meetodi kasutajate käsutusse, et nad saaksid esitada selle teabe oma 
katse protokollis. RhE-mudeli valmistaja/tarnija (või katse tegija, kui ta 
kasutab omatehtud mudelit) peaks kindlaks määrama IC
 50 või ET  50 lubatava 
vahemiku (ülem- ja alampiiri). Nahaärrituse klassifikatsiooni usaldusväär ­
seks ennustamiseks saab kasutada ainult sobivate omadustega kudedega 
saadud tulemusi. Tabelis 3 on näitena esitatud kolme valideeritud standard ­
meetodi puhul lubatavad vahemikud.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabel 3  
Partii kvaliteedi kontrollimise kriteeriumide näited  
Lubatav alampiir Lubatav ülempiir  
EpiSkin  TM (SM) 
(18-tunnine töötlus SDS-ga) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 tundi ET  50 = 8,7 tundi 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 tundi ET  50 = 9,0 tundi  
Uuritavate ja kontrollkemikaalide pealekandmine  
22. Iga uuritava kemikaaliga ja kontrollidega tuleks teha vähemalt kolm paral ­
leelkatset. Vedela ja tahke aine korral tuleb kasutada piisavat uuritava kemi ­
kaali kogust, nii et see kataks ühtlaselt naha pinna, kuid vältida tuleb lõpmatut annust, see tähendab, et ainet tuleb peale kanda vähemalt 25 
μl/cm
 2 või 25 mg/cm  2 . Tahke aine puhul tuleks epidermist niisutada enne 
kemikaali pealekandmist deioniseeritud või destilleeritud veega, et paran ­
dada uuritava kemikaali kontakti nahaga. Võimaluse korral tuleks tahket ainet alati katsetada peene pulbri kujul. Kokkupuuteaja lõpus tuleks uuritav 
kemikaal epidermise pinnalt hoolikalt maha pesta vesipuhverlahusega või 
0,9 % NaCl lahusega. Olenevalt sellest, millist kolmest valideeritud RhE meetodist kasutatakse, võib kokkupuuteaeg olla 15–60 minutit ja inkubat ­
sioonitemperatuur 20–37 °C. Kõnealuseid kokkupuuteaegu ja -temperatuure 
optimeeritakse iga RhE-meetodi jaoks ja need peegeldavad iga meetodi 
eriomadusi; täpsustused on iga meetodi standardtööeeskirjades (26, 27, 28).
 
23. Iga uuringu puhul tuleb teha paralleelkatsed negatiivse kontrolli võrdlusaine 
ja positiivse kontrolli võrdlusainega, millega tõendatakse, et kudede eluvõi ­
melisus (negatiivse kontrolli võrdlusaine), kaitsekihitoime ja sellega määratud kudede tundlikkus (positiivse kontrolli võrdlusaine) on varem 
kindlaksmääratud lubatud piirides. Soovitatav positiivse kontrolli võrdlus ­
aine on SDSi 5 % vesilahus. Soovitatavad negatiivse kontrolli kemikaalid on vesi või fosfaatpuhvrit sisaldav keedusoolalahus.
 
Raku eluvõimelisuse mõõtmine  
24. Kõige olulisem katse tegemisel on see, et eluvõimelisuse mõõtmisi ei 
tehtaks vahetult pärast kokkupuudet uuritava kemikaaliga, vaid pärast tööt ­
lemisele järgnevat puhtaks loputatud kudede piisavalt pikka inkubeerimist 
värskes keskkonnas. Inkubeerimine võimaldab toibuda nõrgalt tsütotoksilis ­
test mõjudest ja ilmneda selgel tsütotoksilisel mõjul. Katse optimeerimise ­
tapis tõendati (11, 12, 13, 14, 15), et 42 tundi töötlemisjärgset inkubeerimist 
oli optimaalne.  
25. MTT-katse on valideeritud kvantitatiivne meetod, mida tuleks käesoleva 
katsemeetodi puhul kasutada rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks. Meetodit 
saab kasutada kolmemõõtmelises koekonstruktsioonis. Koeproov asetatakse 
kolmeks tunniks sobiva kontsentratsiooniga (nt 0,3–1 mg/ml) MTT lahu ­
sesse. Sadestunud sinine formasaan ekstraheeritakse seejärel lahustiga (näiteks isopropanool, hapestatud isopropanool) ja formasaani kontsentrat ­
sioon määratakse optilise tiheduse mõõtmisega lainepikkusel 570 nm, kasu ­
tades spektririba laiust kuni ± 30 nm.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Uuritava kemikaali enda optilised omadused või selle keemiline mõju 
MTT-le võib segada määramist, põhjustades eluvõimelisuse hindamisel 
vea (kuna uuritav kemikaal võib segada värvuse ilmumist, nõrgendada värvust või põhjustada seda). See võib juhtuda, kui uuritavat kemikaali ei ole koelt täielikult maha loputatud või kui kemikaal on tunginud epidermi ­
sesse. Kui uuritav kemikaal reageerib otse MTTga (MTT-taandaja), on ise 
värviline või muutub värviliseks koega kokkupuutumisel, on vaja täienda ­
vaid kontrollkatseid, et teha kindlaks, kuivõrd segab uuritav kemikaal eluvõimelisuse määramist, ning teha vajalik parandus. Üksikasjalik 
kirjeldus, kuidas teha parandust MTT otsese taandamise arvestamiseks 
ning värviliste ainete mõju arvessevõtmiseks, on esitatud kolme valideeritud meetodi standardeeskirjades (26, 27, 28).
 
Katse kehtivuse kriteeriumid  
27. Iga meetodi puhul, milles kasutatakse kõlblikku RhE-mudeli partiid (vt 
punkt 21), peaks negatiivse kontrolli võrdlusainega töödeldud kudede korral 
leitama optilise tiheduse väärtused, mis näitavad, et koed on pärast trans ­
pordi ja vastuvõtmise etappe ning kõiki katse-eeskirjaga ette nähtud töötlusi säilitanud oma kvaliteedi. Kontrollkatsete optilise tiheduse väärtused ei 
peaks olema allpool varem määratud alampiire. Ka positiivse kontrolli võrd ­
lusainega, st 5 % SDSi lahusega, töödeldud kudedel peaks olema säilinud võime reageerida ärritavale ainele katsemeetodi tingimustes (26, 27, 28). Tuleb määratleda koeproovide varieeruvusega seotud sobivad näitajad (kui 
kasutatakse näiteks standardhälbeid, peaksid need olema varasematest 
andmetest arvutatud ühepoolse 95 % tolerantsivahemikus; valideeritud võrd ­
lusmeetodi standardhälve on alla 18 %).
 
Tulemuste tõlgendamine ja ennustusmudel  
28. Iga uuritava kemikaaliga saadud optilise tiheduse väärtusi saab kasutada 
selleks, et arvutada rakkude eluvõimelisuse protsent võrreldes normalisee ­
ritud negatiivse kontrollprooviga, mille eluvõimelisuseks määratakse 100 %. Rakkude eluvõimelisuse protsendimäära piirväärtus, mis eraldab ärritavaid kemikaale klassifitseerimata uuritavatest kemikaalidest, ning statistiline 
meetod (statistilised meetodid), mida kasutatakse tulemuste hindamiseks ja 
ärritavate kemikaalide kindlakstegemiseks, peab (peavad) olema selgelt määratletud ja dokumenteeritud ning selle (nende) sobivus peab olema tõendatud. Piirväärtused, mida kasutatakse ärritava toime kindlakstege ­
miseks, on järgmised:
 
— uuritavat kemikaali peetakse ÜRO GHS-süsteemi ja ELi CLP-määruse 
kohaseks 2. kategooria nahka ärritavaks kemikaaliks, kui koe eluvõime pärast kokkupuudet ja töötlemisjärgset inkubeerimist on väiksem kui 
50 % või sellega võrdne;
 
— olenevalt katsemeetodi tulemuste kasutamise regulatiivsest raamistikust 
võidakse uuritavat kemikaali pidada nahka mitte ärritavaks ja vastavaks ÜRO GHS-süsteemi ja ELi CLP-määruse kohasele kategooriata kemi ­
kaalile, kui koe eluvõime pärast kokkupuudet ja töötlemisjärgset inku ­
beerimist on suurem kui 50 %.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
29. Iga katse kohta tuleks tabelina esitada üksikute paralleelproovikudedega 
saadud tulemused (näiteks optilise tiheduse väärtused ja rakkude eluvõime ­
lisuse arvutatud protsendimäära andmed iga uuritud kemikaali kohta, kaasa 
arvatud klassifikatsioon); samuti tuleb vajaduse korral esitada kordusmäära ­
miste andmed. Lisaks keskväärtusele esitatakse iga katse jaoks ka ± stan ­
dardhälbe väärtused. Iga uuritava kemikaali puhul registreeritakse tähelepa ­
nekud selle mõjude kohta MTT-reagendile, samuti märgitakse ära värvilised 
uuritavad kemikaalid.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Katseprotokoll  
30. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritavad kemikaalid ja kontrollkemikaalid:  
— keemiline nimetus või keemilised nimetused, nagu CASi nimetus ja 
number, EÜ nimetus ja number, kui on teada;  
— kemikaali puhtus või koostis (massiprotsentides);  
— määramise seisukohast olulised füüsikalis-keemilised omadused (näiteks 
füüsikaline olek, stabiilsus, lenduvus, pH, lahustuvus vees, kui on 
teada);  
— uuritava kemikaali / kontrollkemikaali töötlemine enne katset, kui see on 
asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);  
— säilitamistingimused.  
Kasutatud RhE-mudeli ja katse tegemise käigu põhjendus  
Katsetingimused:  
— kasutatud rakusüsteem;  
— kogu täiendav teave kasutatud konkreetse RhE-mudeli ja selle tulemus ­
likkuse kohta. See hõlmab vähemalt järgmist:  
i) eluvõimelisus;  
ii) toimimine kaitsekihina;  
iii) morfoloogia;  
iv) reprodutseeritavus ja ennustamisväärtus;  
v) mudeli kvaliteedi kontroll;  
— katsemetoodika üksikasjad;  
— määramisel kasutatud annused, kokkupuute kestus ja kokkupuutele järg ­
nenud inkubatsiooniaeg;  
— kõikide katse-eeskirjas tehtud muudatuste kirjeldus;  
— viide varasematele andmetele mudeli kohta. See hõlmab vähemalt järg ­
mist:  
i) kvaliteedikontrolli andmete kehtivus, arvestades varasemaid partii 
andmeid;  
ii) positiivse ja negatiivse kontrolli väärtuste kehtivus, arvestades posi ­
tiivse ja negatiivse kontrolli keskväärtusi ja vahemikke;  
— kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus, sealhulgas ennustamismu ­
delis kasutamiseks valitud piirväärtus(t)e valiku põhjendus;  
— viide varasematele kontrolli andmetele.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Tulemused:  
— iga üksiku uuritava kemikaaliga igas katses ja igal paralleelmõõtmisel 
saadud andmete tabel;  
— otseste MTT-taandajate ja/või värviliste uuritavate kemikaalide puhul 
kasutatud kontrollid;  
— muude täheldatud toimete kirjeldus.  
Tulemuste arutelu  
Kokkuvõte  
KIRJANDUS  
1) UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York 
and Geneva. Vt: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/ 
03files_e.html  
2) EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advi ­
sory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Vt: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
3) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) 
nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 
1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse 
määrust (EÜ) nr 1907/2006. ELT L 353, 31.12.2008, lk 1.
 
4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, 
OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Vt: http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu]  
9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57–93.
 
11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 
16, 765–770.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. 
and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the 
upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, ALTEX 
21, 107–114.  
13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351–367.
 
14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation 
process, ATLA 33, 329–349.  
15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irrita ­
tion Task Force report 2, ATLA 30, 109–129.
 
16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., 
Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: Report 
on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity 
function test, ATLA 35, 559–601.
 
17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Vt: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603–619.  
19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351–358.
 
20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC26), 27 April 2007. Vt: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. Vt: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 November 2008. Vt: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/document/24/ 
0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html ]  
24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irritation: 
fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. 
in Vitro 18, 231–243.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55–63.  
26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Vali ­
dation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min - 42 hours for 
the prediction of acute skin irritation of chemicals. Vt: http://ecvam.jrc.ec.eu ­
ropa.eu]  
27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Vt: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irrita ­
tion test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of 
chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Vt: http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu]  
29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7–18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.
 
30) Komisjoni 6. augusti 2001. aasta direktiiv 2001/59/EÜ, millega kahekümne 
kaheksandat korda kohandatakse tehnika arenguga nõukogu direktiivi 
67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitle ­
vate õigus- ja haldusnormide ühtlustamise kohta, EÜT L 225, 21.8.2001, lk 1.
 
31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. 
Contact Dermatitis 51, 1–4.  
32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation 
and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and animal in 
vivo data, ALTEX, 14, 359–365.  
33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch 
test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Derma ­
titis, 62, 109–116.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
1. liide  
Mõisted  
Täpsus:  katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. 
Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab 
katsemeetod õige tulemuse (9).
 
Rakkude eluvõimelisus:  rakupopulatsiooni üldist aktiivust, näiteks raku mitokond ­
rite dehüdrogenaaside võimet taandada vitaalvärvainet MTT (3-(4,5-dimetüültia ­
sool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinine), väljendav para ­
meeter, mis olenevalt mõõdetavast lõpp-punktist ja katseplaanist korreleerub elus ­
rakkude koguarvu ja/või elujõulisusega.  
Vastavus:  katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja katsemeetodite puhul, millega 
saadakse kategooriline tulemus, on üks asjakohasuse aspekte. Terminit kasutatakse 
„täpsuse” asendusterminina ja määratletakse õigesti positiivseks või negatiivseks klassifitseeritud kemikaalide ja kõikide uuritud kemikaalide suhtarvuna (9).
 
ET 50 : hinnatakse sel viisil, et määratakse kokkupuuteaeg, pärast mida markerke ­
mikaali teatava kindla kontsentratsiooni rakendamisel rakkude eluvõimelisus väheneb 50 %; vt ka IC
 50 . 
ELi CLP-määrus (Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta 
määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, 
märgistamist ja pakendamist):  selle määrusega rakendatakse Euroopa Liidus 
(ELis) kemikaalide (ainete ja segude) klassifitseerimise ja märgistamise ÜRO GHS-süsteem (3).
 
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals 
by the United Nations) ehk ÜRO ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseeri ­
mise ja märgistamise süsteem:  süsteem, milles kemikaalid (ained ja segud) on 
klassifitseeritud vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud tüübile ja tasemele ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja 
ohutuskaardid, et anda edasi inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, 
tarbijate ja päästetöötajate) ja keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku mõju kohta (1).
 
IC 50 : hinnatakse sel viisil, et määratakse kontsentratsioon, mille puhul markerke ­
mikaal vähendab pärast kindlaksmääratud kokkupuuteaega kudede eluvõimelisust 
50 %; vt ka ET  50 . 
Lõpmatu annus:  epidermisele kantud uuritava kemikaali kogus, mis on suurem 
epidermise pinna täielikuks ja ühtlaseks katmiseks vajalikust kogusest.  
Mina-kah-meetod:  kõnekeelne väljend katsemeetodi kohta, mis on struktuuriliselt 
ja tööpõhimõttelt sarnane valideeritud ja aktsepteeritud võrdlusmeetodiga. Sellist katsemeetodit võib valideerida kiirendatud korras ( catch-up validation ). Kasuta ­
takse vaheldumisi samalaadsete katsemeetodite puhul (9).
 
Tulemuslikkusnõuded:  valideeritud katsemeetodil põhinevad nõuded, mille alusel 
hinnatakse, kuivõrd saab esitatud katsemeetodit võrrelda teostuslikult ja tööpõhi ­
mõttelt samalaadse meetodiga. Arvesse võetakse järgmist: i) katsemeetodi 
olulised osad, ii) valideeritud standardmeetodi tulemuslikkuse tõendamiseks kasu ­
tatud kemikaalide hulgast valitud võrdluskemikaalide miinimumloend ja iii) võrreldavad täpsuse ja usaldusväärsuse tasemed, mis põhinevad valideeritud 
katsemeetodiga saadud tulemustel ja mis tuleks kavandatud katsemeetodi hinda ­
misel saavutada võrdluskemikaalide miinimumloendi kasutamisel (9).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Võrdluskemikaalid:  valideerimisel kasutamiseks välja valitud kemikaalid, mille 
esilekutsutavad immuunvastused  in vitro  või in vivo  võrdlussüsteemis või huvi ­
pakkuva loomaliigi puhul on juba teada. Sellised kemikaalid peaksid esindama kemikaaliklasse, mille ainete puhul katsemeetodit eeldatavalt kasutatakse, ja samuti selliste ainete põhjustatava immuunvastuse kogu vahemikku, tugevast 
mõjust nõrga mõjuni ja mõju puudumiseni. Valideerimise eri staadiumide 
jaoks, samuti eri katsemeetodite ja kasutusalade puhul võidakse nõuda võrdlus ­
kemikaalide eri kogumite kasutamist (9).
 
Asjakohasus:  mõiste, millega väljendatakse seda, kas katsemeetod võimaldab 
uurida huvipakkuvat efekti, kas meetod on mõttekas ja sobib konkreetse eesmärgi jaoks. See näitab, millisel määral saab katsemeetodiga õigesti mõõta või ennus ­
tada huvipakkuvat bioloogilist efekti. Asjakohasus hõlmab ka katsemeetodi 
õigsuse (sisulise kooskõlalisuse) kaalutlusi (9).
 
Usaldusväärsus:  mõiste, mis iseloomustab katsemeetodi tulemuste reprodutseeri ­
tavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse labo ­
risisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus (9).
 
Asendav meetod:  katsemeetod, mis on kavandatud tavakasutuses oleva kinnitatud 
meetodi asendamiseks ohtude kindlakstegemise ja/või riskide hindamise meeto ­
dina ning on määratud tagama kas inimeste või loomade tervise või keskkonna samaväärse või parema kaitse kui kinnitatud katsemeetod kõikide võimalike 
määramisolukordade ja uuritavate ainete puhul (9).
 
Tundlikkus:  kõikide positiivsete / ärritava toimega kemikaalide osakaal, mis katse ­
meetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkus näitab selgeid tulemusi andva 
katsemeetodi täpsust ja on oluline katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (9).  
Nahaärritus:  pöörduva nahakahjustuse tekkimine uuritava kemikaaliga kuni 
neljatunnise kokkupuute tagajärjel. Nahaärritus on kohalik mitteimmunogeenne reaktsioon, mis tekib lühikese aja jooksul pärast kokkupuudet (29). Selle põhi ­
tunnus on põletikureaktsiooni ja põletikuga seotud ärrituse enamiku iseloomulike 
kliiniliste tunnuste (punetus, turse, sügelus ja valu) pöörduvus.
 
Spetsiifilisus:  kõikide negatiivsete / ärritava toimeta kemikaalide osakaal, mis katse ­
meetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkus näitab selgeid tulemusi andva katsemeetodi täpsust ja on oluline katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (9).
 
Astmelise katsetamise strateegia:  katsetamine, milles katsemeetodit kasutatakse 
järjestatud viisil ja igal järgmisel tasandil valitakse katsemeetodid eelmisel katse ­
tamistasandil saadud tulemuste alusel (9).  
Uuritav kemikaal (ka „uuritav aine”):  iga aine või segu, mida uuritakse käes ­
oleva katsemeetodi abil.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
2. liide  
Nahaärrituse määramiseks pakutava rekonstrueeritud inimepidermise 
mudelil (RhE) põhineva samalaadse või muudetud  in vitro  katsemeetodi 
tulemuslikkusnõuded  
SISSEJUHATUS  
1. Tulemuslikkusnõuete eesmärk on esitada alus, mille põhjal uusi meetodeid, 
nii kaitstud (autoriõiguse või kaubamärgiga või registreeritud) meetodeid 
kui ka kaitsmata meetodeid, saaks tunnistada konkreetse uuringu jaoks piisava täpsuse ja usaldusväärsusega meetodiks. Selliseid valideeritud ja tunnustatud meetoditel põhinevaid tulemuslikkusnõudeid saab kasutada 
selleks, et hinnata muude analoogsete, samalaadsetele teaduslikele põhimõ ­
tetele tuginevate ja samade bioloogiliste või toksiliste mõjude mõõtmiseks või ennustamiseks kasutatavate, nn mina-kah-meetodite usaldusväärsust ja täpsust (9).
 
2. Enne muudetud meetodi, s.o kinnitatud meetodi võimaliku täiustatud 
variandi vastuvõtmist peaks toimuma hindamine, et teha kindlaks kavan ­
datud muudatuste mõju katse tulemuslikkusele ja millisel määral sellised 
muudatused mõjutavad teavet muude valideerimisprotsessi osade kohta. Olenevalt pakutavate muudatuste arvust ja laadist, muudatuste kohta saadud andmetest ja muudatusi toetavatest dokumentidest tuleks nende suhtes 
kohaldada kas sama valideerimisprotsessi kui uue katsemeetodi puhul või 
usaldusväärsuse ja asjakohasuse piiratud hindamist kehtestatud tulemuslik ­
kusnõuete alusel (9).
 
3. Mõnega kolmest valideeritud meetodist (EpiSkin  TM (Validated Reference 
Method  (valideeritud võrdlusmeetod), VRM), EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
ja SkinEthic  TM RHE) sarnanevat (mina-kah-) meetodit või muudetud 
meetodit, mis esitatakse kasutamiseks käesoleva katsemeetodi alusel, tuleks hinnata, et määrata kindlaks sellise meetodi usaldusväärsus ja täpsus kõikide kemikaalide puhul, mis esindavad kogu Draize ärritavusskaalat. Kavandatud 
samalaadsel või muudetud katsemeetodil peaksid kõigi 20 tulemuslikkus ­
nõuete täitmise kontrollimiseks soovitatud võrdluskemikaaliga (tabel 1) hindamisel olema usaldusväärsuse ja täpsuse näitajad, mis oleksid võrrel ­
davad valideeritud standardmeetodi näitajatega (tabel 2) või nendest 
paremad (2, 16). Usaldusväärsuse ja täpsuse väärtused, mis tuleks saavu ­
tada, on esitatud käesoleva liite punktides 8–12. Loetelu hõlmab klassifit ­
seerimata (ÜRO GHS-süsteemi / ELi CLP-määruse kategooriata kemikaal) ja klassifitseeritud (ÜRO GHS-süsteemi / ELi CLP-määruse 2. kategooria 
kemikaal) kemikaale, mis esindavad eri kemikaaliklasse, et kavandatud 
katsemeetodi usaldusväärsust ja tulemuslikkuse näitajaid (tundlikkus, spet ­
siifilisus, üldine täpsus) saaks võrrelda valideeritud katsemeetodi asjaomaste väärtustega. Meetodi usaldusväärsust ja võimet õigesti kindlaks teha ÜRO 
GHS-süsteemi / ELi CLP-määruse 2. kategooria ärritavaid kemikaale ning 
regulatiivsest raamistikust olenevalt ka ÜRO GHS-süsteemi / ELi CLP-määruse kategooriata kemikaale tuleks kontrollida enne seda, kui meetodit kasutatakse uute uuritavate kemikaalide katsetamiseks.
 
4. Need tulemuslikkusnõuded põhinevad alternatiivmeetodite valideerimise 
Euroopa keskuse (EC-ECVAM) tulemuslikkusnõuetel (8), mis on ajakohas ­
tatud vastavalt ÜRO GHS-süsteemi ja ELi CLP-määruse klassifitseerimis- ja märgistamissüsteemidele (1, 3). Tulemuslikkusnõuded määrati esialgsel kujul kindlaks pärast valideerimisuuringu (21) lõpuleviimist ja need põhi ­
nesid ELi klassifitseerimissüsteemil, mis on esitatud komisjoni 6. augusti 
2001. aasta direktiivis 2001/59/EÜ, millega kahekümne kaheksandat korda kohandatakse tehnika arenguga nõukogu direktiivi 67/548/EMÜ ohtlike ainete liigitamist, pakendamist ja märgistamist käsitlevate õigus- ja haldus ­
normide ühtlustamise kohta (
 1 ). Seoses ÜRO klassifitseerimis- ja  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) EÜT L 225, 21.8.2001, lk 1.
 märgistamissüsteemi GHS kasutuselevõtuga ELis (ELi CLP-määrus) (3), 
mis toimus enne valideerimisuuringu lõpuleviimist ja käesoleva katsemee ­
todi valmimist, on tulemuslikkusnõudeid ajakohastatud (8). Ajakohastamine hõlmab peamiselt i) muudatusi tulemuslikkusnõuete võrdluskemikaalide kogumis ning ii) kindlaksmääratud usaldusväärsus- ja täpsusnõudeid (2, 23).
 
NAHAÄRRITUSE RHE ABIL  IN VITRO  MÕÕTMISE KATSEMEETODITE 
TULEMUSLIKKUSNÄITAJAD  
5. Tulemuslikkusnäitajad hõlmavad järgmist kolme aspekti (9):  
I. katsemeetodi olulised koostisosad,  
II. võrdluskemikaalide miinimumloetelu,  
III. usaldusväärsuse ja täpsuse kindlaksmääratud väärtused.  
I. Katsemeetodi olulised koostisosad  
6. Need hõlmavad valideeritud meetodi olulisi struktuurilisi, põhimõttelisi ja 
teostuslikke osi, mis peaksid olema ka kavandatud, teostuslikult ja põhimõt ­
teliselt samalaadse või muudetud meetodi katse-eeskirjas. Sellised osad 
hõlmavad meetodi eriomadusi, üliolulisi teostuslikke üksikasju ja kvalitee ­
dikontrolli meetmeid. Katsemeetodi oluliste osade säilitamine aitab tõen ­
dada, et kavandatud samalaadne või muudetud meetod toetub samadele 
aluspõhimõtetele kui vastav valideeritud võrdlusmeetod (9). Katsemeetodi 
olulised osad on üksikasjalikult kirjeldatud punktides katsemeetodi 16–21 ja katsetamine peaks toimuma järgmises korras:
 
— üldtingimused (punkt 16);  
— funktsionaalsed tingimused, mis hõlmavad järgmist:  
— eluvõimelisus (punkt 17);  
— toimimine kaitsekihina (punkt 18);  
— morfoloogia (punkt 19);  
— reprodutseeritavus (punkt 20) ning  
— kvaliteedikontroll (punkt 21).  
II. Võrdluskemikaalide miinimumloetelu  
7. Võrdluskemikaale kasutatakse selleks, et teha kindlaks, kas uus või 
muudetud meetod, mis nii ülesehituse kui ka põhimõtte poolest on tõen ­
datult piisavalt sarnane valideeritud võrdlusmeetodiga või on kolmest vali ­
deeritud meetodist ühe väike modifikatsioon, annab usaldusväärsuse ja täpsuse poolest valideeritud võrdlusmeetodi tulemustega võrreldavaid või paremaid tulemusi (2, 8, 16, 23). Tabelis 1 soovitatud 20 võrdluskemikaali 
hõlmavad eri kemikaaliklassidesse (st funktsionaalrühmale vastavatesse 
kemikaalikategooriatesse) kuuluvaid kemikaale ja esindavad kogu Draize ärritavusskaalat (mitteärritavatest ainetest kuni tugevat ärritust põhjustavate aineteni). Loetelu ainetest kümme kuuluvad ÜRO GHS-süsteemi ja ELi 
CLP-määruse 2. kategooria kemikaalide hulka ja kümme on kategooriata 
kemikaalid, millest kolm on ÜRO GHS-süsteemi 3. valikkategooria kemikaalid. Käesoleva katsemeetodi kohaselt käsitatakse 3. valikkategoo ­
riat kategooria puudumisena. Tabelis 1 loetletud kemikaalid on 
valitud eelvalideerimisele järgnenud optimeerimisetapil ja võrdlusmeetodi 
valideerimisel kasutatud kemikaalide hulgast, arvestades keemilisi
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
funktsionaalrühmi ja füüsikalist olekut (14, 18). Võrdluskemikaalid on 
vähimalt nõutav arv kemikaale, mida tuleks kasutada selleks, et hinnata 
esitatud samalaadse või muudetud meetodi täpsust ja usaldusväärsust, kuid neid ei tuleks kasutada uute meetodite väljatöötamiseks. Kui mõnda loet ­
letud ainet ei ole saada, võib kasutada muid kemikaale, mille kohta  in vivo  
katsega on määratud piisavad võrdlusandmed, eelkõige kemikaale eelvali ­
deerimisele järgnenud optimeerimisetapil või võrdlusmeetodi valideerimisel kasutatud kemikaalide hulgast. Soovi korral võib võrdluskemikaalidele miinimumloendisse lisada kavandatud katsemeetodi täpsuse hindamiseks 
muid kemikaale, mis esindavad muid kemikaaliklasse ja mille kohta on  
in vivo  katsega määratud piisavad võrdlusandmed.
 
Tabel 1  
Võrdluskemikaalide miinimumloetelu nahaärrituse määramise RhE-põhise samalaadse või muudetud 
katsemeetodi täpsuse ja usaldusväärsuse määramiseks  ( 1 ) 
Kemikaal CASi number Füüsikaline olek Hinne  in vivo  Valideeritud 
võrdlusmeetodiga  
in vitro  määratud 
kategooria ÜRO GHS-süsteemi 
ja ELi CLP-määruse 
kohane  in vivo  
kategooria  
1-bromo-4-klorobutaan 6940-78-9 vedelik 0 2. kat. kat-ta 
dietüülftalaat 84-66-2 vedelik 0 kat-ta kat-ta 
naftüüläädikhape 86-87-3 tahke 0 kat-ta kat-ta 
allüülfenoksüatsetaat 7493-74-5 vedelik 0,3 kat-ta kat-ta isopropanool 67-63-0 vedelik 0,3 kat-ta kat-ta 
4-metüültiobensaldehüüd 3446-89-7 vedelik 1 2. kat. kat-ta 
metüülstearaat 112–61-8 tahke 1 kat-ta kat-ta heptüülbutüraat 5870-93-9 vedelik 1,7 kat-ta kat-ta heksüülsalitsülaat 6259-76-3 vedelik 2 kat-ta kat-ta 
kaneelaldehüüd 104-55-2 vedelik 2 2. kat. kat-ta 
(vabatahtlikult 
kohald. kat.  3) (
 3 ) 
1-dekanool(  ( 2 ) 112-30-1 vedelik 2,3 2. kat. 2. kat.  
3-p-kumenüül-2-metüülpro ­
pioonaldehüüd 103-95-7 vedelik 2,3 2. kat. 2. kat. 
1-bromoheksaan 111-25-1 vedelik 2,7 2. kat. 2. kat. 
2-klorometüül-3,5-dimetüül- 
4-metoksüpüridiinvesinikklo ­
riid 86604-75-3 tahke 2,7 2. kat. 2. kat.  
di-n-propüüldisulfiid(  ( 2 ) 629-19-6 vedelik 3 kat-ta 2. kat.  
kaaliumhüdroksiid (5 % vesi ­
lahus) 1310-58-3 vedelik 3 2. kat. 2. kat. 
5-(1,1-dimetüületüül)-2- 
metüülbenseentiool 7340-90-1 vedelik 3,3 2. kat. 2. kat. 
1-metüül-3-fenüül-1-pipera ­
siin 5271-27-2 tahke 3,3 2. kat. 2. kat.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Kemikaal CASi number Füüsikaline olek Hinne  in vivo  Valideeritud 
võrdlusmeetodiga  
in vitro  määratud 
kategooria ÜRO GHS-süsteemi 
ja ELi CLP-määruse 
kohane  in vivo  
kategooria  
heptanaal 111-71-7 vedelik 3,4 2. kat. 2. kat. 
tetrakloroetüleen 127-18-4 vedelik 4 2. kat. 2. kat.  
( 1 ) Kemikaalid on valitud järgmiste kriteeriumide põhjal: i) kemikaalid on müügil; ii) kemikaalid esindavad kogu Draize 
ärritavusskaalat (mitteärritavatest ainetest kuni tugevat ärritust põhjustavate aineteni); iii) nende kõigi keemiline ehitus on  
hästi teada; iv) nad esindavad samade funktsionaalrühmadega kemikaaliklasse, mida kasutati valideerimisel, ning v) nad ei 
ole äärmiselt mürgised (näiteks kantserogeensed või viljakust kahjustavad) ja nende kõrvaldamine ei ole seotud ülemääraste kulu dega. 
( 2 ) Kemikaalid, mis on ärritavad küüliku jaoks, kuid mille kohta on usaldusväärsed tõendid, et nad ei ole ärritavad inimese jaoks  (31, 
32, 33). 
( 3 ) ÜRO GHS-süsteemi, kuid mitte ELi CLP-määruse kohaselt.  
III. Usaldusväärsuse ja täpsuse kindlaksmääratud väärtused  
8. Kui kavandatud samalaadne või muudetud meetod antakse üle muudele 
laboritele, tuleb selle usaldusväärsuse ja asjakohasuse tõendamiseks määrata kõik tabelis 1 loetletud 20 kemikaali vähemalt kolmes laboris. Kuid kui 
kavandatud meetodit hakatakse kasutama üksnes ühes laboris, siis validee ­
rimiseks ei nõuta selle kontrollimist paljudes laborites. Oluline on siiski, et selliseid valideerimisuuringuid hindaksid sõltumatult vastavalt rahvusvahe ­
listele suunistele (9) rahvusvaheliselt tunnustatud valideerimisasutused. Igas 
laboris tuleks kõiki 20 võrdluskemikaali uurida kolme sõltumatu katsega, 
mis tehakse eri koepartiidega ja piisavalt pikkade ajavahemike järel. Iga katse peaks koosnema vähemalt kolmest paralleelselt tehtavast paralleel ­
proovist iga uuritava kemikaaliga, negatiivsest kontrollist ja positiivsest 
kontrollist.
 
9. Kavandatud meetodi usaldusväärsuse ja täpsuse väärtuste arvutused tuleks 
teha, arvestades korraga kõiki järgmisi kriteeriume ja tagades, et usaldus ­
väärsuse ja asjakohasuse väärtused arvutatakse varem kindlaks määratud ja 
kooskõlalisel viisil:  
1. laborisisese ja laboritevahelise varieeruvuse ning ennustamisvõime 
(täpsuse) arvutamiseks kõlbavad üksnes andmed, mis on saadud täieli ­
kest katseseeriatest;  
2. iga võrdluskemikaali lõplik klassifitseerimine igas osalevas laboris peaks 
põhinema erinevates täielikes katseseeriates määratud eluvõimelisuse keskväärtusel;
 
3. laboritevahelise varieeruvuse arvutamiseks kõlbavad üksnes sellised 
katseandmed, mis on kemikaali kohta saadud kõikides laborites täielikes 
katseseeriates;  
4. täpsuse väärtuste arvutus tuleks teha üksikute laborite ennustuste 
põhjal, mis on saadud kõigi 20 võrdluskemikaali jaoks kõigis osale ­
vates laborites.  
Katseseeria  all mõistetakse siin ühes laboris ühe uuritava kemikaaliga 
tehtud kolme sõltumatut katset.  Täielik katseseeria  on ühes laboris ühe 
uuritava kemikaaliga tehtud katseseeria, mille kõik kolm katset on kehtivad. See tähendab, et üksainus vigaseks tunnistatud katse muudab kehtetuks 
terve kolmest katsest koosneva katseseeria.
 
Laborisisene reprodutseeritavus  
10. Laborisisese korratavuse hinnang peaks näitama, et klassifitseerimistule ­
mused (ÜRO GHS-süsteemi / ELi CLP-määruse kohane 2. kategooria või ilma kategooriata kemikaal), mis on saadud eraldi sõltumatutel määramistel 
20 võrdluskemikaaliga ühes laboris, on omavahel kooskõlas vähemalt ( ≥) 
90 % juhtudest.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Laboritevaheline reprodutseeritavus  
11. Laboritevahelise reprodutseeritavuse hindamine ei ole oluline, kui kavan ­
datud meetodit kavatsetakse kasutada ühesainsas laboris. Kui meetodit tahe ­
takse edasi anda teistesse laboritesse, peaks laboritevahelise varieeruvuse hinnang näitama, et klassifitseerimistulemused (ÜRO GHS-süsteemi / ELi CLP-määruse kohane 2. kategooria või ilma kategooriata kemikaal), mis on 
saadud eraldi sõltumatutel määramistel 20 võrdluskemikaaliga eelistatavalt 
vähemalt kolmes laboris, on omavahel kooskõlas vähemalt ( ≥) 80 % juhtu ­
dest.
 
Ennustusvõime (täpsus)  
12. Kavandatud samalaadse või muudetud meetodi täpsus (tundlikkus, spetsii ­
filisus ja üldine täpsus) peaks olema võrreldav valideeritud võrdlusmeetodi omaga või sellest parem, arvestades lisateavet asjakohasuse kohta huvipak ­
kuva liigi puhul (tabel 2). Tundlikkus peaks olema vähemalt 80 % (2, 8, 
23). Kavandatud  in vitro  meetodi puhul kohaldatakse ka veel konkreetset 
lisapiirangut: nimelt on ainult kahte  in vivo  katse järgi 2. kategooria kemi ­
kaali –  1-dekanooli  ja di-n-propüüldisulfiidi  – lubatud ekslikult klassifitsee ­
rida kategooriata kemikaaliks rohkem kui ühel osaleval laboril. Spetsiifilisus 
peaks olema vähemalt 70 % (2, 8, 23). Kavandatud  in vitro  meetodi spet ­
siifilisusega seotud piiranguid rohkem ei ole, st iga osalev labor võib valesti klassifitseerida mis tahes kemikaali, mis  in vivo  katse järgi on kategooriata, 
kui katsemeetodi lõplik spetsiifilisus on nõutavas vahemikus. Üldine täpsus 
peaks olema vähemalt 75 % (2, 8, 23). Kuigi valideeritud võrdlusmeetodi 
tundlikkus tabelis 1 esitatud 20 võrdluskemikaaliga on 90 %, nõutakse samalaadselt või muudetud meetodilt valideerituks pidamiseks minimaalset 
tundlikkust 80 %, kuna nii  1-dekanool  (piiripealne kemikaal) kui ka  di-n- 
propüüldisulfiid  (valideeritud võrdlusmeetodi puhul valenegatiiv) ei ole 
inimese jaoks ärritavad kemikaalid (31, 32, 33), kuigi küülikuga leitakse neil ärritav toime. Kuna RhE-mudelid põhinevad inimpäritoluga rakkudel, 
võidakse nende mudelitega saada tulemus, et need ei ärrita (ÜRO 
GHS-süsteemi / ELi CLP-määruse järgi kategooriata).
 
Tabel 2  
Samalaadse või muudetud meetodi valideerituks tunnistamiseks nõutavad tundlikkuse, 
spetsiifilisuse ja üldise täpsuse ennustusväärtused  
Tundlikkus Spetsiifilisus Üldine täpsus  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Uuringu nõuetekohasuse kriteeriumid  
13. On võimalik, et üks või mitu katset ühe või mitme võrdluskemikaaliga ei 
vasta katse ja kontrollkemikaalide nõuetekohasuse tingimustele või ei vasta 
nõuetele muul põhjusel. Puuduvate andmete täiendamiseks on iga uuritava kemikaaliga lubatud teha kuni kaks lisakatset („ülemõõtmine”). Täpsemalt, kuna ülemõõtmise puhul tuleb paralleelselt teha ka positiivse ja negatiivse 
kontrolli katsed, lubatakse iga uuritava kemikaaliga teha kuni kaks lisa ­
katset.
 
14. On mõeldav, et isegi pärast ülemõõtmist ei saada igas osalevas laboris iga 
võrdluskemikaali kohta kokku nõutavat kolme kehtivat katset; nii saadakse 
ebatäielik andmete tabel. Sellisel juhul peavad olema täidetud kõik järg ­
mised kolm kriteeriumi, et andmekogumeid võiks siiski pidada nõuetele vastavaks:
 
1. iga võrdluskemikaali kohta 20st peab olema vähemalt üks täielik katse ­
seeria;  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. igas laboris vähemalt kolmest osalevast laborist peavad vähemalt 85 % 
katseseeriatest olema täielikud katseseeriad (20 kemikaaliga; st ühes 
laboris on lubatud kuni kolm nõuetele mittevastavat katseseeriat);  
3. vähemalt 90 % kõigist võimalikest katseseeriatest vähemalt kolmes 
osalevas laboris peavad olema täielikud (20 kemikaaliga kolmes laboris; st kokku on lubatud kuni 6 nõuetele mittevastavat katseseeriat).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47.  VEISE SARVKESTA HÄGUSUSE JA LÄBILASKVUSE KATSE ­
MEETOD SILMA SÖÖVITAVATE JA TUGEVASTI ÄRRITA ­
VATE AINETE KINDLAKSTEGEMISEKS  
SISSEJUHATUS  
1. Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse katse ( Bovine Corneal Opacity 
and Permeability  – BCOP) on  in vitro -katsemeetod, mida võib teatavatel 
asjaoludel ja teatavate piirangutega kasutada, et klassifitseerida aineid ja segusid silma söövitavaks ja tugevasti ärritavaks (1), (2), (3). Käesoleva 
katsemeetodi puhul määratletakse tugevasti ärritava toimega aineks või 
seguks sellised, mis tekitavad küülikul pärast pealekandmist vähemalt 21 päeva püsiva silmakahjustuse. Katsemeetodit ei peeta küüliku silma  in 
vivo-katse täieliku asendamise jaoks kõlblikuks; BCOP-meetodit soovita ­
takse kasutada astmelise katsetamise strateegia osana õigusliku klassifit ­
seerimise ja märgistamise jaoks konkreetses kasutusvaldkonnas (4), (5). Uuritavad ained ja segud (6) võib klassifitseerida silma söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks ilma edasise katsetamiseta küülikutel. Nega ­
tiivse tulemuse andnud ainet on vaja katsetada küülikul, kasutades järjes ­
tikuste katsete strateegiat, mis on esitatud OECD katsesuunises 405 (7) (käesoleva lisa B.5 peatükk).
 
2. Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada menetlusi, mida kasutatakse 
uuritava aine silma söövitava või tugevasti ärritava toime hindamiseks, 
tuginedes aine omadusele põhjustada veise isoleeritud sarvkesta hägustu ­
mist ja suurendada selle läbilaskvust. Toksilist mõju sarvkestale mõõde ­
takse: i) valguse läbilaskvuse vähenemise (hägususe tekke) ja ii) 
naatriumfluorestseiini läbilaskvuse suurenemise järgi. Uuritava aine klassi ­
fitseerimiseks silma ärritava toime järgi kasutatakse nn  in vitro -ärritavuse 
hinnet (In Vitro  Irritancy Score , IVIS), mille arvutamiseks kombineeri ­
takse pärast uuritava ainega kokkupuudet toimunud sarvkesta hägustumise 
ja läbilaskvuse suurenemise hinnangud.  
3. BCOP-meetodiga on uuritud ka silmaärritajaid, mille tekitatud kahjustused 
paranevad vähem kui 21 päevaga, samuti aineid, mis silmi ei ärrita. Kuid sellistesse kategooriatesse kuuluvate ainete puhul ei ole BCOP-meetodi täpsust ja usaldusväärsust ametlikult hinnatud.
 
4. Mõisted on esitatud 1. liites.  
ALGSED KAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
5. Käesolev katsemeetod põhineb alternatiivmeetodite valideerimise ametite ­
vahelise koordineerimiskomitee ( Interagency Coordinating Committee on 
the Validation of Alternative Methods , ICCVAM) BCOP-meetodi eeskirjal 
(8), mis töötati välja rahvusvahelise valideerimisuuringu alusel (4), (5), (9), millesse andsid oma panuse alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa 
keskus (ECVAM) ja alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskus 
(JaCVAM). Eeskiri põhineb  In Vitro  Teaduste Instituudis (IIVS) saadud 
teabel ja INVITTOXi eeskirjal 124 (10), mida kasutati Euroopa Ühenduse rahastatud BCOP-meetodi eelvalideerimisuuringus 1997–1998. Mõlemad 
eeskirjad põhinevad BCOP-katse eeskirjal, mille esimesena avaldasid 
Gautheron ja kaasautorid (11).
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. Käesoleva katsemeetodi puhul kindlaks tehtud piirangud on seotud vale ­
positiivsete tulemuste kõrge osakaaluga alkoholide ja ketoonide puhul ning 
valenegatiivsete tulemuste kõrge osakaaluga tahkete ainete puhul, mida täheldati valideerimisandmebaasi puhul (vt punkt 44) (5). Kui osutatud kemikaaliklassidesse ja füüsikalistesse aineklassidesse kuuluvad ained 
andmebaasist välja jätta, suureneb BCOP-meetodi täpsus ELi ja USA 
keskkonnaameti (EPA) klassifitseerimissüsteemi ning ka ülemaailmselt ühtlustatud klassifitseerimissüsteemi (GHS) järgi oluliselt (5). Pidades silmas kõnealuse katse eesmärki (teha üksnes kindlaks silmi söövitavad 
või tugevasti ärritavad ained), ei ole valenegatiivsed tulemused väga 
olulised, kuna selliseid aineid uuritakse reguleerivate asutuste nõuetest olenevalt edasi küülikutel või muudes korralikult valideeritud  in vitro - 
katsetes, kasutades järjestikuste katsete strateegiat ja tõendite kaalukuse 
lähenemisviisi. Lisaks ei võimaldanud senine valideerimisandmebaas 
õigesti hinnata mõnesid kemikaali- või tooteklasse (näiteks segusid). Kuid teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist kõigi uuri ­
tava materjali tüüpide, kaasa arvatud segude puhul, kusjuures positiivse 
tulemuse võiks lugeda tõendiks, et tegemist on silma söövitava või tuge ­
vasti ärritava toimega. Alkoholide ja ketoonidega saadud positiivseid tule ­
musi tuleks võtta ettevaatusega, kuna nende puhul on oht mõju ülehinnata.
 
7. Veiste silmade ja sarvkestadega tehtavate toimingute puhul tuleks alati 
järgida katselaboris kohaldatavaid loomadelt saadud materjalide, kaasa arvatud kudede ja koevedelike jne käsitsemise eeskirju ja korda. Soovita ­
takse kasutada üldisi laborite ettevaatusmeetmeid (12).
 
8. Katsemeetodi kasutatavust piirab asjaolu, et kuigi selle puhul võetakse 
arvesse mõnesid silmaga seotud mõjusid, mida on hinnatud küüliku 
silma ärritavuse katses, ja mingil määral ka mõjude tugevust, ei peegelda 
katse silma sidekesta ja vikerkesta kahjustusi. Kuigi BCOP-katsega ei saa põhimõtteliselt hinnata sarvkestakahjustuste pöörduvust, on küüliku silma uuringute alusel soovitatud kasutada sarvkestakahjustuse esialgset sügavust 
pöördumatu ja pöörduva mõju eristamiseks (13). Lõpuks ei võimalda 
BCOP-katse hinnata ainete silmasattumisega kaasneva süsteemse toksili ­
suse võimalust.
 
9. Jätkatakse uuringuid BCOP-katse kasulikkuse ja piirangute edasiseks 
iseloomustamiseks ainete puhul, millel ei ole silma tugevasti ärritavat või ärritavat toimet (vt ka punkt 45). Meetodi kasutajatel palutakse vali ­
deerimisorganisatsioonidele saata näidiseid ja/või andmeid, et ametlikult 
hinnata BCOP-katse võimalikku muud tulevast kasutust, sealhulgas ka 
ainete puhul, millel ei ole silma tugevasti ärritavat või ärritavat toimet.
 
10. Iga labor, kes alustab katsemeetodi kasutamist, peaks oma taseme kont ­
rollimiseks kasutama 2. liites esitatud kemikaale. Labor võib osutatud kemikaale kasutada selleks, et tõendada oma tehnilist pädevust BCOP-katse läbiviimisel, enne kui ta esitab BCOP-katsega saadud andmed 
regulatiivseks ohu klassifitseerimiseks.
 
KATSE PÕHIMÕTE  
11. BCOP-meetod on organotüüpne mudel, mille abil on lühiajaliselt võimalik  
in vitro  säilitada veise sarvkesta normaalseid füsioloogilisi ja biokeemilisi 
funktsioone. Katsemeetodis hinnatakse uuritava aine põhjustatud kahjustust 
sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse muutuste mõõtmisega hägususmõõtja ja nähtava valguse spektromeetri abil. Nende kahe mõõdetud suuruse järgi arvutatakse IVIS, mille alusel uuritavale ainele omistatakse  in vitro  
määratud ärritavuse klassifikatsioonikategooria, et ennustada aine võimet 
ärritada silma  in vivo  (vt otsustamise kriteeriumid).
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. BCOP-meetodi puhul kasutatakse värskelt tapetud veise silmast eraldatud 
sarvkesta. Sarvkesta hägusust mõõdetakse sarvkesta läbinud valgushulga 
mõõtmisega. Läbilaskvuse mõõtmiseks mõõdetakse värvaine naatriumfluo ­
restseiini kogus, mis on läbinud kogu sarvkesta paksuse ja jõudnud sarv ­
kestataguses kambris olevasse lahusesse. Uuritavad ained kantakse sarv ­
kesta epiteliaalsele pinnale sel teel, et need lisatakse sarvkestahoidja 
eespoolsesse kambrisse. 3. liites on esitatud BCOP-katses kasutatava sarv ­
kestahoidja kirjeldus ja skeem. Sarvkestahoidjaid võib osta mitmelt firmalt või ehitada ise.
 
Veisesilmade hankimise allikad, kasutatavate loomade vanus ja 
valimine  
13. Tapamajja saadetavad loomad tapetakse harilikult kas inimtoiduks või 
muul kaubanduslikul eesmärgil. BCOP-katseks sobib üksnes sarvkest, 
mis on võetud tervelt loomalt, keda peetakse sobivaks inimtoidus kasuta ­
miseks. Kuna tapetavad loomad on tõust, vanusest ja soost olenevalt väga erineva kaaluga, ei ole looma soovitatavat kaalu tapmise ajal määratletud.
 
14. Eri vanuses loomade silmade kasutamise korral võivad sarvkesta mõõtmed 
olla erinevad. Sarvkestad, mille horisontaalläbimõõt on üle 30,5 mm ja paksus keskosas vähemalt 1 100 μm, saadakse tavaliselt üle kaheksa aasta 
vanustelt loomadelt, samas kui sarvkestad horisontaalläbimõõduga alla 
28,5 mm ja paksusega keskosas alla 900 μm saadakse tavaliselt loomadelt, 
kelle vanus on alla viie aasta (14). Seepärast kasutatakse tavaliselt silmi, mis on saadud kuni 60 kuu vanustelt loomadelt. Alla 12 kuu vanuste loomade silmi ei ole tavaliselt kasutatud, kuna selliste loomade silmad 
alles arenevad ning sarvkesta paksus ja läbimõõt on oluliselt väiksemad 
kui täiskasvanud loomade silmades. Noorte loomade (vanus 6–12 kuud) sarvkestade kasutamine on siiski lubatav, kuna neil on ka eeliseid, nagu parem kättesaadavus, kitsas vanusevahemik ja väiksem oht, et töötajad 
võivad kokku puutuda veiste spongiformse entsefalopaatiaga (15). Kuna 
oleks kasulik hinnata söövitavate või ärritavate ühendite suhtes avalduva sarvkesta tundlikkuse sõltuvust sarvkesta suurusest või paksusest, palu ­
takse kasutajatel teatada, millises vanuses või millise kaaluga loomadelt 
pärinesid uuringus kasutatud sarvkestad.
 
Silmade kogumine ja toimetamine laborisse  
15. Silmad kogutakse tapamaja töötajate poolt. Mehaaniliste ja muude kahjus ­
tuste miinimumini viimiseks tuleks silmad silmakoopast eemaldada võima ­
likult kiiresti pärast looma surma. Et vältida silmade kokkupuudet ärritust 
põhjustavate ainetega, ei tohiks tapamaja töötajad looma pea loputamisel kasutada detergente.
 
16. Silmad tuleks paigutada sobiva suurusega anumasse nii, et need oleksid 
üleni kaetud Hanksi tasakaalustatud soolalahusega ( Hanks’ Balanced Salt 
Solution , HBSS), ja toimetada laborisse viisil, mille puhul nende kahjus ­
tuse või bakteriaalse saastuse oht oleks minimaalne. Kuna silmi kogutakse 
tapmisprotsessi ajal, võivad need kokku puutuda vere ja muude bioloogi ­
liste ainetega, sealhulgas bakterite ja muude mikroorganismidega. Seepä ­
rast on oluline viia saastuse oht miinimumini (näiteks silmi sisaldava anuma hoidmisega jää peal ning silmade säilitamiseks ja transportimiseks 
kasutatavale Hanksi lahusele antibiootikumide lisamisega (näiteks 
100 RÜ/ml penitsilliini ja 100 mg/ml streptomütsiini)).
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Ajavahemik silmade kogumise ja sarvkestade BCOP-katses kasutamise 
vahel peaks olema võimalikult lühike (tavaliselt kogutakse ja kasutatakse 
samal päeval), kusjuures tuleks tõendada, et katsetulemused ei sõltu konkreetsest ajavahemikust. Tulemuste aluseks on silmade valimise kritee ­
riumid ning positiivse ja negatiivse kontrolli katsetes saadud tulemused. 
Kõik katses kasutatud silmad peavad pärinema ühest ja samast silmade 
rühmast, mis on kogutud ühel konkreetsel päeval.
 
BCOP-katses kasutatavate silmade valimise kriteeriumid  
18. Silmi kontrollitakse peale laborisse saabumist hoolikalt, et neil ei esineks 
defekte, sealhulgas suurenenud hägusust, kriimustusi ja neovaskularisat ­
siooni. Kasutatakse ainult sellistest silmadest pärit sarvkesti, milles 
osutatud defekte ei ole.  
19. Iga sarvkesta kvaliteeti hinnatakse ka katse hilisematel etappidel. Katses ei 
kasutata sarvkesti, mille hägusus pärast esialgset ühetunnilist tasakaalustu ­
mist on üle 7 hägususühiku (märkus: hägususmõõtja kaliibritakse hägu ­
susstandarditega, mida kasutatakse hägususühikute määramiseks, vt 3. 
liide).  
20. Igas katserühmas (uuritav aine, sellega paralleelselt läbiviidavad positiivse 
ja negatiivse kontrolli katsed) kasutatakse vähemalt kolme silma. 
BCOP-katses kasutatakse negatiivse kontrolli katses kolme sarvkesta. 
Kuna kõik sarvkestad eemaldatakse tervelt silmamunalt ja paigutatakse sarvkestakambrisse, võivad üksiku sarvkesta, sealhulgas negatiivse kont ­
rolli katses kasutatud sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse väärtusi mõjutada 
käsitsemisest tekkinud artefaktid. Lisaks kasutatakse negatiivse kontrolli 
katses saadud hägususe ja läbilaskvuse väärtusi  in vitro -ärritavuse 
hinnet (IVIS) arvutamisel uuritava ainega ja positiivse kontrolli katsetes saadud vastavate väärtuste parandamiseks.
 
KATSE KÄIK  
Silmade ettevalmistamine  
21. Defektidest vabad sarvkestad lõigatakse välja koos 2–3 mm laiuse kõva ­
kestaäärega, mis hõlbustab edasist käsitsemist, kusjuures tuleb vältida sarv ­
kesta epiteeli ja endoteeli kahjustamist. Isoleeritud sarvkest kinnitatakse 
spetsiaalsesse sarvkestahoidjasse, millel on eespoolne kamber – selle 
poole on sarvkesta epiteliaalne külg –, ja tagapoolne kamber, mille poole on endoteliaalne külg. Mõlemad kambrid täidetakse kuni ülevoola ­
miseni eelsoojendatud EMEM-lahusega ( Eagle’s Minimum Essential 
Medium ), alustades tagapoolsest kambrist ja hoolitsedes, et kambris ei 
tekiks mulle. Seadet tasakaalustatakse seejärel temperatuuril 32 ± 1 °C vähemalt üks tund, et sarvkest saavutaks tasakaalu ümbritseva keskkon ­
naga ja saavutaks normaalse metaboolse aktiivsuse (sarvkesta pinna ligi ­
kaudne temperatuur  in vivo  on 32 °C).
 
22. Pärast tasakaalustumisperioodi lisatakse mõlemasse kambrisse värsket 
eelsoojendatud EMEM-lahust ja registreeritakse iga sarvkesta hägususe nullväärtus. Sarvkestad, millel on makroskoopilisi koekahjustusi (näiteks kriimustused, pigmentatsioon, neovaskularisatsioon) või mille hägusus on 
suurem kui 7 hägususühikut, jäetakse kõrvale. Arvutatakse kõigi tasakaa ­
lustatud sarvkestade keskmine hägusus. Negatiivse (või lahusti-) kontrolli katseteks valitakse vähemalt kolm sarvkesta, mille hägususe väärtused on kõigi sarvkestade hägususe keskväärtuse lähedal. Ülejäänud sarvkestad 
jagatakse seejärel kahte rühma: uuritava ainega töödeldavad ja positiivse 
kontrolli katse sarvkestad.
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Kuna vee soojusmahtuvus on suurem kui õhul, on inkubeerimise ajal 
võimalik veega saavutada püsivamaid temperatuuritingimusi. Seepärast 
soovitatakse täidetud sarvkestahoidjate termostateerimiseks temperatuuril 32 ± 1 °C kasutada vesivanni. Kuid kasutada võib ka õhktermostaate, võttes vajalikud meetmed temperatuuri stabiilsuse tagamiseks (näiteks 
hoidjate ja lahuste eelsoojendamine).
 
Uuritava aine pealekandmine  
24. Kasutatakse kaht pealekandmismeetodit, millest üks on vedelike ja (tahkete 
või vedelate) pindaktiivsete ainete jaoks ning teine on selliste tahkete ainete jaoks, millel ei ole pindaktiivseid omadusi.
 
25. Vedelikke katsetatakse lahjendamata kujul ning pindaktiivseid aineid 
katsetatakse kontsentratsioonis 10 massiprotsenti 0,9 % naatriumkloriidi 
lahuses, destilleeritud vees või muus lahustis, mille kohta on tõendatud, et see ei avalda kahjustavat mõju katsesüsteemile. Püdelaid aineid, kreeme ja vahasid uuritakse tavaliselt nagu vedelikke. Muu lahjenduskontsentrat ­
siooni kasutamist tuleb veenvalt põhjendada. Sarvkestal lastakse vedelike 
ja pindaktiivsete ainetega kokku puutuda 10 minutit. Muu kokkupuuteaja kasutamise korral tuleb esitada veenev teaduslik põhjendus.
 
26. Tahkeid aineid, millel ei ole pindaktiivseid omadusi, katsetatakse lahuse 
või suspensioonina kontsentratsioonis 20 massiprotsenti 0,9 % naatrium ­
kloriidi lahuses, destilleeritud vees või muus lahustis, mille kohta on tõen ­
datud, et see ei avalda kahjustavat mõju katsesüsteemile. Teatavatel puhkudel ja veenva teadusliku põhjendusega võib tahkeid aineid katsetada ka puhtal kujul, kus uuritav aine kantakse otse sarvkesta pinnale, kasutades 
lahtise kambri meetodit (vt punkt 29). Sarvkest jäetakse tahke ainega 
kokkupuutesse neljaks tunniks, kuid nagu vedelike ja pindaktiivsete ainete puhulgi võib veenva teadusliku põhjendusega kasutada ka muid kokku ­
puuteaegu.
 
27. Pealekandmiseks võib kasutada mitmesuguseid meetodeid, olenevalt uuri ­
tava aine füüsikalisest olekust ja keemilistest omadustest (näiteks tahke 
aine, vedelik, viskoosne või mitteviskoosne vedelik). Oluline on tagada, et uuritav aine korralikult kataks epiteliaalse pinna ja täielikult eemaldataks loputamistega. Mitteviskoosse või väheviskoosse uuritava vedeliku puhul 
kasutatakse tavaliselt suletud kambri meetodit; poolviskoosse ja viskoosse 
vedeliku või tahke puhta aine uurimiseks kasutatakse tavaliselt lahtise kambri meetodit.
 
28. Suletud kambri meetodi kasutamise korral viiakse eespoolsesse kambrisse 
kambri ülaosas asuvate pealekandmisavade kaudu piisav kogus uuritavat 
ainet (750 μl), et see kataks sarvkesta epiteliaalse külje; seejärel avad 
suletakse kokkupuuteajaks korkidega. Oluline on tagada, et iga sarvkest oleks uuritava ainega kokkupuutes vajaliku ajavahemiku jooksul.
 
29. Lahtise kambri meetodi kasutamisel võetakse eespoolse kambri akent 
hoidev rõngas ja klaasaken enne pealekandmist ära. Kontrollaine või 
uuritav aine (750 μl või sarvkesta täielikuks katmiseks piisav kogus) 
kantakse mikropipetiga otse sarvkesta epiteliaalsele pinnale. Kui uuritavat ainet on raske pipeteerida, võib pealekandmise hõlbustamiseks viia uuri ­
tava aine surve all kolbpipetti. Kolbpipeti otsik viiakse tihedalt süstla 
dosaatorotsikusse, nii et ainet saab rõhu all viia kolbpipeti otsikusse. Samaaegselt pipetikolvi tagasitõmbamisega lastakse süstla kolb vabaks. Kui pipetiotsikusse ilmuvad õhumullid, surutakse uuritav aine välja ja 
võtet korratakse, kuni otsik on täidetud ja selles ei ole õhumulle. Vajaduse 
korral võib kasutada tavalist (ilma nõelata) süstalt, kuna sellega saab uuri ­
tava aine ruumala täpselt mõõta, samuti on sellega võimalik ainet hõlpsa ­
mini kanda sarvkesta epiteliaalsele pinnale. Pärast uuritava aine pealekand ­
mist pannakse eespoolse kambri klaasaken tagasi, et taas tekiks suletud 
süsteem.
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Kokkupuutejärgne inkubeerimine  
30. Pärast kokkupuuteaja lõppu eemaldatakse uuritav aine, negatiivse kontrolli 
või positiivse kontrolli aine eespoolsest kambrist ja epiteeli pestakse vähe ­
malt kolm korda (või nii kaua, kuni aine jääke ei ole enam võimalik näha) EMEM-lahusega (millesse on lisatud fenoolpunast). Loputamiseks kasuta ­
takse fenoolpunast sisaldavat lahust, kuna fenoolpunase värvusemuutust 
võib kasutada happeliste või aluseliste materjalide väljapesemise täielik ­
kuse hindamiseks. Sarvkesti pestakse rohkem kui kolm korda, kui fenool ­
punane muudab veel oma värvi (kollane või punakaslilla) või kuni uuri ­
tavat ainet on veel näha. Kui keskkond on uuritavast ainest puhas, lopu ­
tatakse sarvkesti viimast korda (fenoolpunast mittesisaldava) 
EMEM-lahusega. Fenoolpunast mittesisaldavat EMEM-lahust kasutatakse viimaseks loputuseks, et kindlustada fenoolpunase eemaldamine eespool ­
sest kambrist enne hägususe mõõtmist. Seejärel täidetakse eespoolne 
kamber värske (fenoolpunast mittesisaldava) EMEM-lahusega.
 
31. Vedelike ja pindaktiivsete ainete puhul inkubeeritakse sarvkesti pärast 
loputamist veel kaks tundi temperatuuril 32 ± 1 °C. Mõnes olukorras on pikem ajavahemik pärast kokkupuudet kasulik ja seda tuleks iga kord kaaluda. Tahke ainega töödeldud sarvkesti loputatakse põhjalikult pärast 
neljatunnilist kokkupuuteaega, kuid täiendavat inkubeerimist ei ole nende 
puhul vaja.
 
32. Vedeliku ja pindaktiivse aine puhul kokkupuutejärgse inkubatsiooniaja 
lõpus ning tahke, pindaktiivsete omadusteta aine puhul neljatunnise kokku ­
puuteaja lõpus registreeritakse iga sarvkesta hägusus ja läbilaskvus. Samuti 
vaadeldakse iga sarvkesta visuaalselt ja märgitakse üles kõik asjakohased tähelepanekud (näiteks koe lahtikoordumine, uuritava aine jäägid, ebaüht ­
laselt jaotunud hägusus). Sellised tähelepanekud võivad olla olulised, kuna 
osutatud muutused võivad mõjutada hägususmõõtja näitu.
 
Kontrollained  
33. Igas katses tehakse paralleelseid mõõtmisi ka negatiivse või lahusti/ ­
pealekandmisvahendi kontrolli ja positiivse kontrolli ainetega.  
34. BCOP-katse läbiviimisel 100-protsendilise vedela ainega tehakse paralleel ­
selt negatiivse kontrolli katse (näiteks 0,9 % naatriumkloriidi lahuse või 
destilleeritud veega), et kindlaks teha mittespetsiifiliste muutuste esinemine 
testsüsteemis ja saada võrdlusväärtused katse tulemusnäitajate jaoks. Sellega tõendatakse ka, et katsetingimused ise ei põhjusta muutusi, mida ekslikult võiks ärrituseks pidada.
 
35. BCOP-katse läbiviimisel lahjendatud vedeliku, pindaktiivse aine või tahke 
ainega tehakse paralleelselt lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli katse, et 
kindlaks teha mittespetsiifiliste muutuste esinemine testsüsteemis ja saada võrdlusväärtus katse tulemusnäitaja jaoks. Katses võib kasutada ainult sellist lahustit/pealekandmisvahendit, mille kohta on tõendatud, et see ei 
avalda negatiivset mõju katsesüsteemile.
 
36. Igas eksperimendis tehakse paralleelselt ka positiivse kontrolli katse silmi 
teadaolevalt ärritava ainega, et tõendada positiivse tulemuse saamist. Kuna käesolevas katsemeetodis kasutatakse BCOP-katset söövitavate või tuge ­
vasti ärritavate ainete kindlakstegemiseks, peaks positiivse kontrolli aine 
soovitatavalt olema kontrollaine, mis selle katsemeetodi puhul põhjustab 
tugeva mõju. Kuid selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli aine mõju sõltuvust ajast, ei tohiks ärritav mõju olla ülemäära suur.
 
37. Vedela uuritava aine korral on positiivse kontrolli aineks näiteks dimetüül ­
formamiid või 1 % naatriumhüdroksiid. Tahke uuritava aine korral on 
positiivse kontrolli aineks näiteks 20 % (mass/ruumala) imidasool 0,9 % 
naatriumkloriidi lahuses.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Võrdlusained võimaldavad hinnata teatava kemikaali- või tooteklassi uuri ­
mata kemikaali omadust põhjustada silmade ärritust või hinnata teatava 
silmi ärritava aine mõju tugevust teatavas ärritava toime vahemikus.  
Mõõdetavad tulemusnäitajad  
39. Hägusus määratakse sarvkesta läbinud valgushulga mõõtmisega. Sarvkesta 
hägusust mõõdetakse hägususmõõtja abil, millega saadakse hägususe väär ­
tused pidevas skaalas.  
40. Läbilaskvust määratakse värvaine naatriumfluorestseiini hulga järgi, mis 
tungib läbi kõigi sarvkesta kihtide (st sarvkesta välispinnal asuvast epiteelist kuni sisepinnal asuva endoteelini). Sarvkestahoidja eespoolsesse kambrisse, mille poole on sarvkesta epiteliaalne külg, lisatakse 1 ml 
naatriumfluorestseiini lahust (4 mg/ml, kui uuritav aine on vedelik või 
pindaktiivne aine, ja 5 mg/ml, kui see on pindaktiivsete omadusteta tahke aine), samas kui tagapoolne kamber, mille poole on endoteliaalne 
külg, täidetakse värske EMEM-lahusega. Seejärel inkubeeritakse sarvkes ­
tahoidjat horisontaalasendis 90 ± 5 minutit 32 ± 1 °C juures. UV/VIS- spektrofotomeetriliselt mõõdetakse tagapoolsesse kambrisse tunginud naatriumfluorestseiini kogus. 490 nm juures läbiviidavate spektrofoto ­
meetriliste mõõtmiste tulemused registreeritakse optilise tiheduse 
(OD
 490 ) või valguse neeldumise ühikutes pidevas skaalas. Fluorestseiini 
läbilaskvuse väärtused määratakse OD  490 väärtustest, mis määratakse 
nähtava valguse spektrofotomeetriga, kasutades standardseid küvette opti ­
lise tee pikkusega 1 cm.  
41. Selle asemel võib kasutada 96-augulise mikrotiiterplaadi lugejat, kui: i) on 
võimalik näidata, et fluorestseiini määramisel on OD  490 väärtused plaadi ­
lugeja lineaarses piirkonnas, ja ii) 96-augulisel mikrotiiterplaadil kasuta ­
takse õiget fluorestseiiniproovi ruumala, nii et saadakse samad OD  490 
väärtused kui tavalise 1 cm küvetiga mõõtmisel (selleks tuleb auk (tava ­
liselt 360 ml) täita võib-olla ääreni).  
ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmete hindamine  
42. Kui hägususe ja keskmise läbilaskvuse (OD  490 ) väärtused on parandatud 
tausthägususe ja negatiivse kontrolli läbilaskvuse OD  490 väärtustega, tuleks 
iga katserühma keskmised hägususe ja läbilaskvuse OD  490 väärtused asen ­
dada empiiriliselt tuletatud võrrandisse, et arvutada  in vitro -ärritavuse 
hinne (IVIS) iga katserühma jaoks:  
IVIS = keskmine hägususe väärtus + (15 × keskmine läbilaskvuse OD  490 
väärtus)  
Sina jt (16) teatavad, et selline võrrand tuletati laborisiseste ja laboriteva ­
heliste uuringutega. 36 ainega läbiviidud laboritevahelise uuringu andmeid 
töödeldi mitmese korrelatsioonanalüüsi meetodiga, et leida  in vivo  ja in 
vitro  saadud tulemuste seost kõige paremini kirjeldav võrrand. Kõnealuse 
analüüsi viisid läbi kahe ettevõtte teadlased, kes said peaaegu identsed võrrandid.
 
43. Hägususe ja läbilaskvuse väärtusi tuleks ka sõltumatult hinnata, et määrata 
kindlaks, kas uuritav aine põhjustas söövitust või tugevat ärritust ainult 
ühe kaudu kahest tulemusnäitajast (vt otsustamise kriteeriumid).  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Otsustuskriteeriumid  
44. Aine, mille IVIS ≥ 55,1, tunnistatakse söövitavaks või tugevat ärritust 
põhjustavaks aineks. Nagu öeldud punktis 1, kui uuritavat ainet ei klassi ­
fitseerita silma söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks, tuleks aine klassifitseerimiseks ja etiketile kantava teabe saamiseks teha täiendavaid katseid. BCOP-katse üldine täpsus on 79 % (113/143) kuni 81 % 
(119/147), valepositiivsete tulemuste määr on 19 % (20/103) kuni 21 % 
(22/103) ja valenegatiivsete tulemuste määr 16 % (7/43) kuni 25 % (10/40), kui tulemusi võrrelda küüliku silma  in vivo -katse tulemustega, 
mis on klassifitseeritud vastavalt EPA (1), ELi (2) või GHSi (3) klassifit ­
seerimissüsteemidele. Kui teatavatesse kemikaaliklassidesse (alkoholid, 
ketoonid) või füüsikalisse klassi (tahked ained) kuuluvad ained andmebaa ­
sist kõrvale jätta, on ELi, EPA ja GHSi klassifitseerimissüsteemide koha ­
selt BCOP-katse täpsus 87 % (72/83) kuni 92 % (78/85), valepositiivsete 
tulemuste määr on 12 % (7/58) kuni 16 % (9/56) ja valenegatiivsete 
tulemuste määr on 0 % (0/27) kuni 12 % (3/26).
 
45. Isegi kui uuritavat ainet ei klassifitseerita silma söövitavaks või tugevasti 
ärritavaks aineks, võib BCOP-katse siiski olla kasulik koos andmetega, 
mis saadakse küüliku silma  in vivo -katsega või muu korralikult validee ­
ritud  in vitro -katsega, kuna see aitab paremini hinnata BCOP-katse 
meetodi kasulikkust ja puudusi selliste ainete kindlakstegemisel, millel ei 
ole tugevasti ärritavat või ärritavat toimet (töötatakse välja suunisdoku ­
menti silma suhtes toksilisuse määramise  in vitro -katsemeetodite kohta).  
Uuringu nõuetekohasuse kriteeriumid  
46. Katse loetakse nõuetekohaseks, kui positiivne kontroll annab 
IVIS-väärtuse, mis asub kuni kahe standardhälbe kaugusel varasemate uuringute jooksvast keskmisest, mida ajakohastatakse vähemalt iga kolme kuu järel või iga nõuetekohase katse läbiviimise järel laboris, kus 
katseid tehakse harva (harvem kui kord kuus). Negatiivse kontrolli või 
lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli katses saadud hägususe ja läbilas ­
kvuse väärtused peavad olema madalamad kui tausthägususe ja läbilas ­
kvuse väärtuse ülempiirid, mis on varem kindlaks tehtud veise sarvkestade 
puhul, mida on töödeldud negatiivse kontrolli või lahusti/ ­
pealekandmisvahendi kontrolli ainetega.
 
Katseprotokoll  
47. Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave, kui see on uuringu läbivii ­
mise seisukohast asjakohane:  
Uuritavad ained ja kontrollained:  
keemiline nimetus või keemilised nimetused, nagu struktuurikohane 
nimetus, mida kasutab  Chemical Abstracts Service  (CAS), seejärel muud 
nimetused, kui need on teada;  
CASi registreerimisnumber (RN), kui on teada;  
aine puhtus või segu koostis (massiprotsendina), kuivõrd see on teada;  
füüsikalis-keemilised omadused nagu füüsikaline olek, lenduvus, pH, 
püsivus, kemikaaliklass, lahustuvus vees, mis on olulised katse läbiviimise 
seisukohast;  
uuritava aine/kontrollaine töötlemine enne katset, kui see on asjakohane 
(näiteks soojendamine, peenestamine);  
püsivus, kui on teada.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Teave sponsori ja uurimisasutuse kohta:  
sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;  
silmade päritolu kirjeldus (asutus, milles need koguti);  
silmade säilitamis- ja transporditingimused (näiteks silmade kogumise aeg, 
ajavahemik kogumisest katse alguseni, transpordivahend ja temperatuur transpordi ajal, kasutatud antibiootikumid);
 
silmade kogumiseks kasutatud loomade eritunnused, kui on teada (näiteks 
vanus, sugu, looma mass).  
Kasutatud meetodi ja katse-eeskirja põhjendus  
Katsemeetodi õigsus:  
kasutatud katsemeetodi ajast sõltumatu õigsuse (st täpsuse ja usaldusväär ­
suse) tagamise meetod (s.o ained, millega katse läbiviimise oskust teatava ajavahemiku järel kontrollitakse, varasemate negatiivse ja positiivse kont ­
rolli andmete kasutamine).
 
Katse kõlblikkuse kriteeriumid:  
varasematel andmetel põhinevad paralleelse positiivse ja negatiivse kont ­
rolli kõlblike tulemuste vahemikud;  
võimaluse korral varasematel andmetel põhinevad kõlblike paralleelsete 
võrdlustulemuste vahemikud.  
Katse tingimused:  
kasutatud katsesüsteemi kirjeldus;  
kasutatud sarvkestahoidja tüüp;  
hägususe ja läbilaskvuse mõõtmiseks kasutatud mõõteriista (näiteks hägu ­
susmõõtja ja spektrofotomeetri) kaliibrimist käsitlev teave;  
kasutatud veisesarvkesti käsitlev teave, seejuures nende kvaliteetsuse 
kinnitused;  
kasutatud katsemeetodi üksikasjad,  
uuritavate ainete kasutatud kontsentratsioonid;  
kõikide katsemetoodikas tehtud muudatuste kirjeldus;  
viide varasematele mudeli andmetele (näiteks negatiivse ja positiivse kont ­
rolli ained, katse läbiviimise oskuse kontrollimiseks kasutatud ained, võrd ­
lusained);  
kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus.  
Tulemused:  
üksikutes katsetes saadud andmete tabel (näiteks hägususe ja OD  490 väär­
tused ning uuritava aine ja positiivse kontrolli, negatiivse kontrolli ning 
[võimaluse korral] võrdlusaine kontrolli jaoks arvutatud IVIS-väärtused 
tabelina, sealhulgas vajaduse korral paralleelsete üksikute määramiste tule ­
mused, iga katse keskväärtused ja standardhälve);  
muude täheldatud toimete kirjeldus.  
Tulemuste arutelu  
Kokkuvõte  
KIRJANDUS  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B- 
96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 
16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseeri ­
mist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006. ELT 
L 353, 31.12.2008, lk 1.
 
(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Vt
 
[http://www.unece.o rg/trans/danger/publi/ghs /ghs_rev02/02files_e.html]  
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Vt  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irri ­
tants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National 
Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publica ­
tion No. 07-4517. Vt
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(6) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1907/2006, 
18. detsember 2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hinda ­
mist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse 
Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komis ­
joni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 
76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ. ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Vt  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html]  
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In 
Vitro  Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe 
Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on 
the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publica ­
tion No.: 07-4517. Vt
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06- 4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Vt
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. 
Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the 
Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Vt
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays.  Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106-117.  
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  
Can. J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). 
A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl 
Toxicol  26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Vt
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm]  
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Vt  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm] ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
1. liide  
MÕISTED  
Täpsus:  katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. 
See on katsemeetodi kasutuskõlblikkuse üks näitajaid ja üks nn asjakohasuse 
aspekte. Terminit kasutatakse sageli vaheldumisi sõnaga „kooskõla”, mis tähendab katsemeetodiga saadud õigete tulemuste osakaalu.
 
Võrdlusaine:  aine, mida kasutatakse standardina võrdlemiseks uuritava ainega. 
Võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne 
tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega; iii) teadao ­
levad füüsikalised ja keemilised omadused; iv) täiendavad andmed teadaolevate mõjude kohta ja v) teadaolev mõjusus soovitavas mõju tugevuse vahemikus.
 
Sarvkest:  silmamuna eespoolses osas asuv läbipaistev kest, mis katab vikerkesta 
ja silmaava ning laseb valgusel tungida silma sisse.  
Sarvkesta hägusus:  suurus, millega väljendatakse pärast sarvkesta kokkupuudet 
uuritava ainega toimuva hägustumise määra. Sarvkesta hägususe suurenemine näitab sarvkesta kahjustuse suurust. Hägusust võib hinnata subjektiivselt, nagu 
tehakse Draize küülikusilma katses, või objektiivselt aparaadiga, näiteks hägu ­
susmõõtjaga.
 
Sarvkesta läbilaskvus:  sarvkesta epiteeli kahjustuse mõõtmine värvaine 
naatriumfluorestseiini koguse järgi, mis tungib läbi kõigi sarvkesta kihtide.  
USA keskkonnaameti (EPA) I kategooria:  söövitus (silmakoe pöördumatu 
kahjustus) või sarvkesta mõjutus või ärritus, mis püsib rohkem kui 21 päeva (1).  
ELi kategooria R41:  koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline näge ­
mislangus pärast seda, kui uuritavat ainet on kantud silma eespoolsele pinnale ja mõju ei ole täielikult pöörduv 21 päeva jooksul pärast aine pealekandmist (2).
 
Valenegatiivsete vastuste määr:  kõikide selliste positiivsete ainete osakaal, mis 
katsemeetodi alusel on ekslikult tunnistatud negatiivseks. See on üks katsemee ­
todi kasutuskõlblikkuse näitaja.  
Valepositiivsete vastuste määr:  kõikide selliste negatiivsete ainete osakaal, mis 
katsemeetodi alusel on ekslikult tunnistatud positiivseks. See on üks katsemeetodi kasutuskõlblikkuse näitaja.
 
GHS ( Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemi ­
cals – kemikaalide ühtne ülemaailmne klassifitseerimis- ja märgistamissüs ­
teem):  süsteem, milles kemikaalid (ained ja segud) on klassifitseeritud vastavalt 
nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud 
tüübile ja -tasemele ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu pikto ­
grammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda edasi inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ja 
keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku mõju 
kohta (3).
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHSi 1. kategooria:  koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline näge ­
mislangus pärast seda, kui uuritavat ainet on kantud silma eespoolsele pinnale ja 
osutatud mõju ei ole täielikult pöörduv 21 päeva jooksul pärast aine pealekand ­
mist (3).  
Oht:  mõjuri või olukorra loomupärane omadus tekitada kahjustust, kui organism, 
süsteem või (ala-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.  
In vitro -ärritavuse hinne (In Vitro  Irritancy Score , IVIS):  BCOP-katses kasu ­
tatav katseliselt tuletatud valem, millega iga katserühma keskmise hägususe ja 
keskmise läbilaskvuse väärtused ühendatakse üheks kõnealusele katserühmale 
avaldatud mõju iseloomustavaks  in vitro -hindeks (punktisummaks). IVIS = kesk ­
mine hägususe väärtus + (15 × keskmine läbilaskvuse väärtus)  
Negatiivne kontroll:  uuritava ainega töötlemata paralleelproov, mis sisaldab 
kõiki katsesüsteemi komponente. Sellist proovi töödeldakse koos proovidega, mida mõjutatakse uuritava ainega, ja koos muude kontrollproovidega, et kont ­
rollida, ega lahusti ei mõjuta katsesüsteemi.
 
Ärritust mittepõhjustav aine:  aine, mida ei ole klassifitseeritud EPA I, II ega III 
kategooriasse, ELi kategooriatesse R41 või R36 ega GHSi 1., 2.A või 2.B kategooriasse kuuluvaks silmaärritajaks.
 
Silma söövitav aine:  a) aine, mis põhjustab silma kudede pöördumatut kahjus ­
tust; b) aine, mis on klassifitseeritud GHSi 1. kategooriasse, EPA I kategooriasse või ELi kategooriasse R41 kuuluvaks silma ärritavaks aineks (1), (2), (3).
 
Silma ärritav aine:  a) aine, mis põhjustab pärast silma eespoolsele pinnale 
kandmist silmas pöörduva muutuse; b) aine, mis on klassifitseeritud EPA II või III kategooriasse, ELi kategooriasse R36 või GHSi 2.A või 2.B kategooriasse 
kuuluvaks silma ärritavaks aineks (1), (2), (3).
 
Silma tugevasti ärritav aine:  a) aine, mis põhjustab pärast silma eespoolsele 
pinnale kandmist silmas koekahjustuse, mis ei parane 21 päeva jooksul, või 
põhjustab tugeva füüsilise nägemislanguse; b) aine, mis on klassifitseeritud 
GHSi 1. kategooriasse, EPA I kategooriasse või ELi kategooriasse R41 kuulu ­
vaks silma ärritavaks aineks (1), (2), (3).  
Hägususmõõtja:  aparaat sarvkesta hägususe mõõtmiseks sarvkesta läbinud 
valguse hulga kvantitatiivse hindamise alusel. Tüüpilisel seadmel on kaks mõõt ­
misruumi, millest kummalgi on oma valgusallikas ja fotoelement. Üht ruumi kasutatakse töödeldud sarvkesta mõõtmiseks; teine on aparaadi kalibreerimiseks 
ja nulliviimiseks. Halogeenlambi valgus suunatakse läbi võrdlusruumi (tühi 
kamber, millel ei ole aknaid ja milles ei ole vedelikku) fotoelemendile ja võrrel ­
dakse valgusega, mis on fotoelemendile suunatud läbi uuritava sarvkestaga ruumi. Fotoelementide andmete võrdlemisest saadakse valguse läbilaskvuse 
erinevus ja hägususe numbriline väärtus esitatakse digitaalsel näidikul.
 
Positiivne kontroll:  paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente 
ja mida töödeldakse ainega, mis teadaolevalt põhjustab positiivse tulemuse. 
Selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli aine mõju sõltuvust 
ajast, ei tohiks mõju olla ülemäära suur.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Usaldusväärsus:  sellega mõõdetakse katsemeetodi tulemuste reprodutseeritavust, 
kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja eri 
laborites pikema aja jooksul. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise reprodutseeritavuse ja laborisisese korratavuse arvutamisega.
 
Lahusti/pealekandmisvahendi kontroll:  uuritava ainega töötlemata proov, mis 
sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente, sealhulgas lahustit või pealekandmis ­
vahendit; sellist proovi töödeldakse sarnaselt uuritava ainega töödeldud proovile 
ja muudele kontrollproovidele, et määrata kindlaks samas lahustis või pealekand ­
misvahendis lahustatud uuritava ainega töödeldud proovide nulljoone tase. Kui paralleelselt katsetatakse negatiivse kontrolli proovi, siis näitab lahusti/ ­
pealekandmisvahendi proov ka seda, kas lahusti või pealekandmisvahend 
mõjutab katsesüsteemi.
 
Astmeline katsetamine:  samm-sammulise katsetamise strateegia, milles enne 
järgmisse etappi minekut vaadatakse kindlaksmääratud korras läbi kogu uuritava aine kohta olemasolev teave, kasutades igas etapis tõendite kaalukuse menetlust, et määrata kindlaks, kas on piisavalt teavet riskirühma klassifitseerimise otsuse 
tegemiseks. Kui olemasoleva teabe põhjal saab uuritava aine ärritavate omaduste 
kohta otsuse teha, ei ole edasisi katseid vaja teha. Kui olemasoleva teabe põhjal ei saa teha otsust uuritava aine ärritavate omaduste kohta, jätkatakse samm-sammult järjestikuste loomkatsete tegemist, kuni aine saab üheselt klassi ­
fitseerida.
 
Valideeritud katsemeetod:  katsemeetod, mille valideerimisuuringud on lõpule 
viidud, st on määratud selle asjakohasus (sealhulgas täpsus) ja usaldusväärsus konkreetse eesmärgi puhul. Oluline on märkida, et valideeritud katsemeetod ei tarvitse olla piisavalt kasutuskõlblik täpsuse ja usaldusväärsuse osas, et seda 
saaks lugeda vastuvõetavaks konkreetse eesmärgi puhul.
 
Tõendusmaterjali kaalukuse hindamine:  protsess, milles kaalutakse mitmesu ­
guste andmete tugevaid ja nõrku külgi, et jõuda otsuseni aine võimaliku ohtlik ­
kuse kohta ja toetada sellist otsust.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
2. liide  
Ained, millega kontrollitakse BCOP-meetodi valdamist  
Enne kõnealuse meetodiga seotud katsemeetodi tavakasutusse võtmist võivad 
laborid soovida tõendada meetodi tehnilist valdamist ja määrata selleks õigesti 
tabelis 1 soovitatud 10 aine klassifikatsioon söövitava toime järgi. Kõnealused ained on valitud nii, et oleks esindatud silma paikse ärrituse/söövituse põhjusta ­
mise kogu skaala, mis põhineb küüliku silmaga  in vivo -katsetes (TG 405) saadud 
tulemustel (st 1., 2.A ja 2.B kategooria või ÜRO GHSi kohaselt „klassifitseeri ­
mata ja märgiseta”) (3), (7). Pidades aga silmas kõnealuste katsete valideeritud kasulikkust (tehakse kindlaks vaid silma söövitavad või tugevasti ärritavad ained), on meetodi valdamise tõendamisel tegemist vaid kahesuguste tulemustega 
klassifitseerimise seisukohast (söövitav / tugevasti ärritav või mittesöövitav / 
silma mitte tugevasti ärritav). Muud valikukriteeriumid olid järgmised: ained peaksid olema kaubanduses saadaval, nende kohta peaksid olema kvaliteetsed  
in vivo -võrdlusandmed ning on kvaliteetsed andmed, mis on määratud kahe  in 
vitro -meetodiga, mille jaoks on välja töötatud katse läbiviimise suunised. Seepä ­
rast valiti ärritavad ained 122 võrdlusaine nimestikust, mida ICCVAM soovitab kasutada silma suhtes toksilisuse  in vitro -katsete valideerimiseks (vt H liide: 
ICCVAMi soovitatud võrdlusained) (5). Võrdlusandmeid on esitatud ka 
ICCVAMi taustülevaatedokumentides BCOP-katse ja isoleeritud kanasilma katse ( Isolated Chicken Eye test method , ICE-katse) jaoks (17), (18).
 
Tabel 1  
Soovitatud ained BCOP-meetodi tehnilise valdamise tõendamiseks  
Aine CASi nr Ühendiklass (  1 ) Füüsikaline 
olek In vivo -klassifi­
katsioon (  2 ) In vitro -klassifikatsioon (  3 ) 
Bensalkoonium ­
kloriid (5 %) 8001-54-5 Ooniumühend Vedel 1. kate ­
gooria Söövitav/tugevasti ärritav 
Kloorheksidiin 55-56-1 Amiin, amidiin Tahke 1. kate ­
gooria Söövitav/tugevasti ärritav 
Dibensoüül-L- 
viinhape 2743-38-6 Karboksüülhappe 
ester Tahke 1. kate ­
gooria Söövitav/tugevasti ärritav 
Imidasool 288-32-4 Heterotsükkel Tahke 1. kate ­
gooria Söövitav/tugevasti ärritav 
Trikloroäädikhape 
(30 %) 76-03-9 Karboksüülhape Vedel 1. kate ­
gooria Söövitav/tugevasti ärritav 
2,6-Dikloroben ­
soüülkloriid 4659-45-4 Atsüülhaliid Vedel 2.A kate ­
gooria Mittesöövitav/mitte tugevasti 
ärritav 
Etüül-2-metüülat ­
seto-atsetaat 609-14-3 Ketoon, ester Vedel 2.B kate ­
gooria Mittesöövitav/mitte tugevasti 
ärritav 
Ammooniumni ­
traat 6484-52-2 Anorgaaniline 
sool Tahke 2.A kate ­
gooria Mittesöövitav/mitte tugevasti 
ärritav  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Aine CASi nr Ühendiklass (  1 ) Füüsikaline 
olek In vivo -klassifi­
katsioon (  2 ) In vitro -klassifikatsioon (  3 ) 
Glütserool 56-81-5 Alkohol Vedel Märgiseta Mittesöövitav/mitte tugevasti 
ärritav  
n-heksaan 110-54-3 Atsükliline 
süsivesinik Vedel Märgiseta Mittesöövitav/mitte tugevasti 
ärritav  
Lühend: CASi nr –  Chemical Abstracts Service 'i number. 
( 1 ) Kemikaaliklass on igale uuritavale ainele omistatud standardse klassifitseerimisskeemi kohaselt, mis põhineb USA meditsiinira a­
matukogu meditsiiniteemade klassifitseerimissüsteemil (vt http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Vastavalt küüliku silma  in vivo -katse (OECD TG 405) tulemustele ja kasutades ÜRO GHSi süsteemi (3), (7). 
( 3 ) Vastavalt BCOP-katse ja ICE-katse tulemustele.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
3. liide  
BCOP-KATSES KASUTATAV SARVKESTAHOIDJA  
1. BCOP-katses kasutatav sarvkestahoidja valmistatakse inertsest materjalist 
(näiteks polüpropüleenist). Sarvkestahoidjal on kaks poolt (eespoolne ja 
tagapoolne kamber) ja nendes on sarnased silindrilised sisekambrid. Kummagi kambri ruumala on 5 ml ja kumbki kamber lõpeb klaasaknaga, 
läbi mille tehakse hägususe mõõtmisi. Kummagi sisekambri diameeter on 
1,7 cm ja pikkus 2,2 cm (
 1 ). Tagapoolsele kambrile asetatud rõngastihendit 
kasutatakse lekete ärahoidmiseks. Sarvkest paigutatakse endoteliaalse küljega tagapoolse kambri rõngastihendile ja eespoolne kamber paigutatakse 
sarvkesta epiteliaalsele küljele. Kambreid hoiavad koos kolm roostevabast 
terasest kruvi, mis asuvad kambri välisservadel. Kummagi kambri otsas on klaasaken, mida on võimalik eemaldada, et võimaldada hõlpsat juurdepääsu sarvkestale. Üks rõngastihend on ka klaasakna ja kambri vahel, et vältida 
lekkimist. Kaks ava kummagi kambri ülemisel küljel võimaldavad lisada ja 
eemaldada lahustit ja uuritavat ainet. Töötlemise ja inkubeerimise ajal on avad suletud kummikorkidega.
 
Sõnastik  
Glass disc: klaasketas  
PTFE-O-ring: polütetrafluoroetüleenist rõngastihend  
Refill: täitmisava  
Hanger: hoidja  
Cap: kork  
Nut: kinnitusrõngas  
O-ring: rõngastihend  
Posterior compartment: tagapoolne kamber  
Anterior compartment: eespoolne kamber  
Fixing screws: kinnituskruvid  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Esitatud mõõtmetega sarvkestahoidjat kasutatakse 12–60 kuu vanuse lehma sarvkesta 
puhul. Kui kasutatakse 6–12 kuu vanuse looma sarvkesta, peaks sarvkestahoidja olema 
projekteeritud nii, et kummagi kambri ruumala on 4 ml ning kummagi sisekambri 
diameeter on 1,5 cm ja pikkus on 2,2 cm. Uue kujundusega sarvkestahoidja puhul on 
väga oluline, et ainega kokkupuutuva sarvkestaosa pindala ja tagapoolse kambri ruumala 
suhe oleks samasugune kui traditsioonilise sarvkestahoidja puhul. Selle tagamine on 
oluline selleks, et määrata õigesti läbilaskvuse väärtused, mida kasutatakse 
IVIS-väärtuse arvutamiseks esitatud valemi järgi.
 HÄGUSUSMÕÕTJA  
2. Hägususmõõtja on seade valguse läbilaskvuse mõõtmiseks. Halogeenlambi 
valgus suunatakse läbi võrdlusruumi (tühi kamber, millel ei ole aknaid ja 
milles ei ole vedelikku) fotoelemendile ja võrreldakse valgusega, mis on fotoelemendile suunatud läbi uuritava sarvkestaga ruumi. Fotoelementide andmete võrdlemisest saadakse valguse läbilaskvuse erinevus ja hägususe 
numbriline väärtus esitatakse digitaalsel näidikul. Tehakse kindlaks hägusu ­
sühikud.
 
3. Hägususmõõtja peaks tagama lineaarse sõltuvuse kogu hägususe lugemite 
vahemikus, mis ulatub ennustusmudelis kirjeldatud eri klassifikatsioonides kasutatavate kriitiliste väärtusteni (st kuni kriitiliste väärtusteni, mille alusel 
aine tunnistatakse söövitavaks või tugevasti ärritavaks). Lineaarsete ja 
täpsete lugemite saamiseks kuni 78-80 hägususühikuni on hägususmõõtja vaja kaliibrida, kasutades rida kaliibrimisfiltreid. Kaliibrimisfiltrid (hägusad polüesterlehed) pannakse kaliibrimiskambrisse (sarvkestahoidja, mis on 
projekteeritud kaliibrimisfiltri hoidmiseks) ja võetakse hägususmõõtja 
lugem. Kaliibrimiskamber on projekteeritud nii, et see hoiaks kaliibrimisfil ­
treid ligikaudu samas kohas valgusallika ja fotoelemendi vahel, milles asub sarvkest hägususe mõõtmise ajal. Hägususmõõtja kaliibritakse esmalt hägu ­
suse lugemile 0, kasutades kaliibrimiskambrit ilma kaliibrimisfiltrita. 
Seejärel paigutatakse kaliibrimiskambrisse ükshaaval kolm eri kaliibrimisfil ­
trit ja mõõdetakse hägusus. Kaliibrimisfiltritega 1, 2 ja 3 tuleks saada nende ettenähtud hägususväärtuste lugemid, vastavalt 75, 150 ja 225 hägususe 
ühikut ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B.48.  ISOLEERITUD KANASILMA MEETOD SILMA SÖÖVITAVATE 
JA TUGEVALT ÄRRITAVATE AINETE KINDLAKSTEGE ­
MISEKS  
SISSEJUHATUS  
1. Isoleeritud kanasilma meetod ( Isolated Chicken Eye , ICE) on  in vitro - 
katsemeetod, mida võib teatavatel asjaoludel ja teatavate piirangutega kasutada, et klassifitseerida aineid ja segusid silma söövitavaks ja tugevasti 
ärritavaks (1), (2), (3). Käesolevas katse-meetodis on tugevasti ärritava 
toimega aineks või seguks määratletud sellised, mis tekitavad küülikul pärast pealekandmist vähemalt 21 päeva püsiva silmakahjustuse. Katse ­
meetodit ei peeta küüliku silma  in vivo -katse täieliku asendamise jaoks 
kõlblikuks; ICE-meetodit soovitatakse kasutada korrastatud astmelise 
katsetamise strateegia osana õigusliku klassifitseerimise ja märgistamise jaoks konkreetses kasutusvaldkonnas (4), (5). Käesoleva katse kohaselt positiivseid uuritavaid aineid ja segusid (6) võib klassifitseerida silma 
söövitavaks või tugevasti ärritavaks aineks ilma edasise katsetamiseta 
küülikutel. Negatiivse tulemuse andnud ainet on vaja katsetada küülikul, kasutades järjestikuste katsete strateegiat, mis on esitatud OECD katsesuu ­
nises 405 (7) (käesoleva lisa B.5 peatükk).
 
2. Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada menetlusi, mida kasutatakse 
uuritava aine võimaliku silma söövitava või tugevasti ärritava toime hinda ­
miseks, tuginedes aine omadusele mõjuda toksiliselt värskelt eraldatud kanasilmale. Toksilist mõju sarvkestale mõõdetakse: i) hägususe kvalita ­
tiivse hindamisega, ii) epiteelikahjustuse kvalitatiivse hindamisega, kasu ­
tades fluorestseiini kandmist silma (fluorestseiini peetumine silmas), iii) 
sarvkesta paksuse suurenemise (turse) mõõtmisega ja iv) makroskoopilise morfoloogilise pinnakahjustuse kvalitatiivse hindamisega. Sarvkesta hägu ­
sust, turset ja kahjustust hinnatakse pärast uuritava ainega kokkupuutumist 
individuaalselt ja seejärel andmed koondatakse silma ärritava toime klas ­
sifitseerimiseks.
 
3. ICE-meetodiga on uuritud ka silmaärritajaid, mille tekitatud kahjustused 
paranevad vähem kui 21 päevaga, samuti aineid, mis silmi ei ärrita. Kuid sellistesse kategooriatesse kuuluvate ainete puhul ei ole ICE-meetodi 
täpsust ja usaldusväärsust ametlikult hinnatud.
 
4. Mõisted on esitatud 1. liites.  
ALGSED KAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
5. Käesolev katsemeetod põhineb alternatiivmeetodite valideerimise ametite ­
vahelise koordineerimiskomitee ( Interagency Coordinating Committee on 
the Validation of Alternative Methods , ICCVAM) ICE-meetodi eeskirjal 
(8), mis töötati välja rahvusvahelise valideerimisuuringu alusel (4), (5), (9), millesse andsid oma panuse alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa 
keskus ( European Centre for the Validation of Alternative Methods , 
ECVAM), alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskus ( Japanese 
Center for the Validation of Alternative Methods , JaCVAM) ja Madal ­
maade uurimisinstituudi TNO toksikoloogia ja rakendusfarmakoloogia 
elukvaliteedi osakond. Eeskirja aluseks on avaldatud andmetest saadud 
teave, samuti TNOs praegu kasutatav eeskiri (10), (11), (12), (13), (14).
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. Käesoleva meetodi kindlakstehtud piirangud on seotud alkoholide valepo ­
sitiivsete tulemuste ning tahkete ainete ja pindaktiivsete ainete valenega ­
tiivsete tulemuste määraga (vt punkt 47) (4). Kui osutatud kemikaaliklas ­
sidesse ja füüsikalistesse aineklassidesse kuuluvad ained andmebaasist välja jätta, suureneb ICE-meetodi täpsus ELi ja USA 
keskkonnaameti (EPA) klassifitseerimissüsteemi ning ka ülemaailmselt 
ühtlustatud klassifitseerimissüsteemi (GHS) järgi oluliselt (4). Pidades silmas kõnealuse katse eesmärki (teha üksnes kindlaks silmi söövitavad või tugevasti ärritavad ained), ei ole valenegatiivsed tulemused väga 
olulised, kuna selliseid aineid uuritakse reguleerivate asutuste nõuetest 
olenevalt edasi küülikutel või muudes korralikult valideeritud  in vitro - 
katsetes, kasutades järjestikuste katsete strateegiat ja tõendite kaalukuse lähenemisviisi. Lisaks ei võimaldanud senine valideerimisandmebaas 
õigesti hinnata mõnesid kemikaali- või tooteklasse (näiteks segusid). 
Kuid teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist kõigi uuri ­
tava materjali tüüpide, kaasa arvatud segude puhul, kusjuures positiivse tulemuse võiks lugeda tõendiks, et tegemist on silma söövitava või tuge ­
vasti ärritava toimega. Alkoholidega saadud positiivseid tulemusi tuleks 
võtta ettevaatusega, kuna nende puhul on oht mõju üle hinnata.
 
7. Kanasilmadega tehtavate toimingute puhul tuleks alati järgida katselaboris 
kohaldatavaid inimestelt ja loomadelt saadud materjalide, kaasa arvatud kudede ja koevedelike jne käsitsemise eeskirju ja korda. Soovitatakse 
kasutada üldisi laborite ettevaatusmeetmeid (15).
 
8. Katsemeetodi kasutatavust piirab asjaolu, et kuigi selle puhul võetakse 
arvesse mõnesid silmaga seotud mõjusid, mida on hinnatud küüliku silma ärritavuse katses, ja mingil määral ka mõjude tugevust, ei peegelda katse silma sidekesta ja vikerkesta kahjustusi. Kuigi ICE-katsega ei saa 
põhimõtteliselt hinnata sarvkestakahjustuste pöörduvust, on küüliku silma 
uuringute alusel soovitatud kasutada sarvkestakahjustuse esialgset sügavust pöördumatu ja pöörduva mõju eristamiseks (16). Lõpuks ei võimalda ICE-katse hinnata ainete silmasattumisega kaasneva süsteemse toksilisuse 
võimalust.
 
9. Jätkatakse uuringuid ICE-katse kasulikkuse ja piirangute edasiseks iseloo ­
mustamiseks ainete puhul, millel ei ole silma tugevasti ärritavat või ärri ­
tavat toimet (vt ka punkt 48). Meetodi kasutajatel palutakse valideerimi ­
sorganisatsioonidele saata näidiseid ja/või andmeid, et ametlikult hinnata 
ICE-katse võimalikku muud tulevast kasutust, sealhulgas ka ainete puhul, millel ei ole silma tugevasti ärritavat või ärritavat toimet.
 
10. Iga labor, kes alustab katsemeetodi kasutamist, peaks oma taseme kont ­
rollimiseks kasutama 2. liites esitatud kemikaale. Labor võib osutatud 
kemikaale kasutada selleks, et tõendada oma tehnilist pädevust ICE-katse 
läbiviimisel, enne kui ta esitab ICE-katsega saadud andmed regulatiivseks ohu klassifitseerimiseks.
 
KATSE PÕHIMÕTE  
11. ICE-meetod on organotüüpne mudel, mille abil on lühiajaliselt võimalik 
säilitada kanasilma  in vitro.  Katsemeetodis hinnatakse uuritava aine 
põhjustatud kahjustust sarvkesta turse, hägususe tekkimise ja fluorestseiini 
peetumise mõõtmisega. Viimase kahe näitaja puhul on tegemist kvalita ­
tiivse hindamisega, sarvkesta turse analüüsi puhul on ette nähtud kvanti ­
tatiivne hindamine. Iga mõõtmise tulemus teisendatakse kas kvantitatiiv ­
seks punktisummaks (hindeks), mida kasutatakse üldise ärritavusnäitaja 
arvutamiseks, või omistatakse sellele kvalitatiivne kategooria, mida kasu ­
tatakse silma söövitava ja tugevasti ärritava toime  in vitro -klassifikatsiooni 
omistamiseks. Kumbagi neist tulemustest võib kasutada selleks, et ennus ­
tada aine võimet söövitada või tugevasti ärritada silma  in vivo  (vt otsusta ­
mise kriteeriumid).  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Kanasilmade hankimise allikad, kasutatavate kanade vanus  
12. Kõnealuseks katseks on kasutatud silmi, mis on kogutud kanadelt tapa ­
majas, kus need tapetakse inimtoiduks; see kõrvaldab katseloomade kasu ­
tamise vajaduse. Kasutatakse üksnes silmi, mis on võetud tervetelt lindu ­
delt, keda peetakse sobivaks inimtoidus kasutamiseks.  
13. Kuigi kanade sobivaima vanuse hindamiseks ei ole läbi viidud kontrollitud 
uuringut, on tavaliselt kasutatud kõnealuseks katseks tapamajas tapetud kevadisi kanu (st vanus umbes 7 nädalat, kaal 1,5–2,5 kg).
 
Silmade kogumine ja toimetamine laborisse  
14. Pead tuleks kõrvaldada kohe pärast kanade uimastamist, tavaliselt elektri ­
löögiga, ja kõri läbilõikamist, et veri välja lasta. Labor peaks olema koha ­
liku tapamaja lähedal, nii et kanade pead saaks kiiresti toimetada tapama ­
jast laborisse, et viia miinimumini lagunemisest ja/või bakteritega saastu ­
misest tingitud kahjustused. Ajavahemik kanapeade kogumise ja silmade ICE-katses kasutamise vahel peaks olema võimalikult lühike (tavaliselt 
kuni kaks tundi), kusjuures tuleks tõendada, et katsetulemused ei sõltu 
konkreetsest ajavahemikust. Tulemuste aluseks on silmade valimise kritee ­
riumid ning positiivse ja negatiivse kontrolli katsetes saadud tulemused. Kõik katses kasutatud silmad peavad pärinema ühest ja samast silmade 
rühmast, mis on kogutud ühel konkreetsel päeval.
 
15. Kuna silmad eraldatakse laboris, veetakse kanade pead tervelt tapamajast 
laborisse toatemperatuuril plastkastides, milles niiskuse suurendamiseks on 
isotoonilise keedusoolalahusega niisutatud käterätid.  
ICE-katses kasutatavate silmade valimise kriteeriumid  
16. Silmad, millel kohe peale silmakoopast väljavõtmist on kõrge fluorestseii ­
niga värvumise näitaja (üle 0,5) või sarvkesta hägususe hinne (üle 0,5), jäetakse kõrvale.
 
17. Igas katserühmas ja paralleelselt läbiviidavas positiivse kontrolli katses 
kasutatakse vähemalt kolme silma. Negatiivse kontrolli rühmas või lahusti kontrollis (kui kasutatakse muud lahustit kui keedusoolalahust) kasutatakse 
vähemalt ühte silma.
 
KATSE KÄIK  
Silmade ettevalmistamine  
18. Silmalaud lõigatakse hoolikalt ära, vältides sarvkesta vigastamist. Sarv ­
kesta kvaliteeti kontrollitakse kiiresti ühe tilga 2 % (mass/ruumala) naatriumfluorestseiini lahusega, mis kantakse sarvkesta pinnale mõneks sekundiks ja loputatakse siis maha isotoonilise keedusoolalahusega. Fluo ­
restseiiniga töödeldud silmi vaadeldakse siis pilulamp-mikroskoobiga, et 
teha kindlaks, et sarvkest on vigastamata (st fluorestseiini peetumine ja sarvkesta hägususe hinne on ≤ 0,5).
 
19. Kui sarvkest on vigastamata, jätkatakse silma väljalõikamist silmakoopast, 
vältides sarvkesta vigastamist. Silmamuna tõmmatakse silmakoopast välja, hoides pilkekilet kindlalt kirurgitangidega, ja silmalihased lõigatakse läbi 
painutatud nüriotsaliste kääridega. Oluline on vältida sarvkesta vigastust 
liigse rõhu tõttu (st kokkusurumisest tingitud artefakte).
 
20. Kui silm on silmakoopast välja tõmmatud, tuleb silmamuna külge jätta 
nähtav osa silmanärvi. Kui silm on silmakoopast välja võetud, pannakse 
see filterpaberile ning lõigatakse ära pilkekile ja muud sidekoelised osad.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Väljavõetud silm paigutatakse roostevabast terasest silmahoidja klambri 
vahele, nii et sarvkest on vertikaalasendis. Silmahoidja pannakse seejärel 
tilgutusaparaadi (superfusiooniaparaadi) kambrisse (16). Silmahoidjad tuleb tilgutusaparaadis paigutada nii, et isotooniline keedusoolalahus niisu ­
taks kogu sarvkesta. Tilgutusaparaadi kambrites tuleks hoida temperatuuri 
32 ± 1,5 °C. 3. liites on esitatud tüüpilise tilgutusaparaadi ja silmahoidjate 
skeem; sellise aparaadi võib osta või valmistada ise. Aparaati võib muuta vastavalt iga labori vajadustele (näiteks vajaliku arvu silmade paigutami ­
seks aparaati).
 
22. Pärast tilgutusaparaati paigutamist kontrollitakse silmi uuesti 
pilulamp-mikroskoobiga, et nende hulgas ei oleks väljavõtmisega vigas ­
tatud silmi. Samal ajal mõõdetakse sarvkesta tipus sarvkesta paksus, kasu ­
tades pilulamp-mikroskoobi sügavusmõõtmisseadet. Asendatakse kõik järgmiste tunnustega silmad: i) fluorestseiini peetumise hinne üle 0,5, ii) sarvkesta hägusus üle 0,5 või iii) omavad muid kahjustuse tunnuseid. 
Osutatud kriteeriumide põhjal kõrvaldamata jäetud silmade hulgast kõrval ­
datakse veel silmad, mille sarvkesta paksus kaldub üle 10 % kõrvale kõikide silmade kohta arvutatud keskväärtusest. Töötajad peaksid arves ­
tama, et pilu erineva laiuse korral võib pilulamp-mikroskoop anda tule ­
museks erinevaid sarvkesta paksuse väärtusi. Pilu laiuseks tuleb seada 
0,095 mm.
 
23. Kui kõik silmad on üle vaadatud ja kõlblikuks tunnistatud, inkubeeritakse 
neid umbes 45–60 minutit, et need saavutaksid katsesüsteemiga tasakaalu, enne kui neile uuritav aine peale kantakse. Pärast tasakaalustumist mõõde ­
takse sarvkesta paksuse ja hägususe võrdlustase (0-tase), mis jääb baasjoo ­
neks (väärtused ajahetkel 0). Väljalõikamise ajal määratud fluorestseiini peetumise hinnet kasutatakse kõnealuse tulemusnäitaja baasjoonena.
 
Uuritava aine pealekandmine  
24. Kohe peale võrdlustaseme (0-taseme) mõõtmist võetakse silm (koos silma ­
hoidjaga) tilgutusaparaadist välja, pannakse horisontaalasendisse ja uuritav 
aine kantakse sarvkestale.  
25. Vedelaid uuritavaid aineid mõõdetakse tavaliselt lahjendamata kujul, kuid 
neid võib ka lahjendada, kui seda peetakse vajalikuks (näiteks kui see on 
osa katse korraldusest). Eelistatud lahusti ainete lahjendamiseks on füsio ­
loogiline keedusoolalahus. Kontrollitud tingimustes võib kasutada ka muid lahusteid, kuid muude lahustite kui füsioloogilise keedusoolalahuse sobi ­
vust on vaja tõendada.
 
26. Vedelad uuritavad ained kantakse sarvkestale nii, et kogu sarvkesta pind 
on uuritava ainega ühtlaselt kaetud; tavaline ruumala on 0,03 ml.  
27. Tahked ained tuleks jahvatada võimalikult peeneks uhmris uhmrinuiaga 
või muu peenestamisvahendiga. Pulber kantakse sarvkestale niimoodi, et pind oleks uuritava ainega ühtlaselt kaetud; tavaline kogus on 0,03 g.
 
28. Uuritav (vedel või tahke) aine kantakse 10 sekundiks peale ja loputatakse 
siis silma pealt maha toatemperatuuril oleva isotoonilise keedusoolalahu ­
sega (umbes 20 ml). Silm (koos silmahoidjaga) pannakse seejärel tagasi 
tilgutusaparaati esialgsesse vertikaalasendisse.  
Kontrollained  
29. Igas katses tuleks teha paralleelseid mõõtmisi ka negatiivse või lahusti/ ­
pealekandmisvahendi kontrolli ja positiivse kontrolli ainetega.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. 100-protsendilise vedeliku või tahke aine uurimise korral kasutatakse 
ICE-katses paralleelse negatiivse kontrollina füsioloogilist keedusoolala ­
hust, et teha kindlaks katsesüsteemi mittespetsiifilisi muutusi ning tõen ­
dada, et katsetingimused ise ei tekita ekslikult ärritusnähtusid.  
31. Lahjendatud vedeliku uurimise korral tehakse ICE-katses paralleelselt 
lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli katse, et teha kindlaks katsesüsteemi 
mittespetsiifilisi muutusi ning tõendada, et katsetingimused ise ei tekita ekslikult ärritusnähtusid. Nagu öeldud punktis 25, võib katses kasutada ainult sellist lahustit/pealekandmisvahendit, mille kohta on tõendatud, et 
see ei avalda negatiivset mõju katsesüsteemile.
 
32. Igas eksperimendis tehakse paralleelselt ka positiivse kontrolli katse 
silmi teadaolevalt ärritava ainega, et tõendada positiivse tulemuse 
saamist. Kuna käesolevas katsemeetodis kasutatakse ICE-katset söövita ­
vate või tugevasti ärritavate ainete kindlakstegemiseks, peaks positiivse kontrolli aine olema võrdlusaine, mis selle katsemeetodi puhul põhjustab tugeva mõju. Kuid selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kont ­
rolli aine mõju sõltuvust ajast, ei tohiks mõju olla ülemäära suur. Posi ­
tiivse kontrolli kohta tuleks saada piisaval hulgal  in vitro -andmeid, nii et 
saaks arvutada positiivse kontrolli väärtuste statistiliselt määratletud vahemiku. Kui konkreetse positiivse kontrolli jaoks ei ole piisavalt vara ­
semaid täpseid ICE-katse andmeid, võib sellise teabe saamiseks olla vaja 
korraldada eraldi uuringuid.
 
33. Vedelate uuritavate ainete positiivse kontrolli näideteks on 10 % äädikhape 
või 5 % bensalkooniumkloriid; tahkete uuritavate ainete positiivse kontrolli 
näideteks on naatriumhüdroksiid või imidasool.  
34. Võrdlusained võimaldavad hinnata teatavasse kemikaali- või tooteklassi 
kuuluva uurimata kemikaali omadust põhjustada silmade ärritust või 
hinnata teatava silmi ärritava aine mõju tugevust teatavas ärritava toime vahemikus.
 
Mõõdetavad tulemusnäitajad  
35. Sarvkesti hinnatakse enne uuritava ainega töötlemist ning 30, 75, 120, 
180 ja 240 minutit (± 5 minutit) pärast töötlemisejärgset loputamist. Sellised mõõtmiste ajad annavad vajaliku hulga mõõtmisi töötlemisele järgneva neljatunnilise ajavahemiku jooksul; samas jääb mõõtmiste vahele 
piisavalt aega, et nõutavad vaatlused saaks teha kõikide silmadega.
 
36. Mõõdetakse järgmisi tulemusnäitajaid: sarvkesta hägusus, turse, fluorest ­
seiini peetumine ja morfoloogilised muutused (näiteks epiteeli augustumine 
või lahtikoorumine). Kõiki tulemusnäitajaid peale fluorestseiini peetumise 
(mida määratakse ainult enne töötlemist ja 30 minutit pärast kokkupuudet uuritava ainega) määratakse igal eespool osutatud ajahetkel.
 
37. Sarvkesta hägususe, fluorestseiini peetumise, morfoloogiliste muutuste ja 
histopatoloogia (kui seda uuritakse) muutusi on soovitatav dokumenteerida fotodega.
 
38. Peale viimast vaatlust nelja tunni pärast on soovitatav silmad konservee ­
rida sobiva fiksaatoriga (näiteks puhverdatud neutraalse formaliiniga), et 
seda oleks võimalik histopatoloogiliselt uurida.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Sarvkesta turse määratakse sarvkesta paksuse mõõtmisega, kasutades 
pilulamp-mikroskoobile lisatud optilist paksusemõõtjat. Sarvkesta turse 
väljendatakse protsendina ja arvutatakse sarvkesta paksuse mõõtmisandme ­
test järgmise valemiga:  
" 
sarvkesta paksus ajahetkel t  Ä sarvkesta paksus ajahetkel  ¼ 0 
sarvkesta paksus ajahetkel  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Arvutatakse kõikide katses kasutatud silmade keskmine sarvkesta turse 
protsent iga uuritud ajahetke jaoks. Igal ajahetkel registreeritud kõige kõrgema keskmise sarvkestaturse hinde põhjal omistatakse igale uuritavale 
ainele üldine kategooriahinne.
 
41. Sarvkesta hägusus arvutatakse, kasutades hindamiseks kõige rohkem 
hägustunud sarvkestaosa pindala. Arvutatakse kõikide katses kasutatud silmade keskmine sarvkesta hägususe väärtus iga uuritud ajahetke jaoks. Igal ajahetkel registreeritud kõige kõrgema keskmise sarvkesta hägususe 
hinde põhjal omistatakse igale uuritavale ainele üldine kategooriahinne 
(tabel 1).
 
Tabel 1.  
Sarvkesta hägususe hinne  
Hinne Vaatlusandmed  
0 hägusust ei ole 
0,5 väga nõrk hägusus 
1 hajutatud või ebaselgete piirjoontega alad; vikerkesta detailid on selgelt nähtavad 
2 kergesti märgatav poolläbipaistev ala; vikerkesta detailid on veidi ebaselged 3 sarvkest on tugevalt hägune; vikerkesta konkreetsed detailid ei ole nähtavad; 
pupilli suurus on vaevunähtav 
4 sarvkest on täielikult hägune; pupilli ei ole näha
 
42. Keskmine fluorestseiini peetumise väärtus arvutatakse kõikide katses kasu ­
tatavate silmade jaoks ainult ajahetke 30 minutit jaoks; osutatud väärtust 
kasutatakse igale uuritavale ainele üldise kategooriahinde omistamisel 
(tabel 2).  
Tabel 2.  
Fluorestseiini peetumise hinne  
Hinne Vaatlusandmed  
0 fluorestseiini peetumist ei ole 
0,5 üksikud rakud on väga nõrgalt värvunud 
1 üksikuid värvunud rakke on hajusalt kogu töödeldud sarvkestal 2 värvunud üksikud rakud moodustavad värvumistsentreid või -laike 3 peetunud fluorestseiiniga sarvkestaalad moodustavad ulatuslikke laike
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Morfoloogiline mõju hõlmab järgmist: „auklikud” sarvkesta epiteelirakud, 
lahtikoorunud epiteel, sarvkesta pinna karedaks muutumine ning uuritava 
aine „kleepumine” sarvkestale. Sellised nähtused võivad olla erineva raskusastmega ja esineda samaaegselt. Nende nähtuste klassifitseerimine on subjektiivne ja sõltub uurija tõlgendusest.
 
ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmete hindamine  
44. Sarvkesta hägususe ja turse ning fluorestseiini peetumise tulemusi tuleb 
hinnata eraldi, et leida ICE-klass iga tulemusnäitaja jaoks. Iga tulemusnäi ­
taja ICE-klassid koondatakse seejärel iga uuritava aine ärritavuse klassifi ­
katsiooni saamiseks.  
Otsustamiskriteeriumid  
45. Kui iga tulemusnäitaja on hinnatud, saab eelnevalt määratud vahemike 
alusel omistada ICE-klassid. Sarvkesta paksuse (tabel 3), hägususe (tabel 
4) ja fluorestseiini peetumise (tabel 5) tõlgendamine nelja ICE-klassi kasu ­
tamisega toimub järgnevate skaalaastmete alusel:  
Tabel 3.  
Sarvkesta turse ICE-klassifitseerimise kriteeriumid  
Keskmine sarvkesta turse (%) (*) ICE-klass  
0 kuni 5 I 
> 5 kuni 12 II > 12 kuni 18 (> 75 minutit pärast kokku ­
puudet uuritava ainega) II 
> 12 kuni 18 ( ≤ 75 minutit pärast kokku ­
puudet uuritava ainega) III 
> 18 kuni 26 III 
> 26 kuni 32 (> 75 minutit pärast kokku ­
puudet uuritava ainega) III 
> 26 kuni 32 ( ≤ 75 minutit pärast kokku ­
puudet uuritava ainega) IV 
> 32 IV
 
(*) Sarvkesta turse hindeid saab kasutada ainult siis, kui sarvkesta paksus on mõõdetud 
pilulamp-mikroskoobiga Haag-Streit BP900, kasutades sügavusmõõtmisseadet nr I ja pilulaiust 9½, mis vastab 0,095 millimeetrile. Töötajad peaksid arvestama, et pilu erineva laiuse korral võib 
pilulamp-mikroskoop anda tulemuseks erinevaid sarvkesta paksuse väärtusi.
 
Tabel 4.  
Sarvkesta hägususe ICE-klassifitseerimise kriteeriumid  
Keskmine maksimaalse hägususe hinne (*) ICE-klass  
0,0–0,5 I 
0,6–1,5 II 1,6–2,5 III 2,6–4,0 IV
 
(*) Vt tabel 1.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabel 5.  
Fluorestseiini peetumise ICE-klassifitseerimise kriteeriumid  
Keskmine fluorestseiini peetumise hinne 30 minutit 
pärast kokkupuudet uuritava ainega (*) ICE-klass  
0,0–0,5 I 
0,6–1,5 II 1,6–2,5 III 2,6–3,0 IV
 
(*) Vt tabel 2.  
46. Uuritava aine üldine  in vitro -ärritavuse klassifikatsioon hinnatakse ärrita ­
vusnäitajate kategooriate kombineerimisega, võttes arvesse sarvkesta turse, 
sarvkesta hägususe ja fluorestseiiini peetumise kategooriaid ning kasutades tabelis 6 esitatud skeemi.
 
Tabel 6.  
Üldise  in vitro -ärritavuse klassifikatsiooni määramine  
Klassifikatsioon Kolme tulemusnäitaja kombineerimine  
Söövitav / tugevasti ärritav 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 2 × IV, 1 × I (*) 
30 minuti pärast sarvkesta hägusus ≥ 3 (vähe­
malt kahes silmas) Mingil ajahetkel sarvkesta hägusus = 4 (vähe ­
malt kahes silmas) 
Epiteeli tugev lahtikoorumine (vähemalt ühes 
silmas)
 
(*) Ebatõenäolisemad kombinatsioonid  
47. Nagu öeldud punktis 1, kui uuritavat ainet ei klassifitseerita silma söövi ­
tavaks või tugevasti ärritavaks aineks, tuleks aine klassifitseerimiseks ja 
etiketile kantava teabe saamiseks teha täiendavaid katseid. Silma söövi ­
tavate ja tugevasti ärritavate ainete kindlakstegemisel on ICE-katse üldine täpsus 83 % (120/144) kuni 87 % (134/154), valepositiivsete 
tulemuste määr on 6 % (7/116) kuni 8 % (9/116) ja valenegatiivsete 
tulemuste määr 41 % (13/32) kuni 50 % (15/30), kui tulemusi võrrelda küüliku silma  in vivo -katse tulemustega, mis on klassifitseeritud vasta ­
valt EPA (1), ELi (2) või GHSi (3) klassifitseerimissüsteemidele. Kui 
teatavatesse kemikaaliklassidesse (alkoholid ja pindaktiivsed ained) või 
füüsikalisse klassi (tahked ained) kuuluvad ained andmebaasist kõrvale jätta, on ELi, EPA ja GHSi klassifitseerimissüsteemide kohaselt ICE-katse täpsus 91 % (75/82) kuni 92 % (69/75), valepositiivsete 
tulemuste määr on 5 % (4/73) kuni 6 % (4/70) ja valenegatiivsete 
tulemuste määr on 29 % (2/7) kuni 33 % (3/9) (4).
 
48. Isegi kui uuritavat ainet ei klassifitseerita silma söövitavaks või tugevasti 
ärritavaks aineks, võib ICE-katse siiski olla kasulik koos andmetega, mis 
saadakse küüliku silma  in vivo -katsega või muu korralikult valideeritud  in 
vitro -katsega, kuna see aitab paremini hinnata ICE-katse meetodi kasulik ­
kust ja puudusi selliste ainete kindlakstegemiseks, millel ei ole tugevasti 
ärritavat või ärritavat toimet (töötatakse välja suunisdokumenti silma toksi ­
lisuse  in vitro -katsemeetodite kasutamise kohta).  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Uuringu nõuetekohasuse kriteeriumid  
49. Katse loetakse nõuetekohaseks, kui paralleelselt läbiviidud negatiivse kont ­
rolli või pealekandmisvahendi / lahusti kontrolli katsed ja positiivse kont ­
rolli katsed annavad ärritavuse klassifikatsiooni tulemused, mille kohaselt esimesel juhul on tegemist silma mitteärritavate ja teisel juhul silma tuge ­
vasti ärritavate / söövitavate ainetega.
 
Katseprotokoll  
50. Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave, kui see on uuringu läbivii ­
mise seisukohast asjakohane:  
Uuritavad ained ja kontrollained  
keemiline nimetus või keemilised nimetused, nagu struktuurikohane 
nimetus, mida kasutab  Chemical Abstracts Service  (CAS), seejärel muud 
nimetused, kui need on teada;  
CASi registreerimisnumber (RN), kui on teada;  
aine puhtus või segu koostis (massiprotsendina), kuivõrd see on teada;  
füüsikalis-keemilised omadused nagu füüsikaline olek, lenduvus, pH, 
püsivus, kemikaaliklass, lahustuvus vees, mis on olulised katse läbiviimise seisukohast;
 
uuritava aine / kontrollaine töötlemine enne katset, kui see on asjakohane 
(näiteks soojendamine, peenestamine);  
püsivus, kui on teada.  
Teave sponsori ja uurimisasutuse kohta  
sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;  
silmade päritolu kirjeldus (näiteks asutus, milles need koguti);  
silmade säilitamis- ja transporditingimused (näiteks silmade kogumise aeg, 
ajavahemik kogumisest katse alguseni);  
silmade kogumiseks kasutatud lindude eritunnused, kui on teada (näiteks 
lindude vanus, sugu, mass).  
Kasutatud meetodi ja katse-eeskirja põhjendus  
Katsemeetodi õigsus  
Kasutatud katsemeetodi ajast sõltumatu õigsuse (st täpsuse ja usaldusväär ­
suse) tagamise meetod (s.o ained, millega katse läbiviimise oskust teatava ajavahemiku järel kontrollitakse, varasemate negatiivse ja positiivse kont ­
rolli andmete kasutamine).
 
Katse kõlblikkuse kriteeriumid  
võimaluse korral varasematel andmetel põhinevad kõlblike paralleelsete 
võrdlustulemuste vahemikud.  
Katse tingimused  
kasutatud katsesüsteemi kirjeldus;  
kasutatud pilulamp-mikroskoop (näiteks mudel);  
kasutatud pilulamp-mikroskoobi seaded;  
kasutatud kanasilmi käsitlev teave, seejuures nende kvaliteetsuse kinni ­
tused;  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
kasutatud katsemeetodi üksikasjad,  
uuritavate ainete kasutatud kontsentratsioonid;  
kõikide katsemetoodikas tehtud muudatuste kirjeldus;  
viide varasematele mudeli andmetele (näiteks negatiivse ja positiivse kont ­
rolli ained, katse läbiviimise oskuse kontrollimiseks kasutatud ained, võrd ­
lusained);  
kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus.  
Tulemused  
muude täheldatud toimete kirjeldus;  
vajaduse korral silmade fotod.  
Tulemuste arutelu  
Kokkuvõte  
KIRJANDUS  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
(2) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 
16. detsember 2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 
67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning 
muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006. ELT L 353, 31.12.2008, lk 1.
 
(3) United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classi ­
fication and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, 
UN New York and Geneva, 2007. Vt  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/ 
02files_e.html]  
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro 
Ocular Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irri ­
tants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National 
Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation 
of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publica ­
tion No. 07-4517. Vt
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Vt  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(6) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1907/2006, 
18. detsember 2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hinda ­
mist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnis ­
tatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni 
määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 
76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ. ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Vt  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. 
In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular Toxicity 
Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological 
Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Vt
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Vt
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuc ­
leated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76.
 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). Vt  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/ prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37.
 
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious 
Agents in Healthcare Settings. Vt  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Vt
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Vt  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm] ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
1. liide  
MÕISTED  
Täpsus:  katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. 
See on katsemeetodi kasutuskõlblikkuse üks näitajaid ja üks nn asjakohasuse 
aspekte. Terminit kasutatakse sageli vaheldumisi sõnaga „kooskõla”, mis tähendab katsemeetodiga saadud õigete tulemuste osakaalu.
 
Võrdlusaine:  aine, mida kasutatakse standardina võrdlemiseks uuritava ainega. 
Võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne 
tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritavate ainetega; iii) teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused; iv) täiendavad andmed teadao ­
levate mõjude kohta ja v) teadaolev mõjusus soovitavas mõju tugevuse vahe ­
mikus.
 
Sarvkest:  silmamuna eespoolses osas asuv läbipaistev kest, mis katab vikerkesta 
ja silmaava ning laseb valgusel tungida silma sisse.  
Sarvkesta hägusus:  suurus, millega väljendatakse pärast sarvkesta kokkupuudet 
uuritava ainega toimuva hägustumise määra. Sarvkesta hägususe suurenemine 
näitab sarvkesta kahjustuse suurust.  
Sarvkesta turse:  ICE-katse puhul objektiivselt mõõdetav suurus, millega väljen ­
datakse pärast sarvkesta kokkupuudet uuritava ainega toimuva sarvkesta paisu ­
mise määra. See väljendatakse protsendina ja arvutatakse ICE-katses enne tööt ­
lemist mõõdetud sarvkesta paksuse ja pärast uuritava ainega kokkupuudet korra ­
päraste ajavahemike järel mõõdetud sarvkesta paksuse andmetest. Sarvkesta turse ulatus näitab sarvkesta kahjustuse suurust.
 
EPA I kategooria:  söövitus (silmakoe pöördumatu kahjustus) või sarvkesta 
mõjutus või ärritus, mis püsib rohkem kui 21 päeva (1).  
ELi kategooria R41:  koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline näge ­
mislangus pärast seda, kui uuritavat ainet on kantud silma eespoolsele pinnale ja mõju ei ole täielikult pöörduv 21 päeva jooksul pärast aine pealekandmist (2).
 
Valenegatiivsete vastuste määr:  kõikide selliste positiivsete ainete osakaal, mis 
katsemeetodi alusel on ekslikult tunnistatud negatiivseks. See on üks katsemee ­
todi kasutuskõlblikkuse näitaja.  
Valepositiivsete vastuste määr:  kõikide selliste negatiivsete ainete osakaal, mis 
katsemeetodi alusel on ekslikult tunnistatud positiivseks. See on üks katsemeetodi 
kasutuskõlblikkuse näitaja.  
Fluorestseiini peetumine:  ICE-katse puhul subjektiivselt hinnatav suurus, 
millega väljendatakse pärast sarvkesta kokkupuudet uuritava ainega toimuva naatriumfluorestseiini epiteelirakkudes peetumise määra. Fluorestseiini peetumise 
määr näitab sarvkesta epiteeli kahjustuse suurust.
 
GHS ( Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemi ­
cals – kemikaalide ühtne ülemaailmne klassifitseerimis- ja märgistamissüs ­
teem):  süsteem, milles kemikaalid (ained ja segud) on klassifitseeritud vastavalt 
nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud 
tüübile ja -tasemele ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu pikto ­
grammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda edasi inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ja 
keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku mõju 
kohta (3).
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHSi 1. kategooria:  koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline näge ­
mislangus pärast seda, kui uuritavat ainet on kantud silma eespoolsele pinnale ja 
mõju ei ole täielikult pöörduv 21 päeva jooksul pärast aine pealekandmist (3).  
Oht:  mõjuri või olukorra loomupärane omadus tekitada kahjustust, kui organism, 
süsteem või (ala-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.  
Negatiivne kontroll:  uuritava ainega töötlemata paralleelproov, mis sisaldab 
kõiki katsesüsteemi komponente. Sellist proovi töödeldakse koos proovidega, 
mida mõjutatakse uuritava ainega, ja koos muude kontrollproovidega, et kont ­
rollida, ega lahusti ei mõjuta katsesüsteemi.  
Ärritust mittepõhjustav aine:  aine, mida ei ole klassifitseeritud EPA I, II ega III 
kategooriasse, ELi kategooriatesse R41 või R36 ega GHSi 1., 2.A või 2.B kategooriasse kuuluvaks silmaärritajaks (1), (2), (3).
 
Silma söövitav aine:  a) aine, mis põhjustab silma kudede pöördumatut kahjus ­
tust; b) aine, mis on klassifitseeritud GHSi 1. kategooriasse, EPA I kategooriasse või ELi kategooriasse R41 kuuluvaks silma ärritavaks aineks (1), (2), (3).
 
Silma ärritav aine:  a) aine, mis põhjustab pärast silma eespoolsele pinnale 
kandmist silmas pöörduva muutuse; b) aine, mis on klassifitseeritud EPA II või III kategooriasse, ELi kategooriasse R36 või GHSi 2.A või 2.B kategooriasse 
kuuluvaks silmaärritajaks (1), (2), (3).
 
Silma tugevasti ärritav aine:  a) aine, mis põhjustab pärast silma eespoolsele 
pinnale kandmist silmas kudede kahjustuse, mis ei ole pöörduv 21 päeva jooksul, 
või põhjustab tugeva füüsilise nägemislanguse; b) aine, mis on klassifitseeritud 
GHSi 1. kategooriasse, EPA I kategooriasse või ELi kategooriasse R41 kuulu ­
vaks silma ärritavaks aineks (1), (2), (3).  
Positiivne kontroll:  paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente 
ja mida töödeldakse ainega, mis teadaolevalt põhjustab positiivse tulemuse. Selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli aine mõju sõltuvust 
ajast, ei tohiks mõju olla ülemäära suur.
 
Usaldusväärsus:  sellega mõõdetakse katsemeetodi tulemuste reprodutseeritavust, 
kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katseprotokolli alusel ühes laboris ja eri 
laborites pikema aja jooksul. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise 
reprodutseeritavuse ja laborisisese korratavuse arvutamisega.  
Pilulamp-mikroskoop:  seade, mida kasutatakse silma otseseks vaatluseks; bino ­
kulaarmikroskoobiga saadakse suurendatud vertikaalne stereoskoopiline kujutis. ICE-katses kasutatakse seda seadet kanasilma eespoolsete struktuuride vaatlemi ­
seks, samuti sarvkesta paksuse objektiivseks mõõtmiseks, kasutades lisaseadet – 
paksusemõõtjat.
 
Lahusti/pealekandmisvahendi kontroll:  uuritava ainega töötlemata proov, mis 
sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente, sealhulgas lahustit või pealekandmis ­
vahendit; sellist proovi töödeldakse sarnaselt uuritava ainega töödeldud proovile 
ja muudele kontrollproovidele, et määrata kindlaks samas lahustis või pealekand ­
misvahendis lahustatud uuritava ainega töödeldud proovide nulljoonetase. Kui paralleelselt katsetatakse negatiivse kontrolli proovi, siis näitab lahusti/ ­
pealekandmisvahendi proov ka seda, kas lahusti või pealekandmisvahend 
mõjutab katsesüsteemi.
 ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Astmeline katsetamine:  samm-sammulise katsetamise strateegia, milles enne 
järgmisse etappi minekut vaadatakse kindlaksmääratud korras läbi kogu uuritava 
aine kohta olemasolev teave, kasutades igas etapis tõendite kaalukuse menetlust, et määrata kindlaks, kas on piisavalt teavet riskirühma klassifitseerimise otsuse tegemiseks. Kui olemasoleva teabe põhjal saab uuritava aine ärritavate omaduste 
kohta otsuse teha, ei ole edasisi katseid vaja teha. Kui olemasoleva teabe põhjal 
ei saa teha otsust uuritava aine ärritavate omaduste kohta, jätkatakse samm-sammult järjestikuste loomkatsete tegemist, kuni aine saab üheselt klassi ­
fitseerida.
 
Valideeritud katsemeetod:  katsemeetod, mille valideerimisuuringud on lõpule 
viidud, st on määratud selle asjakohasus (sealhulgas täpsus) ja usaldusväärsus 
konkreetse eesmärgi puhul. Oluline on märkida, et valideeritud katsemeetod ei 
tarvitse olla piisavalt kasutuskõlblik täpsuse ja usaldusväärsuse osas, et seda saaks lugeda vastuvõetavaks konkreetse eesmärgi puhul.
 
Tõendusmaterjali kaalukuse hindamine:  protsess, milles kaalutakse mitmesu ­
guste andmete tugevaid ja nõrku külgi, et jõuda otsuseni aine võimaliku ohtlik ­
kuse kohta ja toetada sellist otsust.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
2. liide  
ICE-KATSE VALDAMISE KONTROLLIMISEKS SOOVITATAVAD KEMI ­
KAALID  
Enne käesoleva katsemeetodi kohase katsemeetodi tavakasutusse võtmist võivad 
laborid soovida tõendada meetodi tehnilist valdamist ja määrata selleks õigesti tabelis 1 soovitatud 10 aine klassifikatsioon söövitava toime järgi. Kõnealused ained on valitud nii, et oleks esindatud silma paikse ärrituse/söövituse põhjusta ­
mise kogu skaala, mis põhineb küüliku silmaga  in vivo -katsetes (TG 405) saadud 
tulemustel (st 1., 2.A ja 2.B kategooria või ÜRO GHSi kohaselt „klassifitseeri ­
mata ja märgiseta”) (3), (7). Pidades aga silmas kõnealuste katsete valideeritud kasulikkust (tehakse kindlaks vaid silma söövitavad või tugevasti ärritavad 
ained), on meetodi valdamise tõendamisel tegemist vaid kahesuguste tulemustega 
klassifitseerimise seisukohast (söövitav/tugevasti ärritav või mittesöövitav/silma mitte tugevasti ärritav). Muud valikukriteeriumid olid järgmised: ained peaksid olema kaubanduses saadaval ja nende kohta peaksid olema kvaliteetsed  in vivo - 
võrdlusandmed ning on olemas kvaliteetsed andmed, mis on määratud kahe  in 
vitro -meetodiga, mille jaoks on välja töötatud katse läbiviimise suunised. Seepä ­
rast valiti ärritavad ained 122 võrdlusaine nimestikust, mida ICCVAM soovitab 
kasutada silma toksilisuse  in vitro -katsete valideerimiseks (vt H liide: ICCVAMi 
soovitatud võrdlusained) (4). Võrdlusandmeid on esitatud ka ICCVAMi taustü ­
levaatedokumentides veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse meetodi (BCOP- katse) ja ICE-katsemeetodi jaoks (18), (19).
 
Tabel 1  
Soovitatavad ained ICE-meetodi tehnilise valdamise tõendamiseks  
Ühend CASi nr Ühendiklass (  1 ) Füüsikaline olek  In vivo -klassifikat ­
sioon (  2 ) In vitro -klassifikat ­
sioon (  3 ) 
Bensalkooniumklo ­
riid (5 %) 8001-54-5 Ooniumühend Vedel 1. kategooria Söövitav/tugevasti 
ärritav 
Kloorheksidiin 55-56-1 Amiin, amidiin Tahke 1. kategooria Söövitav/tugevasti 
ärritav 
Dibensoüül-L-viin ­
hape 2743-38-6 Karboksüül ­
happe ester Tahke 1. kategooria Söövitav/tugevasti 
ärritav 
Imidasool 288-32-4 Heterotsükkel Tahke 1. kategooria Söövitav/tugevasti 
ärritav 
Trikloroäädikhape 
(30 %) 76-03-9 Karboksüül ­
hape Vedel 1. kategooria Söövitav/tugevasti 
ärritav 
2,6-dikloroben ­
soüülkloriid 4659-45-4 Atsüülhaliid Vedel 2.A kategooria Mittesöövitav/mitte 
tugevasti ärritav 
Etüül-2-metüülatseto- 
atsetaat 609-14-3 Ketoon, ester Vedel 2.B kategooria Mittesöövitav/mitte 
tugevasti ärritav 
Ammooniumnitraat 6484-52-2 Anorgaaniline 
sool Tahke 2.A kategooria Mittesöövitav/mitte 
tugevasti ärritav  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Ühend CASi nr Ühendiklass (  1 ) Füüsikaline olek  In vivo -klassifikat ­
sioon (  2 ) In vitro -klassifikat ­
sioon (  3 ) 
Glütserool 56-81-5 Alkohol Vedel Märgiseta Mittesöövitav/mitte 
tugevasti ärritav  
n-heksaan 110-54-3 Atsükliline 
süsivesinik Vedel Märgiseta Mittesöövitav/mitte 
tugevasti ärritav  
Lühendid: CASi nr –  Chemical Abstracts Service 'i number. 
( 1 ) Kemikaaliklass on igale uuritavale ainele omistatud standardse klassifitseerimisskeemi kohaselt, mis põhineb USA meditsiinira a­
matukogu meditsiiniteemade klassifitseerimissüsteemil (vt http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Vastavalt küüliku silma  in vivo -katse (OECD TG 405) tulemustele ja kasutades ÜRO GHSi süsteemi (3), (7). 
( 3 ) Vastavalt BCOP-katse ja ICE-katse tulemustele.  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
3. liide  
ICE-katses kasutatava tilgutusaparaadi ja silmahoidja skeem  
(Tilgutusaparaadi ja silmahoidja üldise täiendava kirjelduse on esitanud Burton et al. (17))
  ▼M2 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  IN VITRO  IMETAJARAKKUDE MIKROTUUMA KATSE  
SISSEJUHATUS  
1. In vitro  mikrotuuma katse ( micronucleus , MNvit) on genotoksilisuskatse, 
milles uuritakse mikrotuumade (MN) esinemist interfaasis olevate rakkude 
tsütoplasmas. Mikrotuum võib tekkida atsentrilisest kromosoomifragmendist 
(st milles ei ole tsentromeeri) või tervest kromosoomist, mis ei suuda migreeruda pooluseni raku jagunemise anafaasietapil. Katsega määratakse klastogeensete ja aneugeensete kemikaalide (ainete ja segude) aktiivsus (1, 
2) rakkudes, mis on uuritava ainega kokkupuute ajal või pärast seda jagu ­
nenud. Käesolev katsemeetod võimaldab kasutada nii aktiini polümerisat ­
siooni inhibiitori tsütohalasiin B (tsütoB) kasutamisel põhinevaid katse-eeskirju kui ka selliseid, milles tsütoB-d ei kasutata. TsütoB lisamine 
enne valitud mitoosi võimaldab kindlaks teha ja selektiivselt analüüsida 
mikrotuumade esinemise sagedust rakkudes, mis on lõpetanud ühe mitoosi, kuna sellised rakud on kahetuumsed (3, 4). Käesolev katsemeetod 
võimaldab kasutada ka tsütokineesiblokiga katse-eeskirju, kui on tõendatud, 
et uuritud rakupopulatsioon on läbinud mitoosi.
 
2. Lisaks MNvit-katse kasutamisele mikrotuumi tekitavate kemikaalide (ainete 
või segude) kindlakstegemiseks võib teavet kromosoomikahjustuste ja mikrotuumade tekkimise kohta saada veel tsütokineesibloki, kinetokooride immunokeemilise märgistamisega või tsentromeeri-/telomeerisondidega 
hübridiseerimisega (fluorestents  in situ  hübridisatsiooniga (FISH)) kasuta ­
misega (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16). Märgistamist ja hübridi ­
seerimist võib kasutada, kui on tekkinud rohkesti mikrotuumi ja uurija tahab 
kindlaks teha, kas nende tekkimise põhjuseks on klastogeenne ja/või aneu ­
geenne protsess.
 
3. Mikrotuumad kujutavad endast kahjustust, mis on edasi antud tütarrakku ­
dele, samal ajal kui metafaasis olevates rakkudes kogunenud kromosoomi ­
hälbeid edasi ei anta. Kuna interfaasis olevate rakkude mikrotuumi võib küllalt objektiivselt hinnata, peab katse tegija üksnes määrama, kas rakud 
on läbinud jagunemise või ei ole ning kui paljudes rakkudes on mikrotuum. 
Selle tulemusel saab preparaate hinnata suhteliselt kiiresti ja analüüsi saab automatiseerida. Seepärast tasub iga töötlemisega seoses hinnata tuhandeid 
rakke, mitte sadu; see suurendab katse tõhusust. Lõpuks, kuna mikrotuumad 
võivad tekkida mahajäänud kromosoomidest, avaneb võimalus kindlaks teha aneuploidsust tekitavaid mõjureid, mida on raske uurida tavaliste kromo ­
soomihälbekatsetega, näiteks OECD katsejuhendiga 473 (käesoleva lisa 
peatükk B.10) (17). Kuid MNvit-katse ei võimalda eristada polüploidsust 
tekitavaid kemikaale klastogeensetest kemikaalidest, kui ei kasutata selliseid erimeetodeid nagu punktis 2 kirjeldatud FISH.
 
4. MNvit-katse on  in vitro  meetod, milles tavaliselt kasutatakse inimese või 
näriliste kultuuris kasvatatud rakke. Meetod võimaldab kromosoomikahjus ­
tuste tekitamise võimet igakülgselt  in vitro  uurida, kuna sellega saab 
määrata nii aneugeene kui ka klastogeene.  
5. MNvit-katse on töökindel ja tõhus paljude rakutüüpide puhul ja nii tsütoB 
juuresolekul kui ka puudumisel. MNvit-katse kehtivus on tõendatud paljude andmetega, mis on saadud näriliste mitme rakuliiniga (CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) ja inimese lümfotsüütidega (18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 
27, 28, 29, 30, 31). Need hõlmavad eelkõige rahvusvahelisi valideerimisuu ­
ringuid, mida koordineeris Société Française de Toxicologie
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
Génétique (SFTG) (18, 19, 20, 21, 22), ja rahvusvahelise genotoksilisuse 
määramise rahvusvahelise seminari ettekandeid (4, 16). Euroopa Komisjoni 
alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskus (ECVAM) on tõendite kaalukusel põhineva tagasihaarava valideerimisuuringuga olemasolevaid andmeid ka uuesti hinnanud ning katsemeetodi teaduslikku õigsust on 
toetanud ECVAMi teadusnõustajate komitee (ESAC) (32, 33, 34). On 
kirjeldatud inimese TK6-lümfoblastoidrakuliini (35), HepG2-rakkude (36, 37) ja primaarsete Süüria hamstri looterakkude (38) kasutamist, kuid vali ­
deerimisuuringutes neid ei kasutatud.
 
MÕISTED  
6. Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.  
ALGSED KAALUTLUSED  
7. In vitro  tehtavad katsed nõuavad üldjuhul välist metaboolse aktiveerimise 
allikat, kui rakud ei ole uuritavate kemikaalide suhtes metaboolselt kompe ­
tentsed. Välise metaboolse aktiveerimise süsteem ei ole täielikult sarnane  in 
vivo tingimustega. Tuleb hoolitseda, et välditaks valepositiivseid tulemusi 
põhjustavaid tingimusi, mis ei peegelda looduslikku mutageensust ja võivad 
tuleneda pH või osmolaalsuse suurtest muutustest või tsütotoksilisuse kõrgest tasemest (39, 40, 41). Kui uuritav kemikaal tekitab lisamisel kesk ­
konna pH muutuse, tuleb pH õigeks seada, eelistatult varulahusesse puhvri 
lisamisega, nii et kõik ruumalad kõikides katsetingimustes ja kõikide kont ­
rollproovidega jääksid samaks.
 
8. Mikrotuumade tekkimise induktsiooni analüüsimiseks on väga tähtis, et 
mitoos oleks toimunud nii uuritava kemikaaliga töödeldud kultuurides kui ka töötlemata kultuurides. Kõige informatiivsem mikrotuumade tekke hinda ­
mise seisukohast on olukord, kus rakud on lõpetanud ühe mitoosi uuritava 
kemikaaliga töötlemise ajal või pärast seda.
 
KATSE PÕHIMÕTE  
9. Inimpäritoluga või imetajast saadud rakukultuurid viiakse kokkupuutesse 
uuritava ainega nii metaboolse aktivatsiooni välise allika juuresolekul kui 
ka puudumisel, kui ei kasutata vajaliku metaboliseerimisvõimega rakke. 
Igas katses tehakse paralleelsed katsed ka lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli ja positiivse kontrolli kemikaalidega.
 
10. Uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal või pärast seda kasvatatakse rakke 
piisavalt kaua, et kromosoomi- või värtnakahjustus võiks viia mikrotuumade 
tekkimiseni interfaasis olevates rakkudes. Aneuploidsuse tekitamiseks peaks 
uuritav aine tavaliselt olema mitoosi ajal juures. Kogutud ja värvitud inter ­
faasirakke uuritakse mikrotuumade olemasolu kindlakstegemiseks. Ideaal ­
juhul tuleks mikrotuumad arvesse võtta üksnes sellistes rakkudes, mis on 
lõpetanud mitoosi kas uuritava ainega kokkupuute ajal või kokkupuute ­
järgse aja jooksul, kui seda kasutatakse. Tsütokineesiblokkeriga töödeldud kultuurides saavutatakse see ainult kahetuumsete rakkude arvessevõtmisega. Tsütokineesiblokkeri puudumise korral on oluline tõendada, et uuritud 
rakud tõenäoliselt läbisid raku jagunemise uuritava ainega kokkupuute 
ajal või pärast seda. Kõigi katse-eeskirjade puhul on oluline tõendada, et rakkude paljunemine on toimunud nii kontrollkultuurides kui ka uuritava ainega töödeldud kultuurides, ning vaja on hinnata ainest tingitud tsütotok ­
silisust või tsütostaasi kultuurides (või paralleelkultuurides), mida uuritakse 
mikrotuumade esinemise suhtes.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
KATSE KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
11. Võib kasutada primaarsete inimese perifeerse vere lümfotsüütide rakukul ­
tuuri (5, 19, 42, 43) ja mitmeid näriliste rakuliine nagu CHO, V79, CHL/IU 
ja L5178Y (18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 27, 28, 30). Muude rakuliinide ja -tüüpide kasutamist tuleb põhjendada, nagu on kirjeldatud katse kehtivuse kriteeriumide punktis, tõendades, et katse annab nendega usaldusväärseid 
tulemusi. Kuna mikrotuumade esinemise taustsagedus mõjutab katse tund ­
likkust, soovitatakse kasutada rakutüüpe, millel mikrotuumade moodustu ­
mise taustsagedus on madal ja stabiilne.
 
12. Inimese perifeerse vere lümfotsüüdid tuleb saada noorelt (ligikaudu 18–35- 
aastaselt), tervelt mittesuitsetavalt isikult, kes teadaolevalt ei ole hiljuti 
genotoksiliste kemikaalide ega radiatsiooniga kokku puutunud. Kui eri doonoritelt kogutud rakud kasutamiseks ühendatakse, tuleb esitada doono ­
rite arv. Mikrotuumade esinemise sagedus suureneb vanusega; see tendents 
on märgatavam naiste kui meeste puhul (44) ning seda tuleks ühendatavate 
doonorirakkude valimisel arvesse võtta.
 
Kasvukeskkonnad ja kultiveerimistingimused  
13. Rakukultuuride säilitamiseks tuleks kasutada sobivat kasvukeskkonda ja 
inkubeerimistingimusi (kasvunõud, CO  2 kontsentratsioon, temperatuur ja 
niiskus). Püsivaid rakuliine ja -tüvesid tuleb korrapäraselt kontrollida 
modaalse kromosoomiarvu stabiilsuse ning mükoplasmaga saastumise puudumise suhtes; ei tohiks kasutada rakuliine või -tüvesid, mis on saas ­
tunud või mille modaalne kromosoomide arv on muutunud. Kasutatavate 
rakkude normaalse rakutsükli kestus katselabori kasvutingimustes peaks 
olema teada. Kui kasutatakse blokeeritud tsütokineesi meetodit, tuleb tsüto ­
kineesi inhibiitori kontsentratsioon konkreetse rakutüübi jaoks optimeerida ja näidata, et see annab hindamiseks vajalike kahetuumsete rakkude hea 
saagise.
 
Kultuuride ettevalmistamine  
14. Püsivad rakuliinid ja -tüved: rakud paljundatakse tüvikultuuridest, mis on 
külvatud kasvukeskkonda sellise tihedusega, et rakukultuur ei jõua mono ­
kihi puhul söödet täielikult katta enne kogumisaega ning suspensioonkul ­
tuuri puhul ei muutu liiga tihedaks, ja inkubeeritakse 37 °C juures.  
15. Lümfotsüüdid: antikoagulandiga (näiteks hepariiniga) töödeldud täisverd või 
eraldatud lümfotsüüte kasvatatakse enne uuritava aine ja tsütoB-ga kokku ­
puudet mitogeeni, näiteks fütohemaglutiniini juuresolekul.  
Metaboolne aktivatsioon  
16. Kui kasutatakse puuduliku endogeense metabolismivõimega rakke, tuleks 
kasutada välist metaboliseerivat süsteemi. Enimkasutatav süsteem on näri ­
liste ensüüme indutseerivate ainete, nt Aroclor 1254-ga (45, 46) või feno ­
barbitooni ja β-naftoflavooniga (46, 47, 48, 49), töödeldud maksa postmi ­
tokondriaalne fraktsioon (S9), mida on täiendatud kofaktoritega. Fenobarbi ­
tooni ja β-naftoflavooni kasutamine ei ole vastuolus püsivate orgaaniliste 
saasteainete Stockholmi konventsiooniga (50) ega määrusega (EÜ) nr 850/2004 (püsivate orgaaniliste saasteainete kohta) (66) ning on tõen ­
datud, et see on segafunktsiooniga oksüdaaside indutseerimisel sama tõhus 
kui Aroclor 1254 (46, 47, 48, 49). Postmitokondriaalset fraktsiooni kasuta ­
takse tavaliselt kontsentratsioonis 1–10 mahuprotsenti lõplikus katsekesk ­
konnas. Metaboolse aktivatsiooni süsteemi tingimuste valik võib sõltuda 
uuritava aine keemilisest aineklassist ja mõnel juhul võib olla sobiv kasu ­
tada rohkem kui ühte S9 kontsentratsiooni.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Katse tegemiseks võib kasutada geneetiliselt muundatud rakuliine, milles 
töötavad konkreetsed inimese või närilise aktiveerivad ensüümid; sel juhul 
ei ole välist metaboolse aktivatsiooni süsteemi vaja. Sel juhul peab rakuliini valik olema teaduslikult põhjendatud, näiteks sellega, et segafunktsiooniga oksüdaasid on seotud uuritava aine metabolismiga (51) ja on tundlikud 
teadaolevate klastogeenide ja aneugeenide toime suhtes (vt katse kehtivuse 
kriteeriume käsitlev punkt). Tuleb endale aru anda, et rakus töötav(ad) segafunktsiooniga oksüdaas(id) ei tarvitse uuritavat ainet metaboliseerida; sellisel juhul katse negatiivne tulemus ei tõenda, et uuritav aine ei suuda 
tekitada mikrotuumi.
 
Uuritava aine ettevalmistamine  
18. Tahke uuritav aine tuleb lahustada sobivas lahustis või kandeaines ja vaja ­
duse korral lahjendada enne rakkude töötlemist. Vedelat kemikaali võib lisada otse katsesüsteemi ja/või lahjendada enne töötlemist. Gaasi või lenduva kemikaali uurimiseks tuleks tavalist katse-eeskirja sobivalt muuta, 
näiteks töödelda suletud anumas (52, 53). Tuleks kasutada uuritava aine 
värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
 
Katse tingimused  
Lahusti/kandeaine  
19. Lahusti/kandeaine ei tohiks uuritava ainega reageerida ega kasutatavas kont ­
sentratsioonis oluliselt kahjustada rakkude eluvõimet või S9 aktiivsust. Kui 
kasutatakse muid aineid peale tunnustatud lahustite/kandeainete (vesi, raku ­
kultuuri kasvukeskkond, dimetüülsulfoksiid), tuleb esitada tõendavad andmed, et aine sobib uuritava ainega kasutamiseks ega ole genotoksiline. 
Soovitatav on võimaluse korral alati kõigepealt kaaluda vee kui lahusti/kan ­
deaine kasutamist.
 
TsütoB kui tsütokineesi blokeerija kasutamine  
20. Üks olulisemaid asju MNvit-katse tegemisel on tagada, et loendatud rakud 
oleksid uuritava ainega töötlemise või töötlemisjärgse inkubeerimise ajal (kui rakke pärast töötlemist inkubeeritakse) lõpetanud mitoosi. Tsütokineesi 
blokeerimiseks on kõige rohkem kasutatud tsütoB-d, kuna see inhibeerib 
aktiini polümerisatsiooni, hoiab sellega ära tütarrakkude eraldumise pärast mitoosi, mille tagajärjel tekivad kahetuumsed rakud (5, 54, 55). Mikrotuu ­
made loendamise saab seepärast piirata üksnes selliste rakkudega, mis on 
töötlemise ajal või pärast seda läbinud mitoosi. Samal ajal võib mõõta 
uuritava aine mõju raku paljunemise kineetikale. Kui kasutatakse inimese lümfotsüüte, tuleks tsütokineesi blokeerimiseks kasutada tsütoB-d, kuna tsükli aeg sõltub kultuurist ja doonorist ning kuna fütohemaglutiniin ei 
toimi kõikidele lümfotsüütidele. Rakuliinide katsetamisel on kasutatud ka 
muid meetodeid, et teha kindlaks, kas loendatavad rakud on jagunenud; neid meetodeid on käsitletud punktis 26.
 
21. Labor peaks iga rakutüübi jaoks määrama tsütoB sobiva kontsentratsiooni, 
et saavutada lahusti/kandeaine kontrollkultuuris kahetuumsete rakkude 
optimaalne sagedus. TsütoB sobiv kontsentratsioon on tavaliselt vahe ­
mikus 3–6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Rakkude paljunemise ja tsütotoksilisuse mõõtmine ning kokkupuutekont ­
sentratsiooni valimine  
22. Katsetes kasutatava uuritava aine suurima kontsentratsiooni kindlaksmäära ­
misel tuleks vältida kontsentratsioone, mis võivad tekitada kunstlikult posi ­
tiivseid tulemusi, näiteks kontsentratsioone, mis on liiga tsütotoksilised, põhjustavad sadenemist kasvukeskkonnas ja pH või osmolaalsuse olulist 
muutust (39, 40, 41).
 
23. Rakkude paljunemise mõõtmisega tõendatakse, et töödeldud rakud on katse 
ajal läbinud mitoosi ja et töötlusi tehakse lubatava tsütotoksilisustaseme 
juures (vt punkt 29). Metaboolset aktivatsiooni vajavate rakkude puhul 
tuleks tsütotoksilisus määrata metaboolse aktivatsiooniga ja ilma aktivat ­
sioonita, kasutades rakkude arvukuse suhtelist suurenemist ( relative 
increase in cell counts , RICC) või suhtelist rakupopulatsiooni kahekordis ­
tumist ( relative population doubling , RPD) (vt võrrandid, 2. liide), kui ei 
kasutata tsütoB-d. TsütoB kasutamise korral võib tsütotoksilisuse määrata replikatsiooniindeksi ( replication index , RI) abil (vt võrrand, 2. liide).
 
24. Rakukultuuride töötlemine tsütoB-ga ning ühe-, kahe- ja paljutuumsete 
rakkude suhtelise esinemissageduse määramine kultuuris on täpne meetod, millega saab mõõta rakkude töötlemise mõju rakkude paljunemisele, samuti töötlemise tsütotoksilist või tsütostaatilist mõju (5), ja tagada, et loendatakse 
ainult töötlemise ajal või pärast seda jagunenud rakke.
 
25. TsütoB-ga tehtavates katsetes saab tsütostaasi/tsütotoksilisust mõõta tsüto ­
kineesi blokiga paljunemise indeksi ( cytokinesis-block proliferation index , 
CBPI) järgi (5, 26, 56) või tuletada selle näitaja kultuuri vähemalt 500 raku 
replikatsiooniindeksist (RI) (vt võrrand, 2. liide). Kui rakkude paljunemise hindamiseks kasutatakse tsütoB-d, tuleks CBPI või RI määrata vähemalt 500 rakust kultuuri kohta. Selliseid mõõtmisi võib töödeldud ja kontrollkul ­
tuuri võrdlemise abil muu hulgas kasutada tsütotoksilisuse hindamiseks. 
Muude tsütotoksilisuse näitajate (näiteks pinna katmine, rakkude arvu, apoptoosi, nekroosi ja metafaasi loendamine) hindamine võib anda kasu ­
likku teavet.
 
26. Ilma tsütoB-ta tehtavates katsetes on vaja tõendada, et kultuuris loendatavad 
rakud on läbinud raku jagunemise uuritava ainega kokkupuute ajal või pärast seda, muidu võidakse saada valenegatiivne tulemus. Üksnes jagu ­
nenud rakkude loendamise tagamiseks on kasutatud selliseid meetodeid 
nagu bromodesoksüuridiini (BrdU) viimine rakkudesse ja järgnev määra ­
mine, et kindlaks teha replitseerunud rakud (57), kloonide moodustamine, kui püsivate rakuliinide rakke töödeldakse ja loendatakse kohapeal mikro ­
skoobipreparaadis (paljunemisindeks, PI) (25, 26, 27, 28), rakupopulatsiooni 
suhtelise kahekordistumise (RPD) või rakkude arvukuse suhtelise suurenemise (RICC) mõõtmine või muud usaldusväärsed meetodid (16, 56, 58, 59) (vt võrrandid, 2. liide). Muude tsütotoksilisuse või tsütostaasi 
näitajate (näiteks pinna katmine, rakkude arvu, apoptoosi, nekroosi ja meta ­
faasi loendamine) hindamine võib anda kasulikku teavet.
 
27. Tuleks hinnata vähemalt kolme analüüsitavat kontsentratsiooni. Selle saavu ­
tamiseks võib olla tarvis teha katseid suure arvu lähedaste kontsentratsioo ­
nidega ja määrata mikrotuuma moodustumine sellistel kontsentratsioonidel, mille tsütotoksilisus on lubatavas vahemikus. Teine võimalus on teha eelnev tsütotoksilisuse katse, et piirata otsustava katse kontsentratsioonivahemikku.
 
28. Suurima kontsentratsiooni tsütotoksilisus peaks olema 55 ± 5 %. Suuremal 
kontsentratsioonil võivad kromosoomikahjustused tekkida tsütotoksilisuse kõrvalnähuna (60). Tsütotoksilisuse esinemise korral peaksid katse tegemi ­
seks valitud kontsentratsioonid katma vahemiku 55 ± 5 % tsütotoksilisuse 
tekitamisest kuni vähese või puuduva tsütotoksilisuseni.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Kui tsütotoksilisust ega sadenemist ei esine, peaks suurim katses kasutatav 
kontsentratsioon olema 0,01 M, 5 mg/ml või 5 μl/ml, olenevalt sellest, mis 
on kõige väiksem. Analüüsiks valitud kontsentratsioonid ei tohiks üldiselt olla suuremate vahedega kui 10 korda. Järsu kontsentratsiooni-mõju sõltu ­
vusega uuritava aine puhul võib olla vajalik kasutada väiksemat uuritava 
aine kontsentratsioonide vahet, et loendada kultuure ka mõõduka või vähese 
toksilisuse vahemikus.
 
30. Kui piiravaks teguriks on lahustuvus, peaks suurim uuritav kontsentratsioon 
olema selline, mille juures kultuuris on näha väga nõrka sadet, kui see ei 
takista loendamist ja kui piiravaks ei muutu tsütotoksilisus. Sadenemist 
tuleks hinnata selliste meetoditega nagu valgusmikroskoopia, märkides ära püsima jääva või rakkude kasvatamise ajal (töötlemise lõpuks) tekkiva sademe.
 
Kontrollkatsed  
31. Igas uuringus kasutatakse paralleelseid positiivseid ja lahusti/kandeaine 
kontrollkatseid metaboolse aktivatsiooniga ja ilma selleta.  
32. Positiivne kontroll on vajalik selle tõendamiseks, et kasutatavad rakud ja 
katse-eeskiri võimaldavad teha kindlaks klastogeene ja aneugeene ning 
kinnitada S9 valmistise metabolismivõimet. Positiivse kontrolli katses tuleks kasutada teadaolevaid mikrotuuma moodustumist põhjustavaid aineid sellisel kontsentratsioonil, mis põhjustab taustaga võrreldes väikese, kuid 
korratava mikrotuuma esinemissageduse suurenemise ja tõendab katsesüs ­
teemi tundlikkust. Positiivse kontrolli kemikaali kontsentratsioon valitakse nii, et mõju oleks selge, kuid et loendaja kohe ei taipaks, millised kodee ­
ritud mikroskoobipreparaatidest on positiivse kontrolli katsed.
 
33. Tuleks kasutada metaboolset aktivatsiooni vajavat klastogeeni (näiteks 
tsüklofosfamiid, benso[a]püreen), kuna nii on võimalik tõendada katsesüs ­
teemi metaboolset kompetentsust ja suutlikkust teha kindlaks klastogeene. Kasutada võib ka muid positiivse kontrolli kemikaale, kui see on õigus ­
tatud. Kuna mõni metaboolset aktivatsiooni vajav positiivse kontrolli kemi ­
kaal võib teatud töötlemistingimustes või teatava rakuliini puhul olla aktiivne ilma välise metaboolse aktivatsioonita, on valitud rakuliini ja kont ­
sentratsiooni puhul vaja kontrollida metaboolse aktivatsiooni vajalikkust ja 
S9 valmistise aktiivsust.
 
34. Praegu ei teata ühtegi aneugeeni, mille genotoksilisuse avaldumiseks oleks 
vaja metaboolset aktivatsiooni (16). Praegu on aneugeense aktiivsuse posi ­
tiivse kontrolli kemikaalideks tunnistatud näiteks kolhitsiin ja vinblastiin. 
Võib kasutada muid kemikaale, kui need tekitavad mikrotuumi kas üksnes või peamiselt aneugeense toime kaudu. Kahe positiivse kontrolli (klasto ­
geensuse ja aneugeensuse kontroll) vajaduse vältimiseks ilma metaboolse 
aktivatsioonita võib aneugeensuse kontrolli kasutada positiivse kontrollina 
ilma S9-ta ja klastogeensuse kontrolli võib kasutada selleks, et kontrollida kasutatud metaboolse aktivatsiooni süsteemi adekvaatsust. S9 juuresolekut mittevajavate rakkude puhul tuleb kasutada nii klastogeensuse kui ka aneu ­
geensuse positiivset kontrolli. Soovitatavad positiivse kontrolli kemikaalid 
on 3. liites.
 
35. Võib kaaluda samasse keemiliste ainete klassi kuuluva positiivse kontrolli 
kemikaali kasutamist, kui sobiv aine on kättesaadav. Kõik kasutatud posi ­
tiivse kontrolli kemikaalid peaksid sobima rakutüübile ja aktivatsioonitingi ­
mustele.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Lahusti/kandeaine kontrollkatsed tuleb teha kultuuri iga kogumisaja jaoks. 
Lisaks tuleb kasutada ka töötlemata negatiivset kontrolli (ei sisalda lahus ­
tit/kandeainet), kui avaldatud andmete või labori varasemate kontrollikatse ­
tega ei ole tõendatud, et valitud lahustil ei ole kasutatava kontsentratsiooni juures kahjulikku ega genotoksilist mõju.
 
KATSE KÄIK  
Töötlemiskava  
37. Selleks et suurendada konkreetsel rakutsükli etapil toimiva aneugeeni või klas ­
togeeni kindlakstegemise tõenäosust, on väga oluline, et uuritava ainega töödel ­
daks piisavalt palju rakke nende rakutsükli igal etapil. Rakuliinide ja primaarsete rakkude kultuuride töötlemise kava võib seepärast mõnevõrra erineda kavast, 
mida kasutatakse lümfotsüütide puhul, mille rakutsükli alustamiseks on vaja 
mitogeenset stimulatsiooni, vt lähemalt punktid 41–43 (16).
 
38. Teoreetilistest kaalutlustest ja avaldatud andmetest (18) tuleneb, et enamiku 
aneugeene ja klastogeene võib kindlaks teha lühiajalise töötlemisega (3–6 tundi) S9 juuresolekul ja puudumisel, millele järgneb uuritava aine eemal ­
damine ja rakkude kasvatamine 1,5 kuni 2,0 rakutsükli jooksul (6). Rakud 
kogutakse kas siis, kui töötlemise algusest on möödunud ajavahemik, mis vastab umbes 1,5–2,0 rakutsüklile normaalsete (see tähendab töötlemata) rakkude puhul, või töötlemise lõpus (vt tabel 1). Proovide võtmise või 
kogumise aega võib pikendada, kui on teada või võib oletada, et uuritav 
aine mõjutab rakutsükli pikkust (näiteks nukleosiidianaloogide puhul).
 
39. Kuna S9 valmistis võib kultuuris kasvatatava imetajaraku jaoks olla toksi ­
line, kasutatakse pikendatud kokkupuuteajaga (1,5–2,0 normaalse rakutsükli kestust) töötlemist üksnes S9 puudumisel. Pikendatud töötlemisaja puhul 
võib valida, kas töödelda rakke uuritava kemikaaliga tsütoB puudumisel 
või juuresolekul. Need valikvariandid on ette nähtud olukorra jaoks, kus võib karta, et uuritav aine ja tsütoB mõjutavad teineteist.
 
40. Pakutavad rakkude töötlemise kavad on esitatud tabelis 1. Esitatud üldisi 
töötlemiskavu võib muuta, et võtta arvesse uuritava aine stabiilsust või 
reaktsioonivõimet või kasutatavate rakkude konkreetseid kasvunäitajaid. 
Töötlemine peab alati algama ja lõppema rakkude eksponentsiaalse kasvu ajal. Töötlemiskavu on täpsemalt kirjeldatud punktides 41–47.
 
Tabel 1  
Rakkude töötlemise ja kogumise ajad MNvit-katse puhul  
Lümfotsüüdid, primaarsed rakud ja raku ­
liinid, mida töödeldakse tsütoB lisamisega + S9 Töödeldakse 3–6 tundi S9 juuresolekul; 
eemaldatakse S9 ja töötlemiskeskkond; lisatakse uus kasvukeskkond ja tsütoB; 
rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse 
rakutsükliaja möödumist. 
– S9 
Lühiajaline kokku ­
puude Töödeldakse 3–6 tundi; 
eemaldatakse töötlemiskeskkond; 
lisatakse uus kasvukeskkond ja tsütoB; rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse 
rakutsükliaja möödumist.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Pikendatud kokku ­
puude  Variant A:  töödeldakse tsütoB juuresolekul 
1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja jooksul; 
rakud kogutakse kokkupuuteaja lõpus.  
Variant B:  töödeldakse 1,5–2,0 normaalse 
rakutsükliaja jooksul; 
eemaldatakse uuritav aine; 
lisatakse uus kasvukeskkond ja tsütoB; rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse 
rakutsükliaja möödumist. 
Rakuliinid, mida töödeldakse tsütoB lisamiseta 
(Kõik toimub eespool esitatud kavade kohaselt, ainult tsütoB-d ei lisata.)
 
Lümfotsüüdid, primaarsed rakud ja rakuliinid, mida töödeldakse tsütoB lisami ­
sega 
41. Kõige tõhusam lähenemisviis lümfotsüütide puhul on alustada uuritava 
ainega kokkupuudet pärast 44–48 tunni möödumist fütohemaglutiniiniga stimuleerimisest, kui tsükli sünkronisatsioon on kadunud (5). Esialgses katses töödeldakse rakke 3–6 tundi uuritava ainega S9 puudumisel ja juure ­
solekul. Töötlemiskeskkond eemaldatakse ja asendatakse värske kasvukesk ­
konnaga, mis sisaldab tsütoB-d, ning rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
 
42. Kui mõlemad esialgsed lühiajalise töötlemise (3–6 tundi) katsed annavad 
negatiivse või ebaselge tulemuse, kasutatakse järgnevat pikendatud tööt ­
lemis- või kokkupuuteaega ilma S9-ta. Kasutada võib kahte töötlemise varianti, mis on võrdselt lubatavad. Stimuleeritud lümfotsüütide puhul on siiski vahest sobivam kasutada varianti A, kuna eksponentsiaalne kasv võib 
96 tundi pärast stimuleerimist olla juba vähenemas. Variandi B puhul ei 
tohiks rakukultuurid lõpliku kogumise ajaks jõuda pinna kinnikatmiseni.
 
— Variant A: rakke töödeldakse uuritava ainega 1,5–2,0 normaalse rakut ­
sükliaja jooksul ja kogutakse töötlemisaja lõpus.  
— Variant B: rakke töödeldakse uuritava ainega 1,5–2,0 normaalse rakut ­
sükliaja jooksul. Töötlemiskeskkond eemaldatakse ja asendatakse värske 
kasvukeskkonnaga ning rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
 
43. Primaarseid rakke ja rakuliine tuleks töödelda samuti kui lümfotsüüte, kuid 
esimesi ei ole vaja stimuleerida 44–48 tundi fütohemaglutiniiniga. Muid 
rakke kui lümfotsüüte tuleks töödelda uuritava ainega nii, et katse lõpeta ­
mise ajal on rakud ikka veel logaritmilises kasvufaasis.  
Rakuliinid, mida töödeldakse ilma tsütoB lisamiseta  
44. Rakke tuleks töödelda 3–6 tunni jooksul S9 juuresolekul ja puudumisel. 
Töötlemiskeskkond eemaldatakse ja asendatakse värske kasvukeskkonnaga 
ning rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Kui mõlemad esialgsed lühiajalise töötlemise (3–6 tundi) katsed annavad 
negatiivse või ebaselge tulemuse, kasutatakse järgnevat pikendatud tööt ­
lemis- või kokkupuuteaega (ilma S9-ta). Kasutada võib kahte töötlemise varianti, mis on võrdselt lubatavad:
 
— variant A: rakke töödeldakse uuritava ainega 1,5–2,0 normaalse rakut ­
sükliaja jooksul ja kogutakse töötlemisaja lõpus;  
— variant B: rakke töödeldakse uuritava ainega 1,5–2,0 normaalse rakut ­
sükliaja jooksul. Töötlemiskeskkond eemaldatakse ja asendatakse värske kasvukeskkonnaga ning rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
 
46. Monokihtides võib pärast 3–6-tunnise töötlemise lõppu olla mitoosifaasi 
rakke (mida võib ära tunda selle järgi, et need on ümmargused ja tulevad pinna küljest lahti). Kuna mitoosifaasis rakud tulevad kergesti lahti, võivad need uuritavat ainet sisaldava keskkonna eemaldamisel minna kaotsi. Need 
tuleb kultuuri pesemisel kokku koguda ja kultuuri tagasi panna, et vältida 
mitoosifaasi jõudnud ja võimalikke mikrotuumi sisaldavate rakkude kaotsi ­
minekut kogumise ajal.
 
Rakukultuuride arv  
47. Uuritava aine iga kontsentratsiooni juures, samuti lahusti/kandeaine kont ­
rolli ja negatiivse kontrolli puhul, tuleks alati kasutada kaht paralleelkul ­
tuuri. Kui labori varasemad andmed näitavad, et paralleelkultuuride erinevus on väike, võib olla vastuvõetav ühe kultuuri kasutamine. Üksikkultuuride 
kasutamisel tuleks kasutada suuremat arvu kontsentratsioone.
 
Rakkude kogumine ja mikroskoobipreparaadi ettevalmistamine  
48. Iga rakukultuur kogutakse ja töödeldakse eraldi. Rakkude ettevalmistamine 
võib hõlmata hüpotoonilist töötlust, kuid see etapp ei ole vajalik, kui vajalik 
rakkude laotus saadakse muul viisil. Mikroskoobipreparaadi ettevalmistami ­
seks võib kasutada mitmesuguseid meetodeid, kui on saadud kvaliteetsed, loendamiseks sobivad rakkude valmistised. Säilitada tuleks rakkude tsüto ­
plasma, et oleks võimalik määrata mikrotuumi ja (blokeeritud tsütokineesi 
meetodi puhul) usaldusväärselt kindlaks teha kahetuumseid rakke.
 
49. Mikroskoobipreparaate võib värvida mitme meetodiga, nagu näiteks Giemsa 
meetodiga või fluorestseerivate DNA-spetsiifiliste värvainetega (59). DNA-spetsiifilise värvaine kasutamine (nt akridiinoranž (61) või Hoechst 
33258 + püroniin-Y (62)) võib kõrvaldada mõne muude kui 
DNA-spetsiifiliste värvainete kasutamisega seotud artefakti. Kui soovitakse saada teavet mikrotuumade moodustumise mehhanismi kohta, võib mikro ­
tuumade sisalduse (kromosoom/kromosoomifragment) kindlakstegemiseks 
kasutada kinetokoorivastaseid antikehi, fluorestentsi  in situ  
hübridisatsiooniga (FISH) pantsentromeersete DNA-sondidega või prai ­
mitud  in situ  märgistamist pantsentromeerispetsiifilise praimeriga koos 
DNA sobiva vastandvärvimisega. Klastogeenide ja aneugeenide eristami ­
seks võib kasutada muid meetodeid, mille kohta on tõendatud, et need on 
tõhusad.
 
Analüüs  
50. Kõik mikroskoobipreparaadid, sh lahusti/kandeaine ning positiivse ja nega ­
tiivse kontrolli omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist 
analüüsi. Kodeeritud proovide analüüsimiseks võib kasutada ka valideeritud 
automaatseid voolutsütomeetria või kujutise analüüsi süsteeme.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. TsütoB-ga töödeldud kultuuride puhul tuleks mikrotuumade sagedust 
analüüsida vähemalt 2 000 kahetuumses rakus iga kontsentratsiooni kohta 
(vähemalt 1 000 kahetuumses rakus iga kultuuri kohta; kaks kultuuri igal kontsentratsioonil). Üheainsa kultuuri kasutamisel tuleks kõnealuse kultuuri kohta loendada vähemalt 2 000 kahetuumset rakku igal kontsentratsioonil. 
Kui igal kontsentratsioonil on loendamiseks kättesaadav oluliselt vähem kui 
1 000 kahetuumset rakku või üheainsa kultuuri kasutamisel 2 000 rakku ja kui olulist mikrotuumade esinemissageduse suurenemist ei täheldata, tuleb katset korrata suurema rakkude arvuga või vähem mürgise kontsentratsioo ­
niga, olenevalt sellest, kumb on sobivam. Tuleks jälgida, et ei loendataks 
ebakorrapärase kujuga kahetuumseid rakke või rakke, mille kaks tuuma on oluliselt erineva suurusega; samuti ei tohiks kahetuumseid rakke segi ajada halvasti eraldunud paljutuumsete rakkudega. Rakke, mis sisaldavad rohkem 
kui kahte peamist tuuma, ei tuleks mikrotuumade loendamisel arvesse võtta, 
kuna sellistes rakkudes võib mikrotuumade esinemise taustsagedus olla suurem (63, 64). Ühetuumsete rakkude loendamine võib olla lubatav, kui on näidatud, et uuritav aine segab tsütoB toimet.
 
52. TsütoB-ga töötlemata kultuuride puhul tuleks mikrotuumade sagedust 
analüüsida vähemalt 2 000 rakus iga kontsentratsiooni kohta (vähemalt 
1 000 rakus iga kultuuri kohta; kaks kultuuri igal kontsentratsioonil). Kui 
kasutatakse ühtainukest kultuuri igal kontsentratsioonil, tuleks kõnealusest kultuurist loendada vähemalt 2 000 rakku.
 
53. Kui kasutatakse tsütoB-d, tuleks määrata tsütokineesi blokiga paljunemise 
indeks (CBPI) või replikatsiooniindeks (RI) (vt 2. liide), kasutades vähemalt 
500 rakku kultuuri kohta. Kui töötlemine toimub ilma tsütoB juuresolekuta, 
on oluline tõendada, et loendatud rakud on paljunenud (vt punktid 24–27).  
Katse kehtivuse kriteeriumid  
54. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud MNvit-katse kasutamist kavandav 
labor peaks tõendama, et suudab usaldusväärselt ja õigesti määrata teadao ­
leva aneugeense või klastogeense mõjuga kemikaale koos metaboolse akti ­
vatsiooniga ja ilma selleta, samuti teadaolevalt ilma sellise toimeta kemi ­
kaale, kasutades 3. liites esitatud võrdluskemikaale. Tõendina oma suutlik ­
kusest käesolevat katsemeetodit korralikult rakendada peaks labor esitama tõendid, et mikrotuumade moodustumise seisukohast loendatavad rakud on 
läbinud ühe rakujagunemise, kui katse tehakse ilma tsütoB kasutamiseta.
 
55. Võrdluskemikaalidena soovitatakse kasutada 3. liites esitatud kemikaale. 
Võib kasutada ka asendavaid või täiendavaid kemikaale, kui nende toime 
on teada ja need tekitavad mikrotuumi sama toimemehhanismi kaudu ning on näidatud, et need on asjakohased MNvit-eeskirja järgi uuritavate kemi ­
kaalide puhul. Põhjendus võiks hõlmata paljude erinevate ainetega tehtud 
valideerimisuuringut või valideerimisuuringut, mis on suunatud kitsamale 
aineteringile, mis on seotud uuritava aine kemikaaliklassiga või uuritava kahjustusmehhanismiga.
 
56. Lahusti/kandeaine kontrollid ja töötlemata kultuurid peaksid andma repro ­
dutseeritavalt madalad ja kooskõlalised mikrotuumade tekke sagedused (punktis 11 nimetatud rakutüüpide puhul tavaliselt 5–25 mikrotuuma 
1 000 raku kohta). Muul rakutüübil võib olla teistsugune tulemustevahemik, 
mis tuleks kindlaks teha, kui rakutüüpi valideeritakse MNvit-katses kasuta ­
miseks. Negatiivse kontrolli, lahusti ja positiivse kontrolli andmeid tuleks kasutada varasematel andmetel põhinevate kontrollvahemike kindlakstege ­
miseks. Osutatud väärtusi tuleks kasutada selleks, et otsustada, kas katse 
paralleelsed negatiivse ja positiivse kontrolli tulemused on adekvaatsed.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Kui katse-eeskirjas tehakse väike muudatus (näiteks kasutatakse automaatset 
loendamist käsitsi loendamise meetodite asemel, kasutatakse uut rakutüüpi), 
tuleks enne muudetud katse-eeskirja lubatavaks lugemist tõendada, et ka muudetud katse on tõhus. Tõhususe tõendamiseks tuleb muu hulgas tõen ­
dada, et on võimalik kindlaks teha peamisi kromosoomide katkemise, lisan ­
dumise või kaotsimineku mehhanisme ja et on võimalik saada sobivad 
positiivse ja negatiivse kontrolli tulemused üksiku uuritava aine kemikaali ­
klassi või paljude uuritavate ainete puhul.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Tulemuste käsitlemine  
58. Kui kasutatakse tsütokineesibloki meetodit, võetakse mikrotuumade hinda ­
misel arvesse ainult kahetuumsetes rakkudes leitud mikrotuumade esinemise sagedust (sõltumatult mikrotuumade arvust ühe raku kohta). Ühe või kahe 
mikrotuumaga või suurema mikrotuumade arvuga rakkude arvu loendamine 
võib anda kasulikku teavet, kuid ei ole kohustuslik.
 
59. Paralleelselt tuleks mõõta kõikide töödeldud kultuuride ja lahusti/kandeaine 
kontrollikultuuride juures avalduv tsütotoksiline ja/või tsütostaatiline mõju 
(58). Kui kasutatakse tsütokineesi bloki meetodit, tuleks rakutsükli hiline ­
mise mõõtmise järgi arvutada kõikide töödeldud ja kontrollikultuuride puhul tsütokineesi blokiga paljunemise indeks (CBPI) ja replikatsiooniindeks (RI). 
TsütoB puudumise korral tuleks kasutada kas RPDd, RICCi või PId (vt 2. 
liide).
 
60. Tulemused esitatakse iga üksiku kultuuri kohta. Lisaks esitatakse kokkuvõte 
kõikidest tulemustest tabeli kujul.  
61. Mikrotuumade tekkimist MNvit-katses võivad kemikaalid põhjustada 
sellega, et nende tõttu kromosoomid katkevad, lähevad kaotsi või esinevad 
mõlemad variandid korraga. Võib kasutada kinetokoorivastaseid antikehi, tsentromeerispetsiifilisi  in situ  sonde või muid meetodeid, et määrata kind ­
laks, kas mikrotuumade tekkemehhanism on seotud klastogeense ja/või 
aneugeense toimega.
 
Tulemuste hindamine ja tõlgendamine  
62. Selget positiivset või negatiivset vastust ei ole vaja täiendava katsega kont ­
rollida. Ebamäärast tulemust võib selgitada veel 1 000 raku vaatlemisega 
kõikidest kultuuridest, et vältida kultuuride kodeerimise mõttetuks muutu ­
mist. Kui see lähenemisviis ei võimalda tulemust selgitada, tuleks teha edasisi katseid. Järelkatsete tegemisel tuleks kaaluda katse parameetrite 
muutmist laiendatud või kitsamaks muudetud katsetingimuste vahemikus. 
Katse parameetrid, mida võidakse muuta, hõlmavad kasutatavate kontsen ­
tratsioonide jaotust, töötlemise ja rakkude kogumise ajastust ja/või meta ­
boolse aktiveerimise tingimusi.
 
63. Positiivse tulemuse määramiseks on mitmeid kriteeriume, näiteks mikro ­
tuumi sisaldavate rakkude arvu kontsentratsioonist sõltuv suurenemine või statistiliselt oluline suurenemine. Esmalt tuleks arvesse võtta tulemuste 
bioloogilist tähtsust. Vastuse bioloogilise olulisuse hindamisel võib juhin ­
duda sellest, kas leitud väärtused on varasemate kontrollkatsete vahemikus või väljaspool seda vahemikku. Katsetulemuste hindamisel võib abivahen ­
dina kasutada sobivaid statistilisi meetodeid (65). Kuid statistiliste katsete 
tulemusi tuleks hinnata, võttes arvesse saadava tulemuse sõltuvust annusest. 
Samuti tuleks arvesse võtta reprodutseeritavust ja varasemaid andmeid.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Kuigi enamik katseid annab selge positiivse või negatiivse tulemuse, ei ole 
mõnel harval juhul võimalik andmete alusel teha kindlat otsust uuritava aine 
mõju kohta. Tulemused võivad jääda ebaselgeks või küsitavaks, olenemata sellest, kui palju katset korratakse.
 
65. MNvit-katse positiivne tulemus näitab, et uuritav aine tekitab imetajarak ­
kude kultuuris kromosoomide katkemist või kadu. Negatiivne tulemus näitab, et konkreetsetes katsetingimustes ei põhjusta uuritav aine imetaja ­
rakkude kultuuris kromosoomide katkemist ega/või lisandumist või kadu.
 
Katseprotokoll  
66. Katseprotokollis tuleks esitada vähemalt järgmine teave, kui see on uuringu 
läbiviimise seisukohast asjakohane.  
Uuritav kemikaal  
— Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi 
nr ja EÜ nr;  
— füüsikaline olek ja puhtus;  
— uuringu tegemisel olulised füüsikalis-keemilised omadused;  
— uuritava aine võime reageerida lahusti/kandeainega või rakukultuuri 
keskkonnaga.  
Lahusti/kandeaine  
— Lahusti/kandeaine valiku põhjendus;  
— uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines.  
Rakud  
— Kasutatud rakkude tüüp ja päritolu;  
— kasutatud rakutüübi sobivus;  
— mükoplasma puudumine, vajaduse korral;  
— teave rakutsükli pikkuse kohta, pooldumisaeg või paljunemisindeks;  
— lümfotsüütide kasutamise korral veredoonorite arv, sugu ja vanus, vaja ­
duse korral;  
— lümfotsüütide kasutamise korral näidatakse, kas uuritava ainega viidi 
kokkupuutesse kogu veri või eraldatud lümfotsüüdid;  
— ümberkülvide arv, vajaduse korral;  
— rakukultuuri säilitamise meetodid, vajaduse korral;  
— kromosoomide modaalarv;  
— normaalse (negatiivse kontrolli) rakutsükli kestus.  
Katsetingimused  
— Tsütokineesi blokeeriv aine (nt tsütoB), kui seda kasutatakse, selle kont ­
sentratsioon ja rakkude selle ainega kokkupuute kestus;  
— kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, sh nt 
tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud, kui need on olemas;  
— kasvukeskkonna koostis, CO  2 kontsentratsioon, vajaduse korral;  
— uuritava aine kontsentratsioonid;  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— lisatud kandeaine ja uuritava aine kontsentratsioon ja kogus (ja/või 
ruumala);  
— inkubatsiooni temperatuur ja kestus;  
— uuritava ainega töötlemise kestus;  
— ajavahemik töötlemisest kuni rakkude kogumiseni;  
— rakkude tihedus külvamisel, vajaduse korral;  
— metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle heakskiit ­
mise kriteeriumid;  
— positiivse kontrolli kemikaalid ja negatiivsed kontrollid;  
— mikroskoobipreparaatide valmistamise meetodid ja kasutatud värvimis ­
meetodid;  
— mikrotuuma kindlakstegemise kriteeriumid;  
— analüüsitud rakkude arv;  
— tsütotoksilisuse mõõtmise meetodid;  
— igasugune täiendav teave tsütotoksilisuse kohta;  
— kriteeriumid, mille alusel uuringutulemus klassifitseeritakse positiivseks, 
negatiivseks või ebaselgeks;  
— kasutatud statistilise analüüsi meetod(id);  
— vajaduse korral meetodid, millega uuriti, kas mikrotuum sisaldab terveid 
kromosoome või nende fragmente, näiteks kinetokoori antikeha.  
Tulemused  
— Tsütotoksilisuse määramise meetod, mida kasutati tsütokineesi bloki 
meetodi kasutamise puhul, näiteks CBPI või RI; RICC, RPD või PI, 
kui tsütokineesi bloki meetodeid ei kasutatud; vajaduse korral muud 
tähelepanekud, näiteks pinna katmine, apoptoos, nekroos, metafaaside loendamine, kahetuumsete rakkude esinemise sagedus;
 
— sadenemise tunnused;  
— teave kasvukeskkonna pH ja osmolaalsuse kohta, kui see on määratud;  
— analüüsi jaoks kõlblike rakkude määratlus;  
— ühe-, kahe- ja paljutuumsete rakkude jaotus, kui kasutatakse tsütokineesi 
bloki meetodit;  
— mikrotuumadega rakkude arv eraldi igas töödeldud ja kontrollkultuuris; 
vajaduse korral peab olema näidatud, kas on määratud kahetuumsetest või ühetuumsetest rakkudest;
 
— kontsentratsiooni ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;  
— paralleelse negatiivse (lahusti/kandeaine) ja positiivse kontrolli kemikaa ­
lide andmed (kontsentratsioonid ja lahustid);  
— varasemate negatiivsete (lahusti/kandeaine) ja positiivsete kontrollide 
andmed, sh vahemik, keskväärtused ja standardhälbed ning 95 % usal ­
dusvahemik;  
— statistiline analüüs; p-väärtused vajaduse korral.  
Tulemuste arutelu  
Järeldused  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
KIRJANDUS  
1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1–4.  
2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneu ­
genic potential of environmental chemicals: the European Community aneu ­
ploidy project,  Mutation Res. , 287, 3–15.  
3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the 
micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233–246.  
4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167–172.
 
5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084-1104.  
6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193–198.  
7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34–43.
 
8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9–20.  
9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Clas ­
sification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with biotinylated 
gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297–302.
 
10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329–334.  
11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic 
damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and 
micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a centro ­
meric probe,  Mutation Res. , 319, 205–213.  
12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by anti ­
kinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519–525.  
13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes follo ­
wing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor 
fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 
9–20.  
14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluo ­
rescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric 
probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 372, 
233–245.  
15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211–219.  
16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153–163.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Vt: www.oecd.org/env/testguidelines  
18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  
Mutation Res. , 607, 13–36.  
19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37–60.
 
20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61–87.  
21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., 
Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study 
on the  in vitro  micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 
607, 88–124.
 
22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125–152.
 
23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187–208.  
24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
45–59.  
25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alterna ­
tive to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81–116.  
26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically 
induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different 
test approaches,  Mutation Res.  439, 183–190.  
27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55–71.  
28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells - results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137–163.
 
29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  in 
vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Mutation 
Res., 517, 123–134.
 
30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569–580.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International colla ­
borative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1–152.  
32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to the  
in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25  th 
meeting, 16–17 November, 2006. Vt: http://ecvam.jrc.it/index.htm  
33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Vt: http://ecvam.jrc.i ­
t/index.htm  
34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271–283.  
35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, 
T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 
347, 105–115.
 
36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257–260.  
37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of 
human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315–328.
 
38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61–70.
 
39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147–205.
 
40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 
297–305.  
41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789–886.  
42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes,  Mutation Res. , 147, 29–36.  
43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11–18.  
44) Bonassi, S.,  Fenech, M ., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., 
Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman Micro ­
Nucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31–45.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173–215.  
46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 4, 
55–65.
 
47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., 
Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced 
S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175–177.  
48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activa ­
tion Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. 
(eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85–88.  
49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51–59.  
50) UNEP (2001), püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsioon, 
ÜRO keskkonnaprogramm (UNEP). Vt: http://www.pops.int/  
51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to 
genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
247–274.  
52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Muta ­
tion Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., Costa, 
D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91–103.
 
53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795–801.
 
54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed 
description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35–44.
 
55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Mutation 
Res., 521, 103–112.  
56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to 
„Report from the  in vitro  micronucleus assay working group”,  Mutation 
Res., 564, 97–100.  
57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61–65.  
58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in vitro  
micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1–3.  
59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in 
whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169–184.  
60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191–201.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241–247.  
62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269–275.
 
63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, 241–247.  
64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65–75.  
65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463–467.  
66) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 850/2004, 29. aprill 2004, 
püsivate orgaaniliste saasteainete kohta ning millega muudetakse direktiivi 79/117/EMÜ, ELT L 229, 30.4.2004, lk 5.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
1. liide  
Mõisted  
Aneugeen:  iga aine või protsess, mis raku mitootilise või meiootilise jagunemise 
tsükli komponentidega interakteerudes tekitab rakkudes või organismides aneu ­
ploidsust.  
Aneuploidsus:  iga kõrvalekalle normaalsest diploidsest (või haploidsest) kromo ­
soomiarvust ühe või enama kromosoomi võrra, kuid mitte terve(te) kromosoo ­
mikomplekti(de) võrra (polüploidia).  
Apoptoos:  programmeeritud rakusurm, mida iseloomustab rida astmeid, mis 
viivad raku lagunemiseni membraaniga seotud osakesteks, mis kõrvaldatakse 
fagotsütoosi või väljutamisega.  
Rakkude paljunemine:  rakkude arvu suurenemine mitootilise rakujagunemise 
tagajärjel.  
Tsentromeer:  kromosoomi DNA-piirkond, kus mõlemaid kromatiide hoitakse 
koos ja mille külge teineteise kõrvale kinnituvad mõlemad kinetokoorid.  
Klastogeen:  iga aine või protsess, mis tekitab rakkude või organismide populat ­
sioonides struktuurseid kromosoomihälbeid.  
Tsütokinees:  mitoosile vahetult järgnev rakujagunemise protsess, mille tulemusel 
tekivad kaks tütarrakku, millest kummaski on üksainus tuum.  
Tsütokineesi blokiga paljunemise indeks (cytokinesis-block proliferation index, 
CBPI):  teise rakujagunemise rakkude osakaal töödeldud rakupopulatsioonis, 
võrreldes töötlemata kontrolliga (vt võrrand, 2. liide).  
Tsütostaas:  rakkude kasvu inhibeerimine (vt võrrand, 2. liide).  
Tsütotoksilisus:  kahjulik mõju raku struktuurile või funktsioonidele, mis lõpuks 
põhjustab raku surma.  
Genotoksiline:  üldine termin, mis hõlmab DNA või kromosoomide igasugust 
kahjustust, sealhulgas katkemisi, aduktidega seotud ümberkorraldumist, mutat ­
sioone, kromosoomihälbeid ja aneuploidsust. Mitte kõik genotoksilised efektid ei anna tulemuseks mutatsioone või püsivat kromosoomikahjustust.
 
Interfaasirakud:  rakud, mis ei ole mitoosifaasis.  
Kinetokoor:  valke sisaldav struktuur, mis koondub kromosoomi tsentromeeri 
juures, millele raku jagunemise ajal kinnituvad kääviniidid, võimaldades tütar ­
kromosoomidel korrastatult liikuda tütarrakkude poolustele.  
Mikrotuum:  väike tuum, mis on raku põhituumast eraldi ja lisandunud põhituu ­
male, see on moodustunud mitoosi või meioosi telofaasi ajal mahajäänud kromo ­
soomifragmentidest või tervetest kromosoomidest.  
Mitoos:  rakutuuma jagunemine, mida tavaliselt jagatakse profaasiks, prometafaa ­
siks, metafaasiks, anafaasiks ja telofaasiks.  
Mitootiline indeks:  metafaasis olevate rakkude arv jagatakse rakupopulatsioonis 
vaadeldud rakkude koguarvuga; näitab rakkude paljunemise astet kõnealuses 
populatsioonis.  
Mutageenne:  tekitab päriliku muutuse geenide DNA alusepaaride järjestuses või 
kromosoomide struktuuris (kromosoomihälve).  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Mitteeraldumine:  paardunud kromatiidid ei eraldu teineteisest ega liigu kujune ­
vatesse tütarrakkudesse nii, nagu see peaks normaalselt toimuma; tulemuseks on 
ebanormaalse kromosoomide arvuga tütarrakud.  
Polüploidsus:  rakkude või organismi numbriline kromosoomihälve, mis hõlmab 
terveid kromosoomikomplekte; vastandub aneuploidsusele, mille puhul kromo ­
soomihälve hõlmab üht või mitut kromosoomi.  
Paljunemisindeks (Proliferation Index, PI):  tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, 
kui tsütoB-d ei kasutata (vt võrrand, 2. liide).  
Rakkude arvukuse suhteline suurenemine (Relative Increase in Cell Count, 
RICC):  tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, kui tsütoB-d ei kasutata (vt võrrand, 
2. liide).  
Rakupopulatsiooni suhteline kahekordistumine (Relative Population Doubling, 
RPD):  tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, kui tsütoB-d ei kasutata (vt võrrand, 
2. liide).  
Replikatsiooniindeks (Replication Index, RI):  lõpuni kulgenud rakujagunemistsü ­
klite osakaal töödeldud rakukultuuris, võrreldes töötlemata kontrolliga, rakkude 
töötlemise ja toibumise ajal (vt võrrand, 2. liide).  
Uuritav kemikaal (ka „uuritav aine”):  iga aine või segu, mida uuritakse käes ­
oleva katsemeetodi abil.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
2. liide  
Tsütotoksilisuse hindamise võrrandid  
1. Kui kasutatakse tsütoB-d , peaks tsütotoksilisus põhinema tsütokineesi 
blokiga paljunemise indeksil (cytokinesis-block proliferation index, CBPI) või 
replikatsiooniindeksil (RI) (16, 58). CBPI näitab rakutsüklite keskmist arvu 
raku kohta tsütoB-ga kokkupuutumise aja jooksul ja seda võib kasutada raku paljunemise arvutamiseks. Replikatsiooniindeks RI näitab tuumade suhtelist arvu töödeldud kultuurides võrrelduna kontrollkultuuridega ja seda võib kasutada 
tsütostaasi protsendi arvutamiseks:
 
tsütostaasi % = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
ning 
T = uuritava kemikaaliga töödeldud kultuur  
C = kandeaine kontrolli kultuur  
siis: 
CBPI ¼ ðð1 Ä tuums : rakkude arvÞ þ ð2 Ü 2 Ä tuums : rakkude arvÞ þ ð3 Ü paljutuums : rakkude arvÞÞ 
ðrakkude koguarvÞ 
Seega vastab CBPI väärtus 1 (kõik rakud on ühetuumsed) 100 % tsütostaasile.  
Tsütostaas = 100 – RI  
RI ¼ ðð2 Ä tuums : rakkude arvÞ þ ð2 Ü 1 Ä tuums : rakkude arvÞÞ ö ðrakkude koguarvÞ T 
ðð2 Ä tuums : rakkude arvÞ þ ð2 Ü 1 Ä tuums : rakkude arvÞÞ ö ðrakkude koguarvÞ C Ü 100  
T = töödeldud kultuurid  
C = kontrollkultuurid  
2. RI = 53 % tähendab seega, et kui kontrollkultuurides on teatav arv rakke 
jagunenud ja moodustanud kahetuumseid ja paljutuumseid rakke, siis töödeldud 
kultuuris on jagunenud kõigest 53 % sellest arvust, see tähendab 47 % oli tsütostaasi.
 
3. Kui tsütoB-d ei kasutata , soovitatakse tsütotoksilisust hinnata rakkude arvu ­
kuse suhtelise suurenemise (Relative Increase in Cell Counts, RICC) või raku ­
populatsiooni suhtelise kahekordistumise (Relative Population Doubling, RPD) 
järgi (58), kuna mõlema näitaja puhul võetakse arvesse jagunenud rakkude 
osakaalu rakupopulatsioonis.  
RICC ¼ ðrakkude arvu suurenemine töödeldud kultuurides  ðlõplik – algusesÞÞ 
ðrakkude arvu suurenemine kontrollkultuurides  ðlõplik – algusesÞÞ Ü 100  
RPD ¼ ðpopulatsiooni kahekordistumiste arv töödeldud kultuurides Þ 
ðpopulatsiooni kahekordistumiste arv kontrollkultuurides Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
kus: 
populatsiooni kahekordistumine = [log (rakkude arv pärast töötlust ÷ esialgne 
rakkude arv)] ÷ log 2  
4. Seega tähendab 53 % RICC või RPD, et 47 % oli tsütotoksilisust/tsütos ­
taasi.  
5. Tsütotoksilisust võib hinnata 1 rakust koosnevate kloonide (cl1), 2 rakust 
koosnevate kloonide (cl2), 3–4 rakust koosnevate kloonide (cl4) ja 5–8 rakust 
koosnevate kloonide (cl8) loendamise ja paljunemisindeksi (PI) kasutamisega:  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. PI-d on kasutatud tsütotoksilisuse väärtusliku ja usaldusväärse näita ­
jana ka rakuliinide puhul, mida on kultiveeritud  in situ  tsütoB puudumisel 
(25, 26, 27, 28).  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
3. liide  
Tulemuslikkuse hindamiseks soovitatavad võrdluskemikaalid  ( 1 ) 
Kategooria Kemikaal CASi nr EÜ nr  
1. Ilma metaboolse aktivatsioonita toimivad klastogeenid 
tsütosiinarabinosiid 147-94-4 205-705-9 mitomütsiin C 50-07-7 200-008-6 
2. Metaboolset aktivatsiooni vajavad klastogeenid 
benso(a)püreen 50-32-8 200-028-5 
tsüklofosfamiid 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugeenid 
kolhitsiin 64-86-8 200-598-5 vinblastiin 143-67-9 205-606-0 
4. Negatiivsed ained 
di-(2-etüülheksüül)ftalaat 117-81-7 204-211-0 
nalidikshape 389-08-2 206-864-7 püreen 129-00-0 204-927-3 naatriumkloriid 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Võrdluskemikaalid on kasutamiseks soovitatavad kemikaalid. Võrdluskemikaale võib asendada või lisada loetelusse uusi kemikaal e, 
kui nende toime on teada ja need tekitavad mikrotuumi sama toimemehhanismi kaudu ning on näidatud, et need on asjakohased 
MNvit-eeskirja järgi uuritavate kemikaalide puhul. Otstarbest olenevalt võiks põhjendus hõlmata ka paljude erinevate ainetega 
tehtud valideerimisuuringut või valideerimisuuringut, mis on suunatud kitsamale aineteringile, mis on seotud uuritava aine kemi ­
kaaliklassiga või uuritava kahjustusmehhanismiga.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕLMEDE 
KATSE: DA  
SISSEJUHATUS  
1. OECD kemikaalide katsetamise juhendeid ja ELi katsemeetodeid vaadatakse 
korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaolu. Esialgne katsemeetod (B.42) naha sensibilisee ­
rimise määramiseks hiirtel lokaalsete lümfisõlmede katsega ( Local Lymph 
Node Assay  – LLNA; OECD katsejuhend 429) on läbi vaadatud (1). Kirja ­
nduses on avaldatud LLNA valideerimise üksikasjad ja ülevaade sellega seotud töödest (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9). LLNA-meetodi järgi kasutatakse 
lümfotsüütide paljunemise määramiseks radioaktiivse isotoobiga märgistatud 
tümidiini või joodi ja seepärast ei saa katset kasutada, kui radioaktiivsete ühendite hankimine, kasutamine või kõrvaldamine tekitab probleeme. LLNA: DA (mille töötas välja Daicel Chemical Industries, Ltd.) on LLNA variant, 
mis on vaba radioaktiivsusest ja milles lümfotsüütide paljunemise näitajana 
kasutatav adenosiintrifosfaadi (ATP) sisaldus määratakse bioluminestsentsi abil. Katsemeetod LLNA: DA on valideeritud ja läbi vaadatud ning rahvus ­
vaheline eksperdihinnangu komisjon soovitab seda, kuna leiab, et see sobib 
naha sensibiliseerumist põhjustavate ja mittepõhjustavate kemikaalide kind ­
lakstegemiseks, arvestades teatavaid piiranguid (10, 11, 12, 13). Käesolev katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata katseloomadel kemikaalide (ainete ja segude) võimet sensibiliseerida nahka. Käesoleva lisa peatükis 
B.6 ja OECD katsejuhendis 406 kasutatakse merisigu, nimelt merisigade 
maksimeerimise katset ja Buehleri katset (14). LLNAd (käesoleva lisa peatükk B.42, OECD katsejuhis 429) ja selle kahte radioaktiivsuse kasuta ­
miseta versiooni, need on LLNA: DA (käesoleva lisa peatükk B.50, OECD 
katsejuhis 442 A) ja LLNA: BrdU-ELISA (käesoleva lisa peatükk B.51, 
OECD katsejuhis 442 B), tuleb eelistada meriseakatsetele peatükis B.6, OECD katsejuhis 406 (14), kuna nendega vähendatakse ja täiustatakse katse ­
loomade kasutamist.
 
2. Nii nagu LLNA puhul, uuritakse LLNA: DA katsetes naha sensibiliseerimise 
induktsioonifaasi ja saadakse kvantitatiivseid andmeid immuunvastuse annu ­
sest sõltuvuse hindamiseks. Lisaks kõrvaldab võimalus määrata naha sensi ­
biliseerijaid ilma DNA radioaktiivset märgist kasutamata tööalase kokku ­
puute radioaktiivsusega ja radioaktiivsete jäätmete probleemi. See omakorda 
võimaldab naha sensibiliseerijate määramiseks kasutada rohkem hiiri, millega võiks veelgi väheneda merisigade kasutamine (s.o peatükk B.6, OECD katse ­
juhis 406) (14) selleks otstarbeks.
 
MÕISTED  
3. Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.  
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
4. LLNA: DA on muudetud LLNA-meetod võimalike nahka sensibiliseerivate 
kemikaalide kindlakstegemiseks, millel on aga teatavad piirangud. See ei 
tähenda tingimata, et kõikidel juhtudel tuleks kasutada LLNA või merisiga ­
dega tehtavate katsete (B.6 ja OECD katsejuhend 406) (14) asemel LLNA: DAd, vaid pigem, et uuring on sama hea ja seda võib kasutada alternatiivina, 
mille positiivsed või negatiivsed tulemused üldiselt ei vaja täiendavat kinni ­
tamist (10, 11). Katselabor võtab arvesse kogu uuritava aine
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave hõlmab aine 
nimetust ja keemilist struktuuri, füüsikalis-keemilisi omadusi, muude aine ­
tega in vitro  või in vivo  tehtud toksilisuskatsete tulemusi ja struktuurilt 
samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid. Osutatud teavet tuleb analüü ­
sida, et määrata kindlaks, kas LLNA: DA sobib kõnealuse aine puhul (arves ­
tades LLNA: DA sobimatust teatavate piiratud kemikaalitüüpide puhul, vt 
punkt 5) ning valida sobivad annused.  
5. LLNA: DA on  in vivo  meetod ja seetõttu ei lõpeta see loomade kasutamist 
naha allergilise sensibiliseerimise hindamisel. Sellega on siiski võimalik 
vähendada katseloomade kasutamist selleks otstarbeks, võrreldes merisiga ­
dega tehtavate katsetega (B.6, OECD katsejuhis 406) (14). Lisaks võimaldab LLNA: DA oluliselt parandada viisi, kuidas loomi kasutatakse naha allergi ­
lise sensibiliseerimise määramiseks (vähem tekitatakse valu ja kannatusi), 
kuna erinevalt B.6st ja OECD katsejuhendist 406 ei eelda LLNA: DA, et 
naha ärritamisega tekitataks ülitundlikkusreaktsioone. Hoolimata LLNA: DA eelistest B.6 või OECD katsejuhendi 406 (14) kohaste katsetega võrreldes on 
teatud piirangud, mis võivad tingida B.6 või OECD katsejuhendi kohaste 
katsete 406 kasutamist (nt teatavate metallide katsetamine, valepositiivid teatavate nahaärritajate puhul (näiteks teatavat tüüpi pindaktiivsed kemi ­
kaalid) (6) (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42), uuritavate ainete lahustuvus). 
Lisaks võib teatavate kemikaaliklasside või ainete puhul, mis sisaldavad 
segavat toimet avaldada võivaid funktsionaalseid rühmi (16), olla vaja kasu ­
tada meriseakatseid (st B.6 või OECD katsejuhendit 406 (14)). LLNA puhul kindlaks tehtud piiranguid (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42) on peetud 
kehtivateks ka LLNA: DA puhul (10). Lisaks ei tarvitse LLNA: DA kasu ­
tamine olla sobiv selliste ainete uurimiseks, mis mõjutavad ATP taset (näiteks ATP inhibiitorina toimivad ained) või segavad rakusisese ATP täpset määramist (nt ATPd lagundavate ensüümide juuresolek, rakuvälise ATP 
olemasolu lümfisõlmes). Selliste teadaolevate piirangute arvestamisega 
peaks LLNA: DA olema kohaldatav igasuguste ainete uurimiseks, millel ei ole omadusi, mis võiksid mõjutada LLNA: DAga saadavate tulemuste õigsust. Lisaks sellele tuleks kaaluda piiripealse positiivse tulemuse võima ­
lust, kui stimulatsiooniindeksi (SI) väärtus tuleb vahemikku 1,8–2,5 (vt 
punktid 31–32). See tugineb 44 ainest koosnevale valideerimise andmebaa ­
sile, milles kasutati SI väärtusi ≥ 1,8 (vt punkt 6), millest LLNA: DA 
võimaldas õigesti kindlaks teha kõik 32 LLNA järgi sensibiliseerijat, kuid 
mis andis vale tulemuse kolme aine puhul 12st LLNA järgi mitte sensibili ­
seerivast ainest, mille SI oli 1,8–2,5 (st piiripealsed positiivsed tulemused) (10). Kuid kuna samu andmeid kasutati SI väärtuste kindlaksmääramiseks ja katsemeetodi ennustusvõime arvutamiseks, võivad esitatud tulemused viia 
tegeliku ennustusvõime ülehindamisele.
 
KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
6. LLNA: DA põhimõte seisneb selles, et sensibilisaatorid kutsuvad esile 
lümfotsüütide vohamise lähimates lümfisõlmedes, mis dreenivad uuritava 
aine pealekandmise paika. Vohamine on võrdeline pealekantud allergeeni 
annuse ja allergiatekitamisvõimega ning see võimaldab lihtsa meetodiga sensibiliseerimist kvantitatiivselt mõõta. Vohamist mõõdetakse nii, et kesk ­
mist vohamist igas katserühmas võrreldakse keskmise vohamisega 
kandeaine-kontrollrühmas, mille liikmeid on töödeldud üksnes kandeainega 
(vehicle treated control  – VC). Määratakse igas uuritava ainega töödeldud
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
rühmas leitud keskmise vohamise ja paralleelselt kandeaine-kontrollrühmas 
leitud keskmise vohamise suhtarv, mida nimetatakse 
stimulatsiooniindeksiks (SI); SI peab olema vähemalt 1,8 selleks, et katseaine kui naha võimaliku sensibiliseerija edasine hindamine oleks vajalik. Siin kirjeldatud meetod põhineb sellel, et bioluminestsentsi järgi mõõdetakse 
ATP sisaldust ja (kuna see korreleerub elusrakkude arvuga) (17) hinnatakse 
selle järgi paljunevate rakkude arvu suurenemist kõrvalesta dreenivates lümfisõlmedes (18, 19). Bioluminestsentsi meetodis kasutatakse ensüümi lutsiferaasi, mis katalüüsib valguse tekkimist ATPst ja lutsiferiinist vastavalt 
järgmisele reaktsioonile:
 
ATP + lutsiferiin  + O 2
 oksülutsiferiin  + AMP  + PP  i + CO  2 + valgus  
Eralduva valguse intensiivsus on lineaarselt seotud ATP kontsentratsiooniga 
ja seda mõõdetakse luminomeetriga. Lutsiferiini-lutsiferaasi katse on tundlik meetod ATP kvantitatiivseks mõõtmiseks ja seda kasutatakse paljudes meeto ­
dites (20).
 
KATSE KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
7. Käesoleva katse jaoks valitud liik on hiir. LLNA: DA valideerimisuuringud 
tehti ainult CBA/J-liini hiirtega, mida seepärast peetakse eelistatavaks liiniks 
(12, 13). Kasutatakse noori täiskasvanud emashiiri, kes ei ole poeginud ega 
tiined. Katse alguses peaksid loomad olema 8–12 nädalat vanad ning loomade kehamassi varieerumine peaks olema minimaalne ja mitte ületama 20 % keskmisest massist. Võib kasutada ka muid liine ja isasloomi, kui on 
olemas piisavalt andmeid selle tõendamiseks, et LLNA: DA immuunvastuses 
ei ole olulisi liini- ja/või soospetsiifilisi erinevusi.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
8. Hiiri tuleks pidada rühmapuurides (21), kui ei esitata nõuetekohast teadus ­
likku põhjendust üksikpuuris pidamise kasuks. Loomade katseruumi tempe ­
ratuur peaks olema 22 ± 3 °C. Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 
30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, on eesmärk hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast 
labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata.
 
Loomade ettevalmistamine  
9. Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise 
võimaldamiseks (kuid mitte kõrvamärkidega) ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise algust, et võimaldada neil kohaneda 
laboritingimustega. Enne katse alustamist uuritakse kõiki loomi, et neil ei 
oleks nähtavaid nahakahjustusi.
 
Annustamislahuste valmistamine  
10. Tahke uuritav aine tuleb lahustada või suspendeerida lahustis või kandeaines 
ja vajaduse korral lahjendada enne hiire kõrvalestale määrimist. Vedelaid 
kemikaale võib annustada puhtal kujul või lahjendada enne annustamist. 
Lahustumatuid keemilisi aineid, näiteks aineid, mida kasutatakse meditsiini ­
seadmetes, tuleb enne hiire kõrvalestale kandmist sobiva solvendiga tõhusalt ekstraheerida, et teha kindlaks kõik ekstraheeritavad koostisained, mille mõju 
tuleks uurida. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, kui ei ole 
stabiilsusandmetega tõendatud, et säilitamine on lubatav.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Usaldusväärsuse kontroll  
11. Positiivse kontrolli kemikaale kasutatakse selleks, et tõendada katsemee ­
todi vajalikku tulemuslikkust: sensibiliseerivate uuritavate ainetega, mille 
puhul immuunvastuse ulatus on hästi kirjeldatud, saadakse õige ja korratav tulemus. Soovitatakse teha paralleelselt positiivse kontrolli katse, kuna see tõendab labori võimet teha iga katse õigesti ning 
võimaldab hinnata laborisisest ja laboritevahelist korratavust ja võrrelda ­
vust. Mõned reguleerivad asutused nõuavad positiivset kontrolli iga uuringu puhul ja seepärast soovitatakse käesoleva meetodi kasutajatel konsulteerida enne LLNA: DA tegemist asjakohaste asutustega. Seepärast 
soovitatakse alati teha paralleelselt positiivse kontrolli katsed, et vältida 
vajadust teha täiendavaid loomkatseid, et täita nõudeid, mis võivad tekkida perioodilise positiivse kontrolli kasutamise puhul (vt punkt 12). Positiivne kontroll peaks andma positiivse LLNA: DA immuunvastuse 
kokkupuutetasemel, mis eeldatavasti suurendab stimulatsiooniindeksit 
(SI) 1,8 korda või enam, võrreldes negatiivse kontrollrühmaga. Positiivse kontrolli annus tuleks valida nii, et see ei põhjustaks ulatuslikku nahaär ­
ritust või süsteemset mürgitust ja tekitatav mõju oleks korratav, kuid 
mitte liiga suur (näiteks stimulatsiooniindeksit üle 10 peetakse liiga 
suureks). Eelistatud positiivse kontrolli ained on 25 % heksüülkaneelal ­
dehüüd (Chemical Abstracts Service (CASi) number 101-86-0) ja 25 % eugenool (CASi number 97-53-0) atsetooni-oliiviõli segus (4: 1, v/v). 
Võib olla olukordi, kus piisavalt põhjendatult võib kasutada muid posi ­
tiivse kontrolli aineid, mis vastavad eespool esitatud kriteeriumidele.
 
12. Kuigi igas katses soovitatakse paralleelselt teha katsed ka positiivse kontrolli 
rühmaga, võib esineda olukordi, kus labori jaoks, milles korrapäraselt (st 
vähemalt kord kuus) tehakse LLNA: DAd ja on olemas varasemate positiivse 
kontrolli katsete andmebaas, mis tõendab labori võimet saada korratavaid ja õigeid positiivse kontrolli tulemusi, võib sobiv olla perioodiline positiivse kontrolli tegemine (näiteks kuni kuue kuu järel). Vajalikku oskuste taset 
LLNA: DA alal võib tõendada vähemalt kümne sõltumatu ja omavahel 
kooskõlas oleva positiivse kontrolli katsega, mis on tehtud mõistliku ajava ­
hemiku (vähem kui aasta) jooksul.
 
13. Paralleelset positiivse kontrolli rühma tuleb alati kasutada siis, kui muutub 
LLNA: DA läbiviimine (näiteks uued väljaõppe saanud töötajad, katsemee ­
todi materjalide ja/või reaktiivide muutus, katsemeetodi läbiviimise tehniliste vahendite muutus, uus katseloomade tarnija), ja sellised muutused tuleb laboriprotokollis dokumenteerida. Tuleb analüüsida selliste muutuste mõju 
varasemate katsetega loodud andmebaasi järjepidevusele ja otsustada, kas 
on vaja teha uus andmebaas, et dokumenteerida kooskõla varasemate posi ­
tiivse kontrolli tulemustega.
 
14. Meetodi kasutajad peaksid teadma, et otsus kasutada positiivset kontrolli 
perioodiliselt, mitte paralleelselt, mõjutab perioodilise positiivse kontrolli 
vahepealsel ajal ilma positiivse kontrollita saadud negatiivsete uuringutule ­
muste adekvaatsust ja vastuvõetavust. Kui perioodilise positiivse kontrolli katses saadakse näiteks valenegatiiv, võib ajavahemikus viimasest vastuvõe ­
tavast positiivse kontrolli katsest kuni vastuvõetamatu kontrollkatseni uurita ­
vate ainetega saadud negatiivsed tulemused panna kahtluse alla. Selliste 
tulemuste tähendust tuleks hoolikalt analüüsida, kui otsustatakse, kas teha positiivse kontrolli katseid paralleelselt või üksnes perioodiliselt. Mõelda tuleb ka, kuidas kasutada vähem loomi paralleelses positiivse kontrolli 
rühmas, kui see on teaduslikult põhjendatud ja kui labor tõendab oma vara ­
semate andmetega, et on võimalik kasutada vähem hiiri (22).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Kuigi positiivset kontrollainet tuleks uurida kandeaines, mis teatavasti annab 
teatava kindla immuunvastuse (nt atsetoon-oliiviõli, suhtes 4: 1, v/v), võib 
esineda teatavaid regulatiivseid olukordi, milles on vaja teha katseid ka ebatavalise kandeainega (kliiniliselt või keemiliselt asjakohane segu) (23). Kui paralleelset positiivse kontrolli katset tehakse muu kandeainega kui 
uuritava aine puhul, on vaja moodustada eraldi veel positiivse kontrolli 
kandeaine-kontrollrühm.
 
16. Kui uuritakse teatava keemiliste ühendite klassi aineid või mõõdetakse nende 
poolt esile kutsutava immuunvastuse vahemikku, võib olla kasulik mõõta 
teatavaid võrdlusaineid, millega tõendatakse, et katse võimaldab õigesti 
määrata kõnealuste ühenditüüpide võimet nahka sensibiliseerida. Sobival võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused:
 
— struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega;  
— teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused;  
— varasemad toetavad LLNA: DA andmed;  
— toetavad andmed muude katseloomade ja/või inimese kohta.  
KATSE KÄIK  
Loomade arv ja annusemäärad  
17. Ühes annuserühmas on vähemalt neli looma, kasutatakse vähemalt kolme 
uuritava aine kontsentratsiooni ja paralleelselt negatiivset kontrollrühma, 
keda töödeldakse üksnes kandeainega, mida kasutatakse uuritava aine 
puhul, ning positiivse kontrolli rühma (kas paralleelne või hiljutine positiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–15). Tuleb kaaluda positiivse kontrolli tegemist mitme annusega, eriti kui positiivset kontrolli 
tehakse aeg-ajalt. Kontrollrühma loomi koheldakse ja töödeldakse nii nagu 
katserühma loomi, välja arvatud töötlemine uuritava ainega.
 
18. Annuse ja kandeaine valik peaks põhinema viidetes 2 ja 24 antud soovitustel. 
Tavaliselt valitakse järjestikused annused sobivast kontsentratsioonide reast, 
näiteks 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. Kasutatava kontsentratsioonide rea valimisel peaks olema asjakohane teaduslik põhjendus. Tuleks arvesse võtta kõik olemasolevad toksikoloogiaandmed 
(nt ägeda toksilisuse ja nahaärrituse kohta) ning andmed uuritava aine struk ­
tuuri ja füüsikalis-keemiliste omaduste kohta ning valida kolm järjestikust kontsentratsiooni nii, et kõrgeim kontsentratsioon tagab maksimaalse võima ­
liku kokkupuute, kuid selle puhul ei avaldu süsteemset toksilisust ega liiga 
suurt paikset nahaärritust (24, 25). Sellise teabe puudumisel võib olla vajalik 
teha esialgne sõelkatse (vt punktid 21–24).
 
19. Kandeaine ei tohiks segada katse tegemist ega muuta katse tulemust ja tuleks 
valida nii, et viia lahustuvus maksimumini, et kasutada kõrgeimat võimalikku 
kontsentratsiooni ja saada ühtlasi uuritava aine pealekandmiseks sobiv lahus 
või suspensioon. Soovitatavad kandeained on atsetoon-oliiviõli (4: 1, v/v),  
N,N-dimetüülformamiid, metüületüülketoon, propüleenglükool ja dimetüül ­
sulfoksiid (6), kuid võib kasutada ka muid kandeaineid, kui esitada selleks 
piisav teaduslik põhjendus. Teatud olukorras võib osutuda vajalikuks kasu ­
tada täiendavaks kontrolliks kliiniliselt asjakohast lahustit või kaubandus ­
likku valmistist, milles uuritavat ainet turustatakse. Tuleks jälgida, et hüdro ­
fiilsed ained kantaks peale kandeainesüsteemi abil, mis märgab nahka ega 
voola nahalt kohe maha; selleks lisatakse sobivaid solubiliseerijaid (nt 1 % 
Pluronic® L92). Seepärast tuleks täielikku vesilahust vältida.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Iga üksiku hiire lümfisõlmede töötlemine võimaldab hinnata loomadevahelist 
varieeruvust ja statistiliselt võrrelda uuritavate ainetega tehtud mõõtmiste ja 
kandeaine-kontrollrühma mõõtmiste erinevust (vt punkt 33). Lisaks saab positiivse kontrolli rühma hiirte arvu vähendamise võimalikkust hinnata siis, kui kogutakse iga üksiku hiire andmeid (22). Lisaks nõuavad mõned 
reguleerivad asutused iga üksiku looma andmete kogumist. Üksikuid loomi 
käsitlevate andmete korrapärane kogumine annab loomade heaoluga seotud eelise, kuna võimaldab vältida korduvate uuringute tegemist, mis oleks häda ­
vajalik, kui uuritavate ainete tulemusi, mis algselt on kogutud ühel viisil 
(näiteks loomade andmete ühendamisega), peaks reguleeriv asutus hiljem 
vaatlema teiste nõuete alusel (näiteks üksikloomade andmete põhjal).
 
Esialgne sõelkatse  
21. Kui ei ole andmeid suurima uuritava annuse kindlaksmääramiseks (vt punkt 
18), tuleks teha esialgne sõelkatse, et leida LLNA: DA jaoks sobiv annuste vahemik. Esialgse sõelkatse eesmärk on saada andmeid, mille järgi määrata 
suurim LLNA: DA põhikatses kasutatav annus, kui ei ole teada kontsentrat ­
sioon, millel avaldub süsteemne toksilisus (vt punkt 24) ja/või tekib ülemää ­
rane nahaärritus (vt punkt 23). Suurim uuritav annus peab olema 100 % vedela katseaine puhul või kõrgeim võimalik kontsentratsioon tahke aine 
või suspensiooni puhul.
 
22. Esialgne sõelkatse tehakse samades tingimustes kui LLNA: DA põhikatse, 
kuid ei hinnata lümfisõlmede vohamist ja annuserühma kohta võidakse kasu ­
tada vähem katseloomi. Annuserühmas on soovitatavalt üks või kaks hiirt. Kõiki hiiri vaadeldakse iga päev, et leida süsteemse toksilisuse kliinilisi 
ilminguid või paikset nahaärritust pealekandmiskohas. Registreeritakse keha ­
kaal enne katset ja enne katse lõppu (8. päev). Iga hiire kumbagi kõrvalesta uuritakse punetuse suhtes ja hinnatakse selle aste, kasutades tabelit 1 (25). Kõrvalesta paksust mõõdetakse paksusemõõtja (nt digitaalne mikromeeter 
või paksusemõõtja Peacock Dial) abil 1. päeval (enne annustamist), 3. päeval 
(ligikaudu 48 tundi pärast esimest annust), 7. päeval (24 tundi enne katse lõpetamist) ja 8. päeval. Lisaks võib 8. päeval mõõta kõrvalesta paksuse, milleks pärast looma humaanset surmamist lüüakse kõrvalestast mulgustajaga 
välja tükk ja kaalutakse. Ulatuslikku paikset nahaärritust näitab vähemalt 
hindele 3 vastav punetus ja/või kõrvalesta paksuse suurenemine vähemalt 25 % mõnel mõõtmispäeval (26, 27). LLNA: DA põhikatse jaoks valitud suurim annus on järgmine väiksem annus esialgse sõelkatse kontsentratsioo ­
nide reas (vt punkt 18), mille puhul ei avaldu süsteemne toksilisus ega teki 
ülemäärast nahaärritust.
 
Tabel 1  
Punetuse hinne  
Nähud Hinne  
Nahapunetust ei esine 0 
Väga nõrk (vaevumärgatav) nahapunetus 1 Selgesti nähtav nahapunetus 2
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Nähud Hinne  
Mõõdukas kuni tugev nahapunetus 3 
Tugev nahapunetus (meenutab peeti) kuni kooriku tekkimine, mis takistab 
nahapunetuse astme edasist täpsustamist 4 
23. Lisaks kõrvalesta paksuse 25 % suurenemisele (26, 27) on ärritust tekitavate 
ainete kindlakstegemiseks LLNA abil kasutatud ka kõrvalesta paksuse statistili ­
selt olulist suurenemist töödeldud hiirtel, võrreldes kontrollrühma hiirtega (28, 29, 30, 31, 32, 33, 34). Ent kuigi statistiliselt oluline kõrvalesta paksuse suure ­
nemine võib olla ka väiksem kui 25 %, ei ole selline paksuse suurenemine 
konkreetselt seotud ülemäärase nahaärritusega (30, 31, 32, 33, 34).
 
24. Kui kliinilisi uuringuid kasutatakse LLNA: DA põhikatses kasutatava 
suurima annuse hindamise osana, siis süsteemset toksilisust (35) võivad näidata järgmised kliinilised tunnused: närvisüsteemi talitluse muutused (nt karva püstitõusmine, liigutuste koordinatsiooni kadu, värin ja krambid), 
käitumise muutused (nt agressiivsus, muutus oma karvkatte hooldamises, 
liikumisaktiivsuse oluline muutus), hingamise muutused (s.o hingamissage ­
duse ja -sügavuse muutused, nagu raskendatud hingamine, õhuahmimine, räginad) ning muutused toidu ja vee tarbimises. Lisaks tuleb hindamisel 
arvestada letargia ja/või mittereageerimise märke ning rohkem kui kerge 
või lühiajalise valu või ebamugavustunde kliinilisi tunnuseid, samuti rohkem kui 5 % kehakaalu vähenemist ajavahemikus 1.–8. päevani ning suremust. Suremas olevad loomad ja loomad, kes näitavad suure valu või kannatuste 
tunnuseid, tuleks humaanselt surmata (36).
 
Põhiuuringu katse ajakava  
25. Katse ajakava on järgmine.  
— 1. päev:  määratakse iga üksiku looma mass ja registreeritakse koos kõigi 
võimalike kliiniliste tähelepanekutega. Kummagi kõrvalesta välisküljele kantakse naatriumlaurüülsulfaadi (SLS) 1 % vesilahust, kasutades SLSi lahusesse kastetud pintslit ja kattes kogu kõrvalesta väliskülje nelja-viie 
pintslitõmbega. Üks tund pärast SLSiga töötlemist kantakse kummagi 
kõrvalesta välisküljele 25 μl sobivalt lahjendatud uuritavat ainet, üksnes 
kandeainet või positiivse kontrolli ainet (paralleelne või hiljutine perioo ­
diline positiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 
11–15).
 
— 2., 3. ja 7. päev:  korratakse 1. päeval tehtud eeltöötlust SLSi 1 % 
vesilahusega ja uuritava aine pealekandmist.  
— 4., 5. ja 6. päev:  loomi ei töödelda.  
— 8. päev:  määratakse iga looma mass ja registreeritakse koos kõigi võima ­
like kliiniliste tähelepanekutega. Ligikaudu 24–30 tundi pärast 7. päeval 
toimunud uuritava aine pealekandmise algust surmatakse loomad humaanselt. Igal hiirel lõigatakse välja kumbagi kõrvalesta dreenivad lümfisõlmed ja töödeldakse eraldi iga hiire lümfisõlmi fosfaatpuhvriga 
soolalahuses. Lümfisõlmede leidmise ja väljalõikamise üksikasjad ja 
joonised on esitatud viites (22). Paiksete naha immuunvastuste edasiseks jälgimiseks põhikatses võib katseprotokolli kanda ka täiendavad näitajad, nagu kõrvalesta punetuse hinnang või kõrvalesta paksuse mõõtmise 
andmed (mis saadakse kas paksusemõõtjaga või pärast surmamist kõrva ­
lestast mulgustajaga välja löödud tüki massi mõõtmisega).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Rakususpensioonide valmistamine  
26. Valmistatakse iga hiire mõlemalt küljelt välja lõigatud lümfisõlmerakkude 
üherakuline suspensioon, milleks lümfisõlmed pannakse kahe objektiklaasi 
vahele ja purustatakse klaaside kerge surumisega üksteise vastu. Pärast selle kontrollimist, kas kude on jaotunud õhukese kihina, eraldatakse objekti ­
klaasid teineteisest. Mõlemal objektiklaasil olev kude suspendeeritakse 
fosfaatpuhvriga soolalahuses, milleks kumbagi objektiklaasi hoitakse kaldu 
Petri tassi kohal ja loputatakse puhverlahusega, kraapides samal ajal raku ­
kaabitsaga kudet klaasi küljest lahti. Negatiivse kontrolli loomade lümfi ­
sõlmed on väiksed, seepärast on tähtis tegutseda ettevaatlikult, et vältida 
igasugust kõrvalist mõju SI väärtustele. Kokku tuleks mõlema objektiklaasi 
loputamiseks kasutada 1 ml fosfaatpuhvriga soolalahust. Lümfisõlmerakkude suspensioon Petri tassil tuleb rakukaabitsaga kergelt homogeniseerida. Seejärel võetakse mikropipetiga 20 μl alikvoot lümfisõlmerakkude suspen ­
sioonist, püüdes mitte võtta silmaga nähtavat membraani, ja segatakse siis 
1,98 ml fosfaatpuhvriga soolalahusega, nii et kokku saadakse 2 ml proovi. Samal viisil valmistatakse siis teine 2 ml proov, nii et iga looma kohta saadakse kaks proovi.
 
Rakkude vohamise määramine (lümfotsüütide ATP-sisalduse mõõtmine)  
27. Lümfisõlmede ATP-sisalduse suurenemine määratakse lutsiferiin-lutsiferaasi 
meetodiga, kasutades ATP mõõtmise komplekti, millega bioluminestsents 
määratakse suhtelistes luminestsentsi ühikutes (RLU). Katse tegemise aeg looma tapmisest kuni ATP-sisalduse mõõtmiseni peaks iga üksiku looma puhul olema ühesugune, umbes 30 minuti piires, kuna ATP-sisaldus pärast 
looma tapmist möödunud ajaga järk-järgult väheneb (12). Seega tuleks kogu 
tegevus kõrvalesta lümfisõlmede väljalõikamisest kuni ATP mõõtmiseni lõpetada 20 minuti jooksul vastavalt ettemääratud ajakavale, mis on kõikide loomade puhul ühesugune. ATP luminestsents tuleks mõõta kummaski 2 ml 
proovis, nii et kokku saadakse iga looma kohta kaks ATP mõõtmist. Seejärel 
määratakse kindlaks keskmine ATP luminestsents ja kasutatakse seda edasistes arvutustes (vt punkt 30).
 
TÄHELEPANEKUD  
Kliinilised tähelepanekud  
28. Vähemalt kord päevas tuleks igal loomal hoolikalt vaadelda kliiniliste 
tunnuste esinemist – kas annustamiskoha paikset ärritust või süsteemset 
toksilisust. Iga hiire kohta registreeritakse süstemaatiliselt kõik tähelepa ­
nekud. Jälgimiskavas tuleks ette näha kriteeriumid, mille alusel tehakse kiiresti kindlaks ja surmatakse valutult hiired, kellel avaldub süsteemne toksi ­
lisus, ülemäärane paikne nahaärritus või -söövitus (36).
 
Kehamass  
29. Vastavalt punktile 25 tuleks mõõta iga looma kehamass katse alguses ja 
pärast ettemääratud humaanset surmamist.  
TULEMUSTE ARVUTAMINE  
30. Iga katserühma tulemused väljendatakse keskmise stimulatsiooniindeksi (SI) 
kaudu. SI leidmiseks jagatakse iga uuritava aine rühma ja positiivse kont ­
rollrühma keskmine RLU hiire kohta lahusti-/kandeaine-kontrollrühma kesk ­
mise RLU-ga hiire kohta. Keskmine SI kandeaine-kontrollrühmade puhul on 
seega 1.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Otsustamisel peetakse tulemust positiivseks, kui SI on vähemalt 1,8 (10). 
Kuid piiripealse tulemuse (SI väärtus vahemikus 1,8–2,5) positiivseks leiuks 
kuulutamise otsuse tegemisel võib kasutada ka annuse-immuunvastuse sõltu ­
vuse tugevust, statistilist olulisust ja lahusti/kandeaine ning positiivse kont ­
rolli tulemuste kooskõlalisust (2, 3, 37).  
32. Kui SI on vahemikus 1,8–2,5, st tegemist on piiripealse positiivse tulemu ­
sega, võivad meetodi kasutajad võtta koos SI väärtusega arvesse lisateavet, nagu annuse-immuunvastuse sõltuvus, tõendid süsteemse toksilisuse või 
tugeva nahaärrituse kohta ja vajaduse korral statistilist olulisust, mis kinni ­
tavad positiivset tulemust (10). Arvesse tuleks võtta ka uuritava aine mitme ­
suguseid omadusi, sealhulgas struktuurilist sarnasust teadaolevate naha sensi ­
bilisaatoritega, omadust põhjustada hiirel tugevat paikset nahaärritust ning 
annuse-immuunvastuse sõltuvuse laadi. Neid ja muid kaalutlusi on üksikas ­
jalikult arutatud mujal (4).
 
33. Andmete kogumine üksiku hiire tasandil võimaldab statistiliselt analüüsida, 
kas andmetes on näha annuse-immuunvastuse vahelist sõltuvust ja kui tugev see on. Iga statistiline hindamine peaks hõlmama annuse-immuunvastuse sõltuvuse hindamist ja katserühmade läbimõeldud võrdlemist (näiteks paari ­
viisiline annuserühmade ja paralleelsete lahuse-/kandeaine-kontrollrühmade 
võrdlemine). Statistiline analüüs võib hõlmata näiteks lineaarset regressiooni või Williami testi annuse-immuunvastuse sõltuvuste hindamiseks ja Dunnetti paariviisiliste võrdluste testi. Statistilise analüüsi sobiva meetodi valimisel 
peaks uurija kogu aeg arvesse võtma võimalikku dispersioonide ebavõrdsust 
ja muid seonduvaid probleeme, mille tõttu võib vaja minna andmete teisen ­
damist või mitteparameetrilist statistilist analüüsi. Igal juhul võib uurijal olla vaja teha SI arvutusi ja statistilist analüüsi kõigi andmepunktidega ja siis 
mõne andmepunkti kõrvalejätmisega (nn võõrväärtused).
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
34. Andmed tuleks kokku võtta tabeli vormis; tabelis esitatakse iga üksiklooma 
RLU väärtused, rühma keskmine suhte RLU/katseloom väärtus, selle viga (näiteks standardhälve, standardviga) ja iga annuserühma keskmine SI, võrrelduna paralleelse lahusti/kandeaine-kontrollrühma SI-ga.
 
Katsearuanne  
35. Katsearuandes esitatakse järgmine teave:  
uuritavad kemikaalid ja kontrollkemikaalid:  
— tunnusandmed (näiteks CASi ja EÜ numbrid, kui on teada; allikas; 
puhtus; teadaolevad lisandid; partii number);  
— füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt lenduvus, 
stabiilsus, lahustuvus);  
— kui tegemist on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsen ­
dimäärad;  
lahusti/kandeaine:  
— tunnusandmed (puhtus; kontsentratsioon (vajaduse korral); kasutatud 
ruumala);  
— kandeaine valiku põhjendus;  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
katseloomad:  
— CBA-liini hiirte allikas;  
— loomade mikrobioloogiline staatus, kui see on teada;  
— loomade arv ja vanus;  
— loomade päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;  
katsetingimused:  
— ATP määramise komplekti tootja, partiinumber ja tootja esitatud kvali ­
teeditagamise/kvaliteedikontrolli andmed ATP määramise komplekti kohta;
 
— uuritava aine ettevalmistamise ja annustamise üksikasjad;  
— annuse valiku põhjendus (sealhulgas esialgse sõelkatse tulemused, kui 
see tehti);  
— kandeaine ja uuritava aine kontsentratsioonid ning uuritava aine manus ­
tatud üldkogus;  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);  
— annustamis- ja proovivõtukava üksikasjalik kirjeldus;  
— toksilisuse mõõtmise meetodid;  
— kriteeriumid, mille järgi uuringutulemus loeti positiivseks või negatiiv ­
seks;  
— kõikide katse-eeskirjast kõrvalekaldumiste üksikasjad ja selgitus, kuidas 
kõrvalekaldumine mõjutab uuringu korraldust ja tulemusi;  
usaldusväärsuse kontroll:  
— kokkuvõte viimase usaldusväärsuskontrolli tulemustest, sealhulgas teave 
kasutatud aine, kontsentratsiooni ja kandeaine kohta;  
— katselabori paralleelselt saadud ja/või varasemad positiivse kontrolli ja 
paralleelse negatiivse (lahusti/kandeaine) kontrolli andmed;  
— kui paralleelset positiivse kontrolli katset ei tehtud, siis kõige viimase 
korrapärase positiivse kontrolli uuringu kuupäev ja laboriaruanne ning 
aruanne, milles esitatakse labori varasemad positiivse kontrolli andmed, 
mis põhjendavad paralleelse positiivse kontrolli katse tegematajätmist;  
tulemused:  
— iga looma mass annustamise alguses ja pärast ettemääratud surmamist; 
samuti iga katserühma keskväärtus ja selle viga (näiteks standardhälve, standardviga);
 
— iga looma puhul toksilisuse ilmnemise algus ja nähud, sealhulgas 
võimalik nahaärritus annustamiskohas;  
— iga katselooma surmamise aeg ja tema proovidest ATP mõõtmise aeg;  
— tabelina iga üksiku hiire RLU väärtused ja iga katserühma SI väärtused;  
— iga katserühma RLU/hiire keskväärtus ja selle viga (näiteks standard ­
hälve, standardviga) ning iga katserühma võõrväärtuste analüüsi tule ­
mused;  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— arvutatud SI ja sobiv hajuvuse näitaja, millega võetakse arvesse eri 
loomadega saadud tulemuste hajuvust uuritava aine rühmas ja kontroll ­
rühmas;  
— annuse-immuunvastuse sõltuvus;  
— vajaduse korral statistilised analüüsid;  
tulemuste arutelu:  
— lühike kommentaar tulemuste, annuse-immuunvastuse sõltuvuse analüüsi 
ja vajaduse korral statistilise analüüsi kohta ning järeldused selle kohta, kas uuritud ainet tuleks pidada naha sensibilisaatoriks.
 
KIRJANDUS  
1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt 
http://www.oecd.org/env/testguidelines  
2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999-1002.  
3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985–997.
 
4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327–333.  
5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node 
assay: employment of a regression method that includes determination of 
uncertainty margins.  Toxicol ., 146, 49–59.
 
6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Vt: http://iccvam.niehs. ­
nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf
 
7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258–273.
 
8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274–286.  
9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249–257.  
10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive 
local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10- 7551 A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental 
Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna- 
DA/TMER.htm
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam. ­
niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf.
 
12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Charac ­
terization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. 
Meth. , 58, 1–10.
 
13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. 
(2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node 
assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. Toxicol. 
Meth. , 58, 11–26.
 
14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines 
for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/ ­
testguidelines  
15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896-1904.
 
16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. 
(2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Pharmacol ., 
55, 90–96.
 
17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81–88.  
18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular 
ATP.  J. Immunol. Meth ., 72, 127–132.  
19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27–34.
 
20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, 
enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346–370.  
21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Vt: http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf
 
23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71–89.  
24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 13–31.  
25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.or ­
g/env/testguidelines  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and 
false positive substances.  Toxicologist , 96, 235.  
27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/im ­
munotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf.
 
28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195–206.
 
29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  
Toxicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83–94.  
30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245–256.
 
31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491–506.  
32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and 
Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60–68.
 
33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In 
Vitro  Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_works ­
hop.htm  
36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. 
(1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments 
using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. 
Environ. Health , 53 563–79.  
38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment 
No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.or ­
g/env/testguidelines  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
1. liide  
MÕISTED  
Täpsus:  katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. 
Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. 
Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab 
katsemeetod õige tulemuse (38).  
Võrdlusaine:  sensibiliseeriv või muu aine, mida kasutatakse standardina võrdle ­
miseks uuritava ainega. Võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuri ­
tava ainega; iii) teadaolevad füüsikalis-keemilised omadused; iv) täiendavad 
andmed teadaolevate mõjude kohta ja v) teadaolev mõjusus soovitavas immuun ­
vastuse tugevuse vahemikus.
 
Valenegatiiv:  aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud negatiivseks või 
toimetuks, kui see tegelikult on positiivne või sensibiliseeriva toimega.  
Valepositiiv:  aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud positiivseks või 
sensibiliseerivat toimet omavaks, kui see tegelikult on negatiivne või sensibili ­
seeriva toimeta.  
Oht: kahjustava tervise- või ökoloogilise mõju võimalikkus. Kahjustav mõju 
avaldub üksnes piisaval tasemel kokkupuute puhul.  
Laboritevaheline reprodutseeritavus:  suurus, mis näitab, millisel määral 
suudavad erinevad kvalifitseeritud laborid, kasutades sama katse-eeskirja ja uurides samu uuritavaid aineid, saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt sarnaseid tulemusi. Laboritevaheline reprodutseeritavus määratakse valideerimiseelsete ja 
valideerimisega seotud menetlustega ja see näitab, millisel määral võib uurimis ­
meetodit edukalt üle viia ühest laborist teise (38).
 
Laborisisene reprodutseeritavus:  suurus, mis näitab, millisel määral suudavad 
sama labori kvalifitseeritud töötajad konkreetset katse-eeskirja kasutades saada kordusuuringutes eri aegadel samasuguseid tulemusi (38).
 
Võõrväärtus:  võõrväärtus on katsetulemus, mis oluliselt erineb populatsiooni 
juhuvalimi muudest väärtustest.  
Kvaliteedi tagamine:  juhtimisprotsess, mille puhul katsete tegemises osalevatest 
isikutest sõltumatud isikud hindavad labori katsestandarditest, nõuetest ja tege ­
vuse registreerimise korrast kinnipidamist ning andmeedastuse õigsust.  
Usaldusväärsus:  mõiste, mis iseloomustab katsemeetodi tulemuste reprodutseeri ­
tavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse labo ­
risisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus (38).
 
Naha sensibiliseerimine:  immunoloogiline protsess, mis avaldub, kui tundlik 
olend viiakse paikselt kokkupuutesse keemilise allergeeniga, mis kutsub esile 
naha immuunvastuse, mis võib areneda kontaktsensibiliseerimiseks.  
Stimulatsiooniindeks (SI):  arvutatud väärtus, mis näitab uuritava aine võimet 
tekitada naha sensibiliseerimist ning mis on töödeldud rühmades ja paralleelselt uuritud kandeaine-kontrollrühmas jälgitud lümfotsüütide vohamise näitajate 
suhtarv.
 
Uuritav aine (uuritav kemikaal):  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva 
katsemeetodi abil.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕLMEDE 
KATSE: BRDU-ELISA  
SISSEJUHATUS  
1. OECD kemikaalide katsetamise juhendeid ja ELi katsemeetodeid vaadatakse 
korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaolu. Esialgne katsemeetod (B.42) naha sensibilisee ­
rimise määramiseks hiirtel lokaalsete lümfisõlmede katsega ( Local Lymph 
Node Assay  – LLNA; OECD katsejuhend 429) on läbi vaadatud (1 ja 
käesoleva lisa peatükk B.42). LLNA valideerimise üksikasjad ja sellega seotud töö ülevaade on avaldatud (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9). LLNA-meetodi 
järgi kasutatakse lümfotsüütide paljunemise määramiseks radioaktiivse 
isotoobiga märgistatud tümidiini või joodi ja seepärast ei saa katset kasu ­
tada, kui radioaktiivsete ühendite hankimine, kasutamine või kõrvaldamine tekitab probleeme. LLNA: BrdU-ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent 
Assay , ELISA – ensüümimmuunsorptsioonanalüüs) on LLNA 
katse-eeskirja modifikatsioon, milles ei kasutata radioaktiivsust ja lümfot ­
süütide vohamise mõõtmiseks ELISA-põhise katsesüsteemiga kasutatakse radioaktiivselt märgistamata 5-bromo-2-desoksüuridiini (BrdU, Chemical 
Abstracts Service’i (CASi) nr 59-14-3). Katsemeetod LLNA: 
BrdU-ELISA on valideeritud ja läbi vaadatud ning rahvusvaheline sõltu ­
matu teaduslik eksperdihinnangu komisjon soovitab seda, kuna leiab, et see sobib naha sensibiliseerumist põhjustavate ja mittepõhjustavate kemi ­
kaalide kindlakstegemiseks, arvestades teatavaid piiranguid (10, 11, 12). 
Käesolev katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata katseloomadel kemikaalide (ainete ja segude) võimet sensibiliseerida nahka. Käesoleva lisa peatükis B.6 ja OECD katsejuhendis 406 kasutatakse merisigu, nimelt 
merisigade maksimeerimise katset ja Buehleri katset (13). LLNAd (käesole ­
va lisa peatükk B.42, OECD katsejuhis 429) ja selle kahte radioaktiivsuse kasutamiseta versiooni, need on LLNA: BrdU-ELISA (käesoleva lisa peatükk B.51, OECD katsejuhis 442 B) ja LLNA: DA (käesoleva lisa 
peatükk B.50, OECD katsejuhis 442 A), tuleb eelistada meriseakatsetele 
peatükis B.6, OECD katsejuhis 406 (13), kuna nendega vähendatakse ja täiustatakse katseloomade kasutamist.
 
2. Nii nagu LLNA puhul, uuritakse LLNA: BrdU-ELISA katsetes naha sensi ­
biliseerimise induktsioonifaasi ja saadakse kvantitatiivseid andmeid immuunvastuse annusest sõltuvuse hindamiseks. Lisaks kõrvaldab võimalus 
määrata naha sensibiliseerijaid ilma DNA radioaktiivset märgist kasutamata 
tööalase kokkupuute radioaktiivsusega ja radioaktiivsete jäätmete probleemi. See omakorda võimaldab naha sensibiliseerijate määramiseks kasutada rohkem hiiri, millega võiks veelgi väheneda merisigade kasutamine (s.o 
peatükk B.6, OECD katsejuhis 406) selleks otstarbeks (13).
 
MÕISTED  
3. Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.  
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
4. LLNA: BrdU-ELISA on muudetud LLNA-meetod võimalike nahka sensi ­
biliseerivate kemikaalide kindlakstegemiseks, millel on aga teatavad 
piirangud. See ei tähenda tingimata, et kõikidel juhtudel tuleks kasutada 
LLNA või merisigadega tehtavate katsete (B.6 ja OECD katsejuhend 406) (13) asemel LLNA: BrdU-ELISAt, vaid pigem, et uuring on sama hea ja seda võib kasutada alternatiivina, mille positiivsed või negatiivsed tule ­
mused üldiselt ei vaja täiendavat kinnitamist (10, 11). Katselabor võtab 
arvesse kogu uuritava aine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
Selline teave sisaldab uuritava aine nimetust ja keemilist struktuuri, füüsi ­
kalis-keemilisi omadusi, muude ainega  in vitro  või in vivo  tehtud toksili ­
suskatsete tulemusi, struktuurilt samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid. Osutatud teavet tuleb analüüsida, et määrata kindlaks, kas LLNA: BrdU-ELISA sobib kõnealuse aine puhul (arvestades LLNA: 
BrdU-ELISA sobimatust teatavate piiratud kemikaalitüüpide puhul, vt 
punkt 5) ning valida sobivad annused.
 
5. LLNA: BrdU-ELISA on  in vivo  meetod ja seetõttu ei lõpeta see loomade 
kasutamist naha allergilise sensibiliseerimise hindamisel. Sellega on siiski võimalik vähendada katseloomade kasutamist selleks otstarbeks, võrreldes merisigadega tehtavate katsetega (B.6, OECD katsejuhis 406) (13). Lisaks 
võimaldab LLNA: BrdU-ELISA oluliselt parandada viisi, kuidas loomi 
kasutatakse naha allergilise sensibiliseerimise määramiseks, kuna erinevalt B.6st ja OECD katsejuhendist 406 ei eelda LLNA: BrdU-ELISA, et naha ärritamisega tekitataks ülitundlikkusreaktsioone. Samuti ei eelda LLNA: 
BrdU-ELISA adjuvandi kasutamist, nagu seda tehakse merisigadega tehtava 
maksimeerimiskatse puhul (käesoleva lisa peatükk B.6, 13). Seega vähendab LLNA: BrdU-ELISA loomade kannatusi. Hoolimata LLNA: BrdU-ELISA eelistest B.6 või OECD katsejuhendi 406 (13) kohaste katse ­
tega võrreldes on teatud piirangud, mis võivad nõuda B.6 või OECD katse ­
juhendi 406 kohaste katsete (13) kasutamist (nt teatavate metallide katseta ­
mine, valepositiivid teatavate nahaärritajate puhul (näiteks teatavat tüüpi pindaktiivsed kemikaalid) (6) (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42), uuritavate 
ainete lahustuvus). Lisaks võib teatavate kemikaaliklasside või ainete puhul, 
mis sisaldavad segavat toimet avaldada võivaid funktsionaalseid rühmi (15), olla vaja kasutada meriseakatseid (st B.6 või OECD katsejuhend 406 (13)). LLNA puhul kindlaks tehtud piiranguid (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42) 
on peetud kehtivateks ka LLNA: BrdU-ELISA puhul (10). Selliste teadao ­
levate piirangute arvestamisega peaks LLNA: BrdU-ELISA olema kohal ­
datav igasuguste kemikaalide uurimiseks, millel ei ole omadusi, mis võiksid mõjutada LLNA: BrdU-ELISAga saadavate tulemuste õigsust. Lisaks sellele 
tuleks kaaluda piiripealse positiivse tulemuse võimalust, kui 
stimulatsiooniindeksi (SI) väärtus tuleb vahemikku 1,6–1,9 (vt punktid 31–32). See tugineb 43 ainest koosnevale valideerimise andmebaasile, milles kasutati SI väärtusi ≥ 1,6 (vt punkt 6), millest LLNA: 
BrdU-ELISA võimaldas õigesti kindlaks teha kõik 32 LLNA järgi sensibi ­
liseerijat, kuid mis andis vale tulemuse kahe aine puhul 11st LLNA järgi mitte sensibiliseerivast ainest, mille SI oli 1,6–1,9 (st piiripealsed positiivsed tulemused) (10). Kuid kuna samu andmeid kasutati SI väärtuste kindlaks ­
määramiseks ja katsemeetodi ennustusvõime arvutamiseks, võivad esitatud 
tulemused viia tegeliku ennustusvõime ülehindamisele.
 
KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
6. LLNA: BrdU-ELISA põhimõte seisneb selles, et sensibilisaatorid kutsuvad esile 
lümfotsüütide vohamise lähimates lümfisõlmedes, mis dreenivad uuritava aine pealekandmise paika. Vohamine on võrdeline pealekantud allergeeni annuse ja 
allergiatekitamisvõimega ning see võimaldab lihtsa meetodiga sensibiliseerimist 
kvantitatiivselt mõõta. Vohamist mõõdetakse nii, et keskmist vohamist igas katserühmas võrreldakse keskmise vohamisega kandeaine-kontrollrühmas, mille liikmeid on töödeldud üksnes kandeainega ( vehicle treated control  – 
VC). Määratakse igas uuritava ainega töödeldud rühmas leitud keskmise voha ­
mise ja paralleelselt kandeaine-kontrollrühmas leitud keskmise vohamise
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
suhtarv, mida nimetatakse stimulatsiooniindeksiks (SI); SI peab olema vähemalt 
1,6 selleks, et katseaine kui naha võimaliku sensibiliseerija edasine hindamine 
oleks vajalik. Siin kirjeldatud meetodid põhinevad BrdU-sisalduse mõõtmisel; selle meetodiga mõõdetakse vohavate rakkude arvu suurenemist kõrvalesta dreenivates lümfisõlmedes. BrdU on tümidiini analoog ja vohavad rakud kasu ­
tavad seda DNA sünteesil sarnaselt tümidiiniga. BrdU sisenemist DNAsse 
mõõdetakse ELISA abil, milles kasutatakse BrdU-spetsiifilist peroksidaasiga märgistatud antikeha. Substraadi lisamisel reageerib peroksidaas substraadiga ning tekib värviline reaktsioonisaadus, mille kogus mõõdetakse neeldumise 
järgi teataval lainepikkusel, kasutades mikrotiiterplaadi lugejat.
 
KATSE KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
7. Käesoleva katse jaoks valitud liik on hiir. LLNA: BrdU-ELISA valideeri ­
misuuringud tehti ainult CBA/JN-liini hiirtega, mida seepärast peetakse eelistatavaks liiniks (10, 12). Kasutatakse noori täiskasvanud emashiiri, kes ei ole poeginud ega tiined. Katse alguses peaksid loomad olema 8–12 
nädalat vanad ning loomade kehamassi varieerumine peaks olema mini ­
maalne ja mitte ületama 20 % keskmisest massist. Võib kasutada ka muid liine ja isasloomi, kui on olemas piisavalt andmeid selle tõendamiseks, et LLNA: BrdU-ELISA immuunvastuses ei ole olulisi liini- ja/või soospet ­
siifilisi erinevusi.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
8. Hiiri tuleks pidada rühmapuurides (16), kui ei esitata nõuetekohast teadus ­
likku põhjendust üksikpuuris pidamise kasuks. Loomade katseruumi tempe ­
ratuur peaks olema 22 ± 3 °C. Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähe ­
malt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, on eesmärk hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peab olema 
kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada 
tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata.
 
Loomade ettevalmistamine  
9. Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseeri ­
mise võimaldamiseks (kuid mitte kõrvamärkidega) ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise algust, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega. Enne katse alustamist uuritakse kõiki loomi, 
et neil ei oleks nähtavaid nahakahjustusi.
 
Annustamislahuste valmistamine  
10. Tahke uuritav aine tuleb lahustada või suspendeerida lahustis või 
kandeaines ja vajaduse korral lahjendada enne hiire kõrvalestale määrimist. Vedelaid kemikaale võib annustada puhtal kujul või lahjendada enne annus ­
tamist. Lahustumatuid keemilisi aineid, näiteks aineid, mida kasutatakse 
meditsiiniseadmetes, tuleb enne hiire kõrvalestale kandmist sobiva solven ­
diga tõhusalt ekstraheerida, et teha kindlaks kõik ekstraheeritavad koosti ­
sained, mille mõju tuleks uurida. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, kui ei ole stabiilsusandmetega tõendatud, et säilitamine on 
lubatav.
 
Usaldusväärsuse kontroll  
11. Positiivse kontrolli kemikaale kasutatakse selleks, et tõendada katsemeetodi 
vajalikku tulemuslikkust: sensibiliseerivate uuritavate ainetega, mille puhul 
immuunvastuse ulatus on hästi kirjeldatud, saadakse õige ja korratav tulemus. Soovitatakse teha paralleelselt positiivse kontrolli katse, kuna see tõendab labori võimet teha iga katse õigesti ning võimaldab hinnata labo ­
risisest ja laboritevahelist korratavust ja võrreldavust. Mõned regulatiivasu ­
tused nõuavad positiivset kontrolli iga uuringu puhul ja seepärast soovita ­
takse käesoleva meetodi kasutajatel konsulteerida enne LLNA: BrdU-ELISA tegemist asjakohaste asutustega. Seepärast soovitatakse alati 
teha paralleelselt positiivse kontrolli katseid, et vältida vajadust teha täien ­
davaid loomkatseid, et täita nõudeid, mis võivad tekkida perioodilise
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
positiivse kontrolli kasutamise puhul (vt punkt 12). Positiivne kontroll 
peaks andma positiivse LLNA: BrdU-ELISA immuunvastuse kokkupuute ­
tasemel, mis eeldatavasti suurendab stimulatsiooniindeksit (SI) 1,6 korda või enam, võrreldes negatiivse kontrollrühmaga. Positiivse kontrolli annus tuleks valida nii, et see ei põhjustaks ulatuslikku nahaärritust või süsteemset 
mürgitust ja tekitatav mõju oleks korratav, kuid mitte liiga suur (näiteks 
stimulatsiooniindeksit üle 14 peetakse liiga suureks). Eelistatud positiivse kontrolli ained on 25 % heksüülkaneelaldehüüd (CASi number 101-86-0) ja 25 % eugenool (CASi number 97-53-0) atsetooni-oliiviõli segus (4: 1, v/v). 
Võib olla olukordi, kus piisavalt põhjendatult võib kasutada muid positiivse 
kontrolli aineid, mis vastavad eespool esitatud kriteeriumidele.
 
12. Kuigi igas katses soovitatakse paralleelselt teha katsed ka positiivse kont ­
rolli rühmaga, võib esineda olukordi, kus labori jaoks, milles korrapäraselt 
(st mitte enam kui kuue kuu järel) tehakse LLNA: BrdU-ELISAt ja on 
olemas varasemate positiivse kontrolli katsete andmebaas, mis tõendab labori võimet saada korratavaid ja õigeid positiivse kontrolli tulemusi, võib sobiv olla perioodiline positiivse kontrolli tegemine (näiteks kuni 
kuue kuu järel). Vajalikku oskuste taset LLNA: BrdU-ELISA alal võib 
tõendada vähemalt kümne sõltumatu ja omavahel kooskõlas oleva positiivse kontrolli katsega, mis on tehtud mõistliku ajavahemiku (vähem kui aasta) jooksul.
 
13. Paralleelset positiivse kontrolli rühma tuleb alati kasutada siis, kui muutub 
LLNA: BrdU-ELISA läbiviimine (näiteks uued väljaõppe saanud töötajad, 
katsemeetodi materjalide ja/või reaktiivide muutus, katsemeetodi läbiviimise tehniliste vahendite muutus, uus katseloomade tarnija), ja sellised muutused 
tuleb laboriprotokollis dokumenteerida. Tuleb analüüsida selliste muutuste 
mõju varasemate katsetega loodud andmebaasi järjepidevusele ja otsustada, kas on vaja teha uus andmebaas, et dokumenteerida kooskõla varasemate positiivse kontrolli tulemustega.
 
14. Meetodi kasutajad peaksid teadma, et otsus kasutada positiivset kontrolli 
perioodiliselt, mitte paralleelselt, mõjutab perioodilise positiivse kontrolli 
vahepealsel ajal ilma positiivse kontrollita saadud negatiivsete uuringutule ­
muste adekvaatsust ja vastuvõetavust. Kui perioodilise positiivse kontrolli katses saadakse näiteks valenegatiiv, võib ajavahemikus viimasest vastu ­
võetavast positiivse kontrolli katsest kuni vastuvõetamatu kontrollkatseni 
uuritavate ainetega saadud negatiivsed tulemused panna kahtluse alla. Selliste tulemuste tähendust tuleks hoolikalt analüüsida, kui otsustatakse, 
kas teha positiivse kontrolli katseid paralleelselt või üksnes perioodiliselt. 
Mõelda tuleb ka, kuidas kasutada vähem loomi paralleelses positiivse kont ­
rolli rühmas, kui see on teaduslikult põhjendatud ja kui labor tõendab oma varasemate andmetega, et on võimalik kasutada vähem hiiri (17).
 
15. Kuigi positiivset kontrollainet tuleks uurida kandeaines, mis teatavasti annab 
teatava kindla immuunvastuse (nt atsetoon-oliiviõli, suhtes 4: 1, v/v), võib 
esineda teatavaid regulatiivseid olukordi, milles on vaja teha katseid ka ebatavalise kandeainega (kliiniliselt või keemiliselt asjakohane segu) (18). Kui paralleelset positiivse kontrolli katset tehakse muu kandeainega kui 
uuritava aine puhul, on vaja moodustada eraldi veel positiivse kontrolli 
kandeaine-kontrollrühm.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. Kui uuritakse teatava keemiliste ühendite klassi aineid või mõõdetakse 
nende poolt esile kutsutava immuunvastuse vahemikku, võib olla kasulik 
mõõta teatavaid võrdlusaineid, millega tõendatakse, et katse võimaldab õigesti määrata kõnealuste ühenditüüpide võimet nahka sensibiliseerida. Sobival võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused:
 
— struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega;  
— teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused;  
— varasemad toetavad LLNA: BrdU-ELISA andmed;  
— toetavad andmed muude katseloomade ja/või inimese kohta.  
KATSE KÄIK  
Loomade arv ja annusemäärad  
17. Ühes annuserühmas on vähemalt neli looma, kasutatakse vähemalt kolme 
uuritava aine kontsentratsiooni ja paralleelselt negatiivset kontrollrühma, 
keda töödeldakse üksnes kandeainega, mida kasutatakse uuritava aine puhul, ning positiivse kontrolli rühma (kas paralleelne või hiljutine posi ­
tiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–15). Tuleb 
kaaluda positiivse kontrolli tegemist mitme annusega, eriti kui positiivset 
kontrolli tehakse aeg-ajalt. Kontrollrühma loomi koheldakse ja töödeldakse nii nagu katserühma loomi, välja arvatud töötlemine uuritava ainega.
 
18. Annuse ja kandeaine valik peaks põhinema viidetes 2 ja 19 antud soovi ­
tustel. Tavaliselt valitakse järjestikused annused sobivast kontsentratsioonide 
reast, näiteks 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. 
Kasutatava kontsentratsioonide rea valimisel peaks olema asjakohane teaduslik põhjendus. Tuleks arvesse võtta kõik olemasolevad toksikoloogia ­
andmed (nt ägeda toksilisuse ja nahaärrituse kohta) ning andmed uuritava 
aine struktuuri ja füüsikalis-keemiliste omaduste kohta ning valida kolm 
järjestikust kontsentratsiooni nii, et suurim kontsentratsioon tagab maksi ­
maalse võimaliku kokkupuute, kuid selle puhul ei avaldu süsteemset toksi ­
lisust ega liiga suurt paikset nahaärritust (19, 20 ja käesoleva lisa peatükk 
B.4). Sellise teabe puudumisel võib olla vajalik teha esialgne sõelkatse (vt 
punktid 21–24).
 
19. Kandeaine ei tohiks segada katse tegemist ega muuta katse tulemust ja 
tuleks valida nii, et viia lahustuvus maksimumini, et kasutada suurimat võimalikku kontsentratsiooni ja saada ühtlasi uuritava aine pealekandmi ­
seks sobiv lahus või suspensioon. Soovitatavad kandeained on 
atsetoon-oliiviõli (4: 1, v/v),  N,N-dimetüülformamiid, metüületüülketoon, 
propüleenglükool ja dimetüülsulfoksiid (6), kuid võib kasutada ka muid kandeaineid, kui esitada selleks piisav teaduslik põhjendus. Teatud 
olukorras võib osutuda vajalikuks kasutada täiendavaks kontrolliks kliini ­
liselt asjakohast lahustit või kaubanduslikku valmistist, milles uuritavat ainet turustatakse. Tuleks jälgida, et hüdrofiilsed uuritavad ained kantaks peale kandeainesüsteemi abil, mis märgab nahka ega voola nahalt kohe 
maha; selleks lisatakse sobivaid solubiliseerijaid (nt 1 % Pluronic® L92). 
Seepärast tuleks täielikku vesilahust vältida.
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Iga üksiku hiire lümfisõlmede töötlemine võimaldab hinnata loomadevahe ­
list varieeruvust ja statistiliselt võrrelda uuritavate ainetega tehtud mõõtmiste 
ja kandeaine-kontrollrühma mõõtmiste erinevust (vt punkt 33). Lisaks saab positiivse kontrolli rühma hiirte arvu vähendamise võimalikkust hinnata siis, kui kogutakse iga üksiku hiire andmeid (17). Lisaks nõuavad mõned regu ­
leerivad asutused iga üksiku looma andmete kogumist. Üksikuid loomi 
käsitlevate andmete korrapärane kogumine annab loomade heaoluga seotud eelise, kuna võimaldab vältida korduvate uuringute tegemist, mis oleks hädavajalik, kui uuritavate ainete tulemusi, mis algselt on kogutud ühel 
viisil (näiteks loomade andmete ühendamisega), peaks reguleeriv asutus 
hiljem vaatlema teiste nõuete alusel (näiteks üksikloomade andmete põhjal).
 
Esialgne sõelkatse  
21. Kui ei ole andmeid suurima uuritava annuse kindlaksmääramiseks (vt punkt 
18), tuleks teha esialgne sõelkatse, et leida LLNA: BrdU-ELISA jaoks sobiv annuste vahemik. Esialgse sõelkatse eesmärk on saada andmeid, mille järgi 
määrata suurim LLNA: BrdU-ELISA põhikatses kasutatav annus, kui ei ole 
teada kontsentratsioon, millel avaldub süsteemne toksilisus (vt punkt 24) ja/või tekib ülemäärane nahaärritus (vt punkt 23). Suurim uuritav annus peab olema 100 % kontsentratsioon vedela katseaine puhul või suurim 
võimalik kontsentratsioon tahke aine või suspensiooni puhul.
 
22. Esialgne sõelkatse tehakse samades tingimustes kui LLNA: BrdU-ELISA 
põhikatse, kuid ei hinnata lümfisõlmede vohamist ja annuserühma kohta võidakse kasutada vähem katseloomi. Annuserühmas on soovitatavalt üks või kaks hiirt. Kõiki hiiri vaadeldakse iga päev, et leida süsteemse toksili ­
suse kliinilisi ilminguid või paikset nahaärritust pealekandmiskohas. Regis ­
treeritakse kehakaal enne katset ja enne katse lõppu (6. päev). Iga hiire kumbagi kõrva uuritakse punetuse suhtes ja hinnatakse selle aste, kasutades tabelit 1 (20, ja käesoleva lisa peatükk B.4). Kõrvalesta paksust mõõdetakse 
paksusemõõtja (nt digitaalne mikromeeter või paksusemõõtja Peacock Dial) 
abil 1. päeval (enne annustamist), 3. päeval (ligikaudu 48 tundi pärast esimest annust) ja 6. päeval. Lisaks võib 6. päeval mõõta kõrva paksuse, milleks pärast looma humaanset surmamist lüüakse kõrvalestast mulgusta ­
jaga välja tükk ja kaalutakse. Ulatuslikku paikset nahaärritust näitab vähe ­
malt hindele 3 vastav punetus ja/või kõrvalesta paksuse suurenemine vähe ­
malt 25 % mõnel mõõtmispäeval (21, 22). LLNA: BrdU-ELISA põhikatse jaoks valitud suurim annus on järgmine väiksem annus esialgse sõelkatse 
kontsentratsioonide reas (vt punkt 18), millel ei avaldu süsteemne toksilisus 
ega teki ülemäärast nahaärritust.
 
Tabel 1  
Punetuse hinne  
Nähud Hinne  
Nahapunetust ei esine 0 
Väga nõrk (vaevumärgatav) nahapunetus 1 Selgesti nähtav nahapunetus 2
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Nähud Hinne  
Mõõdukas kuni tugev nahapunetus 3 
Tugev nahapunetus (meenutab peeti) kuni kooriku tekkimine, 
mis takistab nahapunetuse astme edasist täpsustamist 4 
23. Lisaks kõrvalesta 25 % suurenemisele (21, 22) on ärritust tekitavate ainete 
kindlakstegemiseks LLNA abil kasutatud ka kõrvalesta paksuse statistiliselt olulist suurenemist töödeldud hiirtel, võrreldes kontrollrühma hiirtega (22, 23, 24, 25, 26, 27, 28). Ent kuigi statistiliselt oluline kõrvalesta paksuse 
suurenemine võib olla ka väiksem kui 25 %, ei ole selline paksuse suure ­
nemine konkreetselt seotud ülemäärase nahaärritusega (25, 26, 27, 28, 29).
 
24. Kui kliinilisi uuringuid kasutatakse LLNA: BrdU-ELISA põhikatses kasu ­
tatava suurima annuse hindamise osana, siis süsteemset toksilisust (30) 
võivad näidata järgmised kliinilised tunnused: närvisüsteemi talitluse 
muutused (nt karva püstitõusmine, liigutuste koordinatsiooni kadu, värin ja krambid), käitumise muutused (nt agressiivsus, muutus oma karvkatte hooldamises, liikumisaktiivsuse oluline muutus), hingamise muutused (s.o 
hingamissageduse ja -sügavuse muutused, nagu raskendatud hingamine, 
õhuahmimine, räginad) ning muutused toidu ja vee tarbimises. Lisaks tuleb hindamisel arvestada letargia ja/või mittereageerimise märke ning rohkem kui kerge või lühiajalise valu või ebamugavustunde kliinilisi tunnu ­
seid, samuti rohkem kui 5 % kehakaalu vähenemist ajavahemikus 1. kuni 6. 
päevani ning suremust. Suremas olevad loomad ja loomad, kes näitavad suure valu või kannatuste tunnuseid, tuleks humaanselt surmata (31).
 
Põhiuuringu katse ajakava  
25. Katse ajakava on järgmine.  
— 1. päev:  määratakse iga üksiku looma mass ja registreeritakse koos 
kõigi võimalike kliiniliste tähelepanekutega. Kummagi kõrva väliskül ­
jele kantakse 25 μl sobivalt lahjendatud uuritavat ainet, üksnes 
kandeainet või positiivse kontrolli ainet (paralleelne või perioodiline 
positiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–15).  
— 2. ja 3. päev:  korratakse 1. päeval tehtud pealekandmist.  
— 4. päev:  loomi ei töödelda.  
— 5. päev:  hiire kõhukelmesse süstitakse 0,5 ml (5 mg hiire kohta) BrdU 
lahust (10 mg/ml).  
— 6. päev:  määratakse iga looma mass ja registreeritakse koos kõigi 
võimalike kliiniliste tähelepanekutega. Umbes 24 tundi pärast BrdU 
süsti surmatakse loomad humaanselt. Igal hiirel lõigatakse välja kumbagi kõrvalesta dreenivad lümfisõlmed ja töödeldakse eraldi iga hiire lümfisõlmi fosfaatpuhvriga soolalahuses. Lümfisõlmede leidmise 
ja väljalõikamise üksikasjad ja joonised on esitatud viites 17. Paiksete 
naha immuunvastuste edasiseks jälgimiseks põhikatses võib katseproto ­
kolli kanda ka täiendavad näitajad, nagu kõrvalesta punetuse hinnang või kõrvalesta paksuse mõõtmise andmed (mis saadakse kas paksuse ­
mõõtjaga või pärast surmamist kõrvalestast mulgustajaga välja löödud 
tüki massi mõõtmisega).
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Rakususpensioonide valmistamine  
26. Valmistatakse iga looma mõlemalt poolelt välja lõigatud ühendatud lümfi ­
sõlmede üksikrakususpensioon, milleks rakud eraldatakse üksteisest ette ­
vaatliku mehaanilise töötlemisega, filtrides läbi 200 μm avaga roostevabast 
terasest võrgu, või kasutatakse üksikrakususpensiooni valmistamiseks muud sobivat võtet (näiteks purustatakse lümfisõlmed ühekordselt kasutatava plas ­
tikuhmrinuiaga ja lastakse seejärel läbi nailonvõrgu avasuurusega nr 70). 
Lümfisõlmerakkude suspensiooni valmistamine on selle katse puhul otsus ­
tava tähtsusega ja metoodika iga kasutaja peaks eelnevalt omandama selle oskuse. Negatiivse kontrolli loomade lümfisõlmed on väiksed, seepärast on 
tähtis tegutseda ettevaatlikult, et vältida igasugust kõrvalist mõju SI väär ­
tustele. Igal juhul tuleb lümfisõlmerakkude suspensiooni lõppruumala viia kindlaksmääratud optimeeritud ruumalani (ligikaudu 15 ml). Optimeeritud ruumala määratakse nii, et negatiivse kontrolli rühmas saavutataks keskmine 
optiline neeldumine (tihedus) vahemikus 0,1–0,2.
 
Rakkude vohamise määramine (BrdU sisalduse mõõtmine lümfotsüütide 
DNAs)  
27. BrdU määratakse ELISA meetodiga, kasutades müügil olevat komplekti 
(näiteks Roche Applied Science, Mannheim, Saksamaa, katalooginumber 
11 647 229 001). Lühidalt, 100 μl lümfisõlmerakkude suspensiooni 
kantakse kolme lamedapõhjalise mikrotiiterplaadi süvendisse. Lümfisõlme ­
rakud fikseeritakse ja denatureeritakse ning lisatakse siis igasse süvendisse 
BdrU-vastaseid antikehi. Seejärel eemaldatakse BrdU-vastased antikehad 
pesemisega ja lisatakse substraadi lahus ning lastakse tekkida kromogeenil. Määratakse optiline neeldumine 370 nm juures võrdluslainepikkuse 492 nm suhtes. Kõigil juhtudel on katsetingimusi vaja optimeerida (vt punkt 26).
 
TÄHELEPANEKUD  
Kliinilised tähelepanekud  
28. Vähemalt kord päevas tuleks igal loomal hoolikalt vaadelda kliiniliste 
tunnuste esinemist – kas annustamiskoha paikset ärritust või süsteemset toksilisust. Iga hiire kohta registreeritakse süstemaatiliselt kõik tähelepa ­
nekud. Jälgimiskavas tuleks ette näha kriteeriumid, mille alusel tehakse 
kiiresti kindlaks ja surmatakse valutult hiired, kellel avaldub süsteemne toksilisus, ülemäärane paikne nahaärritus või -söövitus (31).
 
Kehamass  
29. Vastavalt punktile 25 tuleks mõõta iga looma kehamass katse alguses ja 
pärast ettemääratud humaanset surmamist.  
TULEMUSTE ARVUTAMINE  
30. Iga katserühma tulemused väljendatakse keskmise stimulatsiooniindeksi (SI) 
kaudu. SI leidmiseks jagatakse iga uuritava aine rühma ja positiivse kont ­
rollrühma keskmine BrdU-märgistusindeks hiire kohta lahusti-/kandeaine- 
kontrollrühma keskmise BrdU-märgistusindeksiga hiire kohta. Keskmine SI kandeaine-kontrollrühmade puhul on seega 1.
 
BrdU-märgistusindeks on määratletud järgmiselt:  
BrdU-märgistusindeks = (ABS  em – ABS tühikatse  em ) – (ABS  ref – ABS tühikatse  ref ), 
kus: em = emissioonlainepikkus ja ref = võrdluslainepikkus.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Otsustamisel peetakse tulemust positiivseks, kui SI on vähemalt 1,6 (10). 
Kuid piiripealse tulemuse (SI väärtus vahemikus 1,6–1,9) positiivseks leiuks 
kuulutamise otsuse tegemisel võib kasutada ka annuse-immuunvastuse sõltuvuse tugevust, statistilist olulisust ja lahusti/kandeaine ning positiivse kontrolli tulemuste kooskõlalisust (3, 6, 32).
 
32. Kui SI on vahemikus 1,6–1,9, st tegemist on piiripealse positiivse tulemu ­
sega, võivad meetodi kasutajad võtta koos SI väärtusega arvesse sellist lisateavet nagu annuse-immuunvastuse sõltuvus, tõendid süsteemse toksili ­
suse või ülemäärase ärrituse kohta ja vajaduse korral statistilist olulisust, 
mis kinnitavad positiivset tulemust (10). Arvesse tuleks võtta ka uuritava 
aine mitmesuguseid omadusi, sealhulgas struktuurilist sarnasust teadaolevate naha sensibilisaatoritega, omadust põhjustada hiirel tugevat paikset nahaär ­
ritust ning annuse-immuunvastuse sõltuvuse laadi. Neid ja muid kaalutlusi 
on arutatud üksikasjalikult viites 4.
 
33. Andmete kogumine üksiku hiire tasandil võimaldab statistiliselt analüüsida, 
kas andmetes on näha annuse-immuunvastuse vahelist sõltuvust ja kui tugev see on. Iga statistiline hindamine peaks hõlmama annuse-immuunvastuse 
sõltuvuse hindamist ja katserühmade läbimõeldud võrdlemist (näiteks paari ­
viisiline annuserühmade ja paralleelsete lahuse-/kandeaine-kontrollrühmade võrdlemine). Statistiline analüüs võib hõlmata näiteks lineaarset regressiooni või Williami testi annuse-immuunvastuse sõltuvuste hindamiseks ja 
Dunnetti paariviisiliste võrdluste testi. Statistilise analüüsi sobiva meetodi 
valimisel peaks uurija kogu aeg arvesse võtma võimalikku dispersioonide ebavõrdsust ja muid seonduvaid probleeme, mille tõttu võib vaja minna andmete teisendamist või mitteparameetrilist statistilist analüüsi. Igal juhul 
võib uurijal olla vaja teha SI arvutusi ja statistilist analüüsi kõigi andme ­
punktidega ja siis mõne andmepunkti kõrvalejätmisega (nn võõrväärtused).
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
34. Andmed tuleks kokku võtta tabeli vormis; tabelis esitatakse iga üksiklooma 
BrdU-märgistusindeksi väärtused, rühma keskmine suhte 
BrdU-märgistusindeks/katseloom väärtus, selle viga (näiteks standardhälve, standardviga) ja iga annuserühma keskmine SI, võrrelduna paralleelse lahusti-/kandeaine-kontrollrühma SI-ga.
 
Katsearuanne  
35. Katsearuandes esitatakse järgmine teave:  
uuritavad kemikaalid ja kontrollkemikaalid:  
— tunnusandmed (näiteks CASi ja EÜ numbrid, kui on teada; allikas; 
puhtus; teadaolevad lisandid; partii number);  
— füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt lenduvus, 
stabiilsus, lahustuvus);  
— kui tegemist on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsen ­
dimäärad;  
lahusti/kandeaine:  
— tunnusandmed (puhtus; kontsentratsioon (vajaduse korral); kasutatud 
ruumala);  
— kandeaine valiku põhjendus.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
katseloomad:  
— CBA-liini hiirte allikas;  
— loomade mikrobioloogiline staatus, kui see on teada;  
— loomade arv ja vanus;  
— loomade päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;  
katsetingimused:  
— ELISA määramise komplekti tootja, partiinumber ja tootja esitatud 
kvaliteeditagamise/kvaliteedikontrolli andmed komplekti kohta (antikeha 
tundlikkus ja spetsiifilisus ning määramispiir);  
— uuritava aine ettevalmistamise ja annustamise üksikasjad;  
— annuse valiku põhjendus (sealhulgas esialgse sõelkatse tulemused, kui 
see tehti);  
— kandeaine ja uuritava aine kontsentratsioonid ning uuritava aine manus ­
tatud üldkogus;  
— toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);  
— annustamis- ja proovivõtukava üksikasjalik kirjeldus;  
— toksilisuse mõõtmise meetodid;  
— kriteeriumid, mille järgi uuringutulemus loeti positiivseks või negatiiv ­
seks;  
— kõikide katse-eeskirjast kõrvalekaldumiste üksikasjad ja selgitus, kuidas 
kõrvalekaldumine mõjutab uuringu korraldust ja tulemusi;  
usaldusväärsuse kontroll:  
— kokkuvõte viimase usaldusväärsuskontrolli tulemustest, sealhulgas teave 
kasutatud aine, kontsentratsiooni ja kandeaine kohta;  
— katselabori paralleelselt saadud ja/või varasemad positiivse kontrolli ja 
paralleelse negatiivse (lahusti/kandeaine) kontrolli andmed;  
— kui paralleelset positiivse kontrolli katset ei tehtud, siis kõige viimase 
korrapärase positiivse kontrolli uuringu kuupäev ja laboriaruanne ning aruanne, milles esitatakse labori varasemad positiivse kontrolli andmed, mis põhjendavad paralleelse positiivse kontrolli katse tegematajätmist;
 
tulemused:  
— iga looma mass annustamise alguses ja pärast ettemääratud humaanset 
surmamist; samuti iga katserühma keskväärtus ja selle viga (näiteks 
standardhälve, standardviga);  
— iga looma puhul toksilisuse ilmnemise algus ja nähud, sealhulgas 
võimalik nahaärritus annustamiskohas;  
— tabelina iga üksiku hiire BrdU-märgistusindeksi väärtused ja iga katse ­
rühma SI väärtused;  
— iga katserühma BrdU-märgistusindeksi/hiire keskväärtus ja selle viga 
(näiteks standardhälve, standardviga) ning iga katserühma võõrväärtuste 
analüüsi tulemused;  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— arvutatud SI ja sobiv hajuvuse näitaja, millega võetakse arvesse eri 
loomadega saadud tulemuste hajuvust uuritava aine rühmas ja kontroll ­
rühmas;  
— annuse-immuunvastuse sõltuvus;  
— vajaduse korral statistilised analüüsid;  
tulemuste arutelu:  
— lühike kommentaar tulemuste, annuse-immuunvastuse sõltuvuse 
analüüsi ja vajaduse korral statistilise analüüsi kohta ning järeldused selle kohta, kas uuritud ainet tuleks pidada naha sensibilisaatoriks.
 
KIRJANDUS  
1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.  
3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985–997.
 
4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. 
Toxicol., 36, 327–33.  
5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of 
uncertainty margins. Toxicol., 146, 49–59.
 
6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Vt: http://iccvam.niehs. ­
nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf
 
7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258–273.
 
8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274–286.
 
9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249–257.  
10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive 
local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552 A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam. ­
niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm
 ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam. ­
niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf
 
12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129–134.
 
13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguide ­
lines  
14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, 
C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensi ­
tisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 
90–96.
 
16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the 
Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt:  
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf  
18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89.  
19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31.  
20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.or ­
g/env/testguidelines  
21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
 
22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/im ­
munotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf.  
23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in 
female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195–206.  
24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.
 
25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506.  
27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, 
H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 
60–68.
 
28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.  
29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.
 
30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm.
 
31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. 
(1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments 
using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563–79.
 
33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Envi ­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment 
No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
1. liide  
MÕISTED  
Täpsus:  katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. 
Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. 
Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab 
katsemeetod õige tulemuse (33).  
Võrdlusaine:  sensibiliseeriv või muu aine, mida kasutatakse standardina võrdle ­
miseks uuritava ainega. Võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuri ­
tava ainega; iii) teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused; iv) täiendavad 
andmed teadaolevate mõjude kohta ja v) teadaolev mõjusus soovitavas mõju tugevuse vahemikus.
 
Valenegatiiv:  uuritav aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud negatiivseks 
või toimetuks, kui see tegelikult on positiivne või sensibiliseeriva toimega (33).  
Valepositiiv:  uuritav aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud positiiv ­
seks või sensibiliseerivat toimet omavaks, kui see tegelikult on negatiivne või 
sensibiliseeriva toimeta (33).  
Oht: kahjustava tervise- või ökoloogilise mõju võimalikkus. Kahjustav mõju 
avaldub üksnes piisaval tasemel kokkupuute puhul.  
Laboritevaheline reprodutseeritavus:  suurus, mis näitab, millisel määral 
suudavad erinevad kvalifitseeritud laborid, kasutades sama katse-eeskirja ja uurides sama ainet, saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt sarnaseid tulemusi. Laboritevaheline reprodutseeritavus määratakse valideerimiseelsete ja valideerimi ­
sega seotud menetlustega ja see näitab, millisel määral võib uurimismeetodit 
edukalt üle viia ühest laborist teise (33).
 
Laborisisene reprodutseeritavus:  suurus, mis näitab, millisel määral suudavad 
sama labori kvalifitseeritud töötajad konkreetset katse-eeskirja kasutades saada kordusuuringutes eri aegadel samasuguseid tulemusi (33).
 
Võõrväärtus:  võõrväärtus on katsetulemus, mis oluliselt erineb populatsiooni 
juhuvalimi muudest väärtustest.  
Kvaliteedi tagamine:  juhtimisprotsess, mille puhul katsete tegemises osalevatest 
isikutest sõltumatud isikud hindavad labori katsestandarditest, nõuetest ja tege ­
vuse registreerimise korrast kinnipidamist ning andmeedastuse õigsust.  
Usaldusväärsus:  mõiste, mis iseloomustab katsemeetodi tulemuste reprodutseeri ­
tavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse labo ­
risisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus (33).
 
Naha sensibiliseerimine:  immunoloogiline protsess, mis avaldub, kui tundlik 
olend viiakse paikselt kokkupuutesse keemilise allergeeniga, mis kutsub esile 
naha immuunvastuse, mis võib areneda kontaktsensibiliseerimiseks.  
Stimulatsiooniindeks (SI):  arvutatud väärtus, mis näitab uuritava aine võimet 
tekitada naha sensibiliseerimist ning mis on töödeldud rühmades ja paralleelselt uuritud kandeaine-kontrollrühmas jälgitud lümfotsüütide vohamise näitajate 
suhtarv.
 
Uuritav aine (uuritav kemikaal):  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva 
katsemeetodi abil.  ▼M3 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  ÄGE MÜRGISUS SISSEHINGAMISEL – ÄGEDA MÜRGISUSE 
KLASSI MÄÄRAMISE MEETOD  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga ( Test Guide ­
line, TG) 436 (2009). Esimene sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse 
katsejuhend nr 403 võeti vastu 1981. aastal ja see on hiljem läbi vaadatud 
(vt käesoleva lisa peatükk B.2 (1)). Sissehingamisel avalduva ägeda mürgi ­
suse klassi ( Acute Toxic Class , ATC) määramise meetodi koostamist (2, 3, 
4) peeti asjakohaseks pärast läbivaadatud ägeda suukaudse mürgisusastme 
meetodi vastuvõtmist (käesoleva lisa peatükk B.1b) (5). Sissehingamisel 
avalduva ägeda mürgisuse klassi määramise meetodi tulemuslikkuse tagant ­
järele hindamine näitas, et kõnealune meetod on sobiv kasutamiseks klassi ­
fitseerimise ja märgistamise eesmärgil (6). Sissehingamisel avalduva ägeda 
mürgisuse klassi määramise meetod võimaldab kasutada kindlaksmääratud 
sihtkontsentratsioonide mitut etappi, et määrata uuritava kemikaali mürgi ­
suse klass. Peamise näitajana kasutatakse letaalsust, kuid suurtes valudes, kannatustes, piinlevad või suremas olevad loomad tuleks kannatuste mini ­
meerimiseks humaansel viisil surmata. Humaansete lõpetamiskriteeriumide 
suunised on esitatud OECD juhenddokumendis nr 19 (7).
 
2. Käesoleva katsemeetodi kasutamise ja tõlgendamise suunised on esitatud 
sissehingamisel avalduva ägeda mürgisuse katset käsitlevas juhenddoku ­
mendis nr 39 (8).  
3. Käesoleva katsemeetodi kontekstis kasutatud mõisted on esitatud 1. liites ja 
juhenddokumendis nr 39 (8).  
4. Katsemeetod annab teavet ohtlike omaduste kohta ning võimaldab reastada 
ja klassifitseerida uuritava kemikaali vastavalt ägedat mürgisust põhjustavate 
kemikaalide klassifitseerimist käsitlevale määrusele (EÜ) nr 1272/2008 (9). Kui on vajalikud LC
 50 punktväärtuste hinnangud või mõju kontsentratsioo ­
nist sõltuvuse analüüsid, on asjakohane kasutada käesoleva lisa peatükis B.2 
(1) esitatud meetodit. Täpsemad suunised katsemeetodi valiku kohta on 
esitatud juhenddokumendis nr 39 (8). Käesolev katsemeetod ei ole spetsiaal ­
selt ette nähtud erimaterjalide, nagu vähe lahustuvad isomeetrilised või kiud ­
materjalid või toodetud nanomaterjalid, uurimiseks.  
LÄHTEKAALUTLUSED  
5. Enne käesoleva katsemeetodi kohase katse tegemist peaks uurimislabor läbi 
vaatama kogu olemasoleva teabe uuritava kemikaali kohta, sh tehtud 
uuringud, mille andmete abil oleks võimalik täiendava katse tegemisest 
loobuda, et minimeerida loomade kasutust. Teave, mis võib aidata valida katseks kõige sobivama liigi, liini, soo, kokkupuuteviisi ja sobivad uuritavad kontsentratsioonid, hõlmab järgmist: uuritava kemikaali keemiline nimetus, 
struktuur ja füüsikalis-keemilised omadused; mis tahes  in vitro  või in vivo  
mürgisuse katsete tulemused; eeldatavad kasutusvaldkonnad ja inimestega kokkupuute võimalused; olemasolevad (kvantitatiivsete) struktuuri-aktiivsuse sõltuvuste ((Q)SAR) andmed ja toksikoloogilised andmed samalaadse struk ­
tuuriga ainete kohta. Kontsentratsioone, mis eeldatavasti tekitavad söövi ­
tava (
 1 ) või tugevasti ärritava toime tõttu tugevat valu ja kannatusi, ei tohiks 
käesoleva katsemeetodiga katsetada (vt juhenddokument nr 39 (8)).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Söövitavuse hindamiseks võib kasutada eksperdiarvamust ja järgmisi tõendeid: inimeste 
ja loomadega saadud kogemused, olemasolevad ( in vitro ) andmed, näiteks käesoleva lisa 
peatükk B.40 (10), B.40a (11) või OECD katsejuhend nr 435 (12), pH-väärtused, teave 
samalaadsete kemikaalide kohta või mis tahes muud asjakohased andmed.
 KATSE PÕHIMÕTE  
6. Katse seisneb selles, et astmelise meetodiga kogutakse neljatunnise kokku ­
puute jooksul uuritava kemikaali sissehingamisel tekkiva ägeda mürgisuse kohta piisavalt teavet aine klassifitseerimiseks. Konkreetse regulatiivse 
eesmärgi jaoks võib kasutada muid kokkupuute ajavahemikke. Igal ette ­
nähtud kontsentratsiooni etapil tehakse katse kolme loomaga kummastki soost. Olenevalt loomade suremisest ja/või sellest, kas loomad on suremas, võib uuritava kemikaali ägeda mürgisuse hindamiseks piisata kahest etapist. 
Kui esitatakse tõendid, et üks sugu on tundlikum kui teine, võib katset 
jätkata ainult sellest soost loomadega, kumb on tundlikum. Järgmine etapp määratakse kindlaks eelmise etapi tulemusega, nii et
 
a) lisakatseid ei ole vaja teha;  
b) katse tehakse kolme loomaga kummagi soo kohta või  
c) kuue sellest soost loomaga, kumb on tundlikum, s.o mürgisusklassi alam ­
piiri hinnangud peaksid põhinema kuuel loomal uuritava kontsentrat ­
siooni rühma kohta nende soost olenemata.  
7. Suremas loomad või loomad, kes ilmselgelt kannatavad valu või kellel 
ilmnevad raskete ja kestvate kannatuste tunnused, tuleks humaansel viisil 
surmata; selliseid loomi võetakse katsetulemuste tõlgendamisel arvesse 
samamoodi kui katse käigus surnud loomi. Kriteeriumid, mille põhjal tehakse suremas oleva või raskelt kannatava looma surmamise otsus, ja juhised prognoositava või läheneva surma kindlakstegemiseks on esitatud 
humaanseid lõpetamiskriteeriume käsitlevas juhenddokumendis nr 19 (7).
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
8. Tuleks kasutada katseloomade enim kasutatavate laboriliinide noori terveid 
täiskasvanud isendeid. Eelistatav loomaliik on rott; muude liikide kasutamise korral tuleks seda põhjendada.
 
Loomade ettevalmistamine  
9. Emasloomad ei tohiks olla poeginud ega tiined. Kokkupuute päeval peaksid 
loomad olema 8 kuni 12 nädala vanused noored täiskasvanud, kelle keha ­
mass ei tohiks erineda rohkem kui ±20 % selliste samas vanuses ja samast 
soost loomade keskmisest kehamassist, keda kasutati varasemates kemikaa ­
liga kokkupuute katsetes. Loomad valitakse juhuslikult ja märgistatakse individuaalselt. Loomi hoitakse oma puuris vähemalt viis päeva enne 
katse algust, et võimaldada neil laboritingimustega kohaneda. Loomad 
peaksid olema enne katset ka katseseadmetega lühikese aja vältel koha ­
nenud, kuna sel viisil vähendatakse uude keskkonda viimisest põhjustatud stressi.
 
Pidamistingimused  
10. Katseloomade pidamise ruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Suhtelist 
õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuigi see ei pruugi 
olla võimalik, kui kandeainena kasutatakse vett. Enne ja pärast kokkupuudet tuleks loomad tavaliselt paigutada soo ja kontsentratsiooni alusel rühmita ­
tuna puuridesse, kuid loomade arv puuris ei tohiks segada iga looma täpset 
jälgimist ning peaks minimeerima loomade suremist kannibalismi ja võitle ­
mise tõttu. Kui loomade kokkupuude toimub ainult nina kaudu, siis võib olla vajalik lasta neil hoiutorudega kohaneda. Hoiutorud ei tohiks põhjustada loomadele ülearuseid füüsilisi, soojusest või piiratud liikumisvõimest 
tingitud ebamugavusi. Loomade liikumise piiramine võib mõjutada füsioloo ­
gilisi näitajaid, näiteks kehatemperatuuri (hüpertermia) ja/või hingamise
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
minutimahtu. Kui on kättesaadavad üldandmed, mille kohaselt kõnealuseid 
muutusi märkimisväärses ulatuses ei teki, ei ole eelnev hoiutoruga kohane ­
mine vajalik. Kogu keha kaudu aerosooliga kokku puutuvaid loomi tuleks kokkupuute ajal eraldi hoida, et vältida loomadepoolset uuritava aerosooli filtrimist läbi oma puurikaaslaste karvkatte. Võib kasutada tavalisi ja serti ­
fitseeritud laborisöötasid, v.a kokkupuute ajal, ning anda piiramatus koguses 
kraanivett. Valgustus peaks olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust.
 
Inhalatsioonikambrid  
11. Inhalatsioonikambri valimisel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali laadi ja 
katse eesmärki. Eelistatav kokkupuuteviis on ainult nina kaudu (mis hõlmab 
ainult pea, nina või koonu kaudu kokkupuudet). Ainult nina kaudu toimuvat kokkupuudet eelistatakse üldiselt vedelik- või pulberaerosooli ja aerosooliks 
kondenseeruda võiva auruga tehtavate uuringute puhul. Uuringu erieesmärgi 
saavutamiseks võib parem olla kokkupuude kogu keha kaudu, kuid seda tuleks katseprotokollis põhjendada. Kogukehakambri kasutamise korral keskkonna stabiilsuse tagamiseks ei tohiks katseloomade kogumaht ületada 
5 % kambri mahust. Ainult nina ja kogu keha kaudu kokkupuute tehnilisi 
põhimõtteid ning konkreetseid eeliseid ja puudujääke on kirjeldatud juhend ­
dokumendis nr 39 (8).
 
KOKKUPUUTETINGIMUSED  
Kontsentratsioonide manustamine  
12. Soovitatakse kasutada fikseeritud neljatunnist kokkupuuteaega, arvestamata 
tasakaalustamisaega. Muu kestus võib olla vajalik erinõuete täitmiseks, kuid 
selle kasutamist tuleks uuringuprotokollis põhjendada (vt juhenddokument 
nr 39 (8)). Kogukehakambris uuritava kemikaaliga kokku puutuvad loomad tuleks eraldi paigutada, et vältida puurikaaslaste karvkatte korrastamise tõttu selle suukaudset manustamist. Kokkupuute ajal ei tohiks loomi sööta. Kogu 
keha kaudu toimuva kokkupuute ajal võib loomadele anda vett.
 
13. Loomad viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, mis on gaas, aur, 
aerosool või nende segu. Katses kasutatav füüsikaline olek sõltub uuritava 
kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest, valitud kontsentratsioonist ja/või uuritava kemikaali kõige tõenäolisemast füüsikalisest vormist käsitse ­
mise ja kasutamise ajal. Hügroskoopseid ja väga reaktsioonivõimelisi uuri ­
tavaid kemikaale tuleks katsetada kuiva õhu tingimustes. Tuleks olla ette ­
vaatlik, et vältida plahvatusohtliku kontsentratsiooni tekkimist.
 
Osakeste suurusjaotus  
14. Osakeste suurusjaotus tuleks määrata kõigi aerosoolide puhul ja samuti 
aurude puhul, mis võivad kondenseeruda ja moodustada aerosooli. Hinga ­
misteede kõigi asjakohaste piirkondadega kokkupuute võimaldamiseks soovitatakse kasutada aerosoole, mille osakeste massikeskmine aerodünaa ­
miline diameeter (MMAD) on vahemikus 1–4 μm ning geomeetriline stan ­
dardhälve ( σ
 g ) on 1,5–3,0 (8, 13, 14). Kõnealuse standardi järgimiseks 
tuleks teha mõistlikud jõupingutused; kui standardit ei ole võimalik järgida, tuleks esitada eksperdihinnang. Näiteks metallisuitsu osakesed võivad olla kõnealusest normväärtusest väiksemad ning laenguga osakesed, kiud ja 
hügroskoopsed materjalid (mille suurus hingamisteede niiskes keskkonnas 
suureneb) võivad olla suuremad.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Uuritava kemikaali preparaat kandeaines  
15. Selleks et tagada uuritava kemikaali vajalik kontsentratsioon õhus ja 
osakeste suurus, võib olla vaja kasutada kandeainet. Eelistatult tuleks kasu ­
tada vett. Aineosakesi võib töödelda mehaaniliselt, et saavutada osakeste 
soovitud suurusjaotus, kuid tuleks olla hoolikas, et uuritavat kemikaali 
mitte lagundada ega muuta. Kui mehaaniline töötlus (näiteks tugeval jahva ­
tamisel hõõrdumisest tekkinud kõrge temperatuur) võib olla uuritava kemi ­
kaali koostist muutnud, tuleks uuritava kemikaali koostist analüüsiga kont ­
rollida. Tuleks olla hoolikas, et vältida uuritava kemikaali saastamist. Ei ole 
vaja katsetada raskesti peenestuvat teralist materjali, mis on sihipäraselt valmistatud nii, et seda ei saaks sisse hingata. Materjali hõõrumisega tuleks 
tõendada, et teralise materjali käsitlemisel ei teki sissehingatavaid osakesi. 
Kui hõõrumiskatsel tekib sissehingatavaid osakesi, tuleks teha sissehinga ­
misel mürgisust näitav katse.
 
Loomade kontrollrühm  
16. Samaaegne negatiivne (puhtas õhus peetavate) loomade kontrollrühm ei ole 
vajalik. Kui katsekeskkonna loomiseks kasutatakse muud kandeainet kui vesi, tuleks kandeaine kontrollrühma kasutada ainult juhul, kui varasemad sissehingamisel avalduva mürgisuse andmed ei ole kättesaadavad. Kui 
kandeaines sisalduva uuritava kemikaali mürgisuse uuringus mürgisust ei 
leita, siis võib järeldada, et kandeaine ei ole katsetatud kontsentratsioonil mürgine, seega ei ole kandeaine kontrollrühm vajalik.
 
KOKKUPUUTETINGIMUSTE SEIRE  
Kambri õhuvarustus  
17. Igas kokkupuutekatses tuleks kambri õhuvarustust hoolikalt kontrollida, 
pidevalt seirata ning andmed vähemalt kord tunnis registreerida. Keskkonnas oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (või selle stabiilsuse) seire on kõigi dünaamiliste parameetrite mõõtmisel tingimata vajalik ja kujutab 
endast kaudset vahendit keskkonna tekitamise kõigi asjakohaste dünaami ­
liste parameetrite kontrollimiseks. Eraldi tuleks jälgida, et ainult nina kaudu kokkupuute uurimise kambris ei hingataks väljahingatud õhku uuesti sisse, kuna kokkupuutesüsteemi õhuvarustus ei ole piisav uuritavat kemikaali 
sisaldava õhu dünaamilise voo tagamiseks. On olemas metoodika, mille 
abil saab tõendada, et valitud katsetingimustes ei hingata väljahingatud õhku uuesti sisse (8, 15). Hapnikusisaldus peaks olema vähemalt 19 % ja süsinikdioksiidisisaldus ei tohiks ületada 1 %. Kui on alust arvata, et kõne ­
aluseid nõudeid ei ole võimalik täita, tuleks hapniku- ja süsinikdioksiidisi ­
saldust mõõta.
 
Kambri temperatuur ja suhteline õhuniiskus  
18. Kambri temperatuur tuleks hoida 22 ± 3 °C juures. Loomade hingamistsooni 
suhtelist õhuniiskust tuleks nii ainult nina kui ka kogu keha kaudu kokku ­
puute katsetes seirata ja registreerida vähemalt kolm korda kuni neljatunnise katse jooksul ning iga tund lühema katse puhul. Suhtelist õhuniiskust tuleks eelistatult hoida vahemikus 30–70 %, kuid uuritava kemikaali mõju tõttu 
(näiteks veepõhise segu uurimisel) ei pruugi see olla saavutatav või 
mõõdetav.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Uuritav kemikaal – nimikontsentratsioon  
19. Kui see on võimalik, tuleks kokkupuutekambri nimikontsentratsioon alati 
arvutada ja registreerida. Nimikontsentratsioon on katsekeskkonda lisatud uuritava kemikaali mass, mis on jagatud läbi kambrisüsteemi suunatud 
õhu kogumahuga. Nimikontsentratsiooni ei kasutata loomade kokkupuute 
iseloomustamiseks, kuid nimikontsentratsiooni võrdlus tegeliku kontsentrat ­
siooniga näitab katsesüsteemi kemikaali lisamise tõhusust ning seega saab seda kasutada kemikaali lisamisel esinevate probleemide avastamiseks.
 
Uuritav kemikaal – tegelik kontsentratsioon  
20. Tegelik kontsentratsioon on proovist määratud uuritava kemikaali kontsen ­
tratsioon loomade hingamistsoonis inhalatsioonikambris. Tegelikke kontsen ­
tratsioone on võimalik saada kas spetsiifiliste meetodite abil (näiteks otsene 
proovivõtt, adsorptsiooni või keemilise reaktsiooni meetodid ning järgnev analüüsimine) või mittespetsiifiliste meetodite abil, näiteks filtrite gravimee ­
triline analüüs. Gravimeetrilise analüüsi kasutamine on lubatud ainult ühest 
koostisainest koosneva pulberaerosooli või vähelenduva vedeliku aerosooli 
korral ja see peaks olema enne katse tegemist kinnitatud konkreetse kemi ­
kaali määramisega. Mitmest koostisainest koosneva pulberaerosooli kontsen ­
tratsiooni kindlaksmääramiseks võib samuti kasutada gravimeetrilist 
analüüsi. Sel juhul tuleb analüüsiga tõendada, et õhus oleva materjali koostis 
sarnaneb lähtematerjali koostisega. Kui selline teave ei ole kättesaadav, võib osutuda vajalikuks teha uuringu vältel uuritava kemikaali (eelistatult lenduvas olekus) kordusanalüüse korrapäraste ajavahemike järel. Aerosoo ­
lainete puhul, mis võivad aurustuda või sublimeeruda, tuleks näidata, et 
valitud meetodiga koguti kõiki faase. Katseprotokollis tuleks esitada siht-, nimi- ja tegelikud kontsentratsioonid, kuid letaalse kontsentratsiooni arvuta ­
miseks kasutatakse statistilises analüüsis ainult tegelikke kontsentratsioone.
 
21. Võimaluse korral tuleks kasutada uuritava kemikaali ühte partiid ning uuri ­
tavat proovi tuleks säilitada tingimustes, milles säilib selle puhtus, homo ­
geensus ja stabiilsus. Enne uuringu alustamist tuleks uuritavat kemikaali, sh selle puhtust, iseloomustada; kui see on tehniliselt võimalik, tuleb keemili ­
selt määratleda ka kindlakstehtud saasteained ja lisandid ning määrata nende 
kogused. Seda on võimalik tõendada muu hulgas järgmiste andmete alusel: 
retentsiooniaeg ja suhteline piigipindala, molekulmass massispektroskoopia või gaaskromatograafia analüüsidest või muud hinnangud. Kuigi uurimis ­
labor ei vastuta uuritava kemikaali proovi keemilise määratlemise eest, võib 
uurimislaboril olla mõttekas kinnitada tellija iseloomustust vähemalt piiratud 
ulatuses (näiteks värv, füüsikalised omadused jne).
 
22. Kokkupuutekeskkonda hoitakse võimaluste piires muutumatuna ja seiratakse 
pidevalt ja/või pisteliselt, olenevalt analüüsimeetodist. Kui kasutatakse piste ­
list proovivõttu, tuleks neljatunnise uuringu vältel võtta kambrikeskkonnast proove vähemalt kaks korda. Kui see ei ole piiratud õhuvarustuse või 
väikeste kontsentratsioonide tõttu võimalik, võib kogu kokkupuuteperioodi 
kohta võtta ühe proovi. Kui proovide analüüsimisel saadakse oluliselt erinevad tulemused, tuleks järgmiste uuritavate kontsentratsioonide puhul võtta kokkupuute kohta neli proovi. Kambrist võetud proovide kontsentrat ­
sioon ei tohiks keskmisest kontsentratsioonist erineda rohkem kui ±10 % 
gaaside ja aurude puhul või ±20 % vedelik- või pulberaerosoolide korral. Tuleks arvutada kambri tasakaaluoleku saavutamise aeg (t
 95 ) ja see regis ­
treerida. Kokkupuute kestus on aeg, mille vältel lisatakse uuritavat kemikaali 
ja seejuures arvestatakse t  95 saavutamiseks vajalikku ajavahemikku. 
Juhendid t  95 hindamise kohta on esitatud juhenddokumendis nr 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. Väga keeruka segu puhul, mis koosneb gaasidest/aurudest ja aerosoolidest 
(näiteks põlemiskeskkonnad ja uuritavad kemikaalid, mida paiskab välja 
mõni eriotstarbeline lõppkasutustoode või -seade), võib iga faas käituda inha ­
latsioonikambris erinevalt, nii et tuleks valida vähemalt üks uuritav aine (mida analüüsiga määratakse), tavaliselt sellise segu peamine toimeaine, iga faasi 
(gaas/aur ja aerosool) kohta. Kui uuritav kemikaal on segu, siis tuleks kirja 
panna kogu segu analüütiline kontsentratsioon ja mitte ainult toimeaine või komponendi (analüüsiga määratava aine) kontsentratsioon. Lisateave tegelike kontsentratsioonide kohta on juhenddokumendis nr 39 (8).
 
Uuritav kemikaal – osakeste suurusjaotus  
24. Aerosooliosakeste suurusjaotus tuleks kindlaks määrata vähemalt kaks korda 
iga neljatunnise kokkupuute ajal, kasutades kaskaadimpaktorit või alterna ­
tiivset seadet, näiteks aerodünaamilist osakeste suuruse määrajat. Kui on 
võimalik tõendada kaskaadimpaktori ja alternatiivse seadme abil saadud 
tulemuste võrdväärsust, võib kogu uuringu tegemiseks kasutada alterna ­
tiivset seadet. Paralleelselt peamise seadmega tuleks kasutada muud seadet, näiteks gravimeetrilist filtrit või minitsüklonit või gaasipesukolbi, et veen ­
duda peamise seadme kogumistõhususes. Osakeste suuruse analüüsi kaudu 
saadud massikontsentratsioon peaks mõistlikes piirides kokku langema filtrianalüüsi abil saadud massikontsentratsiooniga (vt juhenddokument nr 39 (8)). Kui uuringu varajases etapis on võimalik tõendada võrdväärsust, 
siis võib loobuda täiendavatest kinnitavatest mõõtmistest. Loomade heaolu 
silmas pidades tuleks võtta meetmeid, et mitte saada katsest ebaselgeid andmeid, mille tõttu võib olla vajalik kokkupuudet korrata. Aurudega tuleks teha osakeste suurusjaotuse määramine sel juhul, kui on võimalik, et auru 
kondensatsiooni tõttu võib tekkida aerosool, või kui auru keskkonnas tuvas ­
tatakse osakesi, mille puhul võib tegemist olla faaside seguga (vt punkt 14).
 
KATSE KÄIK  
Põhikatse  
25. Igal etapil kasutatakse kolme looma kummagi soo kohta või kuut looma 
sellest soost, mis on tundlikum. Kui ainult nina kaudu toimuvat kokku ­
puudet kasutatakse muu näriliseliigi kui roti korral, võib suurimat kokku ­
puute kestust kohandada, et minimeerida konkreetse kasutatava liigi isendite kannatusi. Lähtedoosina kasutatavaks kontsentratsiooniks valitakse üks nelja 
kindlaksmääratud taseme hulgast ning lähtekontsentratsioon peaks olema 
selline, mis tekitab kõige tõenäolisemalt mürgistuse mõnele loomadest, kellele doos manustatakse. Gaaside, aurude ja aerosoolide katseskeemid (mis on lisatud 2.–4. liites) seisnevad katsetamises CLP-määruse ((EÜ) 
nr 1272/2008) 1.–4. kategooria piirväärtustega (9) gaaside puhul (100, 
500, 2 500, 20 000 ppm nelja tunni jooksul) (2. liide), aurude puhul (0,5, 2, 10, 20 mg / l nelja tunni jooksul) (3. liide) ja aerosoolide puhul (0,05, 0,5, 1,5 mg / l nelja tunni jooksul (4. liide). 5. kategooria, mida ei ole 
määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) rakendatud, on seotud vastavaid piirkont ­
sentratsioone ületavate kontsentratsioonidega. Iga lähtekontsentratsiooni puhul kohaldatakse vastavat katsetamise skeemi. Humaanselt surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katseprotseduuris vastavalt nool ­
tega näidatud suunale, kuni on võimalik määrata kategooria.
 
26. Ajavahemik katserühmade kokkupuutekatsete vahel määratakse kindlaks 
mürgistusnähtude alguse, kestuse ja raskuse järgi. Loomade kokkupuude 
järgmise kontsentratsiooniga tuleks edasi lükata seni, kuni eelmises katses kasutatud loomade ellujäämises võib olla mõistlikkuse piires veendunud. Enne iga järgmise kontsentratsiooniga kokkupuudet soovitatakse oodata 
kolm või neli päeva, et oleks võimalik jälgida hiljem avalduvat mürgisust. 
Ajavahemikku võib vajaduse korral korrigeerida, nt ebaselge vastuse puhul.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Piirsisalduskatse  
27. Piirsisalduskatset kasutatakse, kui uuritav kemikaal ei ole teadaolevalt või 
eeldatavalt mürgine, s.o mürgistus tekib ainult regulatiivse piirkontsentrat ­
siooni ületamise puhul. Teavet uuritava kemikaali mürgisuse kohta võib 
saada varem katsetatud samalaadseid aineid või samalaadseid segusid käsit ­
levatest andmetest, võttes arvesse toksikoloogiliselt oluliste koostisainete keemilist laadi ja sisaldust. Kui teavet mürgisuse kohta on vähe või ei ole üldse või kui uuritav kemikaal on eeldatavasti mürgine, tuleks sooritada 
põhikatse (täpsemad suunised on esitatud juhenddokumendis nr 39 (8)).
 
28. Tavalise meetodi kasutamisel viiakse kolm looma kummagi soo kohta või 
kuus looma sellest soost, kumb on tundlikum, kokkupuutesse vastavalt kontsentratsiooniga 20 000 ppm gaaside puhul, 20 mg/l aurude korral ja 5 
mg/l tolmu/udu puhul (kui see on saavutatav), mis on käesoleva katsemee ­
todi piirsisalduskatse. Aerosooli katsetamisel peaks olema peamine eesmärk saavutada sissehingamiseks sobiv osakese suurus (st osakeste massikesk ­
mine aerodünaamiline diameeter (MMAD) on 1–4 μm). See on enamiku 
uuritavate kemikaalide puhul võimalik kontsentratsioonil 2 mg/l. Aerosooli 
katsetamist rohkem kui 2 mg/l juures tuleks proovida ainult juhul, kui sisse ­
hingamiseks sobiv osakeste suurus on võimalik saavutada (vt juhenddoku ­
ment nr 39 (8)). Ühtse ülemaailmse kemikaalide klassifitseerimise ja märgis ­
tamise süsteemi (GHS) (16) kohaselt ei ole katsetamine suuremal kui piir ­
kontsentratsioonil loomade heaolu kaalutlustel soovitatav. GHSi 5. kate ­
gooria (16) kohast katsetamist, mida ei ole määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) rakendatud, tuleks kaaluda ainult juhul, kui on suur tõenäosus, et kõne ­
aluse katse tulemused on otseselt seotud inimeste tervise kaitsega, ning seda 
tuleks sel juhul uuringuprotokollis põhjendada. Plahvatusohtliku uuritava kemikaali puhul tuleks olla hoolikas, et vältida plahvatust võimaldavaid tingimusi. Loomade tarbetu kasutamise vältimiseks tuleks enne piirsisaldus ­
katset teha proovikatse ilma loomadeta, et tagada piirsisalduskatse jaoks 
vajalike kambritingimuste saavutamine.
 
VAATLUSED  
29. Loomi tuleks kokkupuute ajal sageli kliiniliselt jälgida. Pärast kokkupuudet 
tuleks kliinilised vaatlused korraldada vähemalt kaks korda kokkupuute ­
päeva jooksul või, kui loomade reageerimine kokkupuutele seda nõuab, ka sagedamini, ja seejärel vähemalt kord päevas kokku 14 päeva jooksul. 
Vaatlemise ajavahemiku kestus ei ole kindlaks määratud; see tuleks määrata 
kliiniliste nähtude laadi, tekkimisaja ja taastumisperioodi pikkuse alusel. Mürgistusnähtude ilmumise ja kadumise aeg on oluline eelkõige juhul, kui mürgistusnähtudel on kalduvus avalduda viitmõjuna. Kõik vaatlused regis ­
treeritakse süstemaatiliselt, säilitades iga looma kohta eraldi andmed. 
Suremas olevad loomad ja loomad, kellel esinevad tugeva valu ja/või püsivad suurte kannatuste tunnused, tuleks loomade heaolu kaalutlustel humaansel viisil surmata. Uuringute tegemisel tuleks olla hoolikas, et 
mürgistuse kliinilisi tunnuseid kindlaks tehes vältida kokkupuutest põhjus ­
tatud esialgse halva välimuse ja hingamise ajutiste muutuste pidamist tööt ­
lemisega seotud mõjudeks. Arvesse tuleks võtta humaansete lõpetamiskri ­
teeriumide juhisdokumendis esitatud põhimõtteid ja kriteeriume (7). Kui 
loomad surmatakse humaansetel kaalutlustel või leitakse surnuna, tuleks 
surmaaeg võimalikult täpselt registreerida.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Puuri juures tehtavad vaatlused peaksid hõlmama naha ja karvkatte, silmade 
ja limaskestade, hingamise, vereringe- ning autonoomse ja tsentraalse närvi ­
süsteemi muutusi, somatomotoorset aktiivsust ja käitumismustrit. Võimaluse korral tuleks eristada lokaalset ja süsteemset mõju ja need registreerida. Tuleb pöörata tähelepanu värinate, krampide, süljevooluse, kõhulahtisuse, 
letargia, une ja kooma esinemisele. Pärakutemperatuuri mõõtmine võib 
anda lisaandmeid refleksipõhise hingamise aeglustumise või hüpo-/hüper ­
termia kohta, mis on seotud kokkupuute või vangistusega.
 
Kehamassid  
31. Iga looma kehamass tuleks registreerida üks kord kohanemise perioodi 
vältel, kokkupuute päeval enne kokkupuudet (päev 0) ning vähemalt päevadel 1, 3 ja 7 (ning seejärel iga nädal) ja surma või eutanaasia korral, kui see toimub pärast päeva 1. Kehamass on teatavasti mürgistuse oluline 
näitaja ja seega tuleks täpselt jälgida loomi, kelle kehamass väheneb püsivalt 
> 20 % võrreldes uuringueelsete näitajatega. Ellujäänud loomad kaalutakse ja surmatakse humaansel viisil kokkupuutejärgsel ajavahemikul.
 
Patoloogia  
32. Kõik katseloomad (kaasa arvatud need, kes surid katse käigus või kes 
surmati eutanaasiaga või kõrvaldatakse uuringust loomade heaolu tagami ­
seks) lahatakse täielikult. Kui lahkamine vahetult pärast surnud looma leid ­
mist ei ole võimalik, tuleks loom jahutada (mitte külmutada) autolüüsi 
minimeerimiseks piisavalt madala temperatuurini. Lahata tuleks võimalikult kiiresti, tavaliselt ühe või kahe päeva jooksul. Iga looma kõik üldpatoloo ­
gilised muutused tuleks registreerida, pöörates eritähelepanu hingamisteede 
mis tahes muutustele.
 
33. Uuringu tõlgendusväärtuse laiendamiseks võib kaaluda uuringu kavasse 
eelnevalt ettenähtud täiendavate uuringute lisamist, nagu ellujäänud rottide kopsude kaalu mõõtmine ja/või hingamisteede ärrituse tõendamine hinga ­
misteede mikroskoobiga vaatlemise teel. Uurida võib ka organeid, milles 24 
tundi või kauem elanud loomadel esineb patoloogilisi muutusi, samuti orga ­
neid, mis teadaolevalt või eeldatavasti võivad olla kahjustatud. Kogu hinga ­
mistee mikroskoobiuuring võib anda kasulikku teavet veega reageeriva uuri ­
tava kemikaali, näiteks happe või hügroskoopse kemikaali kohta.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
34. Tuleks esitada andmed iga üksiku looma kehamassi ja lahkamistulemuste 
kohta. Kliiniliste vaatluste andmed tuleks esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul, näidates iga katserühma puhul ära osalenud loomade arvu, konkreetsete mürgistusnähtudega loomade arvu, katse käigus surnuna leitud või humaan ­
setel põhjustel surmatud loomade arvu, iga looma surmaaja, toksiliste 
mõjude ja nende ajalise kulu kirjelduse ja pöörduvuse ning lahanguleiud.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Katseprotokoll  
35. Katseprotokoll peaks sisaldama võimaluse korral järgmist teavet.  
Katseloomad ja pidamistingimused  
— Puuritingimuste kirjeldus, sh: loomade arv (või arvu muutus) puuri 
kohta, allapanu, õhu temperatuur ja suhteline niiskus, valgustusperiood ja sööt.
 
— Kasutatud liik/liin ja muu liigi kui roti kasutamise põhjendus.  
— Loomade arv, vanus ja sugu.  
— Randomiseerimismeetod.  
— Üksikandmed sööda ja vee kvaliteedi kohta (sh sööda tüüp/allikas, vee 
allikas).  
— Kõigi eelnenud ettevalmistamismeetmete kirjeldus, sh söötmine, karan ­
tiin ja haiguste ravi.  
Uuritav kemikaal  
— Füüsikaline olek, puhtus ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised 
omadused (kaasa arvatud isomeerne koostis).  
— Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi 
nr, kui see on teada.  
Kandeaine  
— Kandeaine kasutamise põhjendus ja valiku põhjendus (kui kandeainena 
ei kasutata vett).  
— Varasemad või rööpandmed, millega tõendatakse, et kandeaine ei mõjuta 
uuringu tulemusi.  
Inhalatsioonikamber  
— Inhalatsioonikambri kirjeldus, sh selle mõõtmed ja maht.  
— Loomade kokkupuute jaoks kasutatavate seadmete päritolu ja kirjeldus 
ning samuti keskkonna tekitamise kirjeldus.  
— Temperatuuri, niiskuse, osakeste suuruse ja tegeliku kontsentratsiooni 
mõõtmise seadmed.  
— Õhuallikas ja kambrisse suunatud / kambrist välja lastud õhu töötlemi ­
seks ning konditsioneerimiseks kasutatav süsteem.  
— Homogeense katsekeskkonna tagamise seadmete kaliibrimisel kasutatud 
meetodid.  
— Rõhuerinevus (positiivne või negatiivne).  
— Kokkupuuteportide arv kambri kohta (ainult nina kaudu toimuv kokku ­
puude); loomade paiknemine süsteemis (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
 
— Katsekeskkonna ajaline homogeensus/stabiilsus.  
— Temperatuuri- ja niiskusandurite paigutus ning katsekeskkonna proovide 
võtmine kambris.  
— Õhuvoolu kiirused, õhuvoolu kiirus kokkupuutepordi kohta (ainult nina 
kaudu toimuv kokkupuude) või loomade hulk kambri kohta (kogu keha kaudu toimuv kokkupuude).
 
— Teave hapniku ja süsinikdioksiidi sisalduse mõõtmiseks kasutatud sead ­
mete kohta, vajaduse korral.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— Inhalatsioonikambri tasakaaluseisundini jõudmiseks vajalik aeg (t  95 ). 
— Kogu kambris oleva õhu vahetuste arv tunnis.  
— Mõõteseadmed (vajaduse korral).  
Andmed kokkupuute kohta  
— Põhiuuringu sihtkontsentratsiooni valimise põhjendus.  
— Nimikontsentratsioonid (inhalatsioonikambrisse suunatud uuritava kemi ­
kaali kogumass, mis on jagatud läbi kambri juhitud õhu kogusega).  
— Uuritava kemikaali tegelikud kontsentratsioonid loomade hingamistsoo ­
nist kogutud proovides; heterogeensel füüsilisel kujul esineva segu (gaas, 
aur, aerosool) puhul võidakse analüüsida iga faasi eraldi.  
— Kõik õhukontsentratsioonid tuleks teatada massiühikutes (mg/l, mg/m  3 
jne), kontsentratsioonid mahuühikutes (ppm, ppb jne) võib teatada 
sulgudes.  
— Osakeste suurusjaotus, massikeskmine aerodünaamiline 
diameeter (MMAD) ja geomeetriline standardhälve ( σ g ) ning nende 
arvutusmeetodid. Tuleks teatada üksikosakeste suuruse analüüsid.  
Katsetingimused  
— Üksikasjalikud andmed uuritava kemikaali ettevalmistamise kohta, sh 
andmed mis tahes meetmete kohta, mida kasutati tahke aine osakeste 
suuruse vähendamiseks või uuritava kemikaali lahuste valmistamiseks. 
Kui mehaanilised protsessid võivad olla muutnud uuritava kemikaali koostist, tuleb lisada nende analüüside tulemused, mille abil kontrolliti uuritava kemikaali koostist.
 
— Katsekeskkonna tekitamiseks ja loomade kokkupuuteks katsekeskkon ­
naga kasutatud seadmete kirjeldus (eelistatult koos joonisega).  
— Kasutatud keemilise analüüsi meetodi ja selle valideerimise üksikasjad 
(sh uuritava kemikaali analüütiline saagis proovivõtukeskkonna analüü ­
simisel).  
— Katsekontsentratsioonide valiku põhjendus.  
Tulemused  
— Tabelitena andmed katsekambri temperatuuri, niiskuse ja õhuvoolu 
kohta.  
— Tabelitena andmed kambri nimi- ja tegeliku kontsentratsiooni kohta.  
— Tabelid osakeste suurusjaotuse andmete kohta, sh analüüsiproovide 
võtmise andmed, osakeste suurusjaotus ning MMAD ja σ g arvutamine.  
— Tabelid iga looma reageerimise andmete (st mürgistustunnustega 
loomad, kaasa arvatud suremus, mõjude laad, raskus ja kestus) ja annu ­
semäärade kohta.  
— Uuringupäevadel registreeritud iga looma kehamass; surmakuupäev ja 
-aeg, kui loom sureb enne plaanijärgset eutanaasiat, mürgistusnähtude 
tekke aeg ja pöörduvus iga looma puhul.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— Iga looma lahanguleiud ja histopatoloogilised leiud, kui need on olemas.  
— CLP-määruse kohane kategooria klassifikatsioon ja LC  50 piirväärtus.  
Tulemuste arutelu ja tõlgendamine  
— Eritähelepanu tuleks pöörata nende meetodite kirjeldamisele, mida kasu ­
tati käesoleva katsemeetodi kriteeriumide täitmiseks, näiteks piirkontsen ­
tratsioon või osakeste suurus.  
— Üldtulemuste alusel tuleks käsitleda küsimust, kas osakeste suurus oli 
sobiv sissehingamiseks, eelkõige siis, kui osakeste suuruse kriteeriume ei 
olnud võimalik täita.  
— Uuringu üldhinnangus tuleks käsitleda nimi- ja tegelike kontsentratsioo ­
nide kindlaksmääramiseks kasutatud meetodite kooskõlalisust ning tege ­
liku ja nimikontsentratsiooni vahelist seost.  
— Tuleks käsitleda tõenäolist surma põhjust ja uuritava kemikaali peamist 
toimeviisi (süsteemne või lokaalne).  
— Kui OECD humaansete lõpetamiskriteeriumide juhenddokumendis (7) 
sätestatud kriteeriumide alusel tekkis vajadus humaansel viisil surmata 
valu kannatavaid või tõsiste ja püsivate kannatuste tunnustega loomi, siis tuleks esitada selgitus.
 
KIRJANDUS  
1) Käesoleva lisa peatükk B.2 „Äge mürgisus (sissehingamisel)”.  
2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. 
Toxicol.  77: 243–254.  
3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537–549.  
4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129–134.  
5) Käesoleva lisa peatükk B.1b „Äge suukaudne mürgisus – ägeda mürgisuse 
klassi määramise meetod”.  
6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.or ­
g/env/testguidelines]
 
7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/ ­
testguidelines]
 
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines]  
9) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1272/2008, 16. detsember 
2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja paken ­
damist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja 
tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 
(ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
10) Käesoleva lisa peatükk B.40 „Nahasöövituskatse  in vitro : transkutaanse 
elektritakistuse (TER) mõõtmine”.  
11) Käesoleva lisa peatükk B.40a „Nahasöövituskatse  in vitro : katse inimnaha 
mudeliga”.  
12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of 
Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321–327.  
15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167.
 
16) UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welco ­
me_e.html]
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
1. liide  
MÕISTE  
Uuritav kemikaal –  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
2. liide  
Toimimine gaasi iga lähtekontsentratsiooni juures (ppm nelja tunni kohta)  
Üldised märkused (  1 ) 
Selles liites esitatud vastavad katseskeemid selgitavad, kuidas tuleb toimida iga 
lähtekontsentratsiooni juures.  
2.a liide: lähtekontsentratsioon on 100 ppm.  
2.b liide: lähtekontsentratsioon on 500 ppm.  
2.c liide: lähtekontsentratsioon on 2 500 ppm.  
2.d liide: lähtekontsentratsioon on 20 000 ppm.  
Humaansel viisil surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katses ­
keemis vastavalt nooltega näidatud suunale.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) Järgmistes tabelites viidatakse GHSile (ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise 
ja märgistamise süsteem). ELi vaste on määrus (EÜ) nr 1272/2008. Sissehingamisel 
avalduva ägeda mürgisuse puhul ei rakendata määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) kategoo ­
riat 5.
 2.a liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 100 ppm 4 
tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
2.b liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 500 ppm 4 
tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
2.c liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 2 500 ppm 4 
tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
2.d liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 20 000 ppm 4 tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
3. liide  
Toimimine auru iga lähtekontsentratsiooni juures (mg/l nelja tunni kohta)  
Üldised märkused (  1 ) 
Selles liites esitatud vastavad katseskeemid selgitavad, kuidas tuleb toimida iga 
lähtekontsentratsiooni juures.  
3.a liide: lähtekontsentratsioon on 0,5 mg/l.  
3.b liide: lähtekontsentratsioon on 2,0 mg/l.  
3.c liide: lähtekontsentratsioon on 10 mg/l.  
3.d liide: lähtekontsentratsioon on 20 mg/l.  
Humaansel viisil surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katses ­
keemis vastavalt nooltega näidatud suunale.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) Järgmistes tabelites viidatakse GHSile (ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise 
ja märgistamise süsteem). ELi vaste on määrus (EÜ) nr 1272/2008. Sissehingamisel 
avalduva ägeda mürgisuse puhul ei rakendata määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) kategoo ­
riat 5.
 3.a liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine aurude puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 0,5 mg/l 4 tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
3.b liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine gaaside puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 2 mg/l 4 tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
3.c liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine aurude puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 10 mg/l 4 tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
3.d liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine aurude puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 20 mg/l 4 tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
4. liide  
Toimimine aerosooli iga lähtekontsentratsiooni juures (mg/l nelja tunni 
kohta)  
Üldised märkused (  1 ) 
Selles liites esitatud vastavad katseskeemid selgitavad, kuidas tuleb toimida iga 
lähtekontsentratsiooni juures.  
4.a liide: lähtekontsentratsioon on 0,05 mg/l.  
4.b liide: lähtekontsentratsioon on 0,5 mg/l.  
4.c liide: lähtekontsentratsioon on 1 mg/l.  
4.d liide: lähtekontsentratsioon on 5 mg/l.  
Humaansel viisil surmatud või surnud loomade arvust sõltuvalt toimitakse katses ­
keemis vastavalt nooltega näidatud suunale.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) Järgmistes tabelites viidatakse GHSile (ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise 
ja märgistamise süsteem). ELi vaste on määrus (EÜ) nr 1272/2008. Sissehingamisel 
avalduva ägeda mürgisuse puhul ei rakendata määruses (EÜ) nr 1272/2008 (9) kategoo ­
riat 5.
 4.a liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine aurude puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 0,05 mg/l 4 
tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
4.b liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine aerosoolide puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 0,5 mg/l 4 
tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
4.c liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine aerosoolide puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 1 mg/l 4 
tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
4.d liide  
Äge mürgisus sissehingamisel  
Toimimine aerosoolide puhul, alustades lähtekontsentratsioonist 5 mg/l 
4tunni jooksul
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  ARENGUHÄIREID PÕHJUSTAVA NEUROTOKSILISUSE 
UURING  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 426 (2007). 
OECD paljunemisvõimet kahjustava ja arengut mõjutava toksilisuse 
töörühma koosolekul Kopenhaagenis 1995. aasta juunis arutati, kas on 
vaja ajakohastada olemasolevaid OECD katsejuhendeid paljunemisvõimet kahjustava ja arengut mõjutava toksilisuse määramiseks ja töötada välja uusi katsejuhendeid seni veel hõlmamata näitajate määramiseks (1). 
Töörühm soovitas koostada katsejuhendi arenguhäireid põhjustava neuro ­
toksilisuse määramiseks, võttes aluseks USA keskkonnakaitseameti (EPA) katsejuhendi, mis on hiljem läbi vaadatud (2). 1996. aasta juunis toimus Kopenhaagenis teine arutelu selleks, et koostada sekretariaadile suunised 
uue, arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse katse juhendi peamiste küsi ­
muste kohta, sealhulgas näiteks loomaliigi valimise, doseerimisperioodi, hinnatavate näitajate ja tulemuste hindamise kriteeriumide kohta. Ameerika Ühendriikide suunised neurotoksilisuse riski hindamiseks avaldati 1998. 
aastal (3). Oktoobris 2000 toimusid üksteise järel OECD ekspertide koos ­
olek ja ILSI (International Life Science Institute) riskihindamise seminar ning Tokyos peeti 2005. aastal ekspertide koosolek. Koosolekutel arutati seoses käesoleva katsemeetodi väljatöötamisega seniste katsejuhenditega 
seotud teaduslikke ja tehnilisi küsimusi ning koosolekute soovitusi (4, 5, 
6, 7). Lisateavet käesoleva katsemeetodi kasutamise, tulemuste tõlgenda ­
mise ja kasutatud terminite kohta võib leida OECD juhenddokumendist nr 43 „Reproduktiivtoksilisuse määramine ja hindamine” (8) ning nr 20 
„Neurotoksilisuse määramine” (9).
 
LÄHTEKAALUTLUSED  
2. Paljud kemikaalid avaldavad inimesele ja muudele liikidele arenguhäireid 
põhjustavat neurotoksilist mõju (10, 11, 12, 13). Kemikaali toksiliste omaduste hindamisel võib olla vaja määrata arenguhäireid põhjustava 
neurotoksilise mõju võimalikkust. Arenguhäireid põhjustava neurotoksili ­
suse uuringu eesmärk on koguda andmeid mõju kohta, mida emakasisene või sünnijärgne kokkupuude kemikaaliga avaldab järglaste arenevale närvi ­
süsteemile; andmeid kogutakse doosi ja toime vahelise sõltuvuse, võimalike 
funktsionaalsete ja morfoloogiliste mõjude kohta.
 
3. Arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse uuringu võib teha eraldi või 
reproduktiivtoksilisuse ja/või neurotoksilisuse uuringu raames (nt katseju ­
hendid B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) või lisaks sünnieelseid arenguhäi ­
reid põhjustava toksilisuse uuringule (nt katsejuhend B.31 (17)). Kui aren ­
guhäireid põhjustavat neurotoksilisust uuritakse muu uuringu raames, on tingimata vaja säilitada kummagi uuringutüübi terviklikkus. Kõik katsed peaksid olema kooskõlas kohaldatavate õigusaktidega või valitsuse ja insti ­
tutsiooniliste suunistega katseloomade kasutamise kohta teadusuuringutes 
(nt 18).
 
4. Katselabor vaatab enne uuringu tegemist läbi ja võtab arvesse kogu olemas ­
oleva teabe uuritava kemikaali kohta. Selline teave hõlmab järgmist: uuri ­
tava kemikaali nimetus ja struktuur, füüsikalis-keemilised omadused, muud 
sama kemikaaliga  in vitro  või in vivo  tehtud mürgisuskatsete tulemused, 
struktuurilt sarnaste ainete toksikoloogilised andmed ning kemikaali eelda ­
tav(ad) kasutusala(d). Selline teave on vajalik kõikide asjaosaliste veenmi ­
seks, et katse on tähtis inimeste tervise kaitsmiseks, ja aitab valida sobivat 
lähtedoosi.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
KATSE PÕHIMÕTE  
5. Katsekemikaali manustatakse loomadele tiinuse ja imetamise ajal. Katseid 
tehakse emasloomadega, et hinnata mõju tiinus- ja imetamisperioodil, ning 
katsed võivad hõlmata ka võrdleva teabe (emasloomad  vs. nende järglased) 
hankimist. Järglased valitakse neurotoksilisuse hindamiseks pesakondadest juhuslikult. Hindamine hõlmab vaatlusi, et teha kindlaks suuri neuroloogilisi 
ja käitumuslikke kõrvalekaldeid; seejuures hinnatakse füüsilist arengut, 
käitumise ontogeneesi, motoorset aktiivsust, motoorseid ja sensoorseid funktsioone, õppimist ja mälu; samuti hinnatakse aju massi ja neuropato ­
loogiat sünnijärgse arengu käigus ja pärast täiskasvanuikka jõudmist.
 
6. Kui katsemeetodi alusel tehakse eraldi uuring, võib igas rühmas kasutada 
täiendavaid loomi, et teha konkreetseid neurokäitumuslikke uuringuid, 
neuropatoloogia, neurokeemia või elektrofüsioloogia uuringuid, millega võidakse täiendada käesoleva katsemeetodi kasutamisega saadavaid andmeid (16, 19, 20, 21). Täiendavad uuringud võivad olla eriti kasulikud, 
kui empiirilised vaatlused, oodatav mõju või toimemehhanism viitavad 
mingile konkreetsele neurotoksilisuse tüübile. Nende täiendavate katsete jaoks võib kasutada emasloomi ja poegi. Lisaks võib kasutada ka  ex vivo  
või in vitro  katseid, kui need katsed ei muuda  in vivo  katsete usaldusväär ­
sust.
 
KATSE ETTEVALMISTAMINE  
Loomaliigi valimine  
7. Eelistatud liigiks on rott; sobivuse korral võib kasutada muid liike. Siiski 
tuleb silmas pidada, et lootelise ja sünnijärgse arengu kohta käesolevas katsemeetodis osutatud päevad kehtivad rottide sagedamini kasutatavate 
liinide puhul, ning kui kasutatakse muud loomaliiki või ebatavalist rotiliini, 
siis tuleb valida võrreldavad päevad. Muu liigi kasutamist tuleks põhjendada toksikoloogiliste, farmakokineetiliste ja/või muude andmete alusel. Põhjen ­
duses tuleks viidata olemasolevatele liigispetsiifilise käitumise sünnijärgse 
arengu neuroloogia ja neuropatoloogia hinnangutele. Kui varasemad katsed 
andsid muret tekitavaid tulemusi, tuleks kaaluda sama liigi/aretusliini kasu ­
tamist. Kuna erinevate liinide rottidel on erinevad omadused, tuleks tõen ­
dada, et kasutamiseks valitud liini rotid on piisava sigivuse ja reageerimis ­
võimega. Kui arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse uuringus kasuta ­
takse muud liiki, tuleb dokumentidega tõendada selle liigi tundlikkus ja saadavate tulemuste usaldusväärsus.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
8. Temperatuur katseloomade ruumis peab olema 22 ± 3 °C. Kuigi suhteline 
niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi 
koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema 50–60 %. Valgustus peab olema 
kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Valgustustsükli võib enne paaritamist ja uuringu kestuse ajaks muuta ka vastupidiseks, et funktsionaal ­
seid ja käitumise näitajaid saaks hinnata pimedal perioodil (punase valguse 
juures), kui loomad on tavaliselt aktiivsed (22). Kui valguse ja pimeduse 
vaheldumise tsüklit muudetakse, tuleb ette näha vajalik kohanemisperiood, et loomad kohaneksid uue tsükliga. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut koos piiramatu hulga joogiveega. Katseprotokollis esita ­
takse sööda ja vee tüüp ning nii sööda kui ka vee kohta tuleks teha saas ­
teainete analüüs.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Loomi võib hoida puurides eraldi või väikestes, samast soost loomade 
rühmadena. Paaritumine peab toimuma selleks ettenähtud puurides. Pärast 
toimunud paarituse tõendamist või hiljemalt tiinuse 15. päeval tuleks paari ­
tatud loomad paigutada eraldi poegimispuuridesse. Puurid paigutatakse nii, et puuri paigutusest tingitud mõjud oleksid võimalikult väikesed. Paaritunud 
emasloomadele antakse poegimisaja lähenemisel sobivad ja kindlaksmää ­
ratud pesaehitusmaterjalid. On hästi teada, et ebasobiv kohtlemine või stress tiinuse ajal võib teha kahju, sealhulgas põhjustada loote surma enne poegi ­
mist või loote ja vastsündinud poegade arengu häireid. Selleks, et ära hoida 
loote surma kemikaali manustamisega mitte seotud tegurite mõjul, tuleb 
loomi tiinuse ajal kohelda hoolikalt ja vältida välistest teguritest, näiteks mürast, tingitud stressi.
 
Loomade ettevalmistamine  
10. Tuleks kasutada terveid loomi, kes on aklimatiseerunud laboratooriumi 
tingimustega ning keda ei ole varem katses kasutatud, välja arvatud juhul, kui uuring toimub muu uuringu raames (vt punkt 3). Katseloomad tuleks 
kirjeldada ja teatada liik, liin, päritolu, sugu, kehamass ja vanus. Igale 
loomale tuleb määrata ja märkida kordumatu identifitseerimisnumber. Kõikide katserühmade loomad peaksid olema võimalikult ühesuguse kaalu ja vanusega, ning need peaksid olema kasutatava liigi ja liini tavapärases 
vahemikus. Iga doosimäära juures tuleks kasutada noori täiskasvanud poegi ­
mata emasloomi. Õdesid ja vendi ei tohiks lasta omavahel paarituda ja tuleb hoolitseda, et seda ei juhtuks. Tiinuse 0-päevaks (tiinestumispäevaks,  gesta­
tion day , GD) loetakse päev, millal märgati spermat tupes ja/või vaginaal ­
korki. Kui tarnijalt ostetakse teadaoleva tiinestumispäevaga tiined loomad, 
nähakse ette sobiv kohanemisaeg (nt 2–3 päeva). Paaritatud emasloomad jagatakse erapooletul viisil ja võimalikult ühtlaselt kontrollrühmadesse ja katserühmadesse (nt soovitatavalt stratifitseeritud juhusliku meetodiga, et 
tagada rühmade vahel loomade ühtlane jaotus, näiteks kehamassi järgi). 
Sama isaslooma poolt viljastatud emasloomad tuleks jaotada võrdselt eri rühmade vahel.
 
KATSE KORRALDUS  
Loomade arv ja sugu  
11. Tiinete emasloomade arv igas kontrollrühmas ja katserühmas, mille liikmed 
puutuvad kokku uuritava kemikaaliga, peaks olema piisav, et sünniks piisav 
arv järglasi neurotoksilisuse hindamiseks. Iga doosimäära puhul soovita ­
takse kasutada kokku 20 pesakonda. Kui iga sellise rühma kohta saavuta ­
takse nõutav pesakondade arv, on lubatud paralleelsed ja vahelduvate rühmadega manustamiskavad; paralleelproovide arvessevõtmiseks kasuta ­
takse sobivaid statistilisi mudeleid.
 
12. Hiljemalt 4. sünnijärgsel päeval ( post-natal day , PND 4) (sünni päev on 
PND 0) tuleks kõikide pesakondade suurus ühtlustada; selleks surmatakse 
juhusliku valiku alusel liigsed pojad, et kõikide pesakondade suurus oleks võrdne (23). Pesakonna suurus ei tohiks ületada keskmist pesakonna suurust kasutatava näriliste liini puhul (8–12). Pesakonda tuleks alles jätta võrdne 
arv isas- ja emasloomi, kuivõrd see on võimalik. Poegade selektiivne 
kõrvaldamine, näiteks kehamassi põhjal, ei ole sobiv. Pärast pesakondade standardimist (liigsete poegade surmamist) ja enne edasiste funktsionaalsete näitajate määramist tuleks kõik võõrutuseelsete või võõrutusjärgsete katsete 
jaoks ettenähtud pesakonna liikmed varustada individuaalse kordumatu 
märgisega, kasutades sobivat humaanset meetodit (nt 24).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Loomade jagamine rühmadesse funktsionaalsete ja käitumuslike testide 
tegemiseks, aju massi määramiseks ja neuropatoloogiliseks hindamiseks  
13. Meetodis lubatakse kasutada eri lähenemisviise selleks, et jagada loomad 
rühmadesse, kes puutuvad kemikaaliga kokku  in utero  ja imetamise kaudu 
ning kellele tehakse funktsionaalsed ja käitumuslikud testid, kellel jälgitakse suguküpsuse saabumist ja määratakse aju massi ning keda hinnatakse neuro ­
patoloogia seisukohast (25). Vajaduse korral võib üksikjuhtudel määrata 
muid käitumuslikke neuroloogilisi funktsioone (nt sotsiaalset käitumist), uurida neurokeemilisi või neuropatoloogilisi aspekte, kui sellega ei kahjus ­
tata algselt nõutud testide usaldusväärsust.
 
14. Pojad valitakse igast doosirühmast ja iga näitaja hindamiseks alates 4. 
sünnijärgsest päevast (PND 4). Poegade valimine rühmadesse peaks 
toimuma nii, et iga doosirühma iga pesakonna kummastki soost pojad 
oleksid võimalikult ühtlaselt esindatud kõikides testides. Motoorse aktiiv ­
suse katsetes tuleks poegade hulgast ühtesid ja samu isas- ja emaslooma ­
paare uurida igas võõrutuseelses vanuses (vt punkt 35). Kõikide muude 
käitumuslike testide tegemiseks võib määrata sama või erineva isaslooma 
ja emaslooma paari. Võõrutatud poegade ja täiskasvanud loomade kogni ­
tiivse talitluse hindamisel võib osutuda vajalikuks määrata rühmadesse erinevad pojad, et vältida tulemuste sõltumist erineva vanuse või eelneva 
õppimise mõjust (26, 27). Võõrutamise ajal (PND 21) võib pojad, keda 
katsete tegemiseks ei valita, humaansel viisil surmata. Kõik muudatused poegade rühmadesse jagamisel tuleks katseprotokollis fikseerida. Statistiline 
mõõtmisühik peaks olema pesakond (või poeginud emasloom), aga mitte 
poeg.
 
15. Poegade jagamiseks rühmadesse, millega tehakse võõrutuseelseid ja -järg ­
seid vaatlusi, kognitiivseid katseid, patoloogiavaatlusi jne, on mitmeid võimalusi (vt üldkava (joonis 1) ja rühmadesse jagamise näide (1. liide)). Soovitatav minimaalne loomade arv igas doosirühmas võõrutuseelsete ja 
-järgsete uuringute puhul on järgmine: 
Kliinilised vaatlused ja kehamass Kõik loomad 
Üksikasjalikud kliinilised vaatlused 20/sugu (1/sugu/pesakond) 
Aju mass (pärast fikseerimist) PND 11–22 10/sugu (1/pesakond) Aju mass (fikseerimata) ~ PND 70 10/sugu (1/pesakond) Neuropatoloogia (fikseerimine immersiooni 
või perfusiooniga) PND 11–22 10/sugu (1/pesakond) 
Neuropatoloogia (fikseerimine perfusioo ­
niga) ~ PND 70 10/sugu (1/pesakond) 
Suguküpsuse saabumine 20/sugu (1/sugu/pesakond) 
Muud olulised arengunäitajad (soovi korral) Kõik loomad Käitumise ontogenees 20/sugu (1/sugu/pesakond) Motoorne aktiivsus 20/sugu (1/sugu/pesakond) 
Motoorne ja sensoorne funktsioon 20/sugu (1/sugu/pesakond) 
Õppimine ja mälu 10/sugu (
 a ) (1/pesakond)  
( a ) Kognitiivse talitluse katsed: tundlikkusest olenevalt tuleb kaaluda suurema arvu 
loomade kasutamist, nt kuni 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast (loomade 
rühmadeks jagamine, vt 1. liide) (täiendavad juhised valimi suuruse kohta on 
esitatud OECD juhenddokumendis 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dooside manustamine  
16. Tuleks kasutada vähemalt kolme doosimäära ja näha ette paralleelsed kont ­
rollrühmad. Doosimäärad tuleks määrata nii, et tekkivad toksilised mõjud 
tugevneksid järk-järgult. Kui seda ei piira kemikaali füüsikalis-keemilised või bioloogilised omadused, tuleks kõrgeim doosimäär valida nii, et tiinel emasloomal ilmneksid mürgistusnähud (nt kliinilised sümptomid, kehamassi 
väiksem (mitte üle 10 %) suurenemine ja/või tõendid mürgisuse kohta 
sihtorganile, mis ei luba doosi piirmäära suurendada). Suurima doosi piiriks võib teatavate eranditega olla 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas. Näiteks võib inimese oodatava kokkupuute ulatus sundida kasutama suuremat doosi. 
Teise võimalusena tuleks teha prooviuuring või esialgsed doosivahemiku 
määramise katsed, et leida suurim doos, mis põhjustaks tiinel emasloomal vaid minimaalseid mürgistusnähtusid. Kui standardse arenguhäireid põhjus ­
tava toksilisuse uuringu või prooviuuringuga on näidatud, et uuritav kemi ­
kaal põhjustab arenguhäireid, peaks kõrgeim doosimäär olema selline, mis 
ei oleks järglaste jaoks väga mürgine, näiteks ei põhjusta järglaste surma juba emaüsas või kohe pärast sündi, samuti ei põhjusta selliseid vääraren ­
guid, mis ei võimalda mõistlikult hinnata arenguhäireid põhjustavat neuro ­
toksilisust. Väikseim doos tuleks valida nii, et see ei põhjustaks mingeid 
toksilisuse sümptomeid ei tiinel emasloomal ega järglastel, samuti mitte neurotoksilisuse sümptomeid. Doosimäärade alanev järjestus tuleks valida nii, et saaks näidata toime sõltuvust doosist ja leida täheldatavat kahjulikku 
toimet mitteavaldava doosi ( No-Observed-Adverse Effect Level , NOAEL) 
või jälgitava toime piiri lähedase doosi, mis lubaks määrata võrdlusdoosi. Kahe- või neljakordsed vahemikud on sageli optimaalsed alanevate doosi ­
määrade kehtestamisel ja neljanda doosirühma lisamine on sageli eelistatav 
väga suurte doosidevaheliste vahemike (nt üle kümne korra) puhul.
 
17. Doosimäärade valimisel tuleks arvesse võtta kõik olemasolevad andmed 
mürgisuse kohta ning ka lisateavet uuritava kemikaali või samalaadse aine metabolismi ja toksiko-kineetika kohta. Kõnealune teave aitab ehk ka 
näidata, et dooside manustamise režiim on valitud õigesti. Dooside otsest 
manustamist vastsündinud poegadele tuleks kaaluda kokkupuudet ja farma ­
kokineetikat käsitleva teabe põhjal (28, 29). Enne dooside otsese manusta ­
mise uuringu tegemist tuleks hoolikalt kaaluda eeliseid ja puudusi (30).
 
18. Paralleelseks kontrollrühmaks peaks olema kahjutut ainet saav kontrollrühm 
või kandeainet saav kontrollrühm, kui uuritava kemikaali manustamisel 
kasutatakse kandeainet. Kõigile loomadele tuleks kehamassist lähtudes manustada ühesugune kogus kas uuritavat kemikaali või kandeainet. Kui dooside manustamise hõlbustamiseks kasutatakse kandeainet või muud 
lisaainet, tuleks pöörata tähelepanu järgmistele aspektidele: kandeaine 
mõju uuritava kemikaali imendumisele, jaotumisele kehas, metabolismile või peetumisele; mõju uuritava kemikaali keemilistele omadustele, mis võib muuta selle toksilisi omadusi, ning mõju loomade sööda- või veetar ­
bimisele või toitumusele. Kandeainel ei tohiks olla mõju, mis võiks häirida 
uuringu tulemuste tõlgendamist; samuti ei tohiks kandeaine neurotoksilisuse tõttu põhjustada käitumishäireid, mõjutada paljunemist või embrüo arengut. Uudse kandeaine puhul tuleks lisaks kandeaine kontrollrühmale kasutada 
veel võltskontrollrühma. Kontrollrühma(de) loomi tuleks kohelda nii nagu 
katserühma loomi.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Dooside manustamine  
19. Uuritavat kemikaali või kandeainet tuleks manustada viisil, mis on kõige 
asjakohasem inimese kokkupuute puhul, võttes arvesse metabolismiga ja 
katselooma kehas jaotumisega seotud teavet. Manustamisviis on tavaliselt suukaudne (näiteks sundsöötmine sondiga või sööda või joogivee kaudu), kuid kasutada võib ka muid manustamisviise (nt naha kaudu, sissehinga ­
mise teel), sõltuvalt kemikaali omadustest ning eeldatavast või teadaolevast 
kokkupuuteteest inimese puhul (täiendavad juhised on esitatud juhenddoku ­
mendis 43 (8)). Valitud manustamisviisi tuleks põhjendada. Uuritavat kemi ­
kaali tuleks manustada igal päeval ligikaudu samal ajal.
 
20. Iga looma doos peaks tavaliselt põhinema looma kõige viimasel indivi ­
duaalselt kindlaksmääratud kehamassil. Tiinuse viimasel kolmandikul tuleks 
doosi määramisega olla siiski ettevaatlik. Kui emasloomadel, kellele manus ­
tati kemikaali, avalduvad liigse mürgistuse sümptomid, tuleks need loomad humaanselt tappa.
 
21. Uuritavat kemikaali või kandeainet tuleks paaritatud emasloomadele manus ­
tada vähemalt kord päevas alates loodete implantatsioonist (GD 6) kogu 
imetamise aja jooksul (kuni PND 21), nii et pojad puutuksid kemikaaliga kokku närvisüsteemi sünnieelse ja -järgse arengu jooksul. Nii dooside manus ­
tamise algust kui ka kestust ja sagedust võib muuta, kui tõendid osutavad, et 
katse teistsugune korraldus võiks inimese kokkupuudet arvestades olla asja ­
kohasem. Muu liigi puhul tuleks dooside manustamise kestust kohandada, et tagada kokkupuude kemikaaliga aju arengu kõikidel varastel järkudel (s.o järkudel, mis vastavad inimaju sünnieelsele ja varasele sünnijärgsele kasvule). 
Dooside manustamine võib alata kohe tiinuse algusest (GD 0), kuigi tuleks 
silmas pidada võimalust, et kemikaal võib põhjustada embrüo hukkumise juba enne implantatsiooni. Manustamise alustamisega GD 6-st saaks seda riski vältida, kuid arengujärgud GD 0 — GD 6 jäävad siis kemikaaliga 
mõjutamata. Kui labor ostab teadaoleva tiinestumispäevaga tiineid loomi, 
on raske alustada dooside manustamist GD 0-st ja seega oleks hea päev alustamiseks GD 6. Katselabor peaks kehtestama dooside manustamise korra vastavalt uuritava kemikaali mõju käsitlevale asjakohasele teabele, vara ­
sematele kogemustele ja logistilistele kaalutlustele; see võib hõlmata dooside 
manustamist ka pärast võõrutamist. Doosi ei manustata poegimise päeval sellistele loomadele, kes ei ole veel kõiki järglasi sünnitanud. Üldiselt eelda ­
takse, et järglaste kokkupuude kemikaaliga toimub emapiima kaudu; kuid kui 
järglaste jätkuva kokkupuute kohta puuduvad tõendid, tuleks kaaluda kemi ­
kaali manustamist otse poegadele. Tõendeid järglaste katkematu kokkupuute kohta võib leida näiteks farmakokineetilisest teabest, teabest mürgisuse kohta 
järglastele või biomarkerite muutustest (28).
 
VAATLUSED  
Emasloomade jälgimine  
22. Kõiki emasloomi tuleks hoolikalt vaadelda vähemalt kord päevas, et hinnata 
nende terviseseisundit, sealhulgas haigestumust ja suremust.  
23. Dooside manustamise ja vaatluste perioodil tuleks korrapäraselt teha üksi ­
kasjalikke kliinilisi vaatlusi (vähemalt kahel korral poegimiseelsel manusta ­
misperioodil ja kahel korral imetamisaegsel manustamisperioodil), kasutades 
vähemalt kümmet emaslooma iga doosimäära puhul. Loomi peaksid väljas ­
pool kodupuuri vaatlema väljaõppinud spetsialistid, kes ei tea, et manusta ­
takse kemikaali, ja kasutavad standarditud korda, et vähendada loomade stressi ja vaatleja erapoolikuse mõju ning saavutada vaatlejate arvamuste 
võimalikult hea kooskõla. Võimaluse korral on soovitatav, et ühe uuringu 
puhul teeks vaatlusi sama spetsialist.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Täheldatud sümptomid tuleks registreerida. Võimaluse korral tuleks regis ­
treerida ka täheldatud sümptomite intensiivsus. Kliinilised vaatlused peaksid 
hõlmama vähemalt järgmist: naha, karvkatte, silmade ja limaskestade muutused, eritiste esinemine, autonoomse närvisüsteemi aktiivsuse muutused (nt pisaravool, turris karv, pupilli suurus, muutunud hingamine 
ja/või suu kaudu hingamine, kõik urineerimise või roojamisega seotud 
ebatavalised sümptomid).
 
25. Kõik kehaasendi, aktiivsuse astme (nt standardala vähenenud või suure ­
nenud uurimine) ning liigutuste koordinatsiooni muutused tuleks samuti üles märkida. Muutused kõnnakus (nt taarumine, ataksia), kehaasendis (nt küürus selg) ning reageerimises kättevõtmisele, mahapanemisele või 
muudele keskkonna stiimulitele ning klooniliste või tooniliste liigutuste, 
krampide või värinate esinemine, stereotüübid (nt ülemäärane karvkatte eest hoolitsemine, ebatavalised pealiigutused, korduv tiirutamine) või veider käitumine (nt hammustamine või enda ülemäärane lakkumine, enesevigas ­
tamine, tagurpidi kõndimine, häälitsemine) või agressiivsus tuleks 
registreerida.
 
26. Toksilisuse märgid tuleks üles märkida koos ilmnemise päeva, kellaaja, 
sümptomite raskusastme ja kestusega.  
27. Dooside manustamise ajal tuleks loomi kogu uuringu kestel kaaluda vähe ­
malt üks kord nädalas, sünnituse päeval või selle läheduses ja päeval PND 21 (võõrutamine). Emasloomade sundsöötmise uuringute puhul tuleks loomi kaaluda vähemalt kaks korda nädalas. Doose tuleks sobivaks kohandada 
vastavalt igale kehamassi määramise tulemusele. Sööda tarbimist tuleks 
tiinuse ja imetamise ajal mõõta vähemalt iga nädal. Kui kemikaali manus ­
tatakse joogivee kaudu, tuleks vee tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas.
 
Järglaste jälgimine  
28. Kõiki järglasi tuleks hoolikalt vaadelda vähemalt kord päevas, et teha kind ­
laks mürgistusnähud, haigestumus ja suremus.  
29. Dooside manustamise ja vaatluste ajal tuleks teha järglaste üksikasjalikke 
kliinilisi vaatlusi. Järglasi (vähemalt üks loom kummastki soost ja igast 
pesakonnast) peaksid vaatlema väljaõppinud spetsialistid, kes ei tea, et manustatakse kemikaali, ja kasutavad standarditud korda, et vähendada vaatleja erapoolikuse mõju ning saavutada vaatlejate arvamuste võimalikult 
hea kooskõla. Võimaluse korral on soovitatav, et vaatlusi teeks sama spet ­
sialist. Iga vaadeldava arengujärgu kohta tuleks jälgida vähemalt punktides 24 ja 25 kirjeldatud näitajaid.
 
30. Kõik järglaskonnas ilmnevad toksilisuse märgid tuleks üles märkida koos 
ilmnemise päeva, kellaaja, sümptomite raskusastme ja kestusega.  
Füüsilised ja arengut iseloomustavad näitajad  
31. Võõrutuseelse arengu näitajate (kõrvalesta tipu eemaldumine peast, silmade 
avanemine, lõikehammaste ilmumine) muutused korreleeruvad hästi keha ­
massiga (30, 31). Kehamass võib olla parim füüsilise arengu taseme näitaja. 
Arengu põhinäitajate mõõtmist soovitatakse seepärast ainult siis, kui on 
olemas varasemad tõendid selle kohta, et kõnealused näitajad annavad täien ­
davat teavet. Kõnealuste näitajate hindamise ajakava on esitatud tabelis 1. Sõltuvalt oodatavast mõjust ja esialgsete mõõtmiste tulemustest võib olla 
soovitatav lisada täiendavaid aegu või teha mõõtmisi muudes 
arengustaadiumides.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Füüsilise arengu hindamise korral on soovitatav kasutada paaritusjärgset, 
mitte sünnijärgset vanust (33). Kui poegadega tehakse katseid võõrutamise 
päeval, on soovitatav teha katsed enne võõrutushetke, et vältida võõrutami ­
sega seotud stressi segavat mõju. Katseid ei tuleks teha ka kahel võõruta ­
misjärgsel päeval.  
Tabel 1  
Füüsiliste ja arengut iseloomustavate näitajate ning funktsionaalsete või käitumuslike 
näitajate hindamise ajakava  ( a ) 
Vanusejärgud 
Näitajad Võõrutuseelne (  b ) Noorukiiga (  b ) Noored täiskasvanud (  b ) 
Füüsilised ja arengut iseloomustavad näitajad  
Kehamass ja kliinilised 
vaatlused iga nädal (  c ) vähemalt iga kahe 
nädala tagant vähemalt iga kahe 
nädala tagant 
Aju mass PND 22 (  d ) katse lõpetamisel 
Neuropatoloogia PND 22 (  d ) katse lõpetamisel 
Suguküpsuse saabu ­
mine — vajaduse korral — 
Muud arengunäita ­
jad (  e ) vajaduse korral — —  
Funktsionaalsed või käitumuslikud näitajad  
Käitumise ontogenees vähemalt kaks mõõt ­
mist 
Motoorne aktiivsus (sh 
harjumine) 1–3 korda (  f ) — üks kord 
Motoorne ja sensoorne 
funktsioon — üks kord üks kord 
Õppimine ja mälu — üks kord üks kord  
( a ) Selles tabelis on esitatud minimaalne mõõtmiskordade arv. Sõltuvalt oodatavast mõjust ja esialgsete 
mõõtmiste tulemustest võib olla soovitatav lisada täiendavaid aegu (näiteks vanad loomad) või teha 
mõõtmisi muudes arengustaadiumides. 
( b ) Poegadega ei soovitata teha katseid kahel võõrutusjärgsel päeval (vt punkt 32). Soovitatav vanus noor ­
loomadega katsete tegemiseks on järgmine: õppimine ja mälu — PND 25 ± 2; motoorne ja sensoorne 
funktsioon — PND 25 ± 2. Soovitatav vanus katsete tegemiseks noorte täiskasvanutega on PND 60–70. 
( c ) Poegadele dooside otse manustamise korral tuleks kehamassi mõõta vähemalt kaks korda nädalas, et 
kohandada doose vastavalt kehamassi kiirele suurenemisele. 
( d ) Aju massi ja neuropatoloogiat võib hinnata varasemal ajal (nt PND 11), kui see on sobiv (vt punkt 39). 
( e ) Muid arengu näitajaid lisaks kehamassile (nt silmade avanemine) tuleb registreerida sündmuse toimumise 
ajal (vt punkt 31). 
( f ) Vt punkt 35.  
33. Elusad järglased tuleb üle lugeda ja määrata nende sugu, nt visuaalse vaat ­
luse või anogenitaalse vahemaa määramisega (34, 35), ning iga poega 
pesakonnas tuleks kaaluda kohe pärast sündi või varsti selle järel, vähemalt kaks korda nädalas imetamise ajal ja vähemalt iga kahe nädala tagant pärast seda. Suguküpsuse saabumise määramiseks tuleks igas pesakonnas vähemalt 
ühel isasloomal ja ühel emasloomal määrata vanus ja kehamass, kui neil 
toimub tupe avanemine (36) või eesnaha eraldumine (37).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Käitumise ontogenees  
34. Valitud käitumisviisinäitajate arengut tuleks mõõta sobivas vanuses vähe ­
malt ühel pojal kummastki soost igas pesakonnas, kusjuures kõigil katse ­
päevadel kasutatakse kõikide käitumisviisinäitajate määramiseks samu loomi. Mõõtmispäevad jaotatakse ühtlaselt üle vaatluste aja, et määrata normaalsete käitumisjoonte areng või nende muutused, mis on seotud 
dooside manustamisega (38). Hinnata võiks näiteks järgmiste käitumisjoonte 
kujunemist: õige kehaasendi taastamise refleks, negatiivne geotaksis ja motoorne aktiivsus (38, 39, 40).
 
Motoorne aktiivsus  
35. Motoorset aktiivsust tuleks jälgida (41, 42, 43, 44, 45) võõrutuseelses 
vanuses ja täiskasvanuvanuses. Katsete kohta võõrutamise ajal vt punkt 32. Katsete periood peab olema piisavalt pikk, et näidata kemikaaliga tööt ­
lemata kontrollrühmas katsete perioodi jooksul tekkivat harjumist. Käitu ­
mise ontogeneesi hindamiseks on väga soovitatav kasutada motoorse aktiiv ­
suse hindamist. Kui seda kasutatakse käitumise ontogeneesi hindamiseks, tuleks kõikides võõrutuseelsetes katsetes kasutada samu loomi. Katseid 
tuleks teha piisava sagedusega, et demonstreerida katsete perioodi jooksul 
tekkivat harjumist (44). Selleks võib kuluda kolm sessiooni enne võõruta ­
mist ja võõrutamise päeval (nt päevad PND 13, 17, 21). Samu ühe pesa ­
konna loomi tuleks vaadelda ka täiskasvanueas enne katse lõpetamist (nt 
päevad PND 60–70). Katseid võib vajaduse korral teha ka lisapäevadel. 
Motoorset aktiivsust tuleks mõõta salvestusseadmega automatiseeritud aparaadi abil, millega saab määrata nii tegevuse hoogustumist kui ka vähe ­
nemist (nt baastegevus, mida seadmega saab mõõta, ei tohiks olla nii 
vähene, et selle vähenemist ei õnnestu registreerida, ega nii hoogne, et 
selle edasist hoogustumist ei saa registreerida). Iga seadet tuleb kontrollida standardmeetodiga, et tagada võimalikkuse piires eri seadmete mõõtmiste ja eri päevadel toimuvate mõõtmiste usaldusväärsus. Doosirühmade loomad 
jaotatakse eri seadmete vahel võimalikult tasakaalustatult. Iga loomaga 
tuleks katseid teha eraldi. Doosirühmade katsed peavad toimuma tasakaa ­
lustatult eri aegadel, et tulemusi ei mõjutaks tegevuse ööpäevased rütmid. Tuleks püüda tagada, et katsetingimuste varieeruvus oleks võimalikult väike 
ja et ei esineks süstemaatilist viga. Paljude käitumisnäitajate mõõtmist 
mõjutavad sellised muutujad nagu müratase, katsepuuri kuju ja suurus, temperatuur, suhteline õhuniiskus, valgustustingimused, lõhnad, kodupuuri või uue katsepuuri kasutamine ja tähelepanu häirivad keskkonnatingimused.
 
Motoorne ja sensoorne funktsioon  
36. Motoorset ja sensoorset funktsiooni tuleks üksikasjalikult uurida vähemalt 
üks kord noorukieas ja üks kord noore täiskasvanu eas (nt PND 60–70). Katsete tegemise kohta võõrutamise ajal vt punkt 32. Tuleb teha piisavalt 
katseid, et koguda vajalikud kvantitatiivsed andmed sensoorsete funktsioo ­
nide kohta (nt somatosensoorsed ja vestibulaarfunktsioonid) ja motoorsete funktsioonide kohta (nt jõud, koordinatsioon). Mõned motoorsete ja sensoorsete funktsioonide näited on tõukerefleks (tallarefleks) (46), õige 
kehaasendi taastamise refleks (47, 48), ehmatava helisignaaliga harjumine 
(40, 49, 50, 51, 52, 53, 54) ja esilekutsutud võimed (55).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Õppimise ja mälu katsed  
37. Assotsiatiivse õppimise ja mälu katse tuleks teha pärast võõrutamist (nt 
päeval 25 ± 2) ja noorte täiskasvanutega (PND 60 ja vanemad). Katsete 
kohta võõrutamise ajal vt punkt 32. Nende kahe arengutaseme puhul võib kasutada sama või eraldi katset. Võõrutatud poegade ja täiskasvanud rottide õppimise ja mälu katse(te) valimisel lubatakse teatavat paindlikkust. 
Katse(d) tuleks siiski kavandada selliselt, et oleksid täidetud kaks kritee ­
riumi. Esiteks, õppimist tuleks hinnata mitme korduva õppimiskatse või -sessiooni jooksul ilmnevate muutuste kaudu või ühtainukest ülesannet hõlmava katsega ja võrrelda seda kontrollkatsega, milles kontrollitakse 
õpetamiskatse võimalikke mitteassotsiatiivseid mõjusid. Teiseks peaksid 
katsed hõlmama mingil määral (lühiajalise või pikaajalise) mälu kasutamist, lisaks algsele äraõppimisele (omandamine), kuid seda mälu näitajat ei saa registreerida, kui sama katsega ei ole mõõdetud omandamise näitajat. Kui 
õppimise ja mälu katsetest ilmneb kemikaali mõju, tuleb kaaluda lisakatsete 
korraldamist, et jätta kõrvale alternatiivsed tõlgendused, mille aluseks on sensoorsed või motivatsioonilised muutused ja/või motoorse suutlikkuse muutumine. Lisaks eespool nimetatud kahele kriteeriumile on soovitatav, 
et õppimise ja mälu katse tuleks valida nii, et katse oleks tõendatult tundlik 
uuritava kemikaali suhtes, kui kirjandusest on kättesaadav kõnealune teave. Kui sellist teavet ei ole, võiksid selliste katsete näideteks, mida võib teha eespool kirjeldatud kriteeriumide täitmiseks, olla passiivne vältimine (43, 
56, 57), viivitusega reageerimine asendile täiskasvanud roti (58) või rotipoja 
(59) puhul, haistmise kaudu mõjutamine (43, 60), Morrise veelabürindi katse (61, 62, 63), Bieli või Cincinnati labürindi katse (64, 65), radiaalla ­
bürindi katse (66), T-labürindi katse (43) ning ajakavast sõltuva käitumise 
omandamine ja säilitamine (26, 67, 68). Kirjanduses on kirjeldatud veel 
muid katseid võõrutatud rotipoegade (26, 27) ja täiskasvanud rottide jaoks (19, 20).
 
Surmamisjärgne uurimine  
38. Emaloomad võib pärast järglaste võõrutamist surmata.  
39. Järglaste neuropatoloogiliseks uurimiseks kasutatakse kudesid, mis on 
saadud loomadelt, kes on humaanselt surmatud päeval PND 22 või varem (PND 11 — PND 22) või katse lõpetamisel. Päeval PND 22 surmatud järglaste puhul tuleks hinnata ajukudesid; katse lõpetamisel surmatud 
loomade puhul tuleks hinnata nii kesknärvisüsteemi kudesid kui ka peri ­
feerse närvisüsteemi kudesid. Päeval PND 22 või varem surmatud loomad võib fikseerida immersiooni või perfusiooniga. Katse lõpetamisel surmatud loomad tuleks fikseerida perfusiooniga. Koenäidiste ettevalmistamisel tuleks 
kõikidel etappidel — loomade perfusioon, kudede väljalõikamine, kudede 
töötlemine ja mikroskoobipreparaatide värvimine — kasutada tasakaalus ­
tatud katsekorraldust, nii et igas partiis oleks iga doosirühma esindav valim. Täiendavad suunised neuropatoloogia kohta on esitatud OECD 
juhenddokumendis nr 20 (9), vt ka (103).
 
Koeproovide töötlemine  
40. Kõik lahkamise ajal märgatavad suured kõrvalekalded tuleks üles märkida. 
Võetud koeproovid peaksid esindama kõiki peamisi närvisüsteemi piirkondi. Koeproove tuleks säilitada sobivas fiksaatoris ja neid tuleks töödelda vasta ­
valt avaldatud standardsetele histoloogiajuhenditele (69, 70, 71, 103). Para ­
fiinis konserveerimine on sobiv kesk- ja perifeerse närvisüsteemi kudede
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
puhul, kuid osmiumi kasutamine järelfikseerimiseks koos epoksükonservee ­
rimisega võib olla sobiv, kui on vaja saavutada parem lahutusvõime (nt 
perifeersete närvide puhul, kui kahtlustatakse perifeerset neuropaatiat ja/või perifeersete närvide morfomeetriliseks analüüsiks). Morfomeetriliseks analüü ­
siks kogutav ajukude tuleks kõikide doosirühmade puhul paigutada sobivasse 
säilituskeskkonda samal ajal, et vältida kokkutõmbumisest tingitud artefakte, 
mis võivad kaasneda pikaajalise säilitamisega fiksaatoris (6).
 
Neuropatoloogiline uuring  
41. Kvalitatiivse uuringu eesmärgid on järgmised:  
i) teha kindlaks närvisüsteemi piirkonnad, milles esineb nähtavaid neuro ­
patoloogilisi muutusi;  
ii) teha kindlaks, millist tüüpi neuropatoloogilised muutused tulenevad 
kokkupuutest uuritava kemikaaliga, ning  
iii) määrata neuropatoloogiliste muutuste ulatus raskusastme järgi.  
Koeproovidest saadud representatiivseid histoloogilisi lõikeid peaks mikro ­
skoobiga uurima nõuetekohaselt koolitatud patoloog, et leida tõendeid 
neuropatoloogiliste muutuste kohta. Igale neuropatoloogilisele muutusele 
tuleks subjektiivse hindamisskaala alusel omistada raskusaste. Värvimine hematoksüliini ja eosiiniga võib olla piisav, et hinnata päeval PND 22 või varem humaanselt surmatud loomade aju lõikeid. Katse lõpetamisel 
surmatud loomade kesknärvisüsteemi ja perifeerse närvisüsteemi lõigete 
uurimiseks soovitatakse kasutada aga müeliinivärve (nt  Luxol fast blue /kre­
süülviolett) ja hõbedapõhiseid värve (nt Bielschowsky või Bodiani värv). Vastavalt patoloogi eksperthinnangule ja võttes arvesse täheldatud muutusi, 
võib kasutada muid sobivaid värve, et teha kindlaks ja iseloomustada 
teatavat tüüpi muutusi (nt gliiafibrillide happelise proteiini (GFAP) või lektiini histokeemia, et hinnata gliia ja mikrogliia muutusi (72), fluorojadeiit-värv nekroosi tuvastamiseks (73, 74) või närvide degenerat ­
siooni suhtes spetsiifiline hõbedapõhine värv (75)).
 
42. Tuleks teha morfomeetriline (kvantitatiivne) hindamine, kuna need andmed 
võivad aidata tuvastada kokkupuutega seotud mõju ja on väärtuslikud kemi ­
kaaliga kokkupuutest tingitud ajumassi või aju morfoloogia erinevuste 
tõlgendamisel (76, 77). Närvikoest tuleks võtta proovid ja valmistada need ette morfomeetriliseks hindamiseks. Morfomeetriline hindamine võib hõlmata näiteks aju teatavate piirkondade joonmõõtmete või pindala määra ­
mist (78). Joonmõõtmete või pindala määramiseks on vaja kasutada homo ­
loogseid lõikeid, mis on hoolikalt valitud usaldusväärsete mikroskoopiliste punktide järgi (6). Et tuvastada kemikaaliga kokkupuute mõju sellistele näitajatele nagu teatava neuroanatoomilise piirkonna maht või rakkude 
arv, võib kasutada stereoloogiat (79, 80, 81, 82, 83, 84).
 
43. Ajus tuleks otsida tõendeid neuropatoloogiliste muutuste kohta, mis on 
seotud dooside manustamisega, ja piisavad näidised tuleks võtta kõikidest peamistest aju piirkondadest (nt haistmissibulad, ajukoor, hipokamp, basaal ­
ganglionid, talamus, hüpotalamus, keskaju ( tectum , tegmentum  ja ajuvarred), 
ajusild, piklikaju, väikeaju), et läbivaatamine oleks põhjalik. On oluline, et kõigilt loomadelt võetaks lõiked samas tasapinnas. Katse lõpetamisel humaanselt surmatud täiskasvanud loomadelt tuleks võtta seljaaju ja peri ­
feerse närvisüsteemi representatiivsed lõiked. Uuritavad alad peaksid 
hõlmama silma koos nägemisnärvi ja võrkkestaga, seljaaju kaela- ja nimme ­
tüve kohal, selgmisi ja kõhtmisi närvijuuri, proksimaalset istmikunärvi, proksimaalset säärenärvi (põlve juures) ja säärenärvi sääremarjalihase 
harusid. Seljaajust ja perifeersest närvist tuleks teha nii rist- kui ka piki ­
lõiked.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Neuropatoloogilisel hindamisel tuleks otsida närvisüsteemi arenguhäirete 
tunnuseid (6, 85, 86, 87, 88, 89), lisaks rakulistele muutustele (nt närvirak ­
kude vakuolisatsioon, degeneratsioon, nekroos) ja koemuutustele (nt glioos, leukotsüütide infiltratsioon, tsüstide moodustumine). Sellega seoses on oluline, et dooside manustamisega seotud muutusi tuleb eristada tavalistest 
arenguga seotud muutustest, mis peaksid toimuma looma surmamise ajaks 
(90). Arengu häirumisele viitavad muu hulgas näiteks järgmised leiud:
 
— haistmissibulate, aju või väikeaju üldsuuruse või kuju muutused;  
— aju eri piirkondade suhtelise suuruse muutused, sealhulgas sellised aju 
piirkondade suuruse muutused, mis on tingitud tavaliselt ajutiste raku ­
populatsioonide või aksonite väljakasvude kaotsiminekust või püsima ­
jäämisest (nt väikeaju väline germinaalkiht, mõhnkeha);  
— muutused rakkude paljunemises, migreerumises ja diferentseerimises, 
millele osutab ülemäärane apoptoos või nekroos, väärasetsusega, vale ­
suunaliste või vääralt moodustunud närvirakkude kogumid või hajutatud populatsioonid või muutused ajukoorestruktuuride kihtide suhtelises suuruses;
 
— muutused müeliniseerumises, sealhulgas müeliiniga kaetud struktuuride 
muutunud üldsuurus või värvumine;  
— vesipea tunnused, eelkõige vatsakeste suurenemine, ajuveejuha ahene ­
mine ja ajupoolkerade õhenemine.  
Neuropatoloogiliste muutuste doosi ja toime vahelise sõltuvuse analüü ­
simine  
45. Kvalitatiivse ja kvantitatiivse neuropatoloogilise analüüsi puhul soovitatakse 
toimida järgmiselt. Esiteks võrreldakse suure doosi rühma loomade lõikeid 
kontrollrühma loomade lõigetega. Kui suure doosi rühma loomadel neuro ­
patoloogilisi muutusi ei leita, ei ole täiendav analüüs vajalik. Kui suure doosi rühmade loomadel leitakse neuropatoloogilisi muutusi, uuritakse kesk ­
mise ja madala doosi rühmade loomi. Kui katse suure doosi rühmaga lõpe ­
tatakse loomade surma või muu segava mürgistuse tõttu, tuleks suure ja 
keskmise doosi rühma loomadel uurida neuropatoloogilisi muutusi. Kui väiksema doosi rühma loomadel esineb tunnuseid, mis viitavad kemikaali neurotoksilisusele, tuleks neuropatoloogiline analüüs teha osutatud rühmade 
loomadega. Kui kvalitatiivse või kvantitatiivse vaatlusega leitakse dooside 
manustamisega seotud neuropatoloogilisi muutusi, tuleks määrata kõikide kahjustuste või morfomeetriliste muutuste esinemise, sageduse ja rasku ­
sastme sõltuvus doosist, kasutades kõikide doosirühmade loomade vaatluse 
andmeid. Hindamine peaks hõlmama kõiki ajupiirkondi, milles on leitud 
neuropatoloogilisi muutusi. Iga kahjustuste tüübi puhul tuleks kirjeldada näitajaid, mille alusel määrati raskusaste, sealhulgas omadused, mida kasu ­
tati raskusastmete eristamiseks. Iga tüüpi kahjustuste ja nende raskusastmete 
esinemissagedus tuleks registreerida ja teha statistiline analüüs, et hinnata 
doosi ja toime vahelise sõltuvuse laadi. Soovitatakse kasutada koodmärgi ­
sega varustatud mikroskoobipreparaate (91).
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
46. Andmed tuleks esitada iga looma kohta ja samuti kokkuvõtliku tabelina, 
milles iga katserühma kohta näidatakse muutuste tüübid ning iga tüübi puhul emasloomade, järglaste (eraldi kummastki soost) ja pesakondade arv, kellel see esines. Kui järglased viiakse pärast sündi otse kokkupuutesse 
kemikaaliga, tuleb teatada kokkupuuteviis, kestus ja kokkupuute 
ajavahemik.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Tulemuste hindamine ja tõlgendamine  
47. Arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse uuring annab teavet selle kohta, 
millist mõju avaldab korduv sünnieelne ja varane sünnijärgne kokkupuude 
kemikaaliga. Kuna rõhk on pandud nii üldise mürgisuse kui ka arenguhäi ­
reid põhjustava neurotoksilisuse näitajate määramisele, võimaldavad katse ­
tulemused teha vahet järglaste arengu häireid põhjustaval neurotoksilisusel, 
kui üldist mürgistust emaloomal veel ei täheldata, ja sellisel arenguhäireid 
põhjustaval neurotoksilisusel, mis avaldub ainult kontsentratsioonil, mis on mürgine ka emaloomale. Kuna seosed katse kavandamise, andmete statisti ­
lise analüüsi ja bioloogilise olulisuse vahel on keerulised, kasutatakse aren ­
guhäireid põhjustava neurotoksilisuse uuringu andmete õigeks tõlgendami ­
seks eksperdihinnanguid (107, 109). Katsetulemuste tõlgendamisel kasuta ­
takse tõendite kaalukusel põhinevat lähenemisviisi (20, 92, 93, 94). Arutada tuleks käitumuslike ja morfoloogiliste leidude tüüpe ning doosi ja toime 
vahelist sõltuvust. Sellise iseloomustuse koostamisel tuleks kasutada kõiki 
andmeid arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse kohta, sealhulgas inimeste epidemioloogilisi uuringuid või juhtumiaruandeid ja katseloomade uuringuid (nt toksiko-kineetilised andmed, struktuuri-aktiivsuse sõltuvused, 
muude toksikoloogiauuringute andmed). See hõlmab seost uuritava kemi ­
kaali doosi ja neurotoksilise mõju olemasolu või puudumise, esinemissage ­
duse ja raskusastme vahel kummagi soo puhul (20, 95).
 
48. Andmete hindamisel tuleks arutada nii bioloogilist kui ka statistilist tähtsust. 
Statistilist analüüsi tuleks vaadelda kui vahendit, mis suunab andmete tõlgendamist, kuid ei määra seda. Statistilise olulisuse puudumine ei tohiks 
olla ainus põhjendus järeldamiseks, et kokkupuude kemikaaliga ei avalda 
mõju, ja statistiline olulisus ei saa olla ainus põhjendus, millest järeldatakse, et kemikaal avaldab mõju. Et hoiduda võimaliku valenegatiivse järelduse tegemisest ja kuna „mõju puudumise” tõendamine on juba põhimõtteliselt 
raske, tuleks arutada kõiki olemasolevaid andmeid mõju olemasolu kohta ja 
varasema kontrolli andmeid, eriti kui katse näitas, et dooside manustamine mõju ei avalda (102, 106). Valepositiivse järelduse tõenäosust tuleks arutada kõikide andmete statistilise hindamise põhjal (96). Hindamisel 
tuleks vaadelda neuropatoloogiliste ja käitumuslike muutuste vahelist 
seost, kui täheldati mingeid muutusi.
 
49. Kõigi andmete analüüsimisel tuleb kasutada statistilisi mudeleid, milles 
arvestatakse katse korraldust (108). Parameetrilise või mitteparameetrilise analüüsi valimine peaks olema põhjendatud, võttes arvesse selliseid tegureid 
nagu andmete laad (otsesed või teisendatud andmed) ja nende jaotust, 
samuti valitud statistilise analüüsi meetodi suhtelist stabiilsust. Lähtudes uuringu eesmärgist ja katse kavast, tuleks statistilise analüüsi meetod valida nii, et viia miinimumini I tüüpi (valepositiivse) vea ja II tüüpi (valenega ­
tiivse) vea võimalikkus (96, 97, 104, 105). Kui arengu-uuringus kasutatakse 
loomaliiki, kelle pesakonnas on mitu poega, kellega tehakse katseid, tuleks statistilises mudelis vaadelda pesakonda, et vältida I tüüpi vea võimaluse olulist suurenemist (98, 99, 100, 101). Statistiline mõõtmisühik peaks sel 
juhul olema pesakond ja mitte poeg. Katsed peaksid olema kavandatud nii, 
et ühe pesakonna liikmeid ei käsitataks sõltumatute vaatlusaluste looma ­
dena. Kui ühe ja sama vaatlusobjekti põhjal määratakse mitut näitajat, tuleks nende näitajate analüüsiks kasutada statistilisi mudeleid, milles 
võetakse arvesse, et mõõtmised ei ole sõltumatud.
 
Katseprotokoll  
50. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav kemikaal:  
— füüsiline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;  
— identifitseerimisandmed, sh päritolu;  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— preparaadi puhtus ja teadaolevad või eeldatavad lisandid.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valiku põhjendamine, kui kandeaineks ei ole vesi või füsio ­
loogiline soolalahus.  
Katseloomad:  
— kasutatud loomaliik ja liin, ning põhjendus, kui see on muu kui rott;  
— katseloomade tarnija;  
— loomade arv, vanus katse alguses ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, sööt, vesi jne;  
— iga looma mass katse alguses.  
Katsetingimused:  
— doositaseme valimise põhjendus;  
— dooside manustamise tee ja ajavahemiku põhjendus;  
— manustatavate dooside üksikasjad, sh kandeaine, mahu ja manustatava 
aine füüsilise vormi üksikasjad;  
— üksikasjad uuritava kemikaali koostise/söödavalmistise kohta, valmis ­
tises saavutatud kontsentratsiooni, stabiilsuse ja homogeensuse kohta;  
— meetod, mida kasutati emaloomade ja järglaste kordumatuks märgista ­
miseks;  
— üksikasjalik randomiseerimismeetodi(te) kirjeldus: kuidas juhuslikkuse 
alusel jaotati emaloomad doosirühmadesse, valiti välja järglased surma ­
miseks ja määrati järglased katserühmadesse;  
— uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;  
— vajaduse korral söödas/joogivees või sissehingatavas õhus oleva uuri ­
tava kemikaali kontsentratsiooni (ppm) teisendus tegelikuks päevadoo ­
siks (mg kehamassi kg kohta);  
— keskkonnatingimused;  
— üksikasjad sööda ja vee kvaliteedi kohta (nt kraanivesi, destilleeritud 
vesi);  
— uuringu alustamise ja lõpetamise kuupäevad.  
Vaatlused ja katsemeetodid:  
— üksikasjalik meetodi kirjeldus: kuidas standarditi leiud jm protseduurid, 
samuti märgatud leidudele hindepunktide andmise tööjuhendid;  
— kõikide katses kasutatud meetodite loetelu ja nende kasutamise põhjen ­
dused;  
— kõikide kasutatud käitumuslike, funktsionaalsete, patoloogia-, neuro ­
keemia või elektrofüsioloogiameetodite üksikasjad, sealhulgas teave 
automaatseadmete kohta;  
— seadmete kaliibrimise meetodid, seadmete samaväärsuse tagamine ja 
doosirühmade tasakaalustatud jaotamine katsete tegemisel;  
— lühike selgitus kõigi otsuste kohta, milles kasutati eksperdihinnanguid.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Tulemused (individuaalsed tulemused ja nende kokkuvõte, sealhulgas 
võimaluse korral keskväärtus ja dispersioon):  
— loomade arv uuringu alguses ja uuringu lõpus;  
— iga katsemeetodi puhul kasutatud loomade ja pesakondade arv;  
— iga looma identifitseerimisnumber ja pesakond, millest loom on pärit;  
— pesakonna suurus ja sünnijärgne keskmine mass sugude kaupa;  
— kehamassi ja selle muutuse andmed, sealhulgas emaloomade ja järglaste 
lõplik kehamass;  
— sööda tarbimise ja vajaduse korral vee tarbimise andmed (nt kui uuri ­
tavat ainet manustatakse vee kaudu);  
— toksilist reaktsiooni käsitlevad andmed sugude ja doosimäärade kaupa, 
sh surma aeg ja põhjus, kui see on asjakohane;  
— toksilisuse laad, raskusaste, kestus, avaldumise päev, kellaaeg, ja 
edasiste üksikasjalike kliiniliste vaatluste käik;  
— arengu iga olulise näitaja (kehamass, suguküpsuse saabumine ja käitu ­
mise ontogenees) hindepunktide arv igal vaatlusel;  
— kõikide käitumisega seotud, funktsionaalsete, neuropatoloogiliste, neuro ­
keemiliste, elektrofüsioloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus sugude 
kaupa, sealhulgas nii suurenemised kui ka vähenemised, võrreldes kont ­
rollrühmadega;  
— lahkamise tulemused;  
— aju mass;  
— neuroloogiliste tunnuste põhjal pandud diagnoosid ja oletatud kahjus ­
tused, sealhulgas looduslikult esinevad haigused või haigusseisundid;  
— tüüpiliste muutuste fotod;  
— madala lahutusvõimega kujutised, et oleks võimalik hinnata morfomee ­
triaks kasutatud lõigete homoloogsust;  
— andmed absorptsiooni ja metabolismi kohta, sh täiendavad andmed 
eraldi toksiko-kineetilisest uuringust, kui need on olemas;  
— tulemuste statistiline analüüs koos andmete analüüsiks kasutatud statis ­
tiliste mudelitega ja tulemused, sõltumata sellest, kas need olid olulised 
või mitte;  
— uuringust osavõtnute loetelu koos väljaõppe näitamisega.  
Tulemuste arutelu:  
— teave doosi ja selle mõju kohta, sugude ja rühmade kaupa;  
— muude toksiliste mõjude (sugude ja rühmade kaupa) seos uuritud kemi ­
kaali võimaliku neurotoksilisuse kohta tehtud järeldusega;  
— toksiko-kineetilise teabe mõju järeldustele;  
— mõju võrdlus muude tuntud neurotoksiliste ainete mõjuga ja mõju 
sarnasus;  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— andmed, mis kinnitavad katsemeetodi usaldusväärsust ja tundlikkust (st 
positiivsed ja varasemad kontrolli andmed);  
— seosed neuropatoloogilise ja funktsionaalse mõju vahel, kui on seoseid;  
— NOAEL või võrdlusdoos emaloomade ja järglaste puhul, sugude ja 
rühmade kaupa.  
Järeldused:  
— tulemustega saadud andmete üldise tõlgendamise arutelu, sealhulgas 
järeldus, kas uuritav kemikaal on arenguhäireid põhjustav neurotoksiline aine, ja täheldatav kahjuliku toimeta doos.
 
KIRJANDUS  
1) OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13–14 June 1995.
 
2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98–239. Vt: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmo ­
nized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].
 
3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Vt: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?Print ­
Version=True&deid=12479].  
4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91.
 
5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111.
 
6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., 
Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93–100.  
7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 
23–25 October 2000.  
8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Paris. July 2008. Vt: [http://search.oecd.org/officialdocuments/dis ­
playdocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].
 
9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity 
Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Vt: [http://www.oecd.org/documen ­
t/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_ 1_1_1,00.html].
 
10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292.
 
11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition , ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197.  
13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology , 1 st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
14) Käesoleva lisa peatükk B.34. Ühe põlvkonna reproduktsioonitoksilisuse 
uuring.  
15) Käesoleva lisa peatükk B.35. Kahe põlvkonna reproduktsioonitoksilisuse 
uuring.  
16) Käesoleva lisa peatükk B.43. Neurotoksilisuse uuring närilistel.  
17) Käesoleva lisa peatükk B.31. Sünnieelse arengu mürgisuse uurimus.  
18) Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 
2010, teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT 
L 276, 20.10.2010, lk 33).  
19) WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Vt: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].
 
20) WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches , (Environmental Health Criteria 223), World Health Orga ­
nization Publications, Geneva. Vt: [http://www.intox.org/databank/docu ­
ments/supplem/supp/ehc223.htm].  
21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and 
Methods , 1 st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:499–509.  
23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Toxic. Appl. Toxicol., 38:2–6.  
24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110–112.  
25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a 
primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Toxic. Appl. 
Toxicol., 13:118–136.  
26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  Peri­
natal Development: A Psychobiological Perspective . Academic Press, 
Orlando.  
28) Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC.  
29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94.  
30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. Sci., 49: 1–4.
 
31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5 A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use.
 
32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457.
 
34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383–390.
 
35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but 
not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365.
 
36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579–586.
 
37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303.
 
38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95.  
39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920.  
40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. Vt:  Handbook of 
Behavioral Teratology . Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 67–100.  
41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66.  
42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology , 
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 37–82.  
43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129.  
44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260.  
45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assess ­
ments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609.  
46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405–411.  
47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Phy ­
siol. Behav., 64:661–669.  
48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589–591.  
49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. Vt:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 
287–351  
50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 
59:107–128.  
51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181–211.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199–211.  
53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxi ­
city in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25–30.
 
54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437–445.  
55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. Vt:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. pp. 125–145.  
56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321–332.
 
57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296.
 
58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237–244.  
59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105.  
60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465–479.  
61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60.  
62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69.  
63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90.  
64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241.
 
65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399.  
66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332.  
67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342–352.  
68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.  
69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122–131.  
70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Wash ­
ington, DC, pp. 84–107.  
71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5 th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304.
 
73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130.  
74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365–372.  
75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.
 
76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., 
Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. 
Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755.
 
77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in 
rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for 
developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432.
 
78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.
 
79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York.  
80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A prac ­
tical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310.
 
81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262–268.  
82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710.  
83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61.
 
84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831.  
85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113–121.
 
86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/i ­
schemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294–298.  
87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. Vt:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , 
Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3–41.  
88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70–74.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.
 
90) Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin.  
91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133.
 
92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405.  
93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644 A.  
94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274-56322.  
95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology . Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Lade ­
foged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5:113–126.  
97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:21–27.  
98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335.  
99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165–172.  
100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221–228.  
101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90.
 
102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352.
 
103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 
34:296–313.
 
104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210.
 
105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295–301.
 
106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266–287.
 
107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology , 30(4):288–325.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326–348.
 
109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349–381.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Joonis 1  
Üldine katseskeem funktsionaalsete ja käitumuslike katsete tegemiseks, neuropatoloogia 
hindamiseks ja ajumassi määramiseks. Diagramm põhineb punktides 13–15 esitatud 
kirjeldusel (PND — päev pärast sündi). Katsete jaoks loomade määramise näited on 
esitatud 1. liites
  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
1. liide  
1. Allpool esitatud tabelis on kirjeldatud näiteid, kuidas võib määrata loomi 
katsete tegemiseks. Näidete eesmärk on selgitada, et katseloomi võib katse ­
teks määrata mitmel viisil, olenevalt katse korralduse põhimõttest.  
1. näide  
2. Võõrutuseelseteks käitumise ontogeneesi katseteks kasutatakse üks 
komplekt poegi, mille koosseis on 20 looma kummagi soo ja iga doosi ­
määra kohta (edaspidi „looma/sugu/doosimäär”) (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast). Nendest loomadest surmatakse 10 looma/sugu/doosi ­
määr (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast) humaanselt päeval 
PND 22. Aju eemaldatakse, kaalutakse ja töödeldakse histopatoloogilise 
hindamise jaoks. Lisaks kogutakse ajumassi andmed, kasutades ülejäänud 10 isas- ja 10 emaslooma fikseerimata aju.
 
3. Võõrutusjärgsete funktsionaalsete ja käitumuslike katsete (üksikasjalikud 
kliinilised vaatlused, motoorne aktiivsus, helisignaaliga harjumise ja kogni ­
tiivse funktsiooni katsed noorukieas) ning suguküpsuse saabumise vanuse 
hindamiseks kasutatakse ära veel üks komplekt poegi 20 looma/sugu/doo ­
simäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast). Nendest loomadest 10 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast) aneste ­
seeritakse ja fikseeritakse perfusiooniga katse lõpetamisel (ligikaudu päeval 
PND 70). Pärast täiendavat fikseerimist  in situ  aju eemaldatakse ja töödel ­
dakse neuropatoloogilise hindamise jaoks.
 
4. Kognitiivsete funktsioonide testimiseks noorte täiskasvanute puhul (st PND 
60–70) kasutatakse ära kolmas komplekt, mille koosseis on 20 looma/su ­
gu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast). Nendest looma ­
dest 10 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast) surmatakse uuringu lõpus, aju eemaldatakse ja kaalutakse.
 
5. Ülejäänud 20 looma/sugu/doosimäär hoitakse varuks võimalike lisakatsete 
jaoks.  
Tabel 1  
Poeg nr (  a ) Katseks määratud poegade 
arv Vaatlus või katse 
M N  
1 5 20 M + 20 N Käitumise ontogenees 
10 M + 10 N PND 22 aju mass/neuropato ­
loogia/morfomeetria 
10 M + 10 N PND 22 aju mass 
2 6 20 M + 20 N Üksikasjalikud kliinilised vaat ­
lused 
20 M + 20 N Motoorne aktiivsus 
20 M + 20 N Suguküpsuse saabumine 20 M + 20 N Motoorne ja sensoorne funkt ­
sioon 
20 M + 20 N Õppimine ja mälu (PND 25) 10 M + 10 N Noore täiskasvanu aju mass/ 
neuropatoloogia/morfomeetria 
~PND 70
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Poeg nr (  a ) 
Katseks määratud poegade 
arv Vaatlus või katse 
M N  
3 7 20 M + 20 N Õppimine ja mälu (noor täiskas ­
vanu) 
10 M + 10 N Noore täiskasvanu aju mass ~ 
PND 70 
4 8 — Reservloomad asendamiseks või 
lisakatseteks  
( a ) Käesolevas näites vähendatakse pesakond 4 isas- ja 4 emasloomani; isased 
järglased saavad numbrid 1 kuni 4, emased — 5 kuni 8.  
2. näide  
6. Võõrutuseelseteks käitumise ontogeneesi katseteks kasutatakse üks 
komplekt poegi, kelle koosseis on 20 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast). Nendest loomadest surmatakse 10 looma/ ­
sugu/doosimäär (1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast) humaanselt 
päeval PND 11. Aju eemaldatakse, kaalutakse ja töödeldakse histopatoloo ­
gilise hindamise jaoks.
 
7. Teine komplekt loomi, kelle koosseis on 20 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- 
ja1 emasloom igast pesakonnast) kasutatakse võõrutusjärgseteks vaatlusteks (üksikasjalikud kliinilised vaatlused, motoorne aktiivsus, suguküpsuse saabu ­
mise vanuse ning motoorse ja sensoorse funktsiooni hindamine). Nendest 
loomadest 10 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakon ­
nast) anesteseeritakse ja fikseeritakse perfusiooniga katse lõpetamisel (ligi ­
kaudu päeval PND 70). Pärast täiendavat fikseerimist  in situ  aju eemalda ­
takse, kaalutakse ja töödeldakse neuropatoloogilise hindamise jaoks.
 
8. Noorukite ja noorte täiskasvanute kognitiivsete funktsioonide katsetamiseks 
kasutatakse 10 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesa ­
konnast). Kognitiivsete funktsioonide katseteks päeval PND 23 ja noore täiskasvanu vanuses kasutatakse erinevaid loomi. Uuringu lõpetamisel surmatakse 10 looma/sugu/doosimäär, kellega olid tehtud täiskasvanuea 
katseid, aju eemaldatakse ja kaalutakse.
 
9. Ülejäänud 20 looma/sugu/doosimäär, keda ei valitud välja katseteks, surma ­
takse ja kõrvaldatakse võõrutamisel.  
Tabel 2  
Poeg nr (  a ) Katseks määratud poegade 
arv Vaatlus või katse 
M N  
1 5 20 M + 20 N Käitumise ontogenees 
10 M + 10 N PND 11 aju mass/neuropato ­
loogia/morfomeetria 
2 6 20 M + 20 N Üksikasjalikud kliinilised vaat ­
lused 
20 M + 20 N Motoorne aktiivsus 
20 M + 20 N Suguküpsuse saabumine 20 M + 20 N Motoorne ja sensoorne funkt ­
sioon 
10 M + 10 N Noore täiskasvanu aju mass/ 
neuropatoloogia/morfomeetria 
~PND 70
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Poeg nr (  a ) Katseks määratud poegade 
arv Vaatlus või katse 
M N  
3 7 10 M + 10 N (  b ) Õppimine ja mälu (PND 23) 
3 7 10 M + 10 N (  b ) Õppimine ja mälu (noor täiskas ­
vanu) 
Noore täiskasvanu aju mass 
4 8 – Päeval PND 21 surmatud ja 
kõrvaldatud loomad.  
( a ) Käesolevas näites vähendatakse pesakond 4 isas- ja 4 emasloomani; isased 
järglased saavad numbrid 1 kuni 4, emased — 5 kuni 8. 
( b ) Kognitiivseteks katseteks päeval PND 23 ja noore täiskasvanu eas kasutatakse 
erinevaid järglasi (nt paarisarvulised ja paarituarvulised pesakonnad kokku 20 
pesakonnast).  
3. näide  
10. Päeval PND 11 kasutatakse aju massi ja neuropatoloogia hindamiseks üks 
komplekt poegi, kelle koosseis on 20 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 
emasloom igast pesakonnast). Nendest loomadest surmatakse 10 looma/su ­
gu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast) humaanselt päeval PND 11, nende aju eemaldatakse, kaalutakse ja töödeldakse histo ­
patoloogiliseks hindamiseks. Lisaks kogutakse ajumassi andmed, kasutades 
ülejäänud 10 isas- ja 10 emaslooma iga doosimäära kohta.
 
11. Käitumise ontogeneesi (motoorne aktiivsus) vaatlusteks ja võõrutusjärgse ­
teks vaatlusteks (motoorne aktiivsus ja suguküpsuse saabumise vanuse 
hindamine) ning noorukite kognitiivsete funktsioonide katseteks kasutatakse ära veel üks komplekt poegi 20 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast).
 
12. Motoorse ja sensoorse funktsiooni katseteks (helisignaaliga harjumine) ja 
üksikasjalikeks kliinilisteks vaatlusteks kasutatakse ära veel üks komplekt poegi 20 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast). 
Nendest loomadest 10 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast 
pesakonnast) anesteseeritakse ja fikseeritakse perfusiooniga katse lõpetamisel (ligikaudu päeval PND 70). Pärast täiendavat fikseerimist  in situ  aju eemal ­
datakse, kaalutakse ja töödeldakse neuropatoloogilise hindamise jaoks.
 
13. Noore täiskasvanukognitiivsete funktsioonide katseteks kasutatakse ära veel 
üks komplekt poegi 20 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast). Nendest loomadest 10 looma/sugu/doosimäär (st 1 isas- 
ja 1 emasloom igast pesakonnast) surmatakse uuringu lõpus, aju eemalda ­
takse ja kaalutakse.
 
Tabel 3  
Poeg nr (  a ) Katseks määratud poegade 
arv Vaatlus või katse 
M N  
1 5 10 M + 10 N PND 11 aju mass/neuropato ­
loogia/morfomeetria 
10 M + 10 N PND 11 aju mass 
2 6 20 M + 20 N Käitumise ontogenees 
(motoorne aktiivsus) 
20 M + 20 N Motoorne aktiivsus 
20 M + 20 N Suguküpsuse saabumine 
20 M + 20 N Õppimine ja mälu (PND 27)  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Poeg nr (  a ) Katseks määratud poegade 
arv Vaatlus või katse 
M N  
3 7 20 M + 20 N Helisignaal (noorukid ja noored 
täiskasvanud) 
20 M + 20 N Üksikasjalikud kliinilised vaat ­
lused 
10 M + 10 N Noore täiskasvanu aju mass/ 
neuropatoloogia/morfomeetria 
~PND 70 
4 8 20 M + 20 N Õppimine ja mälu (noor täiskas ­
vanu) 
10 M + 10 N Noore täiskasvanu aju mass  
( a ) Käesolevas näites vähendatakse pesakond 4 isas- ja 4 emasloomani; isased 
järglased saavad numbrid 1 kuni 4, emased — 5 kuni 8.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
2. liide  
Mõisted  
Kemikaal – aine või segu  
Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  UTEROTROOFNE BIOKATSE NÄRILISTEL: KIIRE SÕELKATSE 
ÖSTROGEENSETE OMADUSTE VÄLJASELGITAMISEKS  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 440 (2007). 
OECD algatas 1998. aastal prioriteetse tegevussuunana olemasolevate katse ­
juhendite läbivaatamise ja uute väljatöötamise, et sõeluuringutega selgitada välja võimalikud sisesekretsioonisüsteemi kahjustajad ja katsetada neid (1). 
Üks tegevussuund oli töötada välja näriliste uterotroofse biokatse juhend. 
Näriliste uterotroofne biokatse läbis seejärel ulatusliku valideerimispro ­
grammi; sealhulgas koostati üksikasjalik taustadokument (2, 3) ning tehti ulatuslikud laborisisesed ja laboritevahelised uuringud, et näidata biokatse 
asjakohasust ja reprodutseeritavust tugeva võrdlusöstrogeeni, nõrkade östro ­
geeniretseptori agonistide, tugeva östrogeeniretseptori antagonisti ja mõju mitteomava võrdluskemikaali puhul (4, 5, 6, 7, 8, 9). Käesoleva katsemee ­
todi B.54 aluseks on kogemused, mis saadi valideerimiskatsete program ­
miga, ja programmi käigus östrogeeniagonistidega saadud tulemused.
 
2. Uterotroofne biokatse on kiire sõelkatse, mis töötati välja 1930. aastatel (27, 
28) ja mida esmakordselt standarditi sõelkatsena kasutamiseks 1962. aastal 
(32, 35). See põhineb emaka massi suurenemisel või nn uterotroofsel reakt ­
sioonil (vt ülevaade 29). Sellega hinnatakse kemikaali võimet kutsuda esile bioloogilist mõju, mis sarnaneb looduslike östrogeenide (nt 17ß-östradiooli) agonistide või antagonistide mõjuga, kuid meetodit kasutatakse hoopis sage ­
damini agonistide kui antagonistide leidmiseks. Emakas reageerib östrogee ­
nidele kahel viisil. Esmane reaktsioon on massi suurenemine, mida põhjustab vee imamine. Sellele järgneb massi suurenemine kudede kasvu tulemusel (30). Hiire- ja rotiemaka reageerimine on kvalitatiivselt võrreldav.
 
3. Biokatset saab kasutada  in vivo  sõeluuringuks ja selle kasutamist tuleks 
vaadelda „Sisesekretsioonisüsteemi kahjustavate kemikaalide kontrollimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku” osana (2. liide). Selles kont ­
septuaalses raamistikus on uterotroofne biokatse 3. tasemel kui  in vivo  
katse, mis annab andmeid üheainsa sisesekretsioonimehhanismi, nimelt östrogeensuse kohta.
 
4. Uterotroofne biokatse on kavandatud osana  in vitro  ja in vivo  katsetest, 
millega tehakse kindlaks endokriinsüsteemi mõjutada võivaid kemikaale, et hinnata ohtusid inimese tervisele ja keskkonnale. OECD valideerimispro ­
grammis kasutati nii tugevaid kui ka nõrku östrogeeni antagoniste, et 
hinnata katse kasutamist östrogeensete kemikaalide väljaselgitamiseks (4, 
5, 6, 7, 8). Sellega tõendati meetodi tundlikkust östrogeeniagonistide suhtes ja lisaks ka head laborisisest ja laboritevahelist korratavust.
 
5. Mis puutub mõjuta (n-ö negatiivsetesse) kemikaalidesse, siis valideerimis ­
programmis kasutati vaid üht mõjuta võrdluskemikaali, mille kohta oli juba 
varem uterotroofse analüüsi ja ka  in vitro  retseptorisidumise ja retseptori 
katsetega tehtud kindlaks mõju puudumine, kuid on hinnatud veel OECD valideerimisprogrammist sõltumatuid täiendavaid andmeid, mis samuti 
toetavad uterotroofse biokatse selektiivsust östrogeeniagonistide kindlakste ­
gemisel (16).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
6. Östrogeeni agonistid ja antagonistid toimivad östrogeeniretseptorite α ja β 
ligandidena ning võivad vastavalt aktiveerida või pidurdada retseptorite 
poolt kontrollitavat transkriptsiooni. See võib põhjustada tervisekahjustusi, sealhulgas reproduktiivfunktsiooni ja arengu häireid. Seepärast on vaja kiiresti hinnata kemikaale kui võimalikke östrogeeni agoniste või antago ­
niste. Kuigi ligandi afiinsus östrogeeniretseptori suhtes või reportergeeni 
transkriptsiooni aktiveerimine  in vitro  annab küll olulist teavet, on see siiski 
vaid üks ohtu põhjustavatest võimalikest teguritest. Muud tegurid võivad hõlmata metabolismi kaudu aktiveerimist või inaktiveerimist pärast kehasse 
sisenemist, jaotumist sihtkudedes ja väljutamist kehast, mis vähemalt osali ­
selt sõltub ka manustamisteest ja uuritavast kemikaalist. Seepärast on vaja kontrollida kemikaali võimalikku toimet  in vivo  asjakohastes tingimustes, 
kui kemikaali neeldumise, jaotumise, metabolismi ja väljutamisega seotud 
omadused juba ise ei paku vajalikku teavet. Emaka koed reageerivad östro ­
geenidega stimuleerimisele kiire kasvuga, eriti laboris peetavate näriliste puhul, kus östraaltsükkel kestab umbes 4 päeva. Närilisi, eriti rotte, kasu ­
tatakse laialdaselt ka mürgisuse uuringutes ohu iseloomustamiseks. Seepä ­
rast on närilise emakas sobiv sihtorgan, millega saab teha  in vivo  sõeluu­
ringuid östrogeeni agonistide ja antagonistide väljaselgitamiseks.
 
7. Käesolev katsemeetod põhineb OECD valideerimisuuringus kasutatud 
katse-eeskirjadel, mis osutusid usaldusväärseks ja korratavaks nii laborisi ­
sestes kui ka laboritevahelistes uuringutes (5, 7). Praegu on kättesaadavad kaks meetodit, nimelt eemaldatud munasarjadega täiskasvanud emaslooma 
meetod ( OVX-adult method ) ja eemaldamata munasarjadega ebaküpse 
emase meetod ( immature method ). OECD valideerimiskatsete programmiga 
näidati, et nende meetodite tundlikkus ja reprodutseeritavus on võrreldavad. Meetod, milles kasutatakse ebaküpset emaslooma, kelle hüpotalamuse-ajuri ­
patsi-sugunäärmete (HAS) telg on kahjustamata, on siiski mõnevõrra vähem 
spetsiifiline, kuid selle meetodiga saab uurida laiemat mõjude spektrit kui eemaldatud munasarjadega emaslooma meetodiga, kuna see näitab ka kemi ­
kaalide mõju HAS-teljele, mitte üksnes östrogeeniretseptorile. Roti 
HAS-telg hakkab toimima umbes 15. elupäevast. Enne nimetatud tähtaega 
ei saa gonadoliberiiniga (GnRH) puberteeti kiirendada. Kui emasloomad hakkavad jõudma puberteediikka, siis enne tupe avanemist on neil mitu n-ö vaikset tsüklit, millega ei kaasne tupe avanemist või ovulatsiooni, 
kuid kaasnevad teatavad hormoonitaseme kõikumised. Kui kemikaal otse 
või kaudselt stimuleerib HAS-telge, on tulemuseks enneaegne puberteet, varane ovulatsioon ja tupe varasem avanemine. Seda võivad põhjustada mitte ainult HAS-teljele toimivad kemikaalid, vaid ka mõned tavalisest 
suurema metaboliseeritava energia sisaldusega dieedid, mis stimuleerivad 
kasvu ja kiirendavad tupe avanemist, kuigi ei ole östrogeensed. Sellised kemikaalid ei tekita uterotroofset reaktsiooni täiskasvanud OVX-loomal, 
kuna tema HAS-telg ei tööta.
 
8. Loomade heaolu huvides tuleks eelistada ebaküpsete rottide meetodit, 
millega välditakse loomade kirurgilist eeltöötlemist ja ka selliste loomade 
võimalikku kasutamata jätmist, kellel esineb östruse alguse märke 
(vt punkt 30).  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Uterotroofne reaktsioon ei ole täielikult tingitud östrogeenidest, st seda 
võivad esile kutsuda ka kemikaalid, mis ei ole östrogeenide agonistid või 
antagonistid. Näiteks suhteliselt suured progesterooni, testosterooni või mitmesuguste sünteetiliste kollaskehahormoonide doosid võivad kõik põhjustada seda reaktsiooni (30). Igasugust reaktsiooni tuleb uurida histo ­
loogiliselt tupe keratinisatsiooni ja sarvestumise suhtes (30). Olenemata 
reaktsiooni võimalikust põhjusest tuleks uterotroofse biokatse positiivse tulemuse puhul algatada täiendav uuring selguse saamiseks. Täiendavaid tõendeid östrogeensuse kohta võib saada  in vitro  katsetega, nagu östrogee ­
niretseptori sidumise katse ja transkriptsiooni aktivatsiooni katse või muud  
in vivo  uuringud, näiteks emasloomade puberteedi katse.
 
10. Kui võtta arvesse, et uterotroofne biokatse on ette nähtud  in vivo  sõeluu­
ringuks, on kontrollimisviisi valikul lähtutud nii loomade heaoluga seotud kaalutlustest kui ka korrastatud astmelise katsetamise strateegiast. Sel eesmärgil püüti hoolikalt kontrollida, kuivõrd korratavalt ja tundlikult 
lubab meetod kindlaks teha östrogeensust, mis on paljude kemikaalide 
puhul peamine mure; vähem pöörati tähelepanu katsega antiöstrogeensuse tõendamise küljele. Katsetati ainult ühte tugevat antiöstrogeeni, kuna selgelt teadaolevate antiöstrogeensete kemikaalide (millel ei ole mingit varjavat 
östrogeenset mõju) on väga piiratud. Käesolevas katsemeetodis käsitletakse 
seega östrogeensete omaduste tuvastamist; antagonistliku toime tuvastamist on käsitletud ühes juhenddokumendis (37). Biokatse korratavus ja tund ­
likkus puhtalt antiöstrogeense toimega kemikaalide puhul määratletakse 
täpsemalt hiljem, kui katset on tavameetodina mõnda aega kasutatud ja 
leitud rohkem sellise toimeviisiga kemikaale.
 
11. Meetodi kasutamisel arvestatakse, et kõik katsed loomadega peavad 
vastama loomakaitse kohalikele normidele; järgmised loomade hoolduse ja dooside manustamise kirjeldused vastavad miinimumstandarditele, ning kohalikud õigusaktid, nagu Euroopa Parlamendi ja nõukogu 22. septembri 
2010. aasta direktiiv 2010/63/EL teaduslikel eesmärkidel kasutatavate 
loomade kaitse kohta (38), on nende suhtes ülimuslikud. OECD on esitanud loomade humaanse kohtlemise täiendavad juhendid (25).
 
12. Nagu elusloomadega tehtavate katsete puhul tavaliselt, on enne katse algust 
oluline tagada, et andmed on tõepoolest vajalikud. Andmed võivad olla 
tõeliselt vajalikud näiteks järgmiste kahe olukorra puhul:  
— suur oht kokkupuuteks (kontseptuaalne raamistik, 1. tase, vt 2. liide) või 
kaudsed andmed kemikaali östrogeensuse kohta (2. tase), mille tõttu on 
vaja uurida, kas selline mõju võib esineda  in vivo ; 
— toimed, mis näitavad östrogeensust 4. või 5. tasemel  in vivo  katsetes ja 
millest selgub, et mõjud on seotud östrogeense mehhanismiga, mida ei saa uurida  in vitro  katses.
 
13. Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
KATSE PÕHIMÕTE  
14. Uterotroofse biokatse tundlikkuse aluseks on loomkatsesüsteem, milles 
hüpotalamuse-ajuripatsi-munasarjade telg ei funktsioneeri, mistõttu vere ­
ringes on vähe endogeenset östrogeeni. See tagab emaka väikse massi mõjutaja puudumisel (nn nulljoon) ja maksimaalse reageerimise manustatud östrogeenidele. Näriliste emasloomadel esineb sellist östrogeenitundlikku 
seisundit kahes olukorras:
 
i) ebaküpsed emasloomad pärast võõrutamist ja enne puberteeti, ning  
ii) noored täiskasvanud emasloomad pärast munasarjade eemaldamist, kui 
on antud piisavalt aega emaka taandarenguks.  
15. Uuritavat kemikaali manustatakse iga päev suukaudselt sondiga või naha 
alla tehtava süstiga. Uuritava kemikaali eri doose manustatakse vähemalt 
kahele katseloomade doosirühmale (vt punkt 33), kasutades kummaski rühmas oma doositaset ja manustamist kolmel järjestikusel päeval ebaküp ­
sete emasloomade meetodi puhul ja vähemalt kolmel järjestikusel päeval 
täiskasvanud OVX-emasloomade meetodi puhul. Loomad lahatakse 24 
tundi pärast viimase doosi manustamist. Östrogeeni agonistide leidmiseks hinnatakse kemikaali saanud loomade keskmist emaka massi ja võrreldakse kandeainet saanud loomade rühma vastava näitajaga, et leida statistiliselt 
olulist suurenemist. Emaka keskmise massi statistiliselt oluline suurenemine 
osutab, et kõnealuse biokatse vastus on positiivne.
 
MEETODI KIRJELDUS  
Loomaliigi valimine  
16. Katseloomadena võib kasutada tavaliselt laboris peetavate näriliseliinide 
loomi. Valideerimiseks kasutati näiteks Wistari ja Sprague-Dawley liini 
rotte. Ei tohiks kasutada selliste liinide emasloomi, kelle emakas on või 
arvatakse olevat vähem tundlik. Labor peaks tõendama liini tundlikkust, nagu on kirjeldatud punktides 26 ja 27.
 
17. Uterotroofseks biokatseks on juba alates 1930. aastatest tavaliselt kasutatud 
rotte ja hiiri. OECD valideerimisuuringud tehti ainult rottidega, lähtudes arusaamast, et neid liike võib pidada samaväärseks ja seepärast piisab 
ülemaailmseks valideerimiseks katsetest ühe liigi loomadega, kuna sellega 
säästetakse vahendeid ja loomi. Rott valitakse katseloomaks enamiku reproduktiiv- ja arenguhäireid põhjustava toksilisuse uuringutes. Arvestades seda, et hiirte kohta on olemas ulatuslik varasema kasutuse andmebaas, ja 
selleks, et laiendada näriliste uterotroofse biokatse kasutamist ka hiirtele kui 
katseliigile, tehti piiratud valideerimisuuring hiljem ka hiirtel (16). Kuna peamine soov oli hoida kokku vahendeid ja loomi, valiti võrdlusmeetod, milles kasutati piiratud arvu uuritavaid kemikaale ja osalevaid laboreid ning 
ei kasutatud koodiga tähistatud näidiste katsetamist. Kõnealune uterotroofse 
biokatse võrdlev valideerimisuuring näitab, et noorte täiskasvanud OVX-hiirte puhul on rottide ja hiirtega saadud andmed omavahel kvalita ­
tiivselt ja kvantitatiivselt heas kooskõlas. Kui uterotroofse biokatse tulemus 
on pikema uuringu eelkatse, võimaldab selline kooskõla kasutada mõlemas 
uuringus sama liini samast allikast pärinevaid loomi. Võrdleva lähenemis ­
viisi juures piirduti OVX-hiirte kasutamisega ja katsed ei andnud töökind ­
laid andmeid, mis oleksid võimaldanud valideerida meetodi ka ebaküpsete 
emasloomade mudeli jaoks, seepärast ebaküpsete hiirte mudelit käesoleva 
katsemeetodi raames ei vaadelda.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. Seega võib mõnel juhul rottide asemel kasutada hiiri. Hiirte kasutamist 
tuleks põhjendada, lähtudes toksikoloogilistest, farmakokineetilistest ja/või 
muudest kriteeriumidest. Hiirte korral võib olla vaja muuta katse-eeskirja. Näiteks kasutavad hiired oma kehamassi kohta rohkem sööta ja seepärast peab sööda fütoöstrogeenisisaldus olema hiirte puhul madalam kui rottide 
puhul (9, 20, 22).
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
19. Kogu katse teostus peaks vastama laboriloomade hooldamise kohalikele 
normidele. Siin esitatud loomade hoolduse ja dooside manustamise kirjel ­
dused vastavad miinimumstandarditele, ning kohalikud õigusaktid, nagu Euroopa Parlamendi ja nõukogu 22. septembri 2010. aasta direktiiv 
2010/63/EL teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta 
(38), on nende suhtes ülimuslikud. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (ligikaudne vahemik ± 3 °C). Suhteline õhuniiskus peaks olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud 
ruumi koristamise ajal. Eesmärgiks peaks olema suhtelise õhuniiskuse hoid ­
mine 50–60 % vahemikus. Valgustus peaks olema kunstlik. Ööpäevas peaks olema 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust.
 
20. Laborisööda ja joogivee tarbimine peaks olema  ad libitum . Noori täiskas ­
vanud loomi võib hoida puurides eraldi või kuni kolmest loomast koosneva 
rühmana. Ebaküpsete loomade nooruse tõttu soovitatakse neid pidada 
puurides sotsiaalsete rühmadena.  
21. On teada, et fütoöstrogeenide suur sisaldus laborisöödas suurendab näriliste 
emaka massi sedavõrd, et see segab uterotroofse biokatse tegemist (13, 14, 15). Fütoöstrogeenide ja metaboliseeritava energia kõrge tase kasutatavas 
söödas võib ebaküpsete loomade korral põhjustada ka varast puberteeti. 
Laborisöödas on fütoöstrogeene peamiselt siis, kui söödaks kasutatakse soja- ja lutsernitooteid, ning on näidatud, et fütoöstrogeenide tase võib sõltuda standardse laborisööda partiist (23). Kehamass on oluline muutuja, 
kuna tarbitav sööda kogus on seotud kehamassiga. Seetõttu võib tegelik 
saadav fütoöstrogeenide doos sama sööda juures sõltuda loomaliigist ja vanusest (9). Ebaküpsete emasrottide puhul võib sööda tarbimine kehamassi kohta olla ligikaudu kaks korda suurem kui eemaldatud munasarjadega 
noorte täiskasvanud emasloomade puhul. Noorte täiskasvanud hiirte puhul 
võib sööda tarbimine kehamassi kohta olla ligikaudu neli korda suurem kui eemaldatud munasarjadega noorte täiskasvanud emasrottide puhul.
 
22. Uterotroofse biokatse tulemused (9, 17, 18, 19) näitavad siiski, et piiratud 
koguse fütoöstrogeenide olemasolu söödas on lubatav ja ei vähenda 
biokatse tundlikkust. Juhinduda tuleks sellest, et söödaga saadav fütoöstro ­
geenide kogus ei ületaks 350 μg genisteiiniekvivalenti laborisööda grammi 
kohta ebaküpsete Sprague-Dawley ja Wistari rottide puhul (6, 9). Selline sööt peaks samuti sobima katse tegemisel noorte täiskasvanud 
OVX-rottidega, kuna nende söödatarbimine kehamassi kohta on väiksem 
kui ebaküpsetel loomadel. Kui kasutatakse täiskasvanud OVX-hiiri või fütoöstrogeenide suhtes tundlikumaid rotte, tuleb sööda fütoöstrogeenisisal ­
dust vastavalt vähendada (20). Lisaks võivad eri söötade kättesaadava meta ­
boliseeritava energia erinevused põhjustada puberteedi algust eri vanuses 
(21, 22).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Enne uuringut tuleb hoolikalt valida sööt, mille fütoöstrogeenide tase ei 
oleks liiga kõrge (vt juhendid 6, 9) või milles ei oleks liiga palju metabo ­
liseeritavat energiat, mis võib moonutada tulemusi (15, 17, 19, 22, 36). Laboris kasutatava katsesüsteemi õige toimimise tagamine, nagu on täpsus ­
tatud punktides 26 ja 27, on oluline mõlema teguri kontrolli alla võtmiseks. 
Hea laboritava kohane kaitsemeede on võtta uuringu ajal manustatava sööda 
igast partiist representatiivsed proovid, et oleks võimalik teha fütoöstroge ­
nisisalduse analüüse (nt kui kontrollrühma keskmine emaka mass on suurem kui varasemate kontrollrühmade puhul või kui katsest standardöstrogeeni 
17α-etinüülöstradiooliga saadakse ebasobiv tulemus). Uuringu käigus tuleks 
teha alikvootide analüüs või need külmutada –20 °C juures või säilitada nii, et proovid ei laguneks enne analüüsimist.
 
24. Mõned allapanumaterjalid võivad sisaldada looduslikult esinevaid östro ­
geenseid või antiöstrogeenseid kemikaale (nt on teada, et maisitõlvik 
mõjutab emasrottide tsüklit ja näib olevat antiöstrogeenne). Valitud allapa ­
numaterjal peaks sisaldama võimalikult vähe fütoöstrogeene.  
Loomade ettevalmistamine  
25. Katseks valitakse loomad, kel ei esine mingeid haigusnähte ega füüsilisi 
kõrvalekaldeid, ja need jagatakse juhuvaliku alusel kontroll- ja doosirühma ­
desse. Puurid paigutatakse nii, et puuri paigutusest tingitud mõjud oleksid 
võimalikult väikesed. Loomadele tuleks anda kordumatu märgis. Ebaküpsed 
loomad peaksid eelistatavalt olema kuni võõrutamiseni puurides koos oma ema või kasuemaga. Kohanemisaeg enne uuringu algust peaks olema umbes 5 päeva noorte täiskasvanud loomade puhul ja ebaküpsete loomade puhul, 
kes on tarnitud koos oma ema või kasuemaga. Kui ebaküpsed loomad 
ostetakse ilma emata kohe pärast võõrutamist, võib olla vajalik kasutada lühemat kohanemisaega, kuna dooside manustamine peaks algama kohe pärast võõrutamist (vt punkt 29).
 
KATSE KORRALDUS  
Labori pädevuse kontrollimine  
26. Labori pädevuse kontrollimiseks saab kasutada kahte meetodit:  
— perioodiline kontrollimine, mille aluseks on algse nulljoone positiivse 
kontrolli katse (vt punkt 27). Vähemalt iga 6 kuu järel ja iga kord, kui toimub muutus, mis võib mõjutada katse usaldusväärsust (nt uus labo ­
risööda koostis, uus lahkamist teostav isik, loomaliini või loomade 
tarnija vahetamine jne) tuleks kontrollida katsesüsteemi (loommudeli) 
tundlikkust, kasutades nulljoone positiivse kontrolli katset, mida on kirjeldatud punktis 27 ja võrdlusöstrogeeni 17 α-etinüülöstradiooli 
(CASi nr 57-63-6) (EE) sobivat doosi;
 
— samaaegsete kontrollkatsete tegemine, milleks nähakse igas katses ette 
rühm, kellele manustatakse sobiv doos võrdlusöstrogeeni.  
Kui süsteemi reaktsioon ei vasta ootustele, tuleb uurida katsetingimusi ja 
neid vastavalt muuta. On soovitatav, et kummagi lähenemisviisi puhul kasu ­
tatav võrdlusöstrogeeni doos oleks ligikaudu 70–80 efektiivdoosi.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Nulljoone positiivse kontrolli katse . Enne kui labor teeb käesoleva katse ­
juhendi järgi esimese katse, tuleks tal tõendada oma pädevust. Selleks uuri ­
takse loommudeli reageerimist võrdlusöstrogeeni 17 α-etinüülöstradiooli 
(CASi nr 57-63-6) (EE) vähemalt neljale doosile. Emaka massi suurenemist võrreldakse varasemate kontrollitud andmetega (vt viide 5). Kui kõnealune 
nulljoone positiivse kontrolli katse ei anna oodatud tulemusi, tuleb katse ­
tingimused üle vaadata ja neid muuta.
 
Loomade arv ja seisund  
28. Igas doosi- ja kontrollrühmas peaks olema vähemalt 6 looma (nii ebaküpse 
emaslooma kui ka täiskasvanud OVX-emaslooma eeskirja puhul).  
Ebaküpsete loomade vanus  
29. Ebaküpsete loomade uterotroofse biokatse tegemisel peab olema täpsustatud 
loomade sünni kuupäev. Dooside manustamisega tuleks alustada piisavalt vara, et uuritava kemikaali manustamise lõpuks ei oleks puberteediga seotud 
endogeensete östrogeenide taseme tõus veel alanud. Teisest küljest on tõen ­
deid, et väga noored loomad võivad olla vähem tundlikud. Optimaalse vanuse kindlaksmääramiseks peaks iga labor võtma arvesse oma varasemaid tulemusi suguküpsuse saavutamise kohta.
 
Üldise suunisena võib rottidele dooside manustamist alustada kohe pärast 
varast võõrutamist, st 18. päeval pärast sündi (sündimise päev loetakse sünnijärgseks päevaks 0). Dooside manustamine rottidele tuleks eelistatult lõpetada 21. sünnijärgsel päeval ja igal juhul enne 25. sünnijärgset päeva, 
kuna pärast seda päeva hakkab hüpotalamuse-ajuripatsi-munasarjade telg 
toimima ja endogeensete östrogeenide tase võib hakata tõusma, millele vastavalt hakkab suurenema keskmine nulljoone emaka mass ja rühma standardhälve (2, 3, 10, 11, 12).
 
Munasarjade eemaldamise kord  
30. Eemaldatud munasarjadega rottide ja hiirte saamiseks (doosi- ja kontroll ­
rühmad) tuleb emasloomal eemaldada munasarjad vanuses 6–8 nädalat. Roti puhul peab munasarjade eemaldamise ja esimese doosi manustamise vahel 
olema vähemalt 14 päeva, et emakas saaks taandareneda miinimumini ehk 
stabiilse nulljooneni. Hiire puhul peab munasarjade eemaldamise ja esimese doosi manustamise vahel olema vähemalt 7 päeva. Kuna östrogeenide taseme tõstmiseks veres piisab juba väiksest kogusest munasarjakoest (3), 
tuleks loomi enne kasutamist kontrollida tupe-tampooniprooviga saadud 
epiteliaalrakkude vaatlemisega vähemalt viiel järjestikusel päeval (nt päevad 10–14 pärast roti emaslooma munasarjade eemaldamist). Kui loomal esineb algava östruse tunnuseid, ei tohiks teda katseks kasutada. Lisaks 
tuleb lahangul uurida munasarjade kunagisi kinnituskohti munasarjakoe 
leidmiseks. Kui sellist kude leitakse, et tohiks looma andmeid arvutustes kasutada (3).
 
31. Munasarjade eemaldamiseks loom tuimestatakse korralikult ja pannakse 
lamama kõhuli. Sisselõige, millega avatakse kõhuõõne dorsolateraalne 
sein, peaks olema pikkusega umbes 1 cm ja asuma alumise roidekaare ja niudeluuharja vahelise ala keskel ning mõni millimeeter külgmiselt niude ­
lihase välimisest servast. Munasari tuleks eemaldada kõhuõõnest aseptilisele 
alale. Munasari tuleks eraldada munajuha ja emakakeha kokkupuutekohalt. 
Kui on tehtud kindlaks, et massiivset verejooksu ei ole, tuleks kõhuõõne sein sulgeda õmblusega ja nahahaav sulgeda klambrite või sobiva õmblu ­
sega. Niidiga sidumise kohad on skemaatiliselt näidatud joonisel 1. Tuleb 
kasutada asjakohast operatsioonijärgset tuimestust, vastavalt näriliste ravis 
kogenud veterinaararsti soovitustele.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Kehamass  
32. Täiskasvanud OVX-emaslooma meetodi kasutamisel ei ole kehamass ja 
emaka mass omavahel seotud, kuna emaka massi mõjutavad hormoonid, 
nagu östrogeenid, kuid mitte kasvutegurid, mis reguleerivad keha suurust. Seevastu ebaküpse emaslooma kasutamisel on kehamass seotud emaka massiga küpsemise ajal (34). Uuringu alguses peaks loomade kehamassi 
erinevus olema minimaalne ega tohiks ebaküpse emaslooma meetodi kasu ­
tamisel ületada ±20 % keskmisest kehamassist. See tähendab, et loomade kasvataja peaks standardima pesakonna suuruse, et eri emasloomade järglased saaksid umbes ühepalju toitu. Loomad tuleks jaotada (kontroll- 
ja doosi)rühmadesse kehamassi varieeruvuse järgi juhuvaliku alusel, nii et 
iga rühma keskmine kehamass ei oleks statistiliselt erinev muu rühma vastavast näitajast. Tuleks jälgida, et sama pesakonna liikmeid ei määrataks samasse doosirühma, kuivõrd see on võimalik ilma uuringus kasutatavate 
pesakondade arvu suurendamiseta.
 
Doseerimine  
33. Selleks et teha kindlaks, kas uuritaval kemikaalil võib  in vivo  olla östro ­
geenset toimet, piisab tavaliselt kahest doosirühmast ja ühest kontrollrüh ­
mast; seepärast eelistatakse sellist katse kava loomade heaoluga seotud põhjustel. Kui eesmärk on saada doosi ja toime vahelise sõltuvuse kõver 
või ekstrapoleerida toimet madalamatele doosidele, on vaja vähemalt 3 
doosirühma. Kui on vaja ka muud teavet peale östrogeense toime kindlaks ­
tegemise (näiteks hinnata mõju tugevust), tuleks kaaluda teistsugust dooside manustamise režiimi. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda samamoodi kui 
katserühma loomi, välja arvatud uuritava kemikaali manustamine. Kui uuri ­
tava aine manustamisel kasutatakse kandeainet, peaks kontrollrühm saama doosirühmadega võrdses koguses kandeainet (või kui doosirühmades kasu ­
tatakse erinevaid koguseid, siis neist suurima koguse).
 
34. Uterotroofse biokatse puhul on eesmärk valida doosid, mis tagaksid 
loomade ellujäämise ning mis ei oleks oluliselt mürgised ega põhjustaks 
loomadele erilist stressi pärast uuritava kemikaali manustamist kolmel 
järjestikusel päeval maksimumdoosiga kuni 1 000 mg/kg/päevas. Kõikide doosimäärade valimisel tuleks arvesse võtta kõiki uuritava kemikaali või sellega seotud materjalide toksilisust käsitlevaid ja (toksiko-)kineetilisi 
andmeid. Kõrgeima doosimäära puhul tuleks kõigepealt arvestada LD50 
väärtust ja/või andmeid ägeda mürgisuse kohta, et vältida loomade surma, suuri kannatusi ja stressi (24, 25, 26). Suurim doos peaks vastama suurimale talutavale doosile; uuringu võib teha ka doosi suuruse juures, mis põhjustab 
positiivse uterotroofse reaktsiooni. Kuna see on sõelkatse, siis võib üldiselt 
kasutada suuri dooside intervalle (näiteks 0,5 logaritmilist ühikut, mis vastab dooside 3,2-kordsele erinevusele, või isegi kuni 1 logaritmiline ühik). Kui vajalikke andmeid ei ole, võib kasutatavate dooside leidmise 
hõlbustamiseks teha doosipiirkonna määramise katse.
 
35. Teiselt poolt, kui agonisti östrogeenseid omadusi on võimalik hinnata  in 
vitro  (või  in silico ) andmetest, võib neid doosi valimisel arvesse võtta. 
Näiteks määratakse uuritava kemikaali kogus, mis uterotroofses biokatses põhjustab võrdlusagonisti (etinüülöstradiool) mõjuga ekvivalentse reakt ­
siooni, tema suhtelise tõhususe järgi  in vitro , võrreldes etinüülöstradiooliga. 
Kõrgeim katses kasutatav doos leitakse selle ekvivalentse doosi korruta ­
misel sobiva teguriga, näiteks 10 või 100ga.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Vahemiku leidmise kaalutlused  
36. Vajaduse korral võib väikse arvu loomadega teha esialgse uuringu doosi ­
vahemiku leidmiseks. Selleks võib kasutada OECD juhenddokumenti nr 19 
(25), milles on määratletud mürgisusele või looma stressile osutavad kliini ­
lised tunnused. Kui see on doosivahemiku leidmise uuringus teostatav, võib emakad pärast kolmepäevast kemikaali manustamist välja lõigata ja kaaluda 
ligikaudu 24 tundi pärast viimase doosi manustamist. Neid andmeid võiks 
seejärel kasutada põhiuuringu kava koostamiseks (et valida sobivad suurim ja väiksem doos ja vajalik doosirühmade arv).
 
Dooside manustamine  
37. Uuritavat kemikaali manustatakse suukaudselt sondiga või naha alla tehtava 
süstiga. Manustamistee valimisel tuleb arvestada loomade heaolu kaalutlusi, 
toksikoloogia aspekte (kuivõrd asjakohane on teatav manustamistee, arves ­
tades inimese kemikaaliga kokkupuute viise (nt suukaudne sond vastab allaneelamisele, nahaalused süstid sissehingamisele või naha kaudu imen ­
dumisele), uuritava materjali füüsikalisi ja keemilisi omadusi ning eriti 
olemasolevaid toksikoloogilisi andmeid ning andmeid metabolismi ja kinee ­
tika kohta (nt vajadus vältida presüsteemset metabolismi, suurem tõhusus teatava manustamistee korral).
 
38. Soovitatav on võimaluse korral kõigepealt kaaluda manustamist vesilahu ­
sena või suspensioonina vees. Kuid kuna enamik östrogeenseid ligande või 
nende metaboolseid eellasi on hüdrofoobsed, kasutatakse kõige sagedamini lahust või suspensiooni õlis (nt maisi, maapähkli-, seesami- või oliiviõli). Need õlid on eri kalorsuse ja rasvasisaldusega, seega võib kandeaine mõju ­
tada üldist metaboliseeritava energia omastamist, mille tõttu võivad 
muutuda mõõdetavad näitajad, nagu emaka mass, eeskätt ebaküpse emas ­
looma meetodi puhul (33). Seepärast tuleb enne uuringut katsetada 
kandeainet ja võrrelda kontrollrühmaga, kellele ei anta kandeainet. Uuritava 
kemikaali võib lahustada minimaalses koguses 95 % etanoolis või muus sobivas lahustis ja lahjendada lõpliku töökontsentratsioonini katses kasuta ­
tavas kandeaines. Lahusti toksilised omadused peavad olema teada ning 
need tuleks välja selgitada eraldi kontrollrühmaga, kellele manustatakse 
üksnes lahustit. Kui uuritavat kemikaali peetakse stabiilseks, võib selle lahustamise hõlbustamiseks kasutada ettevaatlikku soojendamist ja tugevat segamist. Tuleks määrata uuritava kemikaali stabiilsus kandeaines. Kui 
uuritav kemikaal on stabiilne kogu uuringu jooksul, võib valmistada uuri ­
tava kemikaali lähtealikvoodi ja teha sellest iga päev vajalikud lahjendused.
 
39. Doosi manustamise ajastus sõltub kasutatavast mudelist (vt punkt 29, 
ebaküpse emaslooma mudel, ja punkt 30, täiskasvanud OVX-emaslooma mudel). Ebaküpsetele emasrottidele manustatakse uuritavat kemikaali iga 
päev kolmel järjestikusel päeval. Kolmepäevast dooside manustamist soovi ­
tatakse ka täiskasvanud OVX-emasrottide puhul, kuid sel juhul on lubatav ka pikem kokkupuude ja nii saab paremini avastada nõrga toimega kemi ­
kaale. Täiskasvanud OVX-emashiirte puhul peaks 3-päevane manustamine 
olema piisav ja manustamise pikendamisel seitsme päevani ei ole tugevate 
östrogeeniagonistide puhul erilisi eeliseid, kuid valideerimisuuringus näidati, et nõrkade agonistidega see nii ei ole (16), seepärast tuleks OVX-emashiirte puhul pikendada dooside manustamist kuni 7 järjestikuse päevani.Doos 
tuleks manustada iga päev samal kellaajal. Doose tuleks vajaduse korral 
kohandada, et säilitada konstantset doosimäära looma kehamassi suhtes (nt mg uuritavat kemikaali ühe kg kehamassi kohta päevas). Katses kasu ­
tatava lahuse mahu muutumine tuleks hoida minimaalne; tuleks muuta uuri ­
tava aine lahuse kontsentratsiooni, et tagada ühesugune lahuse maht keha ­
massi suhtes kõikide dooside ja manustamisviiside puhul.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Kui uuritavat kemikaali manustatakse loomadele sundsöötmisega, tuleks 
seda teha ühe doosi kaupa, kasutades maosondi või sobivat intubatsiooni ­
kanüüli. Suurim vedeliku maht, mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Tuleb järgida kohalikke loomakaitse eeskirju, kuid lahuse maht ei tohiks ületada 5 ml kehamassi kg kohta, välja arvatud vesi ­
lahuse puhul, mida võib manustada kuni 10 ml kehamassi kg kohta.
 
41. Kui uuritavat kemikaali manustatakse nahaaluse süstiga, tuleks päevane 
doos manustada üheainsa süstiga. Doose tuleks manustada selja abaluu- 
või nimmepiirkonda steriilse nõela (kaliiber näiteks 23 või 25) ja tuberku ­
liinisüstlaga. Soovi korral võib süstimiskoha puhtaks raseerida. Registree ­
rida tuleks lahuse kaod, süstekohast väljaimbumine või doosi mittetäielik 
manustamine. Rotile päevas süstitav lahuse maht ei tohiks ületada 5 ml 
kehamassi kg kohta, mis jagatakse kahe süstekoha vahel; vesilahuste puhul võib erandina süstida 10 ml kehamassi kg kohta.
 
Vaatlused  
Üld- ja kliinilised vaatlused  
42. Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas ja sagedamini, kui 
ilmneb toksilisuse märke. Vaatlusi oleks soovitatav teha iga päev samal ajal, võttes arvesse oodatava maksimaalse mõju avaldumise aega pärast doosi manustamist. Kõigi loomade puhul jälgitakse suremust, haigestumust ja 
selliseid kliinilisi tunnuseid nagu käitumise, naha, karvkatte, silmade ja 
limaskestade muutused, eritiste esinemine, autonoomse närvisüsteemi aktiiv ­
suse muutused (nt pisaravool, turris karv, pupilli suurus, muutunud hinga ­
mine).
 
Kehamass ja sööda tarbimine  
43. Kõiki loomi tuleks kaaluda iga päev täpsusega 0,1 g, alustades hetkest enne 
esimese doosi manustamist, st kui loomad on juba jagatud rühmadesse. Lisaks võib mõõta dooside manustamise aja jooksul igas puuris tarbitud 
sööda koguse söötmisseadmete kaalumisega. Sööda tarbimise tulemused 
väljendatakse grammides ühe roti kohta päevas.
 
Lahkamine ja emaka massi mõõtmine  
44. Kakskümmend neli tundi pärast viimase doosi manustamist rotid surmatakse 
humaanselt. Ideaaljuhul tuleks kõikide rühmade liikmete lahkamised teha 
juhuslikus järjekorras, et vältida kõige alguses või kõige lõpus ühe või teise 
rühma liikmete lahkamist, mis võiks andmeid natuke mõjutada. Biokatse eesmärk on mõõta nii märja emaka kui ka kuivatatud emaka mass. Märg ­
mass hõlmab emaka ja selle valendikus oleva vedeliku massi. Kuivatatud 
emaka mass mõõdetakse pärast selle valendikus oleva vedeliku väljapigis ­
tamist ja kõrvaldamist.
 
45. Ebaküpsete emasloomade puhul uuritakse enne lahkamist tuppe, et teha 
kindlaks tupe võimalik avanemine. Lahkamist alustatakse kõhuseina avami ­
sega alates häbemeliidusest. Seejärel eemaldatakse emakasarved ja muna ­
sarjad, kui viimased on olemas, kõhuõõne dorsaalse seina küljest. Emaka ja 
tupe ventraalselt ja lateraalselt küljelt eemaldatakse kusepõis ja kusejuhad. 
Kiulised ühendused päraku ja tupe vahel eraldatakse, kuni võib näha tupe ­
suudme ja lahkliha naha ühenduskohta. Emakas ja tupp eraldatakse kehast tupeseina läbilõikamisega otse lahklihanahaga ühenduse kohalt, nagu on 
näidatud joonisel 2. Emakas tuleks kõhuseinast eraldada emaka kinnisti 
(mesenteeriumi) ettevaatliku läbilõikamisega selle kinnituskohalt kummagi
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
emakasarve dorsolateraalse külje kogu pikkuses. Pärast kehast eemaldamist 
tuleks emakat käsitseda piisavalt kiiresti, et vältida kudede kuivamist. 
Massikadu kuivamise tõttu muutub olulisemaks just väikeste kudede nagu emaka puhul (23). Kui munasarjad on alles, eemaldatakse need munajuha juurest, vältides valendikus oleva vee väljavoolamist emakasarvest. Kui 
loomal on munasarjad eemaldatud, tuleks munasarjade kunagisi kinnitus ­
kohti uurida munasarjakoe leidmiseks. Liigne rasv ja sidekude tuleks ära lõigata. Tupp eraldatakse emakast veidi allpool emakakaela, nii et emaka ­
kael jääb emakakeha juurde, nagu on näidatud joonisel 2.
 
46. Iga emakas tuleks paigutada kordumatu märgisega teadaoleva massiga 
anumasse (nt Petri tass või plastikust kaalumisnõu), jälgides kogu aeg, et koed ei enne kaalumist ära ei kuivaks (nõusse võib panna näiteks soolala ­
husega kergelt niisutatud filterpaberi). Emakas koos valendikus oleva vede ­
likuga kaalutakse täpsusega 0,1 mg (märja emaka mass).
 
47. Seejärel töödeldakse eraldi iga emakat, et eemaldada valendikus olev 
vedelik. Mõlemad emakasarved torgatakse läbi või lõigatakse pikuti lõhki. 
Emakas pannakse kergelt niisutatud filterpaberile (nt Whatman nr 3) ja pressitakse kergelt teise kergelt niisutatud filterpaberiga valendikus oleva vedeliku täielikuks eemaldamiseks. Emakas ilma valendikus oleva vedeli ­
kuta kaalutakse täpsusega 0,1 mg (kuivatatud emaka mass).
 
48. Katse lõpetamisel määratud emaka massi võib kasutada selle tõendamiseks, 
et ebaküpse opereerimata roti katses kasutamise sobivat vanust ei ületatud, 
kuid laboris kasutatava rotiliini varasemad andmed on selles suhtes otsus ­
tava tähtsusega (vt tulemuste tõlgendamine, punkt 56).  
Vabavalikulised uuringud  
49. Pärast kaalumist võib emaka fikseerida neutraalse puhvriga 10 % formalii ­
nilahuses, et seda saaks histopatoloogiliselt uurida pärast värvimist hema ­
toksüliini ja eosiiniga. Ka tuppe võib samal viisil uurida (vt punkt 9). Lisaks 
võib teha morfomeetrilise mõõtmise endomeetriumi epiteeli kvantitatiivseks võrdlemiseks.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
50. Uuringu andmed peavad hõlmama järgmist:  
— loomade arv katse alguses,  
— surnuna leitud või katse jooksul humaansetel põhjustel surmatud 
loomade arv ja koodnumbrid ning iga looma surma või humaanse surmamise kuupäev ja kellaaeg,
 
— mürgistustunnustega loomade arv ja koodnumbrid ning tunnuste 
kirjeldus, sealhulgas toksilise toime täheldatud algushetk, kestus ja raskusaste, ning
 
— kahjustustega loomade arv ja koodnumbrid ning kahjustuste tüübi 
kirjeldus.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Iga looma kohta registreeritakse kehamass, märja emaka mass ja kuivatatud 
emaka mass. Selleks, et teha kindlaks, kas uuritava kemikaali manustamine 
põhjustas statistiliselt olulise (p < 0,05) emaka massi suurenemise, tuleks agonistide puhul kasutada ühepoolset statistilist analüüsi. Kuivatatud emaka massi ja märja emaka massi suurenemist tuleks analüüsida asjakohaste 
statistiliste meetoditega, et kindlaks teha kemikaali manustamisega seotud 
suurenemine. Näiteks võib andmeid hinnata kovariatsioonianalüüsi (ANCOVA) lähenemisviisi abil, kus kaasmuutujaks on kehamass lahkamise ajal. Enne andmete analüüsi võib emaka andmed logaritmiliselt teisendada 
dispersiooni stabiilsuse suurendamiseks. Iga doosirühma paariviisiliseks 
võrdlemiseks kontrollrühmaga ja usaldusvahemiku leidmiseks sobivad Dunnetti ja Hsu test. Võimalike võõrväärtuste leidmiseks ja dispersiooni homogeensuse hindamiseks võib kasutada jääkhälvete töötlemist Studenti 
teljestikus. Neid meetodeid kasutati OECD valideerimisuuringus, milles 
kasutati statistilise analüüsi süsteemi programmi PROC GLM (SAS Insti ­
tute, Cary, NC), versioon 8 (6, 7).
 
52. Lõpp-protokollis esitatakse järgmine.  
Uurimislabor:  
— vastutavad töötajad ja nende kohustused uuringu tegemisel;  
— nulljoone positiivse kontrolli andmed ja perioodilise positiivse kontrolli 
andmed (vt punktid 26 ja 27).  
Uuritav kemikaal:  
— uuritava kemikaali iseloomustus;  
— füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;  
— lahjenduste valmistamise meetod ja sagedus;  
— kõik andmed, mis on saadud püsivuse kohta;  
— kõik manustamislahuste analüüsid.  
Kandeaine:  
— kandeaine iseloomustus (olek, tarnija ja partii);  
— kandeaine valimise põhjendus (kui kandeaine on muu kui vesi).  
Katseloomad:  
— liik, liin ja nende valimise põhjendus;  
— tarnija ja tema konkreetne käitis;  
— loomade vanus tarnimise ajal ja sünnikuupäev;  
— ebaküpsete loomade puhul: kas tarniti koos ema või kasuemaga ja 
võõrutamise kuupäev;  
— loomade kohanemise korra üksikasjad;  
— loomade arv puuris;  
— üksiklooma ja rühma märgistamise üksikasjad ja meetod.  
Katse tingimused:  
— randomiseerimise üksikasjad (st kasutatud juhuvaliku meetod);  
— doosi valimise põhjendused;  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— uuritava kemikaali doseerimisvormi üksikasjad, saavutatud kontsentrat ­
sioon, stabiilsus ja homogeensus;  
— uuritava kemikaali manustamise üksikasjad ja kokkupuuteviisi valiku 
põhjendus;  
— sööt (nimetus, tüüp, tarnija, koostis ja, kui see on teada, fütoöstrogee ­
nide sisaldus);  
— vee päritolu (nt kraanivesi või filtritud vesi) ja loomadele kättesaadavaks 
tegemine (torude kaudu suurest mahutist, pudelitest jne);  
— allapanu (nimetus, tüüp, tarnija ja koostis);  
— puurides pidamise tingimused, valgustusaeg, ruumi temperatuur ja 
õhuniiskus, ruumi koristamine;  
— lahkamise ja emaka kaalumise korra üksikasjalik kirjeldus;  
— statistiliste töötluste kirjeldus.  
Tulemused  
Iga looma kohta:  
— iga looma kehamass igal päeval (rühmadesse jagamisest kuni lahkami ­
seni) (täpsusega 0,1 g);  
— iga looma vanus (päevades, lugedes sündimise päeva 0-päevaks) selleks 
ajaks, kui algas uuritava kemikaali manustamine;  
— iga doosi manustamise kuupäev ja kellaaeg;  
— manustatud doosi suurus ja arvutatud ruumala ning kõik tähelepanekud 
kadude kohta doosi manustamisel või pärast manustamist;  
— igapäevased andmed looma olukorra kohta, kõik asjakohased sümp ­
tomid ja tähelepanekud;  
— oletatav surma põhjus (kui loom uuringu ajal oli suremas või suri);  
— humaanse surmamise kuupäev ja kellaaeg ning ajavahemik pärast 
viimast manustamist;  
— märja emaka mass (täpsusega 0,1 mg), tähelepanekud valendikus olnud 
vedeliku kadude kohta lahkamise ja kaalumiseks ettevalmistamise ajal;  
— kuivatatud emaka mass (täpsusega 0,1 mg).  
Iga loomade rühma kohta:  
— keskmine kehamass igal päeval (täpsusega 0,1 g) ja standardhälbed 
(rühmadesse määramisest kuni lahkamiseni);  
— keskmine märja emaka mass ja keskmine kuivatatud emaka mass (täpsu ­
sega 0,1 mg) ja standardhälbed;  
— kui mõõdeti, siis igapäevane sööda tarbimine (arvutatuna tarbitud sööda 
grammides looma kohta);  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— statistilise analüüsi tulemused, milles on võrreldud märja emaka ja 
kuivatatud emaka massi doosirühmades ja kandeainet saanud rühmades;  
— statistilise analüüsi tulemused, milles on võrreldud doosirühmade 
loomade üldist kehamassi ning kehamassi suurenemist märja emaka ja kuivatatud emaka massiga ja kõrvutatud neid tulemusi kandeainet saanud kontrollrühmade asjaomaste näitajatega.
 
53. Katsemeetodi oluliste suunavate faktide kokkuvõte  
Rott Hiir  
Loomad  
Liin Tavaliselt kasutatav laborinäriliste liin Loomade arv Vähemalt 6 looma ühes doosirühmas 
Rühmade arv Vähemalt 2 doosirühma (vt punkt 33 juhiste saamiseks) ja nega ­
tiivne kontrollrühm 
Vt punktid 26 ja 27, juhised positiivse kontrollkatse rühmade 
kohta  
Pidamis- ja söötmistingimused  
Loomade ruumi T° 22 °C ± 3 °C 
Suhteline õhuniiskus 50–60 %, mitte alla 30 % ega üle 70 % 
Ööpäeva valgustusrežiim 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust Sööt ja joogivesi Ad libitum Majutus puurides Üksi või kuni kolmest loomast koosnevate rühmadena (ebaküp ­
seid loomi soovitatakse pidada sotsiaalsete rühmadena) 
Sööt ja allapanu Sööda ja allapanu fütoöstrogeenide sisaldus peaks olema väike  
Katse-eeskiri  
Meetod Ebaküpsete eemaldamata 
munasarjadega loomade 
meetod (eelistatud valik). 
Eemaldatud munasarjadega 
täiskasvanud emasloomade meetod Eemaldatud munasarjadega täis ­
kasvanud emasloomade meetod 
Ebaküpsete loomade 
vanus dooside manusta ­
misel Vähemalt PND 18. Dooside 
manustamine tuleb lõpetada enne päeva PND 25. Praeguse meetodi puhul ei ole 
asjakohane. 
Vanus munasarjade 
eemaldamisel Vanuses 6–8 nädalat. 
Eemaldatud munasarja ­
dega loomade vanus 
dooside manustamisel Munasarjade eemaldamise ja 
esimese doosi manustamise 
vahel peaks olema vähemalt 14 päeva. Munasarjade eemaldamise ja 
esimese doosi manustamise 
vahel peaks olema vähemalt 7 päeva. 
Kehamass Kehamassi erinevused peaksid olema minimaalsed, mitte üle 
±20 % keskmisest kehamassist
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Rott Hiir  
Doseerimine  
Manustamistee Suukaudne sond või nahaalune süst Manustamise sagedus Ühekordne päevane doos Sondiga ja süstimisega 
manustatav ruumala ≤ 5 ml kehamassi kg kohta (või vesilahuste puhul kuni 10 ml 
kehamassi kg kohta) (kahte süstimiskohta nahaaluse manusta ­
mise puhul) 
Manustamise kestus Ebaküpsete loomade puhul 3 
järjestikusel päeval 
OVX-loomade puhul vähemalt 
3 järjestikusel päeval OVX-loomade puhul 7 järjesti ­
kusel päeval 
Lahkamisaeg Ligikaudu 24 tundi pärast viimast doosi  
Tulemused  
Positiivne vastus Keskmise emakamassi statistiliselt oluline suurenemine (märja 
ja/või kuivatatud emaka mass) 
Võrdlusöstrogeen 17 α-etinüülöstradiool
 
TULEMUSTE TÕLGENDAMISE JA KEHTIVAKS TUNNISTAMISE 
JUHISED  
54. Üldiselt tuleks östrogeensuse test lugeda positiivseks, kui tuvastatakse statis ­
tiliselt oluline emakamassi suurenemine (p < 0,05) vähemalt suure doosi 
rühmas, võrreldes lahusti kontrollrühmaga. Positiivset tulemust toetab täien ­
davalt bioloogiliselt usutav sõltuvus doosi ja toime ulatuse vahel, pidades aga silmas, et uuritava kemikaali kattuvad östrogeensed ja antiöstrogeensed toimed võivad mõjutada uuritava kemikaali doosi-toime sõltuvuse kuju.
 
55. Tuleb jälgida, et ei ületataks suurimat talutavat doosi, et andmeid oleks 
võimalik mõistlikult tõlgendada. Selles suhtes tuleks hoolikalt hinnata keha ­
massi vähenemist, kliinilisi tunnuseid ja muid tähelepanekuid.  
56. Oluline asjaolu uterotroofse biokatse tulemuste kehtivaks tunnistamisel on 
emaka mass kandeaine kontrollrühma liikmetel. Suur emaka mass kontroll ­
rühma liikmetel võib panna kahtluse alla biokatse tundlikkuse ja võime tuvastada väga nõrku östrogeeni agoniste. Kirjandusülevaated ja utero ­
troofse biokatse valideerimise käigus kogutud andmed osutavad, et kont ­
rollrühma emakamassi kõrge keskmine esineb spontaanselt, eriti ebaküpsete 
loomade puhul (2, 3, 6, 9). Kuna ebaküpse roti emaka mass sõltub mitmest muutujast, nagu stress või kehamass, ei ole võimalik anda kindlat emaka massi ülempiiri. Juhindumiseks: kui ebaküpsete rottide kontrollrühmas 
emaka mass on 40–45 mg, tuleks tulemusi pidada kahtlaseks, ja emaka 
mass üle 45 mg võib tähendada, et katset tuleks korrata. Siiski tuleb seda kaalutleda iga juhtumi puhul eraldi (3, 6, 8). Täiskasvanud rottidega katsete tegemisel võib munasarjade puudulikul eemaldamisel jääda alles munasar ­
jakude, mis võib nõristada endogeenseid östrogeene ja aeglustada emaka ­
massi taandarengut.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Kandeaine kontrollrühma kuivatatud emaka mass, mis on väiksem kui 
0,09 % roti ebaküpse emaslooma kehamassist ja väiksem kui 0,04 % roti 
eemaldatud munasarjadega noore täiskasvanud emaslooma kehamassist, näib andvat vastuvõetavaid tulemusi (vt tabel 31 (2)). Kui kontrollrühmas on emaka mass suurem kui kõnealused arvud, tuleks analüüsida eri tegureid, 
nagu loomade vanus, munasarjade eemaldamise nõuetekohasus, söödaga 
saadavad fütoöstrogeenid jne), ja katse negatiivset tulemust (östrogeense toime puudumine) tuleks võtta ettevaatusega.
 
58. Laboris tuleks säilitada võrdlusrühmade kohta kogutud varasemad andmed. 
Samuti tuleks laboris säilitada andmed selliste võrdlusöstrogeenide nagu 
17α-etinüülöstradiool poolt esilekutsutud reaktsiooni kohta. Labor võib 
teha katseid ka teadaolevalt nõrga östrogeeni agonisti reaktsiooni määrami ­
seks. Kõiki neid andmeid võib võrrelda kättesaadavate andmetega (2, 3, 4, 
5, 6, 7, 8), et veenduda selles, et labori meetod on piisavalt tundlik.  
59. Kuivatatud emaka massi varieeruvus oli OECD valideerimisuuringus 
väiksem kui märja emaka massi puhul (6, 7). Kuid kummagi näitaja väär ­
tuste tugev suurenemine viitab siiski sellele, et uuritav aine on östrogeense 
toime poolest positiivne.  
60. Uterotroofne reaktsioon ei ole täielikult östrogeense päritoluga, kuid utero ­
troofse biokatse positiivset tulemust tuleks üldiselt tõlgendada kui tõendit võimaliku östrogeensuse kohta  in vivo , ja see peaks tavaliselt andma põhjust 
selle küsimuse edasiseks täpsustamiseks (vt punkt 9 ning „Sisesekretsioo ­
nisüsteemi kahjustavate kemikaalide kontrollimise ja hindamise OECD kontseptuaalne raamistik”, 2. lisa).
 
Joonis 1  
Skeem munasarjade kirurgilise eemaldamise kohta
  
Operatsioon algab kõhuõõne dorsolateraalse seina avamisega alumise roide ­
kaare ja niudeluuharja vahelise ala keskpunktis ning mõne millimeetri kaugusel niudelihase välimisest servast. Kõhuõõnes tuleks leida munasarjad. Munasarjad eemaldatakse seejärel füüsiliselt kõhuõõnest aseptilisele alale, 
munasarja ja emaka vahele pannakse ligatuur verejooksu vältimiseks ning 
munasari eemaldatakse sisselõikega ligatuuri kohalt kummagi munajuha ja emakasarve ühinemiskohast. Kui on tehtud kindlaks, et olulist püsivat vere ­
jooksu ei ole, tuleks kõhuõõne sein sulgeda õmblusega ja nahahaav sulgeda 
klambrite või õmblusega. Loomadel lastakse paraneda ja emakal taandare ­
neda vähemalt 14 päeva enne katses kasutamist.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Joonis 2  
Emakakudede eemaldamine ja ettevalmistamine massi määramiseks.
  
Tööd alustatakse kõhuseina avamisega alates häbemeliidusest. Seejärel eralda ­
takse kumbki munasari ja emakasarv kõhuõõne dorsaalse seina küljest. Emaka ja tupe ventraalselt ja lateraalselt küljelt eemaldatakse kusepõis ja kusejuhad. Kiulised ühendused päraku ja tupe vahel eraldatakse, kuni võib näha tupesuudme 
ja lahkliha naha ühenduskohta. Emakas ja tupp eraldatakse kehast tupeseina 
läbilõikamisega otse lahklihanahaga ühenduse kohalt, nagu on näidatud joonisel. Emakas tuleks kõhuseinast eraldada emaka kinnisti (mesenteeriumi) ettevaatliku läbilõikamisega selle kinnituskohalt kummagi emakasarve dorsolateraalse külje 
kogu pikkuses. Pärast emaka eemaldamist lõigatakse ära liigne rasv ja sidekude. 
Kui munasarjad on alles, eemaldatakse need munajuha juurest, vältides valen ­
dikus oleva vee väljavoolamist emakasarvest. Kui loomal on munasarjad eemal ­
datud, tuleks munasarjade kunagisi kinnituskohti uurida munasarjakoe leidmi ­
seks. Tupp eraldatakse emakast veidi allpool emakakaela, nii et emakakael jääb 
emakakeha juurde, nagu on näidatud joonisel. Emaka võib seejärel kaaluda.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
1. liide  
MÕISTED  
Antiöstrogeensus  – kemikaali võime alla suruda 17ß-etinüülöstradiooli toimet 
imetajate organismile.  
Doos  – manustatav uuritava kemikaali kogus. Uterotroofse biokatse puhul 
väljendatakse doosi uuritava kemikaali massina katselooma kehamassi ühiku kohta päevas (nt mg kehamassi kg kohta päevas).
 
Doseerimine  – üldmõiste, mis hõlmab doosi, dooside manustamise sagedust ja 
kestust.  
Kemikaal  – aine või segu.  
Maksimaalne talutav doos( Maximum Tolerable Dose , MTD)  – suurim kemi ­
kaali kogus, mis katselooma kehasse viiduna ei põhjusta katselooma surma (tähis 
LD 0 ) (IUPAC, 1993).  
Spetsiifilisus  – kõikide negatiivsete/toimeta ainete osakaal, mis katsemeetodi abil 
klassifitseeritakse õigesti. See on tõhususe näitaja katsemeetodi puhul, mis näitab 
selgeid tulemusi andva katsemeetodi täpsust ja on oluline katsemeetodi asjako ­
hasuse hindamisel.  
Sünnijärgne päev X  – X. elupäev pärast sünnikuupäeva.  
Sünnikuupäev  – sünnijärgne päev 0 (PND 0).  
Tundlikkus  – kõikide positiivsete/toimivate ainete osakaal, mis klassifitseeri ­
takse katsemeetodi abil õigesti. Tundlikkus näitab selgeid tulemusi andva katse ­
meetodi täpsust ja on oluline katsemeetodi asjakohasuse hindamisel.  
Uterotroofne  – termin, millega kirjeldatakse positiivset mõju emaka kudede 
kasvule.  
Uuritav kemikaal  – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. 
Östrogeensus  – kemikaali võime avaldada imetaja organismile 17ß-etinüülöstra ­
diooli omaga sarnanevat toimet.  
Valideerimine  – teaduslik menetlus, mille eesmärk on iseloomustada katsemee ­
todi läbiviimise nõudeid ning tõendada meetodi usaldusväärsust ja asjakohasust konkreetse eesmärgi saavutamiseks.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
2. liide
  
VMG mamm: imetajatega tehtavate katsete valideerimist ja hindamist juhtiv rühm
 MÄRKUSED RAAMISTIKU JUURDE  
Märkus 1:  kõigile tasemetele on võimalik siseneda ja kõigilt tasemetelt on 
võimalik väljuda; see oleneb sellest, millist teavet on vaja saada 
ohtude ja riskide hindamiseks.  
Märkus 2:  tasemel 5 peaks ökotoksikoloogia hõlmama näitajaid, mis näitavad 
kahjuliku mõju mehhanisme ja võimalikku kahju elanikkonna jaoks.
 
Märkus 3:  kui mitme näitaja kohta tulemusi andev katsemudel hõlmab näita ­
jaid, mida määratakse ühe näitaja kohta tulemusi andva katsega, 
peaks nimetatud mudel asendama ühe näitaja kohta tulemusi andva 
katsed.  
Märkus 4:  iga kemikaali tuleks eraldi hinnata, võttes arvesse kogu olemasole ­
vat teavet ja pidades silmas raamistiku tasemete funktsiooni.  
Märkus 5:  praegust raamistikku ei tuleks käsitleda kõike hõlmavana. Tase ­
metel 3, 4 ja 5 hõlmab raamistik katseid, mis on juba kättesaadavad või valideerimine on käimas. Viimast asjaolu arvestades on need 
ajutiselt lisatud. Kui need on välja töötatud ja valideeritud, saab 
need ametlikult lisada raamistikku.
 
Märkus 6:  raamistikust ei tohiks niimoodi aru saada, et tasemel 5 on üksnes 
lõplikud katsed. Arvestatakse, et osutatud tasemel olevad katsed aitavad kaasa üldisele ohtude ja riskide hindamisele.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
KIRJANDUS  
1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic 
Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.
 
3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Utero ­
trophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445–520.
 
4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental 
Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.
 
5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785–94.  
6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.  
7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549
 
8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558.
 
9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.  
10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolifera ­
tive pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582–587.  
11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17 β- 
estradiol. Endocrinology 117:2229-2237.  
12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleisch ­
mann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active 
UV screens. SÖFW-J. 127:10–15.  
13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science 118:650–651.  
14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. 
Toxicol. 13:425–427.  
15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  
responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health 
Perspec.106:369–373.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Utero ­
trophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67.  
17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145–157.  
18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.
 
19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature 
rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613–620.
 
20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, 
Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477–485.  
21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343–347.  
22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 
26:381–393.
 
23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596–601.
 
24) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320 — 333.  
28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33 — 41.  
29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288 — 305.
 
30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284 — 291.  
31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92–64-12367-9, Paris.  
32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press.  
33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for 
endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401–416.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1–2): 159–184.  
35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808.  
36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evalua ­
tion of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414.
 
37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 
No. 71.  
38) Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 
2010, teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 20.10.2010, lk 33).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  HERSHBERGERI BIOKATSE ROTTIDEL: KIIRE 
SÕELKATSE (ANTI)ANDROGEENSETE OMADUSTE 
VÄLJASELGITAMISEKS  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 441 (2009). 
OECD algatas 1998. aastal prioriteetse tegevussuunana olemasolevate katse ­
juhendite läbivaatamise ja uute väljatöötamise, et sõeluuringutega selgitada 
välja võimalikud sisesekretsioonisüsteemi kahjustajad ja katsetada neid (1). 
Üks tegevussuund oli töötada välja rotiga tehtava Hershbergeri biokatse juhend. Pärast mitme aastakümne pikkust kasutamist ravimitööstuses stan ­
darditi see katse kõigepealt ametliku eksperdikomitee poolt 1962. aastal 
sõelkatsena androgeense toimega kemikaalide väljaselgitamiseks (2). 
Aastatel 2001–2007 läbis rotiga tehtav Hershbergeri biokatse ulatusliku valideerimisprogrammi, mille käigus koostati üksikasjalik taustadokument (23), põhjalik artikkel (3) meetodite kohta, arendati välja lahkamise 
juhendid (21) ning tehti ulatuslikud laborisisesed ja laboritevahelised 
uuringud, et näidata biokatse asjakohasust ja reprodutseeritavust. Nimetatud uuringud viidi läbi tugeva võrdlusandrogeeniga (testosteroonpropionaat 
(TP)), kahe tugeva sünteetilise androgeeniga (trenboloonatsetaat ja metüül ­
testosteroon), ühe tugeva antiandrogeense ravimiga (flutamiid), loodusliku androgeeni (dihüdrotestosteroon, DHT) sünteesi tugeva inhibiitoriga (finas ­
teriid), mitme nõrgalt antiandrogeense pestitsiidiga (linuroon, vinklosoliin, 
protsümidoon,  p,p'-DDE), tugeva 5 α-reduktaasi inhibiitoriga (finasteriid) ja 
kahe teadaoleva toimeta (negatiivse) kemikaaliga (dinitrofenool ja nonüül ­
fenool) (4, 5, 6, 7, 8). Käesolevas katsemeetodis on võetud kokku pikaaja ­
liste biokatsega saadud kogemused ning valideerimisprogrammi käigus 
saadud kogemused ja saavutatud tulemused.
 
2. Hershbergeri biokatse on kiire  in vivo  sõelkatse, milles kasutatakse isassu ­
guorganite kudesid. Katse töötati välja 1930. aastatel ja 1940. aastatel seda 
muudeti, et lisada ka isassuguorganite androgeenitundlikud lihased (2, 9–15). 1960. aastatel hinnati katse-eeskirja standarditud versiooni kasutades enam kui 700 võimalikku androgeeni (2, 14); sel ajal peeti seda katset nii 
androgeenide kui ka antiandrogeenide määramise standardmeetodiks (2, 15). 
Praegune biokatse põhineb enne puberteeti kastreeritud isasrottide viie androgeenisõltuva koe massi muutustel. Sellega hinnatakse, kas kemikaal kutsub esile bioloogilisi toimeid, mis on kooskõlas androgeeni agonistide, 
antagonistide või 5 α-reduktaasi inhibiitorite toimega. Viis androgeenisõl ­
tuvat kude, mida hõlmab käesolev katsemeetod, on ventraalne eesnääre (ventral prostate , VP), seemnepõis ( seminal vesicle , SV) (pluss vedelikud 
ja koagulatsiooninäärmed), lihas  levator ani-bulbocavernosus  (LABC), 
paarilised Cowperi näärmed (COW) ja suguti pea ( glans penis , GP). Enne 
puberteeti kastreeritud isasrottidel reageerivad kõik need viis kude andro ­
geenidele absoluutse massi suurenemisega. Samas kui nende kudede stimu ­
leerimine tugeva võrdlusandrogeeniga suurendab nende massi, väheneb 
kõigi nende viie koe mass antiandrogeenide toimel. Hershbergeri biokatse 
esmane mudel oli enne puberteeti kirurgiliselt kastreeritud isasrott; seda mudelit valideeriti Hershbergeri valideerimisprogrammide etappidel 1, 2 ja 3.
 
3. Biokatset saab kasutada androgeeni agonistide, antagonistide ja 5 α-reduk­
taasi inhibiitorite rutiinseks  in vivo  sõeluuringuks ja selle kasutamist tuleks 
vaadelda „Sisesekretsioonisüsteemi kahjustavate kemikaalide kontrollimise 
ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku” (2. liide) kontekstis. Selles  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
kontseptuaalses raamistikus on Hershbergeri biokatse 3. tasemel kui  in vivo  
katse, mis annab andmeid üheainsa sisesekretsioonimehhanismi, nimelt 
(anti)androgeensuse kohta. Hershbergeri biokatse on kavandatud osana  in 
vitro  ja in vivo  katsetest, millega tehakse kindlaks endokriinsüsteemi mõju ­
tada võivaid kemikaale, et hinnata ohtusid inimese tervisele ja keskkonnale.  
4. Kuna loomade kastreerimise operatsioon on küsitav loomade heaolu seisu ­
kohast, püüti alternatiivse mudelina hakata kasutama opereerimata (kastree ­
rimata) võõrutamiseas isasrotte, et vältida Hershbergeri biokatses kastreeri ­
misetappi. Võõrutuseas isasloomade katsemeetod valideeriti (24); kuid vali ­
deerimisuuringus selgus, et Hershbergeri biokatse võõrutamiseas isasloo ­
made versiooniga ei ole võimalik järjekindlalt avastada nõrkade antiandro ­
geenide kasutatud kontsentratsioonide mõju androgeenisõltuvate kudede massile. Seetõttu ei hõlma käesolev katsemeetod seda versiooni. Kuna aga selle kasutamine võib olla oluline mitte ainult loomade heaolu seisuko ­
hast, vaid võib anda ka teavet muude toimeviiside kohta, on see kättesaadav 
OECD juhenddokumendis 115 (25).
 
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
5. Androgeeni agonistid ja antagonistid toimivad androgeeniretseptorite ligan ­
didena ja võivad vastavalt aktiveerida või pidurdada retseptorite poolt kont ­
rollitavat transkriptsiooni. Lisaks takistavad mõned kemikaalid testosterooni 
muutmist mõjusamaks looduslikuks androgeeniks dihüdrotestosterooniks mõnes androgeeni sihtkoes (5 α-reduktaasi inhibiitorid). Sellised kemikaalid 
võivad põhjustada tervisekahjustusi, sealhulgas reproduktiivfunktsiooni ja 
arengu häireid. Seepärast on regulatiivsetel eesmärkidel vaja kiiresti hinnata 
kemikaale kui võimalikke androgeeni agoniste või antagoniste või 5 α- 
reduktaasi inhibiitoreid. Kuigi ligandi afiinsus androgeeniretseptori suhtes, mida mõõdetakse retseptorile sidumise või reportergeenide transkriptsiooni 
aktiveerimise kaudu  in vitro , annab küll olulist teavet, ei ole see siiski mitte 
ainus võimalik ohtu põhjustav tegur. Muud tegurid hõlmavad metabolismi aktiveerimist ja inaktiveerimist pärast kehasse sisenemist, kemikaalide jaotu ­
mist sihtkudedesse ja väljutamist kehast. Seepärast on vaja kontrollida 
kemikaali võimalikku mõju  in vivo  asjakohastes tingimustes ja asjakohase 
kokkupuute korral.  In vivo  hindamine on vähem oluline, kui kemikaali 
sellised omadused, mis on seotud neeldumise, jaotumise, metabolismi ja väljutamisega, on teada. Androgeenisõltuvad koed reageerivad androgeeniga 
stimuleerimisele kiire ja jõulise kasvuga, eriti enne puberteeti kastreeritud 
isasrottide puhul. Närilisi, eriti rotte, kasutatakse laialdaselt ka mürgisuse uuringutes ohu iseloomustamiseks. Seepärast sobib biokatse käesolev versioon, milles kasutatakse enne puberteeti kastreeritud rotte ja viit siht ­
kude, androgeeni agonistide, antagonistide või 5 α-reduktaasi inhibiitorite  in 
vivo sõelkatseks.
 
6. Käesolev katsemeetod põhineb OECD valideerimisuuringus kasutatud 
katse-eeskirjadel, mis osutusid usaldusväärseks ja korratavaks nii laborisi ­
sestes kui ka laboritevahelistes uuringutes (4, 5, 6, 7, 8). Käesolevas katse ­
meetodis on esitatud nii androgeeni kui ka antiandrogeeni määramise meetod.
 
7. Kuigi testosteroonpropionaadi (TP) doos, mida kasutati antiandrogeenide 
määramiseks OECD Hershbergeri biokatse valideerimisprogrammis, oli eri 
laborites erinev (0,2 ja 0,4 mg/kg/päevas, nahaalune süst), ei olnud nende 
kahe katse-eeskirja versioonide vahel suuri erinevusi nõrga või tugeva antiandrogeense aktiivsuse tuvastamises. Siiski on selge, et TP doos ei tohiks olla liiga kõrge, et takistada nõrkade androgeeniretseptori (AR) anta ­
gonistide mõju, ega liiga madal, nii et androgeenitundlike kudede kasv on 
liiga väike isegi ilma antiandrogeeni samaaegse manustamiseta.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Üksikute androgeenitundlike kudede reaktsioon ei ole siiski täielikult 
tingitud androgeenist, st ka muud kemikaalid kui androgeeni antagonistid 
võivad muuta teatavate kudede massi. Mitme koe samaaegne kasv siiski tõendab androgeenispetsiifilist mehhanismi. Näiteks tugevad östrogeenid suures doosis võivad suurendada seemnepõiekeste massi; muud androgee ­
nisõltuvad koed ei reageeri aga sarnasel viisil. Antiandrogeense toimega 
kemikaalid võivad toimida kas androgeeniretseptori antagonistidena või 5α-reduktaasi inhibiitoritena. 5 α-reduktaasi inhibiitorid on mitmesuguse 
mõjuga, kuna muundamine tugevama toimega dihüdrotestosterooniks on 
eri kudedes erinev. Antiandrogeenidel, nagu finasteriid, mis inhibeerivad 
5α-reduktaasi, on suurem mõju ventraalses eesnäärmes kui muudes kudedes, 
kui võrrelda sellise androgeeniretseptori tugeva antagonistiga nagu fluta ­
miid. Seda erinevust kudede reaktsioonis võib kasutada androgeeniretsepto ­
rist sõltuva ja 5 α-reduktaasist sõltuva toime eristamiseks. Lisaks sellele on 
androgeeniretseptor evolutsiooniliselt suguluses muude steroidhormoonide retseptoritega, ja kui mõnda muud hormooni manustatakse suures, füsioloo ­
gilist taset kaugelt ületavas doosis, võib see siduda end retseptoriga ja 
toimida testosteroonpropionaadi põhjustatava kasvu stimuleerimise antago ­
nistina (13). Lisaks on ka usutav, et tõhustatud steroidide metabolism ja sellest tingitud seerumi testosteroonisisalduse vähenemine võib vähendada androgeenisõltuvate kudede kasvu. Seepärast tuleb Hershbergeri biokatse 
positiivse tulemuse hindamisel tavaliselt lähtuda sellest, kui kaalukad on 
tõendid, sealhulgas  in vitro  katsed, nagu androgeeniretseptori ja östrogeeni ­
retseptori sidumise katsed ja vastavad transkriptsiooni aktivatsiooni katsed või muud  in vivo  katsed, millega uuritakse sarnaseid androgeeni sihtku ­
desid, nagu isaslooma puberteedikatse, 15-päevane opereerimata täiskas ­
vanud isaslooma katse või 28-päevane või 90-päevane korduvdoosi uuring.
 
9. Kogemused näitavad, et ksenobiootilisi androgeene esineb harvemini kui 
ksenobiootilisi antiandrogeene. Seepärast eeldatakse, et Hershbergeri 
biokatset kasutatakse kõige sagedamini antiandrogeenide leidmise sõelkat ­
sena. Androgeenide tuvastamise katset võib sellele vaatamata siiski soovi ­
tada steroidsete või steroidisarnaste kemikaalide või selliste kemikaalide puhul, mille võimaliku androgeense mõju kohta on saadud viiteid meetodi ­
tega, mis on kontseptuaalse raamistiku (2. liide) 1. või 2. tasemel. Sarnaselt 
sellega võib (anti)androgeense profiiliga seotud kahjulikke mõjusid leida 5. taseme uuringutega, mistõttu tuleb hinnata, kas kemikaal toimib endokriinse mehhanismi kaudu.
 
10. Meetodi kasutamisel arvestatakse, et kõik katsed loomadega peavad 
vastama loomade hooldamise kohalikele normidele; järgmised loomade hoolduse ja dooside manustamise kirjeldused vastavad miinimumstandardi ­
tele ning kohalikud õigusaktid, nagu Euroopa Parlamendi ja nõukogu 
22. septembri 2010. aasta direktiiv 2010/63/EL teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (26), on nende suhtes ülimuslikud. OECD on esitanud loomade humaanse kohtlemise täiendavad juhendid (17).
 
11. Nagu iga biokatse puhul, milles kasutatakse katseloomi, tuleb hoolikalt 
kaaluda, kas uuringut on üldse vaja teha. Sellise otsuse tegemiseks võib põhimõtteliselt olla kaks põhjust:
 
— suur oht kokkupuuteks (kontseptuaalne raamistik, 1. tase) või kaudsed 
andmed kemikaali (anti)androgeensuse kohta  in vitro  katsetest (2. tase), 
mille tõttu on vaja täiendavalt uurida, kas selline mõju võib esineda  in 
vivo; 
— (anti)androgeensusele osutav mõju 4. või 5. tasemel  in vivo  katsetes ja 
on vaja täiendavaid uuringuid konkreetse toimeviisi selgitamiseks, 
näiteks tõendamiseks, et mõju aluseks on (anti)androgeenne mehhanism.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.  
KATSE PÕHIMÕTE  
13. Hershbergeri biokatse on tundlik, kuna selles kasutatakse isasloomi, kelle 
endogeense androgeeni nõristumine on minimaalne. See saavutatakse 
kastreeritud isasloomade kasutamisega tingimusel, et pärast kastreerimist on möödunud piisavalt aega ning sihtkoed on taandarenenud miinimumini ja arvestatakse ühesugust nulljoonele vastavat massi. Seega on võimaliku 
androgeense toime avastamise sõeluuringu tegemisel veres ringleva endo ­
geense androgeeni sisaldus madal, hüpotalamuse-ajuripatsi-sugunäärmete telg ei suuda seda tagasisidemehhanismide kaudu kompenseerida, kudede võime androgeenile reageerida on viidud maksimumini ja lähtekoe mass 
miinimumini. Võimalike antiandrogeenide otsimisel võib saavutada kooskõ ­
lalisema kudede massi suurenemise, kui kudesid stimuleeritakse võrdlusand ­
rogeeniga. Selle tulemusel on Hershbergeri biokatses vaja ainult 6 looma 
doosirühma kohta, samal ajal kui muudes katsetes opereerimata pubertee ­
diealiste või täiskasvanud isasloomadega soovitatakse kasutada 15 isas ­
looma igas doosirühmas.
 
14. Isasrottide puberteedilähedane kastreerimine peaks toimuma asjakohasel 
viisil, heakskiidetud anesteetikumide ja aseptilise tehnika kasutamisega. 
Esimese paari päeva jooksul pärast operatsiooni tuleks manustada valuvai ­
gisteid, et kõrvaldada operatsioonijärgseid vaevusi. Kastreerimine suurendab katsemeetodi täpsust nõrkade androgeenide ja antiandrogeenide avastamisel, kuna kõrvaldab kompenseerivad sisesekretsioonisüsteemi tagasisidemehha ­
nismid, mis on olemas opereerimata katseloomas ja mis võivad nõrgendada 
manustatavate androgeenide ja antiandrogeenide mõju, ning kõrvaldab samuti eri isasrottide testosteroonitaseme suured erinevused seerumis. Seega vähendab kastreerimine loomade arvu, mida on vaja endokriinse 
mõju tuvastamiseks sõeluuringuga.
 
15. Sõeluuringuga võimaliku androgeense toime leidmiseks manustatakse uuri ­
tavat kemikaali iga päev suukaudse sondiga või nahaaluse süstiga kümnel järjestikusel päeval. Uuritavat kemikaali manustatakse vähemalt kahe doosi ­
rühma katseloomadele; kõigile ühe rühma loomadele manustatakse ühesu ­
guseid doose. Loomad lahatakse 24 tundi pärast viimase doosi manustamist. Kahe või enama sihtorgani massi statistiliselt oluline suurenemine uuritavat kemikaali saanud rühmades võrreldes kontrollrühmaga, kellele antakse 
kandeainet, näitab, et uuritav aine on võimaliku androgeense toime suhtes 
positiivne (vt punkt 60). Sellised androgeenid nagu trenboloon, mida ei ole võimalik 5 α — taandada, avaldab tugevamat mõju LABC-le ( levator 
ani-bulbocavernosus ) ja GP-le ( glans penis ) kui testosteroonpropionaat, 
kuid kõigi kudede juures peaks näha olema intensiivsemat kasvu.
 
16. Võimaliku antiandrogeense aktiivsuse otsimisel sõelkatsetega manustatakse 
uuritavat kemikaali iga päev suukaudse sondi või naha alla süstimisega kümnel järjestikusel päeval koos testosteroonpropionaadi igapäevase manus ­
tamisega (0,2 või 0,4 mg/kg/päevas) nahaluste süstide abil. Valideerimis ­
programmiga tehti kindlaks, et võib kasutada kas 0,2 või 0,4 mg/kg/päevas, 
kuna mõlema doosiga sai avastada antiandrogeene ja sellepärast tuleks katses kasutamiseks valida ainult üks nendest doosidest. Erinevaid uuritava kemikaali doose manustatakse vähemalt kolme doosirühma katseloomadele; 
kõigile ühe rühma loomadele manustatakse ühesuguseid doose. Loomad 
lahatakse 24 tundi pärast viimase doosi manustamist. Kahe või enama sihtorgani massi statistiliselt oluline vähenemine uuritavat kemikaali ja testosteroonpropionaati saanud rühmades võrreldes kontrollrühmaga, kellele 
antakse ainult testosteroonpropionaati, näitab, et uuritav aine on võimaliku 
antiandrogeense toime suhtes positiivne (vt punkt 61).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
MEETODI KIRJELDUS  
Liikide ja liinide valimine  
17. Hershbergeri biokatseks on juba alates 1930. aastatest tavaliselt kasutatud 
rotte. Kuigi bioloogiliselt on võimalik, et roti ja hiire reaktsioon võib olla 
sarnane, on roti 70-aastase kasutamise põhjal kujunenud rott Hershbergeri biokatses eelistatud loomaliigiks. Lisaks sellele, kuna Hershbergeri biokatse tulemus võib olla pikema, mitut põlvkonda hõlmava uuringu eelkatse, 
võimaldab see kasutada mõlemas uuringus sama liigi ja liini ning samast 
allikast pärinevaid loomi.
 
18. Käesoleva katse-eeskirja kohaselt lubatakse laboril valida katses kasutami ­
seks sellise liini rott, keda osalevas laboris on varem tavaliselt kasutatud. Katseloomadena võib kasutada tavaliselt laboris peetavate rotiliinide loomi, kuid siiski ei tuleks kasutada liine, mille isasloomad küpsevad oluliselt 
hiljem kui 42 päeva vanuselt, kuna nende loomade kastreerimine 42. päeval 
võib takistada suguti pea massi määramist, mida saab teha alles pärast seda, kui eesnahk on eraldunud peenise tüve küljest. Seega ei tuleks kasutada liine, mis pärinevad Fisher 344 rottidest, või teha seda üksnes harvadel 
juhtudel. Fisher 344 rottidel on seksuaalse küpsemise ajastus teistsugune 
kui sagedamini kasutatavatel Sprague Dawley või Wistari liini rotid (16). Kui tuleb kasutada sellist liini, tuleks need kastreerida veidi kõrgemas vanuses ja labor peab suutma näidata, et kasutatav liin on tundlik. Labor 
peaks selgelt põhjendama, miks valiti konkreetse liini rotid. Kui sõeluuring 
võib olla korduva suukaudse doosi, reproduktiivtoksilisuse, arenguhäireid põhjustava toksilisuse või pikaajalise toksilisuse uuringu eelkatse, tuleks kõigis uuringutes eelistatavalt kasutada samast liinist ja samalt tarnijalt 
saadud loomi.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
19. Kogu katse teostus peaks vastama laboriloomade hooldamise kõikidele 
kohalikele normidele. Siin esitatud loomade hoolduse ja dooside manusta ­
mise kirjeldused vastavad miinimumstandarditele ning rangemad kohalikud õigusaktid, nagu Euroopa Parlamendi ja nõukogu 22. septembri 2010. aasta direktiiv 2010/63/EL teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse 
kohta (26), on nende suhtes ülimuslikud. Loomade katseruumi temperatuur 
peaks olema 22 °C (ligikaudne vahemik ±3 °C). Suhteline õhuniiskus peaks olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt ei peaks olema üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal. Eesmärgiks peaks olema suhtelise õhuniiskuse hoid ­
mine 50–60 % vahemikus. Valgustus peaks olema kunstlik. Ööpäevas 
peaks olema 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust.
 
20. Rühmas pidamine on eelistatav isoleerimisele, arvestades loomade noorust 
ja asjaolu, et rotid on seltsingulised loomad. Kahe või kolme looma paigu ­
tamine puuri võimaldab vältida liigset asustustihedust ja sellega seotud stressi, mis võib mõjutada paljunemisfunktsiooniga seotud kudede arengut. Puurid tuleb hoolikalt puhastada võimalikest saasteainetest; puurid paiguta ­
takse nii, et puuri paigutusest tingitud mõjud oleksid võimalikult väikesed. 
Sobiva suurusega puuris (ca. 2 000 ruutsentimeetrit) ei ole loomad liiga tihedalt.
 
21. Iga loom peab olema humaansel viisil eraldi märgistatud (nt kõrvamärk või 
lipik). Kasutatud märgistamismeetod tuleks kirjeldada.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Laborisööda ja joogivee tarbimine peaks olema  ad libitum . Hershbergeri 
biokatset tegev labor peaks kasutama tavalist sööta, mida tavaliselt kasuta ­
takse kemikaalide katsetamise uuringute puhul. Biokatse valideerimisuu ­
ringus ei täheldatud mõju või varieeruvust, mille põhjuseks oleks tulnud pidada sööta. Kasutatud sööt tuleks kirjeldada ja laborisööda proov tuleks 
säilitada võimaliku tulevase analüüsi jaoks.
 
Androgeenisõltuvate organite masside kasutatavuse kriteeriumid  
23. Valideerimisuuringu ajal ei saadud tõendeid, et kehamassi vähenemine 
oleks mõjutanud sihtkudede (st käesolevas uuringus kaalutavate kudede) massi suurenemist või vähenemist.
 
24. Valideerimisprogrammis edukalt kasutatud eri liinide hulgas on androgee ­
nisõltuvate organite mass suurema kehamassiga rotiliinide puhul suurem kui 
väiksema kehamassiga rottidel. Hershbergeri biotesti kehtivuse kriteeriumid 
ei hõlma seega elundite oodatavat absoluutset massi positiivsetes (doosi) ­
rühmades ja negatiivsetes kontrollrühmades.  
25. Kuna koe puhul on variatsioonikordaja (CV) pöördvõrdeline statistilise 
võimsusega, siis Hershbergeri biokatse kasutatavuse kriteeriumid põhinevad 
iga koe puhul lubataval maksimaalsel CV väärtusel (tabel 1). CV väärtused 
tulenevad OECD valideerimisuuringutest. Negatiivse tulemuse korral peaks labor uurima kontrollrühma ja suure doosiga rühma CV-sid ja tegema kind ­
laks, kas kasutatavuse jaoks lubatava maksimaalse CV kriteerium on 
ületatud.
 
26. Uuringut tuleks korrata, kui: 1) kontrollrühma ja suure doosi rühmade 
kümnest võimalikust eraldi CV-st on kolm või enam suuremad agonisti ja antagonisti uuringute jaoks esitatud väärtustest tabelis 1 ning 2) vähemalt kaks sihtkude olid marginaalselt ebaolulised, st ρ väärtused on vahemikus 
0,05–0,10. (
 1 ) 
Tabel 1  
Maksimaalsed lubatavad CVd, mis on kastraatmudelis määratud 
paljunemisfunktsiooniga seotud sihtkudede jaoks OECD 
valideerimisuuringus  ( 1 ) 
Kude Antiandrogeensed 
mõjud Androgeensed mõjud  
Seemnepõiekesed 40 % 40 % 
Ventraalne eesnääre 40 % 45 % 
Levator ani-bulbocavernosus 20 % 30 % 
Cowperi näärmed 35 % 55 % 
Glans penis 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) CV künnisväärtus teatava koe jaoks määrati CV väärtuste graafikult, millele olid kantud 
kõikide valideerimisuuringute konkreetse mudeliga (agonist või antagonist) leitud 
keskväärtuste CV-d järjestatuna väikseimast suurimani. CV künnisväärtuseks loeti 
punkt, mille juures CV-väärtuste suurenemised järgmiste kõrgemate CV-de suunas 
muutusid järsult suuremaks kui mõne eelneva CV vahel — see loeti murdepunktiks. 
Tuleks märkida, et kuigi selle analüüsiga leiti suhteliselt usaldusväärsed murdepunktid 
katse antagonistide mudeli puhul, olid agonistide mudeli CV kõverad ühtlasemate suure ­
nemistega väärtuste vahel, mistõttu künnisväärtuse CV leidmine selle meetodiga oli 
mõnevõrra meelevaldne.
 KATSE KORRALDUS  
Õigusnormidele vastavus ja labori valideerimine  
27. Erinevalt uterotroofsest katsest (käesoleva lisa peatükk B.54) ei ole Hersh ­
bergeri katse puhul enne katse alustamist vaja tõendada labori pädevust, 
kuna paralleelselt tehakse positiivset kontrollkatset (testosteroonpropionaat ja flutamiid) ja negatiivset kontrollkatset, mis on katse lahutamatud osad.
 
Loomade arv ja seisund  
28. Igas doosi- ja kontrollrühmas peaks olema vähemalt 6 looma. See kehtib nii 
androgeense kui ka antiandrogeense katse-eeskirja kohta.  
Kastreerimine  
29. Pärast loomade saamist peaks olema esialgne kohanemisperiood mitu päeva, 
et veenduda, et loomad on hea tervise juures ja tunnevad end hästi. Kuna enne 42 päeva vanuseks saamist (PND 42) kastreeritud loomadel ei tarvitse eesnahk eralduda, tuleks loomad kastreerida 42. päeval või hiljem, mitte 
varem. Loomad kastreeritakse narkoosi all; munandikotti tehakse sisselõige, 
kõrvaldatakse mõlemad munandid ja munandimanused ning veresooned ja seemnejuhad ligeeritakse. Kui on kindlaks tehtud, et verejooksu ei ole, tuleks munandikott sulgeda õmbluse või klambritega. Loomadele tuleks 
esimestel päevadel pärast operatsiooni anda valuvaigistit, et leevendada 
operatsioonijärgseid ebamugavusi. Kui loomade tarnijalt ostetakse kastree ­
ritud loomad, teatab tarnija loomade vanuse ja seksuaalse küpsuse staadiumi.
 
Kohanemine pärast kastreerimist  
30. Loomadel tuleks lasta jätkata kohanemist laboritingimustega vähemalt 7 
päeva pärast kastreerimist, et sihtkoed saaksid taandareneda (nende mass väheneb). Loomi tuleb iga päev jälgida ja kõik haiguse või kehaliste kõrva ­
lekallete märkidega loomad tuleks kõrvaldada. Dooside manustamist 
uuringu tegemiseks saab alustada kõige varem seega 49. päeval pärast 
sündimist (PND 49), seda ei tohiks alustada hiljem kui päeval PND 60. Vanus lahkamise ajal ei tohiks olla suurem kui PND 70. Selline paindlikkus lubab laboril oma katseid tõhusalt planeerida.
 
Kehamass ja juhuvaliku alusel rühmadesse jagamine  
31. Loomade kehamassi erinevused põhjustavad keha kudede massi varieeru ­
vust nii rühma sees kui ka rühmade vahel. Suurem koemasside varieeruvus 
suurendab variatsioonikordajat (CV) ja vähendab katse statistilist võimsust (mida nimetatakse mõnikord katse tundlikkuseks). Seepärast tuleks keha ­
massi varieeruvust hoida nii eksperimentaalselt kui ka statistiliselt kontrolli 
all.
 
32. Eksperimentaalne kontrolli all hoidmine hõlmab kehamassi varieeruvuse 
võimalikult väiksena hoidmist nii katserühma piires kui ka rühmade vahel. Kõigepealt tuleks vältida ebatavaliselt väikseid või suuri loomi ja neid ei tuleks võtta uuritavate loomade hulka. Katse alguses ei tohiks 
loomade kehamassi varieeruvus olla suurem kui ±20 % keskmisest keha ­
massist (nt 175 g ± 35 g kastreeritud puberteedilähedases vanuses rottide puhul). Teiseks, loomad tuleks jaotada (kontroll- ja doosi)rühmadesse keha ­
massi varieeruvuse järgi juhuvaliku alusel, nii et iga rühma keskmine keha ­
mass ei oleks statistiliselt erinev muu rühma vastavast näitajast. Kasutatud 
randomiseerimismeetodit tuleb kirjeldada.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Kuna kemikaali mürgisus võib vähendada kehamassi doosirühmades, 
võrreldes kontrollrühmaga, võiks statistilise kaasmuutujana kasutada keha ­
massi uuritava kemikaali manustamise esimesel päeval, mitte kehamassi lahkamise ajal.
 
Dooside manustamine  
34. Selleks et teha kindlaks, kas uuritaval kemikaalil võib  in vivo  olla andro ­
geenset toimet, piisab tavaliselt kahest doosirühmast ning positiivsest kont ­
rollrühmast ja kandeaine (negatiivsest) kontrollrühmast (vt punkt 43); seepä ­
rast eelistatakse sellist katse kava loomade heaoluga seotud põhjustel. Kui eesmärk on saada doosi ja toime vahelise sõltuvuse kõver või ekstrapolee ­
rida toimet madalamatele doosidele, on vaja vähemalt 3 doosirühma. Kui on 
vaja ka muud teavet peale androgeense toime kindlakstegemise (näiteks 
hinnata mõju tugevust), tuleks kaaluda teistsugust dooside manustamise režiimi. Antiandrogeense toime uurimiseks manustatakse uuritavat kemi ­
kaali koos võrdluseks kasutatava androgeeniagonistiga. Tuleks kasutada 
vähemalt kolme uuritava kemikaali erineva doosiga katserühma (doosi ­
rühmad) ning positiivse kontrolli ja negatiivse kontrolli rühma (vt punkt 44). Kontrollrühma loomi tuleks kohelda samamoodi kui doosirühma loomi, välja arvatud uuritava kemikaali manustamine. Kui uuritava kemi ­
kaali manustamisel kasutatakse kandeainet, tuleb kontrollrühmale manustada 
kandeainet suurimas doosirühmade puhul kasutatud mahus.
 
35. Kõikide doosimäärade valimisel tuleks arvesse võtta kõiki uuritava kemi ­
kaali või sellega seotud materjalide toksilisust käsitlevaid ja (toksiko-)kinee ­
tilisi andmeid. Suurima doosi puhul tuleb kõigepealt arvesse võtta LD  50 
väärtust ja/või teavet ägeda mürgisuse kohta, et vältida loomade surma, 
suuri kannatusi või ebamugavusi (17, 18, 19, 20), ja teiseks olemasolevat teavet dooside kohta, mida on kasutatud subkroonilise ja kroonilise toksili ­
suse uuringutes. Üldiselt ei tohiks suurim doos põhjustada kehamassi vähe ­
nemist katse lõpuks mitte rohkem kui 10 % kontrollrühma loomade massist. 
Suurim doos peaks olema kas: 1) suurim doos, mis tagab loomade ellujää ­
mise ja mis ei põhjusta erilist mürgistust või kannatusi loomadele pärast manustamist 10 järjestikusel päeval doosis kuni 1 000 mg/kg/päevas (vt 
punkt 36) või 2) doos, mis põhjustab (anti)androgeenset toimet, olenevalt 
sellest, kumb on väiksem. Kuna see on sõelkatse, siis võib kasutada suuri dooside intervalle (näiteks 0,5 logaritmilist ühikut, mis vastab dooside 3,2- 
kordsele erinevusele, või isegi 1 logaritmiline ühik). Kui vajalikke andmeid 
ei ole, võib kasutatavate dooside leidmise hõlbustamiseks teha doosipiir ­
konna määramise katse (vt punkt 37).
 
Piirdoosi tase  
36. Kui katse piirdoosiga 1 000 mg/kg/päevas ja väiksema doosiga vastavalt 
käesolevas eeskirjas kirjeldatud korrale ei tekita statistiliselt olulist muutust 
reproduktiivorganite massis, võib täiendavaid doositasemeid pidada mitte ­
vajalikuks. Sellist piirdoosi väärtust kasutatakse alati, välja arvatud sellised juhud, kui inimese kokkupuute andmed viitavad vajadusele kasutada kõrgemat doositaset.
 
Vahemiku leidmise kaalutlused  
37. Vajaduse korral võib väikse arvu loomadega teha esialgse uuringu doosi ­
vahemiku leidmiseks, et valida sobivad doosirühmad (kasutades ägeda 
mürgisuse tuvastamise katseid (käesoleva lisa peatükid B.1b, B.1c (27), OECD katse-eeskiri 425 (19))). Hershbergeri biokatse puhul on eesmärk valida doosid, mis tagaksid loomade ellujäämise, ei oleks oluliselt mürgised 
ega põhjustaks loomadele erilist stressi pärast uuritava kemikaali manusta ­
mist kümnel järjestikusel päeval piirdoosiga kuni 1 000 mg/kg/päevas, nagu
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
on märgitud punktides 35 ja 36. Selleks võib kasutada OECD juhenddoku ­
menti (17), milles on määratletud mürgistusele või looma stressile osutavad 
kliinilised tunnused. Kui see on doosivahemiku leidmise uuringus teostatav, võib koed pärast 10-päevast kemikaali manustamist välja lõigata ja kaaluda ligikaudu 24 tundi pärast viimase doosi manustamist. Neid andmeid võib 
seejärel kasutada põhiuurimuses kasutatavate dooside valimise hõlbustami ­
seks.
 
Võrdluskemikaalid ja kandeaine  
38. Võrdluseks kasutatav androgeeniagonist peaks olema 
testosteroonpropionaat (TP), CASi nr 57-82-5. Võrdlus-TP doos võib olla 
kas 0,2 või 0,4 mg/kg/päevas. Võrdluseks kasutatav androgeeniantagonist 
peaks olema flutamiid (FT), CASi nr 1311-84-7. Võrdlus-FT doos peaks olema 3 mg/kg/päevas ja FT tuleks manustada koos võrdlus-TP doosiga.
 
39. Soovitatav on võimaluse korral kõigepealt kaaluda manustamist vesilahu ­
sena või suspensioonina vees. Kuid kuna paljud androgeensed ligandid või 
nende metaboolsed eellased on hüdrofoobsed, kasutatakse kõige sagedamini lahust või suspensiooni õlis (nt maisi, maapähkli-, seesami- või oliiviõli). Uuritava kemikaali võib lahustada minimaalses koguses 95 % etanoolis või 
muus sobivas lahustis ja lahjendada lõpliku töökontsentratsioonini katses 
kasutatavas kandeaines. Lahusti toksilised omadused peaksid olema teada ning need tuleks välja selgitada eraldi kontrollrühmaga, kellele manusta ­
takse üksnes lahustit. Kui uuritavat kemikaali peetakse stabiilseks, võib 
selle lahustamise hõlbustamiseks kasutada ettevaatlikku soojendamist ja 
tugevat segamist. Tuleks määrata uuritava kemikaali stabiilsus kandeaines. Kui uuritav kemikaal on stabiilne kogu uuringu jooksul, võib valmistada uuritava kemikaali lähtealikvoodi ja teha sellest iga päev vajalikud lahjen ­
dused, olles hoolikas, et vältida proovide saastumist või rikkumist.
 
Dooside manustamine  
40. TP-d tuleks manustada nahaaluse süstiga ja FT-d suukaudse sondiga.  
41. Uuritavat kemikaali manustatakse suukaudse sondiga või naha alla tehtava 
süstiga. Manustamistee valimisel tuleb arvestada loomade heaoluga seotud 
kaalutlusi ning uuritava kemikaali füüsikalisi ja keemilisi omadusi. Lisaks tuleb arvestada toksikoloogilisi aspekte, nagu kokkupuuteviisi asjakohasus inimese kemikaaliga kokkupuute seisukohast (nt suukaudne sond vastab 
allaneelamisele, nahaalused süstid — sissehingamisele või imendumisele 
naha kaudu), ning olemasolevaid toksikoloogilist teavet ja andmeid meta ­
bolismi ja kineetika kohta (nt vajadus vältida presüsteemset metabolismi, suurem tõhusus teatava manustamistee korral), enne kui süstimise teel 
saadud positiivse tulemuse põhjal algatatakse ulatuslik pikaajaline uuring.
 
42. Loomadele tuleks doose manustada samal viisil ja sama ajakava kohaselt 10 
järjestikusel päeval umbes 24-tunniste vaheaegadega. Doosi suurust tuleks kohandada iga päev, arvestades igapäevaseid kehamassi määramise 
andmeid. Igal doosi manustamise päeval tuleks kirja panna doosi maht ja 
manustamise kellaaeg. Tuleb jälgida, et ei ületataks maksimaalset doosi, mida on kirjeldatud punktis 35, et andmeid oleks võimalik mõistlikult tõlgendada. Selles suhtes tuleks hoolikalt hinnata kehamassi vähenemist, 
kliinilisi tunnuseid ja muid tähelepanekuid. Tuleks kasutada suukaudset 
sondi, maosondi või sobivat intubatsioonikanüüli. Vedeliku suurim kogus,
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
mida saab ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Tuleb 
järgida kohalikke loomakaitse eeskirju, kuid lahuse maht ei tohiks ületada 
5 ml kehamassi kg kohta, välja arvatud vesilahuse puhul, kus võib kasutada mahtu kuni 10 ml kehamassi kg kohta. Nahaaluse süstiga manustamisel tuleks doose manustada selja abaluu- või nimmepiirkonda steriilse nõelaga 
(kaliiber näiteks 23 või 25) ja tuberkuliinisüstlaga. Soovi korral võib süsti ­
miskoha puhtaks raseerida. Registreerida tuleks lahuse kaod, süstekohast väljaimbumine või doosi mittetäielik manustamine. Päevas rotile süstitav vedelikukogus ei tohiks ületada 0,5 ml kehamassi kg kohta.
 
Androgeeniagonistide katsete tegemise meetodid  
43. Androgeeniagonistide katsetes on kandeaine negatiivne kontroll ja TP-d 
saav rühm on positiivse kontrolli rühm. Androgeeniagonistile omast bioloo ­
gilist toimet kontrollitakse uuritava kemikaali manustamisega katserühma ­
dele valitud doosis 10 järjestikuse päeva jooksul. Kemikaali saanud katse ­
rühma loomade paljunemisfunktsiooniga seotud viie koe massi võrreldakse 
kandainet saanud loomade vastavate kudede massiga, et leida statistiliselt 
oluline massi suurenemine.  
Androgeeniantagonistide ja 5 α-reduktaasi inhibiitorite katsete tegemise 
meetodid  
44. Androgeeniantagonistide ja 5 α-reduktaasi inhibiitorite katsetes on TP-d saav 
rühm negatiivne kontroll ja rühm, mille loomadele manustatakse korraga 
TP-d ja FT-d, on positiivne kontroll. Androgeeniantagonistide ja 5 α-reduk­
taasi inhibiitoritega seotud bioloogilist toimet kontrollitakse TP võrdlusdoosi ja uuritava kemikaali manustamisega 10 järjestikuse päeva jooksul. TP-d ja kemikaali saanud katserühma loomade paljunemisfunktsiooniga seotud viie 
koe massi võrreldakse ainult TP-d saanud loomade vastavate kudede 
massiga, et leida statistiliselt oluline massi vähenemine.
 
VAATLUSED  
Kliinilised vaatlused  
45. Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas ja sagedamini, kui 
ilmneb toksilisuse märke. Vaatlusi oleks soovitatav teha iga päev samal ajal, 
võttes arvesse oodatava maksimaalse mõju avaldumise aega pärast doosi 
manustamist. Kõigi loomade puhul tuleks jälgida suremust, haigestumust ja selliseid kliinilisi tunnuseid nagu käitumise, naha, karvkatte, silmade ja limaskestade muutused, eritiste esinemine, autonoomse närvisüsteemi aktiiv ­
suse muutused (nt pisaravool, turris karv, pupilli suurus, muutunud hinga ­
mine).
 
46. Surnuna leitud loomad tuleks kõrvaldada ning hävitada ilma täiendava 
andmete analüüsita. Iga looma surm enne lahangut tuleks kanda katsepro ­
tokolli koos surma võimalike põhjustega. Kõik suremas olevad loomad tuleks humaanselt surmata. Iga suremas olnud ja hiljem eutanaasia teel 
surmatud loom tuleks kanda katseprotokolli ja esitada haiguse võimalikud 
põhjused.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Kehamass ja sööda tarbimine  
47. Kõiki loomi tuleks kaaluda iga päev täpsusega 0,1 g, alustades hetkest enne 
esimese doosi manustamist, st kui loomad on juba jagatud rühmadesse. 
Lisaks võib mõõta dooside manustamise aja jooksul igas puuris tarbitud sööda koguse söötmisseadmete kaalumisega. Sööda tarbimise tulemused väljendatakse grammides ühe roti kohta päevas.
 
Lahkamine ning kudede ja organite massi mõõtmine  
48. Ligikaudu 24 tundi pärast uuritava kemikaali viimase doosi manustamist 
tuleks rotid humaanselt surmata ja lasta verest tühjaks joosta vastavalt katset 
tegeva labori tavalisele korrale ning teha lahkamine. Humaanse surmamise meetod tuleks esitada katseprotokollis.
 
49. Ideaaljuhul tuleks kõikide rühmade liikmete lahkamised teha juhuslikus 
järjekorras, et vältida kõige alguses või kõige lõpus ühe või teise rühma 
liikmete lahkamist, mis võiks andmeid mõjutada. Kõik lahkamise tähelepa ­
nekud, nagu patoloogilised muutused või nähtavad kahjustused, tuleks üles märkida ja esitada protokollis.
 
50. Viis androgeenisõltuvat kude (VP, SV, LABC, COW, GP) tuleks kaaluda. 
Need koed tuleks välja lõigata, hoolikalt vabastada liigsetest nende külge 
kinnitunud kudedest ja rasvast ning määrata nende värske (fikseerimata) 
mass. Iga kude tuleks käidelda eriti hoolikalt, et vältida vedelike kaotust ja kuivamist, mis võib põhjustada suuri vigu ja varieeruvust, kuna väheneb registreeritav mass. Mitmed koed võivad olla väga väiksed või raskesti välja 
lõigatavad ja see tekitab varieeruvust. Seepärast on oluline, et paljunemis ­
funktsiooniga seotud kudede eraldamist sooritav isik tunneks nende kudede eraldamise tavalist korda. Standardse töökorra (SOP) käsiraamatu saab OECD-lt (21). Uuringu tulemuste võimalikku varieeruvust saab vähendada 
SOP juhendialase hoolika koolitusega. Ideaaljuhul peaks teatava konkreetse 
koe eraldamisi tegema sama isik, et vähendada isikutevahelisi erinevusi kudede töötlemisel. Kui see ei ole võimalik, peaks lahkamine olema korral ­
datud nii, et iga lahkaja eraldab teatavat kude kõigi katserühmade looma ­
delt, mitte nii, et üks isik eraldab kõik koed kontrollrühma loomadelt ja 
teine isik doosirühmade loomadelt. Iga paljunemisfunktsiooniga kude tuleks ilma kuivaks pühkimata kaaluda 0,1 mg täpsusega ja iga looma kudede 
massid tuleb registreerida.
 
51. Mitmed koed võivad olla väga väiksed või raskesti välja lõigatavad ja see 
tekitab varieeruvust. Varasema tööga on leitud variatsioonikordajate (CV) 
vahemik, mis näib olevat erinev ja näib sõltuvat labori pädevuse tasemest. Mõnel juhul on täheldatud kudede, nagu VP ja COW, absoluutmasside suuri erinevusi samas konkreetses laboris.
 
52. Soovi korral võib määrata ka maksa massi, mõlema neeru massi (koos) ja 
mõlemate neerupealiste massi (koos). Koed tuleks ka sel puhul vabastada 
nendega ühendatud sidekirmetest ja rasvast. Maks tuleks kaaluda täpsusega 0,1 g, mõlemad neerud ja mõlemad neerupealised — täpsusega 0,1 mg ning need andmed registreerida. Maksa, neerusid ja neerupealisi ei mõjuta mitte 
üksnes androgeenid; need elundid annavad kasulikku teavet ka süsteemse 
mürgisuse kohta.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Soovi korral võib mõõta luteiniseeriva hormooni (LH), folliikuleid stimu ­
leeriva hormooni (FSH) ja testosterooni (T) sisalduse seerumis. Testosteroo ­
nisisaldust seerumis on kasulik määrata siis, kui uuritav kemikaal põhjustab testosterooni metabolismi maksas ja vähendab seerumi testosteroonisisal ­
dust. Kui selliseid T andmeid ei ole, võib näida, et mõju avaldub antiand ­
rogeense mehhanismi kaudu. LH tase annab teavet antiandrogeeni omaduse 
kohta mitte ainult vähendada elundite massi, vaid mõjutada ka hüpotala ­
muse-ajuripatsi funktsioone, mis pikaajalises katses võib tekitada munandi ­
kasvajaid. FSH on oluline hormoon spermatogeneesi jaoks. Võib määrata ka 
seerumi T4 ja T3 sisalduse; see võib anda kasulikku lisateavet kemikaali 
võime kohta häirida kilpnäärme homöostaasi. Kui tehakse hormoonide mõõtmisi, tuleks rotid enne lahkamist tuimastada ja võtta neilt veri südame punktsiooniga; narkoosimeetod tuleks valida hoolikalt, et mitte mõjutada 
hormoonitaseme mõõtmisi. Seerumi valmistamise meetod, radioimmuunana ­
lüüsi- või muude mõõtmiskomplektide päritolu ja tulemused tuleks regis ­
treerida. LH ja T sisaldus esitatakse ng-des seerumi ml kohta.
 
54. Kudede eraldamisel tuleb tugineda üksikasjalikele fotodega lahkamisjuhen ­
ditele, mis on avaldatud valideerimisprogrammi osana kui lisamaterjal (21). 
Korea toidu- ja ravimiameti veebisaidil on kättesaadav ka lahkamist käsitlev video (22).
 
— Looma keha pannakse lauale kõhuga ülespoole ja tehakse kindlaks, kas 
suguti eesnahk on eraldunud suguti peast. Kui see on nii, tõmmatakse 
eesnahk tagasi, eemaldatakse suguti pea ja kaalutakse see 0,1 mg täpsu ­
sega; mass registreeritakse.  
— Avatakse kõhunahk ja kõhuõõne sein, paljastatakse siseelundid. Kui 
tuleb määrata soovi korral määratavate elundite mass, eemaldatakse ja 
kaalutakse maks täpsusega 0,1 g, eemaldatakse magu ja soolestik, eemaldatakse ja kaalutakse neerud (koos) ja neerupealised (koos) täpsu ­
sega 0,1 mg. Sellise lahkamisega paljastatakse kusepõis ja jõutakse 
isaslooma paljunemisfunktsiooniga seotud kudede eraldamiseni.
 
— Ventraalse eesnäärme eraldamiseks eraldatakse kusepõis kõhulihaste 
kihist, milleks lõigatakse läbi sidekude piki keskjoont. Kusepõis nihu ­
tatakse ettepoole seemnepõiekeste suunas, millega paljastatakse 
ventraalse eesnäärme ( ventral prostate , VP) vasak ja parem sagar 
(mida katab rasvakiht). Rasv pühitakse ettevaatlikult VP vasakult ja paremalt sagaralt. VP parem sagar tõstetakse kusitilt ja eraldatakse sagar kusitist. Hoides VP paremat sagarat, tõstetakse VP vasak sagar 
kusitilt ja eraldatakse; kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja registreeritakse 
mass.
 
— Seemnepõiekeste ja koagulatsiooninäärmete ( seminal vesicles plus 
coagulating glands , SVCG) eraldamiseks lükatakse põis saba poole, 
millega paljastatakse seemnejuhad ning SVCG parem ja vasak sagar. 
Vedeliku lekke ärahoidmiseks pannakse verejooksu sulgemise klamber SVCG lähtekohale, kus seemnejuha ühineb kusitiga. SVCGd eraldatakse ettevaatlikult, hoides klambrit oma kohal, lõigatakse ära rasv ja 
manused, pannakse teadaoleva massiga kaalumisnõusse, eemaldatakse 
klamber, kaalutakse 0,1 mg täpsusega ja registreeritakse mass.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Selleks et eraldada  levator ani  ja bulbocavernosus  (LABC) lihased, 
paljastatakse suguti alus ja lihased. LA lihased ümbritsevad käärsoolt, 
samal ajal kui eesmised LA ja BC lihased on kinnitunud suguti sibulale. Perianaalse piirkonna nahk ja manused, mis ulatuvad peenise lähteko ­
hast kuni päraku eesmise otsani, eemaldatakse. BC lihased eraldatakse 
järk-järgult suguti sibulast ja kudedest. Käärsool lõigatakse pooleks ja 
nüüd saab eraldada ja kõrvaldada kogu LABC. LABC tuleks puhastada rasvast ja manustest, kaaluda 0,1 mg täpsusega ja registreerida mass.
 
— Kui LABC on eemaldatud, tulevad nähtavale ümmargused Cowperi või 
bulbouretraalnäärmed (COW) suguti sibula lähtekoha juures, veidi selja poole. Lõigata tuleb hoolikalt, et vältida õhukese kesta läbitorkamist ja 
vedeliku väljavoolu. COW (koos) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja regis ­
treeritakse mass.
 
— Lisaks, kui lahkamise või kudede eraldamise ajal voolas mõnest näär ­
mest vedelikku välja, tuleks see registreerida.  
55. Kui ühe kemikaali hindamiseks on vaja lahata rohkem loomi, kui ühe 
päevaga on võimalik lahata, võib uuringu alguse jaotada kahele järjestiku ­
sele päevale, millega ka lahkamine ja sellega seotud tööd jaotuvad kahele 
päevale. Kui töö jaotatakse niimoodi järkudesse, tuleks ühel päeval kasutada pooled iga doosirühma loomadest.
 
56. Kehad tuleks pärast lahangut kõrvaldada sobival viisil.  
PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmed  
57. Andmed tuleks esitada eraldi iga looma kohta (kehamass, paljunemisfunkt ­
siooniga seotud kudede mass, soovi korral tehtud täiendavad mõõtmised, 
muud toimed ja tähelepanekud) ja iga loomarühma kohta (arvutatakse 
kõikide mõõtmistulemuste keskväärtused ja standardhälbed). Andmed tuleb koondada tabelisse. Tuleks esitada loomade arv katse alguses, katse käigus surnult või mürgistuse tunnustega leitud loomade arv, täheldatud 
toksilisuse tunnuste kirjeldus, sealhulgas tunnuste ilmumise aeg, tunnuste 
kestus ja raskus.
 
58. Lõpp-protokollis tuleks esitada järgmine.  
Uurimislabor:  
— nimi ja asukoht;  
— uuringu juht, muud töötajad ja nende kohustused uuringu käigus;  
— uuringu alguse ja lõpetamise kuupäev, st uuritava kemikaali manusta ­
mise esimene päev ja viimane lahkamispäev.  
Uuritav kemikaal:  
— allikas, partii number, nimetus, puhtus, tarnija täielik aadress ja uuritava 
kemikaali täielik iseloomustus;  
— füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;  
— lahjenduste valmistamise meetod, sagedus ja lahuste hoiutingimused;  
— kõik andmed, mis on saadud püsivuse kohta;  
— kõik manustamislahuste või -suspensioonide analüüsid.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Kandeaine:  
— kandeaine iseloomustus (nimetus, tarnija ja partii nr);  
— kandeaine valimise põhjendus (kui kandeaine on muu kui vesi).  
Katseloomad ja nende pidamise tingimused:  
— kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;  
— päritolu või tarnija, kaasa arvatud täielik aadress;  
— tarnitud loomade arv ja vanus;  
— pidamistingimused (temperatuur, valgustus jne);  
— sööt (nimetus, tüüp, tarnija, partii number, koostis ja, kui on teada, 
fütoöstrogeenide sisaldus);  
— allapanu (nimetus, tüüp, tarnija ja koostis);  
— puuridesse paigutamise tingimused ja loomade arv puuris.  
Katse tingimused:  
— vanus kastreerimise ajal ja kohanemise kestus pärast kastreerimist;  
— iga looma mass katse alguses (täpsusega 0,1 g);  
— kasutatud randomiseerimismeetod ning kandeaine rühma, võrdlusrühma, 
uuritava kemikaali rühmadesse ja puuridesse määramise andmed;  
— iga rühma loomade kehamassi keskväärtus ja standardhälve igal kaalu ­
mispäeval kogu uuringu kestel;  
— doosi valimise põhjendused;  
— uuritava kemikaali manustamise tee ja kokkupuuteviisi valiku 
põhjendus;  
— antiandrogeensuse katse tegemisel TP manustamine (doos ja maht);  
— uuritava kemikaali manustamine (doos ja maht),  
— manustamise aeg;  
— lahkamise kord, sealhulgas veretustamise vahendid ja kasutatud 
anesteetikumid;  
— seerumianalüüside tegemise korral tuleks esitada meetodi üksikasjad. 
Näiteks, kui kasutatakse radioimmuunananalüüsi (RIA), tuleks esitada 
järgmine: RIA tegemise kord, RIA komplektide tootja, RIA komplektide aegumise kuupäev, sädearvestuse kord ja standardimine.
 
Tulemused  
— Igapäevased tähelepanekud iga looma kohta dooside manustamise ajal, 
sealhulgas:  
— kehamass (täpsusega 0,1 g);  
— kliinilised tunnused (kui neid esineb);  
— kõik andmed ja tähelepanekud sööda tarbimise kohta.  
— Lahkamise ajal tehtud tähelepanekud iga looma kohta, sealhulgas:  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— lahkamise kuupäev;  
— doosirühm;  
— looma identifitseerimisnumber;  
— lahkaja;  
— lahangu ja kudede eraldamise kellaaeg;  
— looma vanus;  
— lõplik kehamass lahkamise ajal; märkida iga statistiliselt oluline suure ­
nemine või vähenemine;  
— loomade veretustamise ja lahkamise järjekord;  
— viie androgeenisõltuva sihtkoe mass;  
— ventraalne eesnääre (täpsusega 0,1 mg);  
— seemnepõiekesed ja koagulatsiooninäärmed, koos vedelikuga (koos, 
täpsusega 0,1 mg);  
— levator ani  ja bulbocavernosus  lihaste kompleks (täpsusega 0,1 mg);  
— Cowperi näärmed (märgkaal, koos, täpsusega 0,1 mg);  
— peenise pea (märgkaal täpsusega 0,1 mg);  
— soovi korral määratavate kudede kaal, kui määrati:  
— maks (täpsusega 0,1 g);  
— neerud (koos, täpsusega 0,1 mg);  
— neerupealised (koos, täpsusega 0,1 mg);  
— Üldised märkused ja kommentaarid  
— Seerumihormoonide analüüsid, kui need tehti:  
— seerumi luteiniseeriv hormoon (soovi korral; nanogrammi seerumi 
ml-s) ja  
— seerumi testosteroon (soovi korral; nanogrammi seerumi ml-s).  
— Üldised märkused ja kommentaarid  
Andmete kokkuvõte  
Andmed tuleks esitada kokkuvõtliku tabelina, milles näidatakse valimi 
suurus iga rühma puhul, keskväärtus ja selle standardviga või standardhälve. 
Tabelites tuleks esitada surmajärgne kehamass, kehamassi muutus dooside 
manustamise algusest kuni lahkamiseni, paljunemisfunktsiooniga seotud kudede mass ja soovi korral määratud muude elundite mass.
 
Tulemuste arutelu  
Tulemuste analüüs  
59. Lahkamise ajal määratud kehamassi ja organite massi tuleks statistiliselt 
analüüsida ja leida näitajad nagu dispersiooni homogeensus, mille jaoks on andmeid vaja sobivalt teisendada. Doosirühmi tuleks võrrelda kontroll ­
rühmaga, kasutades selliseid meetodeid nagu ANOVA, millele järgnevad 
paariviisilised võrdlused (nt Dunnetti ühepoolne test) ja statistilise erinevuse kriteerium, näiteks p ≤ 0,05. Tuleb kindlaks teha rühmad, milles on saavu ­
tatud statistiline olulisus. Elundite suhtelisi masse kehamassi suhtes tuleks 
siiski vältida, kuna selline andmetöötlus tugineb vääradele statistilistele 
eeldustele.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Androgeeniagonismi puhul tuleks kontrollrühmale manustada ainult 
kandeainet. Uuritava kemikaali toimimisviisi omadused võivad põhjustada 
eri kudedel suhteliselt erinevat toimet; näiteks trenboloon, mida ei saa 5 α- 
taandada, avaldab tugevamat mõju LABC-le ja GP-le kui TP. Statistiliselt olulist (p ≤ 0,05) massi suurenemist viiest androgeenisõltuvast sihtkoest 
(VP, LABC, GP, CG ja SVCG) vähemalt kahe puhul tuleks lugeda andro ­
geeniagonisti tuvastamise mõttes positiivseks tulemuseks ja kõigi sihtku ­
dede puhul peaks olema näha vähemalt mingisugust kasvu. Kõikide isassu ­
guorganite kudede reageerimise kombineeritud hindamiseks võib kasutada 
mitmest korrelatsioonanalüüsi. See võib tõsta analüüsi kvaliteeti, eelkõige 
juhtudel, kui ainult ühe koe reaktsioon on statistiliselt oluline.
 
61. Androgeeniantagonismi puhul tuleks kontrollrühmale manustada ainult 
võrdlusandrogeeni (ainult testosteroonpropionaati). Uuritava kemikaali 
toimimisviisi omadused võivad põhjustada eri kudede suhteliselt erinevat 
reageerimist; näiteks 5 α-reduktaasi inhibiitorid, nagu finasteriid, mõjutavad 
tugevamini ventraalset eesnääret kui muid kudesid, võrreldes tugevate androgeeniretseptori antagonistidega nagu flutamiid. Statistiliselt olulist (p 
≤ 0,05) massi vähenemist viiest androgeenisõltuvast sihtkoest (VP, LABC, 
GP, CG ja SVCG) vähemalt kahe puhul, võrreldes ainuüksi TP-d saanud kontrollrühmaga, tuleks lugeda androgeeniantagonisti tuvastamise mõttes positiivseks tulemuseks ja kõigi sihtkudede puhul peaks olema näha vähe ­
malt mingil määral vähenenud kasvu. Kõikide isassuguorganite kudede 
reageerimise kombineeritud hindamiseks võib kasutada mitmest korrelat ­
sioonanalüüsi. See võib tõsta analüüsi kvaliteeti, eelkõige juhtudel, kui 
ainult ühe koe reaktsioon on statistiliselt oluline.
 
62. Andmed tuleks esitada kokkuvõtliku tabelina: keskväärtus, keskväärtuse 
standardviga (sobib ka standardhälve) ja iga rühma valimi suurus. Samuti tuleks lisada üksikandmete tabelid. Tuleks uurida kontrollrühma konkreet ­
seid väärtusi, keskväärtust, keskväärtuse viga (standardhälvet) ja 
variatsioonikoefitsienti (CV), et teha kindlaks, kas need vastavad varase ­
mate väärtustega kooskõla kriteeriumidele. CV väärtused, mis ületavad tabelis 1 (vt punktid 25 ja 26) esitatud CV väärtusi iga organi massi 
puhul, peaksid näitama, kas andmete lugemisel või registreerimisel on 
tehtud vigu või kas labor ei ole veel saavutanud androgeenisõltuvate kudede väljalõikamiseks vajalikku meisterlikkust ja vaja oleks täiendavat koolitust või harjutamist. Üldiselt on CV-d (saadakse standardhälbe jagamisel organi 
massi keskväärtusega) eri laborite ja eri uuringute tulemuste võrdlemisel 
korratavad. Esitatud andmed peaksid hõlmama vähemalt järgmist: ventraalse eesnäärme, seemnepõiekeste,  levator ani  ja bulbocavernosus  lihaste, 
Cowperi näärmete, suguti pea, maksa ja keha mass ning kehamassi muutus 
dooside manustamise algusest kuni lahkamiseni. Võib esitada ka parandatud 
andmed, millesse on kovariatsiooni abil tehtud kehamassi muutumist arves ­
tavad parandid, kuid see ei tohiks asendada korrigeerimata andmete esita ­
mist. Lisaks sellele, kui eesnaha eraldumist ( preputial separation , PPS) 
mõnes rühmas ei esine, tuleks registreerida PPS ja võrrelda seda statistiliselt 
olukorraga kontrollrühmas, kasutades Fisheri täpset testi.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Arvutisse sisestatud andmete kontrollimisel võrdluses originaalandmete 
lehtedega tuleb hoolikalt uurida organite kaalu väärtusi, mis ei ole bioloo ­
giliselt usutavad või erinevad rohkem kui kolm standardhälvet vastava katserühma keskväärtusest; sellised andmed tuleb võib-olla välja jätta kui tõenäolised registreerimisvead.
 
64. Sageli on uuringu tulemuste võrdlemine OECD CV väärtustega (tabel 1) 
tõlgendamise oluline etapp, mis näitab uuringu tulemuste kehtivust. Laboris 
tuleks säilitada võrdlusrühmade kohta kogutud varasemaid andmeid. Samuti 
tuleks laboris säilitada andmed positiivsete võrdluskemikaalide nagu TP ja FT toime kohta. Laborid võivad perioodiliselt testida ka teadaolevalt nõrkade androgeeniagonistide ja -antagonistide toimet ning säilitada need 
andmed. Neid andmeid võib võrrelda kättesaadavate OECD andmetega selle 
kontrollimiseks, et labori meetodid annavad piisava statistilise täpsuse ja võimsuse.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
1. liide  
MÕISTED  
Androgeenne  – termin, millega kirjeldatakse positiivset mõju androgeenisõltu ­
vate kudede kasvule.  
Antiandrogeenne  – kemikaali võime alla suruda testosteroonpropionaadi toimet 
imetajate organismile.  
Doos  – manustatav uuritava kemikaali kogus. Hershbergeri biokatse puhul 
väljendatakse doosi uuritava kemikaali massina katselooma kehamassi ühiku kohta päevas (näiteks mg kehamassi kg kohta päevas).
 
Doseerimine  – üldmõiste, mis hõlmab doosi, dooside manustamise sagedust ja 
kestust.  
Kemikaal  – aine või segu.  
Spetsiifilisus  – katsemeetodi võime õigesti kindlaks määrata kemikaale, millel ei 
ole katsega kontrollitavat omadust.  
Suremas olev  – termin, millega kirjeldatakse surmaeelses seisundis looma.  
Sünnijärgne päev X  – X. elupäev pärast sünnikuupäeva.  
Sünnikuupäev  – sünnijärgne päev 0 (PND 0).  
Tundlikkus  – katsemeetodi võime õigesti kindlaks määrata kemikaale, millel on 
katsega kontrollitav omadus.  
Uuritav kemikaal  – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. 
Valideerimine  – teaduslik menetlus, mille eesmärk on iseloomustada katsemee ­
todi läbiviimise nõudeid ning tõendada meetodi usaldusväärsust ja asjakohasust 
konkreetse eesmärgi saavutamiseks.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
2. liide
  
VMG mamm: imetajatega tehtavate katsete valideerimist ja hindamist juhtiv rühm
 MÄRKUSED RAAMISTIKU JUURDE  
Märkus 1:  kõigile tasemetele on võimalik siseneda ja kõigilt tasemetelt on 
võimalik väljuda; see oleneb sellest, millist teavet on vaja saada 
ohtude ja riskide hindamiseks.  
Märkus 2:  tasemel 5 peaks ökotoksikoloogia hõlmama näitajaid, mis näitavad 
kahjuliku mõju mehhanisme ja võimalikku kahju elanikkonna jaoks.  
Märkus 3:  kui mitme näitaja kohta tulemusi andev katsemudel hõlmab näitajaid, 
mida määratakse ühe näitaja kohta tulemusi andva katsega, peaks 
nimetatud mudel asendama ühe näitaja kohta tulemusi andva katsed.  
Märkus 4:  iga kemikaali tuleks eraldi hinnata, võttes arvesse kogu olemasolevat 
teavet ja pidades silmas raamistiku tasemete funktsiooni.  
Märkus 5:  praegust raamistikku ei tuleks käsitleda kõike hõlmavana. Tasemetel 
3, 4 ja 5 hõlmab raamistik katseid, mis on juba kättesaadavad või valideerimine on käimas. Viimast asjaolu arvestades on need ajutiselt 
lisatud. Kui need on välja töötatud ja valideeritud, saab need ametli ­
kult lisada raamistikku.
 
Märkus 6:  raamistikust ei tohiks niimoodi aru saada, et tasemel 5 on üksnes 
lõplikud katsed. Arvestatakse, et osutatud tasemel olevad katsed aitavad kaasa üldisele ohtude ja riskide hindamisele.
 
KIRJANDUS  
1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and 
antiandrogenic activity in castrate-immature male rats. Vt:  Current Proto ­
cols in Toxicology  16.9.1–16.9.15. J Wiley and Sons Inc.  
4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testos ­
terone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental 
Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N  o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30.  
5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing 
and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate 
Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on 
Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671–8.
 
9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413–422.  
10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306- 
1314.  
11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38–44.  
12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113–119.
 
13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175–180.  
14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. Vt: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151–220.
 
16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p 38.  
17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92–64-12367-9, Paris.  
19) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.
 
22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hersh ­
berger assay procedure, including a dissection video. http://rndmoa.kfda. ­
go.kr/endocrine/reference/education_fr.html.  
23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties. Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
26) Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 
2010, teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT 
L 276, 20.10.2010, lk 33).  
27) Käesoleva lisa järgmised peatükid:  
B.1a. Äge suukaudne mürgisus — kindla annuse protseduur  
B.1b. Äge suukaudne mürgisus — ägeda mürgisusastme meetod  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56.  LAIENDATUD ÜHE PÕLVKONNA REPRODUKTIIVTOKSILI ­
SUSE UURING  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 443 (2012). 
See põhineb Rahvusvahelise Bioteaduste Instituudi (Life Science Institute, ILSI), Tervise- ja Keskkonnateaduste Instituudi (Health and Environmental Sciences Institute, HESI), põllumajanduskemikaalide ohutuse hindamise 
(Agricultural Chemical Safety Assessment, ACSA) tehnilise komitee ette ­
panekul võtta aluseks elujärgu F
 1 laiendatud ühe põlvkonna reproduktiiv ­
toksilisuse uuring, mille on avaldanud Cooper  et al ., 2006 (1). Uuringu 
eeskirja on täiustatud ja selgitatud,et tagada paindlikkust ja rõhutada, et 
oluline on alustada olemasolevatest teadmistest ja kasutada uuringu suuna ­
miseks ja kohandamiseks elusloomadega tehtud tähelepanekuid. Käesolevas katsemeetodis on üksikasjalikult kirjeldatud laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuringu läbiviimist. Katsemeetodis kirjeldatakse 
kolme F
 1 -loomade kohorti:  
kohort 1: hinnatakse paljunemist ja arengut iseloomustavaid näitajaid; seda 
kohorti võib laiendada, et hõlmata F  2 -põlvkond;  
kohort 2: hinnatakse kemikaaliga kokkupuute võimalikku mõju arenevale 
närvisüsteemile;  
kohort 3: hinnatakse kemikaaliga kokkupuute võimalikku mõju arenevale 
immuunsüsteemile.  
2. Otsused selle kohta, kas hinnata teist põlvkonda ja jätta ära arenguhäireid 
põhjustava neurotoksilisuse kohort ja/või arenguhäireid põhjustava immu ­
notoksilisuse kohort, peaksid põhinema olemasolevatel teadmistel uuritava kemikaali kohta, samuti mitmesuguste reguleerivate asutuste vajadustel. Katsemeetodi eesmärk on anda üksikasjalist teavet selle kohta, kuidas 
uuringut võib teostada ja kuidas iga kohorti tuleks hinnata.
 
3. Otsustamise kord, millise sisekriteeriumi põhjal algatatakse 2. põlvkonna 
uuring, on kirjeldatud OECD suunisdokumendis 117 (39) reguleerivate 
asutuste jaoks, kes kasutavad sisekriteeriume.  
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
4. Laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuringu peamine eesmärk 
on hinnata konkreetseid eluetappe, mida ei hõlma muud tüüpi mürgisuse uuringud, ja uurida toimet, mis võib ilmneda kemikaaliga sünnieelse ja -järgse kokkupuute puhul. Paljunemisfunktsiooniga seotud näitajate uurimi ­
seks on kavandatud, et esimese etapina tuleb võimaluse korral kasutada 
korduvdoosi uuringutest saadud teavet (sh reproduktiivtoksilisuse sõeluu ­
ringud, nagu OECD katsejuhend 422 (32)) või kiireid sisesekretsioonisüs ­
teemi häirivate kemikaalide sõelkatseid (nt uterotroofne katse, katsemeetod 
B.54 (36), ja Hershbergeri katse, katsemeetod B.55 (37)), et teha kindlaks 
mõju isas- ja emasloomade reproduktiivorganitele. See võib hõlmata sper ­
matogeneesi (munandite histopatoloogia) isasloomadel ning innatsükleid, folliikulite loendamist või munarakkude valmimist ja munasarjade kahjus ­
tusi (histopatoloogia) emasloomadel. Laiendatud ühe põlvkonna reproduk ­
tiivtoksilisuse uuring võimaldab leida paljunemisega seotud näitajaid, mille määramiseks on vaja isasloomade suhtlemist emasloomadega, emasloomade vastastikust toimet areneva lootega ning emasloomade suhtlemist järglaste ja 
F
 1 -põlvkonnaga kuni ajani pärast seksuaalse küpsuse saabumist (vt käeso ­
levat katsemeetodit toetav OECD juhenddokument nr 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata kemikaaliga sünnieelse ja 
-järgse kokkupuute mõju arengule, samuti selleks, et põhjalikult hinnata 
süsteemset toksilisust tiinete ja imetavate emasloomade, noorte ja täiskas ­
vanud järglaste puhul. Katsega tahetakse üksikasjalikult uurida peamisi arenguga seotud näitajaid, nagu järglaste eluvõime, vastsündinute tervisesei ­
sund, sünniaegsed arengunäitajad ning füüsiline ja funktsionaalne areng 
kuni täisikka jõudmiseni, et teha kindlaks konkreetsed sihtelundid järglaste puhul. Lisaks annab uuring teavet uuritava kemikaali mõju kohta täiskas ­
vanud isas- ja emasloomade reproduktiivsüsteemi kahjustuste ja toimimise 
kohta või kinnitab sellist teavet. Muu hulgas vaadeldakse järgmisi näitajaid: 
gonaadide toimimine, innatsükkel, spermatosoidide küpsemine munandima ­
nustes, paaritumiskäitumine, viljastumine, tiinus, poegimine ja imetamine. Lisaks võimaldab arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse ja arenguhäi ­
reid põhjustava immuuntoksilisuse kohta saadav teave iseloomustada mõju 
nimetatud süsteemidele. Nende katsetega saadavad andmed peaksid võimal ­
dama määrata täheldatavat kahjulikku toimet mitteavaldava doosi (NOAEL), vähima täheldatavat kahjulikku toimet avaldava 
doosi (LOAEL) ja/või võrdlusdoosid mitmesuguste näitajate puhul ning 
võimaldama selgitada varasemates korduvdoosi uuringutes täheldatud mõju või aitama kavandada edasisi uuringuid.
 
6. Katse-eeskirja skeem on esitatud joonisel 1. Uuritavat kemikaali manusta ­
takse erinevates doosides pidevalt mitmele suguküpsete isas- ja emasloo ­
made rühmale. Vanemate (P) põlvkonna katseloomadele manustatakse kemikaali teatava aja jooksul enne paaritumist (aeg valitakse uuritava kemi ­
kaali kohta teadaoleva teabe alusel, kuid vähemalt kaks nädalat) ja kahenä ­
dalase paaritumisperioodi ajal. P isasloomadele manustatakse kemikaali 
vähemalt kuni F
 1 -järglaste võõrutamiseni. Kemikaali tuleks neile manustada 
vähemalt 10 nädala jooksul. Kemikaali võib manustada ka kauem, kui on vaja selgitada mõju paljunemisele. P-põlvkonna emasloomadele jätkatakse 
kemikaali manustamist tiinuse ja imetamise ajal kuni katse lõpetamiseni 
pärast järglaste võõrutamist (st 8–10 nädalat). F
 1 -järglastele manustatakse 
uuritavat kemikaali edasi võõrutusperioodist kuni täiskasvanuks saamiseni. Kui hinnatakse teist põlvkonda (vt OECD juhenddokument nr 117 (39)), 
jätkatakse F
 1 -järglastele kemikaali manustamist kuni F  2 -põlvkonna võõruta ­
miseni või uuringu lõpetamiseni.  
7. Kõikidel loomadel tehakse kliinilisi vaatlusi ja patoloogilisi uuringuid 
mürgistuse sümptomite tuvastamiseks; erilist tähelepanu pööratakse isas- 
ja emasloomade reproduktiivsüsteemi rikkumatusele ja selle toimimisele, 
samuti järglaste tervisele, kasvule, arengule ja toimimisele. Võõrutamise ajal määratakse valitud järglased allrühmadesse (kohordid 1–3, vt punktid 33 ja 34 ning joonis 1) edasiseks uurimiseks, mis hõlmab seksuaalse küpse ­
mise, suguelundite struktuurikahjustuste ja toimimise, neuroloogiliste ja 
käitumuslike näitajate ning immuunfunktsioonide uurimist.
 
8. Uuringu tegemisel järgitakse juhtpõhimõtteid ja kaalutlusi, mis on esitatud 
OECD juhenddokumendis nr 19 ohutuse hindamisel kasutatavatel katseloo ­
madel avalduvate kliiniliste tunnuste kui humaansete näitajate kindlakstege ­
mise, hindamise ja kasutamise kohta (34).  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Kui on olemas piisav arv uuringuid, et teha kindlaks uue uurimismeetodi 
mõju, vaadatakse katsemeetod läbi ja vajaduse korral muudetakse, et võtta 
arvesse saadud kogemused.  
Joonis 1  
Laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuringu skeem
  
MEETODI KIRJELDUS JA KATSE ETTEVALMISTAMINE  
Loomad  
Loomaliigi ja -liini valimine  
10. Reproduktiivtoksilisuse katses kasutatava loomaliigi valimist tuleks hooli ­
kalt kaaluda ja võtta arvesse kogu kättesaadav teave. Kuna rotiga on olemas väga palju taustaandmeid ja on võimalikud võrdlused üldise mürgisuse 
katsetega, on eelistatud liigiks tavaliselt rott ning käesolevas meetodi kirjel ­
duses esitatud kriteeriumid ja soovitused kehtivad roti kohta. Kui kasuta ­
takse muud liiki, tuleks seda põhjendada ja teha asjaomased muudatused katse-eeskirjas. Liine, kellel on madal sigivus või kellel teatakse olevat 
iseeneslikke arenguhäireid, ei tohiks kasutada.
 
Vanus, kehamass ja katses kasutamise kriteeriumid  
11. Vanematena ( parent , P) tuleks kasutada terveid loomi, keda ei ole varem 
katsetes kasutatud. Tuleks uurida nii isas- kui ka emasloomi ja emasloomad peaksid olema poegimata ja mitte tiined. P-loomad peaksid olema saavu ­
tanud suguküpsuse, olema dooside manustamise alguses sarnase kehamas ­
siga (samast soost loomade hulgas), olema paaritamise ajal sarnases vanuses 
(ligikaudu 90 päeva) ning olema tüüpilised uuringus kasutatava loomaliigi ja -liini jaoks. Loomadel tuleks pärast saabumist lasta vähemalt 5 päeva aklimatiseeruda. Loomad määratakse juhuvaliku alusel kontroll- ja doosi ­
rühmadesse niimoodi, et rühmades olevate loomade kehamassi keskväär ­
tused oleksid võrreldavad (st ±20 % keskväärtusest).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
12. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 °C (±3 °C). Suhteline 
õhuniiskus peaks olema 30–70 %, ideaaljuhul 50–60 %. Kunstlik valgustus peaks olema järgmine: 12 tundi valgust, 12 tundi pimedust. Kasutada võib 
tavapärast katseloomadele ettenähtud sööta ning joogivee hulk peab olema 
piiramatu. Erilist tähelepanu tuleks pöörata sööda fütoöstrogeenisisaldusele, kuna fütoöstrogeenide suur sisaldus söödas võib mõjutada reproduktiiv ­
funktsiooni määratavaid näitajaid. Soovitatakse kasutada standarditud, 
teadaoleva koostisega sööta, milles östrogeensete kemikaalide sisaldus on 
vähendatud (2, 30). Söödavalikut võib mõjutada vajadus kindlustada sobiva lisasegu lisamine, kui uuritavat kemikaali manustatakse sellisel viisil. Tuleks 
määrata uuritava kemikaali sisaldus, homogeensus ja stabiilsus kandeaines. 
Söödas ja joogivees tuleks korrapäraselt määrata saasteainete sisaldus. Uuringu ajal kasutatud iga söödapartii proovid tuleks säilitada sobivates tingimustes (nt külmutatult –20 °C juures) kuni uuringu lõpuni juhuks, 
kui tulemustest selgub, et sööda komponente oleks vaja täiendavalt uurida.
 
13. Loomad peavad olema puurides väikeste rühmadena, igas puuris on samast 
soost ja sama doosirühma loomad. Loomi võib hoida ka üksikult, et vältida 
võimalikke vigastusi (nt isasloomad pärast paaritumisperioodi). Paaritumine 
peab toimuma selleks ettenähtud sobivates puurides. Kui on saadud tõendid kopulatsiooni kohta, paigutatakse tiineks peetavad emasloomad eraldi poegimis- või pesakonnapuuridesse ja varustatakse nad ettenähtud sobiva 
ja kindlaksmääratud pesamaterjaliga. Pesakondi peetakse koos emaga kuni 
võõrutamiseni. F
 1 -loomi tuleb pidada väikeste rühmadena, igas puuris on 
samast soost ja sama doosirühma loomad võõrutusperioodist kuni uuringu lõpetamiseni. Kui see on teaduslikult põhjendatud, võib loomi pidada üksi ­
kult. Fütoöstrogeenide sisaldus valitud allapanumaterjalis peaks olema 
minimaalne.
 
Loomade arv ja märgistamine  
14. Tavaliselt peaks igas doosi- ja kontrollrühmas olema piisav arv paarituvaid 
loomi, nii et igas doosirühmas oleks vähemalt 20 tiinet emaslooma. 
Eesmärk on saada piisavalt tiinusjuhtumeid, et oleks võimalik mõistlikult 
hinnata kemikaali võimet mõjutada P-põlvkonna viljakust, tiinust ja vane ­
makäitumist ning F  1 -põlvkonna järglaste kasvu ja arengut viljastumisest 
kuni suguküpsuseni. Kui vajalikku arvu tiineid loomi ei saada, ei tähenda 
see veel tingimata katse kehtetuks tunnistamist; iga üksikjuhtu tuleb eraldi 
hinnata ja kaaluda, kuivõrd see võib mõjutada uuritava kemikaali hindamist.  
15. Igale P-loomale omistatakse kordumatu tunnusnumber enne dooside manus ­
tamise algust. Kui varasemad laboriandmed näitavad, et olulisel osal emas ­
loomadest ei tarvitse esineda korrapäraseid innatsükleid (4 või 5 päeva), soovitatakse enne dooside manustamise algust hinnata innatsükleid. Alter ­
natiivina võib rühmasid suurendada, et vähemalt 20 emasloomal igas 
rühmas oleksid tagatud korrapärased innatsüklid (4 või 5 päeva) dooside 
manustamise alguses. Vastsündinute esmakordsel vaatlusel sündimispäeval või sündimisele järgneval päeval ( postnatal day , PND) 0 või 1 märgista ­
takse kõik F
 1 -järglased kordumatu märgisega. Andmeid F  1 -järglaste ja, vaja ­
duse korral, F  2 -järglaste päritolupesakonna kohta tuleb säilitada kogu 
uuringu jooksul.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Uuritav kemikaal  
Olemasolev teave uuritava kemikaali kohta  
16. Oluline on läbi vaadata olemasolev teave, et teha otsused manustamisviisi, 
kandeaine, loomaliigi, dooside valiku kohta, samuti otsused dooside manus ­
tamise ajakava võimaliku muutmise kohta. Laiendatud ühe põlvkonna 
reproduktiivtoksilisuse uuringu kavandamisel tuleks seepärast võtta arvesse kogu asjakohane olemasolev teave: uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised ja toksiko-kineetilised omadused (sealhulgas liigispetsiifiline metabolism), 
toksikodünaamilised omadused, struktuuri-aktiivsuse sõltuvused (SAR),  in 
vitro  kindlaks tehtud metaboolsed protsessid, mürgisuse uuringute tule ­
mused ja asjakohane teave struktuurianaloogide kohta. Esialgset teavet imendumise, jaotumise, metabolismi ja väljutamise (ADME) ning bioaku ­
mulatsiooni kohta võib tuletada keemilisest struktuurist, füüsikalis-keemilis ­
test andmetest, plasmavalkude sidumise ulatusest või toksiko-kineetilistest (TK) uuringutest, samal ajal kui mürgisusuuringute tulemused annavad lisa ­
teavet, nt NOAELi, metabolismi või selle indutseerimise kohta.
 
Toksiko-kineetiliste andmete kaalumine  
17. Kuigi TK andmeid ei nõuta, võivad varasemad TK andmed doosivahemiku 
määramise või muudest katsetest olla uuringu kavandamisel, dooside vali ­
misel ja tulemuste tõlgendamisel olla väga kasulikud. Eriti kasulikud on 
andmed, mis: 1) lubavad kontrollida areneva loote ja poegade kokkupuudet 
uuritava kemikaaliga (või asjakohaste metaboliitidega), 2) võimaldavad saada sisemise dosimeetria hinnangu ja 3) võimaldavad hinnata võimalikke doosist sõltuvaid küllastunud kineetilisi protsesse. Täiendavaid TK andmeid, 
näiteks metaboliidiprofiile, kontsentratsiooni-aja kõveraid jne, tuleks samuti 
arvesse võtta, kui need on kättesaadavad. Täiendavaid TK andmeid võib koguda ka põhikatse ajal tingimusel, et see ei takista põhiuuringu näitajate kogumist ja tõlgendamist.
 
Üldjuhul on laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuringu 
kavandamisel kasulikud järgmised TK andmed:  
— hiline tiinus (nt 20. päev pärast tiinestumispäeva) — emalooma veri ja 
loote veri;  
— keskmine imetamisperiood (PND 10) — ema veri, järglaste veri ja/või 
piim;  
— varajane võõrutusjärgne periood (nt PND 28) — võõrutatud poegade 
vereproovid.  
Konkreetsete analüüsitavate ainete (nt lähtekemikaal ja/või metaboliidid) ja 
proovivõtmise kava kindlaksmääramisel tuleks olla paindlik. Näiteks sõltub 
teataval proovivõtupäeval võetavate proovide arv ja võtmise aeg kokkupuu ­
tumisteest ja eelteadmistest TK omaduste kohta mittetiine looma puhul. Kui uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, on piisav, kui proove võetakse 
kõikidel päevadel ühel sobival ajal; dooside manustamisel sondi kaudu võib 
vaja olla täiendavaid proovivõtuaegu, et saaks paremini hinnata sisemiste dooside vahemikku. Siiski ei ole vaja ühelgi proovide võtmise päeval saada kontsentratsiooni ajast sõltuvuse täielikku kõverat. Vajaduse korral võib 
ühes pesakonnas kummastki soost loodete ja vastsündinute vereproovid 
koondada.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Manustamistee  
18. Manustamistee valimisel tuleks arvestada kokkupuuteviise, mis on inimese 
kokkupuute puhul kõige asjakohasemad. Kuigi katse-eeskiri on koostatud nii, et uuritavat kemikaali manustatakse söödaga, võib seda muuta, et 
manustada kemikaali muul viisil (joogivee, sondi kaudu, sissehingamise 
teel, naha kaudu), olenevalt kemikaali omadustest ja teabest, mida tahetakse saada.
 
Kandeaine valimine  
19. Vajaduse korral lahustatakse või suspendeeritakse uuritav kemikaal sobivas 
kandeaines. Soovitatakse võimaluse korral kaaluda kõigepealt vesilahuse/ ­
suspensiooni kasutamist, seejärel õlilahuse/õlisuspensiooni (nt maisiõli) 
kasutamist. Muu kandeaine kui vee puhul tuleks teada kandeaine mürgiseid omadusi. Tuleks vältida selliste kandeainete kasutamist, mis võivad ise olla mürgised (nt atsetoon, dimetüülsulfoksiid). Tuleks määrata uuritava kemi ­
kaali stabiilsus kandeaines. Kandeaine või muu lisaaine kasutamisel tuleks 
kaaluda järgmist: nende mõju uuritava kemikaali imendumisele, jaotumisele, metabolismile või peetumisele organismis; mõju uuritava kemikaali keemi ­
listele omadustele, mis võib muuta selle toksilisi omadusi, ning mõju 
loomade sööda- või veetarbimisele või toitumusele.
 
Doosi valimine  
20. Tavaliselt peaks uuring hõlmama vähemalt kolme doosimäära ja samaaegset 
kontrolli. Sobiva doositaseme valimisel peab uurija arvestama kogu kätte ­
saadavat teavet, sealhulgas varasemate uuringutega dooside kohta saadud teavet, tiinete ja mittetiinete loomadega saadud toksiko-kineetilisi andmeid, imetamisel piimaga edasikandumise ulatust ja inimeste kemikaaliga kokku ­
puute hinnanguid. Kui on olemas TK andmed, mis näitavad TK-protsesside 
küllastumist dooside suurendamise korral, tuleks vältida suurte dooside kasutamist, mille juures selgelt esineb küllastumine, loomulikult tingimusel, 
et inimeste kokkupuude on eeldatavasti tunduvalt allpool küllastumispunkti 
jõudmist. Sellistel juhtudel peaks suurim doos olema murdepunkti kohal või veidi üle selle punkti, kus algab mittelineaarne toksiko-kineetika.
 
21. Kui asjakohased TK andmed puuduvad, peaksid doositasemed põhinema 
mürgisusel, kui neid ei piira uuritava kemikaali füüsikalis-keemilised 
omadused. Kui doositasemed põhinevad mürgisusel, valitakse kõrgeim 
doos nii, et see põhjustaks teatavat süsteemset toksilisust, kuid mitte loomade surma ega tõsiseid kannatusi.
 
22. Doosimäärade alanev järjestus tuleks valida nii, et näidata doosiga seotud 
mõju ja teha kindlaks täheldatavat kahjulikku toimet mitteavaldav doos või 
mõju avastamise piiri lähedane doos, mis võimaldaks leida võrdlusdoosi kõige tundlikuma(te) näitaja(te) jaoks. Sageli on optimaalsed kahe- või neljakordsed dooside vahemikud, et dooside vahemik NOAELi ja LOAELi 
vahel ei oleks liiga suur. Väga suure doosivahemiku (nt üle 10 korra) 
kasutamisele on sageli eelistatav neljanda doosirühma lisamine.
 
23. Kontrollrühma loomi koheldakse samamoodi kui doosirühma loomi, välja 
arvatud uuritava kemikaali manustamine. Kontrollrühm on rühm, kellele doose ei manustata või manustatakse kahjutut ainet või kandeainet, kui 
uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse kandeainet. Kui kasutatakse 
kandeainet, saab kontrollrühm kandeainet suurimas kasutatud mahus.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Piirsisalduskatse  
24. Kui korduvdoosi uuringutes ei ole leitud tõendeid mürgisuse kohta doosis 
vähemalt 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas või kui andmete põhjal, mis on saadud struktuuri või metabolismi poolest sarnaste kemikaalidega (meta ­
bolism on  in vivo  või in vitro  andmete järgi sarnane), ei pruugi mitme 
doositasemega uuring olla vajalik. Sellisel juhul võiks laiendatud ühe põlv ­
konna reproduktiivtoksilisuse uuringu teha kontrollrühma ja ainult ühe doosirühmaga, milles doos on 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas. Kui 
aga sellise piirsisalduskatsega leitakse tõendeid reproduktiivtoksilisuse või 
arenguhäireid põhjustava toksilisuse kohta, tuleb teha uuring madalamate doositasemetega, et leida NOAEL. Sellised kaalutlused piirsisalduskatse 
kohta kehtivad ainult juhul, kui inimese kokkupuude ei viita sellele, et on 
vaja uurida kõrgemat doositaset.
 
EESKIRJAD  
Järglaste kokkupuude  
25. Kemikaali manustamine sööda kaudu on eelistatud meetod. Sondiuuringute 
tegemise kohta tuleks märkida, et imetatavad pojad saavad uuritavat kemi ­
kaali tavaliselt üksnes kaudselt, piimaga; otsene dooside manustamine algab 
nende jaoks võõrutamise ajal . Sööda või joogiveega manustamise uurin ­
gutes hakkavad pojad uuritavat kemikaali otse saama siis, kui nad imeta ­
misperioodi viimasel nädalal hakkavad ise sööma. Kui uuritavat kemikaali 
eritub piima sisse vähe ja kui ei saa tõendada järglaste pidevat kokkupuudet kemikaaliga, tuleks kaaluda uuringu korralduse muutmist. Sellistel juhtudel tuleks kaaluda vahetut manustamist poegadele imetamise ajal, võttes arvesse 
TK kohta olemas olevat teavet, toksilisust järglastele või muutusi biomar ­
kerites (3, 4). Enne imetatavatele poegadele dooside otsese manustamise uuringu tegemist tuleks hoolikalt kaaluda eeliseid ja puudusi (5).
 
Doseerimise ajakava ja doseerimine  
26. Teave innatsüklite, isas- ja emassuguelundite histopatoloogia ja munandi/ ­
munandimanuse spermaanalüüsi kohta võib olla juba varem saadud piisavalt 
pikkade korduvdoosiuuringutega. Laiendatud ühe põlvkonna reproduktiiv ­
toksilisuse uuringus valitakse paarituseelse dooside manustamise kestus nii, et näha mõju funktsionaalsetele muutustele, mis võivad segada paaritumis ­
käitumist ja viljastamist. Paarituseelne dooside manustamine peab olema 
piisavalt pikk, et saavutada püsioleku kokkupuutetingimused P põlvkonna emas- ja isasloomade puhul. Enamikul juhtudest peetakse mõlema soo puhul piisavaks kahenädalast dooside manustamist enne paaritumist. Emas ­
loomade puhul hõlmab see 3–4 täielikku innatsüklit ja see peaks olema 
piisav, et avastada kõik kahjulikud mõjud innatsüklile. Isasloomade puhul vastab see ajale, mis kulub küpseva spermatosoidi liikumiseks läbi munan ­
dimanuse, ja see peaks lubama avastada paaritamisel munandijärgse mõju 
spermale (spermatogeneesi lõppstaadiumides ja munandimanuses küpsemise 
ajal). Uuringu lõpetamise ajaks, kui uuritakse munandi ja munandimanuse histopatoloogiat ja tehakse sperma näitajate analüüs, on P- ja F
 1 -põlvkonna 
isasloomad uuritava kemikaaliga kokku puutunud vähemalt ühe täieliku 
spermatogeneesi protsessi jooksul (6, 7, 8, 9) ja OECD juhenddokument 
nr 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Paaritumiseelse kokkupuute stsenaariume isasloomade puhul võiks kohan ­
dada, kui varasemate uuringutega on selgelt kindlaks tehtud mürgisus 
munandite jaoks (spermatogeneesi häired) või mõjud seemnerakkude struk ­
tuurile ja funktsioonile. Samamoodi võib emasloomade puhul olla põhjen ­
datud kokkupuutestsenaariumi muutmine, kui on teada, et uuritav kemikaal 
mõjutab innatsüklit ja seega tiinestumisvõimet. Erijuhtudel võib olla 
lubatav, et P-põlvkonna emasloomadele hakatakse uuritavat kemikaali manustama alles pärast seda, kui on saadud sperma suhtes positiivne tupeäie (vt OECD juhenddokument nr 151 (40)).
 
28. Kui paaritumiseelne kemikaali manustamise periood on kindlaks määratud, 
tuleks uuritavat kemikaali loomadele pidevalt manustada 7 päeval nädalas 
kui lahkamiseni. Kõigile loomadele tuleks uuritavat kemikaali manustada 
sama meetodiga. Dooside manustamist tuleks jätkata 2-nädalase paaritumis ­
perioodi jooksul ja P-põlvkonna emasloomadele kogu tiinuse ja imetamise vältel kuni uuringu lõpetamiseni pärast võõrutamist. Isasloomadele tuleb 
doose manustada samal viisil kuni katse lõpetamiseni, kui F
 1 -põlvkonna 
loomad võõrutatakse. Lahkamise juures tuleks eelkõige pidada kinni emaste lahkamise ajakavast, kuna emasloomad tuleks lahata ühel ja samal või lähedasel imetamispäeval. Isasloomade lahkamine võib jaotuda suuremale 
arvule päevadele, olenevalt labori võimalustest. Kui otsest dooside manus ­
tamist ei ole alustatud juba imetamise ajal, alustatakse valitud F
 1 -põlvkonna 
isas- ja emasloomadele kemikaali otsest manustamist võõrutamise ajal ja seda tuleks jätkata kuni kavandatud lahkamiseni, sõltuvalt kohorti määra ­
misest.
 
29. Kemikaalide puhul, mida manustatakse sööda või joogiveega, on oluline 
tagada, et sisseantavad uuritava kemikaali kogused ei muudaks tavalist toitumise või joogivee tarbimise tasakaalu. Kui uuritavat kemikaali manus ­
tatakse söödaga, võib kasutada kas püsivat kontsentratsiooni söödas (ppm) 
või püsiva suurusega doosi vastavalt looma kehamassile; valitud võimalus 
tuleks selgelt määratleda.
 
30. Kui uuritavat kemikaali manustatakse sondiga, ei tohiks ühe korraga manus ­
tatav vedelikukogus ületada tavaliselt 1 ml 100 g kehamassi kohta (õli, näiteks maisiõli puhul on maksimumkogus 0,4 ml 100 g kehamassi kohta). Välja arvatud ärritavad või söövitavad kemikaalid, mille mõjud 
tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada 
katses kasutatavate mahtude varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide dooside korral jääks samaks. Doos tuleks manustada iga päev samal kellaajal. Iga looma doos peab tavaliselt põhinema kõige 
viimaselkehamassi määramisel ja seda kohandatakse vähemalt kord nädalas 
täiskasvanud isas- ja täiskasvanud viljastamata emaslooma puhul ning iga kahe päeva järel tiine emaslooma ja F
 1 -põlvkonna loomadel, kui kemikaali 
manustatakse enne võõrutamist ja 2 nädala jooksul pärast võõrutamist. Kui 
TK andmed viitavad uuritava kemikaali vähesele ülekandele läbi platsenta, 
tuleb tiinuse viimasel nädalal võib-olla kohandada sondiga manustatavat doosi, et vältida tiinele emasloomale liiga mürgise doosi manustamist. Emasloomale ei tohiks poegimise päeval kemikaali manustada sondiga 
või muul viisil, mille juures emasloom tuleb kätte võtta; kemikaali manus ­
tamata jätmine sel päeval on parem kui poegimisprotsessi häirimine.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Paaritumine  
31. Iga P-põlvkonna emane tuleks panna ühte puuri ühe juhuslikult valitud 
mitte suguluses oleva isasloomaga, kes kuulub samasse doosirühma (paari ­
tamine 1: 1), kuni täheldatakse kopulatsiooni tõendeid või on möödunud 2 nädalat. Kui isasloomi ei ole piisavalt, kuna isasloomi on näiteks surnud enne paaritumist, võib panna juba paaritunud (1: 1) isaslooma kokku teise 
emasloomaga, nii et kõik emasloomad saavad paaritatud. Tiinuse 0-päevaks 
peetakse päeva, mil leitakse tõendeid paaritumise kohta (leitakse vaginaal ­
kork või spermat). Loomad tuleks teineteisest võimalikult kiiresti eraldada pärast tõendite saamist kopulatsiooni toimumise kohta. Kui paaritumine ei 
ole kahe nädala pärast toimunud, tuleks loomad eraldada, andmata neile 
täiendavat võimalust paaritumiseks. Paaritunud paarid tuleks andmetes selgesti ära näidata.
 
Pesakonna suurus  
32. Neljandal poegimisjärgsel päeval võib iga pesakonna suurust korrigeerida, 
eemaldades juhuvalikuga liigsed pojad nii, et tulemuseks oleks võimalikult 
täpselt viis emast ja viis isast pesakonna kohta. Poegade selektiivne kõrval ­
damine, näiteks kehamassi põhjal, ei ole sobiv. Kui emaste või isaste poegade arv ei võimalda koostada pesakonda viiest kummastki soost pojast, 
on sobiv ka osaline korrigeerimine (nt kuus isast ja neli emast).
 
Poegade valimine võõrutusjärgsete uuringute jaoks (vt joonis 1)  
33. Võõrutamisel (umbes päeval PND 21) valitakse kõigist kättesaadavatest 
pesakondadest pojad edasiseks uurimiseks, kuni 20 poega igasse doosi ­
rühma ja kontrollrühma, ning peetakse neid kuni suguküpsuse saabumiseni 
(kui katseid ei ole vaja teha varem). Pojad valitakse juhuvaliku alusel, kuid välja jäetakse ilmselt kängujäänud pojad (loomad, kelle kehamass erineb keskmisest sama pesakonna järglase kaalust rohkem kui kahe standardhälbe 
võrra), kuna selliseid poegi ei saa pidada katserühma suhtes esindavaks.
 
Päeval PND 21 määratakse väljavalitud F  1 -põlvkonna pojad juhuvaliku 
alusel ühte loomade kolmest kohordist:  
kohort 1 (1A ja 1B) = reproduktiivtoksilisuse/arenguhäireid põhjustava 
toksilisuse katse;  
kohort 2 (2A ja 2 B) = arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse katse;  
kohort 3 = arenguhäireid põhjustava immuuntoksilisuse katse.  
Kohort 1A: üks isas- ja üks emasloom/pesakond/rühm (20/sugu/rühm): 
eelistatud valik reproduktiivsüsteemi ja üldise mürgisuse esmaseks 
hindamiseks.  
Kohort 1B: üks isas- ja üks emasloom/pesakond/rühm (20/sugu/rühm): 
eelistatud valik paljunemisfunktsiooni hindamiseks paarituvatel F1- loomadel, kui seda hinnatakse (vt OECD juhenddokument nr 117 (39), ja 
täiendavate histopatoloogiaandmete saamiseks, kui kahtlustatakse reproduk ­
tiivsüsteemi või sisesekretsiooni kahjustavat mürgisust või kui kohordi 1A tulemused ei ole ühesed.
 
Kohort 2A: kokku 20 poega rühma kohta (10 isast ja 10 emast rühma 
kohta; üks isasloom ja üks emasloom pesakonna kohta), mis eraldatakse 
käitumishäirete neuroloogia uurimiseks. millele järgneb täiskasvanute neuro ­
histopatoloogiline hindamine.  
Kohort 2B: kokku 20 poega rühma kohta (10 isast ja 10 emast rühma 
kohta; üks isas- ja üks emasloom pesakonna kohta), mis määratakse neuro ­
histopatoloogiauuringuks võõrutamise ajal (PND 21 või PND 22). Kui 
loomi ei ole piisavalt, tuleb loomad esmalt määrata kohorti 2A.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Kohort 3: kokku 20 poega rühma kohta (10 isast ja 10 emast rühma kohta; 
üks poeg igast pesakonnast kui võimalik). Vaja võib minna täiendavaid 
poegi kontrollrühmast, et nad toimiksid positiivse kontrolli loomadena T-rakkudest sõltuva antikehareaktsiooni katses ( T-cell dependant antibody 
response assay , TDAR) päeval PND 56 ± 3.
 
34. Kui pesakonnas ei ole piisavalt poegi kõigi kohortide komplekteerimiseks, 
on eelistatav kohort 1, kuna seda saab laiendada F  2 -põlvkonna saamiseks. 
Konkreetse küsimuse lahendamiseks võib igasse kohorti määrata täienda ­
vaid poegi, näiteks kui kemikaalil kahtlustatakse neuro-, immuun- või reproduktiivtoksilisust. Selliseid poegi võib kasutada uuringuteks eri ajahet ­
kedel või täiendavate näitajate määramiseks. Pojad, keda kohortidesse ei 
määrata, kasutatakse kliinilise biokeemia analüüsideks (punkt 55) ja üldi ­
seks lahkamiseks (punkt 68).
 
P-loomade teine paaritamine  
35. Teist paaritamist P-loomade puhul tavaliselt ei soovitata, kuna sellega kaota ­
takse olulist teavet pesastumiskohtade arvu kohta (ja sellega pesastumisjärg ­
selt ja sünni läheduses hukkunud loodete arvu kohta, mis võib näidata aine 
võimalikku teratogeensust) esimese pesakonna puhul. Kui on vaja kontrol ­
lida või selgitada kemikaali mõju kemikaaliga kokkupuutunud emaslooma ­
dele, siis on parem laiendada uuringut ja lisada F  1 -põlvkonna paaritumine. 
Siiski on P-põlvkonna isasloomade teine paaritumine töötlemata emasloo ­
madega alati üks võimalus, millega saab selgitada vastuolulisi tulemusi või 
täiendavalt iseloomustada mõju viljakusele, mida täheldati esimesel paaritumisel.
 
ELUPUHUSED VAATLUSED  
Kliinilised vaatlused  
36. P-põlvkonna ja valitud F  1 -põlvkonna loomade üldine kliiniline vaatlus 
tehakse kord päevas. Kemikaali sondi kaudu manustamise korral tuleks 
kliinilised vaatlused teha enne ja pärast manustamist (et näha võimalikke toksilisuse märke, mis on seotud maksimaalse kontsentratsiooniga veresee ­
rumis). Asjakohased käitumise muutused, raske või pikaleveniva poegimise 
märgid ja kõik mürgistuse tunnused tuleks registreerida. Kaks korda päevas, 
nädalavahetusel kord päevas tuleks kontrollida kõiki loomi raske mürgis ­
tuse, haigestumise või surma tuvastamiseks.
 
37. Lisaks uuritakse iga nädal üksikasjalikumalt kõiki P- ja F  1 -põlvkonna loomi 
(pärast võõrutamist) ja kõige parem oleks seda teha looma kaalumise ajal, et vähendada kättevõtmisega seotud stressi. Vaatlused tuleks teha hoolikalt ja 
kõik leiud registreerida, kasutades katselaboris määratud punktisüsteeme. 
Tuleks püüda tagada, et katsetingimuste varieeruvus oleks minimaalne. Üles tuleks märkida vähemalt järgmised märgid: muutused nahal, karvas ­
tikus, silmades, limaskestadel, eritiste ja väljaheidete esinemine ning auto ­
noomsed muutused (nt pisaravool, turris karv, pupillide suurus, muutunud 
hingamine). Samuti tuleks üles märkida muutused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad kättevõtmisele reageerivad, samuti kloonilised või toonilised liigutused, stereotüübid (nt ülemäärane karvastiku hooldus, ringi ­
ratast keerlemine) või kummaline käitumine (nt enese vigastamine, tagurpidi 
kõndimine).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Kehamass ja sööda/vee tarbimine  
38. P-põlvkonna loomad kaalutakse dooside manustamise esimesel päeval ja 
seejärel vähemalt kord nädalas. Lisaks kaalutakse P-põlvkonna emasloomi 
imetamise ajal samadel päevadel, kui kaalutakse nende pesakonna poegi (vt punkt 44). Kõik F
 1 -põlvkonna loomad kaalutakse individuaalselt võõruta ­
misel (PND 21) ja seejärel vähemalt kord nädalas. Kehamass registreeri ­
takse ka päeval, kui loomal algab puberteet (eesnaha täielik eraldumine või 
tupe avanemine). Kõik loomad kaalutakse surmamisel.  
39. Uuringu ajal registreeritakse sööda ja vee tarbimine (kui uuritavat kemikaali 
manustatakse joogiveega) vähemalt kord nädalas samal päeval looma keha ­
massi registreerimisega (välja arvatud kooselu ajal). Iga puuri F  1 -põlvkonna 
loomade söödatarbimine registreeritakse iga nädal, alates teatavasse kohorti valimisest.
 
Innatsüklid  
40. Eelteave innatsükli muutuste kohta uuritava kemikaali toimel võib olla 
saadud juba varasemate korduvdoosi mürgisuse uuringutega ja seda võib 
kasutada konkreetse uuritava kemikaaliga tehtava laiendatud ühe-põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuringu eeskirja koostamisel. Tavaliselt alustatakse 
innatsükli hindamist (vaginaaltsütoloogia abil) dooside manustamise alguses 
ja jätkatakse kuni paaritumise kinnituse saamiseni või kahenädalase paari ­
tumisaja lõpuni. Kui emasloomi on enne dooside manustamist kontrollitud tavalise innatsükli seisukohast, siis on kasulik jätkata tupenõre äiete tege ­
mist pärast dooside manustamise algust, kuid kui dooside manustamise 
alguses tekib kahtlus, et esineb mittespetsiifilist mõju (näiteks sööda tarbi ­
mise ilmne vähenemine kohe alguses), võib lasta loomadel dooside manus ­
tamisega kohaneda enne kahenädalast tupenõre äiete tegemise perioodi, 
millele järgneb paaritamine. Kui emasloomale kemikaali manustamist 
niimoodi pikendatakse (st neljanädalane dooside manustamine enne paari ­
tumist), tuleks kaaluda nooremate loomade ostmist ja pikendada isaslooma ­
dele dooside manustamist enne paaritumist. Tupe-/emakakaelarakkude 
võtmisel tuleks olla ettevaatlik, et vältida limaskesta kahjustamist ja seejärel 
pseudotiinuse teket (10, 11).
 
41. Tupenõre äigeid tuleks uurida iga päev kõikide kohorti 1A kuuluvate F  1 - 
põlvkonna emasloomade puhul pärast seda, kui tupp on avanenud, kuni 
leitakse esimene sarvestunud rakke sisaldav äie, et teha kindlaks ajavahemik 
nende kahe sündmuse vahel. Kõigi kohorti 1A kuuluvate F  1 -põlvkonna 
emasloomade innatsükleid tuleks jälgida kahe nädala jooksul, alates umbes päevast PND 75. Lisaks sellele, kui F
 1 -põlvkonna paaritumine 
peaks olema vajalik, jälgitakse kohordi 1B tupe tsütoloogiat alates loomade 
paaridesse paigutamisest kuni kopulatsiooni tõendite saamiseni.  
Paaritumine ja tiinus  
42. Lisaks tavapärastele näitajatele (nt kehamass, sööda tarbimine, kliinilised 
tähelepanekud, sealhulgas surma ja haigestumuse kontroll) registreeritakse 
paaridesse paigutamise, eostamise ja poegimise kuupäev ning arvutatakse 
ühtimiseelne ajavahemik (paaridesse paigutamisest kuni eostamiseni) ja tiinusaeg (eostamisest kuni poegimiseni). P-põlvkonna emasloomi tuleks hoolikalt uurida eeldatava poegimistähtaja ümbruses, et teha kindlaks poegi ­
mishäirete tunnused. Registreerida tuleks kõik pesaehituskäitumise või pesa ­
konna eest hoolitsemise kõrvalekalded.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Poegimispäev võetakse imetamispäevaks 0 (LD 0) emaslooma puhul ja 
sünnijärgseks päevaks 0 (PND 0) järglaste puhul. Teise võimalusena võivad 
kõik võrdlused põhineda ühtimisjärgsel ajal, et vältida segadust sünnijärgse arengu kirjeldamisel, mis on tingitud erinevast tiinusajast; siiski tuleb regis ­
treerida ka poegimisel põhinev ajakava. See on eriti oluline, kui uuritav 
kemikaal mõjutab tiinuse kestust.
 
Järglaste näitajad  
44. Iga pesakonda vaadeldakse nii ruttu kui võimalik pärast poegimist (PND 0 
või 1), et kindlaks määrata poegade arv ja sugu, surnult sünnid, elussünnid 
ja kõik suuremad anomaaliad (väliselt nähtavad kõrvalekalded, sh suulae ­
lõhe; nahaalused verevalumid; ebanormaalne naha värvus või tekstuur; nabaväädi olemasolu; piima puudumine maos; kuivanud eritiste esinemine). Lisaks peaks vastsündinute esimene kliiniline läbivaatus hõlmama kehatem ­
peratuuri, aktiivsusseisundi ja kättevõtmisele reageerimise kvalitatiivset 
hindamist. Poegi, kes leitakse surnult päeval PND 0 või hiljem, tuleks uurida, et teha kindlaks võimalikud puuded ja surma põhjus. Elusad pojad loetakse kokku ja kaalutakse ükshaaval päeval PND 0 või 1 ja edas ­
pidi korrapäraselt, näiteks päevadel PND 4, 7, 14 ja 21. Kliinilisi vaatlusi 
tuleks loomade vanust arvestades korrata järglaste kaalumise ajal või sage ­
damini juhul, kui vastsündinul leiti mingeid konkreetseid puudeid. Tähelda ­
tavad tunnused võiksid muu hulgas hõlmata järgmist: välised anomaaliad, 
naha, karvastiku, silmade ja limaskestade muutused, eritiste ja väljaheidete 
esinemine ja autonoomse närvisüsteemi tegevuse muutused. Samuti tuleks üles märkida muutused kõnnakus, kehaasendis ja selles, kuidas loomad kättevõtmisele reageerivad, samuti kloonilised või toonilised liigutused, 
stereotüübid või kummaline käitumine.
 
45. Iga poja anogenitaalne vahemaa ( anogenital distance , AGD) tuleks mõõta 
vähemalt üks kord ajavahemikus PND 0–4. Järglaste kehamassi andmed 
tuleks koguda AGD mõõtmise päeval ja AGD tuleks normeerida poja suurust arvestava näitajaga, eelistatult kuupjuurega kehamassist (12). Isastel järglastel tuleks rinnanibude ja nibuväljakese olemasolu kontrollida päeval 
PND 12 või 13.
 
46. Kõiki väljavalitud F  1 -põlvkonna loomi hinnatakse iga päev sugutiluki ja 
eesnaha eraldumise (isasloom) või tupe avanemise (emasloom) suhtes, alus ­
tades juba enne nende seksuaalse küpsuse näitajate saavutamise eeldatavat 
aega, et teha kindlaks varane seksuaalne küpsemine. Registreerida tuleks kõik suguorganite kõrvalekalded, nagu püsimajääv tupevahesein, kusiti alumise seina sulgumatus või peeniselõhe. F
 1 -põlvkonna loomade 
seksuaalset küpsust võrreldakse nende füüsilise arenguga, selleks määra ­
takse vanus ja kehamass suguti ja eesnaha eraldumisel (isasloom) või tupe avanemisel (emasloom) (13).
 
Võimaliku arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse hindamine 
(kohordid 2A ja 2B)  
47. Neurotoksilisuse hindamiseks kasutatakse 10 isas- ja 10 emaslooma kohor ­
dist 2A ning 10 isas- ja 10 emaslooma kohordist 2B igast doosirühmast (kumbagi kohorti lähevad 1 isas- ja 1 emasloom igast pesakonnast; iga 
pesakonda esindab vähemalt 1 järglane; kõik on valitud juhuvalikuga). 
Kohordi 2A loomadel kontrollitakse helisignaalile reageerimist, tehakse funktsionaalvaatluste kompleksi katsed, kontrollitakse motoorset aktiivsust (vt punktid 48–50) ja hinnatakse neuropatoloogiat (vt punktid 74–75). 
Tuleks püüda tagada, et kõikide katsetingimuste varieeruvus oleks võima ­
likult väike ja et ei oleks süstemaatilist viga mõne doosirühma suhtes.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
Muutujate hulgas, mis võivad käitumist mõjutada, on helivaljuse tase (nt 
katkendlik müra), temperatuur, niiskus, valgustus, lõhnad, kellaaeg ja kesk ­
konnapoolsed tähelepanu häirijad. Neurotoksikoloogiliste katsete tulemuste tõlgendamisel tuleks arvesse võtta asjakohaseid varasemaid kontrollrühmaga määratud võrdlusvahemikke. Kohordi 2B loomi tuleks kasutada neuropato ­
loogilisteks hindamisteks päevadel PND 21 või 22 (vt punktid 74 ja 75).
 
48. Helisignaali katse tuleks teha päeval PND 24 (±1 päev), kasutades kohorti 
2A kuuluvaid loomi. Katse tegemise päev peaks olema kõigi doosirühmade 
ja kontrollrühmade suhtes tasakaalustatud. Iga katsesessioon koosneb 50 katsest. Helisignaali katse tegemisel määratakse keskmine reaktsiooni ampli ­
tuud igas 10-katselises plokis (10-katselisi plokke on 5), kusjuures katse ­
tingimusi optimeeritakse, et saavutada sessiooni jooksul toimuv harjumine. 
Katse tegemise kord peab olema kooskõlas katsemeetodiga B.53 (35).
 
49. Sobival ajal PND 63 ja PND 75 vahel korraldatakse kõikide kohordi 2A 
loomadega funktsionaalvaatluste kompleksi katsed ja automatiseeritud motoorse aktiivsuse katse. Nende katsete tegemise kord peab olema koos ­
kõlas katsemeetoditega B.43 (33) ja B.53 (35). Funktsionaalvaatluste 
kompleks hõlmab looma välimuse, käitumise ja funktsioonide kahjustatuse 
põhjalikku kirjeldamist. Seda hinnatakse vaatluste järgi algul kodupuuris, pärast üleviimist vaatlemiseks standardväljakule (avamaa), kus loom liigub vabalt, ja manipuleerimiskatsetega. Katsetamine peaks toimuma järjekorras 
kõige vähem interaktiivsetelt katsetelt kõige interaktiivsematele. 1. liites on 
esitatud mõõdetavate näitajate loetelu. Kõiki loomi peaks hoolikalt jälgima koolitatud vaatleja, kes ei ole teadlik, mida igale loomale manustatakse, kasutades standarditud korda, et vähendada vaatlejaga seotud varieerumist. 
Võimaluse korral on soovitatav, et sama vaatleja hindaks kõiki sama katse 
loomi. Kui see ei ole võimalik, tuleb tõendada, et tulemused ei sõltu vaat ­
lejast. Käitumiskatsete kompleksi iga näitaja puhul kasutatakse selgeid hindamisskaalasid ja punktide andmise kriteeriume. Võimaluse korral tuleks 
välja töötada objektiivsed kvantitatiivsed vaatlemisnäitajad, mis hõlmavad 
subjektiivset taseme määramist. Iga looma motoorset aktiivsust katsetatakse eraldi. Vaatlussessioon peab olema piisavalt pikk, et demonstreerida kemi ­
kaaliga töötlemata kontrollrühmas sessiooni jooksul tekkivat harjumist. 
Motoorset aktiivsust tuleks mõõta salvestusseadmega automaatse aparaadi 
abil, millega saab määrata nii tegevuse hoogustumist kui ka vähenemist (nt tausttegevus, mida seadmega saab mõõta, ei tohiks olla nii vähene, et selle vähenemist ei õnnestu registreerida, ega nii hoogne, et selle edasist hoogus ­
tumist ei saa registreerida). Iga seadet tuleb kontrollida standardmeetodiga, 
et tagada, kuivõrd see on võimalik, eri seadmete mõõtmiste ja eri päevadel toimuvate mõõtmiste usaldusväärsus. Doosirühmade loomad jaotatakse eri seadmete vahel võimalikult tasakaalustatult. Doosirühmade katsed peavad 
toimuma tasakaalustatult eri aegadel, et tulemusi ei mõjutaks tegevuse 
ööpäevased rütmid.
 
50. Kui olemasolev teave viitab vajadusele teha muid funktsionaalseid katseid 
(nt sensoorseid, sotsiaalseid, kognitiivseid), tuleks need lisada muudele uuringus tehtavatele hindamistele nii, et muid hindamisi ei häiritaks. Kui kõnealuseid katseid tehakse samade loomadega, keda kasutatakse stan ­
dardses helisignaali katses, funktsionaalvaatluste kompleksi katsetes ja 
motoorse aktiivsuse katsetes, tuleks kavandada erinevad katsed, et katsete kordumisest tulenev väärtulemuste oht viia miinimumini. Täiendavad uuringud võivad olla eriti kasulikud, kui empiirilised vaatlused, oodatav 
mõju või toimemehhanism viitavad mingile konkreetsele neurotoksilise 
mõju tüübile.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Arenguhäireid põhjustava immuuntoksilisuse võimalikkuse hindamine 
(kohort 3)  
51. Päeval PND 56 (±3 päeva) kasutatakse iga doosirühma kohordist 3 10 isas- 
ja 10 emaslooma (1 isas- ja 1 emasloom pesakonna kohta; iga pesakonda esindab vähemalt 1 järglane; loomad on valitud juhuslikult) T-raku-sõltu ­
vate antikehade reaktsiooni katseks, milles uuritakse primaarset 
IgM-antikeha reaktsiooni T-raku-sõltuvale antigeenile, nagu lamba 
punaverelibled (SRBC) või meriteo  Megathura crenulata  
hemotsüaniin (KLH), kooskõlas praeguste immuuntoksilisuse kindlakstege ­
mise katse-eeskirjadega (14, 15). Reaktsiooni võib hinnata spetsiifiliste 
naaste moodustavate rakkude ( plaque-forming cells , PFC) loendamisega 
põrnas või SRBC- või KLH-spetsiifilise IgM-antikeha sisalduse määrami ­
sega vereseerumis ELISA-analüüsiga reaktsiooni maksimumi ajal. Reakt ­
sioon saavutab tavaliselt maksimumi neli (PFC-reaktsioon) või 
viis (ELISA) päeva pärast intravenoosset immuniseerimist. Kui primaarset 
antikehareaktsiooni hinnatakse PFCde loendamisega, siis lubatakse loomade alarühmi hinnata eri päevadel järgmistel tingimustel: alarühma immunisee ­
rimine ja surmamine on ajastatud nii, et PFCd loendatakse reaktsiooni 
maksimumis; alarühmades on võrdsel hulgal isas- ja emasjärglasi kõikidest 
doosirühmadest, kaasa arvatud kontrollrühmad, ning alarühmi hinnatakse ligikaudu samas sünnijärgses vanuses.Kokkupuudet uuritava kemikaaliga jätkatakse kuni päevani enne põrnade kogumist PFC-reaktsiooni määrami ­
seks või seerumi võtmist ELISA-analüüsi jaoks.
 
Võimaliku reproduktiivtoksilisuse järelhindamine (kohort 1B)  
52. Kohordi 1B loomadele võib jätkata kemikaali manustamist pärast päeva 
PND 90 ja vajaduse korral lasta neil paarituda, et saada F  2 -põlvkond. 
Samasse doosirühma kuuluvad isas- ja emasloomad pannakse kokku (vältides pesakonnakaaslaste kokku elama panemist) kuni kaheks nädalaks ajavahemikul PND 90–120. Katse korraldus on samasugune kui 
P-põlvkonna puhul. Olenevalt saadavatest tulemustest võib siiski olla piisav, 
kui lõpetada katse päeval PND 4 ja mitte jätkata katset kuni võõrutamiseni või kauem.
 
VAATLUSED KATSE LÕPETAMISEL  
Kliiniline biokeemia ja hematoloogia  
53. Süsteemset mõju tuleks jälgida P-põlvkonna loomade puhul. Katse lõpeta ­
misel võetakse paastuvereproovid iga doosirühma kümnelt juhuvalikuga leitud P-põlvkonna isas- ja emasloomalt kindlaksmääratud kohast; proove 
säilitatakse asjakohastes tingimustes ning tehakse osaline või täielik hema ­
toloogiline analüüs, kliinilis-biokeemiline analüüs, määratakse T4 ja TSH sisaldus või tehakse muud analüüsid, olenevalt uuritava kemikaali teadao ­
levast mõjuspektrist (vt OECD juhenddokument nr 151 (40)). Tuleks 
määrata järgmised hematoloogilised näitajad: hematokrit, hemoglobiini 
kontsentratsioon, erütrotsüütide arv, leukotsüütide üld- ja suhtarv, vereliis ­
takute arv ning hüübimisaeg ja -võime. Vereplasmast või -seerumist tuleks määrata: glükoos, üldkolesterool, karbamiid, kreatiniin, üldvalk, albumiin ja 
vähemalt kaks hepatotsellulaarset mõju peegeldavat ensüümi (nt alaniinami ­
notransferaas, aspartaataminotransferaas, leelisene fosfataas, γ-glutamüül ­
transpeptidaas ja sorbitooldehüdrogenaas). Täiendavate ensüümide ja sapi ­
hapete mõõtmine võib teatavatel asjaoludel anda kasulikku teavet. Lisaks 
võib võtta kõikide loomade vere ja säilitada hilisemaks analüüsiks, et aidata 
selgitada ebaselget mõju või saada laborisiseseid kokkupuudet käsitlevaid
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
andmeid. Kui P-loomade teist paaritumist ei ole kavandatud, võetakse vere ­
proovid vahetult enne ettenähtud surmamist või selle osana. Kui loomad 
jäetakse alles, kogutakse vereproovid paar päeva enne seda, kui loomad teist korda paaritatakse. Välja arvatud juhul, kui korduvdoosiuuringute andmed osutavad, et uuritav kemikaal ei mõjuta kõnealust näitajat, tuleks enne katse 
lõpetamist teha uriinianalüüs ja hinnata järgmised näitajad: uriini välimus, 
maht, osmolaalsus või erikaal, pH, valgusisaldus, glükoosisisaldus, vere ja vererakkude sisaldus, surnud rakud. Uriini võib koguda ka uuritava kemi ­
kaali ja/või metaboliitide eritumise jälgimiseks.
 
54. Süsteemset mõju tuleks jälgida ka F  1 -põlvkonna loomade puhul. Katse 
lõpetamisel võetakse paastuvereproovid iga doosirühma kümnelt juhuva ­
likuga leitud kohort 1A isas- ja emasloomalt kindlaksmääratud kohast; 
proove säilitatakse asjakohastes tingimustes ning tehakse tavaline kliinilis-biokeemiline analüüs, sealjuures määratakse kilpnäärmehormoonide T4 ja TSH sisaldus, tehakse hematoloogiline analüüs (leukotsüütide üld- ja 
suhtarv ning erütrotsüütide arv) ja uriinianalüüsid.
 
55. Liigsetele poegadele tehakse päeval PND 4 täielik lahkamine ning kaaluda 
tuleks kilpnäärmehormooni (T4) sisalduse mõõtmist vereseerumis. Vajaduse korral võib vastsündinute (PND 4) vereproovid koondada pesakondade kaupa biokeemiliste ja kilpnäärmehormoonide analüüside tegemiseks. 
Hormoonide T4 ja TSH määramiseks kogutakse veri ka võõrutatud poega ­
delt, kellele tehakse täielik lahkamine päeval PND 22 (F
 1 -põlvkonna pojad, 
keda ei valitud kohortidesse).  
Sperma näitajad  
56. Sperma näitajad mõõdetakse kõikidel P-põlvkonna isasloomadel, kui 90- 
päevase katsega ei ole kindlaks tehtud, et uuritav kemikaal sperma näitajaid 
ei mõjuta. Sperma näitajad tuleks määrata kõikidel kohordi 1A 
isasloomadel.  
57. Surmamisel registreeritakse kõikide P- ja F  1 -põlvkonna (kohordi 1A) isas ­
loomadel munandite ja munandimanuste mass. Vähemalt üks munand ja üks munandimanus säilitatakse histopatoloogiliseks uuringuks. Ülejäänud 
munandimanus kasutatakse munandimanuse sabas sisalduvate spermavarude 
määramiseks (16, 17). Lisaks kogutakse seemnerakkude kahjustamist välti ­
vate meetoditega munandimanuse sabas või seemnejuhas olev sperma seem ­
nerakkude liikuvuse ja morfoloogia hindamiseks (18).
 
58. Seemnerakkude liikuvust saab hinnata kohe pärast surmamist või hilisemaks 
analüüsiks säilitatud spermas. Liikumisvõimeliste seemnerakkude protsenti 
võib määrata subjektiivselt või objektiivselt liikumist analüüsiva arvutipro ­
grammiga (19, 20, 21, 22, 23, 24). Seemnerakkude morfoloogia hindami ­
seks tuleb munandimanusest (või seemnejuhast) võetud spermaproovi 
kõigepealt vaadelda fikseeritult või märgpreparaadis (25) ning iga proovi 
kohta vähemalt 200 spermatosoidi tuleb klassifitseerida kas normaalseks (nii pea kui ka keskosa/saba on normaalse välimusega) või ebanormaalseks. Sperma morfoloogiliste kõrvalekallete näideteks on kokkusulamine, isolee ­
ritud pead ning peade ja/või sabade väärmoodustised (26). Väärmoodustis ­
tega või suure peaga seemnerakud võivad osutada spermatogeneesi häire ­
tele.
 
59. Kui lahkamise ajal on spermaproovid külmutatud, äiged fikseeritud ja seem ­
nerakkude liikuvuse analüüs salvestatud (27), võib edasisel analüüsil piir ­
duda kontrollrühma ja suure doosi rühma isasloomadega. Kui täheldatakse 
kemikaali manustamisest tingitud mõjusid, tuleks siiski hinnata ka väiksema 
doosi rühmasid.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Täielik lahang  
60. Katse lõpetamisel või loomade enneaegse surma puhul lahatakse kõik P- ja 
F 1 -põlvkonna loomad ning uuritakse makroskoopiliselt strukturaalsete 
kõrvalekallete või patoloogiliste muutuste suhtes. Erilist tähelepanu tuleks pöörata reproduktiivsüsteemi elunditele. Surmaeelses seisundis humaanselt surmatud või surnud pojad tuleks registreerida ja (kui nende laibad ei ole 
matsereerunud) nende laipu uurida võimalike puuete leidmiseks ja/või 
surmapõhjuse selgitamiseks; nende laibad tuleks säilitada.
 
61. Täiskasvanud P- ja F  1 -põlvkonna emasloomadel uuritakse tupenõre äiet 
lahkamise päeval, et teha kindlaks innatsükli staadium ning leida korrelat ­
sioonid suguelundite histopatoloogiaga. Kõikide P-emasloomade (ja F  1 - 
põlvkonna emasloomade, kui see on kohaldatav) emakat uuritakse pesastu ­
miskohtade olemasolu ja arvu määramiseks viisil, mis ei sega histopatoloo ­
gilist hindamist.  
Elundite mass ja kudede säilitamine — täiskasvanud P- ja F  1 -põlv­
konna loomad  
62. Katse lõpetamise ajal määratakse kõigi P-põlvkonna loomade ja kõigi täis ­
kasvanud F  1 -põlvkonna asjakohastesse kohortidesse (kirjeldatud allpool) 
kuuluvate loomade kehamass ja kõikide allpool loetletud organite märgmass 
nii kiiresti kui võimalik, et vältida kuivamist. Need organid tuleks säilitada 
sobivates tingimustes. Kui ei ole öeldud teisiti, võib paariselundid kaaluda eraldi või koos, vastavalt katset tegeva labori tavale.
 
— Emakas (koos munajuhade ja emakakaelaga, munasarjad);  
— munandid, munandimanused (kokku ja munandimanuse sabad, mida 
kasutatakse seemnerakkude loendamiseks);  
— eesnääre (dorsolateraalne ja ventraalne osa koos). Eesnäärmekompleksi 
puhastamisel naaberkudedest tuleb hoolikalt vältida vedelikuga täidetud seemnepõiekeste vigastamist. Kui eesnäärme üldmassi määramisel tuleb 
nentida käsitlemise mõju, tuleb eesnäärme dorsolateraalne ja ventraalne 
segment pärast fikseerimist hoolikalt välja lõigata ja kaaluda eraldi;
 
— seemnepõiekesed koos koagulatsiooninäärmete ja nendes olevate vede ­
likega (tervikuna);  
— aju, maks, neerud, süda, põrn, harkelund, ajuripats, kilpnääre (pärast 
fikseerimist), neerupealised ja teadaolevad sihtorganid või -koed.  
63. Lisaks eespool loetletud elunditele tuleks võtta ja säilitada sobivates tingi ­
mustes järgmiste elundite proovid: perifeersed närvid, lihased, seljaaju, silmad ja nägemisnärv, seedetrakt, kusepõis, kopsud, hingetoru koos kilp ­
näärme ja kõrvalkilpnäärmetega, luuüdi, seemnejuha (isasloomad), rinna ­
näärmed (isas- ja emasloomad) ja tupp.
 
64. Määratakse kõigi kohordi 1A loomade elundite mass ja elundid konservee ­
ritakse histopatoloogiliste uuringute jaoks.  
65. Sünnieelselt ja -järgselt tekitatud immuuntoksiliste mõjude uurimiseks kasu ­
tatakse iga doosirühma kohordist 1A 10 isas- ja 10 emaslooma (1 isas- ja 1 
emasloom pesakonna kohta; iga pesakonda esindab vähemalt 1 järglane; loomad on valitud juhuslikult), kellel pärast projekti lõpetamist:
 
— kaalutakse manustamisviisiga seotud lümfisõlmed ja kokkupuuteteest 
kaugemal asetsevad lümfisõlmed (lisaks neerupealiste, harkelundi ja 
põrna massi määramisele, mis on tehtud juba kõikidele kohort 1A 
loomadele);  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— tehakse põrna lümfotsüütide alampopulatsiooni analüüs (CD4+ ja CD8+ 
T-lümfotsüüdid, B-lümfotsüüdid ja looduslikud tapjarakud (NK-rakud); 
selleks kasutatakse pool põrna, teine pool põrna säilitatakse histopato ­
loogiliseks hindamiseks.  
Immuniseerimata (kohordi 1A) loomade põrna lümfotsüütide alampopulat ­
sioonide analüüsiga tehakse kindlaks, kas kokkupuude kemikaaliga on 
muutnud helperrakkude (CD4+) või tsütotoksiliste (CD8+) harkelundipäri ­
toluga lümfotsüütide või looduslike tapjarakkude (NK-rakud) arvukust immunoloogilises püsiolekus (nimetatud rakud tagavad kiire reageerimise 
vähirakkudele ja haigusetekitajatele).
 
66. Kohort 1B loomadel tuleb kaaluda järgmised elundid ja töödelda asja ­
omased koed plokkpreparaatideks:  
— tupp (kaalumata);  
— emakas koos emakakaelaga;  
— munasarjad;  
— munandid (vähemalt üks);  
— munandimanused;  
— seemnepõiekesed koagulatsiooninäärmed;  
— eesnääre;  
— ajuripats;  
— kindlakstehtud sihtorganid.  
Kohordi 1B loomadele tehakse histopatoloogiline uuring, kui kohordi 1A 
tulemused on ebaselged või oletatakse reproduktiivtoksilisust või sisesekret ­
sioonisüsteemi kahjustavaid omadusi.  
67. Kohordid 2A ja 2B: arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse katsed (PND 
21–22 ja täiskasvanud järglased). Kohordi 2A loomad surmatakse pärast käitumuslikke katseid, määratakse aju mass ja tehakse täielik neurohistopa ­
toloogiline analüüs neurotoksilisuse hindamiseks. Kohordi 2B loomad 
surmatakse päeval PND 21 või 22, määratakse aju mass ja tehakse aju 
mikroskoopiline läbivaatus neurotoksilisuse hindamiseks. Kohordi 2A puhul on vajalik fikseerimine perfusiooniga; kohordi 2B loomade puhul on see valikuline, nagu on ette nähtud katsemeetodis B.53 (35).
 
Elundite mass ja kudede säilitamine — F  1 -põlvkonna võõrutuseas 
loomad  
68. Pojad, keda ei ole valitud kohortidesse, seejuures kängujäänud pojad, 
surmatakse päeval PND 22, kui tulemused ei osuta täiendava elupuhuse uurimise vajadusele. Surmatud pojad lahatakse, mille käigus hinnatakse 
suguorganeid, nagu on kirjeldatud punktides 62 ja 63. Iga doosirühma 
kummastki soost kuni 10 pojal võimalikult paljudest pesakondadest määra ­
takse aju, põrna ja harkelundi mass ja nimetatud elundid säilitatakse sobi ­
vates tingimustes. Lisaks sellele võib osutatud isastel ja emastel poegadel 
säilitada rinnanäärme koed hilisemaks mikroskoopiliseks analüüsiks (
 1 ) (vt 
OECD juhenddokument nr 151 (40)). Selgelt nähtavad väärarendid ja siht ­
koed tuleks säilitada võimaliku histoloogilise uuringu jaoks.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Uuringud on näidanud, et rinnanääre, eriti varases nooruses toimuv rinnanäärme areng, 
on tundlik östrogeense toime näitaja. On soovitatav, et käesolevas katsemeetodis nähtaks 
ette noorte kummastki soost poegade rinnanäärmete uurimine pärast seda, kui see on 
valideeritud.
 Histopatoloogiline uuring — P-põlvkonna loomad  
69. Kõikidel suure doosi ja kontrollrühmade P-põlvkonna loomadel tuleks teha 
kõikide punktides 62 ja 63 osutatud elundite täielik histopatoloogiline 
uuring. Kemikaaliga kokkupuutest tingitud muutustega elundeid tuleks samuti uurida kõikidel väiksema doosiga rühmade loomadel, et määrata NOAEL (täheldatavat kahjulikku toimet mitteavaldav doos). Lisaks sellele 
tuleks loomadel, kellel kahtlustatakse vähenenud viljakust, nt nendel, kellel 
ei õnnestunud paarituda, viljastuda, sigitada või sünnitada terveid järglasi, või nendel, kelle innatsükkel või sperma hulk, liikuvus või morfoloogia olid muutunud, uurida suguelundeid ning kõiki suuremaid kahjustusi tuleks 
hinnata histopatoloogiliselt.
 
Histopatoloogiline uuring — F  1 -põlvkonna loomad  
Kohordi 1 loomad  
70. Kõikidel suure doosi ja kontrollrühmade täiskasvanud kohordi 1A loomadel 
tuleks teha kõikide punktides 62 ja 63 osutatud elundite täielik histopato ­
loogiline uuring. Iga pesakonda peaks esindama vähemalt 1 järglane kummastki soost. Kemikaaliga kokkupuutest tingitud muutuste ja nähtavate kahjustustega elundeid ja kudesid tuleks samuti uurida kõikidel väiksema 
doosi rühmade loomadel, et määrata NOAEL. Selleks, et hinnata sünnieelse 
ja -järgse kokkupuute põhjustatud mõjusid lümfisüsteemi organitele, tuleks samuti hinnata kogutud lümfisõlmede ja luuüdi histopatoloogiat kohordi 1A 10 isas- ja 10 emasloomal, lisaks kõikidel 1A-loomadel juba tehtavatele 
harkelundi, põrna ja neerupealiste histopatoloogilistele hindamistele.
 
71. Kohordi 1B kõikide loomade suguorganite ja sisesekretsiooninäärmete 
kudesid, mis on töödeldud plokkpreparaadiks, nagu on kirjeldatud punktis 
66, tuleks uurida histopatoloogia suhtes juhtudel, kui kahtlustatakse repro ­
duktiivtoksilist või sisesekretsioonisüsteemi kahjustavat mõju. Kohordi 1B loomadel tuleks teha ka histoloogiline uuring, kui kohordi 1A tulemused on 
ebaselged.
 
72. Täiskasvanud emasloomade munasarjad peaksid sisaldama esmaseid ja 
kasvavaid folliikuleid, samuti kollaskehi; seepärast tuleks F  1 -emasloomadel 
püüda histopatoloogilise uurimisega kvantitatiivselt hinnata esmaseid ja väikseid kasvavaid munarakke, samuti kollaskehi; loomade arv, munasarja ­
lõigete valik ja lõikeproovi suurus peaksid statistiliselt sobima kasutatava 
hindamisprotseduuriga. Folliikulite loendamise võib kõigepealt teha kont ­
rollrühma ja suure doosi rühma loomadel, ning kui viimasel juhul leitakse kahjulikku mõju, siis uurida väiksema doosi rühmi. Uurimisel tuleks arvu ­
tada esmaste folliikulite arv, millele saab liita väikeste kasvavate folliikulite 
arvu, et võrrelda doosirühma ja kontrollrühma kuuluvate emasloomade munasarju (vt OECD juhenddokument 151 (40)). Kollaskehade hindamine peaks toimuma paralleelselt innatsükli staadiumi määramisega, nii et tsükli 
staadiumi saaks hindamisel arvesse võtta. Munajuhade, emaka ja tupe puhul 
uuritakse vastavale organile omast arengut.
 
73. F  1 -isasloomadel uuritakse üksikasjalikult munandite histopatoloogiat, et teha 
kindlaks kemikaaliga kokkupuutest tingitud mõjud kudede diferentseerumi ­
sele munandis, munandi arengule ja spermatogeneesile (38). Võimaluse korral tuleks uurida  rete testis 'e lõikeid. Munandimanuse pead, keha ja 
saba ning seemnejuha uuritakse vastavale organile omase arengu suhtes, 
samuti uuritakse P-isasloomade puhul nõutavaid näitajaid.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Kohordi 2 loomad  
74. Pärast neurokäitumuslike katsete lõpetamist (pärast päeva PND 75, kuid 
mitte hiljem kui PND 90) tehakse kõikidele suure doosi ja kontrollrühmade kohordi 2A kummastki soost loomadele neurohistopatoloogilised uuringud. 
Aju histopatoloogiline uuring tehakse kõikidel suure doosi ja kontrollrüh ­
madesse kuuluvatel kohordi 2B kummastki soost loomadel päeval PND 21 või 22. Kemikaaliga kokkupuutest tingitud muutustega elundeid või kudesid tuleks samuti uurida väiksema doosi rühmade loomadel, et määrata NOAEL 
(täheldatavat kahjulikku toimet mitteavaldav doos). Kohortide 2A ja 2B 
loomade puhul uuritakse mitut aju lõiget, et uurida haistmissibulaid, ajukoort, hipokampi, basaalganglione, talamust, hüpotalamust, keskaju 
(tectum , tegmentum  ja ajuvarred), ajutüve ja väikeaju. Ainult kohordi 2A 
puhul uuritakse silmi (võrkkest ja nägemisnärv) ja perifeersete närvide, lihaste ja seljaaju proove. Kõik neurohistoloogilised määramised tehakse kooskõlas katsemeetodiga B.53 (35).
 
75. Morfomeetrilised (kvantitatiivsed) hindamised tuleks teha aju tüüpilistes 
piirkondades (usaldusväärsete mikroskoopiliste märkide järgi valitakse hoolikalt homoloogsed lõiked) ning need hindamised võivad hõlmata konkreetsete ajupiirkondade joonmõõtmete või pindala mõõtmist. Iga 
iseloomuliku koha tasandilt võetakse vähemalt kolm järjestikust lõiget, et 
valida hindamiseks konkreetse ajuosa kõige homoloogsem ja tüüpilisem lõige. Neuropatoloogil peaks olema eksperdi otsustusvõimet, kui ta otsustab, kas mõõtmiseks valmistatud lõiked on homoloogsed muude lõigetega 
samade proovide hulgas ja kas neid seepärast on sobiv võtta võrdlemiseks, 
kuna eelkõige joonmõõtmed võivad muutuda juba väikse vahemaa juures (28). Mittehomoloogseid lõikeid ei tohiks kasutada. Kuigi eesmärk on võtta proovid kõigilt selleks ettenähtud loomadelt (10/sugu/doositase), võib 
piisata ka väiksemast arvust. Vähem kui 6 loomalt/sugu/doositase võetud 
proovidest tavaliselt siiski ei piisa käesoleva katsemeetodi puhul. Et tuvas ­
tada kemikaaliga kokkupuute mõju sellistele näitajatele nagu teatava neuroanatoomilise piirkonna maht või rakkude arv, võib kasutada stereoloo ­
giat. Koenäidiste ettevalmistamisel tuleks kõikidel etappidel — kudede 
perfusioon, koeproovide väljalõikamine, kudede töötlemine ja mikroskoobi ­
preparaatide värvimine — kasutada tasakaalustatud katsekorraldust, nii et igas partiis oleks iga doosirühma esindav valim. Kui kasutatakse morfomee ­
trilist või stereoloogilist analüüsi, tuleks kõikide doosirühmade ajukoed 
panna sobivasse fikseerivasse keskkonda samaaegselt, et vältida pikaajalisel fiksatiivis hoidmisel ajukoe kokkutõmbumisega seotud artefakte.
 
UURINGU PROTOKOLL  
Andmed  
76. Andmed esitatakse eraldi ja tabelisse kokkuvõetuna. Iga doosirühma ja iga 
põlvkonna kohta tuleks võimaluse korral teatada järgmised andmed: loomade arv katse alguses, katse ajal surnuna leitud või humaanselt 
surmatud loomade arv, iga looma surma või humaanse surmamise aeg, 
viljakate loomade arv, tiinete emasloomade arv, poeginud emasloomade arv, mürgistusnähtudega loomade arv. Tuleks teatada ka mürgistuse tunnuste kirjeldus, sealhulgas avaldumise aeg, kestus ja raskus.
 
77. Numbrilisi tulemusi tuleks hinnata sobiva ja heakskiidetud statistilise 
meetodi abil; Statistilised meetodid tuleks valida juba uuringu kavandamisel ja nendega tuleks asjakohaselt arvesse võtta muid kui normaaljaotusega andmeid (nt loendusandmed), piiratud andmeid (nt piiratud vaatlusaeg), 
muudest andmetest sõltuvaid andmeid (nt pesakonna mõju, korduvad mõõt ­
mised), ja ebavõrdset dispersiooni. Üldistatud lineaarsed segamudelid ning
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
doosi ja toime vahelise sõltuvuse mudelid hõlmavad laia klassi analüütilisi 
vahendeid, mis võivad olla asjakohased käesoleva katsemeetodi alusel 
saadud andmete töötlemisel. Protokollis tuleb esitada piisavalt teavet analüüsimeetodi kohta ja kasutatud arvutiprogrammi kohta, nii et sõltumatu kontrollija/statistik võib hinnata ja uuesti hinnata analüüsi.
 
Tulemuste hindamine  
78. Tulemusi tuleks hinnata täheldatud mõjude suhtes, kaasa arvatud lahangu- 
ja mikroskoopilised leiud. Hindamisega tehakse kindlaks, kas on olemas 
seos doosi ja kõrvalekallete, nende esinemissageduse ja raskusastme, seal ­
hulgas silmaga täheldatavate kahjustuste vahel või sellist seost ei ole. Hinnata tuleb ka mõju sihtorganitele, viljakusele, kliinilistele kõrvalekalle ­
tele, paljunemiskäitumisele ja pesakonna eest hoolitsemisele, kehamassi 
muutusi, suremust ja muid mürgistusega seotud ja arengumõjusid. Erilist 
tähelepanu tuleks pöörata sooga seotud muutustele. Katsetulemuste hinda ­
misel tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali füüsikalis-keemilisi omadusi ja võimaluse korral toksiko-kineetilisi andmeid, sh uuritava kemikaali läbipää ­
semist platsentast ja eritumist piimaga.
 
Katseprotokoll  
79. Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave, mis on saadud käesolevas 
uurimuses P-, F  1 - ja F  2 -loomadega (vajaduse korral).  
Uuritav kemikaal:  
— kogu asjakohane kättesaadav teave uuritava kemikaali ja selle keemi ­
liste, toksiko-kineetiliste ja toksikodünaamiliste omaduste kohta;  
— tunnusandmed;  
— puhtus.  
Kandeaine (vajaduse korral):  
— kandeaine valiku põhjendamine, kui kandeaine ei ole vesi.  
Katseloomad:  
— kasutatud liik/aretusliin;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, sööt, pesamaterjalid jne;  
— iga looma mass katse alguses;  
— P-emasloomade tupeäige andmed enne kemikaali manustamise algust 
(kui andmeid kogutakse sel ajal);  
— P-põlvkonna isas- ja emasloomade paaritamise tulemused, näidatakse 
isas- ja emasloom ning paaritumise edukus;  
— andmed F  1 -põlvkonna täiskasvanud loomade pesakonnapäritolu kohta.  
Katsetingimused:  
— doositaseme valimise põhjendus;  
— uuritava kemikaali valmistise/söödavalmistise üksikasjad, saavutatud 
kontsentratsioonid;  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— uuritava kemikaali stabiilsus kandeainega saadud valmistises, valmistise 
homogeensus (nt sööt, joogivesi), veres ja/või piimas kasutustingimustes 
ja säilitamisel eri kasutuskordade vahel;  
— uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;  
— sööda/joogivee hulka segatud uuritava aine kontsentratsiooni (ppm) 
teisendus tegelikuks doosiks (mg kehamassi kg kohta päevas), vajaduse korral;
 
— sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda koostis, kui see on teada);  
— poegade surmamiseks ja katserühmadesse määramiseks juhusliku vali ­
mise korra üksikasjalik kirjeldus;  
— keskkonnatingimused;  
— uuringust osavõtnute loetelu koos väljaõppe näitamisega.  
Tulemused (kokkuvõte ja individuaalsed andmed sugude ja dooside kaupa):  
— sööda tarbimine, vee tarbimine, kui see on teada, söödakasutuse tõhusus 
(kehamassi lisandumine tarbitud sööda grammi kohta, välja arvatud 
paaritamisperioodil ja imetamise ajal) ning uuritava kemikaali tarbimine 
(sööda või joogiveega manustamise puhul) P- ja F  1 -põlvkonna loomade 
puhul;  
— andmed omastamise kohta (kui on mõõdetud);  
— P-loomade kehamassi andmed;  
— valitud F  1 -põlvkonna loomade võõrutusjärgsed kehamassi andmed;  
— surmaaeg katse ajal või andmed loomade ellujäämise kohta kuni 
surmamiseni;  
— kliiniliste leidude laad, raskus ja kestus (sõltuvalt sellest, kas kahjus ­
tused on pöörduvad või mitte);  
— vereanalüüsi, uriinianalüüsi ja kliinilise keemia andmed, sealhulgas TSH 
ja T4;  
— põrnarakkude fenotüübianalüüsi tulemused (T-, B-, NK-rakud);  
— luuüdi rakuline koostis;  
— mürgise toime andmed;  
— P- ja F  1 -põlvkonna emasloomade arv, kellel on normaalne või ebanor ­
maalne innatsükkel ja tsükli kestus;  
— aeg kuni paaritumiseni (koituseelne ajavahemik, päevade arv kokku 
paigutamise ja paaritumise vahel);  
— toksilised või muud mõjud paljunemisele, sealhulgas selliste loomade 
arv ja osakaal, kellel toimus paaritumine, tiinestumine, sünnitamine ja 
imetamine; tiinuse esilekutsunud isasloomade arv ja osakaal, poegimis ­
raskustega, pika või raske poegimisega emaste arv ja osakaal;  
— tiinuse kestus ja, kui võimalik, poegimise kestus;  
— pesastumiste arv, pesakonna suurus ja isasloomade protsent poegade 
hulgas;  
— pärast pesastumist toimunud abortide, elussündide ja surnultsündinute 
arv ja protsent;  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— pesakonna ja poegade massi andmed (isased, emased ja koos), 
kängunud järglaste arv, kui see määrati;  
— selgelt nähtavate arenguhälvetega poegade arv;  
— mürgistuse või muud mõjud järglastele, sünnijärgsele kasvule, elujõuli ­
susele jne;  
— andmed poegade füüsilise arengu järkude kohta ja muud sünnijärgse 
arengu andmed;  
— F  1 -põlvkonna loomade suguküpsuse saabumise andmed;  
— andmed poegade ja täiskasvanud loomade funktsionaalsete leidude 
kohta;  
— andmed P- ja täiskasvanud F  1 -põlvkonna loomade kehamassi kohta 
surmamisel ning elundite täieliku ja suhtelise massi kohta;  
— lahkamise leiud;  
— kõikide histopatoloogiliste leidude üksikasjalik kirjeldus;  
— P- ja F  1 -põlvkonna isasloomade munandimanuse sabaosas olevate sper ­
matosoidide koguarv, edasiliikuvate spermatosoidide protsent, morfoloo ­
giliselt normaalsete spermatosoidide protsent ning tuvastatud kõrvalekal ­
dega spermatosoidide protsent;  
— P- ja F  1 -põlvkonna emasloomade munasarjades olevate eri küpsemiss ­
taadiumides folliikulite arvud, kui see on kohaldatav;  
— F  1 -põlvkonna emasloomade kollaskehade loendamise andmed;  
— vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine.  
Kohordi 2 näitajad:  
— üksikasjalik meetodi kirjeldus: kuidas standarditi tähelepanekud ja prot ­
seduurid, samuti märgatud nähtustele hindepunktide andmise tööju ­
hendid;  
— kõikide katses kasutatud meetodite loetelu ja nende kasutamise põhjen ­
dused;  
— kõikide kasutatud käitumuslike, funktsionaalsete, patoloogia-, 
neurokeemia- või elektrofüsioloogiameetodite üksikasjad, sealhulgas teave automaatseadmete kohta;
 
— seadmete kaliibrimise meetodid, seadmete samaväärsuse tagamine ja 
doosirühmade tasakaalustatud jaotamine katsete tegemisel;  
— lühike selgitus kõigi otsuste kohta, milles kasutati eksperdihinnanguid;  
— kõikide käitumisega seotud, funktsionaalsete, neuropatoloogiliste ja 
morfomeetriliste leidude üksikasjalik kirjeldus sugude kaupa, sealhulgas 
nii suurenemised kui ka vähenemised, võrreldes kontrollrühmadega;  
— aju mass;  
— neuroloogiliste tunnuste põhjal pandud diagnoosid ja oletatud kahjus ­
tused, sealhulgas looduslikult esinevad haigused või haigusseisundid;  
— tüüpiliste leidude kujutised;  
— madala lahutusvõimega kujutised, et oleks võimalik hinnata morfomee ­
triaks kasutatud lõigete homoloogsust;  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— tulemuste statistiline analüüs koos andmete analüüsiks kasutatud statis ­
tiliste mudelitega ja tulemused, sõltumata sellest, kas need olid olulised 
või mitte;  
— muude toksiliste mõjude (sugude ja doosirühmade kaupa) seos uuritud 
kemikaali võimaliku neurotoksilisuse kohta tehtud järeldusega;  
— toksiko-kineetilise teabe mõju järeldustele;  
— andmed, mis kinnitavad katsemeetodi usaldusväärsust ja tundlikkust (st 
positiivsed ja varasemad kontrolli andmed);  
— seosed neuropatoloogilise ja funktsionaalse mõju vahel, kui on seoseid;  
— NOAEL või võrdlusdoos emaloomade ja järglaste puhul, sugude ja 
rühmade kaupa;  
— tulemustega saadud andmete üldise tõlgendamise arutelu, sealhulgas 
järeldus, kas uuritav kemikaal on arenguhäireid põhjustav neurotoksiline aine, ja täheldatava kahjuliku toimeta doos.
 
Kohordi 3 näitajad:  
— seerumi IgM-antikehade tiitrid (SRBC või KLH suhtes ülitundlikkuse 
tekkimine) või põrna IgM PFC ühikud (SRBC suhtes ülitundlikkuse tekkimine);
 
— T-rakkudest sõltuva antikehareaktsiooni katse ( T-cell dependant anti ­
body response assay,  TDAR) korrektset läbiviimist tuleks kinnitada 
optimeerimise protsessi osana, kui labor teeb seda katset esimest korda, ja regulaarselt (nt igal aastal) kõikide laborite puhul;
 
— tulemustega saadud andmete üldise tõlgendamise arutelu, sealhulgas 
järeldus, kas uuritav kemikaal on arenguhäireid põhjustav immuuntok ­
siline aine, ja täheldatava kahjuliku toimeta doos.  
Tulemuste arutelu.  
Järeldused, sh NOAEL-väärtused mõjude kohta emadele ja järglastele  
Samuti tuleks esitada kogu muu teave, mida ei saadud uuringu käigus, kuid 
mis abistab tulemuste tõlgendamist (nt mõju sarnasus muude teadaolevalt 
neurotoksiliste ainete mõjuga).  
Tulemuste tõlgendamine  
80. Laiendatud ühe põlvkonna reproduktiivtoksilisuse uuring annab vajaduse 
korral teavet selle kohta, kuidas korduv kokkupuude kemikaaliga mõjutab 
reproduktiivtsükli kõiki etappe. Eelkõige annab uuring teavet reproduktiiv ­
süsteemi ja järglaste arengu, kasvu, eluvõime ja funktsionaalsete näitajate kohta kuni päevani PND 90.
 
81. Tulemuste tõlgendamisel tuleb arvesse võtta kogu senist teavet uuritava 
kemikaali kohta, sealhulgas kemikaali füüsikalis-keemilisi, toksikokeemilisi ja -dünaamilisi omadusi, asjakohast teavet struktuurianaloogide ning vara ­
semate mürgisuse uuringute kohta (nt äge mürgisus, korduvdoosi mürgisus, 
mehhaanilised uuringud ja uuringud, millega kvalitatiivselt ja kvantitatiiv ­
selt hinnatakse  in vivo  ja in vitro  metabolismi sõltuvust bioloogilisest 
liigist). Üldise lahangu ja elundite kaalumise tulemusi tuleks hinnata muudes, korduvate annustega uuringutes tehtud vaatluste kontekstis, kui 
see on teostatav. Järglaste kasvu vähenemist võib vaadelda seoses uuritava 
kemikaali mõjuga piima koostisele (29).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Kohort 2 (arenguhäireid põhjustav neurotoksilisus)  
82. Neurokäitumuslikke ja neuropatoloogilisi tulemusi tuleks tõlgendada 
kõikide tehtud tähelepanekute kontekstis, kasutades tõendite kaalukuse lähe ­
nemisviisi ja eksperdiarvamust. Arutada tuleks käitumuslike ja morfoloogi ­
liste leidude tüüpe ning doosi ja toime vahelist sõltuvust. Kõnealuses aren ­
guhäireid põhjustava neurotoksilisuse iseloomustuses tuleks hinnata 
inimeste epidemioloogilisi uuringuid või juhtumiaruandeid, katseloomade 
uuringuid (nt toksiko-kineetilisi andmeid, struktuuri-aktiivsuse sõltuvusi, muid toksikoloogiauuringute andmeid). Andmete hindamisel tuleks arutada nii bioloogilist kui ka statistilist tähtsust. Hindamisel tuleks vaadelda neuro ­
patoloogiliste ja käitumuslike muutuste vahelist seost, kui täheldati mingeid 
muutusi. Arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse katse tulemuste tõlgen ­
damise suunised vt katsemeetod B.53 (35) ja Tyl  et al ., 2008 (31).
 
Kohort 3 (arenguhäireid põhjustav immuuntoksilisus)  
83. Immuunsüsteemi funktsiooni allasurumist või tugevdamist, mida mõõde ­
takse TDAR-meetodiga (T-rakkudest sõltuva antikehareaktsiooni katse), 
tuleks hinnata kõigi muude tähelepanekute kontekstis. TDAR-meetodi tule ­
muste olulisust võivad toetada muud immunoloogiaga seotud näitajad (nt luuüdi rakuline koostis, lümfikudede mass ja histopatoloogia, lümfotsüüdi ­
populatsioonide suhtarvud). TDAR-meetodiga kindlakstehtud mõju ei 
pruugi olla väga oluline, kui juba madalama doosiga kokkupuute juures esineb muid mürgistuse tunnuseid.
 
84. Reproduktiivtoksilisuse ja neurotoksilisuse tulemuste tõlgendamisel tuleks 
vaadata OECD juhenddokumenti nr 43 (26).  
KIRJANDUS  
1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. 
Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers 
and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69–98.
 
2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530- 536.
 
3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.
 
4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI 
Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87–94.  
5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating 
Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicolo ­
gical Sciences , 49, 1–4.  
6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction — a Literature Survey’,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293–327.  
7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356–369.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1–21.
 
9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408–415.  
10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84–97.  
11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York.  
12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology , 13: 383–390.
 
13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Sepa ­
ration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’,  
Biological Reproduction , 17, 298–303.  
14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods , 41, 9–19.  
15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23–35.  
16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92–108.
 
17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility ,54, 103–107.  
18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproductive 
Toxicology ,5, 39–44.  
19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237- 244.
 
20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267–273.
 
21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409–421.  
22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 
449–458.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida. 
pp. 319–333.  
24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401–415.  
25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491–505.  
26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, 
ENV/JM/MONO(2008)16, OECD, Paris.  
27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330–337.  
28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee 
(2006), ‘A “Best Practices” Approach to Neuropathologic Assessment in 
Developmental Neurotoxicity Testing — for Today’,  Toxicological Patho ­
logy, 34, 296–313.  
29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), „Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of 
their Major Components”,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8–16.
 
30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in 
Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives , 115(12), 1717-1726.
 
31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental 
Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints’,  Neurotoxicology and Teratology , 30: 349–381.
 
32) OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for 
Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris.  
33) Käesoleva lisa peatükk B.43. Neurotoksilisuse uuring närilistel.  
34) OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ ­
MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
35) Käesoleva lisa peatükk B.53. Arenguhäireid põhjustava neurotoksilisuse 
uuring.  
36) Käesoleva lisa peatükk B.54. Uterotroofne biokatse närilistel: kiire sõel ­
katse östrogeensete omaduste väljaselgitamiseks.  
37) Käesoleva lisa peatükk B.55. Hershbergeri biokatse rottidel: kiire sõelkatse 
(anti)androgeensete omaduste väljaselgitamiseks  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
38) OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris.  
39) OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.
 
40) OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assess ­
ment, No. 151, OECD, Paris.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
1. liide  
Mõõtmised ja vaatlused, mis kuuluvad funktsionaalvaatluste kompleksi (kohort 2A)  
Kodupuur ja avamaa Manipuleerimiskatsed Füsioloogilised näitajad  
Asend Äravõtmise kergus Temperatuur 
Tahtmatud kloonilised ja tooni ­
lised krambid Kättevõtmise kergus Kehamass 
Silmade sulgemine Lihaste toonus Pupilli reaktsioon 
Turris karv Reaktsioon lähenemisele Pupilli suurus 
Süljevool Reaktsioon puudutusele Pisaravool Helisignaalile reageerimine Häälitsused Reaktsioon saba näpistami ­
sele 
Järglaste hooldamine Reaktsioon asendi muutmi ­
sele 
Kõnnaku kõrvalekalded Tagajalgade laialiajamine 
kukutamisel 
Erutus Esikäpa haardetugevus Stereotüüpne käitumine Tagakäpa haardetugevus Kummaline käitumine Määrdumine Hingamise kõrvalekalded
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
2. liide  
MÕISTED  
Kemikaal  – aine või segu.  
Uuritav kemikaal  – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  H295R STEROIDOGENEESI KATSE  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 456 (2011). 
OECD algatas 1998. aastal prioriteetse tegevussuunana olemasolevate katse ­
juhendite läbivaatamise ja uute väljatöötamise, et sõeluuringutega selgitada välja võimalikud sisesekretsioonisüsteemi kahjustajad ja katsetada neid. OECD 2002. aasta kontseptuaalses raamistikus sisesekretsioonisüsteemi 
kahjustavate kemikaalide katsetamiseks ja hindamiseks on viis taset; igale 
tasemele vastab erinev bioloogilise keerukuse tase (1). Käesolevas katse ­
meetodis kirjeldatud  in vitro  H295R- steroidogeneesi katses (H295R) on 
kasutatud inimese neerupealisevähi rakuliini (NCI-H295R-rakud) ja see 
vastab 2. taseme „ in vitro  katsele, millega saadakse mehhanistlike 
andmeid”, mida kasutatakse sõelumiseks ja selleks, et tunnistada kemikaal erilist tähelepanu nõudvaks. Katse väljatöötamine ja standardimine sõelkat ­
seks, mille abil saaks avastada kemikaalide poolt steroidogeneesile, eriti 
17β-östradiooli (E2) and testosterooni (T) sünteesile avaldatavat mõju, 
toimus mitmeastmelise protsessina. H295R-katse on optimeeritud ja validee ­
ritud (2, 3, 4, 5).
 
2. H295R steroidogeneesi katse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis 
mõjutavad E2 ja T sünteesi. H295R-katse on ette nähtud selliste ksenobioo ­
tikute leidmiseks, mis mõjutavad raku endogeenseid komponente, millest koosneb kolesteroolist E2 ja/või T sünteesini viiv rakusisene biokeemiline 
sünteesirada. H295R-katse ei ole ette nähtud selliste kemikaalide kindlaks ­
tegemiseks, mis mõjutavad steroidogeneesi hüpotalamuse-ajuripatsi- sugunäärmete (HAS) telje kaudu. Katse eesmärk on saada vastus JAH või EI küsimusele, kas kemikaal võib esile kutsuda või pärssida T ja E2 
sünteesi; mõnel juhul võib saada aga ka kvantitatiivse tulemuse (vt punktid 
53 ja 54). Katse tulemused väljendatakse hormoonide sünteesi suhteliste muutustena, võrreldes lahusti kontrolliga. Katse eesmärk ei ole saada konkreetset mehhanismi käsitlevat teavet, kuidas uuritav kemikaal mõjutab 
sisesekretsioonisüsteemi. Teadlased on uurinud kõnealuse rakuliini abil 
mõju konkreetsetele ensüümidele ja vahepealsete hormoonide nagu proges ­
terooni sünteesile (2).
 
3. Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted ja lühendid on esitatud liites. 
Üksikasjalik katse-eeskiri, kuidas valmistada lahuseid, kasvatada rakke ja teha muid katse läbiviimiseks vajalikke töid, on esitatud OECD dokumendi ‘Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Iden ­
tify Modulators of Testosterone and Estradiol Production’ (4) I–III liites.
 
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD  
4. Steroidsete suguhormoonide sünteesis osalevad viis ensüümi, mis katalüü ­
sivad kuue steroidse suguhormooni biosünteesi. Kolesterooli ensümaatiline 
muundamine pregnenolooniks kolesterooli kõrvalahelat lõhustava tsüto ­
kroom P450 (CYP) ensüümi (CYP11A) poolt on steroidsete lõppsaadusteni viiva biokeemiliste reaktsioonide rea esimene etapp. Olenevalt kahe järg ­
mise reaktsiooni järgust hargneb steroidogeenne rada kaheks rajaks, need on 
Δ
 5 -hüdroksüsteroidide rada ja Δ 4 -ketosteroidide rada, mis ühinevad taas 
androsteendiooni sünteesi juures (joonis 1).  
5. Androsteendioon muudetakse 17 β-hüdroksüsteroiddehüdrogenaasi (17 β- 
HSD) poolt testosterooniks (T). Testosteroon on nii vahesaadus kui ka 
lõpphormoonsaadus. Isaslooma organismis võib 5 α-reduktaas muundada 
testosterooni (T) dihüdrotestosterooniks (DHT); 5 α-reduktaasi leidub andro ­
geenide sihtkudede, nagu eesnääre ja seemnepõiekesed, rakumembraanides, tuumaümbrises ja endoplasmaatilises retiikulumis. DHT on oluliselt 
tugevam androgeen kui T ja seda peetakse samuti lõpphormoonsaaduseks. 
H295R-katse abil ei mõõdeta DHT-d (vt punkt 10).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Steroidogeense raja ensüüm, mis muundab androgeensed kemikaalid östro ­
geenseteks kemikaalideks, on aromataas (CYP19). CYP19 muundab 
testosterooni (T) 17 β-östradiooliks (E2) ja androsteendiooni östrooniks. 
Hormoone E2 ja T peetakse steroidogeense raja lõppsaadusteks.  
7. CYP17 lüaasse aktiivsuse spetsiifilisus vahepealsete substraatide suhtes 
oleneb loomaliigist. Inimesel eelistab see ensüüm Δ 5 -hüdroksüsteroidse 
raja substraate (pregnenolooni), samal ajal kui roti puhul on eelistatud Δ 4 - 
ketosteroidse raja substraadid (progesteroon) (19). Sellised erinevused 
CYP17 lüaasses aktiivsuses võivad selgitada mõningaid liigist sõltuvaid erinevusi  in vivo -reaktsioonis steroidogeneesi mõjutavatele kemikaalidele 
(6). On näidatud, et H295R-rakud peegeldavad väga hästi täiskasvanud 
inimese neerupealise ensüümide ekspressiooni ja steroidide sünteesi (20), 
kuid nendes on ekspresseeritud androgeenide sünteesi nii Δ
 5 -hüdroksüste ­
roidse kui ka Δ 4 -ketosteroidse raja ensüümid (7, 11, 13, 15).  
Joonis 1  
Steroidogeenne rada H295R-rakkudes
  
Märkus  
Ensüümid on esitatud kaldkirjas, hormoonid on paksus kirjas ja nooled 
näitavad sünteesi suunda. Halli taustaga on näidatud kortikosteroidsed 
rajad ja saadused. Steroidsete suguhormoonide rajad ja saadused on ümbrit ­
setud ringiga. CYP = tsütokroom P450; HSD = hüdroksüsteroiddehüdroge ­
naas; DHEA = dehüdroepiandrosteroon.  
8. Inimese H295R-adrenokartsinoomi rakud on kasulik  in vitro  mudel steroid ­
hormoonide sünteesile avaldatava mõju uurimiseks (2, 7, 8, 9, 10). H295R- 
rakkudes on ekspresseeritud geenid, milles on kodeeritud eespool steroido ­
geneesi jaoks olulised ensüümid (11, 15) (joonis 1). See on unikaalne omadus, kuna nende geenide  in vivo  ekspressioon sõltub koest ja arengus ­
taadiumist; tavaliselt ei ole üheski koes ega üheski arengustaadiumis 
ekspresseeritud kõik steroidogeneesis osalevad geenid (2). H295R-rakkudel on inimloote tsonaalselt diferentseerumata neerupealiserakkude omadused (11). Need rakud kujutavad endast ainulaadset  in vitro -süsteemi, kuna nad 
on suutelised sünteesima kõiki täiskasvanute neerupealise koores ja sugu ­
näärmetes leiduvaid steroidhormoone ning see võimaldab uurida mõju nii kortikosteroidide sünteesile kui ka steroidsete suguhormoonide nagu andro ­
geenide ja östrogeenide sünteesile, kui katse on valideeritud ainult T ja E2 
määramiseks. Katsesüsteemiga kindlakstehtud T ja E2 sünteesi muutuste 
põhjuseks võivad olla uuritava kemikaali mitmesugused mõjud steroido ­
geensetele funktsioonidele, mis on ekspresseeritud H295R-rakkudes. Need hõlmavad mõju steroidhormoonide sünteesis, muundamises või kõrvalda ­
mises osalevate ensüümide ekspressioonile, sünteesile või funktsioonidele 
(12, 13, 14). Hormoonide sünteesi pidurdamist võib põhjustada otsene
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
konkurents sünteesiraja ensüümile sidumise pärast, mõju sellistele kofakto ­
ritele nagu NADPH (nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaat) ja cAMP 
(tsükliline adenosiinmonofosfaat) ja/või steroidide metabolismi kiirendamine või steroidogeneesi raja mõne ensüümi geeni ekspressiooni allasurumine. Kui sünteesi pidurdamist võib põhjustada hormoonisünteesis osalevate prot ­
sesside otsene või kaudne mõjutamine, siis sünteesi indutseerimine on tava ­
liselt seotud kaudse mõjuga, nagu kofaktorite (nt NADPH, cAMP) mõjuta ­
mine (see toimub forskoliini puhul), steroidide metabolismi vähendamine (13) ja/või steroidogeensete geenide ekspressiooni suurendamine.
 
9. H295R-katsel on rida eeliseid:  
— see võimaldab kindlaks teha nii T ja E2 sünteesi suurenemist kui ka 
vähenemist;  
— see võimaldab otse hinnata kemikaali võimalikku mõju raku eluvõimele 
või tsütotoksilisust. See on oluline, kuna see võimaldab eristada tsüto ­
toksilisusest tingitud mõju sellisest mõjust, mis tuleneb kemikaalide otsesest toimest steroidogeensetele radadele; selline eristamine ei ole võimalik koeeksplantaatide korral, milles on palju eri tundlikkuse ja 
eri funktsioonidega rakutüüpe;
 
— meetod ei nõua loomade kasutamist;  
— rakuliin H295R on kaubanduslikult kättesaadav.  
10. Katsemeetodi peamised piirangud on järgmised:  
— rakkude metaboliseerimisvõime ei ole teada, kuid on tõenäoliselt üsna 
piiratud; seepärast jäävad selle katsega tõenäoliselt avastamata kemi ­
kaalid, mida on vaja metabolismi kaudu aktiveerida;  
— kuna H295R-rakud on saadud neerupealiste koest, on neis olemas 
ensüümid, mis võivad sünteesida glüko- ja mineraalkortikoide, samuti suguhormoone; seetõttu võib mõju glüko- ja mineraalkortikoidide sünteesile mõjutada katses täheldatavat T ja E2 taset;
 
— katsega ei saa määrata DHTd ja sellepärast ei saa määrata kemikaale, 
mis pidurdavad 5 α-reduktaasi; sellisel juhul võib kasutada Hershbergeri 
katset (16);  
— H295R-katsega ei saa avastada kemikaale, mis segavad steroidogeneesi 
hüpotalamuse-ajuripatsi-sugunäärmete (HAS-) telje kaudu; seda omadust 
saab uurida ainult elusloomadel tehtavate katsetega.  
KATSE PÕHIMÕTE  
11. Katse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis mõjutavad T ja E2 
sünteesi. T on E2 sünteesi rajal ühtlasi üks vaheühendeid. Katsega saab 
kindlaks teha kemikaale, mis tavaliselt pidurdavad steroidogeneesi raja 
ensüüme.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Katse tehakse tavaliselt standardse rakukultuuri tingimustes 24 süvendiga 
plaatidel. Katse tegemiseks võib kasutada ka muu suurusega plaate; sellisel 
juhul tuleb külvamist ja katsetingimusi siiski vastavalt kohandada, et järgida tulemuslikkuse kriteeriume.
 
13. Pärast 24-tunnilist kohanemisperioodi süvenditega plaatidel viiakse rakud 
48 tunniks kokkupuutesse uuritava kemikaali seitsme kontsentratsiooniga (vähemalt kolm paralleelkatset). Paralleelselt tehakse katsed lahusti ja teada oleva pidurdaja või aktiveerija ühe kindla kontsentratsiooniga; need 
on negatiivne ja positiivne kontroll. Kokkupuuteperioodi lõpus eemalda ­
takse igast süvendist katsekeskkond. Rakkude elujõulisust igas süvendis kontrollitakse kohe pärast katsekeskkonna eemaldamist. Hormoonide kesk ­
mist kontsentratsiooni katsekeskkonnas saab mõõta eri meetoditega; võib 
kasutada müügil olevaid hormoonide mõõtmise komplekte ja/või kasutada 
instrumentaalseid meetodeid, näiteks vedelikkromatograafia-mass-spektro ­
meetriat (LC-MS). Andmed väljendatakse suhtelise muutusena (kordades), võrreldes muutust lahusti kontrolli ja vähima täheldatavat toimet avaldava 
kontsentratsiooniga ( lowest-observed-effect-concentration , LOEC). Kui 
katse tulemus on negatiivne, teatatakse kõrgeim uuritud kontsentratsioon kui täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon ( no-observed-effect- 
concentration , NOEC). Järeldus kemikaali võime kohta mõjutada steroido ­
geneesi peaks põhinema vähemalt kahel teineteisest sõltumatul katsel. 
Esimese katse võib teha doosivahemiku otsimise katsena, edaspidi kohan ­
datakse katsetes 2 ja 3 (kui need tehakse) kontsentratsioone, kui tekivad raskused lahustuvuse ja tsütotoksilisusega või kui kemikaali toime hakkab 
avalduma alles uuritud kontsentratsioonide vahemiku äärel.
 
RAKUKULTUURI KASVATAMINE  
Rakuliin  
14. NCI-H295R-rakke saab osta Ameerika rakukultuuride kollektsioonist 
(American Type Culture Collections, ATCC) materjali üleandmise lepingu 
(Material Transfer Agreement , MTA) (  1 ) allakirjutamisel.  
Sissejuhatus  
15. Kuna rakkude võime toota E2 muutub rakkude vanuse või passaažide arvu 
suurenemisega (2), tuleks rakke enne nende kasutamist kasvatada teatavate 
eeskirjade järgi, ning üles tuleks märkida passaažide arv pärast rakkude ülessulatamist ja passaaži number, mille juures rakud külmutati ja pandi vedelasse lämmastikku. Esimene number on tegelik rakupassaaži number 
ja teine number näitab rakupassaaži, milles rakud külmutati ja pandi hoiule. 
Näiteks rakud, mis külmutati pärast viiendat passaaži ning sulatati ja seejärel eraldati aluselt kolm korda (4 passaaži, kui loeme värskelt sulatatud rakud passaažiks 1) pärast seda, kui neid oli jälle kasvatatud, saavad 
märgise 4.5. Nummerdamisskeemi kohta on esitatud näide valideerimisa ­
ruande I liites (4).
 
16. Säilituskeskkonda kasutatakse täiendatud keskkonna ja külmutamiskesk ­
konna alusena. Täiendatud keskkond on rakkude kasvatamise vajalik komponent. Külmutamiskeskkond on spetsiaalselt välja töötatud selleks, et rakke saaks kahjustamatult külmutada pikaajaliseks säilitamiseks. Enne 
kasutamist tuleks Nu-seerumit (vm sarnaste omadustega seerumit, mille 
kohta on näidatud, et see vastab katse tegemise ja kvaliteedikontrolli nõue ­
tele), mis on lisatud keskkonna osa, analüüsida, et teha kindlaks T ja E2 taustkontsentratsioon. Nende lahuste valmistamist on kirjeldatud valideeri ­
misaruande II liites (4).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA (http://www.lgcstandards-atcc.org/).
 17. Pärast H295R-rakkude kultuuri alustamist ATCC-originaalpartiist tuleb 
rakke kasvatada viie passaaži jooksul (st rakke eraldatakse aluselt 4 
korda). Viienda passaaži rakud külmutatakse seejärel säilitamiseks vedelas lämmastikus. Enne rakkude külmutamist kasvatatakse eelmise, neljanda passaaži rakke kvaliteedikontrolli plaadil (vt punktid 36 ja 37), millega 
kontrollitakse, et hormoonide baasproduktsioon ja reageering positiivse 
kontrolli kemikaalidele vastaksid katse kvaliteedikontrolli kriteeriumidele, mis on esitatud tabelis 5.
 
18. H295R-rakke tuleb kasvatada, külmutada ja hoida vedelas lämmastikus selle 
tagamiseks, et alati on kättesaadavad vajaliku passaaži/vajalikus vanuses rakud kasvatamiseks ja kasutamiseks. H295R-katse puhul lubatav passaa ­ 
žide maksimaalne arv pärast uue (
 1 ) või külmutatud (  2 ) rakupartii kultuuri 
võtmist ei tohiks olla üle 10. Näiteks sobivad rakukultuuride passaažid, mis on võetud 5. passaažis külmutatud partiist, on 4.5 kuni 10.5. Külmutatud partiist alustatud rakukultuuri puhul tuleb järgida punktis 19 kirjeldatud 
korda. Neid rakke tuleks kasvatada vähemalt neljas (4) täiendavas passaažis 
(passaaž 4.5), enne kui neid kasutatakse katses.
 
Rakkude võtmine külmutatud varukultuurist  
19. Rakkude külmutatud varukultuurist võtmise korda tuleb kasutada siis, kui 
uus partii rakke võetakse välja vedela lämmastikuga hoidlast kasvatamiseks ja katses kasutamiseks. Toimimise üksikasjad on esitatud valideerimisuu ­
ringu III liites (4). Rakud eemaldatakse vedela lämmastikuga hoidlast, sula ­
tatakse kiiresti, pannakse tsentrifuugitopsis olevasse täiendatud keskkonda, 
tsentrifuugitakse toatemperatuuril, suspendeeritakse uuesti täiendatud kesk ­
konnas ja viiakse üle kultuurikolbi. Keskkonda tuleks järgmisel päeval 
vahetada. H295R-rakke kasvatatakse inkubaatoris 37 °C juures õhuatmos ­
fääris, mis sisaldab 5 % CO
 2 , ja keskkonda uuendatakse 2–3 korda nädalas. 
Kui rakukultuur saavutab ligikaudu 85–90 % laatumise (konfluentsuse), tuleb kultuur eraldada aluselt. Rakkude aluselt eraldamine on vajalik 
nende tervise ja kasvu tagamiseks, et need oleksid biokatse tegemiseks 
vajalikus seisundis. Rakke loputatakse kolm korda fosfaatpuhvrit sisaldava soolalahusega (mis ei sisalda Ca
 2+ ega Mg  2+ ) ja vabastatakse rakud kultuu ­
rikolvist, milleks lisatakse sobivat ensüümi, mis aitab rakkudel eralduda, nt 
trüpsiiniga fosfaatpuhvrit sisaldava soolalahusega (mis ei sisalda Ca  2+ ega 
Mg 2+ ). Kohe pärast rakkude eraldumist kultuurikolvist tuleks ensüümi toime 
peatada, milleks lisatakse kolm korda suurem kogus täiendatud keskkonda, kui selle lahuse maht, mida kasutati ensüümiga töötlemisel. Rakud viiakse 
üle tsentrifuugitopsi, tsentrifuugitakse toatemperatuuril, supernatant eemal ­
datakse ja tsentrifuugitud rakukogum suspendeeritakse uuesti täiendatud keskkonnas. Sobiv kogus rakkudega lahust pannakse uude kultuurikolbi. Rakkudega lahuse kogus tuleks reguleerida selliseks, et rakud laatuvad 
5–7 päevaga. Soovitatav alamkultuuri suhtarv on 1: 3 kuni 1: 4. Tass tuleks 
hoolikalt märgistada. Rakud on nüüd valmis katses kasutamiseks ja liigsed rakud tuleks külmutada vedelas lämmastikus, nagu on kirjeldatud punktis 20.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) „Uus partii” — uus rakkude partii, mis on saadud ATCC-lt. 
( 2 ) „Külmutatud partii” — rakke on varem kasvatatud ja siis külmutatud mujal kui ATCC-s.
 H295R-rakkude külmutamine (rakkude ettevalmistamine vedelas 
lämmastikus säilitamiseks)  
20. H295R-rakkude ettevalmistamisel külmutamiseks tuleks korrata eespool 
kirjeldatud rakkude eraldamisel kasutatud korda kuni tsentrifuugitopsi põhja kogutud rakkude uuesti suspendeerimiseni. Seekord suspendeeritakse tsentrifuugitud rakkudekogum külmutamiskeskkonnas. Rakkudega lahus 
viiakse üle krüoviaali, märgistatakse, nagu vaja, ja külmutatakse 24 tundi 
– 80 °C juures, mille järel viaal pannakse hoiule vedelasse lämmastikku. Toimimise üksikasjad on esitatud valideerimisuuringu III liites (4).
 
Rakkude kandmine plaadile ja eelinkubeerimine katse tegemiseks  
21. Katse tegemiseks vajalike punktis 19 esitatud juhendite kohaselt ettevalmis ­
tatud 24 süvendiga plaatide arv sõltub uuritavate kemikaalide arvust ja 
rakkude laatumisest kultuuritassidel. Üldreeglina saab ühest kultuurikolvist (75 cm
 2 ), milles laatumismäär on 80–90 %, piisava hulga rakke 1,5 (24 
süvendiga) plaadi jaoks, kui vajalik rakkude tihedus on 200 000 kuni 
300 000 rakku keskkonna ml-s, mis tekitab umbes 50–60 % laatumise süve ­
ndites 24 tunniga (joonis 2). See on tavaliselt sobivaim rakkude tihedus katses hormoonide sünteesiks. Suurema tiheduse juures muutub T ja ka 
E2 sünteesi ajaline käik. Enne katse esmakordset tegemist soovitatakse 
katsetada mitut külvamistihedust vahemikus 200 000 kuni 300 000 rakku ml-s ja edasisteks katseteks tuleks valida selline tihedus, mis annab 50–60 % laatumise süvendites 24 tunniga.
 
Joonis 2  
H295R-rakkude mikrofoto külvamistihedusel 50 % 24 süvendiga plaadil pärast 24 tundi: 
A — süvendi äärel; B — süvendi keskel
  
22. Keskkond eemaldatakse kultuurikolvist pipetiga ja rakke loputatakse 3 
korda steriilse fosfaatpuhvrit sisaldava soolalahusega (mis ei sisalda Ca  2+ 
ega Mg  2+ ). Lisatakse ensüümi lahust samas fosfaatpuhvrit sisaldavas soola ­
lahuses, et eraldada rakud kultuurikolvist. Rakkude eraldumiseks sobiva aja 
järel tuleks ensüümi toime peatada, milleks lisatakse kolm korda kogus 
täiendatud keskkonda, kui selle lahuse maht, mida kasutati ensüümiga tööt ­
lemisel. Rakud viiakse üle tsentrifuugitopsi, tsentrifuugitakse toatempera ­
tuuril, supernatant eemaldatakse ja tsentrifuugitud rakukogum suspendeeri ­
takse uuesti täiendatud keskkonnas. Arvutatakse rakkude tihedus, kasutades 
näiteks hematotsütomeetrit või rakuloendajat. Rakkudega lahust tuleks  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
lahjendada kuni vajaliku külvamistiheduseni ja segada hoolikalt, et tagada 
rakkude ühtlane tihedus. Rakud tuleks kanda plaadile, 1 ml rakkudega 
lahust igasse süvendisse, ning plaadid ja süvendid märgistatakse. Rakku ­
dega plaate inkubeeritakse 24 tundi 37 °C juures õhuatmosfääris, mis sisaldab 5 % CO
 2 , et lasta rakkudel kinnituda süvenditele.  
KVALITEEDIKONTROLLI NÕUDED  
23. On väga oluline, et süvenditesse pandaks täpne maht lahuseid ja dooside 
lisamisel proove, kuna need mahud määravad kontsentratsioonid, mida 
kasutatakse katsetulemuste arvutamisel.  
24. Enne rakukultuuri loomist ja edasist katsete tegemist peaks iga labor 
näitama, et tema hormoonide määramise süsteem on piisavalt tundlik 
(punktid 29–31).  
25. Kui hormoonide määramiseks kasutatakse antikehapõhiseid katseid, tuleks 
enne katse alustamist kontrollida, kas uuritavad kemikaalid võivad segada T ja E2 mõõtmist vastavalt punktis 32 kirjeldatule.
 
26. Katse puhul soovitatakse lahustina kasutada dimetüülsulfoksiidi (DMSO). 
Kui kasutatakse muud lahustit, tuleks määrata:  
— uuritava kemikaali, forskoliini ja prokloraasi lahustuvus selles lahustis 
ning 
— tsütotoksilisus funktsioonina lahusti kontsentratsioonist.  
Soovitatakse, et lahusti suurim lubatav kontsentratsioon ei oleks kõrgem kui 
solvendi madalaima tsütotoksilise kontsentratsiooni 10-kordne lahjendus.  
27. Enne katse esmakordset tegemist peaks labor läbi tegema kvalifikatsiooni ­
katse, mis näitab, et labor suudab hooldada rakukultuuri ning saavutada rakukultuuri ja eksperimenditingimused, mis on vajalikud kemikaali katse ­
tamiseks, nagu on kirjeldatud punktides 33–35.
 
28. Katsete alustamisel uue partiiga tuleks enne uue partii rakkude kasutamist 
teha katse kontrollplaadiga, et hinnata rakkude toimimist, nagu on kirjel ­
datud punktides 36 ja 37.  
Hormoonide määramise süsteemi toimimine  
Meetodi tundlikkus, mõõtetäpsus ja kordustäpsus ning ristreaktsioonid 
proovi maatriksiga  
29. Iga labor võib ise valida hormoonide mõõtmise süsteemi, mida ta kasutab 
H295R poolt sünteesitud T ja E2 määramiseks, tingimusel, et see vastab tulemuslikkuse kriteeriumidele, sealjuures mõõtmispiirile ( Limit of Quanti ­
fication , LOQ). Nominaalselt on need 100 pg/ml T puhul ja 10 pg/ml E2 
puhul; väärtused põhinevad valideerimisuuringus leitud normaalsetel hormoonitaseme baasväärtustel. Kuid ka kõrgem või madalam tase võib olla sobiv; see oleneb hormoonide baastasemest, mis on määratud katset 
tegevas laboris. Enne edikontrolli plaadi ja uuritava kemikaali katsete käivi ­
tamist peaks labor tõendama, et kasutatava hormoonide määramise katsega saab hormoonide kontsentratsiooni mõõta täiendatud keskkonnas piisava mõõtmis- ja kordustäpsusega, et täita tabelites 1 ja 5 esitatud kvaliteedikon ­
trolli kriteeriumid; selleks analüüsitakse täiendatud keskkonda, mida on 
tembitud hormooni sisestandardiga. Täiendatud keskkonda peaks olema
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
tembitud kummagi hormooniga vähemalt kolmel kontsentratsioonil (nt 100, 
500 ja 2 500 pg/ml T-d; 10, 50 ja 250 pg/ml E2; T ja E2-ga tempimise 
kõige madalama määrana võib kasutada ka kõige madalamaid võimalikke kontsentratsioone, arvestades valitud hormoonide määramise süsteemi avas ­
tamispiiri) ja need tuleks määrata. Ekstraheerimata proovides mõõdetud 
hormoonide kontsentratsioonid tohivad nominaalsest kontsentratsioonist 
erineda kuni 30 % ja sama proovi paralleelmõõtmiste erinevus ei tohiks olla üle 25 % (vt ka tabel 8, täiendavad kvaliteedikontrolli kriteeriumid). Kui need kvaliteedikontrolli kriteeriumid on täidetud, siis eeldatakse, et 
valitud hormoonide määramise süsteem on piisavalt täpne, korratav ja ei 
esine ristreaktsioone keskkonnaga (proovi maatriks), mis võiksid oluliselt mõjutada katse tulemust. Sellisel juhul ei ole enne hormoonide mõõtmist vaja proove ekstraheerida.
 
30. Kui tabelites 1 ja 8 esitatud kvaliteedikontrolli kriteeriumid ei ole täidetud, 
võib olla tegemist olulise maatriksiefektiga; sel juhul tuleb teha katse tembitud keskkonnaga ja ekstraheerida hormoonid. Ekstraheerimise käigu 
kohta on esitatud näide valideerimisaruande II liites (4). Hormoonide kont ­
sentratsiooni mõõtmisel ekstraheeritud proovidest tuleks teha kolm paralleelkatset (
 1 ). Kui on võimalik näidata, et pärast ekstraheerimist kesk ­
konna komponendid ei sega hormoonide määramise meetodit, nagu on 
määratletud kvaliteedikontrolli kriteeriumidega, tuleks kõik edaspidised 
katsed teha ekstraheeritud proovidega. Kui pärast ekstraheerimist ei õnnestu kvaliteedikontrolli kriteeriume täita, siis ei ole kasutatav hormoonide määra ­
mise süsteem sobiv H295R steroidogeneesi katses kasutamiseks ja tuleb 
kasutada muud hormoonide määramise meetodit.
 
Standardkõver  
31. Lahusti kontrolli katsetest määratavad hormoonide kontsentratsioonid 
peaksid olema standardkõvera lineaarse osa peal. Eelistatavalt peaksid 
lahusti kontrolli tulemused asuma lineaarse osa keskel, mis tõendaks, et 
on võimalik mõõta nii hormoonisünteesi pärssimist kui ka aktiveerimist. Vastavalt sellele tuleks valida keskkonna (või ekstraktide) lahjendused, mis tehakse enne mõõtmist. Lineaarne sõltuvus määratakse kindlaks sobiva 
statistilise meetodiga.
 
Kemikaali häiriva mõju katse  
32. Kui hormoonide määramiseks kasutatakse antikeha-põhiseid meetodeid 
nagu ensüümimmuunsorptsioonanalüüs (ELISA) ja radioimmuunanalüüs 
(RIA), tuleks enne kemikaalidega tegelike katsete tegemist kontrollida kemikaalide võimalikku segavat mõju (valideerimisaruande III liide (4)), kuna mõni kemikaal võib neid katseid segada (17). Kui esineb segamine, 
mis on ≥ 20 % hormoonide T ja/või E2 baastasemest, mis määratakse 
hormoonianalüüsiga, tuleb kõigi uuritavate kemikaalide varulahuse lahjen ­
dustega teha hormoonide analüüsile kemikaali poolt avaldatava segava mõju
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Märkus : kui on vajalik ekstraheerimine, tehakse iga ekstraktiga kolm paralleelset määra ­
mist. Iga proovi ekstraheeritakse ainult üks kord.
 katse (nagu on kirjeldatud valideerimisaruande (4) III liites, jaotis 5.0), et 
teha kindlaks lävidoos, mille juures esineb oluline ( ≥ 20 %) segamine. Kui 
segamine on alla 30 %, võib segamise arvestamiseks viia tulemusse sisse parandi. Kui segamine on üle 30 %, on andmed kõlbmatud ja selliste kont ­
sentratsioonide juures saadud andmed tuleks jätta arvestamata. Kui uuritav 
kemikaal segab oluliselt hormoonide määramist rohkem kui ühel kontsen ­
tratsioonil, mis ei ole tsütotoksiline, tuleb kasutada muud hormoonide määramise süsteemi. Selleks et vältida saastavate kemikaalide segavat mõju, on soovitatav hormoonid keskkonnast sobiva lahustiga ekstraheerida; 
võimalikud meetodid on esitatud valideerimisaruandes (4).
 
Tabel 1  
Tulemuste õigsuse kriteeriumid hormoonide mõõtmise süsteemide puhul  
Näitaja Kriteerium  
Mõõtmismeetodi tundlikkus Mõõtmispiir 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Hormoonide ekstraheerimise 
tõhusus (ainult siis, kui on vaja ekstraheerida) Tembitud hormooniproovide kesk ­
mine ekstraheerimismäär (mis põhineb kolmel mõõtmisel) ei tohiks erineda üle 30 % lisatud kogusest. 
Kemikaali segav mõju (ainult 
antikeha-põhised süsteemid) Olulisi ristreaktsioone (> 30 % 
vastava hormooni baastasemest) ei 
ole ühegi raku poolt sünteesitava 
hormooniga (
 b ) ( c ). 
( a ) Märkus:  meetodi mõõtmispiirid põhinevad tabelis 5 esitatud hormoonide sünteesi 
baastaseme väärtustel ja sõltuvad määramise kvaliteedist. Kui saavutatakse 
kõrgem hormoonide baastase, võib piir olla kõrgem. 
( b ) Mõned T ja E2 antikehad võivad suurema protsendimäära korral ristreageerida 
vastavalt androsteendiooni ja östrooniga. Sellisel juhul ei ole võimalik õigesti 
määrata mõju 17 β-hüdroksüsteroiddehüdrogenaasile. Siiski võib andmetest saada 
kasulikku teavet mõju kohta üldisele östrogeenide või androgeenide sünteesile. 
Sellistel juhtudel tuleks andmed väljendada pigem androgeeni/östrogeeni toimena, 
mitte E2 ja T-na. 
( c ) Need hõlmavad järgmisi: kolesterool, pregnenoloon, progesteroon, 11-desoksükor ­
tikosteroon, kortikosteroon, aldosteroon, 17 α-pregnenoloon, 17 α-progesteroon, 
desoksükortisool, kortisool, DHEA, androsteendioon, östroon.  
Labori pädevuse katse  
33. Enne tundmatu kemikaali katsetamist peaks labor näitama, et ta suudab 
saavutada ja säilitada asjakohast rakukultuuri ja katsetingimusi, mis on vajalikud katse edukaks läbiviimiseks; selleks tehakse labori pädevuse katse. Kuna katse tulemuslikkus sõltub otseselt laboris analüüsi tegevatest 
inimestest, tuleb neid katseid osaliselt korrata, kui labori töötajaskonnas on 
muutusi.
 
34. Labori pädevuse katse tehakse samades tingimustes, mis on loetletud punk ­
tides 38–40: rakud viiakse kokkupuutesse tugeva, mõõduka ja nõrga akti ­
vaatori ja pärssija 7 kontsentratsiooniga ja negatiivse kemikaaliga (vt tabel 2). Konkreetselt kuuluvad uuritavate ainete hulka järgmised kemikaalid: tugev aktivaator forskoliin (CASi nr 66575-29-9); tugev pärssija prokloraas 
(CASi nr 67747-09-5); mõõdukas aktivaator atrasiin (CASi nr 1912-24-9); 
mõõdukas pärssija aminoglutetimiid (CASi nr 125-84-8); nõrk (E2 sünteesi)
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
aktivaator ja nõrk (T sünteesi) pärssija bisfenool A (CASi nr 80-05-7) ning 
negatiivne kemikaal inimese kooriongonadotropiin (HCG) (CASi nr 9002- 
61-3), vt tabel 2. Eraldi plaatidel tehakse katsed kõigi kemikaalidega, kasu ­
tades tabelis 6 näidatud formaati. Iga päev tuleb koos katsetega teha ka üks katse kvaliteedikontrolli plaadiga (tabel 4, punktid 36-37), millele pannakse 
labori pädevuse kontrollimise kemikaalid.
 
Tabel 2  
Pädevuse kontrollimise kemikaalid ja kokkupuutekontsentratsioonid  
Pädevuse kontrollimise kemi ­
kaal Uuritavad kontsentratsioonid [ μM] 
prokloraas 0 (  a ), 0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1, 3, 10 
forskoliin 0 (  a ), 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3, 10, 30 
atrasiin 0 (  a ), 0,03; 0,1; 1; 3; 10, 30, 100 
aminoglutetimiid 0 (  a ), 0,03; 0,1; 1; 3; 10, 30, 100 
bisfenool A 0 (  a ), 0,03; 0,1; 1; 3; 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03; 0,1; 1; 3; 10, 30, 100  
( a ) Lahusti (DMSO) kontroll (0), 1 μl DMSOd süvendisse.  
H295R kokkupuude pädevuse kontrollimise kemikaalidega tuleks teha 24 
süvendiga plaatidel labori pädevuse kontrollimise katse ajal. Doosi ühik kõigi uuritavate kemikaalide puhul on μM. Doosid tuleks manustada 
DMSO-lahusena, 0,1 mahuprotsenti igasse süvendisse. Iga uuritavat kont ­
sentratsiooni tuleks katsetada kolmes süvendis (tabel 6). Iga kemikaali uuri ­
takse eraldi plaadil. Iga päev lisatakse plaatide hulka üks kvaliteedikontrolli plaat.
 
35. Rakkude elujõulisuse ja hormoonide analüüsid tuleb teha vastavalt punkti ­
dele 42–46. Teatatakse läviväärtus (vähim avastatava mõjuga kontsentrat ­
sioon,  lowest observed effect concentration , LOEC) ja otsus klassifitseeri ­
mise kohta ning tulemusi võrreldakse tabelis 3 esitatud väärtustega. Andmed loetakse kasutamiskõlblikuks, kui need vastavad LOEC-le ja klas ­
sifitseerimisotsusele, mis on esitatud tabelis 3.
 
Tabel 3  
Läviväärtused (LOEC) ja klassifitseerimisotsused pädevuse kontrollimise kemikaalide 
puhul  
CASi number LOEC [μM] Klassifitseerimisotsus 
T E2 T E2  
prokloraas 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (Pärssimine) + (pärssimine) 
forskoliin 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (aktiveerimine) + (aktiveerimine) 
atrasiin 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (aktiveerimine) + (aktiveerimine) 
aminoglutetimiid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (pärssimine) + (pärssimine)  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
CASi number LOEC [μM] Klassifitseerimisotsus 
T E2 T E2  
bisfenool A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (pärssimine) + (aktiveerimine) 
HCG 9002-61-3 Puudub Puudub Negatiivne Negatiivne  
( a ) +, positiivne 
Puudub: ei kohaldata, kuna pärast kokkupuudet negatiivse kontrolli mittetsütotoksilise kontsentratsiooniga ei tohiks muutusi olla.
 
Kvaliteedikontrolli plaat  
36. Kvaliteedikontrolli plaati kasutatakse H295R-rakkude toimimise tõendami ­
seks rakkude kasvatamise standardtingimustes ja varasemate katsete andme ­
baasi loomiseks, millesse pannakse hormoonide kontsentratsioon lahusti 
kontrolli katsetes, positiivse ja negatiivse kontrolli katsetes, samuti varase ­
mate katsete muud kvaliteedikontrolli peegeldavad näitajad.  
— H295R-rakkude toimimist tuleks hinnata nii, et kvaliteedikontrolli plaa ­
diga kontrollitakse iga uut ATCC partiid, samuti varem külmutatud rakkude iga sulatatud partiid, kui sama rakkude partiiga ei tehta labori pädevuse katset (punktid 32–34).
 
— Üks kvaliteedikontrolli plaat võimaldab täielikult hinnata katse tingimusi 
(nt rakkude elujõulisus, lahusti kontrollid, negatiivsed ja positiivsed 
kontrollid, samuti katsetevaheline ja katsesisene varieeruvus) kemikaali katsetamisel ning see peaks kuuluma iga katse juurde.
 
37. Kvaliteedikontrolli katse tehakse 24 süvendiga plaadil ja selle puhul kasu ­
tatakse samasugust inkubeerimise, dooside manustamise, rakkude eluvõime ­
lisuse või tsütotoksilisuse määramise, hormoonide ekstraheerimise ja 
analüüsimise korda, mida on kirjeldatud punktides 38–46 kemikaalide 
katsetamiseks. Kvaliteedikontrolli plaadil on tühikatsed, lahusti kontrollid ning E2 ja T teadaoleva aktivaatori kaks kontsentratsiooni (forskoliin, 1 ja 10 μM) ning teadaoleva pärssija kaks kontsentratsiooni (prokloraas, 0,1 
ja 1 μM). Lisaks kasutatakse MeOH teatavates süvendites kui rakkude 
eluvõimelisuse/tsütotoksilisuse positiivset kontrolli. Plaadi üksikasjalik kirjeldus on esitatud tabelis 4. Kriteeriumid, millele peavad vastama kvali ­
teedikontrolli plaadi tulemused, on loetletud tabelis 5. Nii lahusti kontrolli 
kui ka tühikatsete süvendites tuleb saavutada T ja E2 sünteesi minimaalne 
baastase.
 
Tabel 4  
Kvaliteedikontrolli plaat, millega kontrollitakse mõjutamata H295R-rakkude ja 
teadaolevate pärssijatega (PRO — prokloraas) ja aktiveerijate (FOR — forskoliin) kokkupuutes olevate H295R-rakkude E2 ja T sünteesi. Pärast kokkupuutekatse 
lõpetamist ja keskkonna kõrvaldamist lisatakse kõikidesse MeOH süvenditesse 70 % 
metanoolilahust; see on tsütotoksilisuse positiivne kontroll (vt tsütotoksilisuse katse 
valideerimisaruande (4) III liites)
 
1 2 3 4 5 6  
A Tühi ­
katse (  a ) Tühi­
katse (  a ) Tühi­
katse (  a ) Tühikatse (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Tühikatse (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Tühikatse (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Tühikatse süvendites olevatele rakkudele lisatakse ainult keskkonda (st lahustit ei lisata). 
( b ) Metanool (MeOH) lisatakse  pärast seda, kui kokkupuude on lõpetatud ja keskkond on nendest süve ­
nditest eemaldatud. 
( c ) DMSO lahusti kontrolli katse (1 μl süvendi kohta).  
Tabel 5  
Kvaliteedikontrolli plaadi tulemuslikkuse kriteeriumid  
T E2  
Hormoonide baassüntees 
lahusti kontrollis (SC) ≥ 5 korda LOQ ≥ 2,5 korda LOQ 
Aktiveerimine (10 μM 
forskoliin) ≥ 1,5 korda SC ≥ 7,5 korda SC 
Pärssimine (1 μM proklo ­
raas) ≥ 0,5 korda SC ≥ 0,5 korda SC  
KEMIKAALIGA KOKKUPUUTESSE VIIMINE  
38. Eelinkubeeritud rakud võetakse inkubaatorist välja (punkt 21) ja kontrolli ­
takse mikroskoobi all, et teha kindlaks, kas need on heas seisundis (klee ­
pumine, morfoloogia) enne kemikaaliga kokkupuutesse viimist.  
39. Rakud pannakse bioohutuskambrisse ja eemaldatakse täiendatud keskkond 
ning asendatakse uue täiendatud keskkonnaga (1 ml süvendi kohta). Käes ­
oleva katsemeetodi puhul on eelistatud lahusti DMSO. Kui on olemas põhjusi muude lahustite kasutamiseks, tuleks esitada teaduslik põhjendus. 
Rakud viiakse uuritava kemikaaliga kokkupuutesse, milleks lisatakse 1 μl 
sobivat põhilahust dimetüülsulfoksiidis (vt valideerimisaruande (4) II liide) süvendis oleva täiendatud keskkonna 1 ml kohta (süvendi maht). Sellega saavutatakse süvendites DMSO lõppkontsentratsioon 0,1 %. Vajaliku sega ­
mise kindlustamiseks eelistatakse üldiselt segada uuritava kemikaali sobiv 
põhilahus DMSOs täiendatud keskkonnaga, et saada iga doosi vajalik lõpp ­
kontsentratsioon, ja selline segu lisatakse igasse süvendisse kohe pärast vana keskkonna eemaldamist. Kui kasutatakse sellist varianti, peaks 
DMSO kontsentratsioon (0,1 %) olema ühesugune kõikides süvendites. 
Süvendeid, milles on kaks kõige kõrgemat kontsentratsiooni, kontrollitakse visuaalselt stereomikroskoobiga, et neis ei oleks sadet ega hägu, mis osutaks kemikaali ebapiisavale lahustuvusele. Kui leitakse hägusust või sademe 
tekkimist, kontrollitakse ka järgmise kahe kontsentratsiooniga süvendeid 
(jne); kontsentratsioone, mille juures ei saavutatud täielikku lahustumist, ei arvestata edasisel hindamisel ja analüüsil. Plaat pannakse tagasi inkubaa ­
torisse 37 °C juurde 5 % CO
 2 -sisaldusega õhu atmosfääri 48 tunniks. Uuri ­
tava kemikaaliga katse plaat on näidatud tabelis 6. Põhilahused 1–7 
näitavad uuritava kemikaali suurenevate dooside paigutust.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabel 6  
Dooside manustamise skeem H295R-rakkude kokkupuutel uuritava kemikaaliga 
24-süvendilisel plaadil  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Põhilahus 4 Põhilahus 
4 Põhilahus 4 
B Põhilahus 1 Põhilahus 1 Põhilahus 1 Põhilahus 5 Põhilahus 
5 Põhilahus 5 
C Põhilahus 2 Põhilahus 2 Põhilahus 2 Põhilahus 6 Põhilahus 
6 Põhilahus 6 
D Põhilahus 3 Põhilahus 3 Põhilahus 3 Põhilahus 7 Põhilahus 
7 Põhilahus 7  
40. Pärast 48-tunnilist kokkupuudet võetakse plaadid inkubaatorist ja iga süve ­
ndit kontrollitakse mikroskoobiga rakkude seisundi (kleepumine, morfo ­
loogia, laatumise määr) ja tsütotoksikoloogilisuse suhtes. Iga süvendi kesk ­
kond jagatakse kaheks võrdseks osaks (kumbki ligikaudu 490 μl) ja 
kantakse kahte korralikult märgistatud viaali (st üks alikvoot annab iga süvendi kohta varuproovi). Rakkude kuivamise vältimiseks eemaldatakse 
keskkond korraga ühe rea süvenditest ja asendatakse keskkonnaga rakkude 
eluvõimelisuse (tsütotoksilisuse) katseks. Kui rakkude eluvõimelisust (tsüto ­
toksilisust) kohe määrama ei hakata, lisatakse igasse süvendisse 200 μl 
fosfaatpuhvrit sisaldavat soolalahust, mis sisaldab Ca
 2+ ja Mg  2+ . Keskkond 
külmutatakse – 80 °C juures kuni edasise töötlemiseni hormoonikontsen ­
tratsioonide määramiseks (vt punktid 44–46). T ja E2 on – 80 °C juures hoitavas keskkonnas üldiselt stabiilsed vähemalt kolm kuud, kuid hormoo ­
nide stabiilsus säilitamisel tuleks dokumentaalselt tõendada igas laboris.
 
41. Kohe pärast keskkonna eemaldamist määratakse igal kemikaaliga kokku ­
puute plaadil rakkude eluvõimelisus/tsütotoksilisus.  
Rakkude eluvõimelisuse määramine  
42. Rakkude eluvõimelisuse/tsütotoksilisuse katset võib teha mitmel viisil; katse 
eesmärk on teha kindlaks kemikaali võimalik mõju rakkude eluvõimele. 
Katsega peaks saama määrata süvendis olevate eluvõimeliste rakkude tege ­
likku protsendimäära või tuleb näidata, et see on võrreldav katsega Live/ ­
Dead® (on selle lineaarne funktsioon) (vt valideerimisaruande (4) III liide). Samavõrra hästi töötab teine katse MTT-ga ([3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)- 
2,5-difenüültetrasooliumbromiid] (18)). Rakkude eluvõimelisuse hindamine 
nimetatud meetoditega on suhteline ja selle puhul ei pruugi tingimata olla lineaarset sõltuvust süvendis olevate rakkude absoluutsest arvust. Seepärast tuleks igas süvendis rakke paralleelselt hinnata ka silmaga ning teha lahusti 
kontrolli ja kahe kõrgeima mittetsütotoksilise kontsentratsiooni katse digi ­
taalpildid arhiivi jaoks, et hiljem oleks võimalik määrata tegelikku rakkude tihedust, kui seda on vaja. Kui visuaalne kontrollimine või eluvõimelisu ­
se/tsütotoksilisuse katse näitab rakkude arvu suurenemist, tuleb seda näilist 
kasvu kontrollida. Kui rakkude arvu suurenemist kontrollitakse, tuleks see 
märkida katseprotokolli. Rakkude eluvõimelisus väljendatakse suhtena lahusti kontrolli katsete keskmisse tulemusse; viimast peetakse 100 % eluvõimelisuseks ja see arvutatakse vastavalt kasutatava rakkude eluvõime ­
lisuse/tsütoloogilisuse katse eeskirjale. MTT-katse puhul võib kasutada järg ­
mist valemit:
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
eluvõimeliste rakkude % =  (väärtus süvendis – MeOH-ga [= 100 % 
surnud] süvendite keskväärtus) ÷ (lahustikontrolli süvendite keskväärtus – 
MeOH-ga [= 100 % surnud] süvendite keskväärtus)  
43. Süvendid, milles eluvõimelisus on alla 80 % võrreldes keskmise eluvõime ­
lisusega lahusti kontrolli katsetes (= 100 % eluvõimelisus), tuleks lõplikust andmete analüüsist välja jätta. Kui steroidogeneesi pärssimine toimub 
peaaegu 20-protsendilise tsütotoksilisuse juures, tuleb tulemust hoolikalt 
hinnata ja tõendada, et pärssimise põhjuseks ei ole tsütotoksilisus.
 
Hormoonide analüüs  
44. Iga labor võib kasutada vabalt valitud süsteemi hormoonide T ja E2 mõõt ­
miseks. Iga doosirühma vabasid keskkonna alikvoote võib kasutada lahjen ­
duste tegemiseks, et viia kontsentratsioon standardkõvera lineaarsesse 
osasse. Nagu märgitud punktis 29, peaks iga labor tõendama, et tema 
hormoonide määramise süsteem (nt ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) vastab kvaliteedikontrolli kriteeriumidele. Selle jaoks tuleb enne kvaliteedi ­
kontrolli katseid või kemikaalide katsetamist täiendatud keskkonda tempida 
hormooni sisestandardiga. Selleks et tagada, et katsesüsteemi komponendid 
ei segaks hormoonide määramist, võib olla vajalik need enne määramist keskkonnast ekstraheerida (vt punkt 30, millistel tingimustel ekstraheeri ­
mine on või ei ole vajalik). On soovitatav teha ekstraheerimine nii, nagu 
on kirjeldatud valideerimisaruande (4) III liites.
 
45. Kui hormoonide sünteesi mõõdetakse kaubandusliku katsekomplektiga, 
tuleb hormoonide analüüs teha vastavalt katsekomplekti tootja juhenditele. Enamikul tootjatest on oma individuaalne meetod hormoonide analüüsi 
tegemiseks. Uuritavaid proove on vaja lahjendada nii, et eeldatavad 
hormoonide kontsentratsioonid lahusti kontrolli katsetes langevad üksik ­
katse standardkõveral lineaarse osa keskele (valideerimisaruande (4) III liide). Väärtused väljaspool standardkõvera lineaarset osa tuleb jätta 
arvestamata.
 
46. Lõplik hormoonide kontsentratsioon arvutatakse järgmiselt.  
Näide: 
Ekstraheeriti: 450 μl keskkonda 
Lahustati: 250 μl katsepuhvris 
Lahjendus analüüsiks: 1: 10 (proovi tulemuse toomiseks stan ­
dardkõvera lineaarsesse osasse) 
Hormooni kontsentratsioon 
mõõdetud proovis: 150 pg/ml (pärast kohandamist kontsen ­
tratsiooniks mõõdetud proovi milliliitris) 
Taas leitud: 89 % 
Lõplik hormooni kontsentrat ­
sioon = (hormooni kontsentratsioon (milliliitri 
kohta) ÷ taas leitud) (lahjendustegur) 
Lõplik hormooni kontsentrat ­
sioon = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Uuritavate kontsentratsioonide valimine  
47. Tuleks teha vähemalt kaks sõltumatut analüüsikatset. Kui katses kasutata ­
vate kontsentratsioonide valimiseks ei ole varasemast teavet lahustuvuspii ­
ride või tsütotoksilisuse kohta, siis soovitatakse esimesel katsel võtta katse ­
kontsentratsioonid vahega log  10 , kusjuures 10  –3 M on maksimaalne kont ­
sentratsioon. Kui kemikaal on lahustuv ja ei ole tsütotoksiline ühelgi uuritud 
kontsentratsioonil ning esimesel katsel andsid kõik kontsentratsioonid nega ­
tiivse tulemuse, siis tuleb seda kinnitada veel ühe katsega, kasutades samu tingimusi kui esimesel katsel (tabel 7). Kui esimese katse tulemused on  
ebaselged  (st suuruse suhteline muutus (kordades) on lahusti kontrolliga 
võrreldes statistiliselt oluline ainult ühel kontsentratsioonil) või positiivsed 
(st suuruse suhteline muutus lahusti kontrolliga võrreldes on statistiliselt oluline kahe või enama kõrvuti oleva kontsentratsiooni puhul), tuleb katset korrata, nagu on näidatud tabelis 7, täpsustades katseks kontsentratsioonide 
valimist. Uuritavaid kontsentratsioone teises ja kolmandas katses (kui see 
tehakse) tuleks kohandada, arvestades esimeses katses mõju põhjustanud kontsentratsioonivahemikku, kasutades poole logaritmilise ühiku suurusi kontsentratsioonivahemikke (nt kui esimeses katses kontsentratsioonidega 
0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 μM leiti aktivatsioon kontsentratsioonidel 
1 ja 10 μM, tuleks teises katses valida kontsentratsioonideks 0,1, 0,3, 1, 3, 
10, 30, 100 μM), kui ei ole vaja kasutada väiksemaid kontsentratsioone 
LOEC saavutamiseks. Viimasel juhul kasutatakse vähemalt viit kontsentrat ­
siooni allpool madalaimat esimeses katses uuritud kontsentratsiooni poole 
logaritmilise ühiku suuruse vahega. Kui teine katse ei kinnita esimest katset (st statistiliselt olulist erinevust ei leita varem positiivse kontsentratsiooni ümbruses ±1 kontsentratsiooniinkrement), tuleb teha kolmas katse, kasu ­
tades esialgseid katsetingimusi. Esimese katse ebaselged tulemused loetakse 
negatiivseks, kui täheldatud mõju ei õnnestu kinnitada ühegagi järgmisest kahest katsest. Ebaselged tulemused loetakse positiivseks toimeks, kui reaktsiooni õnnestub kinnitada vähemalt ühes järgmises katses kontsentrat ­
sioonil ±1 kontsentratsiooniinkrement (vt punkt 55, andmete tõlgendamise 
meetod).
 
Tabel 7  
Otsuste maatriks võimalike tulemusestsenaariumide korral  
1. katse 2. katse 3. katse Otsus 
Stsenaarium Otsus Stsenaarium Otsus Stsenaarium Positiivne Negatiivne  
Negatiivne Kinnita (  a ) Negatiivne Stopp X 
Negatiivne Kinnita (  a ) Positiivne Täpsusta (  b ) Nega ­
tiivne X 
Ebaselge (  c ) Täpsusta (  b ) Negatiivne Kinnita (  a ) Nega ­
tiivne X 
Ebaselge (  c ) Täpsusta (  b ) Negatiivne Kinnita (  a ) Posi ­
tiivne X 
Ebaselge (  c ) Täpsusta (  b ) Positiivne X 
Positiivne Täpsusta (  b ) Negatiivne Kinnita (  a ) Posi ­
tiivne X ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
1. katse 2. katse 3. katse Otsus 
Stsenaarium Otsus Stsenaarium Otsus Stsenaarium Positiivne Negatiivne  
Negatiivne Kinnita (  a ) Positiivne Täpsusta (  b ) Posi ­
tiivne X 
Positiivne Täpsusta (  b ) Positiivne Stopp X  
( a ) Kinnita eelmist katset, kasutades sama eksperimendiplaani. 
( b ) Korda katset poole logaritmilise ühiku suuruste kontsentratsioonivahemikega (mõlemale poole kontsentratsioonist, mis 
eelmises katses osutus oluliselt erinevaks). 
( c ) Suuruse suhteline muutus (kordades) on lahusti kontrolliga võrreldes statistiliselt oluline ühel kontsentratsioonil.  
Katseplaadi kvaliteedikontroll  
48. Lisaks kvaliteedikontrolli plaadi kriteeriumide täitmisele tuleks täita ka 
muid kvaliteedikriteeriume, mis on seotud paralleelsüvendite tulemuste lubatavate erinevustega, korduskatsetega, hormooni määramise süsteemide lineaarsuse ja tundlikkusega, ühest ja samast proovist hormooni paralleelsete 
määramiste erinevustega ja tembitud hormoonipiikide taasleidmise protsen ­
dimääraga pärast keskkonna ekstraheerimist (kui seda tehakse; vt nõuded ekstraheerimisele, punkt 30); sellised kvaliteedikriteeriumid on esitatud tabelis 8. Andmed peaksid langema iga näitaja lubatavasse väärtuste vahe ­
mikku, ainult siis saab neid arvestada edasisel hindamisel. Kui need kritee ­
riumid ei ole täidetud, tuleks tabelis märkida, et kvaliteedikontrolli kritee ­
riumid ei olnud kõnealuses proovis täidetud; proov tuleks uuesti analüüsida või andmed välja visata.
 
Tabel 8  
H295R-katse plaadi näitajate lubatavad väärtused ja varieerumisvahemik (%)  
(LOQ — hormooni määramise süsteemi mõõtmispiir ( Limit of Quantification ); CV — 
variatsioonikordaja; SC — lahusti kontrollkatse; DPM — lagunemist minutis)  
Võrreldavad suurused T E2  
Hormoonide baassüntees 
lahusti kontrolli katsetes Suhteline suurenemine 
võrreldes LOQga ≥ 5 korda ≥ 2,5 korda 
Kokkupuutekatsed — plaa ­
disisene CV lahusti kont ­
rolli katsetes (paralleelsü ­
vendid) Absoluutsed kontsentrat ­
sioonid ≤ 30 % ≤ 30 % 
Kokkupuutekatsed — plaa ­
tidevaheline CV lahusti kontrolli katsetes (paral ­
leelkatsed) Muutus kordades ≤ 30 % ≤ 30 % 
Hormoonide mõõtmise 
süsteem — tundlikkus Tuvastatav suhteline 
vähenemine, võrreldes 
lahusti kontrolliga ≥ 5 korda ≥ 2,5 korda 
Hormoonide mõõtmise 
süsteem — kordusmõõt ­
mised lahusti kontrollide CV (
 a ) Absoluutsed kontsentrat ­
sioonid ≤ 25 % ≤ 25 % 
Keskkonna ekstraheerimine 
— 3H-sisestandardi taas ­
leidmine (vajaduse korral) DPM ≥ 65 % nominaalsest  
( a ) Tähendab ühe ja sama proovi kordusmõõtmisi.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
KATSEANDMETE ANALÜÜS JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmete analüüs  
49. Selleks, et hinnata hormoonide sünteesi suhtelist suurenemist või vähene ­
mist kemikaali juuresolekul, tuleb tulemused normeerida lahusti kontrolli 
tulemuste keskväärtusega igal plaadil, ja tulemused esitatakse suhteliste muutustena, võrreldes lahusti kontrolliga igal katseplaadil. Kõik andmed esitatakse kujul keskväärtus ±1 standardhälve (SD).
 
50. Andmete analüüsil arvestatakse ainult süvendeid, milles tsütotoksilisus oli 
alla 20 %. Suhtelised muutused tuleks arvutada järgmiselt:  
suhteline muutus =  (hormooni kontsentratsioon igas süvendis) ÷ (kõikide 
lahusti kontrollide hormooni kontsentratsiooni keskväärtus).  
51. Kui süvendi visuaalse kontrollimise või punktis 42 kirjeldatud eluvõimeli ­
suse/tsütotoksilisuse katsega näidati rakkude arvu suurenemist, tuleb seda näilist suurenemist kontrollida. Kui rakkude arvu suurenemist kontrollitakse, tuleks see märkida katseprotokolli.
 
52. Enne statistilise analüüsi tegemist tuleks hinnata normaaljaotuse ja disper ­
siooni homogeensuse eelduste kehtivust. Normaaljaotust tuleks hinnata stan ­
dardsete tõenäosusgraafikute või muu sobiva statistilise meetodiga (nt 
Shapiro-Wilki katse). Kui andmed (suhtelised muutused kordades) ei ole 
normaaljaotusega, tuleks püüda andmeid teisendada, et lähendada neid normaaljaotusele. Kui andmed on normaaljaotusega või ligikaudu normaal ­
jaotusega, tuleks analüüsida erinevusi kemikaali kontsentratsioonirühmade 
ja lahusti kontrollide vahel, kasutades parameetrilist testi (nt Dunnetti test), 
milles  kontsentratsioon  on sõltumatu muutuja, ja  toime  (suhteline muutus 
kordades) on sõltuv muutuja. Kui andmed ei ole normaaljaotusega, tuleb kasutada sobivat mitteparameetrilist testi (nt Kruskal Wallis, Steeli mitmese 
võrdluse astaktest). Erinevused loetakse oluliseks p ≤ 0,05 puhul. Statistiline 
hindamine tehakse iga süvendi keskväärtuste alusel, mis esindavad sõltu ­
matuid paralleelidega andmepunkte. Eeldatakse, et kuna esimeses katses on dooside vahel suured vahed (log
 10 skaala), ei ole paljudel juhtudel võimalik 
täpselt kirjeldada kontsentratsiooni-toime sõltuvust, kui kaks kõrgeimat 
kontsentratsiooni on sigmoidse kõvera lineaarses osas. Seepärast kasutatakse esimese katse või muude andmete puhul, kus see olukord esineb (nt kui ei hinnata maksimaalset tõhusust), I tüüpi fikseeritud muutuja statistikat, nagu 
on kirjeldatud eespool.
 
53. Kui rohkem kui kaks andmepunkti asuvad kõvera lineaarsel osal ja on 
võimalik arvutada maksimaalseid tõhususi — nagu eeldatakse mõne teise 
katse juures, mille tegemisel kasutatakse poole logaritmilise ühiku suurusi 
kokkupuutekontsentratsioonide erinevusi — tuleks kasutada probit-, logit- või muud sobivat regressioonimudelit, et arvutada tõhususega seotud kont ­
sentratsioone (nt EC50 ja EC20).
 
54. Tulemused tuleks esitada nii graafiliselt (tulpdiagrammid, mis näitavad 
keskväärtust ±1 SD) kui ka tabelina (LOEC/NOEC, mõju suund, ja maksi ­
maalse toime tugevus, mis on osa andmete doosi-toime aspektist) (vt näide 
joonisel 3). Andmete hindamine on ainult siis kehtiv, kui see põhineb 
vähemalt kahel sõltumatul katsel. Katset loetakse sõltumatuks, kui see on läbi viidud muul kuupäeval, uute lahuste ja kontrollidega. Teises ja (vaja ­
duse korral) kolmandas katses kasutatava kontsentratsioonivahemiku võib 
valida esimese katse tulemuste põhjal, et paremini määratleda doosi-toime 
vahemik, milles asub LOEC (vt punkt 47).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Joonis 3  
H295R-katsega saadud andmete graafikuna ja tabelina esitamise ja hindamise näide  
(tärn märgib statistiliselt olulisi erinevusi solvendi kontrollist (p < 0,05); LOEC — vähim 
täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon ( lowest observed effective concentration ); suurim muutus — 
toime maksimaalne tugevus igal kontsentratsioonil võrreldes lahusti kontrolli keskväärtusega (= 1))
  
Kemikaal LOEC Suurim muutus  
forskoliin 0,01 0,15 korda 
letrosool 0,001 29 korda  
Andmete tõlgendamise kord  
55. Uuritav kemikaal tunnistatakse positiivseks, kui suhteline aktivatsioon 
(kordades) on statistiliselt erinev (p ≤ 0,05) lahusti kontrollist kahel kõrvuti 
oleval kontsentratsioonil vähemalt kahes sõltumatus katses (tabel 7). Uuritav kemikaal tunnistatakse negatiivseks pärast kahte sõltumatut negatiivset 
katset või pärast kolme katset, millest kaks olid negatiivsed ja üks ebaselge 
või positiivne. Kui andmed, mis on saadud kolme iseseisva katsega, ei vasta tabelis 7 loetletud otsustamise kriteeriumidele, ei ole uurimistulemused tõlgendatavad. Tulemusi, mis on saadud lahustuvuspiirist kõrgema või 
tsütotoksilise kontsentratsiooni juures, ei tohiks kasutada tulemuste tõlgen ­
damiseks.
 
Katseprotokoll  
56. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uurimislabor:  
— nimi ja asukoht;  
— uuringu juht, muud töötajad ja nende kohustused uuringu käigus;  
— uuringu alguse ja lõpetamise kuupäevad.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Uuritav kemikaal, reaktiivid ja kontrollid:  
— identifitseerimisandmed (nimetus ja CASi number, kui on olemas), päri ­
tolu, partii number, puhtus, tarnija, ning uuritava kemikaali, reaktiivide 
ja kontrollide iseloomustus;  
— uuritava kemikaali füüsiline olek ja asjaomased füüsikalis-keemilised 
omadused;  
— uuritavate kemikaalide, reaktiivide ja kontrollide säilitustingimused ning 
katseks ettevalmistamise meetod ja sagedus;  
— uuritava kemikaali stabiilsus.  
Rakud:  
— allikas ja rakutüüp;  
— katses kasutatud rakkude passaažide arv (rakupassaaži tunnus);  
— rakukultuuride säilitusmeetodite korra kirjeldus.  
Enne katset täidetavad nõuded (vajaduse korral):  
— uuritava kemikaali võimalik segav mõju hormoonide määramise süstee ­
mile — kontrollkatse kirjeldus ja tulemused;  
— hormoonide ekstraheerimise tõhususe mõõtmised — kirjeldus ja 
tulemused;  
— kõigi tehtavate analüüside standard- ja kaliibrimiskõverad;  
— valitud analüüsimeetodite avastamispiir.  
Katsetingimused:  
— keskkonna koostis;  
— uuritava kemikaali kontsentratsioon;  
— rakkude tihedus (hinnatud või mõõdetud rakkude kontsentratsioon 24 ja 
48 tunni järel);  
— uuritava kemikaali lahustuvus (lahustumispiir, kui see on määratud);  
— inkubatsiooniaeg ja tingimused.  
Katsetulemused:  
— iga kontrollisüvendi ja kemikaaliga süvendi töötlemata andmed — iga 
üksiku mõõtmise tulemus otse sellisel kujul, mille annab hormoonide 
mõõtmiseks kasutatav vahend (nt optilise tiheduse ühikutes, fluorest ­
sentsi ühikutes, lagunemiste arv minutis jne);  
— normaaljaotuse eelduse kontrollimine või andmete teisendamise selgitus;  
— keskmine toime ±1 standardhälve igas mõõdetud süvendis;  
— tsütotoksilisuse andmed (uuritavad kontsentratsioonid, mis olid tsütotok ­
silised);  
— kinnitus selle kohta, et kvaliteedikontrolli nõuded olid täidetud;  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— suhteline muutus võrreldes lahusti kontrolli proovidega, tsütotoksilisuse 
parandiga;  
— tulpdiagramm, mis näitab suhtelist muutust (kordades) igal kontsentrat ­
sioonil, koos standardhälbe ja statistilise olulisusega, vt punktid 49–54.  
Andmete tõlgendamine:  
— andmete tõlgendamise korra kohaldamine tulemustele ja tähelepanekute 
arutelu.  
Arutelu:  
— kas tulemustest järeldub midagi võimaluse kohta, et T ja E2 andmeid 
võisid mõjutada kaudsed mõjud glüko- ja mineraalkortikoidide rada ­
dele?  
Järeldused  
KIRJANDUS  
1) OECD (2002), Sisesekretsioonisüsteemi kahjustavate kemikaalide kontrol ­
limise ja hindamise OECD kontseptuaalne raamistik, käesoleva lisa peatüki 
B.54 2. liide.  
2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone 
production,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114–124.
 
3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone 
and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23 — 30.
 
4) OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/ ­
MONO(2010)31, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/docu ­
ment/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html  
5) OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, 
ENV/JM/MONO(2010)32, Paris. Kättesaadav aadressil http://www.oec ­
d.org/document/30/0,3746,en_2649_34 377_1916638_1_1_1_1,00.html  
6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis. Kättesaadav 
aadressil http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_fi ­
nal_3_29_05.pdf  
7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78–89.
 
8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  
Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44–54.
 
9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265–272.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137–1148.  
11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488–5496.
 
12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroi ­
dogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the 
H295R cell line,  Chemosphere,  80:578–584.  
13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777-2785.
 
14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137-1148.
 
15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731–737.
 
16) Käesoleva lisa peatükk B.55. Hershbergeri biokatse rottidel: kiire sõelkatse 
(anti)androgeensete omaduste väljaselgitamiseks  
17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222–231.  
18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55–63.  
19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.  
20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 
26:484–492.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Liide  
MÕISTED  
CV ( Coefficient of Variation ) – variatsioonikordaja, määratletud kui jaotuse 
standardhälbe ja aritmeetilise keskmise suhtarv.  
CYP  – tsütokroom P450 monooksügenaasid, geenide ja nende järgi sünteesitud 
ensüümide perekond, mis osaleb väga paljude biokeemiliste reaktsioonide kata ­
lüüsimises, sealhulgas steroidhormoonide sünteesi ja metabolismi katalüüsimises.  
DPM ( disintegrations per minute ) – lagunemiste arv minutis. See on teatava 
koguse radioaktiivse aine ühe minuti jooksul lagunenud aatomite arv.  
E2 – 17β-östradiool, kõige tähtsam östrogeen imetajate hormoonisüsteemides.  
H295R-rakud  – inimese adrenokartsinoomi rakud, millel on tsonaalselt diferent ­
seerumata inimloote neerupealise rakkude füsioloogilised omadused ning milles 
on ekspresseeritud kõik steroidogeneesi raja ensüümid. Selliseid rakke saab 
tellida ATCC-st.  
Katse  – sõltumatu eksperiment, mis tehakse uute lahuste ja uute kontrollidega.  
Katseplaat  – plaat, millel H295R-rakud viiakse kokkupuutesse uuritavate kemi ­
kaalidega. Katseplaadil on lahusti kontroll ja uuritav kemikaal seitsmes kontsen ­
tratsioonis, igaüks kolme paralleelina.  
Kvaliteedikontroll (QC)  – osutab meetmetele, mida on vaja võtta kasutamiskõl ­
blike andmete saamiseks.  
Kvaliteedikontrolli plaat  – 24 süvendiga plaat, millel on positiivse ja negatiivse 
kontrolli kaks kontsentratsiooni, millega kontrollitakse uue rakkude partii toimi ­
mist või tehakse katse positiivsed kontrollid kemikaalide katsetamisel.  
Kemikaal  – aine või segu.  
Külmutuskeskkond  – keskkond, mida kasutatakse rakkude külmutamiseks ja 
milles hoitakse külmutatud rakke. Selle koostis on järgmine: varulahusekeskkond pluss BD NuSerum ja dimetüülsulfoksiid.
 
Laatumismäär  – iseloomustab pinna katmise või paljunemise määra, mida 
rakkudele võimaldatakse kasvukeskkonna pinnal või sees.  
Lineaarne osa  – hormoonide määramise süsteemi standardkõvera osa, milles 
tulemus on võrdeline proovis oleva analüüdi kontsentratsiooniga.  
LOEC ( Lowest Observed Effect Concentration ) – vähim avastatava mõjuga 
kontsentratsioon, mille juures katse tulemus on statistiliselt erinev lahusti kont ­
rolli tulemusest.  
LOQ ( Limit of Quantification ) – mõõtmispiir, väikseim kogus kemikaali, mida 
saab eristada kõnealuse kemikaali puudumisest (tühikatse) teatava usalduspiiri 
juures. Käesoleva meetodi puhul on LOQ tavaliselt katsesüsteemi valmistaja poolt ette antud, kui seda ei ole täpsustatud teisiti.
 
NOEC ( No Observed Effect Concentration ) – kõrgeim uuritud kontsentratsioon, 
mille juures analüüs ei näita positiivset tulemust.  
Passaaž  – kordade arv, millal rakud on pärast külmutatud tüvikultuurist kultuuri 
loomist aluselt eraldatud. Lähtepassaažile, mis tehakse külmutatud tüvikultuurist, 
omistatakse number üks (1). Rakud, mis on aluselt eraldatud üks kord, nimeta ­
takse passaažiks 2 jne.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
PBS – Dulbecco fosfaatpuhvrilisandiga keedusoolalahus.  
Steroidogenees  – sünteesirada, mille kaudu kolesteroolist sünteesitakse mitme ­
sugused steroidhormoonid. Steroidide sünteesi raja mitu vahesaadust nagu 
progesteroon ja testosteroon on ise olulised hormoonid; samas on nad sünteesi ­
raja edasiste hormoonide eellased.  
T – testosteroon, üks kahest kõige olulisemast androgeenist imetajate hormooni ­
süsteemides.  
Trüpsiin 1X  – lahjendatud trüpsiini (üks ensüüme, kõhunäärme seriinproteaas) 
lahus, mida kasutatakse rakkude eraldamiseks rakkude kasvatamise plaadilt, vt valideerimisaruande (4) III liide.
 
Täiendatud keskkond  – varukeskkond pluss BD Nu-Serum ja ITS+ premium 
mix, vt valideerimisaruande (4) II liide.  
Uuritav kemikaal  – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. 
Varukeskkond  – lähtekeskkond, mis on alus muude reagendilahuste valmista ­
miseks. See koosneb Dulbecco modifitseeritud Eagle'i keskkonna ja Hami F-12 toitainesegust (DMEM/F12) vahekorras 1: 1 15 mM HEPES-puhvris, mis ei 
sisalda fenoolpunast ega Na-vesinikkarbonaati. Na-vesinikkarbonaat lisatakse 
puhverdamiseks, vt valideerimisaruande (4) II liide.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  TRANSGEENSE NÄRILISE SOMAATILISTE JA SUGURAKKUDE 
GEENIDE MUTATSIOONI KATSE  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 488 (2013). 
ELil on katsemeetodid paljude  in vitro  geenmutatsioonide uuringute tege ­
miseks, millega on võimalik avastada kromosoomide ja/või geenide mutat ­
sioone. On olemas katsemeetodid  in vivo  näitajate (st kromosoomihälvete ja 
plaanivälise DNA sünteesi) määramiseks; kuid nendega ei saa mõõta geeni ­
mutatsioone. Transgeense närilise ( transgenic rodent , TGR) mutatsiooni 
katse rahuldab vajaduse praktilise ja kergesti kättesaadava  in vivo  katse 
järele, millega saab määrata geenimutatsioone.  
2. TGR-mutatsioonikatse kohta on avaldatud põhjalikke ülevaateid (24, 33). 
Nendes kasutatakse transgeenseid rotte ja hiiri, kelle kromosoomidesse on 
integreeritud rohkesti plasmiidi või faagi-ülekandevektorite koopiaid (trans ­
geene). Transgeenid sisaldavad reportergeene mitmesugust tüüpi mutatsioo ­
nide avastamiseks, mida  in vivo  tekitavad uuritavad kemikaalid.  
3. Närilises tekkivaid mutatsioone loendatakse transgeeni väljavõtmise ja 
reportergeeni fenotüübi analüüsimisega bakteriaalses peremees-organismis, 
kellel vastavat reportergeeni ei ole. TGR geenimutatsiooni katsetega mõõde ­
takse mutatsioone, mis on tekkinud geneetiliselt neutraalsetes geenides, mis eraldatakse praktiliselt kõikidest närilise kudedest. Nende katsetega võib seepärast üle saada paljudest olemasolevatest piirangutest, mis on seotud  
in vivo  geenimutatsioonide uurimisega endogeensetes geenides (näiteks 
piiratud hulk analüüsikõlblikke kudesid, negatiivne või positiivne selekt ­
sioon mutatsioonide vastu).
 
4. Olemasolevad tõendid näitavad veenvalt, et transgeenid reageerivad muta ­
geenidele samal viisil kui endogeensed geenid, eriti mis puutub alusepaari asendustesse, raaminihkemutatsioonidesse ning väikestesse deletsioonidesse 
ja insertsioonidesse (24).
 
5. Genotoksilisuse testimise rahvusvahelistel seminaridel (IWGT) on toetatud 
TGR-geenimutatsioonikatse kasutamist geenimutatsioonide avastamiseks  in 
vivo ja on esitatud soovituslik katse-eeskiri selliste katsete tegemiseks (15, 
29). Käesolev katsemeetod põhineb kõnealustel soovitustel. Käesoleva katse-eeskirja kasutamist toetav täiendav analüüs on esitatud viites (16).
 
6. Arvatavasti on tulevikus võimalik ühendada TGR-geenimutatsiooni katse 
korduvdoosi toksilisuse uuringuga (käesoleva lisa peatükk B.7). Siiski on 
vaja veel andmeid selle tõendamiseks, et korduvdoosi toksikoloogia 
uuringus kasutatav lühem ühepäevane vahe dooside manustamise lõpu ja proovide võtmise vahel ei mõjuta TGR-geenimutatsiooni katseid, mille puhul kasutatakse 3päevast ajavahemikku. On vaja ka andmeid, mis 
näitaksid, et transgeense näriliseliini kasutamine tavaliste näriliseliinide 
asemel ei kahjusta korduvdoosi katse tulemusi. Kui need andmed saadakse, tuleb käesolevat katsemeetodit ajakohastada.
 
7. Peamiste terminite tähendused on esitatud liites.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
LÄHTEKAALUTLUSED  
8. TGR-geenimutatsiooni mudelsüsteemid, mille kohta on kogutud piisavalt 
andmeid, et toetada nende kasutamist käesolevas katsemeetodis, on järg ­
mised:  lacZ- bakteriofaag-hiir (Muta™Mouse);  lacZ -plasmiid-hiir;  gpt-  
delta- ( gpt- ja Spi  – )-hiir ja -rott;  lacI- hiir ja -rott (Big Blue®), kui katse 
tehakse standardtingimustes. Lisaks võib kasutada  cII-  positiivsevaliku 
katset, et hinnata mutatsioone Big Blue®- ja Muta™Mouse'i mudelites. 
Mutageneesi hinnatakse TGR-mudelite puhul tavaliselt mutantide sageduse järgi; vajaduse korral võib kasutada aga ka mutatsioonide molekulaarana ­
lüüsi täiendava teabe saamiseks (vt punkt 24).
 
9. Need näriliste  in vivo  geenimutatsiooni katsed on eriti olulised mutageen ­
suse ohu hindamisel, kuna katsete tulemused sõltuvad  in vivo  metabolismist, 
farmakokineetikast, DNA parandusprotsessidest ja DNA sünteesimehha ­
nismi võimest kahjustusega toime tulla, kuigi need omadused võivad eri liikidel ja kudedel olla erinevad ja sõltuda ka DNA kahjustuse tüübist.  In 
vivo meetod geenimutatsiooni täiendavaks uurimiseks on kasulik edasiseks 
uurimiseks, kui  in vitro  süsteemis on leitud mutageenne toime, samuti 
täiendavate  in vivo  näitajate väljaselgitamiseks (24). Lisaks sellele, et geeni ­
mutatsioonid on põhjuslikult seotud vähi tekkimisega, on need ka asjako ­
hane näitaja muude mutatsioonipõhiste haiguste kui vähk (12, 13) ja päri ­
like haiguste tekkimise ennustamiseks.
 
10. Kui on tõendeid, et uuritav kemikaal või asjakohane metaboliit ei pääse 
mõne huvipakkuva koeni, siis ei ole transgeense närilise geenimutatsiooni 
katse asjakohane.  
KATSE PÕHIMÕTE  
11. Punktis 8 kirjeldatud katsetes on sihtgeeniks bakteriaalse või bakteriofaagse 
päritoluga geen ning selle transgeeni närilise genoomsest DNAst väljaeral ­
damise vahendiks on transgeeni viimine λ-bakteriofaagisse või plasmiid ­
sesse süstikvektorisse. Selleks ekstraheeritakse huvipakkuvast närilisekoest 
genoomne DNA, töödeldakse seda  in vitro  (süstikvektori taastamiseks 
pakendatakse λ-vektorid või ligeeritakse ja elektroporeeritakse plasmiidid) 
ja seejärel tehakse pärast peremeesorganismi (bakterisse) viimist sobivates tingimustes kindlaks mutatsioonid. Analüüsiks kasutatakse neutraalseid 
transgeene, mida saab enamikust kudedest hõlpsasti jälle välja võtta.
 
12. Tavaline TGR geenimutatsiooni katse hõlmab näriliste viimist teatavaks 
ajaks kokkupuutesse uuritava kemikaaliga. Kemikaale võib manustada mis 
tahes asjakohasel viisil, sealhulgas implantatsiooniga (nt meditsiiniseadme testimine). Kogu ajavahemikku, mille jooksul loomale manustatakse kemi ­
kaali, nimetatakse manustamisajaks. Manustamisele järgneb tavaliselt teatav 
aeg enne surmamist, mille jooksul kemikaali ei manustata ja mille jooksul 
parandamata DNA-kahjustused fikseeruvad püsivateks stabiilseteks mutat ­
sioonideks. Kirjanduses on seda ajavahemikku nimetatud mitmel viisil: avaldumisaeg, kinnistumisaeg või väljendumisaeg ( manifestation, fixation, 
expression ); see ajavahemik lõpeb proovivõtuajaga(15, 29). Kui loom on 
surmatud, eraldatakse huvipakkuvatest kudedest DNA ja puhastatakse.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Paljudest pakendamistest või ligeerimistest iga looma ühe koe kohta saadud 
andmed tavaliselt koondatakse ja muteerumise sagedus hinnatakse tavaliselt 
kokku 10  5 –10  7 lüüsilaike või kolooniaid moodustava ühiku põhjal. Kui 
kasutatakse positiivseid selektsioonimeetodeid, määratakse lüüsilaike moodustavad ühikud eraldi mitteselektiivsete plaatidega.
 
14. Positiivsed selektsioonimeetodid on välja töötatud mutatsioonide avastami ­
seks nii  gpt- geenis[ gpt-delta-hiir ja -rott , gpt  – -fenotüüp (20, 22, 28)] kui ka  
lacZ- geenis [Muta™Mouse või  lacZ- plasmiid-hiir (3, 10, 11, 30)]; samas  
lacI-geeni mutatsioone Big Blue®-loomades tuvastatakse mitteselektiivse 
meetodiga, milles mutante avastatakse värvunud (siniste) lüüsilaikude tekki ­
mise järgi. Positiivne selektsioonimeetod on loodud ka punktmutatsioonide avastamiseks λ-bakteriofaagsüstikvektori  cII-geenis [Big Blue®-hiir või -rott 
ja Muta™Mouse (17)] ning deletsioonimutatsioonide leidmiseks λ red ja 
gam geenides [Spi
 – -selektsioon  gpt- delta-hiire ja -roti puhul (21, 22, 28)]. 
Mutatsioonisagedusarvutatakse transgeenis lüüsilaike/plasmiide sisaldavate mutatsioonide arvu jagamisel lüüsilaikude/plasmiidide üldarvuga, mis on saadud samast DNA-proovist. Transgeense närilise geenimutatsiooni uurin ­
gute puhul esitatav näitaja on mutatsioonide sagedus. Lisaks sellele saab 
mutatsioonisageduse määrata sõltumatut mutatsiooni sisaldavate rakkude määrana; selle arvutuse jaoks on vaja eraldatud mutantide sekveneerimisega teha klooni kasvu arvestav parand(24).
 
15. Mutatsioonid, mis loendatakse  lacI, lacZ, cII  ja gpt punktmutatsioonide 
katsetes, kujutavad endast peamiselt alusepaari asenduse, raaminihke ning väikeste insertsioonide ja deletsioonidega seotud mutatsioone. Selliste mutatsioonitüüpide suhteline osa spontaansete mutatsioonide hulgas 
sarnaneb selle piirkonna endogeenses HPRT-geenis tekkivate mutatsioonide 
suhtelise osaga. Suuri deletsioone avastatakse ainult Spi
 – -selektsioonija  
lacZ- plasmiidi katsetega (24). Huvipakkuvad mutatsioonid on  in vivo  mutat­
sioonid, mis tekivad hiirtel või rottidel.  In vitro  ja ex vivo  mutatsioonid, mis 
võivad tekkida faagi/plasmiidi tagasisaamisel, replikatsioonil või paranda ­
misel, on võrdlemisi haruldased ja mõnes süsteemis on neid võimalik spet ­
siifiliselt tuvastada või välistada bakteriaalse peremeesorganismi/positiivse selektsiooni süsteemiga.
 
MEETODI KIRJELDUS  
Ettevalmistused  
Loomaliigi valimine  
16. Praegu on olemas mitmesuguseid transgeensete hiirte geenimutatsioonide 
tuvastamise mudeleid ja neid süsteeme kasutatakse laialdasemalt kui trans ­
geense roti mudeleid. Kui rott on selgelt sobivam mudel kui hiir (nt kui uuritakse üksnes rottidel esineva kasvaja tekkimise mehhanismi, et korre ­
leerida seda rottide puhul avalduva toksilisuse uuringuga, või kui metabo ­
lism rotis on teadaolevalt lähedasem metabolismile inimese organismis), siis tuleks kaaluda transgeense roti mudeli kasutamist.
 
Pidamis- ja söötmistingimused  
17. Temperatuur katseloomade ruumis peaks olema 22 ± 3 °C. Kuigi suhteline 
niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, peaks eesmärgiks olema hoida niiskust 50–60 %. 
Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. 
Söötmiseks võib kasutada tavapärast labori söödavalikut koos piiramatu
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
hulga joogiveega. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava 
kemikaali sobiv lisamine söödasse, kui kemikaali manustatakse sellisel 
viisil. Loomi tuleb pidada väikestes rühmades, kuni viis samast soost looma, kui ei eeldata agressiivset käitumist. Loomi võib hoida eraldi, kui see on teaduslikult põhjendatud.
 
Loomade ettevalmistamine  
18. Terved noored suguküpsuse saavutanud täiskasvanud loomad (vanus 8–12 
nädalat katse alguses) määratakse juhuvaliku alusel kontrolli- ja doosirüh ­
madesse. Loomad varustatakse individuaalse märgisega. Loomi harjutatakse 
laboritingimustega vähemalt viis päeva. Puurid paigutatakse nii, et puuri 
paigutusest tingitud mõjud oleksid võimalikult väikesed. Uuringu alguses peaksid loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ja ei tohiks ületada ±20 % kummagi soo keskmisest massist.
 
Dooside ettevalmistamine  
19. Tahke uuritav kemikaal tuleb lahustada või suspendeerida sobivas lahustis 
või kandeaines ja segada sööda või joogivee sisse enne loomadele andmist. Vedelat uuritavat ainet võib manustada vahetult või lahjendada enne manus ­
tamist. Sissehingamise kaudu toimuva kokkupuute korral manustatakse 
uuritavat kemikaali gaasi, auru või tahke/vedela aerosoolina, sõltuvalt kemi ­
kaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Tuleks kasutada uuritava kemikaali värskeid valmistisi, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, 
et säilitamine on aktsepteeritav.
 
Katsetingimused  
Lahusti/kandeaine  
20. Lahusti/kandeaine ei tohi avaldada toksilist mõju kasutatavate dooside 
korral ega keemiliselt reageerida uuritava ainega. Kui kasutatakse tuntud 
lahustist/kandeainest erinevat lahustit või ainet, peab olema võrdlusandme ­
tega näidatud, et see on sobiv. Soovitatav on võimaluse korral esimesena kaaluda vesilahuste/vee kui kandeaine kasutamist.
 
Positiivsed kontrollid  
21. Tavaliselt tuleks kasutada paralleelselt positiivse kontrolli loomi. Labori 
puhul, kes on tõendanud oma pädevust (vt punkt 23) ja teeb selliseid katseid tavalises korras, võib meetodi edukuse tõenduseks lisada igasse katsesse DNA eelmisest positiivse kontrolli katsest. Selline varasema 
katse DNA peaks olema saadud sama loomaliigi samadest huvipakkuvatest 
kudedest ja see peaks olema nõuetekohaselt säilitatud (vt punkt 36). Kui kasutatakse samaaegset positiivset kontrolli, ei ole kontrollkemikaali vaja tingimata manustada samal viisil kui uuritavat kemikaali; siiski peaks posi ­
tiivse kontrolli kemikaali kohta olema teada, et see põhjustab mutatsioone 
samas koes/samades kudedes, mis pakuvad huvi uuritava kemikaali puhul. Positiivse kontrolli kemikaali doosid tuleks valida nii, et mõju oleks nõrk või mõõdukas, et kriitiliselt hinnata katse tulemuslikkust ja tundlikkust. 
Positiivse kontrolli kemikaalide ja mõnede nende sihtkudede näited on 
esitatud tabelis 1.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabel 1  
Positiivse kontrolli kemikaalide ja mõnede nende sihtkudede näited  
Positiivse kontrolli kemikaal 
ja selle CASi nr EINECSi nimetus ja 
EINECSi nr Kirjeldus Mutatsiooni sihtkude 
Rott Hiired  
N-etüül- N-nitrosokarba ­
miid 
[CASi nr 759-73-9]  N-etüül- N-nitrosokarba ­
miid 
[212-072-2] Otse toimiv muta ­
geen Maks, 
kopsud Luuüdi, käärsool, 
käärsoole epiteel, sool, maks, kopsud, 
põrn, neerud, muna ­
sarjade granuloos ­
rakud, isaslooma sugurakud 
Etüülkarbamaat (uretaan) 
[CASi nr 51-79-6] Uretaan 
[200-123-1] Mutageen, vajalik 
on metabolism, 
mõju on aga nõrk Luuüdi, eelmagu, 
peensool, maks, 
kopsud, põrn 
2,4-diaminotolueen 
[CASi nr 95-80-7] 4-metüül- m-fenüleendia ­
miin 
[202-453-1] Mutageen, vajalik 
on metabolism, positiivne ka Spi
 - - 
katses Maks Maks 
Benso[a]püreen 
[CASi nr 50-32-8] Benso[def]krüseen 
[200-028-5] Mutageen, vajalik 
on metabolism Maks, 
rasvikud Luuüdi, rinnanääre, 
käärsool, eelmagu, 
näärmemagu, süda, 
maks, kopsud, isas ­
looma sugurakud  
Negatiivsed kontrollid  
22. Igal proovide võtmisel peaksid olema negatiivsed kontrollid, loomad, kellele 
on manustatud ainult lahustit või kandeainet ja kes muidu on läbinud sama kohtlemise kui doosirühmad. Kui ei ole varasemaid või kirjanduses aval ­
datud kontrollandmeid, mis näitaksid, et valitud lahustil või kandeainel ei 
ole kahjulikku ega mutageenset toimet, tuleb igal proovide võtmisel kaasata ka loomad, kellele ei ole üldse midagi manustatud, et tõendada kandeaine kontrolli vastuvõetavust.
 
Labori pädevuse tõendamine  
23. Pädevust nende katsete tegemises tuleks tõendada võimega korrata aval ­
datud andmetele (24) vastavaid järgmisi oodatavaid tulemusi: 1) mutatsioo ­
nide sagedus positiivse kontrolli kemikaalide puhul (kaasa arvatud nõrga ­
toimelised kemikaalid), nagu tabelis 1 esitatud kemikaalid, mittemutagee ­
nide puhul ja kandeaine kontrolli puhul ning 2) transgeeni tagasisaamine 
genoomsest DNA-st (nt pakendamise tõhusus).  
Mutantide sekveneerimine  
24. Regulatiivsete rakenduste puhul mutantide DNA sekveneerimist ei nõuta, 
eriti kui on saadud selge positiivne või negatiivne tulemus. Sekveneerimine 
võib siiski olla kasulik, kui individuaalsete loomade vahelised erinevused on suured. Sellistel juhtudel võib järjestuse määramist kasutada nn  jackpot 'i 
või kloonsete sündmuste võimaluse välistamiseks: sekveneerimisega määra ­
takse ainulaadsete mutatsioonide osakaal konkreetses koes. Ühe looma ühe 
koe ligikaudu 10 mutandi sekveneerimine peaks olema piisav, et lihtsalt
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
kindlaks teha, kas kloonmutandid võivad anda panuse mutatsioonide sage ­
dusse; mutatsioonisageduse andmete matemaatiliseks parandamiseks kloo ­
niefektide suhtes tuleks sekveneerida kuni 25 mutanti. Mutantide sekvenee ­
rimist võib kaaluda ka siis, kui leitakse mutatsioonisageduse nõrk suurene ­
mine (st vaid veidi rohkem mutatsioone kui kontrollkatses, kus kemikaali ei 
manustatud). Kui kemikaali saanud ja kontrollkatse mutandikolooniate 
spekter on erinev, võib see toetada mutageense toime oletust (29). Mutat ­
sioonide spektrid võivad olla abiks ka toimemehhanismi käsitlevate hüpo ­
teeside tegemisel. Kui uuringus nähakse ette sekveneerimine, tuleb uuringu 
kavandamisel olla eriti hoolikas, eriti ühe proovi kohta sekveneeritavate 
mutantide arvu määramisel, et tulemusel oleks vastavalt kasutatavale statis ­
tilisele mudelile piisav statistiline võimsus (vt punkt 43).  
KATSE KORRALDUS  
Loomade arv ja sugu  
25. Loomade arv igas rühmas peaks olema eelnevalt kindlaks määratud nii, et 
see tagaks piisava statistilise võimsuse, mis võimaldaks tuvastada vähemalt 
mutantide arvu kahekordistumise. Rühmas on vähemalt viis looma; kui statistiline võimsus ei ole piisav, tuleks loomade arvu vastavalt vajadusele suurendada. Tavaliselt tuleks kasutada isasloomi. Võib esineda juhtusid, kus 
on õigustatud üksnes emasloomade kasutamine, näiteks kui uuritakse spet ­
siaalselt naiste jaoks ettenähtud ravimeid või uuritakse naissoole eripäraseid metabolismi aspekte. Kui kemikaali toksilisuses või metabolismis esineb märkimisväärseid soospetsiifilisi erinevusi, on vaja uurida nii isas- kui ka 
emasloomi.
 
Manustamisperiood  
26. Kuna on kindlaks tehtud, et mutatsioonid akumuleeruvad iga manustamis ­
korraga, on vaja kasutada korduvdoosi manustamise režiimi — manustamist iga päev 28 päeva jooksul. Seda peetakse üldiselt rahuldavaks, kuna 
niimoodi tekib ka nõrga mutageeniga piisavalt palju mutatsioone ja see 
on piisav kokkupuuteaeg mutatsioonide avastamiseks aeglaselt kasvavates organismides. Mõne hindamise puhul võib olla sobiv muu manustamisre ­ 
žiim, mille kasutamist tuleks uuringu protokollis teaduslikult põhjendada. 
Kemikaali manustamise aeg ei tohiks olla lühem kui aeg, mis on vajalik 
kõikide asjakohaste metabolismiensüümide täielikuks induktsiooniks; lühema manustamisperioodi puhul võib olla vaja kasutada mitut proovide võtmise aega, mis sobivad eri kasvukiirusega organite jaoks. Igal juhul 
tuleks katse-eeskirja põhjendamiseks kasutada kogu kättesaadavat teavet 
(nt üldise toksilisuse, metabolismi ja farmakokineetika kohta), eriti kui kaldutakse kõrvale eespool esitatud standardsoovitustest. Pikemat manusta ­
misperioodi kui 8 nädalat tuleks selgelt põhjendada ja õigustada, sest kuigi 
see võib suurendada katse tundlikkust, võib see põhjustada mutantide sage ­
duse näilist suurenemist klooni kasvu tagajärjel (29).
 
Doositasemed  
27. Doositasemed peaksid põhinema tulemustel, mis on saadud doosivahemiku 
leidmise katsega, milles mõõdetakse üldist mürgisust samasuguse 
manustamis- või kokkupuuteviisi puhul, või varasemate alaägeda mürgis ­
tuse uuringute tulemustel. Doosivahemiku leidmiseks võib kasutada sama näriliseliini mitte-transgeenseid loomi. Doosi ja toime vahelist seost käsit ­
leva teabe saamiseks peaks täielikus põhikatses olema negatiivne kontroll ­
rühm (vt punkt 22) ja vähemalt kolm sobiva vahemikuga doositaset, välja 
arvatud juhul, kui kasutatakse piirdoosi (vt punkt 28). Suurim doos peaks
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
vastama suurimale talutavale doosile. Suurim talutav doos on doos, mis 
põhjustab selliseid mürgistusenähte, et sama manustamiskava puhul põhjus ­
taks veel suurem doos juba surma. Kemikaalid (näiteks hormoonid ja mito ­
geenid), millel juba madala mittetoksilise doosi juures on teatav bioloogiline aktiivsus, ja sellised kemikaalid, mille toksiko-kineetilistes omadustes 
esineb küllastumine, moodustavad erandi üldistest doosivaliku kriteeriumi ­
dest ja neid tuleks igal juhul hinnata konkreetselt. Doositasemetega tuleks katta kogu vahemik suurimast talutavast doosist kuni vähese mürgisuseni või mürgisuse puudumiseni.
 
Piirdoosikatse  
28. Kui doosivahemiku leidmise katsed või lähedaste näriliseliinide andmed 
osutavad, et vähemalt piirdoosi manustamine ei põhjusta närilisele tähelda ­
tavaid toksilisi mõjusidja kui struktuurilt lähedaste kemikaalide andmete põhjal ei ole karta genotoksilisust, ei tarvitse täielik uuring kolme doosita ­
semega olla vajalik. 28-päevase manustamisperioodi (28 manustamist üks 
kord päevas) puhul on piirdoos 1 000 mg kehakaalu kg kohta päevas. Kui 
manustamisperiood on 14 päeva või lühem, on piirdoos 2 000 mg keha ­
kaalu kg kohta päevas (dooside manustamise kavad, mis erinevad 28-päeva ­
sest manustamisest, peaksid olema katseprotokollis teaduslikult põhjen ­
datud; vt punkt 26).
 
Dooside manustamine  
29. Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt sundsöötmisega maosondi 
kaudu või sobiva intubeerimiskanüüli abil. Üldiselt tuleks katse kavanda ­
misel silmas pidada inimese võimalikku kokkupuuteviisi. Seepärast võib 
kasutada muid kokkupuuteviise (näiteks joogiveega, nahaaluse süstiga, 
intravenoosselt, nahale määrimisega, sissehingamisega, trahheasse juhtimi ­
sega, söödaga või implantaadiga), kui neid saab põhjendada. Süstimist kõhukelmesse ei soovitata, kuna see ei ole inimese kokkupuute seisukohast 
asjakohane. Vedeliku suurim kogus, mida saab söögitoru kaudu või süstides 
ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Kogus ei tohiks ületada 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema mahu kasutamise korral tuleb seda põhjendada. Välja arvatud ärritavad või söövitavad kemikaalid, mille mõjud 
tavaliselt teravnevad suuremate kontsentratsioonide korral, tuleks vähendada 
katses kasutatavate mahtude varieeruvust, reguleerides kontsentratsioone nii, et kogumaht kõikide dooside korral jääks samaks.
 
Proovivõtuaeg  
Somaatilised rakud  
30. Proovide võtmise aeg on väga oluline muutuja, sest see on määratud ajava ­
hemikuga, mis kulub mutatsioonide fikseerumiseks. See ajavahemik on koespetsiifiline ja näib olevat seotud rakupopulatsiooni uuenemisajaga; 
luuüdi ja soolestiku puhul on toime kiire, maksa puhul on see palju 
aeglasem. Sobiv kompromiss mutatsioonisageduse mõõtmiseks nii kiiresti kui ka aeglaselt kasvavate kudede korral on manustamine 28 järjestikusel päeval (vt punkt 26) ja proovide võtmine kolm päeva pärast viimast manus ­
tamist, kuigi maksimaalne mutantide sagedus ei tarvitse nendes tingimustes 
aeglaselt kasvavate kudede puhul veel avalduda. Kui aeglaselt kasvavad koed on eriti olulised, võib hilisem proovide võtmise aeg 28 päeva pärast 28-päevase manustamisperioodi lõppu olla kohasem (16, 29). Sellisel juhul 
asendaks hilisem proovivõtuaeg proovide võtmise pärast kolme päeva, ning 
see nõuaks teaduslikku põhjendust.
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Sugurakud  
31. Transgeense närilise katse sobib hästi isaslooma sugurakkudes põhjustatud 
mutatsioonide uurimiseks (7, 8, 27), kuna spermatogeneesi ajastust ja kinee ­
tikat on palju uuritud (27). Analüüsiks kättesaadavate munarakkude väike 
arv, isegi pärast superovulatsiooni, ning asjaolu, et munarakus ei toimu 
DNA sünteesi, välistavad transgeense närilise katse kasutamise mutatsioo ­
nide tekkimise uurimiseks emaslooma sugurakkudes (31).  
32. Proovide võtmise aeg isaslooma sugurakkude puhul valitakse nii, et proovid 
kogutakse kõikidest kogu suguraku arengutsükli jooksul kemikaaliga 
kokkupuutunud rakutüüpidest; jälgitakse, et see staadium, mille proove eriti tahetakse saada, oleks piisavalt kaua kemikaaliga kokku puutunud. Aeg, mis kulub arenevatel sugurakkudel jõudmiseks spermatogooniumi 
tüvirakkudest küpse spermatosoidi staadiumini seemnejuhas või munandi ­
manuse sabas,on ~49 päeva hiire (36) ja ~70 päeva roti (34, 35) puhul. Sperma, mis kogutakse pärast 28-päevast kokkupuuteperioodi ja sellele järgnevat kolmepäevast ajavahemikku proovide võtmiseni seemnejuhast ja 
munandimanuse sabast (7, 8), kujutab endast rakkude populatsiooni, mis on 
olnud kemikaaliga kokkupuutes umbes poole spermatogeneesi ajast; see spermatogeneesi lõpp-periood hõlmab meioosi ja sellele järgnevaid etappe, kuid ei hõlma spermatogooniumi- ega tüvirakuetappi. Selleks, et saada 
seemnejuhast ja munandimanuse sabast õigeid proove rakkudest, mis olid 
spermatogooniumi tüvirakud kokkupuuteperioodi ajal, tuleb pärast kemi ­
kaali manustamise lõppu proovide võtmisele eelnevale ajale lisada hiire puhul vähemalt 7 nädalat ja roti puhul 10 nädalat.
 
33. Pärast 28 + 3 päeva pikkust katseperioodi seemnekanalikestest väljasurutud 
rakud kujutavad endast segapopulatsiooni, milles on kõiki sugurakkude 
arengu staadiume (7, 8). Nendest rakkudest proovide võtmine geenimutat ­
sioonide avastamiseks ei võimalda nii täpselt hinnata, millistes suguraku arengu etappides tekivad mutatsioonid, kui seemnejuhast või munandima ­
nuse sabast kogutud spermatosoidiproovid (kuna seemnekanalikestest 
saadud proovis on palju sugurakutüüpe ja ka somaatilisi rakke, mis saas ­
tavad seda rakupopulatsiooni). Kuid rakuproovi võtmine seemnekanalikes ­
test lisaks spermatosoidiproovile seemnejuhast või munandimanuse sabast 
pärast üksnes 28 + 3 päeva pikkust katseperioodi võimaldab saada mingid proovid kõikidest rakkudest, mis on olnud kemikaaliga kokkupuutes enamiku suguraku küpsemise faaside ajal, ja see võib olla kasulik mõnede 
suguraku mutageenide tuvastamiseks.
 
Vaatlused  
34. Üldisi kliinilisi vaatlusi tuleks teha vähemalt kord päevas, soovitavalt iga 
kord samal ajal ning võttes arvesse, et oodatud tulemusi esineb kõige rohkem pärast doseerimist. Üles tuleks märkida loomade tervislik seisund. Vähemalt kaks korda päevas tuleks kontrollida, ega loomad ei ole haiges ­
tunud või surnud. Kõiki loomi tuleks kaaluda vähemalt kord nädalas ja 
surmamisel. Sööda tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuri ­
tavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleb vee tarbimist mõõta pärast iga veevahetust ja vähemalt üks kord nädalas. Loomad, kellel leitakse raske 
mürgistuse tunnuseid, mis ei ole küll surmavad, tuleks humaanselt surmata 
enne katse lõppu (23).
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Kudede kogumine  
35. Kudede kogumise põhjendus peaks olema selgelt määratletud. Kuna mutat ­
sioonide tekkimist on võimalik uurida peaaegu igas koes, peaks kogutavate 
kudede valimine põhinema uuringu tegemise eesmärgil ja kõikidel uuritava kemikaali kohta saadud mutageensuse, kantserogeensuse ja mürgisuse andmetel. Olulised tegurid, mida tuleks kaaluda, peaksid hõlmama vähemalt 
järgmist: manustamisviis (põhineb inimeste tõenäolisel kokkupuuteviisil), 
jaotumine kudedes ja võimalik toimemehhanism. Taustteabe puudumise korral tuleks koguda paljusid somaatilisi kudesid, kuna need võivad pakkuda huvi. Nende hulgas peaks olema kiiresti kasvavaid, aeglaselt 
kasvavaid ja kokkupuutekoha kudesid. Lisaks tuleks koguda spermatosoide 
seemnejuhast ja munandimanuse sabast ning arenevaid sugurakke seemne ­
kanalikestest (nagu on kirjeldatud punktides 32 ja 33) ja säilitada hilisema analüüsi jaoks, kui on vaja määrata mutageensust sugurakkude suhtes. 
Tuleks määrata elundite massid ja suuremate elundite puhul tuleks kõikidelt 
loomadelt koguda üks ja sama piirkond.
 
Kudede ja DNA säilitamine  
36. Kudesid või nende homogenaate tuleb säilitada temperatuuril alla —70 °C 
ja kasutada DNA eraldamiseks viie aasta jooksul. Eraldatud DNA, mida 
säilitatakse temperatuuril 4 °C sobivas puhverlahuses, tuleks kasutada mutatsioonide analüüsiks 1 aasta jooksul.
 
Kudede valimine mutantide analüüsiks  
37. Kudede valimisel tuleks arvestada järgmist: 1) manustamistee või esimese 
kokkupuute koht (nt näärmemagu suukaudsel manustamisel, kopsud sisse ­
hingamisega manustamisel, nahk, kui määritakse nahale) ja 2) farmakoki ­
neetilised näitajad, mida vaadeldakse üldistes mürgisuse uuringutes, mis 
näitavad levikut kudedesse, püsimist kudedes või kogunemist kudedesse, 
samuti mürgisuse sihtorganid. Kui uuring tehakse kantserogeensusuuringu jätkuna, tuleks arvestada kantserogeensuse sihtkudesid. Analüüsi jaoks kudede valimisel tuleks seada eesmärgiks selliste kemikaalide tuvastamine, 
mis on otse toimivad  in vitro  mutageenid, mis kiiresti metaboliseeritakse, on 
väga reaktsioonivõimelised või neelduvad halvasti või mille sihtkude on määratud manustamisteega (6).
 
38. Kui taustteavet ei ole ning võttes arvesse kokkupuute kohta, mis on 
määratud manustamisviisiga, tuleks mutageensust hinnata maksa ja vähe ­
malt ühe kiiresti jaguneva koe (nt näärmemagu, luuüdi) järgi. Enamikul juhtudel võib eespool nimetatud nõuded täita kahe hoolikalt valitud koe 
analüüsiga, kuid mõnel juhul oleks vaja analüüsida kolme või enamat 
kude. Kui on põhjust eriti muretseda mõju pärast sugurakkudele, sealhulgas positiivse tulemuse pärast somaatilistes rakkudes, tuleks mutatsioonide suhtes uurida sugurakkude kudesid.
 
Mõõtmismeetodid  
39. Standardsed avaldatud laborimeetodid mutantide avastamiseks on kättesaa ­
davad järgmiste soovitatavate transgeenimudelite jaoks:  lacZ  λ-bakteriofaag 
ja -plasmiid (30);  lacI hiir (2, 18);  gpt delta hiir (22);  gpt delta rott (28);  cII 
(17). Muudatused peavad olema nõuetekohaselt põhjendatud ja dokumen ­
teeritud. Mitme pakendi andmed saab koondada ja kasutada selleks, et saavutada piisav arv lüüsilaike või kolooniaid. Kui vajaliku arvu lüüsilai ­
kude saamiseks on vaja suurt arvu pakendamisreaktsioone, võib see näidata 
DNA halba kvaliteeti. Sellisel juhul tuleks andmeid hoolikalt kaaluda, kuna 
need ei tarvitse olla usaldusväärsed. Lüüsilaikude või kolooniate optimaalne
 ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
koguarv DNA- proovi kohta on määratud statistilise tõenäosusega, et 
õnnestub kindlaks teha piisav arv mutante teatava spontaanse mutatsiooni ­
sageduse juures. Üldiselt on vaja vähemalt 125 000 — 300 000 lüüsilaiku, kui spontaanne mutatsioonisagedus on suurusjärgus 3 × 10
 –5 (15). Big 
Blue®  lacI  katse puhul on oluline näidata, et kogu mutantide värvusfeno ­
tüüpide vahemikku saab avastada; selleks lisatakse sobivad värvuse kont ­
rollid paralleelselt igale plaadile. Koed ja saadavad proovid (näidised) tuleks töödelda ja analüüsida plokkskeemi alusel, milles lahusti/kandeaine kont ­
rollrühma, positiivse kontrolli rühma (kui seda kasutatakse) või positiivse 
kontrolli DNA (kui see on asjakohane) ja iga doosirühma näidised töödel ­
dakse koos.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Andmete töötlemine  
40. Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabeli kujul. Katseühikuks on 
loom. Protokollis tuleks esitada lüüsilaike moodustavate ühikute ( plaque- 
forming units , PFU) või kolooniaid moodustavate ühikute ( colony-forming 
units , CFU) koguarv, mutantide arv ja mutatsioonide sagedus iga looma iga 
koe puhul. Kui tegemist on paljude pakendamis- või vabastamisreaktsioo ­
nidega, tuleks esitada reaktsioonide arv iga DNA-näidise kohta. Andmed iga üksiku reaktsiooni kohta tuleks säilitada, kuid protokollis on vaja esitada 
ainult vaid PFU-de või CFU-de üldarv. Tuleks esitada andmed mürgisuse 
kohta ja kliinilised tunnused, vt punkt 34. Iga analüüsitud mutandi puhul tuleb esitada kõik sekveneerimisandmed, samuti nendest tulenevad mutat ­
sioonisageduse andmed iga looma ja iga koe kohta.
 
Tulemuste statistiline hindamine ja tõlgendamine  
41. On mitmeid kriteeriume positiivse tulemuse määramiseks, nagu muteerumis ­
sageduse suurenemine sõltuvalt kemikaali doosist või mutatsioonide sage ­
duse selge suurenemine ühes doosirühmas, võrreldes lahusti/kandeaine kontrollrühmaga. Doosi-toime sõltuvuse jaoks piisavate andmete saamiseks 
on vaja uurida vähemalt kolme doosirühma. Peamine arvesse võetav tegur 
on tulemuste bioloogiline asjakohasus, kuid katsetulemuste hindamiseks võib kasutada sobivaid statistilisi meetodeid (4, 14, 15, 25, 26). Kasutata ­
vate statistiliste testide korral tuleks eksperimendiühikuks pidada üksi ­
klooma.
 
42. Uuritavat kemikaali, millega saadavad tulemused ühegi koe puhul ei vasta 
eespool esitatud kriteeriumidele, peetakse käesoleva katsemeetodi kohaselt negatiivseks. Et negatiivset tulemust saaks pidada bioloogiliselt asjakoha ­
seks, tuleks koe kokkupuudet kemikaaliga tõendada.
 
43. DNA sekveneerimisanalüüside puhul võib tulemuste tõlgendamisel kasutada 
mitmeid statistilisi lähenemisviise (1, 5, 9, 19).  
44. Toime bioloogilise olulisuse hindamisel võib juhinduda sellest, kas leitud 
väärtused on varasemate kontrollkatsete vahemikus või väljaspool seda 
vahemikku (32).  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Katseprotokoll  
45. Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav kemikaal:  
— identifitseerimisandmed ja CASi nr, kui see on teada;  
— allikas, partii number, kui on olemas;  
— füüsikaline olek ja puhtus;  
— uuringu tegemisel olulised füüsikalis-keemilised omadused;  
— uuritava kemikaali stabiilsus, kui see on teada.  
Lahusti/kandeaine:  
— kandeaine valiku põhjendus;  
— uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines, kui on 
teada;  
— sööda, joogivee või sissehingamise kaudu manustamiseks sobiva vormi 
valmistamine;  
— osutatud vormi analüüsid (nt, stabiilsus, ühtlus, nominaalsed kontsen ­
tratsioonid).  
Katseloomad:  
— kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;  
— loomade arv, vanus ja sugu;  
— päritolu, pidamistingimused, sööt jne;  
— iga looma mass katse alustamisel, sh kehamassi vahemik, keskväärtus ja 
standardhälve iga rühma kohta.  
Katsetingimused:  
— positiivseid ja negatiivseid (lahus/kandeaine) kontrollkatseid käsitlevad 
andmed;  
— vahemiku leidmise uuringu andmed;  
— doositaseme valimise põhjendus;  
— uuritud kemikaali preparaadi üksikasjad;  
— uuritud kemikaali manustamise üksikasjad;  
— manustamistee põhjendus;  
— looma suhtes avalduva mürgisuse mõõtmise meetodid, sealhulgas histo ­
patoloogilised või hematoloogilised analüüsid, kui need on tehtud, ja loomade vaatluste ja kehamassi määramise sagedus;
 
— meetodid, millega kontrolliti, et uuritav kemikaal jõudis sihtkoesse või 
üldvereringesse, kui tulemused olid negatiivsed;  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— tegelik doos (mg kehakaalu kg kohta päevas), mis arvutatakse sööda/ ­
joogivee tarbimise ja selles uuritava kemikaali sisalduse (ppm) järgi, kui 
see on kohaldatav;  
— sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;  
— manustamis- ja proovivõtukavade detailne kirjeldus ja nende valiku 
põhjendused;  
— humaanse surmamise meetod;  
— kudede eraldamise ja säilitamise kord;  
— näriliste genoomse DNA eraldamise, transgeeni genoomsest DNA-st 
vabastamise ja transgeense DNA bakteriaalsesse peremeesorganismi 
ülekandmise meetodid;  
— kõikide rakkude, katsekomplektide ja reaktiivide allikad ja partiide 
numbrid (vajaduse korral);  
— mutantide loendamine meetodid;  
— mutantide molekulaarse analüüsi, kloonsuse paranduse kasutamise ja 
mutatsioonide sageduse arvutamise meetodid, kui see on kohaldatav.  
Tulemused:  
— loomade seisund enne katset ja kogu katse ajal, sealhulgas mürgistuse 
tunnused;  
— keha ja elundite massid surmamisel;  
— iga koe ja looma kohta mutantide arv, hinnatud lüüsilaikude või koloo ­
niate arv, mutatsioonide sagedus;  
— iga koe ja loomade rühma kohta pakendamisreaktsioonide arv DNA 
proovi kohta, mutantide üldarv, keskmine muteerumissagedus, standard ­
hälve;  
— doosi ja toime suhe, võimaluse korral;  
— iga koe ja looma kohta sõltumatute mutantide arv ja keskmine mutat ­
sioonisagedus, kui tehti mutatsioonide molekulaarne analüüs;  
— paralleelsed ja varasemad negatiivse kontrolli andmed, nende vahe ­
mikud, keskväärtused ja standardhälbed;  
— paralleelse positiivse kontrolli (või mitteparalleelse positiivse kontrolli 
DNA) andmed;  
— analüütilised määramised, kui need on kättesaadavad (nt DNA kontsen ­
tratsioon, mida kasutati pakendamisel, DNA sekveneerimise andmed);  
— kasutatud statistilised analüüsid ja meetodid.  
Tulemuste arutelu  
Kokkuvõte  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
KIRJANDUS  
1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391–396.  
2) Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107–112.  
3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  
Mutations’  Nature , 377(6550): 657–659  
4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’  , Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255.  
5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413.
 
6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151.  
7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 
7485-7489.
 
8) Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2–3): 197–212.
 
9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418.  
10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  86(20): 7971–7975.
 
11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques , 14(3): 326, 330.  
12) Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125–136.  
13) Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96–106 . 
14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255.  
15) Heddle, J.A ., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. 
Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Trans ­
genic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253–259.
 
16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. 
Mutagen. , 41: 1–6.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  Muta­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 
93(17): 9073-9078.  
18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Muta ­
genicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.  
19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772–778.  
20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi  – 
and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.  
21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15.  
22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215.  
23) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, 
ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/ ­
MONO(2009)7, OECD, Paris.  
25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245.  
26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.
 
27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164–193.
 
28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71–78.
 
29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. 
Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Trans­
genic Mutation Assays’,  Mutation Res ., 540: 141–151.
 
30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo’  in: G. Pfeifer (ed.),  
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  
Plenum Press, New York, NY, USA, pp. 391–410.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1–2): 
117–123.  
32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control 
Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.  
33) OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays , Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/ ­
MONO(2011)20, OECD, Paris.  
34) Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198–236.
 
35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epidi ­
dymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, 
Elsevier, the Netherlands, pp. 1071-1148.  
36) Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Liide  
MÕISTED  
Alusepaari asendumine  – mutatsioonitüüp, mille tulemusel üksainus DNA 
nukleotiidipaar asendub muu nukleotiidipaariga.  
Cos-sait  – 12 nukleotiidi pikkune üheahelaline DNA-lõik, mis asub λ-bakterio­
faagi kaheahelalise genoomi mõlemas otsas.  
Deletsioon  – mutatsioon, millega genoomist läheb kaduma üks nukleotiid või 
(järjestikuste) nukleotiidide lõik.  
Ekstrabinomiaalne variatsioon  – populatsiooni osatähtsuse korduvate hinda ­
miste suurem varieeruvus, kui võiks oodata juhul, kui populatsioonil on binomiaaljaotus.
 
Elektroporeerimine  – elektriimpulsside kasutamine rakumembraanide läbilas ­
kvuse suurendamiseks.  
Endogeenne geen  – genoomile algselt omane geen.  
Insertsioon  – genoomile ühe nukleotiidse alusepaari või (järjestikuste) nukle ­
otiidsete alusepaaride lõigu lisamine.  
Jackpot  – suur arv mutante, mis on tekkinud ühestainsast mutatsioonist klooni 
kasvu tulemusel.  
Kapsiid  – valgukest, mis ümbritseb viiruseosakest.  
Kemikaal  – aine või segu.  
Klooni kasv  – paljude rakkude tekkimine ühestainsast (muteerunud) rakust.  
Kolooniaid moodustav ühik ( colony-forming unit , CFU)  – eluvõimeliste 
bakterite arvu näitav suurus.  
Konkatameer  – pikk pidev biomolekul, mis koosneb paljudest ahelaks ühen ­
datud ühesugustest koopiatest.  
Ligeerimine  – DNA-molekulide kahe otsa kovalentne linkimine DNA-ligaasi 
toimel.  
Lüüsilaikusid moodustav ühik ( plaque forming unit , PFU)  – eluvõimeliste 
bakteriofaagide arvu näitav suurus.  
Manustamisperiood  – kogu ajavahemik, mille jooksul loomale manustatakse 
kemikaalidoose.  
Mitogeen  – kemikaal, mis stimuleerib rakku alustama jagunemist ja käivitab 
sellega mitoosi (raku jagunemise).  
Neutraalne geen  – geen, mida ei mõjuta ei positiivne ega negatiivne selektsioo ­
niline surve.  
Pakendamine  – nakatamisvõimeliste faagiosakeste sünteesimine faagi kapsiidi 
ja faagi saba valkude valmistisest ning faagi DNA-molekulide konkatameerist. Kasutatakse tavaliselt kloonitud DNA pakendamiseks λ-vektorisse (mis on eral ­
datud cos-saitidega), et saada nakatamisvõimelised λ-osakesed.
 
Pakendamise tõhusus  – tõhusus, millega pakendatud bakteriofaagid leitakse 
peremeesbakterites.  
Positiivne selektsioon  – meetod, mille puhul jäetakse ellu üksnes mutandid.  ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Proovivõtuaeg  – surmamisele eelneva ajavahemiku lõpp, mille kestel kemikaali 
ei manustata ja parandamata DNA-kahjustused fikseeruvad püsivateks stabiilse ­
teks mutatsioonideks.  
Punktmutatsioon  – üldine termin, millega tähistatakse üksnes väikses 
DNA-lõigus toimunud mutatsiooni, hõlmab insertsioone, deletsioone ja alusepaari asendumisi.
 
Raaminihke mutatsioon  – geneetiline mutatsioon, mis tekib valku või peptiidi 
kodeerivas DNA-järjestuses, kui insertsiooniga on lisatud või deletsiooniga 
eemaldatud selline arv nukleotiide, mida ei saa jäägita jagada kolmega.  
Reportergeen  – geen, mille mutantne geenisaadus on kergesti avastatav.  
Suur deletsioon  – DNA-st mitme tuhande alusepaari väljalangemine (mida saab 
tõhusalt kindlaks teha Spi  – -selektsiooni ja lacZ-plasmiidi katsega).  
Süstikvektor  – selliselt konstrueeritud vektor, mis saab paljuneda kahes erinevas 
peremeesliigis; tänu sellele saab süstikvektorisse sisestatud DNA-d tuvastada või 
muuta kahes erinevat tüüpi rakus või kahes erinevas organismis.  
Transgeenne  – iseloomustab organismi, mille genoomi on muudetud sellesse 
muu liigi geeni või geenide sisseviimisega, või on sellega seotud.  
Uuritav kemikaal  – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M5 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
C OSA: KESKKONNAMÜRGISUSE MÄÄRAMISE MEETODID  
SISUKORD 
C.1. ÄGE MÜRGISUS KALADELE 
C.2. DAPHNIA  SP. LIIKUMISVÕIME AKU 
UTSE PÄRSSIMISE KATSE 
C.3. MAGEVEEVETIKATE JA TSÜANOBAKTERITE KASVU 
PIDURDAMISE KATSE 
C.4. KOHESE BIOLAGUNDUVUSE MÄÄRAMINE I OSA. ÜLDPÕHIMÕTTED 
II OSA. DOC KÕRVALDAMISE KATSE (meetod C.4-A) 
III OSA. MUUDETUD OECD SÕELKATSE (meetod C.4-B) 
IV OSA. CO
 2 ERALDUMISE KATSE (meetod C.4-C) 
V OSA. MANOMEETRILISE RESPIROMEETRIA KATSE (meetod C.4-D) 
VI OSA. KINNISE PUDELI KATSE (meetod C.4-E) 
VII OSA. MITI KATSE (meetod C.4-F) 
C.5. LAGUNEMINE – BIOKEEMILINE HAPNIKUTARVE 
C.6. LAGUNEMINE – KEEMILINE HAPNIKUTARVE C.7. LAGUNEMINE – ABIOOTILINE LAGUNEMINE: HÜDRO ­
LÜÜSI SÕLTUVUS pHst 
C.8. TOKSILISUS VIHMAUSSIDELE – TEHISMULLA TEST 
C.9. BIODEGRADATSIOON – ZAHNI-WELLENSI TEST 
C.10. REOVEE AEROOBSE TÖÖTLEMISE SIMULATSIOONI ­
KATSE: C.10-A: AKTIIVMUDA – C.10-B: BIOKILED 
C.11. BIODEGRADATSIOON – AKTIIVMUDA RESPIRATSIOONI 
PÄRSSIMISE TEST 
C.12. BIODEGRADATSIOON – MODIFITSEERITUD SCAS TEST 
C.13. BIOKONTSENTRATSIOON: KALADEGA LÄBIVOOLU ­
KATSE 
C.14. NOORKALADE KASVUKATSE 
C.15. KALA EMBRÜO JA REBUKOTIGA VASTSETEGA TEHTAV 
LÜHIAJALINE TOKSILISUSE KATSE 
C.16. MESILASED – AKUUTSE SUUKAUDSE TOKSILISUSE 
KATSE 
C.17 MESILASED – AKUUTSE KONTAKTTOKSILISUSE KATSE 
C.18. ADSORPTSIOON/DESORPTSIOON, KASUTADES PARTII 
TASAKAALUSTAMISE MEETODIT
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. ADSORPTSIOONITEGURI (K  OC ) KINDLAKSMÄARAMINE ­
MULLAS JA REOVEESETTES KÕRGSURVEVEDELIKKRO ­
MATOGRAAFIA (HPLC) ABIL 
C.20. HIIDKIIVRIKU ( DAPHNIA MAGNA ) SIGIVUSE KATSE 
C.21. MULLAMIKROOBID: LÄMMASTIKU TRAMSFORMAT ­
SIOONI KATSE 
C.22. MULLAMIKROOBID: SÜSINIKU TRANSFORMATSIOONI 
KATSE 
C.23. AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON 
MULLAS 
C.24. AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON 
PÕHJASETTES 
C.25. AEROOBNE MINERALISEERUMINE PINNAVEES – BIOLA ­
GUNEMISE MUDELKATSE 
C.26. LEMLE  LEMNA  SP. KASVU PIDURDAMISE KATSE  
▼M4 
C.27. SETTE-VEE MÜRGISUSKATSE SURUSÄÄSKLASTEL 
RIKASTATUD SETTE KASUTAMISEGA 
C.28. SETTE-VEE MÜRGISUSKATSE SURUSÄÄSKLASTEL 
RIKASTATUD VEE KASUTAMISEGA 
C.29. KIIRE BIOLAGUNDATAVUS – CO  2 SULETUD NÕUDES 
(VABARUUMI KATSE) 
C.30. BIOAKUMULATSIOON MULLA VÄHEHARJASUSSIDES  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. ÄGE MÜRGISUS KALADELE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Katses määratakse aine äge surmav mürgisus mageveekaladele. 
Katse kestel testaine piisavalt püsiva kontsentratsiooni tagamiseks 
parima katsemeetodi (seisva, poolseisva veega või läbivooluga katse ­
süsteem) valimisel on kasulik teada võimaluse korral aine lahustu ­
vust vees, aururõhku, keemilist stabiilsust, dissotsiatsioonikonstante 
ja biolagunduvust.  
Katse kavandamisel ja tulemuste tõlgendamisel tuleks arvestada ka 
muid andmeid (näiteks struktuurivalemit, puhtusastet, peamiste lisan ­
dite iseloomu ja protsentuaalset sisaldust, lisaainete olemasolu ja 
koguseid ning oktanooli/vee jaotustegurit).  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Äge mürgisus on märgatav kahjulik mõju, mis avaldub organismis 
lühikese aja (päevade) jooksul pärast ainega kokkupuudet. Käesole ­
vas katses väljendatakse ägedat mürgisust keskmise surmava kont ­
sentratsioonina (LC  50 ), see tähendab kontsentratsioonina vees, mis 
surmab kindla katkematu kokkupuuteaja (mis peab olema märgitud) jooksul 50 % katses kasutatud kaladest.
 
Kõiki testaine kontsentratsioone väljendatakse massiühikutes mahuü ­
hiku kohta (milligrammides liitri kohta). Neid võib väljendada ka 
massiühikutes massiühiku kohta (mg/kg  –1 ). 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Katses võib kasutada võrdlusainet näitamaks, et katseliigi reaktsioon 
ei ole laboratoorsetes katsetingimustes oluliselt muutunud.  
Käesoleva katse jaoks ei ole võrdlusaineid nimetatud.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Kontsentratsioonil 100 mg/l võib teha piirsisalduskatse näitamaks, et 
LC 50 on sellest kontsentratsioonist kõrgem.  
Kalad viiakse 96 tunniks kokkupuutesse veele kindlaksmääratud 
kontsentratsioonides lisatud testainega. Suremus registreeritakse vähemalt iga 24 tunni tagant ja igas vaatluspunktis arvutatakse 
võimaluse korral kontsentratsioon, mis surmab 50 % kaladest (LC
 50 ). 
1.5. KVALITEEDINÕUDED  
Kvaliteedinõuded kehtivad nii piirsisalduskatse kui ka täiskatsepro ­
grammi suhtes.  
Kontrollkatsete suremus ei tohi katse lõpuks ületada 10 % (alla 
kümne kala kasutamisel võib surra vaid üks kala).  
Lahustunud hapniku kontsentratsioon peab kogu katse kestel olema 
kõrgem kui 60 % küllastusväärtusest.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Testaine kontsentratsioon peab kogu katse kestel olema vähemalt 
80 % algkontsentratsioonist.  
Katsekeskkonnas hästi lahustuvaid ja püsivaid lahuseid, st arvesta ­
taval määral mitte lenduvaid, lagunevaid, hüdrolüüsuvaid ega adsor ­
beeruvaid lahuseid andvate ainete puhul võib algkontsentratsiooni 
lugeda võrdseks nimikontsentratsiooniga. Kontsentratsiooni püsimist 
kogu katse kestel ja kvaliteedinõuete täitmist tuleb tõendada.  
Ainete puhul, mis:  
i) on katsekeskkonnas vähelahustuvad või  
ii) moodustavad stabiilseid emulsioone või dispersioone või  
iii) ei ole vesilahuses stabiilsed,  
loetakse algkontsentratsiooniks lahuses mõõdetud kontsentratsioon 
(või veesambas mõõdetud kontsentratsioon, kui lahuses mõõtmine 
ei ole tehniliselt võimalik). Kontsentratsioon mõõdetakse pärast 
mõningast tasakaalustumist, kuid enne kalade lahusesse viimist.  
Kõigil neil juhtudel tuleb katse kestel teha täiendavaid mõõtmisi, mis 
kinnitaksid tegelikku kokkupuutekontsentratsiooni ja kvaliteedi ­
nõuete täitmist.  
pH ei tohiks kõikuda rohkem kui ühe ühiku võrra.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
Kasutada võib kolme tüüpi katseskeemi.  
Seisva veega katsesüsteem:  
mürgisuse katse ilma katselahuse läbivooluta (lahus ei vahetu katse 
kestel).  
Poolseisva veega katse:  
katse ilma katselahuse läbivooluta, kuid regulaarse katselahuse 
osakaupa vahetamisega pikemate perioodide (nt 24 tunni) järel.  
Läbivooluga katse:  
mürgisuse katse, mille puhul vesi katsekambrites pidevalt vahetub, 
kusjuures koos vahetusveega viiakse katsekambritesse ka uuritav kemikaal.
 
1.6.1.  Reaktiivid  
1.6.1.1.  Testainete lahused  
Vajaliku kontsentratsiooniga põhilahused valmistatakse aine lahusta ­
misel deioniseeritud vees või punktile 1.6.1.2 vastavas vees.  
Vajaliku kontsentratsiooniga katselahused valmistatakse põhilahuse 
lahjendamisel. Kõrgete kontsentratsioonide uurimisel võib aine 
lahustada otse lahjendusvees.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Aineid kontrollitakse üldjuhul lahustuvuse piirini. Mõnede ainete 
puhul (nt vees vähelahustuvate, kõrge P  OW -ga või vees pigem 
stabiilse dispersiooni kui tõelise lahuse moodustavate ainete puhul) võib katse teha aine lahustuvuspiirist kõrgemal kontsentratsioonil, et tagada kõrgeima lahustuva/stabiilse kontsentratsiooni saavutamine. 
Samas on oluline, et see kontsentratsioon ei häiriks katsesüsteemi 
muul moel (nt nii, et aine kile vee pinnal takistab hapniku lahustu ­
mist vees jne).
 
Vees vähelahustuvate ainete põhilahuste valmistamisel või nende 
dispergeerimisel katsekeskkonnas võib abivahendina kasutada ultra ­
helidispergeerimist, orgaanilisi lahusteid, emulgaatoreid või disper ­
gaatoreid. Selliste abiainete kasutamisel peavad kõik katsekontsen ­
tratsioonid sisaldama sama koguse abiainet ja täiendavad kontroll ­
kalad tuleks viia kokkupuutesse katseseeriaga võrdväärse abiaine 
kontsentratsiooniga. Seesuguste abiainete kontsentratsioon katsekesk ­
konnas peaks olema minimaalne ega tohiks mingil juhul ületada 100 mg/l.
 
Katse tuleks teha ilma pH-d reguleerimata. Märgatavate pH muutuste 
ilmnemisel on soovitatav katset reguleeritava pH-ga korrata ja esitada korduskatse tulemused. Eriliste vastunäidustuste puudumisel tuleks 
sellisel juhul põhilahuse pH reguleerida võrdseks lahjendusvee 
omaga. Eelistatav on selleks kasutada HCl ja NaOH. pH-d tuleb reguleerida nii, et testaine kontsentratsioon põhilahuses märgatavalt 
ei muutu. Ära tuleks märkida pH reguleerimisest tingitud võimalikud 
keemilised reaktsioonid või sademe teke.
 
1.6.1.2.  Pidamis- ja lahjendusvesi  
Kasutada võib kraanivett (milles ei leidu ohtlikus kontsentratsioonis 
kloori, raskmetalle ega muid aineid), kvaliteetset looduslikku vett või taastatud vett. Eelistada tuleks vett üldkaredusega 10–250 mg/l (arvestatud CaCO
 3 -na) ja pH-ga 6,0–8,5.  
1.6.2.  Seade  
Kõik seadme osad peavad olema valmistatud keemiliselt inertsest 
materjalist:  
— automaatne lahjendussüsteem (läbivooluga katses);  
— hapnikumõõtur;  
— vee kareduse määramise seade;  
— asjakohane termoregulaator;  
— pH-meeter.  
1.6.3.  Katses kasutatavad kalad  
Kalad peaksid olema terved ja nähtavate väärarenguteta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Kasutatav liik tuleks valida praktiliste kaalutluste põhjal, näiteks 
aastaringse kättesaadavuse, vähese hooldusvajaduse ja hõlpsa katses 
kasutatavuse põhjal, tundlikkuse põhjal kemikaalide suhtes ja mis tahes asjaomaste majanduslike, bioloogiliste või ökoloogiliste tegu ­
rite põhjal. Kalaliigi valikul tuleks silmas pidada andmete võrrelda ­
vust ja olemasolevaid rahvusvahelisi kooskõlastusi (viide 1).
 
Soovitatavate katses kasutatavate liikide nimekiri on esitatud 2. liites; 
eelistatavad liigid on sebrakala ja vikerforell.  
1.6.3.1.  Pidamine  
Katses kasutatavad kalad peaksid olema pärit ühest allikast ja olema 
sarnase pikkuse ja vanusega. Kalu tuleb vähemalt 12 päeva pidada järgmistel tingimustel:
 
katseaine sisaldus:  
vastavalt süsteemile (tsirkulatsiooni või läbivooluga) ja kalaliigile,  
vesi:  
vt 1.6.1.2,  
valgus:  
12–16 tundi päevas,  
lahustunud hapniku kontsentratsioon:  
vähemalt 80 % küllastusväärtusest,  
söötmine:  
kolm korda nädalas või iga päev, söötmine lõpetatakse 24 tundi enne 
katset.  
1.6.3.2.  Suremus  
Pärast 48tunnist stabiliseerumisperioodi registreeritakse suremus ja 
rakendatakse järgmiseid kriteeriume:  
— üle 10 % populatsioonist seitsme päeva jooksul:  
kalad loetakse sobimatuks;  
— 5–10 % populatsioonist:  
kalu jälgitakse veel seitse päeva.  
Kui suremust rohkem ei esine, on kalad sobivad, vastasel juhul 
loetakse need sobimatuks;  
— alla 5 % populatsioonist:  
kalad loetakse sobivaks.  
1.6.4.  Kohandumisperiood  
Kõiki kalu tuleb enne katset pidada vähemalt seitse päeva katsetin ­
gimustele vastavas vees katsetingimustele vastaval temperatuuril.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Katse käik  
Lõplikule katsele võib eelneda annusevahemiku leidmise katse, kus 
kogutakse andmeid katses kasutatava kontsentratsioonivahemiku kohta.
 
Lisaks katseseeriale tehakse üks kontrollkatse ilma testaineta ja vaja ­
duse korral ka üks kontrollkatse abiainet sisaldava lahusega.  
Vastavalt katseühendi füüsikalis-keemilistele omadustele valitakse 
kvaliteedinõuete täitmiseks seisva veega, poolseisva veega või läbi ­
vooluga katsesüsteem.  
Kalad viiakse testainega kokkupuutesse allpool kirjeldatud moel:  
— kestus: 96 tundi;  
— isendite arv: iga kontsentratsiooni kohta vähemalt seitse;  
— mahutid: küllaldase mahuga soovitatava koguse jaoks;  
— katseaine sisaldus: seisva veega ja poolseisva veega katsesüs ­
teemis on suurim soovitatav sisaldus 1 g/l, läbivooluga süstee ­
mides võib see olla suurem;  
— katsekontsentratsioon: kasutatakse vähemalt viit kontsentrat ­
siooni, mis erinevad üksteisest konstantse teguri (kuni 2,2) 
võrra ja mis võimaluse korral hõlmavad kogu suremusvahemikku 
0–100 %;  
— vesi: vt 1.6.1.2;  
— valgus: 12–16 tundi päevas;  
— temperatuur: vastavalt liigile (2. liide), kuid ei tohi ühegi katse 
kestel kõikuda rohkem kui ± 1  o C; 
— lahustunud hapniku kontsentratsioon: vähemalt 60 % küllastus ­
väärtusest antud temperatuuril;  
— söötmine: ei söödeta.  
Kalu vaadeldakse esimese 2–4 tunni pärast ja seejärel vähemalt iga 
24 tunni järel. Kalad loetakse surnuks, kui sabavarre puudutamine ei 
kutsu esile reaktsiooni ja puuduvad nähtavad hingamisliigutused. Surnud kalade avastamisel need kõrvaldatakse ja suremus registree ­
ritakse. Registreeritakse ka nähtavad kõrvalekalded (nt tasakaalu 
puudumine, muutused ujumiskäitumises, hingamisfunktsioonis või 
pigmentatsioonis jne).
 
Iga päev tuleb mõõta pH-d, lahustunud hapniku kontsentratsiooni ja 
temperatuuri.  
Piirsisalduskatse  
Käesoleva katsemeetodi protseduuri järgides võib kontsentratsioonil 
100 mg/l teha piirsisalduskatse näitamaks, et LC  50 on sellest kont ­
sentratsioonist kõrgem.  
Kui aine iseloom välistab kontsentratsiooni 100 mg/l saavutamise 
katses kasutatavas vees, tuleks piirsisalduskatse teha kontsentrat ­
sioonil, mis on võrdne aine lahustuvusega kasutatavas keskkonnas 
(või kõrgeimal kontsentratsioonil, kus moodustub stabiilne disper ­
sioon) (vt ka punkti 1.6.1.1).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Piirsisalduskatses tuleks kasutada 7–10 kala ja samapalju kontroll ­
kalu. (Binomiaalteooria kohaselt võib 99,9 % tõenäosusega väita, et 
kui 10 kalaga katses on suremus null, siis on LC  50 piirsisalduskatses 
kasutatud kontsentratsioonist kõrgem. 7, 8 või 9 kala puhul näitab suremuse puudumine vähemalt 99 % tõenäosusega seda, et LC
 50 on 
kasutatud kontsentratsioonist kõrgem.)  
Suremuse esinemisel tuleb teha täiemahuline uuring. Subletaalse 
toime avaldumisel tuleks see registreerida.  
2. ANDMED JA HINDAMINE  
Iga vaatlustulemuste registreerimise ajavahemiku puhul (24, 48, 72 ja 
96 tundi) tuleb näidata iga soovitatava kokkupuuteperioodi kohta logaritmilisel diagrammil graafiliselt suremusprotsendi sõltuvus kont ­
sentratsioonist.
 
Võimaluse korral tuleks iga vaatlushetke kohta leida standardmeeto ­
deid kasutades hinnanguline LC  50 väärtus ja usalduspiirid (p = 0,05); 
need väärtused tuleks ümardada ühe või maksimaalselt kahe tüve ­
numbrini (kahe tüvenumbrini ümardamise näited: 173,5 → 170; 
0,127 → 0,13; 1,21 → 1,2).  
Juhtudel, kus kontsentratsiooni/protsentuaalse reaktsiooni kõvera tõus 
on LC  50 arvutamiseks liiga suur, piisab selle väärtuse graafilisest 
hindamisest.  
Kui kahe järjestikuse, 2,2kordse vahega kontsentratsiooni suremus 
on vastavalt 0 ja 100 %, piisab LC  50 vahemiku näitamiseks neist 
kahest väärtusest.  
Kui täheldatakse, et testaine stabiilsust või homogeensust ei ole 
võimalik säilitada, tuleks see ära märkida ja olla tulemuste tõlgenda ­
misel ettevaatlik.  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— andmeid katses kasutatavate kalade kohta (teaduslikku nimetust, 
liini, päritolu, mis tahes eelnevat mõjutamist ning igal katsekont ­
sentratsioonil kasutatud kalade suurust ja arvu);  
— lahjendusvee päritolu ja peamisi keemilisi näitajaid (pH, karedus, 
temperatuur);  
— vees vähelahustuva aine puhul põhi- ja katselahuste valmistamise 
meetodit;  
— kõigi abiainete kontsentratsiooni;  
— kasutatud kontsentratsioone ja kõiki olemasolevaid andmeid uuri ­
tava kemikaali kontsentratsioonide stabiilsuse kohta katselahuses;  
— keemiliste analüüside tegemisel kasutatud meetodeid ja saadud 
tulemusi;  
— piirsisalduskatse tulemusi, kui see tehti;  
— kasutatud katsemeetodi valiku põhjusi ja meetodi üksikasju (nt 
seisva veega, poolseisva veega katsesüsteem, annustamiskiirus, 
läbivoolu kiirus, aeratsioon, kalade hulk jne);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— katseseadmete kirjeldust;  
— valgusrežiimi;  
— katselahuste hapnikusisaldust, pH väärtusi ja temperatuuri iga 24 
tunni järel;  
— tõendeid kvaliteedinõuete täitmise kohta;  
— tabelit kumulatiivse suremuse kohta igal kontsentratsioonil ja 
kontrollkatses (ja vajaduse korral abiainega kontrollkatses) kõigil 
soovitatud vaatlushetkedel;  
— kontsentratsiooni/protsentuaalse reaktsioonikõvera graafikut katse 
lõpus;  
— võimaluse korral LC  50 väärtusi kõigil soovitatud vaatlushetkedel 
(95 % usalduspiiridega);  
— LC  50 määramisel kasutatud statistilisi meetodeid;  
— võrdlusainete kasutamisel nendega saadud tulemusi;  
— kõrgeimat katsekontsentratsiooni, mille puhul katse kestel sure ­
must ei esinenud;  
— madalaimat katsekontsentratsiooni, mille puhul suremus katse 
kestel oli 100 %.  
4. VIITED  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates.  
2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio -  Static and Flow Through methods – NFT 
90-303 June 1985.  
3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri -  Static and Flow Through methods – NFT 
90-305 June 1985.  
4) ISO 7346/l,/2 and/3 – Water Quality – Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish  (Brac­
hydanio rerio  Hamilton-Buchanan –  Teleostei, Cyprinidae).  
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: 
Flow-through method.  
5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsme ­
thoden – Part II 1974.  
6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) 
und L (15).  
7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata,  1980.  
9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
 
10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 
fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test 
programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979.
 
14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grund ­
lagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.986.  
15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
 
16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.
 
18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utili ­
sing and applying bioassay results. Water Res. 1970, 
vol. 4, 3-32.  
19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50.C50. In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I..I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634, 1977, 65-84.
 
20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
1. liide  
Taastatud vesi  
Sobiva lahjendusvee näited  
Kõik kemikaalid peavad olema analüüsipuhtad.  
Vesi peaks olema kvaliteetne destilleeritud vesi või deioniseeritud vesi juhtivu ­
sega alla 5 μS/cm  –1. 
Vee destilleerimise seade ei tohi sisaldada vaskosi.  
Põhilahused  
CaCl  2 . 2H  2 O (kaltsiumkloriiddihüdraat): 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini. 11,76 g 
MgSO  4 . 7H  2 O (magneesiumsulfaatheptahüdraat): 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini. 4,93 g 
NaHCO  3 (naatriumvesinikkarbonaat): 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini. 2,59 g 
KCl (kaaliumkloriid): 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini. 0,23 g  
Taastatud lahjendusvesi  
25 ml kõigist neljast põhilahusest segatakse kokku ja täiendatakse veega 1 liitrini.  
Aereeritakse, kuni hapnikusisaldus jõuab küllastuskontsentratsioonini.  
pH peaks olema 7,8 ± 0,2.  
Vajaduse korral reguleeritakse pH-d NaOH (naatriumhüdroksiidi) või HCl-ga 
(vesinikkloriidhappega).  
Sel viisil valmistatud lahjendusvett lastakse 12 tundi seista ja seda ei tohi enam 
aereerida.  
Ca ja Mg ioonide summaarne kogus selles lahuses on 2,5 mmol/l. Ca:Mg ioonide 
suhe on 4:1 ja Na:K ioonide suhe 10:1. Lahuse üldleelisus on 0,8 mmol/1.  
Ükski kõrvalekalle lahjendusvee valmistamisprotseduurist ei tohi muuta vee 
koostist või omadusi.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
2. liide  
Katseks soovitatavad kalaliigid  
Soovitatav liik Soovitatav katse ­
temperatuuride 
vahemik (  o C) Soovitatav katsei ­
sendi täispikkus 
(cm) 
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Sebrakala 20–24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Pakspea lepamaim 20–24 5,0 ± 2,5  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) Sasaan 20–24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) 
Cyprinodontidae  (Tomminck ja Schlegel 
1850) Riisikala 20–24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Gupi 20–24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarc ­
hidae)  (Rafinesque Linneaus 1758) Suur 
päikeseahven 20–24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmo ­
nidae)  (Walbaum 1988) Vikerforell 12–17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) Harilik säinas 20–24 6,0 ± 2,0  
Kogumine  
Eespool loetletud kalu on lihtne kasvatada ja/või neid on võimalik aasta läbi 
hankida. Neid on võimalik aretada ja kasvatada kalakasvandustes või laboris, 
tingimustes, kus haigused ja parasiidid on kontrolli all, nii et katses kasutatav 
isend on terve ja tema põlvnemine teada. Need kalad on saadaval mitmel pool maailmas.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
3. liide  
Kontsentratsiooni näide: suremusprotsendi sõltuvus  
Näide LC  50 määramise kohta logaritmilise probit-diagrammi abil
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. DAPHNIA  SP. LIIKUMISVÕIME AKUUTSE PÄRSSIMISE 
KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev liikumisvõime akuutse pärssimise katsemeetod vastab 
suunisele OECD TG 202 (2004).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolevas metoodikas kirjeldatakse akuutse toksilisuse katset kemi ­
kaalide toime hindamiseks vesikirpudele. Olemasolevaid katsemeeto ­
deid kasutati võimalikus ulatuses (viited 1, 2, 3).  
1.2. MÕISTED  
Käesoleva metoodika puhul kasutatakse järgmisi mõisteid.  
EC 50 – kontsentratsioon, mis hinnanguliselt muudab liikumisvõime ­
tuks 50 % vesikirpudest konkreetse kokkupuuteaja vältel. Muu määratluse kasutamisest tuleb teatada ja anda viide.
 
Liikumisvõime kaotus  – neid loomi, kes ei ole võimelised ujuma 15 
sekundi jooksul pärast katseanuma ettevaatlikku raputamist, loetakse 
liikumisvõime kaotanuks (isegi kui nad suudavad liigutada oma tundlaid).
 
1.3. MEETODI PÕHIMÕTE  
Noored vesikirbud vanuses kuni 24 tundi (katse alguseks) viiakse 
kokkupuutesse uuritava aine eri kontsentratsioonidega 48 tunniks. 
Liikumisvõime kaotus registreeritakse 24 ja 48 tunni pärast ja seda 
võrreldakse kontrollkatse väärtustega. Tulemustest arvutatakse EC  50 
48 tunni pärast (vt punkt 1.2, määratlus). EC  50 kindlaksmääramine 
pärast 24tunnist kokkupuudet ei ole kohustuslik.  
1.4. ANDMED UURITAVA AINE KOHTA  
Teada peaksid olema uuritava aine lahustuvus vees ja aururõhk ning 
peaks olema usaldusväärne analüütiline meetod, mille abil määrata 
kindlaks aine kogus uuritavas lahuses ja mille kohta on teada määra ­
mise saagis ja määramispiir. Kasulik on teada järgmist: struktuur ­
valem, aine puhtus, püsivus vees või valguse käes, P  OW ja kiire 
biolagundatavuse katse tulemused (vt meetod C.4).  
Märkus: suunised uuritava aine kohta, mille mõju uurimist rasken ­
davad selle füüsikalis-keemilised omadused, on esitatud viites 4.  
1.5. VÕRDLUSAINED  
EC 50 määramist võrdlusaine jaoks võib pidada vahendiks, millega 
tõendatakse katsetingimuste usaldusväärsust. Selleks soovitatakse kasutada rahvusvahelistes laboritevahelistes võrdluskatsetes kasutata ­
vaid mürkaineid (viited 1, 5) (
 1 ). Katse(d) võrdlusainega tuleb teha 
eelistatavalt iga kuu, kuid kindlasti vähemalt kaks korda aastas.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Kõnealuste laboritevaheliste katsete tulemuste ja standardi ISO 6341 tehnilise paranduse 
kohaselt asub kaaliumdikromaadi (K  2 Cr 2 O 7 ) 24 tunni EC  50 vahemikus 0,6 mg/l kuni 1,7 
mg/l.
 1.6. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Määramise õigsuse tõendamisel kohaldatakse järgmisi kriteeriume:  
— kontrollkatsetes, sealhulgas lahuse valmistamisel kasutatud abiai ­
nega kontrollkatsetes, ei tohiks liikumisvõimet kaotada üle 10 % vesikirpudest;
 
— lahustunud hapniku kontsentratsioon katse lõpus peab kontroll ­
katse- ja katseanumates olema ≥ 3 mg/l.  
Märkus: esimese kriteeriumi puhul ei tohi rohkem kui 10 %-1 vesi ­
kirpudest esineda liikumisvõime kaotust või muid haiguse või stressi 
nähte, näiteks värvuse muutust, ebaharilikku käitumist nagu veepin ­
nale lõksu jäämine.  
1.7. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.7.1.  Seadmed  
Katseanumad ja muud seadmed, mis puutuvad kokku katselahustega, 
peavad täielikult olema valmistatud klaasist või keemiliselt inertsest materjalist. Katseanumateks on tavaliselt klaasist katseklaasid või 
keeduklaasid, neid tuleb tavaliste laborimeetoditega puhastada enne 
iga kasutamist. Katseanumad peavad olema vabalt kaetud, et vähen ­
dada veekaotust auramise tõttu ja vältida tolmu sattumist lahustesse. Lenduvaid aineid tuleb uurida tihedalt suletud nõudes, mis on piisa ­
valt suured, et hapnikusisaldus ei hakkaks limiteerima ega langeks 
liiga madalale (vt osa 1.6 ja osa 1.8.3 esimene lõik).
 
Lisaks kasutatakse veel järgmisi vahendeid: hapnikumõõtja (mikro ­
elektroodi või muu sobiva anduriga, mis võimaldaks mõõta lahus ­
tunud hapnikku väikese ruumalaga proovis), pH-meeter, temperatuuri reguleerimiseks vajalik seade, seade orgaanilise süsiniku kogusisal ­
duse (TOC) määramiseks, seade keemilise hapnikutarbe (COD) 
määramiseks, seade vee kareduse määramiseks jne.
 
1.7.2.  Katsealune organism  
Daphnia magna  Straus on eelistatud katseliik, kuigi kõnealuses 
katses võib kasutada ka muid sobivaid  Daphnia  liike (nt  Daphnia 
pulex).  Katse alguses peavad loomad olema alla 24 tunni vanad ja 
varieeruvuse vähendamiseks soovitatakse tungivalt, et nad ei oleks esimese haudme järglased. Nad peavad olema terved (st neil ei tohi esineda selliseid stressi tunnuseid nagu suur suremus, isaste ja 
puhkeolekus munade esinemine, esimese haudme saamise viibimine, 
loomade värvuse muutus jne). Kõik konkreetses katses kasutatavad organismid peavad pärinema vesikirpude sama populatsiooni kultuu ­
ridest. Populatsiooni loomi tuleb säilitada katsetingimustega sarnane ­
vates kasvutingimustes (valgus, temperatuur, keskkond). Kui katses 
kasutatav vesikirpude kasvukeskkond erineb sellest, mida kasuta ­
takse tavalise vesikirpude kultuuri jaoks, on heaks tavaks näha ette katse-eelne aklimatiseerumisperiood. Selleks tuleb haudmevesikirpe 
hoida lahjendamiseks kasutatavas vees katsetemperatuuril vähemalt 
48 tundi enne katse alustamist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Hoidmisvesi ja lahjendamiseks kasutatav vesi  
Hoidmisveena ja lahjendamiseks kasutatava veena lubatakse kasu ­
tada looduslikku vett (pinna- või põhjavesi), taastatud vett või deklooritud kraanivett, kui vesikirbud jäävad selles ellu kasvatamise, 
aklimatiseerimise ja katsetamise ajal ega ilmuta stressi tunnuseid. 
Katseveeks sobib vesi, mis vastab 1. liites esitatud nõuetekohase lahjendamiseks kasutatava vee keemilistele omadustele. See vesi peab katse vältel olema ühesuguse kvaliteediga. Taastatud vee 
valmistamiseks lisatakse deioniseeritud või destilleeritud veele täpsed 
kogused tunnustatud analüütilise puhtusega reaktiive. Viidetes 1 ja 6 ning 2. liites on esitatud taastatud vee näited. Metalle sisaldavate 
uuritavate ainete puhul tuleks vältida kelaadimoodustajaid sisaldavaid 
toitesegusid, nagu M4 ja M7 2. liites. pH peaks olema vahemikus 6–9. Karedus peaks  Daphnia Magna  puhul olema vahemikus 
140–250 mg/l (CaCO
 3 -na); teiste  Daphnia  liikide puhul võib sobida 
väiksem karedus. Lahjendamiseks kasutatavat vett võib enne katses 
kasutamist aereerida, et lahustunud hapniku kontsentratsioon jõuaks küllastuseni.
 
Kui kasutatakse looduslikku vett, tuleb selle kvaliteedi parameetreid 
mõõta vähemalt kaks korda aastas või kui kahtlustatakse, et need 
omadused võivad olla oluliselt muutunud (vt eelmist lõiku ja 1. liidet). Samuti tuleb mõõta raskmetallide (st Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) sisaldus. Kui kasutatakse deklooritud kraanivett, on soovitatav 
iga päev mõõta kloori sisaldust. Kui lahjendamiseks kasutatakse 
pinna- või põhjavett, tuleb mõõta juhtivus ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus (TOC) või keemiline hapnikutarve (COD).
 
1.7.4.  Katselahused  
Valitud kontsentratsioonidega katselahused saadakse tavaliselt põhi ­
lahuse lahjendamisel. Põhilahuse valmistamiseks on soovitatav lahus ­
tada aine lahjendamiseks kasutatavas vees. Võimaluse korral tuleb vältida lahustite, emulgaatorite ja dispersantide kasutamist. Siiski võivad nimetatud ühendid olla teatud juhtudel vajalikud piisava kont ­
sentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks. Suunised sobivate lahus ­
tite, emulgaatorite ja dispersantide kohta on esitatud viites 4. Igal juhul ei tohi uuritava aine sisaldus katselahustes olla kõrgem kui lahustuvuse piir lahjendamiseks kasutatavas vees.
 
Katse tuleb teha ilma pH-d muutmata. Kui pH ei püsi vahemikus 
6–9, siis võib teha teise katse, milles põhilahuse pH väärtuseks seatakse lahjendamiseks kasutatava vee pH väärtus enne uuritava aine lisamist. pH tuleb korrigeerida nii, et see ei muudaks oluliselt 
põhilahuse kontsentratsiooni ega põhjustaks uuritava aine keemilist 
reaktsiooni ega sadenemist. Eelistatakse HCl ja NaOH lahuseid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. KATSE KÄIK  
1.8.1.  Kokkupuutetingimused  
1.8.1.1.  Katserühmad ja kontrollkatsed  
Katseanumasse viiakse vajalik kogus lahjendamiseks kasutatavat vett 
ja uuritava aine lahust. Õhu ja vee mahu suhe anumates peab olema 
katse- ja kontrollrühma puhul ühesugune. Seejärel lisatakse anuma ­
tesse vesikirbud. Iga uuritava kontsentratsiooni juures ja ka kontroll ­
katses tuleb kasutada vähemalt 20 looma, eelistatavalt jaotatuna 
neljaks viieloomaliseks rühmaks. Iga looma kohta peab olema vähe ­
malt 2 ml uuritavat lahust (st viie vesikirbu kohta peab katseanumas olema 10 ml lahust). Katse tegemisel võib kasutada poolstaatilist 
uuendamist või läbivoolusüsteemi, kui uuritava aine kontsentratsioon 
ei ole püsiv.
 
Lisaks uuritavate lahuste seeriatele tuleb kasutada ühte lahjendami ­
seks kasutatava vee kontrollseeriat ja vajaduse korral ühte kontroll ­
seeriat, mis sisaldab lahuse valmistamisel kasutatud abiainet.  
1.8.1.2.  Uuritavad kontsentratsioonid  
Kui uuritava aine toksilisuse kohta ei ole andmeid, võib lõpliku katse 
kontsentratsioonivahemiku kindlaksmääramiseks teha eelkatse. Selleks viiakse vesikirbud kokkupuutesse lahustega, mis sisaldavad uuritavat ainet suuresti erinevas kontsentratsioonis. Viit vesikirpu 
hoitakse uuritava aine teatava kontsentratsiooniga lahuses kuni 48 
tundi; korduskatseid ei ole vaja. Kokkupuuteaeg võib olla lühem (nt 24 tundi või vähem), kui vahemiku kindlaksmääramiseks vaja ­
likud andmed saadakse kiiremini.
 
Tuleb kasutada vähemalt viit uuritavat kontsentratsiooni. Need 
peavad olema geomeetrilises jadas, mille kordaja on eelistatavalt mitte üle 2.2. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, 
tuleb seda põhjendada. Kõige kõrgema uuritava kontsentratsiooni 
tulemuseks peaks eelistatavalt olema 100 %line liikumisvõime kaotus ja kõige madalamal uuritaval kontsentratsioonil ei peaks eelis ­
tatavalt olema jälgitavat toimet.
 
1.8.1.3.  Inkubatsioonitingimused  
Temperatuur peab olema vahemikus 18–22  o C ja iga üksiku katse 
puhul peaks see olema konstantne piirides ± 1  o C. Soovitatav on 
16tunnise valguse ja kaheksatunnise pimeduse tsükkel. Lubatud on ka täielik pimedus, eriti testitavate ainete puhul, mis on valguse käes ebastabiilsed.
 
Katseanumaid ei tohi katse ajal aereerida. Katse tehakse ilma pH-d 
muutmata. Vesikirpe ei tohi katse ajal toita.  
1.8.1.4.  Kestus  
Katse kestus on 48 tundi.  
1.8.2.  Vaatlused  
Igas katseanumas tuleb 24 ja 48 tundi pärast katse algust määrata 
liikumisvõime kaotanud vesikirpude arv (vt punkt 1.2 „Mõisted”). 
Lisaks liikumisvõime kaotusele tuleb registreerida kõik normist 
kõrvalekaldumised käitumises või välimuses.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Analüütilised mõõtmised  
Katse alguses ja lõpus mõõdetakse kontrollkatse(te)s ja kõige 
kõrgema uuritava aine kontsentratsiooniga lahuses lahustunud hapniku sisaldus ja pH. Lahustunud hapniku sisaldus kontrollkatsetes 
peab vastama määramise õigsuse kriteeriumile (vt punkt 1.6). pH ei 
tohiks tavaliselt muutuda üle 1,5 ühiku üheski katses. Temperatuuri mõõdetakse tavaliselt kontrollkatse anumates või ümbritsevas õhus ja see tuleb kirja panna eelistatavalt pidevalt katse käigus või äärmisel 
juhul vähemalt katse alguses ja lõpus.
 
Uuritava aine kontsentratsioon tuleb mõõta vähemalt kõige kõrgemal 
ja madalamal kontsentratsioonil katse alguses ja lõpus (viide 4). 
Tulemused peaksid soovitatavalt põhinema mõõdetud kontsentrat ­
sioonidel. Ent kui saab tõendada, et uuritava aine kontsentratsioon on katse jooksul rahuldavalt säilinud ± 20 % juures nominaalsest või mõõdetud algkontsentratsioonist, võivad katse tulemused põhineda 
nominaalsetel või mõõdetud algväärtustel.
 
1.9. PIIRSISALDUSKATSE  
Käesolevat meetodit kasutades võib teha piirsisalduskatse uuritava 
aine kontsentratsioonil 100 mg/l või katsekeskkonnas lahustuvuse 
piiril (olenevalt sellest, kumb neist on madalam) ja tõendada nii, et 
EC 50 on kõrgem kui see kontsentratsioon. Piirsisalduskatse tegemisel 
tuleb kasutada 20 vesikirpu (eelistatavalt jaotatuna neljaks viieloo ­
maliseks rühmaks) ja panna sama arv loomi ka kontrollkatse(te)sse. 
Kui kas või osagi vesikirpudest kaotab liikumisvõime, tuleb soori ­
tada täielik uuring. Iga kõrvalekalle normaalsest käitumisest tuleb registreerida.
 
2. ANDMED  
Andmed tuleb esitada kokkuvõtvas tabelis, näidates iga katse- ja 
kontrollrühma jaoks kasutatud vesikirpude arvu ja liikumisvõime 
kaotuse igal vaatlemisel. Koostatakse graafik 24 ja 48 tundi pärast liikumisvõime kaotanud vesikirpude protsendi sõltuvuse kohta uuri ­
tava aine kontsentratsiooni. Andmeid analüüsitakse sobivate statisti ­
liste meetoditega (nt probit-analüüs jne), et arvutada kõverate tõusud 
ja EC
 50 95 %lised usalduspiirid (p = 0,05) (7, 8).  
Kui saadud andmete puhul ei saa EC  50 arvutamise standardmeeto ­
deid rakendada, tuleb EC  50 umbkaudseks määramiseks kasutada 
kõige kõrgemat kontsentratsiooni, mis ei põhjusta liikumisvõime kaotust, ja kõige madalamat kontsentratsiooni, mis põhjustab liik ­
umisvõime kaotuse 100 % (selleks peetakse nende kahe kontsentrat ­
siooni geomeetrilist keskmist).
 
3. TULEMUSTE VORMISTAMINE  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuandes esitatakse järgmine teave.  
Uuritav aine:  
— füüsikaline laad ja olulised füüsikalis-keemilised omadused;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— andmed keemiliseks identifitseerimiseks, sealhulgas puhtus.  
Katseorganismi liik:  
— Daphnia  päritolu ja liik, algne tarnija (kui on teada) ja kasutatud 
kultuuri tingimused (kaasa arvatud toidu päritolu, tüüp ja kogus, toitmise sagedus).
 
Katsetingimused:  
— katseanumate kirjeldus: anumate tüüp, lahuse kogus, vesikirpude 
arv katseanuma kohta, katseanumate (korduskatsete) arv kontsen ­
tratsiooni kohta;  
— põhi- ja katselahuste valmistamise meetodid, kaasa arvatud mis 
tahes lahustite või dispersantide kasutamine, kasutatud kontsen ­
tratsioonid;  
— üksikasjad lahjendamiseks kasutatava vee kohta: vee päritolu ja 
kvaliteediomadused (pH, karedus, Ca/Mg suhe, Na/K suhe, aluselisus, juhtivus jne); taastatud vee koostis, kui seda kasutati;
 
— inkubatsioonitingimused: temperatuur, valguse intensiivsus ja 
valgustamise perioodid, lahustunud hapnik, pH jne.  
Tulemused:  
— kontrollkatsetes ja igas katserühmas mis tahes vaatlusajal liik ­
umisvõime kaotanud või kõrvalekaldeid (kaasa arvatud ebanor ­
maalne käitumine) ilmutanud vesikirpude arv ja protsent ning ilmnenud nähtuste kirjeldus;
 
— võimaluse korral võrdlusainega tehtud katse tulemused ja 
kuupäev;  
— nominaalsed uuritavad kontsentratsioonid ja kõik tulemused, mis 
saadi uuritava aine kontsentratsiooni määramisel katseanumas; samuti tuleb teatada määramismeetodi saagis ja määramispiir;
 
— kõigi katse ajal tehtud füüsikalis-keemiliste mõõtmiste tulemused: 
temperatuuri, pH ja lahustunud hapniku väärtused;  
— EC  50 48 tunni pärast koos usaldusintervallidega ja graafik sobi ­
tatud mudeli kohta, millest need arvutati, annuse ja toime kõve ­
rate tõusud ja nende standardviga; EC  50 kindlaksmääramiseks 
kasutatud statistiline meetod (kui määrati ka liikumisvõime 
kadu 24 tunni pärast, tuleb esitada ka need andmed);  
— selgitused iga kõrvalekalde kohta katse tegemise eeskirjast ja 
arutelu, kuivõrd see võis mõjutada katse tulemusi.  
4. VIITED  
1) ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, Crus ­
tacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 
23. Paris 2000.
 
5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  
Daphnia.
 
6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society 
for Testing and Materials. Pp 65-84
 
8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
1. liide  
LAHJENDAMISEKS KASUTATAVA VEE NÕUTAVAD KEEMILISED 
OMADUSED  
Aine Kontsentratsioon  
tahked osakesed < 20 mg/l 
orgaanilise süsiniku kogusisaldus < 2 mg/l 
ioniseerimata ammoniaak < 1 μg/l 
jääkkloor < 10 μg/l 
fosfororgaaniliste pestitsiidide kogusisaldus < 50 ng/l kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide 
kogusisaldus < 50 ng/l 
orgaanilise kloori kogusisaldus < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
2. liide  
SOBIVA TAASTATUD KATSEVEE NÄITED  
SO katsevesi (1)  
Põhilahused (üks aine) Taastatud vee valmistamiseks 
lisada järgmised põhilahuste 
kogused 1 liitrile veele (*) Aine 1 liitrile veele lisatav 
kogus (*)  
kaltsiumkloriid 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
magneesiumsulfaat 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
naatriumvesinikkarbonaat 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
kaaliumkloriid 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Sobiva puhtusastmega vesi, st puhastatud ioonvahetuse, destilleerimise või pöördos ­
moosiga; vee juhtivus ei ületa eelistatavalt 10 μS/cm  –1 . 
Elendti keskkonnad M7 ja M4  
Aklimatiseerimine Elendti keskkondadega M4 ja M7  
Mõnes laboris on olnud raskusi vesikirbu otsesel üleviimisel keskkondadesse M4 
ja M7. Teatavat edu on siiski saavutatud järkjärgulise aklimatiseerimisega, st viimisega oma keskkonnast 30 %lisse, siis 60 %lisse ja seejärel 100 %lisse Elendti keskkonda. Aklimatiseerumisperioodid võivad olla kuu aja pikkused.
 
Valmistamine  
Mikroelemendid  
Individuaalsete mikroelementide põhilahused (I) valmistatakse esmalt sobiva 
puhtusega vees, st deioniseeritud, destilleeritud või pöördosmoosiga puhastatud 
vees. Nendest põhilahustest (I) valmistatakse järgmine üks põhilahus (II), mis sisaldab kõiki mikroelemente (kombineeritud lahus), st:
 
I põhilahus(ed) (üks aine) Veele lisatav kogus 
(mg/l) Kontsentratsioon (kesk ­
kond M4-ga võrreldes) Kombineeritud II põhilahuse valmistamiseks 
lisada veele järgmine kogus I põhilahust (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000kordne 1,0 0,25 
MnCl  2 -4H  2 O 7 210 20 000kordne 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000kordne 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
I põhilahus(ed) (üks aine) Veele lisatav kogus 
(mg/l) Kontsentratsioon (kesk ­
kond M4-ga võrreldes) Kombineeritud II põhilahuse valmistamiseks 
lisada veele järgmine kogus I põhilahust (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000kordne 1,0 0,25 
SrCl  2 -6H  2 O 3 040 20 000kordne 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000kordne 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4- 2H 2 O 1 230 20 000kordne 1,0 0,25 
CuCl  2- 2H 2 O 335 20 000kordne 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000kordne 1,0 1,0 
CoCl  2- 6H 2 O 200 20 000kordne 1,0 1,0 
KI 65 20 000kordne 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000kordne 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000kordne 1,0 1,0 
Na 2 EDTA-2H  2 O 5 000 2 000kordne — — 
FeSO  4- 7H 2 O 1 991 2 000kordne — — 
Na 2 EDTA ja FeSO  4 lahused valmistatakse eraldi, valatakse kokku autoklaavitakse kohe 
Nii saadakse: 
2 l Fe-EDTA lahust 1 000kordne 20,0 5,0  
Keskkonnad M4 ja M7  
Keskkondade M4 ja M7 valmistamiseks kasutatakse II põhilahust, makrotoitai ­
neid ja vitamiine järgmiselt:  
Veele lisatav kogus 
(mg/l) Kontsentratsioon (kesk ­
kond M4-ga võrreldes) Keskkonnale lisatav II põhilahuse kogus (ml/1) 
M4 M7  
II põhilahus (kombineeritud 
mikroelemendid) 20kordne 50 50 
Makrotoitainete põhila ­
hused (üks aine) 
CaCl  2 – 2H  2 O 293 800 1 000kordne 1,0 1,0 
MgSO  4 – 7H  2 O 246 600 2 000kordne 0,5 0,5 
KCI 58 000 10 000kordne 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000kordne 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 – 9H  2 O 50 000 5 000kordne 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000kordne 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000kordne 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000kordne 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Veele lisatav kogus 
(mg/l) Kontsentratsioon (kesk ­
kond M4-ga võrreldes) Keskkonnale lisatav II põhilahuse kogus (ml/1) 
M4 M7  
Kombineeritud vitamiinide 
põhilahus — 10 000kordne 0,1 0,1 
Kombineeritud vitamiinide põhilahuse valmistamiseks lisatakse 3 vitamiini 1 liitrile veele järgmistes kogustes: 
tiamiinvesinikkloriid 750 10 000kordne 
tsüanokobalamiin (B  12 ) 10 10 000kordne 
biotiin 7,5 10 000kordne  
Kombineeritud vitamiinide põhilahust säilitatakse külmutatult väikeste alikvooti ­
dena. Vitamiinid lisatakse keskkonnale vahetult enne kasutamist.  
NB: Soolade sadenemise vältimiseks lisatakse täieliku keskkonna valmistamisel 
põhilahuste alikvoodid umbes 500–800 ml deioniseeritud veele ja seejärel 
täiendatakse veega kuni 1 liitrini.  
NB: Keskkonna M4 koostis avaldati esimest korda järgmises artiklis: Elendt, B. 
P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. MAGEVEEVETIKATE JA TSÜANOBAKTERITE KASVU 
PIDURDAMISE KATSE  
1. METOODIKA  
Käesolev metoodika on samaväärne standardiga OECD TG 201 
(2006) (1).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Metoodikaid on vaja teaduse arengut arvestades korrapäraselt läbi 
vaadata ja ajakohastada. Metoodika C.3 vajas läbivaatamist, et lisada 
täiendavaid liike ja viia see vastavusse ohu hindamise nõuetega ning 
kemikaalide klassifikatsiooniga. Läbivaatamisel võeti aluseks laial ­
dased praktilised kogemused, teaduse edusammud vetikatele toksi ­
liste ainete uurimisel ja asjaomaste õigusaktide laialdane rakenda ­
mine pärast esialgse metoodika kasutuselevõttu.  
1.2. MÕISTED  
Käesoleva metoodikaga seoses kasutatakse järgmisi mõisteid ja 
lühendeid.  
Biomass  on populatsiooni elusaine kuivmass teatava mahuühiku 
kohta, nt vetikate kuivmass milligrammides ühe liitri katselahuse 
kohta. Tavaliselt tähendab „biomass” lihtsalt massi, kuid käesoleva metoodika tähenduses on see mass mahuühiku kohta. Käesoleva meetodi kasutamisel mõõdetakse harilikult biomassi asendavaid 
näitajaid, nagu rakkude arv, fluorestsents jne; sellisel juhul mõiste ­
takse termini „biomass” all ka kõnesolevaid asendusnäitajaid.
 
Variatsioonikordaja  on suhteline (mõõtühikuta) näitaja, mis iseloo ­
mustab parameetri varieeruvust ja võrdub standardhälbe ja keskväär ­
tuse suhtega. Seda võib väljendada ka protsentides. Paralleelsete 
kontrollkultuuride kasvu keskmise erikiiruse keskmine variatsiooni ­
kordaja arvutatakse järgmiselt:  
1. ööpäevade ja/või lõikude kaupa leitud kasvukiiruste põhjal arvu ­
tatakse asjaomase paralleelkultuuri kasvu keskmise erikiiruse 
variatsioonikordaja protsentides;  
2. paralleelsete kontrollkultuuride ööpäevade/lõikude kaupa 
mõõdetud kasvu keskmise erikiiruse keskmise variatsioonikordaja 
leidmiseks arvutatakse 1. punkti kohaselt leitud väärtuste kesk ­
mine.  
EC x on katsekeskkonnas lahustatud uuritava aine kontsentratsioon, 
mille puhul katseorganismi kasv pidurdub x % (nt 50 %) võrra, kui 
see organism puutub ainega kokku kindlaksmääratud ajavahemiku 
jooksul (kui kokkupuuteaeg erineb täielikust ehk tavaliselt katsetes kasutatavast kokkupuuteajast, tuleb selle pikkus täpselt märkida). Kasvukiiruse järgi ja saagise järgi leitavate EC väärtuste eristamiseks 
kasutatakse vastavalt tähiseid E
 r C ja E  y C. 
Sööde  on täielik sünteetiline keskkond, milles katsevetikaid kasvata ­
takse uuritava ainega kokkupuutumise ajal. Tavaliselt lahustatakse uuritav aine katsekeskkonnas.
 
Kasvukiirus (keskmine kasvu erikiirus)  on biomassi logaritmiline 
suurenemine kokkupuute ajal.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon  on madalaim 
uuritud kontsentratsioon, mille puhul on näidatud, et teatava kokku ­
puuteaja jooksul pidurdab uuritav aine kontrolliga võrreldes statisti ­
liselt oluliselt (p < 0,05) katseorganismi kasvu. Kõik madalaimast avastatava mõjuga kontsentratsioonist kõrgemad kontsentratsioonid 
peavad avaldama sama tugevat või tugevamat kahjulikku mõju kui 
madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon. Kui neid kahte tingi ­
must ei ole võimalik täita, tuleb anda täielik selgitus, kuidas valiti madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon (ja avastatava mõjuta 
kontsentratsioon).
 
Avastatava mõjuta kontsentratsioon  on madalaimast avastatava 
mõjuga kontsentratsioonist allapoole järgmine uuritud kontsentrat ­
sioon.  
Kostemuutuja  on toksilisuse hindamiseks kasutatav muutuja, mis 
tuletatakse biomassi kajastavast mõõtemuutujast mitmesuguste arvu ­
tuste abil. Käesoleva metoodika tähenduses on kostemuutujateks kasvukiirus ja saagis, mis tuletatakse biomassi otsese mõõtmise 
andmetest või eespool mainitud asendusnäitajate mõõtmisest.
 
Kasvu erikiirus  on kostemuutuja, mis määratletakse jagatisena, 
mille lugejaks on uuritava parameetri (käesoleva metoodika puhul biomassi) väärtuste naturaallogaritmide vahe ja nimetajaks asjaomane ajavahemik.
 
Saagis  on kokkupuuteaja lõpus ja alguses leitud mõõdetava muutuja 
väärtuste vahe, mis väljendab katse jooksul toimunud biomassi 
kasvu.  
1.3. MEETODI RAKENDATAVUS  
Käesolevat meetodit on kõige lihtsam rakendada vees lahustuvate 
ainete puhul, mis katsetingimustes tõenäoliselt püsivad vesilahuses. 
Kui uuritav aine on lenduv, seostub tugevasti pindadega, on värviline või vees vähelahustuv või võib mõjutada söötme toit- või mineraa ­
lainete kättesaadavust, siis võib kirjeldatud määramismeetodis olla 
vaja teha teatavaid muudatusi (nt kasutada suletud süsteemi, valmis ­
tada katsenõusid eelnevalt spetsiaalselt ette). Juhendid teatavate vaja ­
like muudatuste tegemiseks on esitatud standardites (2, 3, 4).
 
1.4. KATSE PÕHIMÕTE  
Katse eesmärk on määrata uuritava aine mõju magevee-mikrovetikate 
ja/või tsüanobakterite kasvule. Portskultuuris lastakse eksponent ­
siaalse kasvu faasis olevatel katseorganismidel uuritava ainega 
kokku puutuda tavaliselt 72 tunni jooksul. Vaatamata suhteliselt lühi ­
kesele katseajale võimaldab see hinnata, millist mõju avaldab uuri ­
tava ainega kokkupuutumine mitme põlvkonna vältel.  
Katsesüsteemi koste on vetikakultuuri seeriate (katseüksused) kasvu 
pidurdumine kokkupuutumisel uuritava aine mitmesuguste kontsen ­
tratsioonidega. Katsesüsteemi koste hindamiseks uuritakse kasvu 
sõltuvust aine kontsentratsioonist ja võrreldakse seda keskmise 
kasvuga paralleelsetes kontrollkultuurides, kuhu uuritavat ainet ei ole lisatud. Et süsteemi koste toksilisele mõjule täielikult avalduks (optimaalne tundlikkus), lastakse kultuuridel küllaldase aja jooksul 
piiramatult eksponentsiaalselt kasvada piisava toitainete sisalduse ja 
pideva valguse tingimustes, et mõõta kasvu erikiiruse vähenemist.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Kasvu ja kasvu pidurdamise kvantitatiivseks iseloomustamiseks 
mõõdetakse vetikate biomassi sõltuvust ajast. Vetikate biomass on 
määratletud kuivmassina ruumala kohta, nt milligrammides ühe liitri katselahuse kohta. Kuna kuivmassi on raske mõõta, kasutatakse asendusparameetreid. Asendusparameetritest kasutatakse kõige 
rohkem rakkude arvu. Asendusparameetriteks võivad olla veel 
rakkude maht, fluorestsents, optiline tihedus jne. On vaja teada kordajat, mille abil saab mõõdetava asendusparameetri arvutada ümber biomassiks.
 
Katsetulem on kasvu pidurdumine, kusjuures kasvu väljendatakse 
biomassi logaritmi suurenemisena kokkupuuteaja jooksul (keskmine kasvu erikiirus). Katselahuste seerias määratud keskmistest kasvu 
erikiirustest leitakse kontsentratsioon, mis vähendab kasvukiirust 
teatava protsendimäära x võrra (näiteks 50 %); selle kontsentrat ­
siooni tähis on E
 r C x (nt E  r C 50 ). 
Kui käesolevat meetodit rakendatakse ELi õigusraamistikus, peaksid 
tulemuste arvutused punktis 2.2 kirjeldatud põhjusi arvestades põhi ­
nema kasvu keskmisel erikiirusel. Lisaks kasutatakse käesoleva 
meetodi korral kostemuutujana veel saagist, mida võib vaja olla 
teatavates riikides kehtestatud erieeskirjade täitmiseks. Saagis on määratletud kokkupuuteaja lõpus ja alguses olevate biomasside vahena. Katselahuste seerias määratud saagiste põhjal leitakse kont ­
sentratsioon, mis vähendab saagist teatava protsendimäära x võrra 
(näiteks 50 %); selle tähis on E
 y C x (nt E  y C 50 ). 
Lisaks sellele võib statistiliselt määrata madalaima avastatava mõjuga 
kontsentratsiooni ja ka avastatava mõjuta kontsentratsiooni.  
1.5. ANDMED UURITAVA AINE KOHTA  
Katsetingimuste kindlaksmääramiseks võib uuritava aine kohta olla 
vaja teada järgmisi andmeid: struktuurivalem, puhtusaste, püsivus 
valguse käes, püsivus katsetingimustes, valguse neeldumisega seotud omadused, pKa ja andmed aine muundumiste kohta, sealhulgas biolagunduvus vees.
 
On vaja teada uuritava aine lahustuvust vees, jaotuskoefitsienti okta ­
nooli-vee süsteemis (P  ow ) ja aururõhku; katselahuses oleva aine kont ­
sentratsiooni mõõtmiseks peaks olema valideeritud meetod, mille 
kohta oleksid teada tulemuslikkus ja määramispiir.  
1.6. STANDARDAINE  
Katse teostuse kontrollimiseks võib kasutada rahvusvahelistes võrd ­
luskatsetes (4) kasutatavaid standardaineid, näiteks 3,5-diklorofe ­
nooli. Rohevetikate puhul võib standardainena kasutada ka kaalium ­
dikromaati. Kontrolli standardainega soovitatakse teha vähemalt kaks korda aastas.
 
1.7. KATSE VASTAVUS NÕUETELE  
Katse on läbi viidud nõuetekohaselt, kui on täidetud järgmised 
kriteeriumid.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Kontrollkultuuri biomass peab 72-tunnise katseaja jooksul olema 
eksponentsiaalselt suurenenud vähemalt 16 korda. See vastab 
kasvu erikiirusele 0,92 ööpäev  –1 . Kõige sagedamini kasutatavate 
liikide puhul on kasvukiirus tavaliselt palju suurem (vt 1. liide). See kriteerium ei pea olema täidetud, kui kasutatakse 1. liites 
loetletud liikidest aeglasemalt kasvavaid liike. Sellisel juhul 
tuleb katseaega pikendada, nii et kontrollkultuuri biomass kasvaks vähemalt 16-kordseks, kusjuures kasv peab kogu katse ajal olema eksponentsiaalne. Kui piiramatu eksponentsiaalse 
kasvu tingimustes saavutatakse biomassi nõutav 16-kordne kasv 
lühema ajaga, võib katseaega lühendada 48 tunnini.
 
— Lõikude kaupa (72-tunnise katse puhul katsepäevad 0–1, 1–2 ja 
2–3) leitud kontrollkultuuride kasvu erikiiruste keskmine variat ­
sioonikordaja (vt punkt 1.2, variatsioonikordaja) ei tohi ületada 
35 %. Kontrollkultuuride kasvu erikiiruste lõikude kaupa arvuta ­
mise kohta vt punkt 2.2.1, teine lõik. Seda kriteeriumi rakenda ­
takse paralleelsete kontrollkultuuride puhul arvutatud variatsioo ­
nikordaja keskmise väärtuse suhtes.  
— Katsetes  Pseudokirchneriella subcapitata  ja Desmodesmus subs ­
picatus ’ega ei tohi paralleelsete kontrollkultuuride keskmiste 
kasvu erikiiruste variatsioonikordaja kogu katseaja jooksul 
ületada 7 %. Harvemini kasutatavate liikide korral ei tohi see 
väärtus ületada 10 %.  
1.8. MEETODI KIRJELDUS  
1.8.1.  Seadmed  
Katselahusega kokku puutuvad katsenõud ja muud seadmed peavad 
olema tervenisti klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. 
Seadmed peavad olema hoolikalt pestud, et orgaanilised või anorgaa ­
nilised lisandid ei mõjutaks vetikate kasvu või katselahuse koostist.  
Katse viiakse tavaliselt läbi klaaskolvis, mis on piisavalt suur, et 
katse ajal saaks mõõtmisteks võtta küllaldases mahus kultuuri, ja 
oleks tagatud piisav CO  2 massiülekanne atmosfäärist (vt punkt 
1.8.9, teine lõik). Tuleb silmas pidada, et vedeliku maht oleks küllal ­
dane analüüside tegemiseks (vt punkt 1.8.11, viies lõik).  
Lisaks sellele võib vaja minna järgmisi seadmeid.  
— Kultiveerimisseade: soovitatav on kasutada kappi või kambrit, 
milles inkubatsioonitemperatuuri hoitakse täpsusega ± 2 °C.  
— Fotomeetrid: on oluline silmas pidada, et valgustatuse mõõtmise 
meetod ja eriti vastuvõtja (kollektori) tüüp mõjutavad mõõdetavat 
väärtust. Mõõtmiseks kasutatakse eelistatavalt sfäärilist (4 π) 
vastuvõtjat (reageerib igast suunast, nii ülalt- kui ka altpoolt mõõtetasapinda saabuvale otsesele ja peegeldunud valgusele) 
või poolsfäärilist (2 π) vastuvõtjat (reageerib igast suunast ülalt ­
poolt mõõtetasapinda saabuvale valgusele).
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Seade vetikate biomassi määramiseks. Rakkude arvu, mis on 
kõige sagedamini kasutatav vetikate biomassi asendusparameeter, 
võib määrata elektroonilise osakesteloenduri, loenduskambriga varustatud mikroskoobi või läbivoolutsütomeetri abil. Muid biomassi asendusparameetreid võib mõõta läbivoolutsütomeetri, 
fluorimeetri, spektrofotomeetri või kolorimeetri abil. On kasulik 
arvutada ümberarvutustegur üleminekuks rakkude arvult kuiv ­
massile. Kui madalatel biomassi kontsentratsioonidel kasutatakse spektrofotomeetrit, võib kasutuskõlblike mõõtmistulemuste 
saamiseks olla vaja küvette, mille optilise tee pikkus on 
vähemalt 4 cm.
 
1.8.2.  Katseorganismid  
Võib kasutada mitmeid vabalt ujuvate mikrovetikate ja tsüanobakte ­
rite liike. On näidatud, et käesolevas metoodikas esitatud määramis ­
meetodi korral sobivad kasutamiseks 1. liites loetletud tüved.  
Kui kasutatakse muid liike, tuleb märkida kasutatud tüvi ja/või selle 
päritolu. Tuleb tõendada, et valitud katsevetikate kasv on kasutata ­
vates tingimustes kogu katseaja kestel eksponentsiaalne.  
1.8.3.  Sööde  
Soovitatakse kasutada kas OECD või AAP söödet. Nende söötmete 
koostis on esitatud 2. liites. Tuleb silmas pidada, et nende söötmete pH algväärtused ja puhvermahtuvused (viimane kompenseerib pH tõusu) on erinevad. Seetõttu võivad katse tulemused sõltuda kasu ­
tatud söötmest, eriti kui uuritakse ioniseeruva aine mõju.
 
Teatavatel juhtudel, näiteks metallide ja kelaaditekitajate uurimise 
korral või katsetel erineva pH väärtuse juures, võib olla vaja söödet muuta. Muudetud söötme kasutamist tuleb üksikasjalikult kirjeldada 
ja põhjendada (3, 4).
 
1.8.4.  Biomassi algkontsentratsioon  
Biomassi algkontsentratsioon peab kõigis uuritava ainega kultuurides 
olema sama ja piisavalt madal, et kasv püsiks kogu inkubatsiooniaja kestel eksponentsiaalne ja ei tekiks toitainete ammendumise ohtu. 
Biomassi kuivaine algkontsentratsioon ei tohi olla kõrgem kui 
0,5 mg/l. Soovitatakse kasutada järgmisi rakkude algkontsentrat ­
sioone:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 × 10
 3 –10  4 rakku/ml  
Desmodesmus subspicatus  2–5 × 10  3 rakku/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 rakku/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 rakku/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 –10  5 rakku/ml  
1.8.5.  Uuritava aine kontsentratsioon  
Kontsentratsioonivahemiku, milles mõju tõenäoliselt avaldub, võib 
määrata mõjuvahemiku hindamise katsete tulemuste alusel. Lõpliku 
katse tegemisel kasutatakse vähemalt viit geomeetrilise jadana järjes ­
tatud kontsentratsiooni, kus jadategur ei ole suurem kui 3,2. Laugema kontsentratsiooni-mõju kõvera korral võib olla õigustatud suurema jadateguri kasutamine. Eelistatavalt peaks kontsentratsioonide jada 
hõlmama vahemiku, milles vetikate kasvukiirus pidurdub 5–75 % 
võrra.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Paralleel- ja kontrollkultuurid  
Katseplaanis tuleb ette näha kolm paralleelkultuuri iga uuritava kont ­
sentratsiooni kohta. Kui avastatava mõjuta kontsentratsiooni määra ­
mist ei nõuta, võib katseplaani muuta selliselt, et suurendatakse uuri ­
tavate kontsentratsioonide arvu ja vähendatakse paralleelkultuuride 
arvu ühe kontsentratsiooni kohta. Paralleelseid kontrollkultuure peab olema vähemalt kolm ja parimal juhul võiks neid olla kaks korda rohkem kui iga uuritava kontsentratsiooni puhul kasutatavaid 
paralleelkultuure.
 
Uuritava aine kontsentratsioonide määramiseks võib valmistada 
eraldi katselahuste seeria (vt punkt 1.8.11, neljas ja kuues lõik).  
Kui uuritava aine lahustamiseks kasutatakse lahustit, tuleb katse ­
plaanis ette näha täiendavad kontrollkultuurid, millele on lisatud lahustit samas kontsentratsioonis kui uuritava ainega kultuuridele.
 
1.8.7.  Inokulum-kultuuri valmistamine  
Harjutamaks katsevetikaid katsetingimustega ja tagamaks, et katsela ­
huse inokuleerimisel on vetikad eksponentsiaalse kasvu faasis, 
valmistatakse katsekeskkonnas 2–4 päeva enne katse algust 
inokulum-kultuur. Vetikate biomass reguleeritakse nii, et inokulum- kultuuris oleks enne katse algust ülekaalus eksponentsiaalne kasv. Inokulum-kultuuri inkubeeritakse samades tingimustes kui uuritava 
ainega kultuure. Veendumaks, et katsetüvi kasvab kultiveerimistingi ­
mustes normaalselt, mõõdetakse inokulum-kultuuris biomassi juurde ­
kasvu. 3. liites on esitatud ühe vetikate kultiveerimise katse näide. Rakkude sünkroonse pooldumise vältimiseks katse ajal võib olla 
vajalik inokulum-kultuuri teistkordne ülekandmise etapp.
 
1.8.8.  Katselahuste valmistamine  
Kõigis katselahustes peab söötme kontsentratsioon ja katsevetikate 
biomassi algkontsentratsioon olema ühesugune. Valitud kontsentrat ­
siooniga katselahuste valmistamiseks segatakse tavaliselt uuritava aine põhilahus söötme ja inokulum-kultuuriga. Põhilahuse saamiseks lahustatakse uuritav aine tavaliselt söötmes.
 
Vees raskesti lahustuvate ainete lisamiseks söötmele võib kasutada 
lahusteid, näiteks atsetooni,  t-butüülalkoholi või dimetüülformamiidi 
(2, 3). Lahusti kontsentratsioon ei tohi olla kõrgem kui 100 μl/l ja 
peab olema sama kõigis katseseeria kultuurides, kaasa arvatud kont ­
rollkultuurid.  
1.8.9.  Inkubeerimine  
Katsenõud suletakse õhku läbi laskvate korkidega. Nõusid loksuta ­
takse ja need asetatakse kultiveerimisseadmesse. Katse ajal on veti ­
kaid vaja hoida suspensioonis ja soodustada CO  2 transporti. Selleks 
loksutatakse või segatakse kultuure pidevalt. Kultuure termostateeri ­
takse temperatuurivahemikus 21–24 °C täpsusega ± 2 °C. Kui kasu ­
tatakse 1. liites loetlemata liike (nt troopilised liigid), võib olla vaja valida kõrgem temperatuur, kuid nõuetele vastavuse kriteeriumid 
peavad olema täidetud. On soovitav paigutada kolvid inkubaatoris 
juhuslikult ja muuta iga päev nende paigutust.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
Katse ajal ei tohi kontrollkeskkonna pH tõusta enam kui 1,5 ühiku 
võrra. Kui uuritakse metalle või ühendeid, mis katsekeskkonna pH 
väärtustel on osaliselt ioniseeritud, võib reprodutseeritavate ja selgete tulemuste saamiseks olla vaja piirata pH muutumist. Tehniliselt on võimalik saavutada, et pH muutuks vähem kui 0,5 ühikut, kui 
tagada, näiteks loksutamiskiiruse suurendamisega, piisavalt kiire 
CO
 2 ülekanne atmosfääriõhust katselahusesse. Teine võimalus on 
vähendada CO  2 tarvet, vähendades algset biomassi või katse kestust.  
Pinnale, millel inkubeeritakse kultuure, suunatakse pidev ühtlane 
külmvalge või päevavalgusspektriga fluorestsentsvalgus. Vetikate ja 
tsüanobakterite tüvede valgusetarve on erinev. Valguse intensiivsus 
valitakse vastavalt kasutatava katseorganismi vajadusele. Soovitatud rohevetikaliikide puhul valitakse valguse intensiivsuseks katselahuste tasapinnal 60–120 μEm
 –2 s –1 , mõõdetuna sobiva anduri abil fotosün ­
teesiks sobivas lainepikkuse vahemikus 400–700 nm. Mõni liik, eriti  
Anabaena flos-aquae , kasvab hästi nõrgema valguse juures ja liigne 
valgus võib teda kahjustada. Sellise liigi puhul valitakse keskmiseks valguse intensiivsuseks 40–60 μEm
 –2 s –1 . (Luksides kalibreeritud 
fotomeetri puhul vastab külmvalge valguse soovitatud valgustatuse 
vahemikule 60–120 μEm –2 s –1 vahemik 4 440 – 8 880 luksi). Valguse 
intensiivsus inkubatsiooniala eri osades ei tohi keskmisest väärtusest erineda üle 15 %.
 
1.8.10.  Katse kestus  
Katse kestab harilikult 72 tundi. Võib siiski kasutada ka lühema või 
pikema kestusega katseid tingimusel, et kõiki nõuetele vastavuse kriteeriume (vt punkt 1.7) on võimalik täita.
 
1.8.11.  Mõõtmised ja analüütilised määramised  
Katse ajal määratakse vetikate biomassi igas kolvis vähemalt üks 
kord ööpäevas. Kui mõõtmiseks kasutatakse katselahusest pipetiga 
võetud väikesi proove, ei panda neid enam katselahusesse tagasi.  
Biomassi mõõdetakse kas mikroskoobi abil rakkude silmaga loenda ­
misega või elektroonilise osakeste loenduriga (määratakse rakkude arv ja/või biomaht). Võib kasutada ka alternatiivmeetodeid, nt läbi ­
voolutsütomeetriat, klorofülli fluorestsentsi  in vitro  või in vivo  (6, 7) 
või optilist tihedust, kui saab näidata, et katses esinevas biomassi 
vahemikus on asjaomaste parameetrite ja biomassi vahel rahuldav korrelatsioon.
 
Lahuste pH mõõdetakse katse alguses ja lõpus.  
Kui uuritavat ainet on kasutatavas kontsentratsioonivahemikus 
võimalik määrata, siis kontrollitakse aine algkontsentratsiooni katse ­
lahuses ja kontsentratsiooni püsivust katse ajal.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Kui kontsentratsiooni muutus katse ajal on tõenäoliselt alla 20 % 
nominaalväärtusest, siis piisab uuritava aine kontsentratsiooni määra ­
misest katse alguses ja lõpus ühel madalal ja ühel kõrgel väärtusel ja eeldatava EC
 50 läheduses. Kui kontsentratsioon tõenäoliselt ei püsi 
vahemikus 80–120 % nominaalväärtusest, siis soovitatakse kõigi 
uuritavate kontsentratsioonide määramist katse alguses ja lõpus. 
Kui uuritav aine on lenduv, ebapüsiv või adsorbeerub pindadele, soovitatakse katse ajal võtta iga 24 tunni tagant määramiseks lisa ­
proove, et paremini jälgida uuritava aine kadu. Selliste ainete puhul 
on vaja täiendavaid paralleelkultuure. Igal juhul on uuritava aine 
kontsentratsioone igal uuritaval väärtusel vaja määrata ainult ühes paralleelkultuuri nõus (või ühes paralleelkultuuridest kokku segatud proovis).
 
Söötmeid, mis valmistatakse spetsiaalselt kokkupuutekontsentrat ­
siooni määramiseks, käideldakse täpselt samuti kui katses kasutata ­
vaid söötmeid, st need inokuleeritakse vetikatega ja neid inkubeeri ­
takse samades tingimustes. Uuritava aine kontsentratsiooni määrami ­
seks lahuses võib olla vaja vetikate eraldamist kasvukeskkonnast. 
Eraldamiseks kasutatakse eelistatavalt tsentrifuugimist madalal, kuid vetikate sadestamiseks piisaval kiirendusel.
 
Kui saab tõendada, et uuritava aine kontsentratsioon püsib katse ajal 
nominaalse või mõõdetud algväärtuse läheduses täpsusega ± 20 %, 
võib tulemuste analüüsil kasutada nominaalset või mõõdetud algväär ­
tust. Kui kõrvalekalle nominaalsest või mõõdetud algväärtusest on suurem kui ± 20 %, kasutatakse tulemuste analüüsil katse geomee ­
trilist keskmist kontsentratsiooni või uuritava aine kontsentratsiooni 
muutumist kajastavaid mudeleid (3, 8).
 
Vetikate kasvu pidurdamise katse on dünaamilisem kui enamik muid 
veeorganismidele mürgise toime määramise kiirkatseid. Sellepärast 
võib olla raske kindlaks teha tegelikku kokkupuutekontsentratsiooni, 
eriti kui uuritakse adsorbeeruvat ainet madalal kontsentratsioonil. Uuritava aine kadumine lahusest adsorbeerumise tõttu kasvavale vetikate biomassile ei tähenda sel juhul, et aine on katsesüsteemist 
kadunud. Katsetulemuste analüüsimisel tuleb kontrollida, kas uuri ­
tava aine kontsentratsiooni vähenemisega katse ajal kaasneb kasvu pidurdumise vähenemine. Kui kasvu pidurdumine väheneb, võib kaaluda uuritava aine kontsentratsiooni vähenemist kajastava sobiva 
mudeli rakendamist (8). Kui kasvu pidurdamine ei vähene, võib olla 
sobiv kasutada tulemuste analüüsil nominaalset või mõõdetud algkontsentratsiooni.
 
1.8.12.  Muud tähelepanekud  
Inokulum-kultuuri vaadeldakse mikroskoobiga veendumaks, et 
kultuur on normaalse ja terve välimusega, ning katse lõpus uuritakse 
kultuuri mikroskoobiga, et avastada vetikate morfoloogilisi muutusi 
(mis võivad olla põhjustatud kokkupuutumisest uuritava ainega).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Piirsisalduskatse  
Teatavatel asjaoludel, näiteks kui eelkatse näitab, et kontsentrat ­
sioonil kuni 100 mg·l  –1 või katsekeskkonnas lahustuvuse piirkont ­
sentratsioonil (olenevalt sellest, kumb on madalam), ei avalda uuritav 
aine toksilist mõju, võib teha piirsisalduskatse, milles võrreldakse 
kontrollrühmas ja ühes katserühmas (kontsentratsioonil 100 mg·l  –1 
või lahustuvuse piirkontsentratsioonil) avalduvat mõju. Piirsisaldus ­
katse tegemisel soovitatakse kindlasti määrata ka kokkupuutekont ­
sentratsioon. Kõik eespool kirjeldatud katsetingimused ja nõuetele 
vastavuse kriteeriumid on rakendatavad ka piirsisalduskatse puhul, ent uuritava ainega tuleb teha vähemalt kuus paralleelkatset. Kont ­
roll- ja katserühma kostemuutujate analüüsil võib keskväärtusi 
võrrelda statistilise kriteeriumi (nt Studenti t-kriteerium) abil. Kui kahe rühma dispersioonid erinevad, kasutatakse mittevõrdsete disper ­
sioonide juhtumile kohandatud t-kriteeriumi.
 
1.8.14.  Muudatus intensiivse värvusega ainete määramise puhul  
Valgustatus (valguse intensiivsus) peaks olema käesolevas katsemee ­
todis ette nähtud vahemiku ülemises otsas: 120 μEm –2 s –1 või 
suurem.  
Optilise tee pikkust tuleks lühendada katselahuste ruumala vähenda ­
misega (vahemikus 5–25 ml).  
Tuleks tagada piisav segamine (näiteks mõõduka loksutamisega), et 
vetikad võimalikult sageli satuksid hea valgustatuse tingimustesse kasvukeskkonna pinnal.
 
2. KATSEANDMED  
2.1. KASVUKÕVERATE EHITAMINE  
Katsenõus olevat biomassi võib väljendada mõõtmisel kasutatud 
asendusparameetri (nt rakkude arvu, fluorestsentsi) ühikutes.  
Katse- ja kontrollkultuurides määratud biomassi ning uuritava mater ­
jali kontsentratsioonid, mis registreeritakse vähemalt iga täistunni 
möödumisel, ja mõõtmise ajad kantakse tabelisse ja nende andmete 
põhjal ehitatakse graafik. Sel esimesel etapil võib olla vaja nii loga ­
ritmilist kui ka lineaarset skaalat, kuid logaritmiline skaala on kohus ­
tuslik ja üldiselt saab katse ajal esinevaid kasvulaadi muutusi selles 
paremini esitada. Logaritmilises skaalas saadakse eksponentsiaalse 
kasvu puhul sirge, mille tõus näitab kasvu erikiirust.  
Kasvugraafikute abil kontrollitakse, kas kontrollkultuuride kasv on 
kogu katse jooksul eksponentsiaalne ja toimub eeldatud kiirusega. 
Iga andmepunkti ja graafikute kuju hinnatakse kriitiliselt veendu ­
maks, et originaalandmetes ei ole vigu ja katse on läbi viidud korrektselt. Eriti kontrollitakse andmepunkte, mille kõrvalekaldu ­
mises võib kahtlustada süstemaatilist viga. Kui katse läbiviimises 
saab tuvastada vea või selle olemasolu võib pidada väga tõenäoli ­
seks, siis tähistatakse asjaomane punkt võõrväärtusena ja seda punkti ei arvestata hiljem statistilisel analüüsil. (Näiteks võib vetikate null ­
kontsentratsioon ühes kahest või kolmest paralleelnõust osutada 
sellele, et nõu ei inokuleeritud õigesti või see oli halvasti puhas ­
tatud.) Põhjused, miks teatavat andmepunkti käsitleti võõrväärtusena ja ei arvestatud, tuleb katseprotokollis selgesti esitada. Lubatavaks põhjuseks peetakse ainult (harva esinevaid) vigu katse läbiviimises, 
mitte aga vähest täpsust. Kõnesoleva küsimuse puhul saab statistilisi 
meetodeid võõrväärtuste kindlakstegemiseks kasutada üksnes piira ­
tult ja need ei asenda eksperdihinnangut. Edasisel katseandmete esitamisel graafiku või tabelina on soovitav esitada koos muude 
punktidega ka võõrväärtustele vastavad (ja sellisena tähistatud) 
punktid.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. KOSTEMUUTUJAD  
Kõnesoleva katse eesmärk on määrata uuritava aine mõju vetikate 
kasvule. Kuna liikmesriikide eelistused ja reguleerimisvajadused on erinevad, käsitletakse käesolevas metoodikas kahte kostemuutujat. Et katsetulemused oleksid vastuvõetavad kõikides liikmesriikides, tuleb 
uuritava mõju hindamisel kasutada mõlemat järgnevalt kirjeldatud 
kostemuutujat (a ja b).
 
a) Keskmine kasvu erikiirus: see kostemuutuja arvutatakse katse ajal 
toimunud biomassi juurdekasvu logaritmi alusel ja väljendatakse ühe ööpäeva kohta.
 
b) Saagis: see kostemuutuja on biomasside vahe katse lõpus ja 
alguses.  
Kui käesolevat meetodit rakendatakse ELi õigusraamistikus, peaksid 
tulemuste arvutused tagapool kirjeldatud põhjusi arvestades põhi ­
nema kasvu keskmisel erikiirusel. Tuleb märkida, et nende kahe 
kostemuutuja abil arvutatud toksilisuse väärtused ei ole võrreldavad ning seda erinevust tuleb katsetulemuste kasutamisel arvestada. Kui järgitakse käesoleva metoodika tingimusi, on asjaomaste lähenemis ­
viiside matemaatilise aluse eripära tõttu keskmisel kasvu erikiirusel 
põhinevad EC
 x väärtused (E  r C x ) üldiselt suuremad kui saagise alusel 
saadud tulemused (E  y C x ). See erinevus ei ole tõlgendatav kahe 
kostemuutuja tundlikkuse erinevusena; asjaomased väärtused on liht ­
salt matemaatiliselt erinevad. Keskmise kasvu erikiiruse mõiste 
põhineb vetikate üldisel eksponentsiaalsel kasvul piiramata kultuuris, kusjuures toksilisus määratakse kasvukiirusele avaldatava mõju alusel; see ei sõltu kontrollkultuuri kasvu erikiiruse tegelikust väär ­
tusest, kontsentratsiooni-mõju sõltuvuse suurenemisest või katse 
kestusest. Kui kostemuutujaks on saagis, siis sõltuvad tulemused aga kõikidest mainitud kõrvalmuutujatest. E
 y C x sõltub igas katses 
kasutatud vetikaliigi kasvu erikiirusest ja maksimaalsest kasvu erikii ­
rusest, mis võib eri vetikaliikidel ja isegi ühe liigi eri tüvedel olla 
erinev. Seda kostemuutujat ei tohi kasutada, kui võrreldakse vetika ­
liikide või -tüvede tundlikkust toksiliste ainete suhtes. Kuigi kasvu erikiiruse kasutamine toksilisuse määramiseks on teaduslikult pare ­
mini põhjendatud, vaadeldakse käesolevas metoodikas toksilisuse 
määramist ka saagise põhjal, et võtta arvesse teatavate liikmesriikide praegusi nõudeid.
 
2.2.1.  Keskmine kasvukiirus  
Nii kontrollkultuuride kui uuritava ainega kultuuride puhul arvuta ­
takse teatava ajavahemiku keskmine kasvu erikiirus nõus biomassi 
suurenemise logaritmist järgmise valemi abil:  
μ iÄj ¼ lnX j – lnX i 
t j – t i (ööpäev  –1 ) 
kus: 
μ i–j on keskmine kasvu erikiirus ajavahemikul  i–j; 
X i on biomass ajahetkel  i; 
X j on biomass ajahetkel  j. ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Iga katse- ja kontrollrühma puhul arvutatakse kasvukiiruse keskmine 
väärtus ja selle dispersiooni hinnang.  
Arvutatakse kogu katse (tavaliselt päevad 0–3) keskmine kasvu 
erikiirus, võttes aluseks inokuleerimiseks kasutatud nominaalse 
biomassi väärtuse, mitte biomassi mõõdetud algväärtuse, sest harili ­
kult saadakse nii täpsem tulemus. Kui biomassi mõõtmise seade (nt läbivoolutsütomeeter) võimaldab määrata inokulumi biomassi piisa ­
valt täpselt, võib lähtuda siiski biomassi mõõdetud algkontsentrat ­
sioonist. Kasvukiirusi hinnatakse ka lõikude kaupa, need väärtused 
arvutatakse iga ööpäeva kohta (katsepäevad 0–1, 1–2 ja 2–3) ja kontrollitakse, kas kontrollkultuuri kasvukiirus püsib muutumatuna (vt punkt 1.7, nõuetele vastavuse kriteerium). Kui esimesel katse ­
päeval leitakse üldisest keskmisest väärtusest oluliselt väiksem 
kasvu erikiirus, võib see osutada ootefaasi esinemisele. Kontrollkul ­
tuuri ootefaasi võib minimeerida või praktiliselt kõrvaldada eelkul ­
tuuri õige paljundamisega; uuritava ainega kultuuri puhul võib oote ­
faasi olemasolu osutada taastumisele esialgsest toksilise aine põhjus ­
tatud stressist või uuritava aine sisalduse vähenemisele seoses aine kaoga pärast kokkupuudet (ka sorptsiooni tõttu vetikate biomassil). Sellepärast võib kasvukiiruse lõikude kaupa hindamist kasutada ka 
selleks, et määrata uuritava aine mõju kokkupuuteaja jooksul. 
Lõikude kaupa leitud kasvukiiruste ja keskmise kasvukiiruse olulised erinevused osutavad kõrvalekaldumisele pidevast eksponentsiaalsest kasvust; sel juhul on kasvukõveraid vaja üksikasjalikult uurida.
 
Iga uuritavat ainet sisaldava paralleelkultuuri puhul arvutatakse 
kasvukiiruse pidurdumise protsent järgmise valemi abil:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
kus: 
%I r on keskmise kasvu erikiiruse pidurdumise määr protsentides;  
μ C on keskmise kasvu erikiiruse ( μ) keskväärtus kontrollrühmas;  
μ T on asjaomase uuritava ainega kultuuri keskmine kasvu erikiirus.  
Kui katselahuste valmistamiseks kasutatakse lahusteid, tuleb pidur ­
dumise määra arvutamisel kasutada lahustit sisaldavaid kontrollkul ­
tuure, mitte lahustivabasid kontrollkultuure.  
2.2.2.  Saagis  
Iga kontrollkultuuri või uuritava ainega kultuuri puhul arvutatakse 
saagis, lahutades biomassist katse lõpus biomassi katse alguses. Iga 
uuritava kontsentratsiooni ja kontrollkultuuri jaoks arvutatakse kesk ­
mine saagis ning selle dispersiooni hinnang. Saagise vähenemine protsentides (%I
 y ) arvutatakse iga uuritava ainega paralleelkultuuri 
puhul järgmiselt:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
kus: 
%I y on saagise vähenemine protsentides;  
Y C on kontrollrühma keskmine saagis;  
Y T on asjaomase uuritava ainega kultuuri saagis.  
2.3. KONTSENTRATSIOONI-MÕJU KÕVERA EHITAMINE  
Andmed kantakse graafikule koordinaadistikus, mis näitab protsen ­
tides väljendatud pidurdumismäära sõltuvust uuritava aine kontsen ­
tratsiooni logaritmist; graafikut uuritakse üksikasjalikult, jättes 
kõrvale kõik esimesel etapil kõrvale jäetud punktid. Läbi punktide ehitatakse käsitsi või arvutiinterpolatsiooni abil sujuv kõver, mis annab esmapildi kontsentratsiooni-mõju seosest; seejärel rakenda ­
takse üksikasjalikumat lähenemisviisi, eelistatavalt mõnda arvutista ­
tistilist meetodit. Olenevalt andmete edasisest kasutamisest, kvalitee ­
dist (täpsusest) ja hulgast ning andmete analüüsivahendite kättesaa ­
davusest, võidakse andmete analüüsimine sellega lõpetada (teatavatel 
juhtudel on see õigustatud) ning lihtsalt lugeda peamised väärtused 
EC
 50 ja EC  10 (ja/või EC  20 ) silma järgi ehitatud kõveralt (vt ka 
stimuleerivat mõju käsitlev punkt allpool). Mõjuvad põhjused statis ­
tiliste meetodite kasutamisest loobumiseks võivad olla näiteks järg ­
mised:  
— andmed ei võimalda saada arvutimeetoditega usaldusväärsemaid 
tulemusi kui eksperdihinnanguga – sellisel juhul võivad mõned 
arvutiprogrammid üldse mitte anda usaldusväärseid lahendeid 
(iteratsioonisammud võivad mitte koonduda jne);  
— olemasolevad arvutiprogrammid ei võimalda adekvaatselt hinnata 
kasvu stimuleerivat mõju (vt allpool).  
2.4. STATISTILISED MEETODID  
Eesmärk on leida regressioonanalüüsi abil kvantitatiivne seos kont ­
sentratsiooni ja mõju vahel. Võib kasutada kaalutud lineaarset regres ­
siooni pärast kosteandmete lineariseerivat teisendamist näiteks probit-, logit- või Weibulli ühikute kujule (9), kuid eelistada tuleb siiski mittelineaarse regressiooni meetodeid, mis sobivad paremini 
vältimatute andmevigade ja sujuvast jaotusest kõrvalekallete puhul. 
Kui andmevead lähenevad null-pidurdusele või täielikule pidurdu ­
sele, võivad need teisendustel võimendada ja segada analüüsi (9). Tuleb silmas pidada, et probit-, logit- või Weibulli teisendusega 
standardsed analüüsimeetodid on ette nähtud kõik-või-mitte-midagi- 
andmete (nt suremus või elulemus) analüüsiks ja kasvu või biomassi andmete analüüsimiseks tuleb neid kohandada. Konkreetsed meetodid EC
 x väärtuste määramiseks pidevate andmete alusel on 
esitatud publikatsioonides (10, 11, 12). Mittelineaarse regressiooni 
kasutamist on üksikasjalikult käsitletud 4. liites.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Kummagi kostemuutuja puhul arvutatakse kontsentratsiooni-mõju 
kõverast punkti EC  x hinnangud. Võimaluse korral määratakse iga 
hinnangu usaldusvahemik 95 % usaldusnivoo jaoks. Kosteandmete sobivust regressioonimudeliga hinnatakse graafiliselt või statistiliselt. Regressioonanalüüsiks ei kasutata katserühma keskväärtusi, vaid 
individuaalsete paralleelkultuuride koste väärtusi. Kui andmete 
suure hajuvuse tõttu on kõvera mittelineaarne lähendamine raske või võimatu, võib probleemi ületamiseks kasutada rühmade keskväärtuste regressioonanalüüsi – see on praktiline lähenemisviis, 
mis võimaldab vähendada oletatavate võõrväärtuste mõju. Selle 
võimaluse kasutamise korral tuleb katseprotokolli teha märkus, et kalduti kõrvale tavalisest toimimisviisist, kuna kõvera lähendamine individuaalsete paralleelkultuuride andmetega ei andnud head tule ­
must.
 
Kui tavalised regressioonimudelid ja -meetodid katseandmete puhul 
ei sobi, võib EC  50 hinnangute ja usaldusvahemike leidmiseks kasu ­
tada ka lineaarset interpolatsiooni koos andmete usaldusväärsuse iteratiivse kontrollimisega ( bootstrapping ) (13).
 
Selleks et määrata madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon, 
selle kaudu ka avastatava mõjuta kontsentratsioon ja kirjeldada uuri ­
tava aine mõju kasvukiirusele, on vaja võrrelda uuritava ainega 
kultuuride keskväärtusi dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. Iga kont ­
sentratsiooni puhul leitud keskväärtust võrreldakse seejärel kontroll ­
kultuuride keskväärtusega, kasutades sobivat mitmekordse võrdluse või trendikatse meetodit. Dunnetti või Williamsi test võib osutuda 
sobivaks (14, 15, 16, 17, 18). Tuleb hinnata, kas kehtib dispersioo ­
nanalüüsi eeldus, et dispersioon on homogeenne. Selle hinnangu võib saada graafiliselt või formaaltesti abil (18). Sobivad Levene’i või Bartletti testid. Kui dispersioonide homogeensuse eeldus ei kehti, 
võib mõnikord olla abi andmete logaritmilisest teisendamisest. Kui 
dispersiooni heterogeensus on väga suur ja seda ei saa korrigeerida teisendamisega, tuleb kaaluda Jonkheere alanevate astmetega trendi ­
testi kasutamist. Täiendavad juhised avastatava mõjuta kontsentrat ­
siooni määramiseks on esitatud publikatsioonis (12).
 
Teaduse viimaste saavutuste põhjal on soovitatud loobuda avastatava 
mõjuta kontsentratsiooni mõistest ja asendada see regressioonist leitud punkti EC
 x hinnangutega. Kõnesoleva katse jaoks vetikatel 
ei ole sobivat x väärtust veel kindlaks määratud. Nähtavasti on see 
väärtus 10–20 % vahemikus (olenevalt valitud kosteparameetrist); 
parem oleks esitada nii EC  10 kui ka EC  20 . 
2.5. KASVU STIMULEERIMINE  
Mõnikord täheldatakse madalatel kontsentratsioonidel kasvu stimuleeri ­
mist (negatiivne pidurdumine). Selle põhjuseks võib olla hormees 
(mürgise aine stimuleeriv toime) või kasutatud minimaalsöötmele stimu ­
leeriva kasvufaktori lisamine katsematerjaliga. Tuleb arvestada, et anor ­
gaaniliste toitainete lisamine ei peaks avaldama otsest mõju, sest katse ­
keskkonnas on kogu katse vältel toitaineid liiaga. Tavaliselt võib EC  50 
arvutamisel väikeste dooside stimuleerivat mõju mitte arvestada, kui see 
mõju ei ole liiga suur. Kui stimuleeriv mõju on väga suur või on vaja leida EC
 x väärtus väikese x puhul, võib vaja minna erimeetmeid. Võima ­
luse korral tuleb vältida stimuleerimist kajastavate tulemuste väljajätmist 
andmeanalüüsist; kui olemasolev kõveraga lähendamise tarkvara ei võimalda nõrka stimuleerimist töödelda, võib kasutada lineaarset inter ­
polatsiooni koos andmete usaldusväärsuse iteratiivse kontrollimisega. 
Kui stimuleerimine on väga tugev, võib kaaluda hormeesimudeli kasu ­
tamist (19).
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. KASVU PIDURDAMINE MITTETOKSILISTE AINETEGA  
Valgust neelavad uuritavad materjalid võivad vähendada kasvukii ­
rust, kuna varjestamine vähendab kättesaadavat valgust. Sedalaadi füüsikalised mõjud tuleb toksilisest mõjust katsetingimuste muutmi ­
sega lahku viia, ja füüsikalisi mõjusid tuleb kirjeldada eraldi. Asja ­
omased juhtnöörid on esitatud publikatsioonides (2, 3).
 
3. TULEMUSTE ESITAMINE  
3.1. KATSEPROTOKOLL  
Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav aine:  
— füüsikaline iseloomustus ja asjakohased füüsikalis-keemilised 
omadused, kaasa arvatud lahustuvus vees;  
— keemiline iseloomustus, kaasa arvatud puhtusaste.  
Katseorganismi liik:  
— tüvi, päritolukollektsioon või eraldamise koht, kasutatud kultivee ­
rimistingimused.  
Katsetingimused:  
— katse alustamise kuupäev ja katse kestus;  
— katseplaani kirjeldus: katsenõud, kultuuri mahud, biomassi 
tihedus katse alguses;  
— söötme koostis;  
— uuritud kontsentratsioonid ja paralleelkultuurid (paralleelkultuu ­
ride arv, uuritud kontsentratsioonide arv, kasutatud geomeetriline 
progressioon);  
— katselahuste valmistamise kirjeldus, sh lahustite kasutamine jne;  
— kultiveerimisseade;  
— valguse intensiivsus ja kvaliteet (valgusallikas, valguse ühtlus);  
— temperatuur;  
— uuritud kontsentratsioonid: nominaalsed uuritud kontsentrat ­
sioonid ja katsenõudes oleva uuritava aine kontsentratsiooni määramiste tulemused. Märgitakse meetodi tulemuslikkus ja uuri ­
tavas süsteemis määratav minimaalne kontsentratsioon;
 
— kõik kõrvalekaldumised käesolevast metoodikast;  
— biomassi määramise meetod ning mõõdetava parameetri ja kuiv ­
massi korrelatsiooni tõendid.  
Katsetulemused:  
— pH väärtused kõikide katsete alguses ja lõpus;  
— biomass igas kolvis igas mõõtmispunktis ning biomassi mõõt ­
mise meetod;  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— kasvukõverad (graafikud, kuidas biomass muutus aja muutudes);  
— iga uuritava ainega paralleelkultuuri puhul arvutatud kostemuu ­
tujate väärtused, keskväärtused ja paralleelkultuuride variatsioo ­
nikordaja;  
— graafik, kuidas mõju sõltub kontsentratsioonist;  
— kostemuutujate (nt EC  50 , EC  10 , EC  20 ) abil väljendatud toksilisuse 
hinnangud ja nende usaldusvahemikud. Madalaim avastatava 
mõjuga kontsentratsioon ja ka avastatava mõjuta kontsentratsioon 
(kui need arvutati) ning nende määramiseks kasutatud statistilised meetodid;
 
— kui kasutati dispersioonanalüüsi (ANOVA), siis avastatava efekti 
suurus (nt väikseim oluline erinevus);  
— uuritava ainega kultuuris jälgitud kasvu stimuleerimine;  
— muu täheldatud mõju, nt vetikate morfoloogilised muutused;  
— tulemuste arutelu, kaasa arvatud käesolevast metoodikast kõrva ­
lekaldumise võimalik mõju katsetulemustele.  
4. KIRJANDUS  
1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test.  
2) ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibition 
tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442.
 
3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and 
Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.  
4) ISO 1998: Water quality – Sampling – Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667–16.  
5) ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. ISO 
8692.  
6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth 
inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.  
7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceano ­
graphy 22,5 (1977), pp. 919–925  
8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal 
bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073–2079.  
9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713–718.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.  
11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485–1494.
 
12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50: 1096–1121  
15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482–491.  
16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103–117.  
17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.  
18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
1. liide  
Tüved, mille sobivus katseks on tõendatud  
Rohevetikad  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (varasem liiginimi  Selenastrum capricor ­
nutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (varasem liiginimi  Scenedesmus subspicatus ), 
86.81 SAG  
Ränivetikad  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Tsüanobakterid  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Tüvede kollektsioonid  
Soovitatud tüved on kättesaadavad vetikate monokultuuridena järgmistest kollekt ­
sioonidest (tähestikulises järjestuses):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110–2209  
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UK 
SAG: Sammlung von Algenkulturen  
Albrecht-von-Haller-Institut  
Universität Göttingen  
Nikolausberger Weg 18  
D-3400 Göttingen  
GERMANY  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Soovitatavate liikide väline iseloomustus ja omadused  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Väline iseloomustus Kõverdunud 
kruvijad 
eraldi rakud Ovaalsed 
enamasti 
eraldi rakud Kepikesed Ovaalsete 
rakkude 
ahelad Kepikesed 
Mõõtmed (pikkus × läbimõõt) μm 8–14 × 2–3 7–15 × 3–12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Rakumaht ( μm 3 /rakk) 40–60 (  1 ) 60–80 (  1 ) 40–50 (  1 ) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Raku kuivmass (mg/rakk) 2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Kasvukiirus (  3 ) (ööpäev  –1 ) 1,5–1,7 1,2–1,5 1,4 1,1–1,4 2,0–2,4  
( 1 ) Määratud elektroonilise osakesteloenduri abil. 
( 2 ) Arvutatud mõõtmete alusel. 
( 3 ) Kõige sagedamini täheldatav kasvukiirus OECD söötmel, kui valgustatus on 70 μEm –2 s –1 ja temperatuur 21 °C.  
Konkreetsed soovitused soovitatavate katseliikide kultiveerimiseks ja 
käitlemiseks  
Pseudokirchneriella subcapitata ja Desmodesmus subspicatus  
Neid rohevetikaid on üldiselt kerge säilitada erinevatel söötmetel. Teavet sobivate 
söötmete kohta võib saada vetikakultuuri kollektsioonidest. Tavaliselt on rakud 
eraldi ja rakkude kontsentratsiooni on kerge määrata elektroonilise osakesteloen ­
duri või mikroskoobi abil.  
Anabaena flos-aquae  
Tüvikultuuri säilitamiseks võib kasutada erinevaid söötmeid. Portskultuuri uuen ­
damisel on eriti tähtis vältida kasvu väljumist logaritmilisest faasist, sest logarit ­
milise kasvu taastamine on raske.  
Anabaena flos-aquae  areneb kokkukeerdunud rakuahelate kogumitena. Olenevalt 
kultiveerimistingimustest võib nende rakukogumite suurus olla erinev. Kui biomassi määramiseks kasutatakse loendamist mikroskoobi abil või elektroonilist 
osakesteloendurit, võib olla vaja neid rakukogumeid lõhkuda.
 
Kõikumiste vähendamiseks rakkude loendamisel võib rakuahelad lõhkuda, 
töödeldes osaproove ultraheliga. Kui osaproove töödeldakse ultraheliga kauem, 
kui on vaja rakuahelate lõhkumiseks, siis võivad rakud puruneda. Ultraheliga töötlemise intensiivsus ja kestus peab olema kõigis katsetes ühesugune.
 
Tulemuste kõikumise kompenseerimiseks peab hemotsütomeetri abil loendatud 
väljade arv olema küllaldane (vähemalt 400 rakku). See muudab rakkude kont ­
sentratsiooni mikroskoobiga määramise usaldusväärsemaks.  
Pärast rakuahelate lõhkumist hoolika ultrahelitöötluse abil võib  Anabaena  
rakkude üldmahu määramiseks kasutada elektroonilist osakesteloendurit. Ultraheli 
energia tuleb nii reguleerida, et rakud jääksid terveks.  
Katsenõude inokuleerimiseks kasutatava vetikasuspensiooni hea läbisegatuse ja 
homogeensuse tagamiseks kasutatakse pöörissegajat.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Katsenõud asetatakse orbitaal- või võnkloksuti lauale töörežiimil ligikaudu 150 
pööret minutis.  Anabaena  rakukogumite moodustumist võib takistada ka perioo ­
dilise loksutamisega. Kui rakukogumid siiski tekivad, tuleb jälgida, et biomassi mõõtmiseks võetavad proovid oleksid representatiivsed. Võib olla vajalik kultuuri tugev segamine, et lõhkuda vetikakogumid enne proovi võtmist.
 
Synechococcus leopoliensis  
Tüvikultuuri säilitamiseks võib kasutada erinevaid söötmeid. Teavet sobivate 
söötmete kohta võib saada vetikakultuuri kollektsioonidest.  
Synechococcus leopoliensis  kasvab eraldi kepikesekujuliste rakkudena. Rakud on 
väga väikesed, mis raskendab biomassi mõõtmist rakkude loendamisega mikro ­
skoobi abil. Võib kasutada elektroonilist osakesteloendurit, mis võimaldab loen ­
dada osakesi läbimõõduga alates 1 μm. Võib kasutada ka fluorimeetrilisi mõõt ­
misi in vitro . 
Navicula pelliculosa  
Tüvikultuuri säilitamiseks võib kasutada erinevaid söötmeid. Teavet sobivate 
söötmete kohta võib saada vetikakultuuri kollektsioonidest. Tuleb silmas pidada, et sööde peab sisaldama silikaati.
 
Navicula pelliculosa  võib teatavates kasvutingimustes moodustada rakukogu ­
meid. Lipiidide moodustumise tõttu võivad vetikarakud mõnikord koguneda õhukesse pinnakihti. Sel juhul tuleb biomassi määramiseks vajalike osaproovide võtmisel rakendada erimeetmeid selleks, et proovid oleksid representatiivsed. 
Näiteks võib vaja minna intensiivset segamist pöörissegajaga.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
2. liide  
Söötmed  
Võib kasutada ühte järgmistest söötmetest.  
OECD sööde: originaalsööde OECD TG 201, vastab ka standardile ISO 8692.  
US EPA sööde AAP, vastab ka standardile ASTM.  
Nende söötmete valmistamisel kasutatakse keemiliselt või analüütiliselt puhtaid 
kemikaale ja deioniseeritud vett.  
USA Keskkonnakaitseagentuuri (U.S. EPA) AAP-söötme ja OECD eeskirjas 201 ette nähtud 
söötme koostis  
Koostisaine EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 ·2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) EDTA ja raua moolsuhe on veidi suurem kui 1. See hoiab ära raua sadestumise, samas kui kelaatide 
moodustumine raskmetallide ioonidega on minimaalne.  
Kui katses kasutatakse ränivetikat  Navicula pelliculosa , lisatakse kummalegi 
söötmele Na  2 SiO  3 ·9H  2 O kontsentratsioonini 1,4 mg Si/l.  
Nõutav söötme pH saavutatakse, kui söötme karbonaatsüsteem on tasakaalus 
CO 2 partsiaalrõhuga atmosfääriõhus. pH väärtus ja vesinikkarbonaadi molaarne 
kontsentratsioon 25 °C juures on omavahel seotud järgmise ligikaudse võrran ­
diga:  
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Kui NaHCO  3 sisaldus on 15 mg/l, siis pH  eq = 7,5 (U.S. EPA sööde); kui 
NaHCO  3 sisaldus on 50 mg/l, siis pH  eq = 8,1 (OECD sööde).  
Elementide sisaldus katsesöötmes  
Element EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
OECD söötme valmistamine  
Toitaine Sisaldus põhilahuses 
Põhilahus 1: makrotoitained  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Põhilahus 2: raud  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Põhilahus 3: mikroelemendid  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Põhilahus 4: vesinikkarbonaat  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Põhilahused steriliseeritakse membraanfiltrimise (keskmine poori läbimõõt 0,2 
μm) või autoklaavimise (120 °C, 15 min) abil. Lahuseid hoitakse valguse juur ­
depääsuta 4 °C juures.  
Põhilahuseid 2 ja 4 ei autoklaavita, vaid steriliseeritakse membraanfiltrimise abil.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Söötme valmistamiseks lisatakse veele vajalikud mahud põhilahuseid 1–4.  
500 ml steriliseeritud veele lisatakse:  
— 10 ml põhilahust 1;  
— 1 ml põhilahust 2;  
— 1 ml põhilahust 3;  
— 1 ml põhilahust 4.  
Lahuse ruumala viiakse steriliseeritud veega 1 000 milliliitrini.  
Lahusel lastakse piisavalt kaua seista, et sööde saavutaks tasakaalu atmosfääris 
oleva süsihappegaasiga; vajaduse korral barboteeritakse mõne tunni jooksul läbi 
lahuse filtritud steriilset õhku.  
AAP-söötme valmistamine  
A1.1. Ligikaudu 900 ml deioniseeritud või destilleeritud veele lisatakse  à 
1 ml põhilahuseid A1.2.1–A1.2.7 ja saadud lahuse ruumala viiakse 1 liitrini.
 
A1.2. Makrotoitainete põhilahuse valmistamiseks lahustatakse 500 ml deioni ­
seeritud või destilleeritud vees järgmised kogused aineid. Reaktiiviko ­
gustest A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 ja A1.2.4 võib valmistada ühe kombi ­
neeritud põhilahuse.  
A1.2.1. NaNO  3 – 12,750 g.  
A1.2.2. MgCl  2 ·6H  2 O – 6,082 g.  
A1.2.3. CaCl  2 ·2H  2 O – 2,205 g.  
A1.2.4. Mikrotoitainete põhilahus – (vt A1.3).  
A1.2.5. MgSO  4 ·7H  2 O – 7,350 g.  
A1.2.6. K  2 HPO  4 – 0,522 g.  
A1.2.7. NaHCO  3 – 7,500 g.  
A1.2.8. Na  2 SiO  3 ·9H  2 O – vt märkus A1.1.  
Märkus A1.1. Kasutatakse ainult ränivetikatel tehtavates katsetes. Võib 
lisada otse (202,4 mg) või põhilahuse koostises, nii et räni lõppkont ­
sentratsioon söötmes oleks 20 mg/l.  
A1.3. Mikroelementide põhilahuse saamiseks lahustatakse 500 ml deionisee ­
ritud või destilleeritud vees järgmised kogused aineid.  
A1.3.1. H  3 BO 3 – 92,760 mg.  
A1.3.2. MnCl  2 ·4H  2 O – 207,690 mg.  
A1.3.3. ZnCl  2 – 1,635 mg.  
A1.3.4. FeCl  3 ·6H  2 O – 79,880 mg.  
A1.3.5. CoCl  2 ·6H  2 O – 0,714 mg.  
A1.3.6. Na  2 MoO  4 ·2H  2 O – 3,630 mg.  
A1.3.7. CuCl  2 ·2H  2 O – 0,006 mg.  
A1.3.8. Na  2 EDTA·2H  2 O – 150,000 mg  
[dinaatrium(etüleendinitrilo)tetraatsetaat].  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9. Na  2 SeO  4 ·5H  2 O – 0,005 mg, vt märkus A1.2.  
Märkus A1.2. Kasutatakse ainult ränivetikaliikide tüvikultuuride jaoks 
ette nähtud söötmetes.  
A1.4. pH reguleeritakse väärtusele 7,5 ± 0,1, kasutades 0,1 N või 1,0 N 
NaOH või HCl lahust.  
A1.5. Sööde filtritakse steriilsesse nõusse läbi 0,22 μm membraanfiltri (kui 
kasutatakse osakeste loendurit) või 0,45 μm membraanfiltri (kui 
osakeste loendurit ei kasutata).  
A1.6. Kuni kasutamiseni hoitakse söödet valguse juurdepääsuta 4 °C juures.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
3. liide  
Vetikate kultiveerimiskatse näide  
Üldised märkused  
Allpool on kirjeldatud vetikakultuuride saamist mürgisuse määramise katsete 
jaoks.  
Tuleb rakendada kohaseid meetmeid, et hoida ära vetikakultuuride nakatumine 
bakteritega. Puhaskultuuri kasutamine võib olla eelistatav, kuid on vaja saada 
selline kultuur, mis sisaldaks ainult ühte vetikat, ja kasutada seda.  
Bakterite või teiste vetikatüvedega saastumise vältimiseks töötatakse steriilsetes 
tingimustes.  
Seadmed ja materjalid  
Vt „Meetodi kirjeldus: seadmed”.  
Vetikakultuuride saamine  
Toitainelahuste (söötmete) valmistamine  
Kõikidest söötmeks vajalikest toitesooladest valmistatakse kontsentreeritud põhi ­
lahused, mida hoitakse valguse juurdepääsuta ja jahedas kohas. Need lahused 
steriliseeritakse filtrimise või autoklaavimisega.  
Söötme valmistamiseks lisatakse steriilsele destilleeritud veele vajalik kogus 
põhilahust, jälgides, et lahusesse ei viidaks infektsiooni. Tahke söötme saamiseks 
lisatakse 0,8 % agarit.  
Tüvikultuur  
Tüvikultuur on väikesemahuline vetikakultuur, mida kantakse korrapäraselt üle 
värskesse söötmesse ja kasutatakse katse algmaterjalina. Kui tüvikultuuri pidevalt 
ei kasutata, külvatakse see viirgudena kaldagariga katseklaasi. Kaldagarilt 
kantakse tüvikultuur ümber värskele söötmele vähemalt üks kord kahe kuu jooksul.
 
Tüvikultuure kasvatatakse sobiva söötmega koonilistes kolbides (maht ligikaudu 
100 ml). Vetikate inkubeerimisel pideva valguse käes 20 °C juures tuleb neid iga 
nädal üle kanda.  
Teatav kogus vana kultuuri kantakse steriilse pipetiga üle värske söötmega kolbi 
nii, et kiirelt kasvava liigi puhul oleks algkontsentratsioon ligikaudu 100 korda väiksem kui vanas kultuuris.
 
Liigi kasvukiiruse võib määrata kasvukõveralt. Kui see on teada, on võimalik 
hinnanguliselt määrata kultuuri uude söötmesse ülekandmiseks vajalik kontsen ­
tratsioon. Seda on vaja teha enne, kui kultuur jõuab suremisfaasi.  
Eelkultuur  
Eelkultuur on mõeldud vetikakoguse saamiseks, mis sobib uuritava ainega 
kultuuride inokuleerimiseks. Eelkultuuri inkubeeritakse katse tingimustes ja kasu ­
tatakse siis, kui see on veel eksponentsiaalse kasvu faasis, harilikult pärast 2–4 päeva kestnud inkubeerimist. Kui vetikakultuur sisaldab moondunud või ebanor ­
maalseid rakke, praagitakse kultuur välja.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
4. liide  
Andmete töötlemine mittelineaarse regressiooni abil  
Üldised märkused  
Vetikate ja muude mikroorganismide kasvu katsetes on kostemuutujaks protsessi 
kiirus, kui kasutatakse kasvukiirust, või selle integraal aja järgi, kui kasutatakse 
biomassi (biomassi kasv on pidev ehk mõõdetav muutuja). Kumbagi muutujat 
võrreldakse vastava keskmise kostemuutuja väärtusega paralleelsetes kontrollkul ­
tuurides, mis ei sisalda uuritavat ainet, kusjuures tingimused (vetikakatse puhul on peamised määravad tegurid valgus ja temperatuur) on valitud nii, et koste 
oleks maksimaalne. Tegemist on hajus- ehk homogeense süsteemiga, mille 
biomassi võib vaadelda kontiinumina, arvestamata individuaalseid rakke. Sellise süsteemi koste dispersiooni jaotus sõltub üksnes katsetingimustest (harilikult on vea jaotus lognormaalne või normaalne). Olukord on teistsugune kui tavaliste 
biotestide puhul, millest saadakse kõik-või-mitte-midagi-andmeid, mille korral 
sageli eeldatakse, et dispersiooni põhikomponent on – tavaliselt binomiaaljaotu ­
sega – individuaalsete organismide taluvus. Antud juhul on null- ehk tausttase ­
meks kontrollkultuuridega saadud koste.
 
Lihtsal juhul väheneb normeeritud ehk suhteline koste r monotoonselt alates 
väärtusest 1 (nullpidurdus) kuni väärtuseni 0 (täielik pidurdus). Tuleb silmas pidada, et koste mõõtmine on seotud veaga ja näilist negatiivset pidurdust võib 
töödelda üksnes kui juhuvea tulemust.
 
Regressioonanalüüs  
Mudelid  
Regressioonanalüüsi eesmärk on esitada kontsentratsiooni-mõju kõver kvantita ­
tiivselt kas matemaatilise regressioonifunktsiooni Y = f(C) kujul või sagedamini funktsioonina F(Z), kus Z = log C. Pöördfunktsioon C = f
 –1 (Y) võimaldab 
arvutada EC  x väärtused EC  50 , EC  10 ja EC  20 ning nende usaldusvahemikud usal ­
dusnivool 95 %. Vetikate kasvu pidurdamise katsetes on kontsentratsiooni mõju kirjeldamisel edukalt kasutatud mitut lihtsat matemaatilist funktsiooni. Sellisteks funktsioonideks on näiteks logistiline võrrand, mittesümmeetriline Weibulli 
võrrand ja lognormaalne jaotusfunktsioon, mis kõik kujutavad endast sigmoidkõ ­
veraid ning lähenevad 1-le, kui C → 0, ja 0-le, kui C → ∞.
 
Viimasel ajal on asümptootiliste mudelite alternatiiviks pakutud pideva lävifunkt ­
siooni mudeleid (nt Kooijmani mudel populatsiooni kasvu pidurdamise kirjelda ­
miseks, Kooijman  et al.  1996). Kooijmani mudeli puhul eeldatakse, et teatavast 
kontsentratsiooni läviväärtusest EC0+ allpool uuritav aine ei mõju; see lävi ­
väärtus määratakse, ekstrapoleerides kontsentratsiooni-mõju kõverat lõikumiseni 
kontsentratsiooniteljega, kasutades selleks lihtsat pidevat funktsiooni, mis 
algpunktis ei ole diferentseeritav.  
Analüüs võib seisneda lihtsalt hälvete ruutude summa minimeerimises (oletades, 
et dispersioon on konstantne) või kaalutud hälvete ruutude summa minimeeri ­
mises (kui dispersiooni heterogeensus on kompenseeritud).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Analüüsi käik  
Analüüsi käiku võib kirjeldada järgmiselt. Valitakse sobiv funktsioon Y = f(C) ja 
lähendatakse see katseandmetega mittelineaarse regressiooni abil. Et saada katseandmetest võimalikult palju teavet, on parem mitte kasutada paralleelkultuu ­
ridest leitud keskmisi väärtusi, vaid iga üksiku kolvi puhul saadud mõõteväärtusi. 
Teisest küljest näitavad kogemused, et kui dispersioon on suur, võib paralleel ­
kultuuride keskmise väärtuse kasutamine anda usaldusväärsema, katseandmete juhuslikest vigadest vähem mõjutatud matemaatilise hinnangu kui iga indivi ­
duaalse andmepunkti kasutamine.
 
Lähendatud kõver ja mõõdetud andmed kantakse graafikule ning kontrollitakse 
kõvera ja andmete sobivust. Selleks võib olla eriti kasulik rakendada hälvete analüüsi. Kui kontsentratsiooni-mõju kirjeldamiseks valitud funktsionaalseos ei kajasta hästi kogu kõverat või mõnda selle olulist osa, nt madalate kontsentrat ­
sioonide mõju, valitakse lähendamiseks muu kõver – näiteks võib sümmeetrilise 
kõvera asemel valida Weibulli funktsioonile vastava mittesümmeetrilise kõvera. Negatiivne pidurdus võib olla probleemiks näiteks lognormaalse jaotusfunkt ­
siooni korral ja vajada samuti alternatiivset regressioonifunktsiooni. Sellistele 
negatiivsetele väärtustele ei soovitata omistada nullväärtust või väikesi positiiv ­
seid väärtusi, kuna see moonutab vigade jaotust. Võib olla vaja lähendada teata ­
vaid kõvera osi eraldi, nt lähendada eraldi nõrga pidurduse osa EC
 madal x  väär­
tuste hindamiseks. Lähendatud võrrandi ja pöördfunktsiooni C = f  –1 (Y) abil 
arvutatakse iseloomulike punktide EC  x hinnangud, kusjuures katseprotokolli 
kantakse vähemalt EC  50 hinnang ning üks või kaks EC  madal x  hinnangut. Koge ­
mused on näidanud, et vetikakatsete täpsus võimaldab mõistliku täpsusega hinda ­
mist tavaliselt 10-protsendilise pidurdustaseme juures, kui andmepunkte on 
küllaldaselt ja madalatel kontsentratsioonidel ei esine segavat kasvu stimuleeri ­
mist. EC  20 hinnang on sageli oluliselt täpsem kui EC  10 hinnang, kuna EC  20 asub 
harilikult kontsentratsiooni-mõju kõvera keskmises, ligikaudu lineaarses osas. 
Kasvu stimuleerimise tõttu on EC  10 väärtusi mõnikord raske tõlgendada. Selle ­
pärast soovitatakse, et kuigi EC  10 on piisava täpsusega määratav, oleks katsepro ­
tokollis alati esitatud ka EC  20 . 
Kaalutegurid  
Dispersioon katses ei ole üldiselt konstantne ja sisaldab harilikult võrdelist 
komponenti, sellepärast on tavaliselt parem kasutada kaalutud regressiooni. Tava ­
liselt eeldatakse sellise analüüsi puhul, et kaalutegur on pöördvõrdeline disper ­
siooniga:  
W i = 1/Var(r  i ) 
Paljud regressiooniprogrammid võimaldavad valida kaalutud regressioonanalüüsi 
tabelites esitatud kaalutegurite kasutamisega. Sobiv on kaalutegurid normeerida; selleks korrutatakse need teguriga n/ ∑ w
 i (n on andmepunktide arv), nii et 
kõikide kaalutegurite summa on 1.  
Koste normeerimine  
Normeerimine kontrollkatse keskmise koste abil tekitab teatavaid põhimõttelisi 
raskusi ja muudab dispersiooni struktuuri üsna keeruliseks. Kui pidurdusprotsendi 
saamiseks jagatakse koste väärtus kontrollkatse koste keskväärtusega, siis tuuakse 
sisse lisaviga, kuna kontrollkatse koste keskväärtus ise on määratud veaga. Kui see viga ei ole tühiselt väike, tuleb regressiooni kaalutegureid ja usaldusintervalle parandada, arvestades kontrolli kovariatsiooni (17). Tuleb silmas pidada, et kont ­
rolli koste keskväärtuse täpne määramine on oluline suhtelise koste ülddisper ­
siooni vähendamiseks. Seda dispersiooni kirjeldab järgmine valem,
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
milles alaindeks i märgib kontsentratsiooni i ja alaindeks 0 – kontrollkultuuri:  
Y i = suhteline koste = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
mille dispersioon on järgmine:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
ja kuna  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 ja (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
andmete dispersiooni normaaljaotuse ja paralleelkultuuride arvu m  i ja m  0 puhul:  
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
siis suhtelise koste summaarne dispersioon Y  i võrdub:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Kontrollkultuuride koste keskväärtuse viga on pöördvõrdeline ruutjuurega kesk ­
mistatud kontrollkultuuride arvust; sellepärast on vea oluliseks vähendamiseks 
mõnikord õigustatud varasemate andmete arvestamine. Teine võimalus on loobuda andmete normeerimisest ja kasutada lähendamisel absoluutseid koste väärtusi, kaasa arvatud kontrollkultuuride koste väärtused, kusjuures kontrollkul ­
tuuri koste väärtust käsitletakse mittelineaarse regressiooni abil lähendatava täien ­
dava parameetrina. Tavalise kaheparameetrilise regressioonivõrrandi puhul nõuab see meetod lähendamist kolme parameetri järgi, järelikult on meetodi kasutami ­
seks vaja rohkem andmepunkte kui mittelineaarse regressiooni läbiviimiseks 
andmetega, mida on normeeritud eelnevalt kindlaks määratud kontrollkultuuri koste väärtuse abil.
 
Usaldusvahemike pöördhinnangud  
Mittelineaarse regressiooni usaldusvahemike arvutamine pöördhinnangu abil on 
üsna keeruline ega kuulu tavaliste statistilise tarkvara pakettide standardvarian ­
tides ette nähtud võimaluste hulka. Ligikaudsed usaldusvahemikud võib leida standardse mittelineaarse regressiooni programmide abil, kasutades ümberparame ­
triseerimist (Bruce and Versteeg, 1992), mille puhul matemaatiline võrrand kirju ­
tatakse ümber nii, et määratavateks parameetriteks on otsitavad punktide hinnangud, (nt EC
 10 ja EC  50 ). Kui funktsioon on I = f( α, β, kontsentratsioon), 
kasutatakse määratlusi f( α, β, EC  10 ) = 0,1 ja f( α, β, EC  50 ) = 0,5 selleks, et 
asendada funktsioon f( α, β, kontsentratsioon) ekvivalentse funktsiooniga 
g(EC  10 , EC  50 , kontsentratsioon).  
Otsesema arvutusviisi kasutamisel (Andersen  et al , 1998) säilitatakse võrrand 
originaalkujul ja arendatakse funktsioon Taylori ritta r  i ja r  0 keskväärtuste 
ümbruses.  
Viimasel ajal on saanud populaarseks andmete usaldusväärsuse iteratiivsel kont ­
rollil põhinevad ( boot strap ) meetodid. Nende meetodite puhul kasutatakse 
empiirilise dispersioonijaotuse saamiseks katseandmeid ja sagedast korduvat valimi moodustamist, mida suunatakse juhuslike arvude generaatori abil.
 
KIRJANDUS  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485–1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. KOHESE BIOLAGUNDUVUSE MÄÄRAMINE  
I OSA  ÜLDPÕHIMÕTTED  
I.1. SISSEJUHATUS  
Kirjeldatakse kuut katsemeetodit, mis sobivad kemikaalide kohese 
biolagunduvuse sõelkatseteks aeroobses veekeskkonnas:  
a) lahustunud orgaanilise süsiniku (DOC) kõrvaldamine (meetod 
C.4-A);  
b) muudetud OECD sõelkatse – DOC kõrvaldamine (meetod C.4-B);  
c) süsinikdioksiidi (CO  2 ) eraldumine (muudetud Sturmi katse) 
(meetod C.4-C);  
d) manomeetriline respiromeetria (meetod C.4-D);  
e) kinnise pudeli katse (meetod C.4-E);  
f) MITI (Jaapani Väliskaubandus- ja Tööstusministeeriumi) katse 
(meetod C.4-F).  
Kõigi kuue katse üldpõhimõtted on esitatud meetodi I osas. Üksikute 
meetodite spetsiifilised osad on esitatud II–VII osas. Lisades on 
toodud määratlused, valemid ja suunismaterjalid.  
1988. a tehtud OECD laboritevaheline võrdluskatse näitas, et nende 
meetoditega saadakse ühtseid tulemusi. Siiski võib mõni meetod 
olenevalt aine füüsikalistest omadustest olla eelistatav.  
I.2. SOBIVA MEETODI VALIMINE  
Sobivaima meetodi valikul on olulised andmed kemikaali lahustu ­
vuse, aururõhu ja adsorptsiooniomaduste kohta. Teoreetiliste väär ­
tuste arvutamisel ja/või mõõdetud väärtuste, nt ThOD, ThCO  2 , 
DOC, TOC, COD (vt 1. ja 2. liide) kontrollimisel on vaja teada 
aine keemilist struktuuri või valemit.  
Aineid, mille lahustuvus vees on vähemalt 100 mg/ml, võib analüü ­
sida kõigi meetoditega eeldusel, et ained ei ole lenduvad ega adsor ­
beeruvad. Tabelis 1 on märgitud meetodid, mis sobivad vees vähe ­
lahustuvate, lenduvate või adsorbeeruvate kemikaalide puhul. Vees 
vähelahustuvate ja lenduvate kemikaalide käsitlemisviise on kirjel ­
datud 3. liites. Mõõdukalt lenduvaid kemikaale võib uurida DOC kõrvaldamise katses eeldusel, et katseanumates (mis peaksid olema sobival moel suletud) on küllaldaselt vaba ruumi gaasifaasile. Sellisel 
juhul tuleb füüsikaliste kadude arvessevõtmiseks teha ka abiootiline 
kontrollkatse.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabel 1  
Katsemeetodite kohaldatavus  
Katse Analüüsimeetod Sobivus ainetele, mis on: 
vähelahustuvad lenduvad adsorbeeruvad  
DOC kõrvaldamine Lahustunud orgaaniline 
süsinik — — +/- 
Muudetud OECD sõelkatse Lahustunud orgaaniline 
süsinik — — +/- 
CO 2 eraldumine Respiromeetria: CO  2 eral­
dumine + — + 
Manomeetriline respiro ­
meetria Manomeetriline respiro ­
meetria: hapniku tarbimine + +/- + 
Kinnise pudeli katse Respiromeetria: lahustunud 
hapnik +/- + + 
MITI katse Respiromeetria: hapniku 
tarbimine + +/- +  
Saadud tulemuste tõlgendamisel on vaja andmeid katsematerjali 
puhtusastme või põhikomponentide osakaalu kohta, eriti kui tule ­
mused on väikesed või piiripealsed.  
Andmed uuritava kemikaali mürgisuse kohta bakteritele (IV liide) 
võivad olla sobivate katsekontsentratsioonide valikul väga kasu ­
likud ja madalate biolagunduvuse väärtuste õigel tõlgendamisel 
hädavajalikud.  
I.3. VÕRDLUSAINED  
Töövõtete kontrollimiseks tehakse koos tavaliste katsetega sobivas 
kolvis paralleelkatse kohese biolagunduvuse kriteeriumidele vasta ­
vate võrdlusainetega.  
Sobivad võrdlusained on aniliin (värskelt destilleeritud), naatriumat ­
setaat ja naatriumbensoaat. Võrdlusained lagunevad nende meetodite 
puhul isegi ilma otseselt inokulaati lisamata.  
On tehtud ettepanekuid bioloogiliselt kergesti laguneva, kuid inoku ­
laadi lisamist nõudva võrdlusaine otsimiseks. Välja on pakutud 
kaaliumvesinikftalaati, kuid enne selle aine võrdlusainena tunnusta ­
mist tuleb selle kohta rohkem andmeid koguda.  
Respiromeetrilistes katsetes võivad lämmastikku sisaldavad ühendid 
nitrifikatsiooni kaudu mõjutada hapniku tarbimist (vt II ja V liidet).  
I.4. KATSEMEETODITE PÕHIMÕTE  
Testaine lahus või suspensioon mineraalses toitelahuses inokuleeri ­
takse ja seda inkubeeritakse aeroobsetes tingimustes pimedas või hajutatud valguse käes. Inokulaadist pärit DOC kogus katselahuses 
tuleks testainest pärit DOC kogusega võrreldes hoida võimalikult 
madal. Et arvestada endogeenset aktiivsust inokulaadis, tehakse paralleelne pimekatse inokulaadiga ja ilma testaineta, ehkki endo ­
geenne aktiivsus rakkudes testaine juuresolekul ei ole täpselt identne 
endogeense kontrollproovi omaga. Töövõtete toimimise kontrolliks 
tehakse paralleelkatse võrdlusainega.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Üldjuhul jälgitakse lagundamisprotsessi mitmesuguste parameetrite, 
nagu DOC, CO  2 eraldumise ja hapniku tarbimise põhjal ja mõõtmisi 
tehakse nii sageli, et see võimaldab määrata biolagundamise algust ja lõppu. Automaatsete respiromeetrite kasutamisel toimub mõõtmine pidevalt. Lisaks mingile muule parameetrile mõõdetakse vahel 
DOC-d, kuid tavaliselt tehakse seda ainult katse alguses ja lõpus. 
Kasutada võib ka spetsiifilist keemilist analüüsi testaine esmase lagu ­
nemise ja mis tahes tekkinud vaheühendite kontsentratsiooni määra ­
miseks (nõutav MITI katses).
 
Üldjuhul on katse pikkus 28 päeva. Katsed võib siiski lõpetada enne 
28 päeva möödumist, st kohe, kui biolagundamise graafik on jõudnud platooni ja jäänud sinna vähemalt kolmeks mõõtmiseks. Katseid võib pikendada ka pikemaks kui 28 päeva, kui graafik 
näitab, et biolagundumine on alanud, kuid platooni ei ole 28 päeva 
jooksul jõutud.
 
I.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
I.5.1.  Reprodutseeritavus  
Biodegradatsiooni ja inokulaadina kasutatud bakteripopulatsioonide 
iseloomu tõttu tuleks kõiki määramisi teha vähemalt kahe parallee ­
lina. 
Kogemus näitab, et mida suurem on katsekeskkonda lisatud mikro ­
organismide kontsentratsioon, seda väiksemad on korduskatsete 
vahelised erinevused. Laboritevahelised võrdlused on näidanud ka 
seda, et eri laborites saadud tulemused võivad erineda üsna palju, kuid tavaliselt saadakse hea biolagunduvusega ühendite puhul üsna sarnased tulemused.
 
I.5.2.  Katse kehtivus  
Katse loetakse kehtivaks, kui uuritava kemikaali kõrvaldamispara ­
meetri kordusväärtuste suurim erinevus platool ja katse lõpus või 
kümnepäevase akna lõpus on väiksem kui 20 % ja kui võrdlusaine protsentuaalne lagunemine on 14 päeva jooksul jõudnud kohese biolagunduvuse määrani. Kui kas või üks neist tingimustest ei ole 
täidetud, tuleb katset korrata. Meetodite piiratuse tõttu ei tähenda 
madalad väärtused tingimata seda, et testaine keskkonnas bioloogili ­
selt ei lagune, küll aga seda, et biolagunduvuse määramine nõuab 
rohkem tööd.
 
Kui lagunemise määr on testaine ja võrdlusainega mürgisuse katses 
14 päeva jooksul alla 35 % (DOC järgi) või alla 25 % (ThOD või ThCO
 2 järgi), võib testaine lugeda bioloogilisi protsesse pidurdavaks 
(vt ka IV liidet). Katseseeriat tuleks korrata, võimaluse korral uuri ­
tava kemikaali madalama kontsentratsiooni ja/või inokulaadi kõrgema kontsentratsiooniga, kuid mitte rohkem kui 30 mg tahkeid aineid/liitris.
 
I.6. ÜLDISED TÖÖMEETODID JA ETTEVALMISTUSED  
Katsete puhul kehtivad üldnõuded on kokku võetud tabelis 
2. Konkreetselt üksikute katsetega seotud seadmeid ja katsetingimusi 
kirjeldatakse hiljem, vastava katse alapunktis.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Tabel 2  
Katsetingimused  
Katse DOC 
kõrvaldamine CO 2 
eraldumine Manomeetriline 
respiromeetria Muudetud 
OECD 
sõelkatse Kinnise pudeli 
katse MITI (I)  
Testaine 
kontsentrat ­
sioon 
mg/l 100 2–10 100 mg DOC/l 10–40 10–20 10–40 10–40 mg ThOD/l 50–100 5–10 
Inokulaadi 
kontsentrat ­
sioon (rakku ­
des/l, ligi ­
kaudne) ≤ 30 mg/l hõljumit 
või ≤ 100 ml reovett/l 
(10
 7 –10  8 ) 0,5 ml 
töödeldud 
reovett/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
reovett/l 
(10 4 –10  6 ) 30 mg/l 
hõljumit 
(10 7 –10  8 ) 
Elementide 
kontsentrat ­
sioonid mine ­
raalses toite ­
lahuses (mg/l) 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 
Ca 9,9 9,9 29,7 
Fe 0,05—0,1 0,05—0,1 0,15 
pH 7,4± 0,2 eelistatavalt 
7,0 
Temperatuur 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = lahustunud orgaaniline süsinik ThOD = lahustunud 
orgaaniline süsinik SS = hõljuvaine
 
I.6.1.  Lahjendusvesi  
Kasutatakse deioniseeritud või destilleeritud vett, mis ei sisalda inhi ­
beerivates kontsentratsioonides mürgiseid aineid (nt Cu  ++ ioone). 
Orgaanilise süsiniku sisaldus ei tohi olla suurem kui 10 % testainest 
tulenevast orgaanilise süsiniku sisaldusest. Vee kõrge puhtusaste 
aitab välistada kõrgete tulemuste saamise nullproovidega. Saastus võib tuleneda nii testaines olevatest lisanditest kui ka ioonvahetus ­
vaikudest ja lüüsunud bakteri- või vetikamaterjalist. Igas katseseerias 
tuleb kasutada ainult samast partiist pärit vett, millele on eelnevalt 
tehtud DOC analüüs. Kinnise pudeli katses selline analüüs vajalik ei ole, kuid vee hapnikutarve peab olema madal.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Mineraalainete põhilahused  
Katselahuste jaoks valmistatakse sobivate mineraalainete kontsentrat ­
sioonidega põhilahused. Järgmised põhilahused sobivad (erinevaid lahjendusastmeid kasutades) DOC kõrvaldamise katse, muudetud 
OECD sõelkatse, CO
 2 eraldumise katse, manomeetrilise respiro ­
meetria katse ja kinnise pudeli katse jaoks.  
Lahjendusastmed ja MITI katse mineraalse toitelahuse valmistamis ­
juhend on esitatud vastavate katsete alapunktides.  
Põhilahused  
Analüüsipuhastest reaktiividest valmistatakse järgmised põhilahused. 
a) Kaaliumdivesinikfosfaat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaaliumvesinikfosfaat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinaatriumvesinikfosfaatdihüdraat, Na  2 HPO  4 , 
2H 2 O 33,40 g 
Ammooniumkloriid, NH  4 Cl 0,50 g 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini. 
Lahuse pH peaks olema 7,4. 
b) Kaltsiumkloriid, veevaba, CaCl  2 27,50 g 
või kaltsiumkloriiddihüdraat, CaCl  2 × 2 H  2 O 36,40 g 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini 
c) Magneesiumsulfaatheptahüdraat, MgSO  4 × 7 H  2 O 22,50 g 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini 
d) Raud(III)kloriidheksahüdraat, FeCl  3 × 6 H  2 O 0,25 g 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini.  
Märkus.  Vältimaks vajadust valmistada lahus vahetult enne kasuta ­
mist, tuleb neile 1 liitri kohta lisada üks tilk konts. vesinikkloriid ­
hapet või 0,4 g etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumsoola.  
I.6.3.  Kemikaalide põhilahused  
Juhul kui aine lahustuvus ületab 1 g/l, lahustada vastavalt vajadusele 
1–10 g test- või võrdlusainet deioniseeritud vees ja täiendada veega 
1 liitrini. Teise võimalusena võib valmistada põhilahuse mineraalses toitelahuses või lisada kemikaali otse mineraalsele toitelahusele. Halvemini lahustuvate kemikaalide käsitlemist vt 3. liitest, kuid 
MITI katses (meetod C.4-F) ei tohi kasutada ei lahusteid ega emul ­
gaatoreid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
1.6.4.  Inokulaadid  
Inokulaadi saamisel võib kasutada mitmeid lähtematerjale: aktiiv ­
muda, (klooritamata) reovett, pinnavett või mulda või nende segu. DOC kõrvaldamise, CO
 2 eraldumise või manomeetrilise respiro ­
meetria katses aktiivmuda kasutamisel peaks see olema pärit valda ­
valt olmereovett töötlevast puhastusjaamast või laborimõõdus sead ­
mest. Teistest allikatest pärit inokulaatide puhul on ilmnenud tule ­
muste suurem hajuvus. Muudetud OECD sõelkatse ja kinnise pudeli 
katse jaoks on vaja lahjemat, mudahelvesteta inokulaati, eelistatav 
allikas on valdavalt olmereovett töötlevast puhastusjaamast või labo ­
rimõõdus seadmest väljuv töödeldud reovesi. MITI katse inokulaat 
valmistatakse mitmete lähtematerjalide segust ja vastav kirjeldus on 
esitatud konkreetse katse alapunktis.  
I.6.4.1.  Aktiivmudast saadud inokulaat  
Proov võetakse valdavalt olmereovett töötleva puhastusjaama või 
laborimõõdus seadme aeratsioonibasseini värskest aktiivmudast. Vajaduse korral eemaldatakse peene sõelaga filtrimisel jämedad 
osakesed ja hoitakse muda seejärel aeroobsena.
 
Teine võimalus on muda pärast jämedate osakeste eemaldamist seti ­
tada või tsentrifuugida (näiteks 1 100 g 10 min). Kõrvaldatakse supernatant. Muda võib pesta mineraalse toitelahusega. Kontsentree ­
ritud muda suspendeeritakse mineraalses toitelahuses kontsentrat ­
sioonil 3–5 g hõljumit/l ja aereeritakse tarvitamiseni.
 
Muda tuleks võtta tavapärasest, töökorras puhastusjaamast. Suure 
koormusega puhastusjaamast pärinevat või inhibiitoreid sisaldada 
võivat muda tuleks pesta. Pärast põhjalikku segamist resuspendee ­
ritud muda setitatakse või tsentrifuugitakse, kõrvaldatakse superna ­
tant ja resuspendeeritakse muda järgmises koguses mineraalses toite ­
lahuses. Protseduuri korratakse, kuni muda loetakse substraadi liiast 
või inhibiitorist vabaks.  
Täielikult resuspendeeritud või töötlemata mudast võetakse vahetult 
enne kasutamist proov hõljumi kuivmassi määramiseks.  
Veel üks võimalus on aktiivmuda homogeniseerida (3–5 g hõljumit/ ­
l). Muda töödeldakse keskmisel kiirusel 2 min mehaanilises segistis. 
Homogeniseeritud muda setitatakse 30 min või vajaduse korral kauem ja dekanteeritakse vedelik, mida kasutatakse inokulaadina kontsentratsioonil 10 ml/l mineraalse toitelahuse kohta.
 
I.6.4.2.  Muud inokulaadiallikad  
Inokulaadi võib valmistada valdavalt olmereovett töötlevast puhas ­
tusjaamast või laborimõõdus seadmest väljuvast töödeldud reoveest. 
Selleks võetakse värske proov, mida hoitakse transportimisel aeroob ­
sena. Mudal lastakse 1 h seista või filtritakse see läbi jämeda filter ­
paberi ja hoitakse dekanteeritud vedelik või filtraat kuni tarvitamiseni 
aeroobsena. Sellist inokulaati võib kasutada kuni 100 ml toitelahuse 
liitri kohta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Veel üks võimalik inokulaadiallikas on pinnavesi. Sobivast pinna ­
veekogust, nt jõest või järvest võetakse proov ja hoitakse seda tarvi ­
tamiseni aeroobsena. Vajaduse korral kontsentreeritakse inokulaati filtrimise või tsentrifuugimise teel.
 
I.6.5.  Inokulaatide kohandamine  
Inokulaate võib lasta kohanduda katsetingimustega, kuid mitte adap ­
teeruda uuritava kemikaaliga. Kohandamine seisneb aktiivmuda aeratsioonis mineraalses toitelahuses või töödeldud reovees katsetem ­
peratuuril 5–7 päeva jooksul. Mõnikord parandab kohandamine 
katsemeetodite täpsust, vähendades nullproovidega saadavaid tule ­
musi. MITI inokulaadi kohandamist ei peeta vajalikuks.
 
I.6.6.  Abiootilised kontrollproovid  
Vajaduse korral kontrollitakse testaine võimalikku abiootilist lagune ­
mist, uurides DOC kõrvaldamist, hapniku tarbimist või süsinikdiok ­
siidi eraldumist steriilsetes inokulaadita kontrollproovides. Proov steriliseeritakse filtrimisel läbi membraani (0,2–0,45 μm) või sobiva 
mürkaine lisamisel vajalikus kontsentratsioonis. Membraanfiltrat ­
siooni kasutamisel võetakse proovid steriilsuse tagamiseks aseptili ­
selt. Kui uuritava kemikaali adsorbeerumine ei ole eelnevalt välis ­
tatud, tuleb katsetes, kus biolagundumist mõõdetakse DOC kõrval ­
damise järgi, eriti aktiivmuda-inokulaatide kasutamisel, kasutada 
inokuleeritavat ja mürgitatavat abiootilist kontrollproovi.
 
I.6.7.  Kolbide arv  
Kolbide arv tüüpilises katses on ära toodud iga katse alapunktis.  
Kasutada võib järgmisi kombinatsioone:  
— katsesuspensioon: sisaldab testainet ja inokulaati;  
— inokulaadi nullproov: sisaldab ainult inokulaati;  
— protseduuri kontrollproov: sisaldab võrdlusainet ja inokulaati;  
— abiootiline steriilne kontrollproov: steriilne, sisaldab testainet (vt 
I.6.6);  
— adsorptsiooni kontrollproov: sisaldab testainet, inokulaati ja steri ­
liseerivat ainet;  
— mürgisuse kontrollproov: sisaldab testainet, võrdlusainet ja 
inokulaati.  
Paralleelmõõtmised katsesuspensiooni ja inokulaadi nullprooviga on 
kohustuslikud. Soovitatav on teha mõõtmised ka ülejäänud parallee ­
lidega.  
See ei pruugi aga alati võimalik olla. Tagada tuleb küllaldane 
proovide või mõõtmiste arv protsentuaalse kõrvaldamise leidmiseks 
10-päevase akna kestel.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. ANDMED JA HINDAMINE  
Protsentuaalse lagunemise (D  t ) arvutamisel kasutatakse nii katsea ­
numa kui ka inokulaadi nullproovi kordusmõõtmiste keskmisi. Vastavad valemid on sätestatud allpool, konkreetsetele katsetele 
vastavates alapunktides. Lagunemise käik esitatakse graafiliselt ja 
näidatakse ära kümnepäevane aken. Tuleks arvutada ja esitada kõrvaldamisprotsent kümnepäevase akna lõpus ja väärtus platool või katse lõpus, vastavalt vajadusele.
 
Respiromeetrilistes katsetes võivad lämmastikku sisaldavad ühendid 
nitrifikatsiooni kaudu mõjutada hapniku tarbimist (vt II ja V liidet).  
I.7.1.  DOC määramise põhjal mõõdetud lagunemine  
Katse kehtivuse hindamiseks tuleks testainet sisaldavate kolbide 
kohta eraldi arvutada protsentuaalne lagunemine (D  t ) igal proovi 
võtmise hetkel, kasutades DOC topeltmõõtmiste keskmisi väärtusi (vt I.5.2). See arvutatakse järgmise võrrandi abil:
 
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Í Î  
Ü 100  
kus: 
D t = lagunemisprotsent ajahetkel t,  
C o = DOC keskmine algkontsentratsioon testainet sisaldavas 
inokuleeritud toitelahuses (mg DOC/l),  
C t = DOC keskmine kontsentratsioon testainet sisaldavas inoku ­
leeritud toitelahuses ajahetkel t (mg DOC/l),  
C bo = DOC keskmine algkontsentratsioon substraadivabas inoku ­
leeritud mineraalses toitelahuses (mg DOC/l),  
C bt = DOC keskmine kontsentratsioon substraadivabas inokulee ­
ritud mineraalses toitelahuses ajahetkel t (mg DOC/l).  
Kõik kontsentratsioonid määratakse katseliselt.  
I.7.2.  Spetsiifilise analüüsi põhjal mõõdetud lagunemine  
Kui on olemas spetsiifilise analüüsi andmed, arvutatakse esmane 
biolagunemine valemist:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
kus: 
D t = lagunemisprotsent ajahetkel t, üldjuhul 28 päeva möödu ­
misel,  
S a = testaine jääk inokuleeritud toitelahuses katse lõpul (mg),  
S b = testaine jääk pimekatses vee/toitelahusega, kuhu on lisatud 
ainult testaine (mg).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
1.7.3.  Abiootiline lagunemine  
Abiootilise steriilse kontrollproovi kasutamisel arvutatakse protsen ­
tuaalne abiootiline lagunemine valemist:  
protsentuaalneabiootilinelagunemine  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
kus 
C s(o) = DOC kontsentratsioon steriilses kontrollproovis 0-päeval,  
C s(t) = DOC kontsentratsioon steriilses kontrollproovis päeval t.  
I.8. ARUANDLUS  
Katsearuanne sisaldab võimaluse korral järgmisi andmeid:  
— test- ja võrdlusaineid ning nende puhtusastet;  
— katsetingimusi;  
— inokulaadi kohta: tüüpi ja päritolu, kontsentratsiooni ja kohanda ­
mist, kui seda kasutati;  
— tööstuslike heitmete osakaalu ja iseloomu reovees, kui see on 
teada;  
— katse kestust ja temperatuuri;  
— vähelahustuvate testainete puhul nende käsitlemismeetodeid;  
— kasutatud katsemeetodit; meetodi mis tahes muudatusi tuleb 
teaduslikult põhjendada ja seletada;  
— andmeid;  
— kõiki täheldatud inhibitsiooninähte;  
— abiootilist lagunemist, kui seda täheldati;  
— spetsiifilise keemilise analüüsi andmeid, kui neid on;  
— vaheühendite analüüsiandmeid, kui neid analüüsiti;  
— test- ja võrdlusainete protsentuaalse lagunemise graafikut ajas; 
selgelt tuleks näidata ootefaas, lagunemisfaas, kümnepäevane 
aken ja tõus (1. liide). Kui katse vastab kvaliteedinõuetele, 
võib graafikul kasutada testainet sisaldavate kolbide lagunemis ­
protsentide keskmist väärtust;  
— lagunemisprotsenti kümnepäevase akna lõpus ja platool või katse 
lõpus.  
II OSA  DOC KÕRVALDAMISE KATSE  (meetod C.4-A)  
II.1. PÕHIMÕTE  
Kindlat kogust inokuleeritud mineraalset toitelahust kindla testaine 
kontsentratsiooniga (10–40 mg DOC/l), mis on ainus nominaalne 
orgaanilise süsiniku allikas, aereeritakse pimedas või hajutatud 
valguse käes 22 ± 2  o C juures.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Lagunemisprotsessi jälgitakse 28 päeva jooksul sagedaste DOC 
analüüsidega. Arvutatakse biolagundumise määr, väljendades kõrval ­
datud DOC kontsentratsiooni (mida on parandatud inokulaadiga null ­
proovi vastava väärtuse võrra) protsendina algkontsentratsioonist. Esmase biolagundumise määra võib arvutada ka inkubeerimise 
algul tehtud täiendava keemilise analüüsi põhjal.
 
II.2. MEETODI KIRJELDUS  
II.2.1.  Seade  
a) koonilised kolvid, mahuga nt 250 ml kuni 2 l, olenevalt DOC 
analüüsiks vajalikust mahust;  
b) kooniliste kolbide loksutusseade, mis on termostateeritud või 
asub püsiva temperatuuriga ruumis ja on piisava võimsusega 
aeroobsete tingimuste tagamiseks kõigis kolbides;  
c) sobivate membraanidega filtrimisseade;  
d) DOC analüsaator;  
e) lahustunud hapniku määramise seade;  
f) tsentrifuug.  
II.2.2.  Mineraalse toitelahuse valmistamine  
Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.  
10 ml lahust a segatakse 800 ml lahjendusveega, liidetakse 1 ml 
lahuseid b kuni d ja täiendatakse veega 1 liitrini.  
II.2.3.  Inokulaadi valmistamine ja kohandamine  
Inokulaadi saamisel võib kasutada mitmeid lähtematerjale: aktiiv ­
muda; reovett; pinnavett või mulda või nende segu.  
Vt punkte I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ja I.6.5.  
II.2.4.  Kolbide ettevalmistamine  
Näiteks viiakse 800 ml kogused mineraalset toitelahust 2 l kooni ­
listesse kolbidesse ning lisatakse eri kolbidesse küllaldased kogused test- ja võrdlusainete põhilahuseid, nii et saadakse kemi ­
kaalikontsentratsioon, mis vastab 10–40 mg DOC-ile liitris. Kont ­
rollitakse pH väärtusi ja viiakse need vajaduse korral 7,4ni. Kolvid 
inokuleeritakse aktiivmuda või muud päritolu inokulaadiga (vt I.6.4), lõpliku hõljumi kontsentratsiooniga kuni 30 mg/l. Valmista ­
takse ka inokulaadi kontrollproovid mineraalse toitelahusega, kuid 
ilma test- või võrdlusaineta.
 
Vajaduse korral kontrollitakse ühes kolvis testaine võimalikku inhi ­
beerivat mõju, inokuleerides võrreldavate kontsentratsioonidega test- ja võrdlusaine lahuse mineraalses toitelahuses.
 
Vajaduse korral kontrollitakse veel ühes steriilses kolvis testaine 
abiootilist lagunemist, kasutades aine inokuleerimata lahust (vt I.6.6).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Kui arvatakse, et testaine võib olulisel määral adsorbeeruda klaasil, 
mudal jne, tehakse eelkatse, kus hinnatakse adsorptsiooni tõenäolist 
ulatust ja seega ka katse sobivust antud ainele (vt tabelit 1). Selleks valmistatakse ette kolb testaine, inokulaadi ja steriliseeriva ainega.
 
Lahused kõigis kolbides täiendatakse mineraalse toitelahusega 1 
liitrini ja võetakse pärast segamist igast kolvist DOC algkontsentrat ­
siooni määramiseks proov (vt II.4 liide). Kolbide avad kaetakse nt alumiiniumfooliumiga nii, et see ei takista õhu vaba liikumist kolvi ja ümbritseva atmosfääri vahel. Seejärel asetatakse kolvid katse alus ­
tamiseks loksutisse.
 
II.2.5.  Kolbide arv tüüpilises katses  
Kolvid 1 ja 2: katsesuspensioon.  
Kolvid 3 ja 4: inokulaadi nullproov.  
Kolb 5: protseduuri kontrollproov.  
Eelistatavalt ja vajaduse korral:  
kolb 6: abiootiline steriilne kontrollproov,  
kolb 7: adsorptsiooni kontrollproov,  
kolb 8: mürgisuse kontrollproov.  
Vt ka punkti I.6.7.  
II.2.6.  Katse tegemine  
Kogu katse kestel määratakse igas kolvis kindlate ajavahemike järel 
DOC kontsentratsioon, piisava sagedusega kümnepäevase akna 
alguse määramiseks ja protsentuaalse kõrvaldamise määramiseks kümnepäevase akna lõpus. Igaks määramiseks võetakse ainult mini ­
maalne vajalik kogus katsesuspensiooni.
 
Enne proovide võtmist korvatakse vajaduse korral aurustumiskaod 
kolbides vajaliku koguse lahjendusvee lisamisega (I.6.1). Segu sega ­
takse enne proovi võtmist hoolikalt ja veendutakse, et nõu seintele sadestunud materjal enne proovi võtmist lahustub või suspendeerub. 
Kohe pärast võtmist proovid membraan-filtreeritakse või tsentrifuu ­
gitakse (vt II.4 liidet). Filtritud või tsentrifuugitud proovid analüüsi ­
takse samal päeval või säilitatakse 2–4
 o C juures kuni 48 tundi või 
pikaajalisemal säilitamisel alla –18  o C juures.  
II.3. ANDMED JA ARUANDLUS  
II.3.1.  Tulemuste käsitlemine  
Protsentuaalne lagunemine ajahetkel t arvutatakse punktis I.7.1 
(DOC määramine) ja vajaduse korral ka punktis 1.7.2 (spetsiifiline 
analüüs) kirjeldatud moel.  
Kõik tulemused esitatakse etteantud andmetabelis.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Tulemuste kehtivus  
Vt punkti I.5.2.  
II.3.3.  Aruandlus  
Vt punkti I.8.  
II.4. ANDMETABEL  
Järgneb andmetabeli näide.  
DOC KÕRVALDAMISE KATSE  
1. LABOR  
2. KATSE ALGUSKUUPÄEV  
3. TESTAINE  
Nimi:  
Põhilahuse kontsentratsioon: … (kemikaali sisaldus, mg/l)  
Algkontsentratsioon toitelahuses, t  0 : … (kemikaali sisaldus, 
mg/l)  
4. INOKULAAT  
Allikas:  
Töötlus:  
Kohandamine, kui seda tehti:  
Hõljumi kontsentratsioon segus: … mg/l  
5. SÜSINIKU MÄÄRAMINE  
Süsinikuanalüsaator:  
Kolvi nr DOC n päeva pärast (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testaine koos 
inokulaadiga 
1 a 1 
a 2 
a, keskmine 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, keskmine 
C b(t) ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Kolvi nr DOC n päeva pärast (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Inokulaadi null ­
proovid testaineta 
3 C 1 
C 2 
c, keskmine C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, keskmine 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. TÖÖTLEMATA ANDMETE HINDAMINE  
Kolvi nr Lagunemisprotsent in päeva möödumisel 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Keskmine (  1 ) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
( 1 ) D  1 ja D  2 ei tohiks olulise erinevuse puhul keskmistada.  
Märkus . Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasu ­
tada analoogseid tabeleid.  
7. ABIOOTILINE KONTROLLPROOV  (pole kohustuslik)  
Aeg (päevades) 
0 t  
DOC konts. steriilses kontrollproovis (mg/l) C s(o) C s(t) 
protsentuaalne abiootiline lagunemine  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPETSIIFILINE KEEMILINE ANALÜÜS  (pole kohustuslik)  
Testaine jääk katse lõpus (mg/l) Esmase lagunemise %  
Steriilne kontrollproov S  b ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Testaine jääk katse lõpus (mg/l) Esmase lagunemise %  
Inokuleeritud toitelahus S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
III OSA  MUUDETUD OECD SÕELKATSE  (meetod C.4-B)  
III.1. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Kindlat kogust inokuleeritud mineraalset toitelahust kindla testaine 
kontsentratsiooniga (10–40 mg DOC/l), mis on ainus nominaalne 
orgaanilise süsiniku allikas, inokuleeritakse 0,5 ml reoveega liitri lahuse kohta. Seejärel aereeritakse segu pimedas või hajutatud valguse käes 22 ± 2
 o C juures.  
Lagunemisprotsessi jälgitakse 28 päeva jooksul sagedaste DOC 
analüüsidega. Arvutatakse biolagundumise määr, väljendades kõrval ­
datud DOC kontsentratsiooni (mida on parandatud inokulaadiga null ­
proovi vastava väärtuse võrra) protsendina algkontsentratsioonist. 
Esmase biolagundumise määra võib arvutada ka inkubeerimise 
algul ja lõpul tehtud täiendava keemilise analüüsi põhjal.  
III.2. MEETODI KIRJELDUS  
III.2.1. Seadmed:  
a) koonilised kolvid, mahuga nt 250 ml kuni 2 l, olenevalt DOC 
analüüsiks vajalikust mahust;  
b) kooniliste kolbide loksutusseade, mis on termostateeritud või asub 
püsiva temperatuuriga ruumis ja on piisava võimsusega aeroob ­
sete tingimuste tagamiseks kõigis kolbides;  
c) sobivate membraanidega filtrimisseade;  
d) DOC analüsaator;  
e) lahustunud hapniku määramise seade;  
f) tsentrifuug.  
III.2.2.  Mineraalse toitelahuse valmistamine  
Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.  
10 ml lahust a segatakse 80 ml lahjendusveega, lisatakse 1 ml lahu ­
seid b–d ja täiendatakse veega 1 liitrini.  
Selles meetodis kasutatakse ainult 0,5 ml inokulaati liitri kohta, 
mistõttu võib olla vaja lisada toitelahusele mikroelemente ja kasvu ­
tegureid. Selleks lisatakse liitri lõpliku toitelahuse kohta 1 ml igast 
järgmisest lahusest:  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Mikroelementide lahus: 
Mangaansulfaattetrahüdraat, MnSO  4. 4H 2 O 39,9 mg 
Boorhape, H  3 BO 3 57,2 mg 
Tsinksulfaatheptahüdraat, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg 
Ammooniumheptamolübdaat, (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Fe-kelaat (FeCl  3 -etüleendiamiintetraäädikhape) 100,0 mg 
Lahustatakse vees ja täiendatakse lahjendusveega 
1 000 ml-ni. 
Vitamiinilahus: pärmiekstrakt 15,0 mg
 
Pärmiekstrakt lahustatakse 100 ml vees. Lahus steriliseeritakse filtri ­
misel läbi 0,2 μm membraani või valmistatakse vahetult enne kasu ­
tamist.  
III.2.3.  Inokulaadi valmistamine ja kohandamine  
Inokulaadi võib valmistada valdavalt olmereovett töötlevast puhas ­
tusjaamast või laborimõõdus seadmest väljuvast töödeldud reoveest. Vt punkte I.6.4.2 ja I.6.5.
 
Kasutatav kogus on 0,5 ml ühe liitri mineraalse toitelahuse kohta.  
III.2.4.  Kolbide ettevalmistamine  
Näiteks viiakse 800 ml kogused mineraalset toitelahust 2 l koonilis ­
tesse kolbidesse ning lisatakse eri kolbidesse küllaldased kogused test- ja võrdlusainete põhilahuseid, nii et saadakse kemikaalikontsen ­
tratsioon, mis vastab 10–40 mg DOC-ile liitris. Kontrollitakse pH 
väärtust ja viiakse see vajaduse korral 7,4ni. Kolvid inokuleeritakse 
0,5 ml reovee lisamisega liitri kohta (vt I.6.4.2). Valmistatakse ka inokulaadi kontrollproovid mineraalse toitelahusega, kuid ilma test- 
või võrdlusaineta.
 
Vajaduse korral kontrollitakse ühes kolvis testaine võimalikku inhi ­
beerivat mõju, inokuleerides võrreldavate kontsentratsioonidega test- 
ja võrdlusaine lahuse mineraalses toitelahuses.  
Vajaduse korral kontrollitakse veel ühes steriilses kolvis testaine 
abiootilist lagunemist, kasutades aine inokuleerimata lahust (vt I.6.6).  
Kui arvatakse, et testaine võib olulisel määral adsorbeeruda klaasil, 
mudal jne, tehakse eelkatse, kus hinnatakse adsorptsiooni tõenäolist 
ulatust ja seega ka katse sobivust antud ainele (vt tabelit 1). Selleks 
valmistatakse ette kolb testaine, inokulaadi ja steriliseeriva ainega.  
Lahused kõigis kolbides täiendatakse mineraalse toitelahusega 1 
liitrini ja võetakse pärast segamist igast kolvist DOC algkontsentrat ­
siooni määramiseks proov (vt II.4 liidet). Kolbide avad kaetakse näiteks alumiiniumfooliumiga nii, et see ei takista õhu vaba liikumist 
kolvi ja ümbritseva atmosfääri vahel. Seejärel asetatakse kolvid katse 
alustamiseks loksutisse.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Kolbide arv tüüpilises katses  
Kolvid 1 ja 2: katsesuspensioon.  
Kolvid 3 ja 4: inokulaadi nullproov.  
Kolb 5: protseduuri kontrollproov.  
Eelistatavalt ja vajaduse korral  
kolb 6: abiootiline steriilne kontrollproov,  
kolb 7: adsorptsiooni kontrollproov,  
kolb 8: mürgisuse kontrollproov.  
Vt ka punkti I.6.7.  
III.2.6.  Katse tegemine  
Kogu katse kestel määratakse igas kolvis kindlate ajavahemike järel 
DOC kontsentratsioon piisava sagedusega kümnepäevase akna alguse määramiseks ja protsentuaalse kõrvaldamise määramiseks kümnepäevase akna lõpus. Igaks määramiseks võetakse ainult mini ­
maalne vajalik kogus katsesuspensiooni.
 
Enne proovide võtmist korvatakse vajaduse korral aurustumiskaod 
kolbides vajaliku koguse lahjendusvee lisamisega (I.6.1). Segu sega ­
takse enne proovi võtmist hoolikalt ja veendutakse, et nõu seintele 
sadestunud materjal enne proovi võtmist lahustub või suspendeerub. 
Kohe pärast võtmist proovid membraan-filtreeritakse või tsentrifuu ­
gitakse (vt II.4 liidet). Filtritud või tsentrifuugitud proovid analüüsi ­
takse samal päeval või säilitatakse 2–4  o C juures kuni 48 tundi või 
pikaajalisemal säilitamisel alla –18  o C juures.  
III.3. ANDMED JA ARUANDLUS  
III.3.1.  Tulemuste käsitlemine  
Protsentuaalne lagunemine ajahetkel t arvutatakse punktis I.7.1 
(DOC määramine) ja vajaduse korral ka punktis I.7.2 (spetsiifiline analüüs) kirjeldatud moel.
 
Kõik tulemused esitatakse etteantud andmetabelis.  
III.3.2. Tulemuste kehtivus  
Vt punkti I.5.2.  
III.3.3. Aruandlus  
Vt punkti I.8.  
III.4. ANDMETABEL  
Järgneb andmetabeli näide.  
MUUDETUD OECD SÕELKATSE  
1. LABOR  
2. KATSE ALGUSKUUPÄEV  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. TESTAINE  
Nimi:  
Põhilahuse kontsentratsioon: … (kemikaali sisaldus, mg/l)  
Algkontsentratsioon toitelahuses, t  0 : … (kemikaali sisaldus, mg/l)  
4. INOKULAAT  
Allikas:  
Töötlus:  
Kohandamine, kui seda tehti:  
Hõljumi kontsentratsioon segus: … mg/l  
5. SÜSINIKU MÄÄRAMINE  
Süsinikuanalüsaator:  
Kolvi nr DOC n päeva möödumisel (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testaine koos 
inokulaadiga 
1 a 1 
a 2 
a, keskmine 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, keskmine 
C b(t) 
Inokulaadi null ­
proovid testaineta 
3 C 1 
C 2 
c, keskmine C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, keskmine 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. TÖÖTLEMATA ANDMETE HINDAMINE  
Kolvi nr Laguremisprotsent n päeva pärast 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Kolvi nr Laguremisprotsent n päeva pärast 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Keskmine (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 ja D  2 ei tohiks olulise erinevuse puhul keskmistada.  
Märkus.  Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasu ­
tada analoogseid tabeleid.  
7. ABIOOTILINE KONTROLLPROOV  (pole kohustuslik)  
Aeg (päevades) 
0 t  
DOC konts. steriilses kontrollproovis (mg/l) C S(o) C s(t) 
Protsentuaalne abiootiline lagunemine  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPETSIIFILINE KEEMILINE ANALÜÜS  (pole kohustuslik)  
Testaine jääk katse lõpus Esmase lagunemise %  
Steriilne kontrollproov S  b 
Inokuleeritud toitelahus S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
IV OSA CO  2 ERALDUMISE KATSE (meetod C.4-C)  
IV.1. PÕHIMÕTE  
Kindlat kogust inokuleeritud mineraalset toitelahust kindla testaine 
kontsentratsiooniga (10–20 mg DOC/l), mis on ainus nominaalne 
orgaanilise süsiniku allikas, aereeritakse süsinikdioksiidivaba õhu läbipuhumisega kindlal kiirusel pimedas või hajutatud valguse käes. Lagunemisprotsessi jälgitakse 28 päeva jooksul eralduva CO
 2 
määramise abil, viimane püütakse baarium- või naatriumhüdroksiidi 
ja mõõdetakse hüdroksiidi jäägi tiitrimise või anorgaanilise süsiniku määramise teel. Testainest tekkiv süsinikdioksiidi kogus (mida on parandatud inokulaadiga nullproovi vastava väärtuse võrra) väljenda ­
takse protsendina ThCO
 2 -st. Biolagundumise määra võib arvutada ka 
inkubeerimise algul tehtud täiendava DOC analüüsi põhjal.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
IV.2.1.  Seadmed  
a) 2–5liitrised kolvid peaaegu põhjani ulatuva aeratsioonitoru ja 
väljaviiguga;  
b) vähelahustuvate ainete uurimisel magnetsegajad;  
c) gaasipüüdurpudelid;  
d) õhuvoolu reguleerimise ja mõõtmise seade;  
e) seade süsinikdioksiidi väljapesemiseks süsinikdioksiidivaba õhu 
valmistamiseks; teise võimalusena võib kasutada õiges vahe ­
korras segu (20 % O  2 : 80 % N  2 ) CO  2 -vabast balloonihapnikust 
ja CO  2 -vabast balloonilämmastikust;  
f) seade süsinikdioksiidi määramiseks kas tiitrimeetriliselt või mis 
tahes põhimõttel töötava anorgaanilise süsiniku analüsaatori abil;  
g) membraanfiltratsiooniseade (ei ole kohustuslik);  
h) DOC analüsaator (ei ole kohustuslik).  
IV.2.2.  Mineraalse toitelahuse valmistamine  
Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.  
10 ml lahust a segatakse 800 ml lahjendusveega, lisatakse 1 ml 
lahuseid b kuni d ja täiendatakse veega 1 liitrini.  
IV.2.3.  Inokulaadi valmistamine ja kohandamine  
Inokulaadi saamisel võib kasutada mitmeid lähtematerjale: aktiiv ­
muda, reovett, pinnavett või mulda või nende segu.  
Vt punkte I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ja I.6.5.  
IV.2.4.  Kolbide ettevalmistamine  
Järgmises näites on esitatud mahulised kogused ja kaalutised viielii ­
triste kolbide jaoks 3 1 suspensiooniga. Väiksemate koguste kasuta ­
misel võib koguseid vastavalt muuta, kuid tagada tuleb täpseks 
mõõtmiseks piisav süsinikdioksiidi eraldumine.  
Igasse viieliitrisesse kolbi lisatakse 2 400 ml mineraalset toitelahust. 
Seejärel lisatakse sobiv kogus ettevalmistatud aktiivmuda (vt I.6.4.1 
ja I.6.5) nii, et hõljumi kontsentratsioon lõplikus 3 liitris inokulee ­
ritud segus ei ületa 30 mg/l. Teise võimalusena võib ettevalmistatud muda kõigepealt lahjendada mineraalse toitelahusega nii, et saadakse 
suspensioon kontsentratsiooniga 500 – 1 000 mg/l, misjärel lisatakse 
sellest kindel kogus viieliitrisesse kolbi nii, et saadakse lõppkontsen ­
tratsioon 30 mg/l; nõnda tagatakse suurem täpsus. Kasutada võib muid inokulaadiallikaid (vt I.6.4.2).
 
Inokuleeritud segusid aereeritakse üleöö CO  2 -vaba õhuga, et puhas ­
tada süsteem süsinikdioksiidist.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Eraldi paralleelkolbidele lisatakse kindla koguse põhilahuse näol test- 
ja võrdlusaine nii, et neist tulenev DOC või TOC kontsentratsioon 
on 10–20 mg/l; mõned kolvid jäetakse kemikaalita inokulaadi kont ­
rollproovideks. Vähelahustuvad testained lisatakse massi või mahu järgi otse kolbi või neid käsitletakse 3. liites kirjeldatud moel.
 
Vajaduse korral kontrollitakse ühes kolvis testaine võimalikku inhi ­
beerivat mõju, lisades kolbi ülejäänud kolbidega võrdses kontsentrat ­
sioonis nii test- kui ka võrdlusainet.  
Vajaduse korral kontrollitakse veel ühes steriilses kolvis testaine 
abiootilist lagunemist, kasutades aine inokuleerimata lahust (vt 
I.6.6). Proov steriliseeritakse sobivas kontsentratsioonis mürkaine 
lisamisega.  
Enne seda täiendatakse suspensioonid kõigis kolmes kolvis CO  2 - 
vaba õhuga aereeritud mineraalse toitelahusega 3 liitrini. Lisaks võib võtta proove DOC analüüsiks (vt II.4 liidet) ja/või spetsiifiliseks analüüsiks. Pesupudelid ühendatakse kolbide väljaviiguga.
 
Baariumhüdroksiidi kasutamisel ühendatakse iga viieliitrise kolviga 
järjestikku kolm pesupudelit, millest igaühes on 100 ml 0,0125 M baariumhüdroksiidlahust. Lahus ei tohi sisaldada sulfaadi ja karbo ­
naadi sadet ja selle kontsentratsioon tuleb määrata vahetult enne 
kasutamist. Naatriumhüdroksiidi kasutamisel ühendatakse järjestikku kaks püüdurit, kusjuures teine on kontrollpüüdur, mis peab näitama, kas esimene absorbeeris kogu süsinikdioksiidi. Sobivad ka seerumi ­
pudeli sulguriga pesupudelid. Igasse pudelisse lisatakse 200 ml 0,05 
M naatriumhüdroksiidi, mis on küllaldane kogu testaine täielikul lagunemisel tekkiva süsinikdioksiidi absorbeerimiseks. Isegi vahetult 
enne kasutamist valmistatud naatriumhüdroksiidi lahus sisaldab 
väikestes kogustes karbonaate, vastav viga korrigeeritakse nullproovi karbonaadikoguse lahutamisega.
 
IV.2.5.  Kolbide arv tüüpilises katses  
Kolvid 1 ja 2: katsesuspensioon.  
Kolvid 3 ja 4: inokulaadi nullproov.  
Kolb 5: protseduuri kontrollproov.  
Eelistatavalt ja vajaduse korral:  
kolb 6: abiootiline steriilne kontrollproov,  
kolb 7: mürgisuse kontrollproov,  
kolb 8: mürgisuse kontrollproov.  
Vt ka punkti I.6.7.  
IV.2.6.  Katse tegemine  
Katset alustatakse CO  2 -vaba õhu juhtimisega läbi suspensioonide 
kiirusega 30–100 ml/min. Süsinikdioksiidi absorbendist võetakse CO
 2 sisalduse määramiseks regulaarselt proove. Esimese kümne 
päeva jooksul on soovitatav teha analüüse iga kahe või kolme 
päeva tagant, seejärel iga viie päeva tagant kuni 28. päevani, nii et 
saab määrata kümnepäevase aknaperioodi.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
28. päeval võetakse proovid DOC ja spetsiifilise analüüsi jaoks (kui 
neid tehakse), mõõdetakse suspensioonide pH ja lisatakse igasse 
kolbi 1 ml kontsentreeritud vesinikkloriidhapet; kolbe aereeritakse üleöö, et kõrvaldada suspensioonides olev süsinikdioksiid. 29. päeval tehakse viimane eralduva süsinikdioksiidi analüüs.
 
CO 2 mõõtmise päevadel eemaldatakse kõige kolvipoolsem baarium ­
hüdroksiidiga pesupudel ja tiitritakse hüdroksiidilahust 0,05 M HCl- 
ga, kasutades indikaatorina fenoolftaleiini. Ülejäänud pesupudelid 
nihutatakse ühe koha võrra kolvile lähemale ja paigutatakse kauge ­
masse otsa uus pesupudel 100 ml värske 0,0125 M baariumhüdrok ­
siidiga. Tiitrimisi tehakse kas vastavalt vajadusele, näiteks siis, kui 
esimeses püüduris täheldatakse märgatavat sadet ja enne sademe 
teket teises pudelis või vähemalt kord nädalas. NaOH kasutamisel absorbendina võetakse süstlaga väike proov (mille suurus sõltub kasutatavast süsinikuanalüsaatorist) kolvipoolses pesupudelis olevast 
naatriumhüdroksiidilahusest. Proov süstitakse eraldunud süsinikdiok ­
siidi otseseks määramiseks süsinikuanalüsaatori anorgaanilise süsi ­
niku määrajasse.
 
Teise püüduri sisu analüüsitakse alles katse lõpus, et vajaduse korral 
lisada arvutustesse läbikandunud süsinikdioksiidi arvestav parandus.  
IV.3. ANDMED JA ARUANDLUS  
IV.3.1.  Tulemuste käsitlemine  
Püüdurisse kogutud CO  2 kogus leitakse tiitrimisel järgmise valemi 
järgi:  
mgCO  2 = (100 × C  B – 0,5 × v × C  A ) × 44  
kus: 
V = 100 ml absorbeerimislahuse tiirimiseks kulunud HCl maht 
(ml),  
C B = baariumhüdroksiidilahuse kontsentratsioon (M),  
C A = vesinikkloriidhappelahuse kontsentratsioon (M),  
kui C  B on 0,0125 M ja C  A on 0,05 M, kulub 100 ml baariumhü ­
droksiidi tiitrimiseks 50 ml lahust ja CO  2 mass leitakse järgmisest 
valemist:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü tiitrimiseks kulunud HCl  ðmlÞ ¼ 1; 1 Ü ml HCI  
Seega on teisendustegur tekkinud CO  2 massi (mg) arvutamisel tiitri ­
misel kulunud HCl mahust (ml) 1,1.  
Vastavate tiitrimisandmete põhjal arvutatakse ainult inokulaadist 
tekkiva CO  2 ning inokulaadi ja testaine segust tekkiva CO  2 massid, 
nende vahe ongi ainult testainest tekkiva CO  2 mass.  
Näiteks kui inokulaadiga kulub tiitrimisele 48 ml ning inokulaadi ja 
testaine seguga 45 ml,  
CO 2 inokulaadist = 1,1 × (50–48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 inokulaadi ja testaine segust = 1,1 × (50–45) = 5,5 mg  
on testainest tekkiva CO  2 mass 3,3 mg.  
Biolagundumise protsent arvutatakse järgmise valemi järgi:  
lagunemisprotsent  ¼ eralduva CO  2 mass ðmgÞ Ü 100 
ThCO  2 Ü lisatud testainemass  ðmgÞ 
lagunemisprotsent  ¼ eralduva CO  2 mass ðmgÞ Ü 100 
katses lisatud TOC ðmgÞ Ü 3; 67 
kus 3,67 on teisendustegur (44/12) üleminekul süsiniku massilt süsi ­
nikdioksiidi massile.  
Lagunemisprotsent mis tahes ajavahemiku järel leitakse kõigi mõõt ­
mispäevale eelnevate päevade kohta arvutatud protsentuaalsete ThCO
 2 väärtuste liitmisel.  
Naatriumhüdroksiidiga absorbeerimisel arvutatakse tekkinud süsinik ­
dioksiidi kogus, väljendatuna anorgaanilise süsinikuna (IC) milli ­
grammides, korrutades IC kontsentratsiooni absorbendis absorbendi mahuga.
 
Lagunemisprotsent arvutatakse järgmise valemi järgi:  
% of ThCO  2 ¼ IC katsekolvi ðmgÞ Ä IC nullprooviðmgÞ 
Katseainen a lisatud TOC ðmgÞ Ü 100  
DOC kõrvaldamise võib arvutada vastavalt punktile I.7. Need ja kõik 
ülejäänud tulemused registreeritakse etteantud andmetabelis.  
IV.3.2.  Tulemuste kehtivus  
Katseaine – mineraalse toitelahuse suspensiooni anorgaanilise süsi ­
niku sisaldus katse algul peab olema vähem kui 5 % süsiniku üldsi ­
saldusest (TC) ja eraldunud CO  2 summaarne kogus inokulaadiga 
nullproovi puhul ei tohiks katse lõpul üldjuhul ületada 40 mg/l lahuse kohta. Kui saadavad väärtused on suuremad kui 70 mg CO
 2 /l, tuleks andmed ja katsetehnika kriitiliselt üle vaadata.  
Vt ka punkti I.5.2.  
IV.3.3.  Aruandlus  
Vt punkti I.8.  
IV.4. ANDMETABEL  
Järgneb andmetabeli näide.  
SÜSINIKDIOKSIIDI ERALDUMISE KATSE  
1. LABOR  
2. KATSE ALGUSKUUPÄEV  
3. TESTAINE  
Nimi:  
Põhilahuse kontsentratsioon: ... (kemikaali sisaldus, mg/l)  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Algkonts. toitelahuses: ... (kemikaali sisaldus, mg/l)  
Kolbi lisatud süsiniku koguhulk: ...mg C  
ThCO  2 :...mg CO  2 
4. INOKULAAT  
Allikas:  
Töötlus:  
Kohandamine, kui seda tehti:  
Hõljumi kontsentratsioon segus: ... mg/l  
5. SÜSINIKDIOKSIIDI ERALDUMINE JA LAGUN ­
DUVUS  
Meetod: Ba(OH)2/NaOH/muu  
Aeg 
(päevades) Tekkinud CO  2 
Katselahus (mg) Tekkinud CO  2 
nullproov (mg) Tekkinud CO  2 kumu­
latiivne (mg) 
(ja nullproovi vahe 
keskmine) ThCO  2 
kumulatiiv ne  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 keskmine 3 
4 keskmine 1 2 1 2 keskmine  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Märkus.:  Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasu ­
tada analoogseid tabeleid.  
5. SÜSINIKU ANALÜÜS  (pole kohustuslik)  
Süsinikuanalüsaator:  
Aeg (päevades) Nullproov (mg/l) Testaine (mg/l)  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) või inkubatsiooniperioodi lõpus.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
DOC Kõrvaldamisprotsent  ¼ Í 1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C t Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. ABIOOTILISE LAGUNEMISE KATSE  (pole kohustuslik)  
abiootilise lagunemise %  ¼ CO  2 Ä CO  2 teke steriilses kolvis 28 paeva jarel  ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
V. OSA  MANOMEETRILISE RESPIROMEETRIA KATSE  
(meetod C.4-D)  
V.1. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Kindlat kogust inokuleeritud mineraalset toitelahust kindla testaine 
kontsentratsiooniga (100 mg/l testainet, ThOD-ga vähemalt 50–100 mg/l), mis on ainus nominaalne orgaanilise süsiniku allikas, 
segatakse kuni 28 päeva kinnises kolvis konstantsel temperatuuril 
(kõikumisega ± 1
 o C või alla selle). Hapniku tarbimine määratakse 
kas konstantse gaasiruumala hoidmiseks vajaliku (elektrolüüsil saadud) hapniku koguse mõõtmisel või ruumala või rõhu (või 
mõlema) muutuse järgi seadmes. Tekkiv süsinikdioksiid absorbeeri ­
takse kaaliumhüdroksiidi või muu sobiva absorbendi lahuses. Test ­
aine hapnikutarve (mida on parandatud paralleelse inokulaadiga null ­
proovi vastava väärtuse võrra) väljendatakse protsendina ThOD-st 
või KHT-st. Lisaks võib inkubeerimise algul ja lõpul tehtud täien ­
dava keemilise analüüsi põhjal arvutada ka esmase biolagundumise määra ja DOC analüüsi põhjal lõpliku biolagundumise määra.
 
V.2. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
V.2.1.  Seadmed  
a) sobiv respiromeeter;  
b) termostaat täpsusega ± 1  o C või täpsem;  
c) membraanfiltratsiooni seade (pole kohustuslik);  
d) süsinikuanalüsaator (pole kohustuslik).  
V.2.2.  Mineraalse toitelahuse valmistamine  
Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.  
10 ml lahust a segatakse 800 ml lahjendusveega, lisatakse 1 ml 
lahuseid b kuni d ja täiendatakse veega 1 liitrini.  
V.2.3.  Inokulaadi valmistamine ja kohandamine  
Inokulaadi saamisel võib kasutada mitmeid lähtematerjale: aktiiv ­
muda, reovett, pinnavett ja mulda või nende segu.  
Vt punkte I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ja I.6.5.  
V.2.4.  Kolbide ettevalmistamine  
Põhilahustest valmistatakse eraldi test- ja võrdlusainete lahused 
mineraalses toitelahuses, üldjuhul kontsentratsiooniga 100 mg 
kemikaali/liitris (ThOD-ga vähemalt 50–100 mg/l).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
ThOD arvutatakse ammooniumisoolade moodustumise põhjal, välja 
arvatud juhul, kui eeldatakse nitrifikatsiooni toimumist, sel juhul 
eeldatakse arvutustes nitraadi moodustumist (vt II liidet punkti 2).  
Kontrollitakse pH väärtusi ja viiakse need vajaduse korral 7,4± 0,2ni.  
Vähelahustuvad ained tuleks lisada hilisemas faasis (vt allpool).  
Testaine mürgisuse kontrollimisel valmistatakse ette veel üks lahus, 
mis sisaldab üksikute lahustega võrdses kontsentratsioonis nii test- kui ka võrdlusainet.
 
Kui on vaja määrata füüsikalis-keemiline hapnikutarve, valmistatakse 
testaine lahus ThOD-ga üldjuhul 100 mg/l, mis steriliseeritakse sobiva mürkaine lisamisega (vt I.6.6).
 
Vähemalt kahtedesse paralleelkolbidesse lisatakse vajalikud kogused 
test- ja võrdlusainete lahuseid. Täiendavad kolvid valmistatakse ette ainult mineraalse toitelahusega (inokulaadi kontrollproovid) ning 
vajaduse korral test- ja võrdlusaine seguga ja steriilse lahusega.
 
Vähelahustuvad testained lisatakse selles faasis massi või mahu järgi 
otse kolbi või neid käsitsetakse 3. liites kirjeldatud moel. CO  2 - 
püüduri kambritesse lisatakse kaaliumhüdroksiidi, naatronlubja graa ­
nuleid või muud absorbenti.  
V.2.5.  Kolbide arv tüüpilises katses  
Kolvid 1 ja 2: katsesuspensioon.  
Kolvid 3 ja 4: inokulaadi nullproov.  
Kolb 5: protseduuri kontrollproov.  
Eelistatavalt ja vajaduse korral:  
kolb 6: steriilne kontrollproov,  
kolb 7: mürgisuse kontrollproov.  
Vt ka punkti I.6.7.  
V.2.6.  Katse tegemine  
Kolbidel lastakse jõuda soovitud temperatuurini ning asjaomased 
kolvid inokuleeritakse ettevalmistatud aktiivmuda või muud päritolu inokulaadiga lõpliku hõljumi kontsentratsiooniga kuni 30 mg/l. Katseaparatuur pannakse kokku, käivitatakse segaja ning kontrolli ­
takse seadme hermeetilisust ja alustatakse hapnikutarbe mõõtmist. 
Üldjuhul ei ole vaja katseaparatuuri rohkem jälgida, välja arvatud vajalike tulemuste registreerimine ja igapäevase temperatuuri- ja segamisrežiimi kontrollimine.
 
Hapnikutarve arvutatakse regulaarselt ja sageli loetavate näitude 
põhjal, seadme tootja ette nähtud meetodite abil. Inkubatsioonipe ­
rioodi lõpus, tavaliselt 28 päeva pärast, mõõdetakse kolbide pH, 
eriti kui hapnikutarve on madal või kõrgem kui ThODNH  4 (lämmas­
tikku sisaldavate ühendite puhul).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Vajaduse korral võetakse respiromeetri kolbidest katse alguses ja 
lõpus proove DOC analüüsiks või spetsiifilise aine analüüsiks (vt 
II.4 liidet). Pärast proovi võtmist katse alguses peab teada olema kolbi jääva katsesuspensiooni maht. Kui hapniku tarbimine on tingitud lämmastikku sisaldavast testainest, mõõdetakse nitriti ja 
nitraadi kontsentratsiooni tõus 28 päeva jooksul ja arvutatakse 
välja nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus (V liide).
 
V.3. ANDMED JA ARUANDLUS  
V.3.1.  Tulemuste käsitlemine  
Testaine hapnikutarve (mg) kindlaksmääratud aja möödumisel 
(millest on lahutatud inokulaadiga nullproovi vastav näitaja sama 
aja kohta) jagatakse kasutatud testaine massiga. Nii saadakse BHT 
väärtus, mis on väljendatud hapniku massina (mg) testaine massi (mg) suhtes, st
 
BHT ¼ ðTestaine hapnikutar ve  ðmgÞ Ä nullproovi hapnikutar ve  ðmgÞÞ 
ðTestaine kogus kolvis  ðmgÞÞ 
= hapnikutarve (mg) testaine massiühiku (mg) kohta.  
Biolagundumise protsent arvutatakse kas valemist:  
biolagundumise protsent  ¼ % ThOD ¼ BHTðO 2 ðmgÞ=testain e ðmgÞÞ 
ThODðO 2 ðmgÞ=testain eðmgÞÞ Ü 100 
või valemist  
% COD ¼ BODðO 2 ðmgÞ=testain e ðmgÞÞ 
CODðO 2 ðmgÞ=testain e ðmgÞÞ Ü 100 
Tuleb märkida, et kui need kaks meetodit ei anna alati samasugust 
tulemust, on eelistatav kasutada esimest meetodit.  
Lämmastikku sisaldavate testainete puhul tuleb kasutada asjakohast 
ThOD-d (NH  4 või NO  3 ) vastavalt nitrifikatsiooni teadaolevale või 
eeldatavale toimumisele. Kui nitrifikatsioon toimub, kuid ei ole täielik, arvutatakse nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus välja nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutustest (V liide).
 
Valikulistel orgaanilise süsiniku ja/või spetsiifilise aine määramistel 
arvutatakse lagunemisprotsent punktis I.7 kirjeldatud moel.  
Kõik tulemused registreeritakse etteantud andmetabelis.  
V.3.2.  Tulemuste kehtivus  
Inokulaadiga nullproovi hapnikutarve 28 päeva jooksul on üldjuhul 
20–30 mg O  2 /l ega tohiks ületada 60 mg/l. Kui saadavad väärtused 
on suuremad kui 60 mg/l, tuleks andmed ja katsetehnika kriitiliselt üle vaadata. Kui pH jääb väljapoole vahemikku 6–8,5 ja testaine hapnikutarve on alla 60 %, tuleks katset testaine madalama kontsen ­
tratsiooniga korrata.
 
Vt ka punkti I.5.2.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Aruandlus  
Vt punkti I.8.  
V.4. ANDMETABEL  
Järgneb andmetabeli näide.  
MANOMEETRILISE RESPIROMEETRIA KATSE  
1. LABOR  
2. KATSE ALGUSKUUPÄEV  
3. TESTAINE  
Nimi:  
Põhilahuse kontsentratsioon: ... mg/l  
Algkontsentratsioon toitelahuses, C  O : ... mg/l  
Lahuse maht katsekolvis (V): ... ml  
ThOD või KHT: ... O  2 (mg)/testaine (mg) (NH  4 või NO  3 ) 
4. INOKULAAT  
Allikas:  
Töötlus:  
Kohandamine, kui seda tehti:  
Hõljumi kontsentratsioon segus: ... mg/l  
5. HAPNIKUTARVE: BIOLAGUNDUVUS  
Aeg (päevades) 
0 7 14 21 28  
Hapnikutarve 
(mg) testaine 1 
2 
a, keskmine 
Hapnikutarve 
(mg) nullproov 3 
4 
b, keskmine 
Parandatud 
BHT (mg) (a 1 –b m ) 
(a 2 –b m ) 
BHT mg test ­
aine kohta ða 1 Ä bÞ
CoV 
ða 2 Ä bÞ
CoV ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Aeg (päevades) 
0 7 14 21 28  
Lagunemisprot ­
sent 
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Keskmine (*)  
V = lahuse maht katsekolvis 
(*) D  1 ja D  2 ei tohiks olulise erinevuse puhul keskmistada.  
NB: Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasutada 
analoogseid tabeleid.  
6. NITRIFIKATSIOONI ARVESTAV PARANDUS  (vt V 
liidet)  
Päev 0 28 Erinevus  
i) Nitraadi kontsentratsioon (mg N/liitris), (N) 
ii) Hapnikuekvivalent (4,57 × N × V) (mg) — — 
iii) Nitriti kontsentratsioon (mg N/liitris) (N) iv) Hapnikuekvivalent (3,43 × N × V) (mg) — — ii + iv) Summaarne hapnikuekvivalent — —
 
7. SÜSINIKU ANALÜÜS  (pole kohustuslik)  
Süsinikuanalüsaator:  
Aeg (päevades) Nullproov (mg/l) Testaine mg/l  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (  1 ) (C  blt ) (C  t ) 
( 1 ) või inkubatsioonniperioodi lõpus  
% DOC kõrvaldamisprotsent  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100 
8. SPETSIIFILINE AINE  (pole kohustuslik)  
S b = kontsentratsioon füüsikalis-keemilises (steriilses) kontroll ­
proovis 28 päeva möödumisel.  
S a = kontsentratsioon inokuleeritud kolvis 28 päeva möödu ­
misel.  
% biolagundumise protesent  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. ABIOOTILISE LAGUNEMISE KATSE  (pole kohustuslik)  
a = hapnikutarve steriilsetes kolbides 28 päeva möödumisel 
(mg)  
hapnikutarve testaine mg kohta  ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(vt jaotiseid 1 ja 3)  
abiootilise lagunemise protsent  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
VI OSA  KINNISE PUDELI KATSE  (meetod C.4-E)  
VI.1. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Testaine lahus mineraalses toitelahuses, üldjuhul kontsentratsiooniga 
2–5 mg/l, inokuleeritakse suhteliselt väikese arvu segapopulatsiooni 
mikroorganismidega ja seda hoitakse täiesti täis suletud pudelites konstantsel temperatuuril. Lagunemisprotsessi jälgitakse 28 päeva jooksul lahustunud hapniku analüüsimisega. Testaine hapnikutarve 
(mida on parandatud paralleelse inokulaadiga nullproovi vastava 
väärtuse võrra) väljendatakse protsendina ThOD-st või KHT-st.
 
VI.2. MEETODI KIRJELDUS  
VI.2.1.  Seadmed  
a) Klaaskorkidega BHT pudelid mahuga näiteks 250–300 ml.  
b) Vesivann või inkubaator pudelite termostateerimiseks konstantsel 
temperatuuril (± 1  o C või täpsem) pimedas.  
c) Suured klaaspudelid (2–5 l) lahuste valmistamiseks ja BHT pude ­
lite täitmiseks.  
d) Hapnikuelektrood ja -mõõtur või seadmed ja reaktiivid Winkleri 
tiitrimiseks.  
VI.2.2.  Mineraalse toitelahuse valmistamine  
Põhilahuste valmistamist vt I.6.2.  
1 (üks) ml lahuseid a kuni d segatakse kokku ja täiendatakse lahjen ­
dusveega 1 liitrini.  
VI.2.3.  Inokulaadi valmistamine  
Inokulaat valmistatakse üldjuhul valdavalt olmereovett töötlevast 
puhastusjaamast või laborimõõdus seadmest väljuvast töödeldud reoveest. Veel üks võimalik inokulaadi allikas on pinnavesi. 
Üldjuhul lisatakse liitri lahuse kohta üks tilk (0,05 ml) kuni 5 ml 
filtraati; antud reoveele vastava optimaalse koguse määramiseks võib vaja olla eelkatseid (vt I.6.4.2 ja I.6.5).
 
VI.2.4.  Kolbide ettevalmistamine  
Mineraalset toitelahust aereeritakse tugevalt vähemalt 20 minutit. 
Igas katseseerias tuleb kasutada ainult samast partiist pärinevat mine ­
raalset toitelahust. Üldjuhul on lahus kasutusvalmis pärast 20tunnist katsetemperatuuril seismist. Kontrollimiseks määratakse lahustunud hapniku kontsentratsioon, mis peaks 20
 o C juures olema umbes 
9 mg/l. Kõik ülekande- ja täitmisoperatsioonid õhuga küllastatud 
toitelahusega tuleb teha mullivabalt, näiteks sifooni abil.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Test- ja võrdlusainete uurimiseks üheaegsetes katseseeriates valmis ­
tatakse ette paralleelsed BHT pudelite rühmad. Katses kasutatakse 
küllaldast arvu BHT pudeleid, sealhulgas inokulaadiga nullproove, nii et soovitatavate ajavahemike, näiteks 0, 7, 14, 21 ja 28 päeva järel, saab hapnikutarvet mõõta vähemalt kahes paralleelis. Kümne ­
päevase akna määramiseks võib vaja olla täiendavaid pudeleid.
 
Suured pudelid täidetakse põhjalikult aereeritud mineraalse toitelahu ­
sega umbes ühe kolmandiku ulatuses. Seejärel lisatakse eraldi suur ­
tesse pudelitesse küllaldased kogused test- ja võrdlusainete põhilahu ­
seid nii, et kemikaalide lõplik kontsentratsioon ei ületa üldjuhul 10 mg/l. Täiendavas suures pudelis olevale kemikaalivabale kontroll ­
toitelahusele kemikaale ei lisata.
 
Et mitte piirata inokulaadi aktiivsust, ei tohi lahustunud hapniku 
kontsentratsioon BHT pudelites langeda alla 0,5 mg/l. Seega on testaine kontsentratsioon piiratud umbes 2 mg/l. Raskestilagunevate ja madala ThOD-ga ühendite puhul võib siiski kasutada kontsentrat ­
siooni 5–10 mg/l. Mõningatel juhtudel võib soovitada teha paralleel ­
seid katseseeriaid kahe erineva testaine kontsentratsiooniga, näiteks 2 ja 5 mg/l. ThOD arvutatakse üldjuhul ammooniumisoolade moodus ­
tumise põhjal, kuid kui eeldatakse nitrifikatsiooni toimumist või selle 
toimumine on teada, arvutatakse see nitraadi moodustumise põhjal 
(ThODNO
 3 : vt II liite punkti 2). Kui nitrifikatsioon toimub, kuid ei 
ole täielik, parandatakse tulemust, arvestades analüütiliselt leitud nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutusi (vt V liidet).
 
Testaine mürgisuse uurimisel (näiteks madala biolagunduvuse tule ­
muse puhul) on vaja veel üht pudeliseeriat.  
Valmistatakse ette veel üks suur pudel, mis sisaldab aereeritud mine ­
raalset toitelahust (umbes 1/3 pudeli mahust) ja ülejäänud suurte pudelitega võrdses kontsentratsioonis nii test- kui ka võrdlusainet.
 
Lahused suurtes pudelites inokuleeritakse töödeldud reoveega (1 tilk 
ehk umbes 0,05 ml kuni 5 ml/l) või muu inokulaadi, nagu jõeveega 
(vt I.6.4.2). Seejärel täiendatakse lahused aereeritud mineraalse toite ­
lahusega vajaliku mahuni, kasutades piisava segunemise saavutami ­
seks pudeli põhjani ulatuvat voolikut.  
VI.2.5.  Kolbide arv tüüpilises katses  
Tüüpilises katses kasutatakse järgmisi pudeleid:  
— vähemalt 10 pudelit testaine ja inokulaadiga (katsesuspensioon);  
— vähemalt 10 pudelit ainult inokulaadiga (inokulaadiga nullproov);  
— vähemalt 10 pudelit võrdlusaine ja inokulaadiga (protseduuri 
kontrollproov),  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— ning vajaduse korral 6 pudelit nii testaine, võrdlusaine kui ka 
inokulaadiga (mürgisuse kontrollproov). Kümnepäevase akna 
määramiseks võib aga vaja olla umbes kahekordset arvu pude ­
leid. 
VI.2.6. Katse tegemine  
Kõik valmis lahused viiakse kohe vastavasse BHT pudelite rühma, 
kasutades voolikut, mille ots on BHT pudelite täielikuks täitmiseks 
vastava suure pudeli alumises veerandis (mitte põhjas). Õrnalt kopu ­
tades eemaldatakse õhumullid. Nullhetkel määratakse kõigis pudelites Winkleri meetodi või hapnikuelektroodi abil kohe lahustunud hapnik. Proovid võib mangaan(II)sulfaadi ja naatriumhüdroksiidi (esimese 
Winkleri reaktiivi) abil konserveerida hilisemaks analüüsiks, kasutades 
Winkleri meetodit. Hoolikalt suletud pudeleid, milles hapnik on fiksee ­
ritud pruuni mangaan(III)oksiidi hüdraadina, hoitakse enne Winkleri meetodi järgmiste etappidega jätkamist pimedas 10–20
 o C juures kõige 
rohkem 24 tundi. Ülejäänud paralleelpudelid suletakse õhumullide 
pudelitesse jäämise vältimiseks korgiga ja inkubeeritakse 20  o C juures 
pimedas. Iga katseseeriaga peab kaasnema täielik paralleelseeria inoku ­
leeritud, testaineta toitelahuse uurimiseks. Igast seeriast võetakse 28 
päeva jooksul kindlate ajavahemike järel (vähemalt kord nädalas) 
korraga vähemalt kaks pudelit lahustunud hapniku määramiseks.  
Nädalaste vahedega võetud proovid võimaldavad määrata kõrvalda ­
misprotsendi 14päevases aknas, 3–4päevaste vahedega võetud 
proovid võimaldavad määrata kümnepäevase akna, selleks on vaja 
umbes kaks korda rohkem pudeleid.  
Lämmastikku sisaldavate testainete puhul tuleb tulemustesse teha 
nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus. Selleks määratakse 
hapnikuelektroodi abil lahustunud hapniku kontsentratsioon ja 
võetakse BHT pudelist nitriti ja nitraadi analüüsiks proov. Nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni tõusu järgi arvutatakse välja vastav hapni ­
kutarve (vt V liidet).
 
VI.3. ANDMED JA ARUANDLUS  
VI.3.1.  Tulemuste käsitlemine  
Kõigepealt arvutatakse iga ajavahemiku BHT, lahutades testaine 
hapnikutarbest inokulaadiga nullproovi hapnikutarbe (mg/l). Suhte ­
lise BHT (hapniku ja testaine masside (mg) suhte) saamiseks jaga ­
takse parandatud hapnikutarve testaine kontsentratsiooniga (mg/l). 
Protsentuaalne biolagunduvus arvutatakse suhtelise BHT jagamisel 
suhtelise (II liite punktis 2 kirjeldatud viisil arvutatud) ThOD-ga või KHT-ga (mis on määratud analüütiliselt, vt II.3 liidet), seega:
 
BOD ¼ Testaine hapnikutar ve  ðmgÞ Ä nullproovi hapnikutar  ðmgÞ 
Testaine kogus kolvis  ðmgÞ ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= hapnikutarve (mg) testaine massiühiku (mg) kohta  
lagunemisprotsent  ¼ BHTðO 2 ðmgÞ=testain e ðmgÞÞ 
ThODðO 2 ðmgÞ=testaineðmgÞÞ Ü 100  
või 
lagunemisprotsent  ¼ BHTðO 2 mg=testain e mgÞ 
KHTðO 2 mg=testain e mgÞ Ü 100  
Tuleb märkida, et kui need kaks meetodit ei anna alati samasugust 
tulemust, on eelistatav kasutada viimast meetodit.  
Lämmastikku sisaldavate testainete puhul tuleb kasutada asjakohast 
ThOD-d (NH  4 või NO  3 ) vastavalt nitrifikatsiooni teadaolevale või 
eeldatavale toimumisele (II liite punkt 2). Kui nitrifikatsioon toimub, 
kuid ei ole täielik, arvutatakse nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav parandus välja nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutustest (V liide).
 
VI.3.2.  Tulemuste kehtivus  
Inokulaadiga nullproovi hapnikutarve 28 päeva jooksul ei tohiks olla 
suurem kui 1,5 mg/l. Kui saadavad väärtused on suuremad, tuleks katsetehnika üle vaadata. Lahustunud hapniku kontsentratsioon 
katsepudelites ei tohiks millalgi langeda alla 0,5 mg/l. Sellised 
madalad hapnikusisaldused saab kehtivaks lugeda ainult juhul, kui kasutatav lahustunud hapniku määramise meetod võimaldab selliseid sisaldusi täpselt määrata.
 
Vt ka punkti I.5.2.  
VI.3.3.  Aruandlus  
Vt punkti I.8.  
VI.4. ANDMETABEL  
Järgneb andmetabeli näide.  
KINNISE PUDELI KATSE  
1. LABOR  
2. KATSE ALGUSKUUPÄEV  
3. TESTAINE  
Nimi:  
Põhilahuse kontsentratsioon: ... mg/l  
Algkontsentratsioon pudelis: ... mg/l  
ThOD või KHT: ... O  2 (mg)/testaine (mg)  
4. INOKULAAT  
Allikas:  
Töötlus:  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Kohandamine, kui seda tehti:  
Kontsentratsioon katsesegus: ... mg/l  
5. LAHUSTUNUD HAPNIKU MÄÄRAMINE  
Meetod: Winkler/elektrood  
Kolbide analüüsitulemused  
Inkubatsiooniaeg (d) Lahustunud hapnik (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Nullproov (kemikaa ­
lita) 1 C  1 
2 C  2 
Keskmine 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Testaine 1 a  1 
2 a  2 
Keskmine 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Märkus. Võrdlusaine ja mürgisuse kontrollproovide jaoks võib kasu ­
tada analoogseid tabeleid.  
6. NITRIFIKATSIOONI ARVESTAV PARANDUS  (vt V 
liidet ) 
Inkubatsiooniaeg (d) 0 n  1 n 2 n 3 
i) Nitraadi kontsentratsioon (mg N/liitris) 
ii) Nitraadi kontsentratsiooni muutus (mg N/liitris) — iii) Hapnikuekvivalent (mg/l) — iv) Nitriti kontsentratsioon (mg N/liitris) v) Nitriti kontsentratsiooni muutus (mg N/liitris) — vi) Hapnikuekvivalent (mg/l) — iii + vi) Summaarne hapnikuekvivalent (mg/l) —
 
7. LAHUSTUNUD HAPNIKU TARBIMINE: LAGUNEMIS ­
PROTSENT  
Tarbimine n päeva pärast (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
1. KOLB: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
2. KOLB: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Tarbimine n päeva pärast (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
1. KOLB: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
katsekonts : Ü ThOD kemikaal 
2. KOLB: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
katsekonts : Ü ThOD kemikaal 
keskmine %D (*) =  D 1 þ D 2 
2 
(*) Kordustulemuste olulise erinevuse puhul mitte keskmistada.  
m to = väärtus katsekolvis ajahetkel 0  
m tx = väärtus katsekolvis ajahetkel x  
m b0 = nullproovi keskmine väärtus ajahetkel 0  
m bx = nullproovi keskmine väärtus ajahetkel x  
Teha tuleb ka nitrifikatsiooni arvestav parandus jaotise 6 punktist 
iii + vi.  
8. LAHUSTUNUD HAPNIKU TARBIMINE NULLPROO ­
VIDES  
Nullproovi hapnikutarve: (m  b0 – m  b28 ) mg/l. Nullproovi hapni ­
kutarve on oluline katse kehtivuse seisukohalt. See peaks 
olema alla 1,5 mg/l.  
VII OSA  MITI KATSE  (meetod C.4-F)  
VII.1. PÕHIMÕTE  
28 päeva kestel mõõdetakse automaatselt pimedas, suletud respiro ­
meetris 25 ± 1  o C juures oleva, pidevalt segatava, testainest ja mine ­
raalsest toitelahusest koosneva, spetsiaalselt kasvatatud, adapteeri ­
mata mikroorganismidega inokuleeritud lahuse või suspensiooni hapnikutarvet. Tekkinud süsinikdioksiid absorbeeritakse naatronlub ­
jaga. Biolagunduvust väljendatakse nullproovi hapnikutarbe võrra 
parandatud hapnikutarbe protsendina teoreetilisest hapnikutarbest 
(ThOD). Lisaks arvutatakse inkubeerimise algul ja lõpul tehtava täiendava keemilise analüüsi ja soovi korral ka DOC analüüsi põhjal esmase biolagundumise määr.
 
VII.2. MEETODI KIRJELDUS  
VII.2.1.  Seadmed  
a) Automaatne elektrolüütiline BHT mõõtur või respiromeeter, tava ­
liselt kuue 300 ml pudeliga ja topsidega CO  2 absorbendi jaoks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Püsiva temperatuuriga ruum ja/või veevann temperatuuriga 
25 o C, lubatava kõikumisega ± 1  o C või alla selle.  
c) Membraanfiltratsiooni seade (pole kohustuslik).  
d) Süsinikuanalüsaator (pole kohustuslik).  
VII.2.2.  Mineraalse toitelahuse valmistamine  
Analüüsipuhastest reaktiividest ja veest (1.6.1) valmistatakse järg ­
mised põhilahused: 
a) Kaaliumdivesinikfosfaat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaaliumvesinikfosfaat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinaatriumvesinikfosfaatdodekahüdraat, Na  2 HPO  4 
· 12H  2 O 44,60 g 
Ammooniumkloriid, NH  4 Cl 1,70 g 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini 
Lahuse pH peaks olema 7,2 
b) Magneesiumsulfaatheptahüdraat, MgSO  4 · 7H  2 O 22,50 g 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini 
c) Veevaba kaltsiumkloriid, CaCl  2 27,50 g 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini 
d) Raud(III)kloriidheksahüdraat, FeCl  3 · 6 H  2 O 0,25 g 
Lahustatakse vees ja täiendatakse veega 1 liitrini  
3 ml igast lahusest a kuni d segatakse kokku ja täiendatakse 1 liitrini.  
VII.2.3.  Inokulaadi valmistamine  
Võetakse värsked proovid vähemalt kümnest kohast, peamiselt piir ­
kondadest, kus kasutatakse ja kuhu suunatakse mitmesuguseid kemi ­
kaale. Üheliitrised muda, pindmise mullakihi, vee- jms proovid võetakse näiteks olme- ja tööstusliku heitvee puhastitest, jõgedest, 
järvedest ja meredest ning segatakse need hoolikalt kokku. Pärast 
hõljumi kõrvaldamist ja mõningast seismist viiakse supernatandi pH naatriumhüdroksiidi või fosforhappe abil väärtuseni 7 ± 1.
 
Sobiva koguse filtritud supernatandiga täidetakse edaspidi regulaar ­
selt täidetav ja osaliselt tühjendatav aktiivmuda anum ja vedelikku 
aereeritakse umbes 23,5 tundi. 30 minutit pärast aereerimise lõppu 
kõrvaldatakse umbes kolmandik supernatandist ja lisatakse settinud materjalile samas mahus lahust (pH 7), mis sisaldab 0,1 % glükoosi, 0,1 % peptooni ja kaaliumdivesinikfosfaati, ning jätkatakse aereeri ­
mist. Protseduuri korratakse iga päev. Mudareservuaari tuleb 
käidelda hea tava kohaselt: väljavool peab olema selge, temperatuur peaks olema 25 ± 2
 o C, pH peaks olema 7 ± 1, muda peaks hästi 
settima, aeratsioon peaks segu pideva aeroobsuse tagamiseks olema 
küllaldane, segu peaks sisaldama algloomi ning muda aktiivsust 
võrdlusaine suhtes tuleks kontrollida vähemalt iga kolme kuu tagant. Muda võib inokulaadina kasutada pärast vähemalt ühekuulist töötle ­
mist, aga hiljemalt nelja kuu pärast. Seejärel võetakse regulaarsete 
vaheaegade järel vähemalt kord kolme kuu jooksul jälle vähemalt 
kümnest paigast eespool kirjeldatud proovid.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Et tagada värske ja vana muda ühesugune aktiivsus, segatakse kasu ­
tuses oleva aktiivmuda filtritud supernatant võrdsetes kogustes vahe ­
tult enne kogutud kümne allika segu filtritud supernatandiga ja kulti ­
veeritakse saadud segu eespool kirjeldatud moel. Inokulaadiks võetakse muda 18–24 t pärast selle söötmist.
 
VII.2.4.  Kolbide ettevalmistamine  
Valmistatakse ette järgmised kuus kolbi:  
nr 1: testaine lahjendusvees, kontsentratsioonis 100 mg/l;  
nr 2, 3 ja 4: testaine mineraalses toitelahuses, kontsentratsioonis 
100 mg/1;  
nr 5: võrdlusaine (nt aniliin) mineraalses toitelahuses, kontsentrat ­
sioonis 100 mg/l;  
nr 6: ainult mineraalne toitelahus.  
Vähelahustuvad testained lisatakse massi või mahu järgi otse katse ­
segusse või käsitsetakse neid 3. liites kirjeldatud moel, kuid lahusteid ega emulgaatoreid kasutada ei tohiks. Kõikidele kolbidele lisatakse 
vastavasse topsi CO
 2 absorbent. pH kolbides nr 2, 3 ja 4 viiakse 
väärtuseni 7,0.  
VII.2.5.  Katse tegemine  
Kolvid nr 2, 3 ja 4 (katsesuspensioonid), nr 5 (inokulaadi aktiivsuse 
kontrollproov) ja nr 6 (inokulaadiga nullproov) inokuleeritakse sellise väikese koguse inokulaadiga, et hõljumi kontsentratsioon 
segus oleks 30 mg/l. Abiootilist kontrollproovi kolvis nr 1 ei inoku ­
leerita. Katseaparatuur pannakse kokku, kontrollitakse seadme hermeetilisust, käivitatakse segajad ja alustatakse pimeduses hapni ­
kutarbe mõõtmist. Iga päev kontrollitakse temperatuuri, segajaid ja 
kulonomeetrilist hapnikutarbe meerikut ning märgitakse üles kõik 
kolbide sisu värvuse muutused. Sobival moel, näiteks kuue kanaliga meeriku abil jälgitakse vahetult kõigi kolbide BHT-d. Inkubatsiooni ­
perioodi lõpus, tavaliselt 28 päeva möödumisel, mõõdetakse kolbide 
pH ja määratakse testaine jääkkontsentratsioon, kõigi vaheühendite 
kontsentratsioonid ja vees lahustuva ühendi puhul DOC kontsentrat ­
sioon (II.4 liide). Lenduvate kemikaalide puhul tuleb olla eriti hoolikas. Kui eeldatakse nitrifikatsiooni toimumist, mõõdetakse 
võimaluse korral nitriti ja nitraadi kontsentratsioon.
 
VII.3. ANDMED JA ARUANDLUS  
VII.3.1.  Tulemuste käsitlemine  
Testaine hapnikutarve (mg) kindla aja möödumisel (millest on lahu ­
tatud inokulaadiga nullproovi vastav näitaja sama aja kohta) jaga ­
takse kasutatud testaine massiga. Nii saadakse BHT väärtus, mis on 
väljendatud hapniku massina (mg) testaine massi (mg) suhtes, st:  
BHT ¼ ðTestaine hapnikutar ve  ðmgÞ Ä nullproovi hapnikutar ve  ðmgÞÞ 
ðTestaine kogus kolvis  ðmgÞÞ 
= hapnikutarve (mg)/testaine (mg).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Biolagundumise protsent arvutatakse seejärel valemist:  
biolagundumise protsent  ¼ ThOD %  BHT ðO 2 ðmgÞ=testain e ðmgÞÞ 
ThOD ðO 2 ðmgÞ=testain eðmgÞÞ Ü 100 
Segude puhul arvutatakse ThOD elementanalüüsi tulemuste põhjal, 
käsitledes segu ühendina. Kasutada tuleb asjakohast ThOD-d (ThODN
 H4 või ThOD  NO3 ) vastavalt nitrifikatsiooni toimumisele või 
mittetoimumisele (II liite punkt 2). Kui nitrifikatsioon toimub, kuid 
ei ole täielik, tehakse nitrifikatsiooni hapnikutarvet arvestav 
parandus, mis arvutatakse välja nitriti ja nitraadi kontsentratsiooni muutustest (V liide).
 
Spetsiifilise (lähte-)aine kao järgi arvutatakse esmase biolagundumise 
protsent (vt I.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100%  
Kui testaine sisaldus füüsikalis-keemilist kadu mõõtvas kolvis nr 1 
on vähenenud, registreeritakse see ja selles kolvis (S  b ) oleva testaine 
kontsentratsiooni kasutatakse 28 päeva möödumisel biolagundumise protsendi arvutamisel.
 
DOC analüüside (pole kohustuslik) tegemisel arvutatakse biolagun ­
dumise protsent valemist:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100%  
vastavalt kirjeldusele punktis I.7.1. Kui DOC sisaldus füüsikalis- 
keemilist kadu mõõtvas kolvis nr 1 on vähenenud, kasutatakse 
DOC kontsentratsiooni selles kolvis biolagundumise protsendi arvu ­
tamisel.  
Kõik tulemused registreeritakse etteantud andmetabelis.  
VII.3.2.  Tulemuste kehtivus  
Inokulaadiga nullproovi hapnikutarve 28 päeva jooksul on üldjuhul 
20–30 mg O  2 /l ega tohiks ületada 60 mg/l. Kui saadavad väärtused 
on suuremad kui 60 mg/l, tuleks andmed ja katsetehnika kriitiliselt 
üle vaadata. Kui pH jääb väljapoole vahemikku 6–8,5 ja testaine 
hapnikutarve on alla 60 %, tuleks katset testaine madalama kontsen ­
tratsiooniga korrata.  
Vt ka punkti I.5.2.  
Kui hapnikutarbe põhjal arvutatud aniliini lagunemisprotsent ei ole 7 
päeva jooksul suurem kui 40 % ja 14 päeva jooksul suurem kui 
65 %, loetakse katse tühiseks.  
VII.3.3.  Aruandlus  
Vt punkti I.8.  
VII.4. ANDMETABEL  
Järgneb andmetabeli näide.  
MITI (I) KATSE  
1. LABOR  
2. KATSE ALGUSKUUPÄEV  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. TESTAINE  
Nimi:  
Põhilahuse kontsentratsioon: ... (kemikaali sisaldus, mg/l)  
Algkontsentratsioon toitelahuses, C  0 : ... (kemikaali sisaldus, 
mg/l 
Katsesegu maht, V: … ml  
ThOD: ... mg O  2 /l 
4. INOKULAAT  
Mudavõtukohad: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 3) … 8) … 
4) … 9) … 
5) … 10) …
 
Hõljumi kontsentratsioon aktiivmudas pärast sünteetilise 
reoveega aklimatiseerimist = ... mg/l  
Aktiivmuda maht liitri lõpliku lahuse kohta = ... ml  
Muda kontsentratsioon lõplikus lahuses = ... mg/l  
5. HAPNIKUTARVE: BIOLAGUNDUVUS  
Kasutatava respiromeetri tüüp:  
Aeg (päevades) 
0 7 14 21 28  
Hapnikutarve 
(mg), testaine a 1 
a 2 
a 3 
Hapnikutarve 
(mg), nullproov b 
Parandatud hapni ­
kutarve (mg) (a 1 – b  1 ) 
(a 1 – b  1 ) 
(a 1 – b  1 ) 
BHT mg testaine 
kohta ða Ä bÞ
CoV 1. kolb 
2. kolb 3. kolb 
Lagunemisprotsent 
BOD/ThOD × 100
 
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 3 
Keskmine (*)
 
(*) Kordustulemuste olulise erinevuse puhul mitte keskmistada.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
NB: Võrdlusaine jaoks võib kasutada analoogseid tabeleid.  
6. SÜSINIKU ANALÜÜS  (pole kohustuslik)  
Süsinikuanalüsaator:  
Kolb DOC DOC kõrvaldamis ­
protsent Keskmine 
Mõõdetud Parandatud  
Vesi + testaine a — — 
Muda + testaine b  1 b 1 –c 
Muda + testaine b  2 b 2 –c 
Muda + testaine b  3 b 3 –c 
Testaineta kontrollproov c — — —  
kõrvaldamisprotsent  ¼ a Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100  
7. SPETSIIFILISE KEEMILISE ANALÜÜSI ANDMED  
Testaine jääk katse lõpus Lagunemisprotsent  
Nullproov veega S  b 
Inokuleeritud toitelahus S a1 
S a2 
S a3 
lagunemisprotsent  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Lagunemisprotsent arvutatakse kolbide a, a  2 ja a  3 puhul.  
8. MÄRKUSED  
Lisada tuleks BHT kõver ajas, kui see koostati.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
I liide  
LÜHENDID JA MÕISTED  
DO: lahustunud hapnik (mg/l) on vesikeskkonnaga proovis lahustunud 
hapniku kontsentratsioon.  
BHT: bioloogiline hapnikutarve (g) on mikroorganismide poolt testaine meta ­
boliseerimisel tarvitatud hapniku kogus, väljendatakse ka hapnikutarbe 
(g) ja katseühendi massi (g) suhtena (vt meetodit C.5).  
KHT: keemiline hapnikutarve (g) on testaine oksüdeerimisel kuuma happelise 
dikromaadiga tarvitatud hapniku kogus, näitab oksüdeeritava materjali 
sisaldust; väljendatakse ka hapnikutarbe (g) ja katseühendi massi (g) 
suhtena (vt meetodit C.6).  
DOC: lahustunud orgaaniline süsinik on lahuses olev süsinik, mis läbib 
0,45 μm filtri või jääb supernatanti 15minutilisel tsentrifuugimisel 
40 000 m/s  –2 (± 4 000 g) juures.  
ThOD: teoreetiline hapnikutarve (mg) on aine täielikuks oksüdeerimiseks 
vajalik hapnikukogus; arvutatakse brutovalemi järgi (vt II liite punkti 
2) ning väljendatakse ka hapnikutarbe (g) ja katseühendi massi (g) suhtena.
 
ThCO  2 : teoreetiline süsinikdioksiid (mg) on arvutuslik süsinikdioksiidi kogus, 
mis tekib katseühendi teadaolevast või määratud süsinikusisaldusest katseühendi täielikul mineraliseerumisel; väljendatakse ka mg katseü ­
hendi kohta eraldunud süsinikdioksiidi kogusena (mg).
 
TOC: proovi kogu orgaaniline süsinik on lahuses ja suspensioonis oleva 
orgaanilise süsiniku sisalduse summa.  
IC: anorgaaniline süsinik.  
TC: üldsüsinik on proovis oleva orgaanilise ja anorgaanilise süsiniku 
summa.  
Esmane biolagundumine:  
bioloogilisest toimest tingitud muutus aine keemilises struktuuris, mille tulemusel 
see aine kaotab mingi spetsiifilise omaduse.  
Lõplik biolagundumine (aeroobne):  
lagunemise määr, mille puhul mikroorganismid on katseühendi täielikult ära 
tarvitanud ja muutnud selle süsinikdioksiidiks, veeks, mineraalsooladeks ja uute mikroobsete rakkude osaks (biomassiks).
 
Bioloogiliselt kergesti lagunduv.  
teatavad kindlaksmääratud lõpliku biolagunduvuse sõelkatsed läbinud kemikaa ­
lide rangelt määratlemata klassifikatsioon; need katsed on nii ranged, et võib 
eeldada, et veekeskkonnas aeroobsetes tingimustes biolagunduvad need ühendid 
kiiresti ja täielikult.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Potentsiaalselt biolagunduv:  
klassifikatsioon kemikaalide puhul, mille (esmase või lõpliku) biolagunduvuse 
kohta mis tahes tunnustatud biolagunduvuse katses on kindlaid tõendeid.  
Biotöödeldavus:  
ühendite kõrvaldatavus biopuhastusjaamades, rikkumata puhastusprotsesside 
normaalset käiku. Üldjuhul on bioloogiliselt kergesti lagunduvad ühendid biotöö ­
deldavad, samal ajal kui kõik potentsiaalselt biolagunduvad ühendid ei ole biotöödeldavad. Toimida võivad ka abiootilised protsessid.
 
Ooteaeg:  
kõrvaldamiskatses ajavahemik inokulatsioonist kuni hetkeni, kus lagunemine on 
jõudnud vähemalt 10 %ni. Ooteaja pikkus võib olla väga erinev ja halvasti reprodutseeritav.
 
Lagunemisaeg:  
aeg ooteaja lõpust hetkeni, mil on saavutatud 90 % maksimaalsest lagunemisest.  
Kümnepäevane aken  
on 10 % lagunemise saavutamisele vahetult järgnevad kümme päeva.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
2. liide  
SOBIVATE SUMMAARSETE PARAMEETRITE ARVUTAMINE JA 
MÄÄRAMINE  
Olenevalt valitud meetodist on vajalikud teatavad summaarsed parameetrid. Järg ­
mine jaotis kirjeldab nende väärtuste leidmist. Nende parameetrite kasutamist on 
kirjeldatud üksikute meetodite juures.  
1. Süsinikusisaldus  
Süsinikusisaldus arvutatakse testaine teadaoleva elemendilise koostise 
põhjal või määratakse elementanalüüsil.  
2. Teoreetiline hapnikutarve (ThOD)  
Teoreetilise hapnikutarbe (ThOD) saab arvutada siis, kui elemendiline 
koostis on teada või määratakse elementanalüüsil. Järgmise ühendi puhul:  
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
on see nitrifikatsiooni mitteesinemisel  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
ja nitrifikatsiooni esinemisel  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2n þ 3s þ 5=2p þ 1=2na Ä oâ 
MW mg=mg 
3. Keemiline hapnikutarve (KHT)  
Keemiline hapnikutarve (KHT) määratakse meetodi C.6 kohaselt.  
4. Lahustunud orgaaniline süsinik (DOC)  
Lahustunud orgaaniline süsinik (DOC) on määratletud kui mis tahes vees 
oleva, 0,45 μm filtrit läbiva aine või segu koostises olev orgaaniline 
süsinik.  
Katseanumatest võetakse proovid ja filtritakse kohe sobiva membraanfil ­
triga filtrimisseadmes. Esimesed 20 ml filtraati (väikeste filtrite kasutamisel võib kogust vähendada) jäetakse kõrvale. 10–20 ml või süstimisel väik ­
semad kogused (maht sõltub süsinikuanalüsaatori jaoks vajalikust kogusest) 
jäetakse süsiniku analüüsimiseks alles. DOC kontsentratsioon määratakse orgaanilise süsiniku analüsaatori abil, mis suudab täpselt mõõta süsiniku 
kontsentratsiooni, mis on 10 % DOC kontsentratsioonist katse alguses või 
sellest madalam.
 
Filtritud proove, mida ei saa analüüsida samal tööpäeval, võib säilitada 
külmikus 2–4 °C juures kuni neli tundi või pikaajalisemal säilitamisel alla –18 °C juures.
 
Märkused:  
Membraanfiltrid on sageli hüdrofiilsuse suurendamiseks immutatud pindak ­
tiivsete ainetega. Seega võib filter sisaldada mitu mg lahustuvat orgaanilist 
süsinikku, mis segaks biolagunduvuse määramist. Pindaktiivsed ained ja muud lahustuvad orgaanilised ühendid kõrvaldatakse filtritest kolme tunnia ­
jase keetmisega deioniseeritud vees. Filtreid võib seejärel nädal aega vees 
hoida. Ühekordse filterpadruni kasutamisel tuleb iga partii puhul kontrol ­
lida, et see ei eralda lahustuvat orgaanilist süsinikku.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
Olenevalt membraanfiltri tüübist võib testaine sellel adsorbeeruda. Seetõttu 
on soovitatav veenduda, et testainet filtrisse ei jää.  
DOC eristamisel TOCst võib filtrimise asemel kasutada 15minutilist tsent ­
rifuugimist 40 000 m/s  –2 (4 000 g) juures. Kui DOC algkontsentratsioon on 
alla 10 mg/l, ei ole see meetod usaldusväärne, kuna kõiki baktereid ei kõrvaldata või lahustatakse osa süsinikust bakteriplasmas.
 
KIRJANDUS  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.
 
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 388 409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur 
Wasser-, Abwasser- und Schlammunter-chlammunter-suchung, Summa ­
rische Wirkungs- and Stoffkenngr6Ben (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschu βorme­
nausschuβ Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut fürür 
Normung e.V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984,984, vol 133 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
3. liide  
VÄHELAHUSTUVATE AINETE BIOLAGUNDUVUSE HINDAMINE  
Biolagunduvuse katsetes vähelahustuvate ainetega tuleks erilist tähelepanu 
pöörata järgmistele asjaoludele.  
Sellal kui homogeensed vedelikud tekitavad proovi võtmisel harva probleeme, on 
soovitatav tahked ained sobival moel homogeniseerida, et vältida mittehomo ­
geensusest tingitud vigu. Eriti hoolikas tuleb olla siis, kui on vaja mõnemilli ­
grammiseid proove suure lisandite sisaldusega segudest või ainetest.  
Katsete käigus võib kasutada mitmesuguseid loksutamisviise. Loksutada tuleks 
ainult aine dispergeerituna hoidmiseks vajalikul määral, vältides hoolikalt ülekuu ­
mutamist, liigset vahutamist ja liigseid nihkejõude.  
Kasutada võib emulgaatorit, mille abil saadakse ainest stabiilne dispersioon. 
Emulgaator ei tohiks olla bakteritele mürgine ega olla katse tingimustel biola ­
gunduv või vahtu tekitav.  
Lahustitele kehtivad samad nõuded nagu emulgaatoritele.  
Tahkete testainete puhul ei ole tahkeid kandjaid soovitatav kasutada, küll aga 
võivad need olla sobivad õlitaoliste ainete puhul.  
Abiainete, nagu emulgaatorite, lahustite ja kandjate kasutamisel tuleks teha null ­
proov abiainega.  
Vähelahustuvate ühendite biolagunduvuse uurimiseks sobivad respiromeetrilistest 
katsetest nii CO  2 , BHT kui ka MITI katse.  
KIRJANDUS  
— de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.  
— Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
IV liide  
INOKULAADI SUHTES OLETATAVALT MÜRGISTE AINETE 
BIOLAGUNDUVUSE HINDAMINE  
Kui aine osutub kohese biolagunduvuse katses näiliselt mittelagunevaks, on inhi ­
beerivuse ja inertsuse eristamise vajaduse korral soovitatav kasutada järgmist 
meetodit (Reynolds jt, 1987).  
Mürgisuse ja biolagunduvuse katsetes tuleks kasutada samasuguseid või identseid 
inokulaate.  
Kohese biolagunduvuse katsetes uuritud ainete mürgisuse hindamiseks peaks 
sobima muda hapnikutarbe inhibeerimise (aktiivmuda hapnikutarbe inhibeerimis ­
katse – direktiiv 88/302/EMÜ), BHT ja/või kasvu pidurdumise meetodid või 
nende kombinatsioon.  
Kui mürgisusest tulenevat inhibeerumist soovitakse vältida, on kohese biolagun ­
duvuse katsetes soovitatav kasutada testaine kontsentratsioone, mis on väiksemad kui 1/10 mürgisuse katsetes leitud EC
 50 väärtustest (ehk väiksemad kui EC  20 
väärtused). Ühendite puhul, mille EC  50 on kõrgem kui 300 mg/l, kohese biola ­
gunduvuse katsetes tõenäoliselt mürgist mõju ei ilmne.  
EC 50 väärtused alla 20 mg/l tekitavad järgnevates katsetes eeldatavalt tõsiseid 
probleeme. Kasutada tuleks madalaid katsekontsentratsioone, mistõttu tuleb kasu ­
tada ranget ja tundlikku kinnise pudeli katset või  14 C-märgistatud materjali. 
Aklimatiseerunud inokulaat võib võimaldada kasutada testaine kõrgemaid kont ­
sentratsioone. Viimasel juhul ei ole aga täidetud kohese biolagunduvuse katse konkreetne kriteerium.
 
KIRJANDUS  
Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
V Liide  
NITRIFIKATSIOONI HAPNIKUTARVET ARVESTAV PARANDUS  
Lämmastikku mittesisaldavate testainete puhul on nitrifikatsiooni arvestamatajät ­
misest tingitud viga testainete biolagundumise hapnikutarbe hindamisel tühine (ei ületa 5 %), isegi kui toitelahuse ammoniakaalse lämmastiku oksüdatsioon toimub 
ebaühtlaselt, näiteks erinevustega testainega pudelite ja nullproovidega anumate 
vahel. Lämmastikku sisaldavate testainete puhul võivad aga ilmneda tõsised vead.
 
Kui nitrifikatsioon on toimunud, kuid ei ole täielik, võib nitriti ja nitraadi kont ­
sentratsiooni muutuste määramisel parandada segu mõõdetud hapnikutarvet järg ­
miste valemite põhjal ammooniumiooni nitritiks ja nitraadiks oksüdeerimisel 
kuluva hapnikukoguse võrra: 
2 NH  4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCI + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Summaarselt: 2 HN
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Valemi 1 põhjal kulub ammooniumkloriidi (NH  4 Cl) koosseisus oleva 28 g 
lämmastiku oksüdeerimisel nitritiks 96 g hapnikku, st vastav teisendustegur on 
3,43 (96/28). Samamoodi kulub valemi 3 põhjal 28 g lämmastiku oksüdeerimisel 
nitraadiks 128 g hapnikku, st vastav teisendustegur on 4,57 (128/28).  
Kuna need reaktsioonid on järjestikused ja neid viivad läbi erinevad bakteriliigid, 
võib nitriti kontsentratsioon nii väheneda kui ka suureneda; viimasel juhul tekib 
vastav kogus nitraati. Seega on nitraadi tekkel kuluv hapnikukogus 4,57kordne 
nitraadi kontsentratsiooni tõusuga võrreldes, sellal kui nitriti tekkel kuluv hapni ­
kukogus on 3,43kordne nitriti kontsentratsiooni tõusuga võrreldes ning nitriti kontsentratsiooni vähenemisega seotud hapnikukadu – 3,43kordne nitriti kontsen ­
tratsiooni vähenemisega võrreldes.
 
Seega: 
O 2 kulu nitraadi tekkel = 4,57 x nitraadi kontsentratsiooni tõus (4) 
ja O
 2 kulu nitriti tekkel = 3,43 x nitriti kontsentratsiooni tõus (5) 
ja O
 2 kadu nitriti kadumisel = – 3,43 x nitriti kontsentratsiooni 
vähenemine (6) 
Seega 
O 2 kulu nitrifikatsioonil = ± 3,43 x nitriti kontsentratsiooni 
muutus + 4,57 x nitraadi kontsentratsiooni tõus (7) 
ja seega 
O 2 kulu süsiniku oksüdeerimisel = vaadeldud kogutarve – nitri ­
fikatsioonist tingitud tarve (8) 
Ainult summaarse oksüdeeritud lämmastiku hulga määramisel võib nitrifikatsioo ­
nist tingitud hapnikutarbe lugeda esimeses lähenduses oksüdeeritud lämmastiku 
hulgaga võrreldes 4,57kordseks.  
Süsiniku oksüdeerimise hapnikutarbe parandatud väärtust võrreldakse seejärel 2. 
liite kohaselt arvutatud ThOD  NH3 väärtusega.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. LAGUNEMINE – BIOKEEMILINE HAPNIKUTARVE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesoleva meetodi abil mõõdetakse tahkete või vedelate orgaaniliste 
ainete bioloogilist hapnikutarvet (BHT).  
Katses leitud andmed kehtivad vees lahustuvate ühendite puhul; 
siiski võib vähemalt põhimõtteliselt uurida ka lenduvaid ja vees 
vähelahustuvaid ühendeid.  
Meetod on kohaldatav ainult sellistele uuritavatele orgaanilistele 
katsematerjalidele, mis ei mõju katses kasutatavatel kontsentratsioo ­
nidel bakteritele inhibeerivalt. Kui uuritav materjal katsekontsentrat ­
sioonil ei lahustu, võib selle hea dispergeerituse saavutamiseks vaja 
olla erimeetmeid, näiteks ultrahelidispergeerimist.  
Madalate biolagunduvuse väärtuste tõlgendamisel ja sobivate katse ­
kontsentratsioonide valikul võivad kasulikud olla andmed uuritava 
kemikaali mürgisuse kohta.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
BHT määratletakse kindla koguse aine lahuse ettenähtud tingimustel 
biokeemiliseks oksüdeerimiseks vajaliku lahustunud hapniku 
massina.  
Tulemused väljendatakse grammides grammi testaine kohta.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Soovitatav on kontrollida inokulaadi aktiivsust sobiva võrdlus ­
aine abil.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Kindel kogus sobivas hästi aereeritud lahuses lahustatud või disper ­
geeritud ainet inokuleeritakse mikroorganismidega ja inkubeeritakse pimedas kindlaksmääratud konstantse temperatuuriga ruumis.
 
BHT määratakse lahustunud hapniku sisalduse vahe järgi katse algul 
ja lõpul. Katse kestus peab olema vähemalt viis ja mitte rohkem kui 28 päeva.
 
Paralleelselt tuleb teha testaineta nullproov.  
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
BHT määramist ei saa lugeda aine usaldusväärseks biolagunduvuse 
määramise meetodiks. Meetod sobib kasutamiseks ainult sõelkatsena.  
1.6. MEETODI KIRJELDUS  
Ainest valmistatakse lähtelahus või dispersioon, mille BHT sobiks 
kasutatava meetodiga. Seejärel määratakse mis tahes siseriikliku või 
rahvusvahelise standardmeetodi abil BHT.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. ANDMED JA HINDAMINE  
Lähtelahuse BHT arvutatakse vastavalt valitud standarditud meeto ­
dile ja väljendatakse grammides grammi testaine kohta.  
3. ARUANDLUS  
Ära tuleb märkida kasutatud meetod.  
Bioloogilise hapnikutarbena esitatakse vähemalt kolme nõuetekohase 
mõõtmise keskmine tulemus.  
Registreerida tuleb kõik tulemuste tõlgendamist mõjutavad, eriti aine 
lisandeid, füüsikalist olekut, mürgisust ja koostist käsitlevad andmed ja märkused.
 
Kui bioloogilise nitrifikatsiooni pidurdamiseks kasutatakse lisaainet, 
tuleb see ära märkida.  
4. VIITED  
Näitlike standardmeetodite nimekiri:  
NF T 90 – 103: Determination of the biochemical oxygen 
demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, 
London.  
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand 
after n days.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. LAGUNEMINE – KEEMILINE HAPNIKUTARVE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesoleva meetodi abil mõõdetakse valitud standarditud, kindlaks ­
määratud laboritingimustel tahkete või vedelate orgaaniliste ainete 
keemilist hapnikutarvet (KHT).  
Katse tegemisel ja saadud tulemuste tõlgendamisel on kasulik teada 
aine struktuuri (nt orgaaniline halogeniidsool, orgaaniline Fe  ++ sool, 
kloororgaaniline ühend).  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Keemiline hapnikutarve iseloomustab aine oksüdeeritavust ja seda 
väljendatakse kindlaksmääratud laboritingimustel aine oksüdeerimi ­
seks kulunud oksüdeerija kogusele vastava hapniku kogusena.  
Tulemused väljendatakse grammides grammi testaine kohta.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Uut ainet uurides ei ole võrdlusaineid alati vaja kasutada. Neid tuleks 
kasutada peamiselt meetodi kaliibrimiseks ja võimaldamaks võrdlust 
teiste meetodite abil saadud tulemustega.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Kindlaksmääratud kogust vees lahustatud või dispergeeritud ainet 
oksüdeeritakse kahe tunni jooksul tagasijooksuga kuumutamisel 
kaaliumdikromaadiga kontsentreeritud väävelhappes, hõbesulfaatka ­
talüsaatori juuresolekul. Dikromaadi jääk määratakse raud(II)ammoo ­
niumsulfaadi standardlahusega tiitrimisel.  
Kloori sisaldavate ühendite puhul lisatakse kloori segava mõju 
vähendamiseks elavhõbesulfaati (  1 ). 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Rangelt määratlemata määramismeetodi tõttu on KHT „oksüdeerita ­
vuse näitaja” ja on sellisena praktiline meetod orgaanilise aine sisal ­
duse määramiseks.  
Katset võib segada kloorisisaldus; KHT määramist võivad segada ka 
anorgaanilised redutseerijad ja oksüdeerijad.  
Mõned tsüklilised ühendid ja paljud lenduvad ained (nt madalamad 
rasvhapped) ei oksüdeeru selles katses täielikult.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
Ainest valmistatakse lähtelahus või -dispersioon, mille KHT jääb 
vahemikku 250–600 mg/l.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Pärast kasutamist tuleb elavhõbedasooli sisaldavad lahused ümber töödelda, et vältida 
elavhõbeda sattumist looduskeskkonda.
 Märkused  
Vähelahustuvate või mittedispergeeruvate ainete puhul võib kaaluda 
5 mg KHT-le vastava koguse peenestatud ainet või vedelikku ja viia 
selle koos veega katseseadmesse.  
Sageli ja eriti vähelahustuvate ainete puhul määratakse KHT meetodi 
ühe variatsiooni kohaselt, st suletud rõhuühtlustajaga süsteemis (H. Kelkenberg, 1975). Selle modifitseeritud meetodi abil saab edukalt 
uurida ka tavameetodi abil raskesti uuritavaid aineid, nt äädikhapet. 
Püridiiniga see meetod aga ei toimi. Kui kaaliumdikromaadi kont ­
sentratsioon viiakse viite 1 kohaselt väärtuseni 0,0416 M (0,25 N), võimaldab see 5–10 mg ainet otse sisse kaaluda, mis on vees vähe ­
lahustuvate ainete KHT määramisel väga oluline (viide 2).
 
Muul juhul määratakse KHT seejärel mis tahes siseriikliku või 
rahvusvahelise standarditud meetodi abil.  
2. ANDMED JA HINDAMINE  
Kolvi sisu KHT arvutatakse valitud standarditud meetodi abil ja 
väljendatakse grammides grammi testaine kohta.  
3. ARUANDLUS  
Ära tuleks märkida kasutatud standardmeetod.  
Keemilise hapnikutarbena esitatakse vähemalt kolme mõõtmise kesk ­
mine tulemus. Registreerida tuleb kõik teadaolevad tulemuste tõlgen ­
damist mõjutavad, eriti tulemusi aine lisandeid, füüsikalist olekut ja omadusi käsitlevad andmed ja märkused.
 
Ära tuleb märkida elavhõbesulfaadi lisamine kloori segava mõju 
vähendamiseks.  
4. VIITED  
1) Kelkenberg, H., Z. Von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
2) Gerike, P The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, 984, vol. 13, 169.  
Standardmeetodite näidisloend:  
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen 
demand.  
ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate 
methods.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. LAGUNEMINE – ABIOOTILINE LAGUNEMINE: HÜDRO ­
LÜÜSI SÕLTUVUS pHst  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod vastab suunisele OECD TG 111 (2004).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kemikaalid võivad sattuda pinnavette otsese kasutamise, pritsmete 
edasikandumise, äravoolu, drenaaži, jäätmete kõrvaldamise, tööstus- , olme- või põllumajandusheitvee ja atmosfäärisademetega ning 
võivad pinnavees muunduda keemiliste (nt hüdrolüüs, oksüdatsioon), 
fotokeemiliste ja/või mikrobioloogiliste protsesside teel. Käesolevas suunises kirjeldatakse laboratoorset katsemeetodit kemikaalide abioo ­
tilise hüdrolüütilise muundumise hindamiseks veesüsteemides pH 
väärtuste juures, mis esinevad tavaliselt keskkonnas (pH 4–9); 
meetod põhineb olemasolevatel suunistel (1–7).
 
Katsetega määratakse kindlaks i) uuritava aine hüdrolüüsi kiirus pH 
funktsioonina ja ii) hüdrolüüsisaaduste, millega organismid võivad 
kokku puutuda, koostis või laad ning tekkimis- ja lagunemiskiirus. Selliseid uuringuid võib olla vaja kemikaalide puhul, mida juhitakse otse vette või mis võivad sattuda keskkonda muudel eespool kirjel ­
datud viisidel.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Vt 2. liidet.  
1.3. KATSEMEETODI KASUTUSALA  
Meetod on üldiselt kasutatav (märgiseta või märgisega) keemiliste 
ainete puhul, mille jaoks on olemas piisava täpsuse ja tundlikkusega 
määramismeetod. Seda saab kasutada vähelenduva või lendumatu ühendi puhul, mis lahustub piisavalt hästi vees. Käesoleva meetodiga 
ei tuleks uurida kemikaali, mis lendub vesilahusest väga kergesti (nt 
fumigant, orgaaniline lahusti) ja mida seetõttu ei saa hoida lahuses käesoleva katse tingimustes. Katset võib olla raske teha vees väga vähe lahustuva ainega (8).
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritav aine viiakse pH eri väärtusega (pH 4, 7 ja 9) steriilsetesse 
vesipuhverlahustesse ja neid inkubeeritakse kontrollitud laboritingi ­
mustes pimedas (püsival temperatuuril). Pärast ettenähtud ajavahe ­
mike möödumist määratakse puhverlahuses uuritava aine ja hüdro ­
lüüsisaaduste sisaldus. Märgisega (nt  14 C) aine puhul on kergem 
koostada massibilanssi.  
Käesolevas katsemeetodis kasutatakse astmelist lähenemisviisi, mida 
on näidatud ja selgitatud 1. liites. Iga järgmine aste sõltub eelmise 
tulemustest.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. ANDMED UURITAVA AINE KOHTA  
Hüdrolüüsi kiiruse mõõtmiseks saab kasutada märgiseta või märgi ­
sega ainet. Märgisega ainet tuleb hüdrolüüsitee uurimisel ja massi ­
bilansi koostamisel üldiselt eelistada; siiski ei pruugi märgisega aine 
kasutamine olla erijuhtudel tingimata vajalik. Soovitatakse kasutada  
14 C-märgist, kuid teiste isotoopide, näiteks  13 C, 15 N, 3 H tarvitamine 
võib samuti kasulik olla.Märgisega aatom peaks võimaluse korral paiknema molekuli kõige stabiilsema(te)s osa(de)s. Kui uuritav 
aine sisaldab näiteks ühte tsüklit, peaks märgis olema selles tsüklis; 
kui uuritav aine sisaldab kaht või enamat tsüklit, võib olla vaja eraldi uuringuid, et hinnata iga märgisega tsükli muundumisi ja saada vaja ­
likku teavet hüdrolüüsisaaduste moodustumise kohta. Uuritava aine 
puhtus peab olema vähemalt 95 %.
 
Enne hüdrolüüsikatse tegemist peab olemas olema järgmine teave 
uuritava aine kohta:  
a) lahustuvus vees (katsemeetod A.6);  
b) lahustuvus orgaanilistes lahustites;  
c) aururõhk (katsemeetod A.4) ja/või Henry konstant;  
d) jaotuskoefitsient süsteemis n-oktanool/vesi (katsemeetod A.8);  
e) dissotsiatsioonikonstant (pK  a ) (OECD suunis 112) (viide 9);  
f) otsese ja kaudse fototransformatsiooni kiirus vees (vajaduse 
korral).  
On vaja määramismeetodeid uuritava aine kvantitatiivseks määrami ­
seks ning vajaduse korral hüdrolüüsisaaduste identifitseerimiseks ja 
kvantitatiivseks määramiseks vesilahuses (vt ka punkt 1.7.2).  
1.6. VÕRDLUSAINED  
Hüdrolüüsisaaduste kindlakstegemiseks ja kvantitatiivseks määrami ­
seks spektroskoopiliste ja kromatograafiliste meetodite või muude 
piisavalt tundlike meetodite abil tuleks võimaluse korral kasutada võrdlusaineid.
 
1.7. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
1.7.1.  Saagis  
Uuritava aine määramine puhverlahustest või nende ekstraktidest 
vähemalt kahes paralleelkatses kohe pärast uuritava aine lisamist annab esimese ettekujutuse määramismeetodi ja uuritava aine lisa ­
mise korratavusest. Hilisemate katsestaadiumide puhul saab määra ­
missaagised leida vastavate massibilansside alusel (kui kasutatakse märgisega ainet). Määramissaagis peaks nii märgisega kui ka märgi ­
seta kemikaali puhul olema vahemikus 90–110 % (7). Kui tehniliselt 
on sellist vahemikku raske saavutada, on 70 %line saagis märgiseta 
kemikaali puhul lubatav, kuid seda tuleb põhjendada.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Määramismeetodi korratavus ja tundlikkus  
Uuritava aine ja hüdrolüüsisaaduste kvantitatiivsel määramisel hiljem 
kasutatava(te) meetodi(te) korratavust saab kontrollida samade puhverlahuste (või nende ekstraktide) paralleelmääramistega siis, 
kui määramiseks on tekkinud piisav kogus hüdrolüüsisaadusi.
 
Määramismeetod peab olema piisavalt tundlik, et määrata katseaine 
kontsentratsioone 10 % või vähem algsest kontsentratsioonist. Vaja ­
duse korral peavad analüüsimeetodid olema ka piisavalt tundlikud, et määrata hüdrolüüsisaaduste kogust, mis moodustab 10 % või enam (ükskõik millisel uuringu hetkel) lisatud kogusest või 25 % või 
vähem selle saaduse maksimaalsest kontsentratsioonist.
 
1.7.3.  Hüdrolüüsi kineetiliste andmete usaldusvahemikud  
Kõigi regressioonikoefitsientide, kiiruskonstantide, poolestusaegade 
ja muude (nt DT50) kineetiliste parameetrite väärtuste jaoks tuleks 
arvutada ja esitada usaldusvahemikud.  
1.8. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.8.1  Laborivarustus ja seadmed  
Uuring tuleb teha klaasnõudes (nt katseklaasid, väikesed kolvid), 
vajaduse korral pimedas ja steriilsetes tingimustes, välja arvatud juhul, kui eelnev teave (nagu jaotuskoefitsient n-oktanooli/vee 
süsteemis) viitab sellele, et uuritav aine võib adsorbeeruda klaasile.
 
Sellistel juhtudel tuleb võib-olla kaaluda muude materjalide (näiteks 
Teflon®) kasutamist. Klaasile adsorbeerumise mõju saab vähendada 
ka järgmiste meetoditega:  
— katseanuma külge sorbeerunud uuritava aine ja hüdrolüüsisaa ­
duste massi määramine;  
— ultrahelivanni kasutamine;  
— kõigi klaasnõude pesemine lahustiga iga katseintervalli ajal;  
— kaubanduslikku segu jäljendavate toodete kasutamine;  
— suurema koguse kaaslahusti kasutamine uuritava aine lisamiseks 
süsteemile; kui kasutatakse kaaslahustit, peab see olema selline, mis ei hüdrolüüsi uuritavat ainet.
 
Tavaliselt on vajalikud kontrollitava temperatuuriga vesivann- 
loksutid või termostateeritavad inkubaatorid eri katselahuste inkubee ­
rimiseks.  
Vaja läheb standardset laborivarustust, eriti järgmisi seadmeid:  
— pH-meeter;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analüüsiseadmed, nagu GC-, HPLC-, TLC-seadmed, kaasa 
arvatud vajalikud seadmed radioaktiivse märgisega ja märgiseta 
ainete määramiseks või isotooplahjenduse pöördmeetodi kasuta ­
miseks;  
— seadmed identifitseerimise jaoks (nt MS, GC-MS, HPLC-MS, 
TMR jne);  
— vedelik-stsintillatsiooniloendaja;  
— jaotuslehtrid vedelik-vedelik-ekstraktsiooni jaoks;  
— seadmed lahuste ja ekstraktide kontsentreerimiseks (nt rotaatorau ­
rusti);  
— temperatuuri kontrollimise vahend (nt veevann).  
Keemiareagentidest läheb vaja näiteks järgmisi:  
— analüüsipuhtad orgaanilised lahustid, nagu heksaan, diklorome ­
taan jne;  
— stsintillatsioonivedelik;  
— puhverlahused (lähemalt vt punktist 1.8.3).  
Kõik hüdrolüüsikatsetes kasutatavad klaasnõud, analüütilise puhtu ­
sega vesi ja puhverlahused peavad olema steriliseeritud.  
1.8.2.  Uuritava aine lisamine  
Uuritav aine tuleb lisada vesilahusena erinevatesse puhverlahustesse 
(vt 3. liidet). Lahustumise parandamiseks on lubatud kasutada 
väikest kogust veega segunevat lahustit (nagu atsetonitriil, atsetoon, 
etanool), kuid lahusti kontsentratsioon ei tohi tavaliselt ületada 1 mahuprotsenti. Kõrgemat lahusti kontsentratsiooni võib kasutada (nt halvasti lahustuva uuritava aine puhul) ainult siis, kui saab 
näidata, et lahusti ei mõjuta uuritava aine hüdrolüüsi.
 
Kaubanduslikku segu jäljendava toote kasutamist üldiselt ei soovi ­
tata, kuna ei saa välistada, et segu koostisosad mõjutavad hüdrolüüsi. Siiski võib kaubanduslikku segu jäljendava materjali kasutamine olla sobiv lahendus vees halvasti lahustuva või klaasile adsorbeeruva 
uuritava aine puhul (vt punkti 1.8.1).
 
Tuleks kasutada ühte uuritava aine kontsentratsiooni; see ei tohiks 
ületada 0,01 M või poolt küllastuskontsentratsiooni (vt 1. liidet).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Puhverlahused  
Hüdrolüüsikatse tuleks sooritada pH väärtuste 4, 7 ja 9 juures. 
Selleks tuleb puhverlahuste valmistamisel kasutada analüüsipuhtaid kemikaale ja vett. Mõned sobivad puhversüsteemid on esitatud 3. 
liites. Tuleb märkida, et kasutatav puhversüsteem võib mõjutada 
hüdrolüüsi kiirust ja sellistel juhtudel tuleb kasutada alternatiivset puhversüsteemi (
 1 ). 
Iga puhverlahuse pH väärtust tuleb kontrollida kalibreeritud pH- 
meetriga, mille täpsus on vähemalt 0,1 nõutava temperatuuri juures.  
1.8.4.  Katsetingimused  
1.8.4.1.  Katsetemperatuur  
Hüdrolüüsikatsed tuleb teha konstantse temperatuuri juures. Ekstra ­
poleerimise eesmärgil on oluline hoida temperatuuri vahemikus 
vähemalt ± 0,5  o C. 
Kui uuritava aine hüdrolüüsi kohta ei ole midagi teada, tuleks teha 
eelkatse temperatuuril 50  o C (1. aste). Edasiste astmete kineetilised 
katsed tuleb teha vähemalt kolmel temperatuuril (kaasa arvatud katse 
50 o C juures), välja arvatud juhul, kui 1. astme katses selgub, et 
uuritav aine on hüdrolüüsi suhtes stabiilne. Soovitatav temperatuuri ­
vahemik on 10–70  o C (eelistatavalt tuleks kasutada vähemalt ühte 
temperatuuri alla 25  o C); see hõlmab standardtemperatuuri 25  o C ja 
enamikku välitingimustes esinevaid temperatuure.  
1.8.4.2.  Valgus ja hapnik  
Kõik hüdrolüüsikatsed tuleb teha, kasutades sobivaid meetodeid foto ­
lüüsi vältimiseks. Tuleb võtta kõik sobivad meetmed hapniku toime 
vältimiseks (nt barboteerimine heeliumi, lämmastiku või argooniga viie minuti jooksul enne lahuse valmistamist).
 
1.8.4.3.  Katse kestus  
Eelkatse kestab viis päeva, samal ajal kui kõrgemate astmete katsed 
tehakse kuni 90 %lise hüdrolüüsini või kestavad 30 päeva, sõltuvalt sellest, kumb aeg on lühem.
 
1.8.5.  Katse käik  
1.8.5.1.  Eelkatse (1. aste)  
Eelkatse tehakse temperatuuril 50 ± 0,5  o C pH väärtuste 4,0, 7,0 ja 
9,0 juures. Kui viie päeva pärast täheldatakse alla 10 %list hüdro ­
lüüsi (t  0,5 25  o C juures  > 1 aasta), peetakse uuritavat ainet hüdrolüüsi 
suhtes stabiilseks ja tavaliselt ei ole täiendavaid katseid vaja. Kui katseaine on teadaolevalt ebastabiilne keskkonna mõistes oluliste 
temperatuuride juures, (
 2 ) ei ole eelkatset vaja teha. Analüüsimeetod 
peab olema piisavalt täpne ja tundlik, et avastada esialgse kontsen ­
tratsiooni 10 %list vähenemist.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey ja Mill soovitavad fosfaatpuhvri asemel kasutada boraat- või atsetaatpuhvreid (11). 
( 2 ) Selline teave võib pärineda muudest allikatest, nagu samalaadse struktuuriga ühendite 
hüdrolüüsi andmed kirjandusest või muud poolkvantitatiivsed hüdrolüüsi eelkatsed uuri ­
tava ainega varasemas väljaarendamisetapis.
 1.8.5.2.  Ebastabiilse aine hüdrolüüs (2. aste)  
Kõrgema astme katse sooritatakse pH väärtustel, mille juures uuritav 
aine leiti olevat ebastabiilne vastavalt eespool toodud eelkatse määratlusele. Katseaine puhverdatud lahused termostateeritakse 
valitud temperatuuridel. Et kontrollida, kas tegemist on 1. järgu 
reaktsiooniga, tuleb iga reaktsioonilahust analüüsida ajavahemike järel, millega saadakse vähemalt kuus eraldi paiknevat andmepunkti uuritava aine 10–90 %lise hüdrolüüsi vahel. Võetakse individuaalsed 
paralleelsed proovid (vähemalt kaks proovi eraldi reaktsiooninõudest) 
vähemalt kuuel proovivõtuajal ja nende sisu analüüsitakse (et saada vähemalt kaksteist paralleeliga andmepunkti). Ühe koondproovi 
kasutamist, millest igal proovivõtuajal võetakse uuritava aine lahuse 
individuaalsed alikvoodid, peetakse ebapiisavaks, kuna see ei võimalda analüüsida andmete varieeruvust ja võivad tekkida raskused uuritava aine lahuse saastumise tõttu. Kõrgema astme 
katse lõpus (st 90 %lise hüdrolüüsi juures või 30 päeva möödudes) 
tuleb näidata, et lahuse steriilsus on säilinud. Kui lagunemist (st muundumist) ei täheldata, ei peeta steriilsuse katseid siiski vajali ­
kuks.
 
1.8.5.3.  Hüdrolüüsisaaduste kindlakstegemine (3. aste)  
Sobivate määramismeetoditega tuleb kindlaks teha kõik peamised 
hüdrolüüsisaadused, vähemalt sellised, mis moodustavad üle 10 % kasutatud kogusest.
 
1.8.5.4.  Mittekohustuslikud katsed  
Kergesti hüdrolüüsuva uuritava aine puhul võivad olla vajalikud 
lisakatsed muudel pH väärtustel kui 4, 7 ja 9. Näiteks võib füsio ­
loogiaga seotud eesmärkidel olla vajalik teha katse happelisemates 
tingimustes (nt pH 1,2) füsioloogiliselt olulise temperatuuri (37  o C) 
juures.  
2. ANDMED  
Uuritava aine ja hüdrolüüsisaaduste (kui neid on vaja uurida) 
kogused iga proovivõtuintervalli ning iga pH ja katsetemperatuuri puhul esitatakse, kui see on asjakohane, protsendina esialgsest kasu ­
tatud kontsentratsioonist ning vajaduse korral ühikutes mg/l. Kui 
kasutati märgisega ainet, tuleb lisaks esitada massibilanss protsendina 
esialgsest kasutatud kontsentratsioonist.
 
Tuleb koostada graafik uuritava aine kontsentratsiooni logaritmi 
sõltuvuse kohta ajast. Kõik peamised hüdrolüüsisaadused, vähemalt need, mis moodustavad ≥ 10 % kasutatud kogusest, tuleb kindlaks 
teha ja esitada nende kontsentratsiooni logaritmid samal viisil graa ­
fikul nagu nende lähteainete puhul, et näidata nende tekkimise ja 
lagunemise kiirusi.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. ANDMETE TÖÖTLEMINE  
Täpsema poolestusaja või DT  50 väärtuse arvutamiseks tuleb kasutada 
sobivaid kineetilisi arvutusmudeleid. Poolestusaja ja/või DT  50 väär­
tused (koos usalduspiiridega) tuleb arvutada iga pH ja temperatuuri 
jaoks, näidates ära ka mudeli, mida kasutati reaktsiooni kineetika 
järgu ja determinatsioonikordaja (r  2 ) määramisel. Võimaluse korral 
tuleb need arvutused teha ka hüdrolüüsisaaduste jaoks.  
Erinevatel temperatuuridel tehtud kiiruse mõõtmiste puhul tuleb 
pseudoesimest järku hüdrolüüsi kiiruskonstante (k  0bS ) kirjeldada 
temperatuuri funktsioonina. Arvutus peaks põhinema nii k  obs eralda­
misel happekatalüütilise, neutraalse ja alusekatalüütilise hüdrolüüsi 
kiiruskonstantideks (k  H , k neutral  , k OH ) kui ka Arrheniuse võrrandil:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
kus A  i ja B  i on regressioonikonstandid, mis leitakse sirge algordi ­
naadist ja tõusust, mis on lineaarse regressiooniga pandud läbi ln k  i 
väärtuse ja kelvinites väljendatud absoluutse temperatuuri (T) pöörd ­
väärtusega määratud punktide. Kasutades neid Arrheniuse suhteid 
happekatalüütilise, neutraalse ja alusekatalüütilise hüdrolüüsi jaoks, 
saab pseudoesimest järku kiiruskonstandid ja seega poolestusajad välja arvutada teiste temperatuuride jaoks, mille puhul otsene ekspe ­
rimentaalne kiiruskonstandi määramine pole teostatav (10).
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Enamik hüdrolüüsireaktsioone toimub pseudoesimest järku reaktsioo ­
nina ja seetõttu on poolestusajad sõltumatud kontsentratsioonist (vt 2. liites võrrandit 4). See võimaldab tavaliselt 10
 –2 kuni 10  –3 M juures 
määratud laboratoorseid tulemusi üle kanda keskkonnatingimustele 
(≤ 10  –6 M) (10). Mabey ja Mill (11) on esitanud rea näiteid selle 
kohta, et puhtas vees ja looduslikus vees mõõdetud hüdrolüüsi kiirused on eri kemikaalide puhul olnud heas kooskõlas, kui nii 
pH kui ka temperatuur olid mõõdetud.
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuandes tuleks esitada vähemalt järgmine teave.  
Uuritav aine:  
— tavanimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem 
(milles on näidatud märgise asukoht, kui kasutatakse radioak ­
tiivse märgisega materjali) ja olulised füüsikalis-keemilised omadused (vt punkti 1.5);
 
— uuritava aine puhtus (lisandid);  
— märgise puhtus märgisega kemikaali puhul ja molaarne aktiivsus 
(vajaduse korral).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Puhverlahused:  
— valmistamise kuupäevad ja üksikasjad;  
— kasutatud puhvrid ja vesi;  
— puhverlahuste molaarsus ja pH.  
Katsetingimused:  
— uuringute tegemise kuupäevad;  
— uuritava aine kasutatud kogus;  
— uuritava aine lisamiseks kasutatud meetod ja lahustid (liik ja 
kogus);  
— inkubeeritud uuritava aine puhverdatud lahuste mahud;  
— kasutatud inkubatsioonisüsteemi kirjeldus;  
— pH ja temperatuur uuringu jooksul;  
— proovivõtuajad;  
— ekstraktsioonimeetod(id);  
— uuritava aine ja selle hüdrolüüsisaaduste puhverlahuses kindlaks ­
tegemise ja nende koguse määramise meetodid;  
— paralleelproovide arv.  
Tulemused:  
— kasutatud määramismeetodite korratavus ja tundlikkus;  
— määramissaagised (väärtused (%) õigesti tehtud uuringu jaoks on 
esitatud punktis 1.7.1);  
— paralleelproovide andmed ja keskmised tabelina;  
— massibilanss kogu katse ajal ja lõpus (kui kasutatakse märgisega 
ainet);  
— eelkatse tulemused;  
— tulemuste arutelu ja tõlgendamine;  
— kõik originaalandmed ja -näidud.  
Järgmine teave on vajalik ainult siis, kui määratakse hüdrolüüsi 
kiirust:  
— uuritava aine ja vajaduse korral hüdrolüüsisaaduste kontsentrat ­
siooni graafikud sõltuvusena ajast iga pH väärtuse ja tempera ­
tuuri juures;  
— Arrheniuse võrrandi tulemuste tabelid temperatuuri 20  o C/25  o C 
jaoks koos pH, kiiruskonstandi [h  -1 või päev  -1 ], poolestusaja või 
DT 50 ja temperatuuridega [  o C], koos usalduspiiride ja korrelat ­
sioonikordaja (r  2 ) vms andmetega;  
— hüpotees hüdrolüüsitee kohta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. VIITED  
1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.  
2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
4) Euroopa Liit (EL) (1995). Komisjoni direktiiv 95/36/EÜ, 
millega muudetakse nõukogu direktiivi 91/414/EMÜ taimekait ­
sevahendite turuleviimise kohta; V liide. Säilimine ja toime keskkonnas.
 
5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
 
7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assess ­
ment Nr.23.
 
9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
 
10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of Envi ­
ronmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 
1993).  
11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis of 
organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383–415.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
1. liide  
Hüdrolüüsi uuringu astmeline skeem
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
2. liide  
Mõisted ja mõõtühikud  
Kõigil juhtudel tuleb kasutada  rahvusvahelise süsteemi (SI) standardseid 
mõõtühikuid.  
Uuritav aine –  mis tahes aine, kas lähteühend või asjaomased muundumissaa ­
dused.  
Muundumissaadused –  kõik ained, mis tekivad uuritava aine biootiliste või 
abiootiliste muundumisreaktsioonide tulemusel.  
Hüdrolüüsisaadused –  kõik ained, mis tekivad uuritava aine hüdrolüütiliste 
muundumisreaktsioonide tulemusel.  
Hüdrolüüs –  uuritava aine RX reaktsioon veega, mille tulemusena X-rühm 
reaktsioonitsentris asendub OH-rühmaga: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
Aine RX kontsentratsiooni vähenemise kiirust selles lihtsustatud protsessis 
kirjeldab järgmine võrrand: 
kiirus = k [H  2 O] [RX] teist järku reaktsioon 
või 
kiirus = k [RX] esimest järku reaktsioon,  
sõltuvalt kiirust määravast staadiumist. Kuna vett on uuritava ainega võrreldes 
väga palju, kirjeldab seda tüüpi reaktsiooni tavaliselt pseudoesimest järku reakt ­
siooni võrrand, milles mõõdetav kiiruskonstant on määratud seosega 
k obs = k [H  2 O] [2]  
ja selle saab määrata valemist (  1 ) 
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
kus 
t = on aeg  
ja C  0 , C t = on RX kontsentratsioonid ajahetkedel 0 ja t.  
Selle konstandi ühik on (aeg)  –1 ja reaktsiooni poolestusaeg (aeg, mis kulub 50 % 
RX-i reageerimiseks) on määratud seosega  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Poolestusaeg –  (t 0,5 ) on aeg, mis kulub 50 % uuritava aine hüdrolüüsiks, kui 
reaktsiooni saab kirjeldada esimest järku kineetikaga; see ei sõltu kontsentratsioo ­
nist. ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
( 1 ) Kui logaritmitud andmete ja aja seose graafik ei ole sirge (mis vastab esimest järku 
reaktsioonile), siis ei sobi valem (3) katseaine hüdrolüüsi kiiruskonstandi määramiseks.
 DT 50 (50 % kadumisaeg) –  aeg, mille jooksul uuritava aine kontsentratsioon 
väheneb 50 % võrra; see on erinev poolestusajast t  0,5 , kui reaktsioon ei järgi 
esimest järku kineetikat.  
k hindamine eri temperatuuridel  
Kui on teada kiiruskonstandid kahe temperatuuri juures, saab kiiruskonstandid 
teiste temperatuuride juures arvutada Arrheniuse valemiga:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T või ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Graafik, mis kujutab ln k sõltuvust 1/T-st, annab sirgjoone tõusuga –E/R,  
kus: 
k = erinevatel temperatuuridel mõõdetud kiiruskonstant  
E = aktivatsioonienergia [kJ/mol]  
T = absoluutne temperatuur [K]  
R = gaasikonstant [8,314 J/mol.K]  
Aktivatsioonienergia arvutatakse regressioonanalüüsi teel järgmisest võrrandist:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
kus T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
3. liide  
Puhversüsteemid  
A. CLARK ja LUBS  
CLARKI ja LUBSI puhversegud  (*) 
Koostis pH  
0,2 N HCl ja 0,2 N KCl 20  o C JUURES  
47,5 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml 1,4 
13,15 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml 1,8 
5,3 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl, lahjendatud kuni 100 ml 2,2  
0,1 M kaaliumbiftalaat + 0,1 N HCl 20  o C juures  
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 2,2 39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 2,8 20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 3,0 
14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 3,4 
5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 3,6 
2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 3,8  
0,1 M kaaliumbiftalaat + 0,1 N NaOH 20
 o C juures  
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 4,0 
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 4,2 7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 4,6 
17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Nendes tabelites toodud pH väärtused on arvutatud potentsiaali mõõtmistest, kasutades Sörenseni standard ­
võrrandeid (1909). Vastavad pH väärtused on 0,04 ühikut suuremad kui tabelis olevad väärtused.
 Koostis pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaati kuni 100 ml 6,0
 
CLARKI ja LUBSI puhversegud (järg) 
0,1 M monokaaliumfosfaat + 0,1 N NaOH 20  o C juures  
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 6,0 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaati kuni 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 BO  3 0,1 M KCl-s + 0,1 N NaOH 20  o C juures  
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 9,6 40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorhapet kuni 100 ml 10,0
 
B. KOLTHOFF ja VLEESCHHOUWER  
KOLTHOFFI ja VLEESCHHOUWERI tsitraatpuhvrid  (*) 
Koostis pH  
0,1 M monokaaliumtsitraat ja 0,1 N HCl 18  o C juures  (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 2,4 36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 2,6 30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 2,8 23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 3,0 
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 3,6  
0,1 M monokaaliumtsitraat ja 0,1 N NaOH 18
 o C juures  (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 4,2 
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 4,4 31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 5,0 
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 5,4 
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 5,6 
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 5,8 81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml tsitraati kuni 100 ml 6,0
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Lisada väike tümooli- või samalaadse aine kristall hallitusseente kasvu ärahoidmiseks.
 C. SÖRENSEN  
SÖRENSENI boraadisegud  
Koostis Sörensen 
18 o C Walbum, pH temperatuuril: 
ml booraksit ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M booraks + 0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 
7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 
7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 
9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 
9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M booraks + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 
8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 
6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
SÖRENSENI fosfaadisegud  
Koostis pH  
0,0667 M monokaaliumfosfaat + 0,0667 M  dinaatriumfosfaat 20  o C juures 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOKSILISUS VIHMAUSSIDELE  
TEHISMULLA KATSE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Selles laboratoorses katses lisatakse uuritav aine tehismullale, milles 
14 päeva jooksul usse hoitakse. Pärast seda perioodi (ja valikuliselt seitsme päeva pärast) uuritakse katseaine letaalset mõju vihmaussi ­
dele. Katse annab suhteliselt kiire meetodi naha ja seedekulgla kaudu 
omastatavate kemikaalide mõju skriinimiseks vihmaussidel.
 
1.2. DEFINITSIOON JA ÜHIK  
LC 50 – aine kontsentratsioon, mis arvestuslikult tapab uuringupe ­
rioodil 50 % katseloomadest.  
1.3. VÕRDLUSAINE  
Võrdlusainet kasutatakse perioodiliselt kui vahendit, mis näitab, et 
katse süsteemi tundlikkus pole oluliselt muutunud.  
Võrdlusainena soovitatakse kasutada analüütilise klassi kloroatseta ­
miidi.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Muld on varieeruv keskkond, seepärast kasutatakse selles katses 
hoolikalt määratletud tehislikku liivsavi mulda. Täiskasvanud vihmausse liigist  Eisenia foetida  (vt märkust liites) hoitakse kindlas 
tehismullas, mida on töödeldud uuritava aine erinevate kontsentrat ­
sioonidega. Konteinerite sisu puistatakse kandikule laiali 14 päeva 
(ja valikuliselt seitse päeva) pärast katse algust ning loendatakse iga kontsentratsiooni juures ellujäänud vihmaussid.
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Katse on planeeritud katsesubstraadi ja organismi osas võimalikult 
hästi korratavana (reprodutseeritavana). Suremus kontrollis ei tohi katse lõpuks olla kõrgem kui 10 %, vastasel juhul on katse kehtetu.
 
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Materjalid  
1.6.1.1. K a t s e s u b s t r a a t  
Katse põhisubstraadina kasutatakse kindla koostisega tehismulda.  
a) Põhisubstraat (protsendid on antud kuivkaalu kohta)  
— 10 %  Sphagnu m ’i turvast (pH võimalikult lähedal vahemi ­
kule 5,5–6,0 ning ilma nähtavate taimejäänusteta, ühtlaselt 
peenestunud);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaoliniitsavi, milles võiks olla üle 50 % kaoliniiti;  
— umbes 69 % tööstuslikku kvartsiliiva (ülekaalus oleva peene 
liiva osakestest üle 50 % on suurusega 0,05 kuni 0,2 mm). 
Kui aine vees piisavalt ei dispergeeru, tuleb jätta 10 g iga 
katseanuma jaoks saadavale, et see hiljem katseainega segada;  
— lisatakse umbes 1 % keemiliselt puhast peenestatud kaltsium ­
karbonaati (CaCO  3 ), et pH oleks 6,0 ± 0,5.  
b) Katsesubstraat  
Katsesubstraat sisaldab põhisubstraati, katseainet ja deioniseeritud 
vett. 
Veesisaldus on 25–42 % põhisubstraadi kuivkaalust. Substraadi 
veesisaldus määratakse kindlaks proovi kuivatamisel 105  o C 
juures konstantse kaaluni. Võtmekriteerium on, et tehismuld 
tuleb niisutada punktini, kus pole seisvat vett. Segamisel tuleb hoolega jälgida, et substraat ja uuritav aine seguneksid ühtlaselt. 
Ära tuleb näidata uuritava aine substraati viimise viis.
 
c) Kontrollsubstraat  
Kontrollsubstraat koosneb põhisubstraadist ja veest. Kui kasuta ­
takse mõnda lisaainet, peab täiendav kontroll sisaldama sama 
koguse seda lisaainet.  
1.6.1.2. K a t s e a n u m a d  
Umbes üheliitrise mahuga klaasanumad (kaetud plastkaante, katete 
või plastkilega, milles on ventileerimiseks augud), mis on täidetud 500 g kuivale substraadile vastava koguse märja katse- või kontroll ­
substraadiga.
 
1.6.2.  Katsetingimused  
Konteinereid tuleb hoida kliimakambris temperatuuri 20 ± 2  o C 
pidevas valguses. Valgusintensiivsus peaks olema 400 kuni 800 
luksi.  
Uuringuperiood on 14 päeva, kuid suremust võib hinnata valikuliselt 
seitse päeva pärast katse algust.  
1.6.3.  Katse käik  
K a t s e k o n t s e n t r a t s i o o n i d  
Uuritava aine kontsentratsioonid väljendatakse aine massina põhi ­
substraadi kuivkaalu kohta (mg/kg).  
V a h e m i k u l e i d m i s e k a t s e  
Kontsentratsioonide vahemikku, mis põhjustab 0–100 %lise sure ­
vuse, võib määrata vahemiku leidmise katsega. Nii saadakse infor ­
matsiooni kontsentratsioonide vahemiku kohta, mida tuleb kasutada 
lõplikus katses.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Ainet tuleks uurida järgnevate kontsentratsioonide juures: 1 000; 
100; 10; 1; 0,1 mg ainet/kg uuritava substraati (kuivkaalus) kohta.  
Kui tehakse täielik lõplik katse, piisab vahemiku leidmiseks ühest 
uuringuseeriast iga kontsentratsiooni kohta ja ühest uuringuseeriast töötlemata kontrolli kohta, igas seerias kümme vihmaussi.
 
L õ p l i k k a t s e  
Vahemiku leidmiseks tehtud uuringu tulemusi kasutatakse vähemalt 
viie geomeetrilises reas oleva kontsentratsiooni valimiseks, mis 
katavad surevuse vahemiku 0–100 % ja erinevad konstantse faktori poolest, mis ei ole suurem kui 1,8.
 
Uuringud, mis kasutavad neid kontsentratsiooni seeriaid, peaks 
võimaldama LC  50 väärtust ja selle usaldatavuse piire hinnata nii 
täpselt kui võimalik.  
Lõpliku katse puhul kasutatakse vähemalt nelja uuringukomplekti iga 
kontsentratsiooni kohta ja nelja töötlemata kontrolli, igas kümme ussi. Nende korduskomplektide tulemused esitatakse keskmise ja 
standardhälbe kujul.
 
Kui kaks järjestikust kontsentratsiooni suhtega 1,8 annavad ainult 
0 % ja 100 % surevuse, siis need kaks väärtust on piisavad näita ­
maks vahemikku, kuhu LC  50 langeb.  
K a t s e p õ h i s u b s t r a a d i j a u u r i t a v a a i n e s e g u  
Kui vähegi võimalik, tuleks katsesubstraat valmistada ilma igasuguse 
lisaaineta, v.a vesi. Vahetult enne uuringu algust segatakse uuritavast ainest deioniseeritud vette või muusse lahustisse tehtud emulsioon või dispersioon uuringu põhisubstraadiga või pritsitakse ühtlaselt 
selle peale peene kromatograafilise või samalaadse pihustiga.
 
Vees lahustumatu katseaine võib lahustada võimalikult väikeses 
sobiva orgaanilise lahusti koguses (näiteks heksaan, atsetoon või kloroform).
 
Uuritava aine lahustamiseks, dispergeerimiseks või emulgeerimiseks 
võib kasutada ainult kergesti lagunevaid aineid. Uuritavat substraati 
tuleb enne kasutamist aereerida. Aurustunud vesi tuleb samas 
koguses asendada. Kontroll peab sisaldama sama koguse iga lisaainet.
 
Kui uuritav aine pole orgaanilises lahustis lahustatav, dispergeeritav 
või emulgeeritav, segatakse 10 g peeneteralise kvartsliiva ja 500 g 
kuivkaalus tehismulla töötlemiseks vajaliku katseaine segu 490 g 
kuiva katsesubstraadiga.  
Iga katsekomplekti jaoks pannakse igasse klaasanumasse 500 g kuiv ­
kaalus substraadiga ekvivalentne kogus niisket substraati ning uuri ­
tava substraadi pinnale 10 vihmaussi, keda on eelnevalt 24 tunni 
jooksul hoitud samasuguses niiskes põhisubstraadis, siis kiirelt 
pestud ja enne kasutamist filterpaberil üleliigsest veest kuivatatud.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Konteinerid kaetakse perforeeritud plastkaante, katete või kilega, 
vältimaks substraadi kuivamist, ning hoitakse 14 päeva katsetingi ­
mustes.  
Hindamised tuleb teha 14 päeva (valikuliselt seitse päeva) pärast 
katse üles seadmist. Substraat laotatakse klaasist või roostevabast terasest tehtud alusele. Vihmaussid vaadatakse üle ja loetakse 
kokku ellujäänud vihmaussid. Vihmaussid tunnistatakse surnuks, 
kui nad ei vasta keha eesosa õrnale mehhaanilisele stimuleerimisele.
 
Kui ülevaatus tehakse seitsmendal päeval, täidetakse konteiner uuesti 
substraadiga ja ellujäänud vihmaussid pannakse sama katsesubstraadi 
pinnale tagasi.  
1.6.4.  Katseorganismid  
Katseorganismideks peavad olema täiskasvanud  Eisenia foetida  
eksemplarid (vt märkust liites) (vähemalt kahe kuu vanused, klitel ­
lumiga) kaaluga 300 kuni 600 mg (kasvatamise meetodeid vt liitest).  
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE JA HINDAMINE  
Uuritud aine kontsentratsioonid esitatakse vastavate surnud vihmaus ­
side protsentide suhtes.  
Kui andmed on küllaldased, määratakse LC  50 väärtus ja usalduspiirid 
(p = 0,05) standardmeetodite abil (Litchfield ja Wilcoxon, 1949, ekvivalentne meetod). LC
 50 esitatakse kui testaine (mg) uuritava 
substraadi (kg) kohta (kuivkaalus).  
Neil juhtudel, kui kontsentratsioonikõvera tõus on liiga järsk LC  50 
arvutamise võimaldamiseks, piisab selle väärtuse graafilisest hinda ­
misest.  
Kui kaks järjestikust kontsentratsiooni vahega 1,8 annavad ainult 
0 % ja 100 % surevuse, piisab neist kahest väärtusest selle vahemiku 
näitamiseks, kuhu LC  50 jääb.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:  
— kinnitus, et katse on tehtud vastavalt ülalmainitud kvaliteedikri ­
teeriumidele;  
— tehtud katse (vahemiku leidmise uuring ja/või lõplik katse);  
— katsetingimuste täpne kirjeldus või kinnitus, et katse on tehtud 
kooskõlas meetodiga; kõik kõrvalekalded tuleb loetleda;  
— täpne uuritava aine ja põhisubstraadi segamise kirjeldus;  
— katseorganisme puudutav informatsioon (liik, vanus, keskmine 
kaal ja kaalude vahemik, hoidmise ja paljundamise tingimused, 
tarnija);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— LC  50 määramiseks kasutatud meetod;  
— katse tulemused koos kõigi kasutatud andmetega;  
— katseorganismidel täheldatud sümptomite või käitumise muutuste 
kirjeldus;  
— surevus kontrollides;  
— LC  50 või kõrgeim katsetatud ilma surevuseta kontsentratsioon ja 
madalaim 100 %lise surevusega katsetatud kontsentratsioon 14 päeva (ja valikuliselt seitse päeva) pärast katse alustamist;
 
— kontsentratsiooni/vastusreaktsiooni kõvera joonistamine;  
— võrdlusaine abil saadud tulemused, kas seoses käesoleva katsega 
või varasematest kvaliteedikontrollidest.  
4. VIITED  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council 
C(81) 30 final.  
2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, 
Chapman and Hall, London, p. 331.  
3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Syste ­
matique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 pp.  
4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of 
evaluation dose effect experiments./. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
 
5) Commission of the European Communities, Development of a 
standardized laboratory method for assessing the toxicity of 
chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.  
6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorsch-lag „Toxizitäts ­
test am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden”, in: 
Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Liide  
Vihmausside kasvatamine ja hoidmine enne uurimist  
Loomade paljundamiseks pannakse 30 kuni 50 täiskasvanud ussi värske subs ­
traadiga kasvatamise karpi, kust nad võetakse välja 14 päeva pärast. Neid loomi võib kasutada edaspidiste paljundamiste jaoks. Kookonitest koorunud vihmausse 
kasutatakse uuringuks, kui nad on täiskasvanud (ettenähtud tingimustes kahe või 
kolme kuu pärast).
 
Hoidmise ja paljundamise tingimused  
Kliimakamber: temperatuur 20 ± 2  o C, eelistatavalt pidevas valguses (inten ­
siivsus 400 kuni 800 luksi).  
Kasvatamise 
karbid: sobivad 10 kuni 20 1 mahuga madalad anumad.  
Substraat:  Eisenia foetida ’t võib kasvatada erinevate loomade ekskremen ­
tides. Kasvukeskkonnana soovitatakse 50 % turba ja 50 % 
lehma- või hobusesõnniku segu. Segu pH peaks olema 6 kuni 
7 (reguleerida kaltsiumkarbonaadiga) ja ioonjuhtivus madal (väiksem kui 6 mmhos või 0,5 % soola kontsentratsioon). 
Substraat peab olema niiske, kuid mitte liiga märg.
 
Lisaks ülaltoodud meetodile võib kasutada ka teisi tulemuslikke 
metoodikaid.  
Märkus.  Olemas on mitu  Eisenia foetida  rassi, mida mõned taksonomistid on 
eristanud liikidena (Bouche, 1972). Need on morfoloogiliselt sarnased, välja 
arvatud  Eisenia foetida foetida,  mille segmendid on tüüpiliselt põikitriipude või 
–ribadega, ja  Eisenia foetida andrei,  millel need puuduvad ja punane värvus on 
varieerunud. Võib kasutada teisi liike, kui vajalik metoodika on olemas.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIODEGRADATSIOON ZAHNI-WELLENSI KATSE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev meetod on mõeldud vesilahustuvate mittelenduvate orgaa ­
niliste ainete täieliku biodegradatsiooni hindamiseks staatilises 
katses, eksponeerituna suhteliselt suurele mikroorganismide kontsen ­
tratsioonile.  
Võimalik on füüsikalis-keemiline adsorptsioon suspendeeritud 
kuivainele, mida tuleks arvestada tulemuste interpreteerimisel 
(vt 3.2).  
Uuritavaid aineid kasutatakse kontsentratsioonides, mis vastavad 
LOS-väärtustele vahemikus 50 kuni 400 mg/l või KHT-väärtus ­
tele vahemikus 100 kuni 1 000 mg/l (LOS = lahustunud orgaaniline süsinik, KHT = keemiline hapnikutarve). Nende 
suhteliselt suurte kontsentratsioonide eeliseks on analüütiline 
usaldusväärsus. Toksilise toimega ühendid võivad lagunemisprot ­
sessi aeglustada või inhibeerida.
 
Selle meetodi puhul kasutatakse uuritava aine täieliku bioloogilise 
lagunemise hindamiseks lahustunud orgaanilise süsiniku või keemi ­
lise hapnikutarve mõõtmist.  
Samaaegne spetsiifilise analüüsimeetodi rakendamine võib anda 
võimaluse määrata aine primaarset biolagunemist (eelühendi keemi ­
lise struktuuri kadumine).  
Meetod on kasutatav ainult nende uuritavate orgaaniliste ainete 
puhul, mis katses kasutatud kontsentratsiooni juures  
— on katsetingimustel veeslahustuvad;  
— omavad katsetingimustel ebaolulist aururõhku;  
— ei ole bakterite suhtes pärssiva toimega;  
— imenduvad katsesüsteemi vaid piiratud ulatuses;  
— ei kao katselahusest vahu tekke tulemusena.  
Katsetulemuste tõlgendamisel on kasulik teada uuritava materjali 
põhikomponentide kohta käivat teavet. Seda eelkõige juhtudel, kui 
tulemused on väga väikesed või alammääralised.  
Teave uuritava aine toksilisusest mikroorganismidele on vajalik 
väikeste tulemuste tõlgendamisel ja sobivate kontsentratsioonide vali ­
misel.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Katse lõpuks saavutatud biolagunemise määr on Zahni-Wellensi 
testis tuntud kui „biolagunemine”:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100  
kus: 
DT = biodegradatsioon (%) ajahetkel T,  
C A = LOS- (või KHT-) väärtused katsesegus kolm tundi pärast 
katse algust (mg/l) (LOS = lahustunud orgaaniline süsinik, 
KHT = keemiline hapnikutarve),  
C T = LOS- või KHT-väärtused katsesegus proovi võtmise ajal 
(mg/l),  
C B = LOS- või KHT-väärtused „tühja” proovi võtmise ajal 
(mg/l),  
C BA = tühja proovi LOS- või KHT-väärtused, mõõdetuna kolm 
tundi pärast testi algust (mg/l).  
Lagunemise ulatus ümardatakse lähima täisarvulise protsendini.  
Lagunemise protsent esitatakse kui LOSi (või KHT) eraldamine testi ­
tavast ainest.  
Erinevus kolme tunni järel mõõdetud väärtuse ja arvutatud või eelis ­
tatult mõõdetud algväärtuse vahel võib anda kasulikku informat ­
siooni aine eliminatsiooni kohta (vt 3.2 „Tulemuste tõlgendamine”).  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Mõnel juhul, kui uuritakse uusi aineid, võivad võrdlusained olla 
kasulikud, siiski ei saa veel soovitada spetsiifilisi võrdlusaineid.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Aktiivmuda, mineraalsed toitained ja uuritav materjal (ainuke süsi ­
niku allikas vesilahuses) segatakse kokku ühe-kuni neljaliitrises klaa ­
sanumas, mis on varustatud segisti ja aeraatoriga. Segu segatakse ja aereeritakse 20 kuni 25
 o C juures üldvalgustatud või pimedas ruumis 
kuni 28 päeva. Lagunemisprotsessi jälgitakse LOS- (või KHT-) väär ­
tuste määramisel filtreeritud lahuses, mida tehakse iga päev või muude sobivate ajavahemike järel. Kõikide ajavahemike järel mõõdetud elimineeritud LOS- (või KHT-) väärtuste suhet kolme 
tunni möödumisel saadud näitajaga väljendatakse protsentides biode ­
gradatsioonina. Saadud tulemus näitab degradatsiooni ulatust antud ajavahemikus.
 
Kui kasutatakse spetsiifilist analüüsimeetodit, saab mõõta biodegra ­
datsioonist tingitud eellasmolekuli kontsentratsiooni muutusi 
(primaarne biodegradatsioon).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Käesoleva katse korduvteostatavus on ringtesti järgi piisav.  
Käesoleva meetodi tundlikkuse määrab suures osas põhilahuse 
varieeruvus ning vähesemal määral lahustunud orgaanilise süsiniku 
määramise täpsus ja uuritava ühendi sisaldus vedelikus iga tsükli alguses.
 
1.6. KATSEPROTSEDUURI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistused  
1.6.1.1. R e a g e n d i d  
Uuritav vesi: joogivesi, mille orgaanilise süsiniku sisaldus on < 
5 mg/l. Kaltsium- ja magneesiumioonide kontsentratsioon ei tohi koos ületada näitajat 2,7 mmol/l; vastasel juhul on vaja piisav 
lahjendus deioniseeritud või destilleeritud veega. 
Väävelhape, analüüsi reagent (A.R.): 50 g/l 
Naatriumihüdroksiidi lahus A.R.: 40 g/l 
Mineraalainetega toitelahus: lahustada ühes liitris deio ­
niseeritud vees: 
ammooniumkloriid, NH
 4 Cl, A.R.: 38,5 g 
naatriumdivesinikfosfaat, NaH  2 PO 4 .2H  2 O, A.R.: 33,4 g 
kaaliumdivesinikfosfaat, KH  2 PO 4 , A.R.: 8,5 g 
dikaaliumvesinikfosfaat, K  2 HPO  4 , A.R.: 21,75 g  
Segu on nii toitelahuseks kui ka puhversüsteemiks.  
1.6.1.2. S e a d m e d  
Klaasnõud mahuga üks kuni neli liitrit (näiteks silindrilised anumad).  
Segisti klaasist või metallist segajaosaga sobiva varre küljes (segaja 
peaks pöörlema ligikaudu 5 kuni 10 cm kõrgemalt anuma põhjast). 
Kasutada võib ka 7 kuni 10 cm pikkuse pulgaga magnetsegajat.  
2 kuni 4 mm siseläbimõõduga klaastoru õhu sissejuhtimiseks. Toru 
avaus peaks olema ligikaudu 1 cm kõrgusel anuma põhjast.  
Tsentrifuug (ligikaudu 3 550 g).  
pH-meeter.  
Lahustunud hapniku mõõtmise seade.  
Paberfiltrid.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Aparatuur membraanfiltreerimiseks.  
Membraanfiltrid poori läbimõõduga 0,45 μn. Membraanfiltrid on 
sobivad, kui on kindel, et nad ei lase läbi süsinikku ega absorbeeri 
aineid filtratsiooni etapis.  
Analüüsivarustus orgaanilise süsiniku sisalduse ja hapnikutarve 
määramiseks.  
1.6.1.3. I n o k u l a a d i v a l m i s t a m i n e  
Reoveepuhastist pärit aktiivmuda pestakse (korduvalt) tsentrifuugi ­
misel või katsevees setitamisel (vt ülalt).  
Aktiivmuda peab olema sobivate omadustega. Sellist muda saadakse 
õigesti töötavatest reoveepuhastitest. Võimalikult paljude erinevate 
bakteriliikide ja -tüvede saamiseks võib olla sobivaim meetod erine ­
vatest allikatest pärit inokulaatide kokku segamine (näiteks erinevad reoveepuhastid, mullaekstraktid, jõevesi jne). Segu tuleb töödelda, 
nagu allpool kirjeldatud.
 
Aktiivmuda aktiivsuse kontrollimiseks vt allpool „Funktsionaalne 
kontroll”.  
1.6.1.4. K a t s e l a h u s t e v a l m i s t a m i n e  
Valada anumasse 500 ml katsevett, 2,5 ml/l mineraalainetega toite ­
lahust ja aktiivmuda koguses, mis annab lõpliku segu kuivaine sisal ­
duseks 0,2 kuni 1,0 g/l. Lisada piisavalt uuritava aine põhilahust, et lõpliku segu LOS-kontsentratsioon oleks 50 kuni 400 mg/l. Vastavad 
KHT-väärtused on 100 kuni 1 000 mg/l. Lisage katsevett kuni üldko ­
guseks on üks kuni neli liitrit. Valitav lõppkogus oleneb KHT- ja LOS-määramiseks võetud proovide arvust ja analüüsiprotseduurideks vajalikust kogusest.
 
Normaalsel juhul on piisavaks koguseks kaks liitrit. Paralleelselt iga 
katseseeriaga hakatakse kasutama vähemalt ühte kontrollnõud (tühi); see sisaldab ainult aktiivmuda ja mineraalainetega toitelahust, mis lahustatakse katseveega teiste anumates olevate lahustega sama 
koguseni.
 
1.6.2.  Katse käik  
Katsenõudes olevat lahust segatakse magnetsegajaga või kruvipropel ­
leriga üldvalgustatud või pimedas ruumis temperatuuril 20 kuni 
25 o C. Aeratsiooni tehakse suruõhuga, mida puhastatakse vajaduse 
korral läbi puuvillast filtri või veega täidetud pesupudeli. Muda ei tohi settida ja hapniku kontsentratsioon ei tohi langeda alla 2 mg/l.
 
pH-väärtust tuleb kontrollida regulaarsete ajavahemike järel (näiteks 
üks kord päevas) ja kohandada vajaduse korral väärtusele pH 7 
kuni 8.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Aurustumisest tingitud kaod taastatakse vahetult enne proovi võtmist 
deioniseeritud või destilleeritud veega vastavalt vajalikule kogusele. 
Soovitatav on enne testi alustamist märkida ära vedelikunivoo kõrgus anumas. Uued märked tehakse pärast iga proovi võtmist (aereerimise ja segamiseta). Esimesed proovid võetakse alati kolm tundi pärast 
katse alustamist, et kindlaks teha uuritava materjali adsorptsiooni 
aktiivmuda poolt.
 
Uuritava aine eliminatsiooni jälgitakse LOS- ja KHT-määramistega 
iga päev või muude ajavahemike järel. Katse- ja kontrollnõust võetud proovid filtreeritakse läbi hoolikalt pestud paberfiltri. Esimesed 5 ml uuritavat lahusefiltraati visatakse ära. Raskesti filtree ­
ritavad mudaosad eemaldatakse eelnevalt lOminutilise tsentrifuugi ­
mise teel. LOS- ja KHT-määramisi tehakse vähemalt kaks korda ühest proovist. Katse kestuseks on kuni 28 päeva.
 
Märkus.  Häguseks jäänud proovid filtreeritakse läbi membraanfiltrite. 
Membraanfiltrid ei tohi vabastada ega adsorbeerida ühtegi orgaanilist 
ainet.  
A k t i i v m u d a f u n k t s i o n a a l n e k o n t r o l l  
Paralleelselt katseanumatega kasutatakse teatud kindlat lahust sisal ­
davat anumat, et kontrollida aktiivmuda funktsionaalsust. Dietüleeng ­
lükool on sellisel juhul osutunud kasulikuks kontroll-lahuseks.  
A d a p t a t s i o o n  
Kui analüüse tehakse suhteliselt lühikeste ajavahemike järel (näiteks 
kord päevas), on võimalik adaptatsiooni selgelt jälgida degradatsiooni kõveralt (vt joonis 2). Seetõttu ei tohiks katset alustada vahetult enne nädalavahetust.
 
Kui adaptatsioon tekib perioodi lõpus, võib katset pikendada 
kuni degradatsiooni lõppemiseni.  
Märkus.  Kui vajatakse täpsemat teavet adapteerunud muda käitumise 
kohta, võib sama aktiivmuda veel kord panna kokku sama uuritava 
materjaliga vastavalt järgnevalt kirjeldatud protseduurile:  
Lülitada segaja ja aeraator välja ja lasta aktiivmudal settida. Visata 
ära supernatant, täita anum katseveega kuni kahe liitrini, segada 15 minutit ja lasta jälle settida. Kui supernatant on jälle ära visatud, kasutage järelejäänud muda katse kordamiseks vastavalt eespool 
olevatele punktidele 1.6.1.4 ja 1.6.2. Aktiivmuda võib setitamise 
asemel eraldada ka tsentrifuugimise teel.
 
Adapteerunud muda võib segada värske mudaga kontsentratsioonini 
0,2 kuni 1 g kuivainet/l.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l ü ü s i k ä i k  
Tavalisel juhul filtreeritakse proovid läbi hoolikalt pestud paberfiltri 
(pesemiseks kasutada ioniseeritud vett).  
Häguseks jäänud proovid filtreeritakse läbi membraanfiltrite 
(0,45 μm). 
LOS-kontsentratsiooni määratakse ühest proovi filtraadist kaks korda 
(esimesed 5 ml tuleb ära visata) TOC järgi. Kui infiltraati ei ole 
võimalik analüüsida samal päeval, tuleb seda kuni järgmise päevani säilitada külmkapis. Pikemaajaline säilitamine ei ole soovitatav.
 
KHT-kontsentratsiooni määratakse proovi filtraatidest KHT-analüüsi 
meetodil, mida on kirjeldatud näitlikult allpool (2).  
2. ANDMED JA HINDAMINE  
LOS- ja/või KHT-kontsentratsioone määratakse ühest proovist vähe ­
malt kaks korda vastavalt eespool olevale punktile 1.6.2. Degradat ­
siooni ajahetkel T arvutatakse vastavalt valemile (definitsioonidega) mis on toodud eespool punktis 1.2.
 
Degradatsiooni ulatus ümardatakse lähima täisarvulise protsendini. 
Katse lõpus kindlaks tehtud degradatsiooni näitajat esitatakse kui 
„Biolagundatavus Zahni-Wellensi testi järgi”.  
Märkus.  Kui täielik degradatsioon saavutatakse enne katseaja lõppe ­
mist ja seda tulemust kinnitatakse järgneval päeval, võib katse lõpe ­
tada.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Võimaluse korral peaks katsearuanne sisaldama järgmist teavet:  
— uuritava aine algkontsentratsioon;  
— kogu ülejäänud teave ja kõik katsetulemused, mis puudutavad 
uuritavat ainet, võrdlusainet (kui kasutati) ja tühja proovi;  
— kontsentratsioon kolme tunni pärast;  
— biodegradatsiooni kõver koos selgitustega;  
— kuupäev ja koht, kust võeti uuritavate organismide proov, adap ­
teerumise kirjeldus, kasutatud kontsentratsioon jne;  
— uuringuprotseduuri muutuste teaduslik põhjendus.  
3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
LOS (KHT) vähenemine, mis leiab aset järk-järgult päevade ja näda ­
late jooksul, viitab uuritava aine biodegradeerumisele.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Mõnikord võib olulist rolli mängida füüsikalis-keemiline adsorpt ­
sioon. See on näidatud juhul, kui esineb täielik või osaline lisatud 
LOS-eliminatsioon alguses (esimese kolme tunni jooksul) ning erine ­
vused kontrolli ja katse supernatandi vahel jäävad oodatust väikse ­
mateks.  
Kui biodegradatsiooni (või osalise biodegradatsiooni) ja adsorpt ­
siooni tuleb eristada, on vajalikud täiendavad katsed.  
Seda saab teha mitmel erineval viisil, kuid kõige usaldusväärsem on 
supernatantvedeliku või muda kasutamine inokulaadina baasuuringu raames (eelistatult respiromeetriline uuring).
 
Selles uuringus tuleks kõrgeid, adsorptsiooni teel mitte eemaldata ­
vaid LOS (KHT) tulemusi pidada potentsiaalselt biolagundatavateks. 
Osaline adsorptsiooni teel mitteeemaldamine viitab sellele, et kemi ­
kaal allub vähemalt osalisele biodegradatsioonile. LOS-eemaldamise madalate või null-näitajate põhjuseks võib olla mikroorganismide 
pärssimine uuritava aine poolt ja selle võib vallandada ka muda 
lõhustamine või kadu, mis tekitab häguse supernatandi. Testi tuleks korrata, kasutades uuritava aine madalamaid kontsentratsioone.
 
Spetsiifilise analüütilise meetodi või  14 C-märgistatud uuritava aine 
kasutamine võib anda suurema tundlikkuse.  14 C testi ühendi kasuta ­
misel  14 CO 2 sedastamine kinnitab biodegradatsiooni teket.  
Kui tulemusi antakse ka primaarse biodegradatsiooni kohta, tuleks 
võimaluse korral anda selgitus keemilise struktuuri muutustele, mis viib uuritava eellasühendi vastusreaktsiooni kadumisele.
 
Analüütilise meetodi kinnitus tuleb edastada koos vastusega, mis 
saadi puhta katsekeskkonna kohta.  
4. VIITED  
1) OECD, Paris, 1981, Test  Guideline 302 B,  Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Commis ­
sion Directive 84/449/EEC (OJ L 251, 19.9.1984, p. 1).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Liide  
HINDAMISE NÄIDE 
Orgaaniline ühend: 4-etoksübensoehape 
Teoreetiline katsekontsentratsioon: 600 mg/1 Teoreetiline LOS: 390 mg/1 
Inokulaat reoveepuhasti 
Kontsentratsioon: 1 g kuivainet/l Adaptatsiooni tase: Pole kohandatud Analüüs: LOS-määramine 
Proovi kogus: 3 ml 
Kontrollaine: Dietüleenglükool Ühendi toksilisus: Toksilised toimed puuduvad kontsentratsioonil 
alla 1 000 mg/1 
Kasutatud test: ensümaatiline test
 
Katseaeg Kontrollaine Katseaine 
Tühi 
LOS (  1 ) 
mg/l LOS (  1 ) 
mg/l LOS, puhas 
mg/1 Degradat­
sioon 
% LOS (  1 ) 
mg/1 LOS, puhas 
mg/1 Degradat­
sioon 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 tundi 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 1 päev 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 2 päeva 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 päeva 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 päeva 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 päeva 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 päeva 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 päeva 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 päeva 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Kolme mõõtmise keskmine näitaja.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Joonis 1  
Biodegradatsioonikõverate näited
  
Joonis 2  
Aktiivmuda adaptatsiooni näited
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  REOVEE AEROOBSE TÖÖTLEMISE SIMULATSIOONIKATSE: 
C.10-A: AKTIIVMUDA – C.10-B: BIOKILED  
C.10-A: Aktiivmuda  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 303 (2001). 
1950. aastatel jõuti järeldusele, et hiljuti kasutusele võetud pindaktiivsed ained põhjustasid reoveepuhastites ja jõgedes liigset vahutamist. Neid ei kõrvaldatud täielikult aeroobse töötlemise käigus ja mõnel juhul need takis ­
tasid muude orgaaniliste ainete kõrvaldamist. Seepärast alustati mitmeid 
uuringuid selle kohta, kuidas pindaktiivseid aineid reoveest kõrvaldada ja kas tööstuses toodetud uusi kemikaale on üldse võimalik reoveest puhastada. Selleks kasutati mudelseadmeid, mis esindasid aeroobse bioloogilise reovee 
puhastamise kahte peamist tüüpi (aktiivmuda ja nõrgfiltri kasutamine). Iga 
uue kemikaali jaotamine puhastusjaamadesse ja suuremahuliste puhastusjaa ­
made jälgimine ei oleks olnud isegi kohalikul tasandil praktiline ning oleks 
olnud väga kulukas.
 
ESIALGSED KAALUTLUSED  
Aktiivmuda  
2. Aktiivmuda mudelühiku suurus on vahemikus 300 ml kuni ligikaudu 2 000 
ml. Mõned neist imiteerisid lähedaselt täiemahulisi puhastusjaamu; neil olid 
mudasettepaagid, milles settinud muda pumbati tagasi aeratsioonibasseini, teistel ei olnud settimisnõusid, näiteks Swisher (1). Seadme suuruse vali ­
misel on tehtud kompromiss; ühelt poolt peab see olema piisavalt suur, et 
seda oleks võimalik tulemuslikult mehaaniliselt käitada ja tagada piisav 
proovide kogus ilma käitamist mõjutamata, kuid teiselt poolt ei tohiks see olla nii suur, et selle rajamiseks oleks vaja liiga palju ruumi ja materjale.
 
3. Kaks laialdaselt ja rahuldavalt kasutatud seadmete vormi on Husmanni 
seadmed (2) ja poorse poti seadmed (3, 4), mida kasutati esmakordselt pindaktiivsete ainete uurimisel. Kõnealuseid seadmeid on kirjeldatud käes ­
olevas katsemeetodis. Rahuldavalt on kasutatud ka muid seadmeid, vt 
näiteks Eckenfelder (5). Kõnealuse simulatsioonikatse tegemise jaoks vaja ­
like suhteliselt suurte kulude ja jõupingutuste tõttu tehti sellega paralleelselt lihtsamad ja odavamad sõelkatsed, mis on nüüd esitatud käesoleva lisa peatüki C.4 meetodites C4.-A kuni C.4-F (6). Kogemused paljude pindak ­
tiivsete ainete ja muude kemikaalidega on näidanud, et sõelkatses kergesti 
biolagunevaks osutunud ained lagundati ka simulatsioonikatses. Mõned sõel ­
katse järgi mittelagundatavaks klassifitseeritud ainetest olid loomuliku biola ­
gundatavuse katsetes lagundatavad (käesoleva lisa peatükid C.12 (7) ja C.19 
(8)), kuid ainult mõnda ainet viimati nimetatud rühmast lagundati simulat ­
sioonikatses ning loomuliku biolagundatavuse katsetes mittelagunevaks klas ­
sifitseeritud kemikaalid ei lagunenud simulatsioonikatsetes (9, 10, 11).
 
4. Mõne eesmärgi saavutamiseks piisab ühe käitamistingimuste kogumiga 
tehtud simulatsioonikatsetest; katsete tulemused väljendatakse lahustunud orgaanilise süsiniku (DOC) või uuritava kemikaali kõrvaldamise protsen ­
diga. Käesolevas katsemeetodis on esitatud sellise katse kirjeldus. Erinevalt 
käesoleva peatüki varasemast versioonist, kus kirjeldati ainult ühte tüüpi 
seadet sünteetilise reovee töötlemiseks, mis töötas ühendatud seadmete
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
režiimis ja milles kasutati suhteliselt algelist muda kõrvaldamise meetodit, 
on käesolevas tekstis esitatud mitmesuguseid variante. On kirjeldatud 
seadme tüübi, käitamisrežiimi, reovee ja muda kõrvaldamise alternatiive. Käesolev tekst vastab üsna täpselt standardis ISO 11733 (12) kirjeldatule, mida kontrolliti koostamise ajal hoolikalt, kuigi meetodi jaoks ei ole veel 
laboritevahelist võrdluskatset korraldatud.
 
5. Muude eesmärkide saavutamiseks peab uuritava kemikaali kontsentratsioon 
väljavoolus olema täpsemalt teada ja selleks vajatakse ulatuslikumat meetodit. Näiteks muda kõrvaldamise kiirust tuleb iga päev ja kogu katse ajal täpsemalt kontrollida ning seadmeid tuleb käitada mitmel erineval 
kõrvaldamise kiirusel. Täiemahulise meetodi jaoks tuleks katsed korraldada 
ka kahel või kolmel erineval temperatuuril: sellist meetodit on kirjeldanud Birch (13, 14) ja selle kokkuvõte on esitatud 6. liites. Praegused teadmised ei ole siiski piisavad, et otsustada, milline kineetilistest mudelitest on kemi ­
kaalide biolagunemisele reovee puhastamisel ja veekeskkonnas üldisemalt 
kohaldatav. Monod’ kineetika kohaldamine, mis on näitena esitatud 6. liites, on piiratud kemikaalidega, mille sisaldus on vähemalt 1 mg/l, kuid mõne arvates on isegi see veel põhjendamata. Reoveele iseloomulikke kontsentrat ­
sioone täpsemalt peegeldavad katsed on esitatud 7. liites, kuid kõnealused 
katsed (ja 6. liites esitatud katsed) on esitatud liidetes ning neid ei ole avaldatud eraldi katsemeetoditena.
 
Filtrid  
6. Palju vähem tähelepanu on pööratud nõrgfiltrimudelitele. See võib olla 
põhjustatud asjaolust, et need on kogukamad ja vähem kompaktsed kui 
aktiivmudapuhasti mudelid. Gerike  et al.  töötasid välja nõrgfiltrimisseadmed 
ja käitasid neid ühendatud režiimis (15). Kõnealused filtrid olid suhteliselt suured (kõrgus 2 m; maht 60 l) ja iga filtri jaoks oli vaja 2 l/h reovett. Baumann  et al.  (16) simuleerisid nõrgfiltreid, sisestades 1 m torudesse (mille 
siseläbimõõt oli 14 mm) nn polüestervillaribad, mida oli 30 minuti vältel 
immutatud kontsentreeritud aktiivmudaga. Uuritav kemikaal, mis oli ainus süsinikuallikas mineraalsoolade lahuses, sisestati püstsuunalisse torusse ja biolagundamist hinnati lahustunud orgaanilise süsiniku määramisega välja ­
voolus ning CO
 2 mõõtmisega eralduvas gaasis.  
7. Biofiltreid simuleeriti teise meetodi abil (15); horisontaalsuuna suhtes väikse 
nurga all olevate pöörlevate torude sisepindadele viidi reovett (ligikaudu 250 ml/h) koos uuritava kemikaaliga või ilma selleta ning kogutud väljavoolu analüüsiti lahustunud orgaanilise süsiniku ja/või konkreetse uuritava kemi ­
kaali määramiseks.
 
KATSE PÕHIMÕTE  
8. Käesolev meetod on kavandatud selleks, et määrata vees lahustuvate orgaa ­
niliste kemikaalide kõrvaldamist ning esmast ja/või täielikku biolagundamist aeroobsete mikroorganismide poolt pidevalt käitatavas katsesüsteemis, millega simuleeritakse aktiivmuda protsessi. Lihtsasti biolagundatav orgaa ­
niline kasvukeskkond ja orgaaniline uuritav kemikaal on mikroorganismi ­
dele energia- ja süsinikuallikateks.
 
9. Kaks pidevalt käitatavat katseseadet (aktiivmudapuhastid või poorsed potid) 
töötavad paralleelselt ühesugustel tingimustel, mis valitakse katse eesmärgi kohaselt. Keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg on tavaliselt kuus tundi ja 
keskmine muda kasutamise aeg (muda retentsiooniaeg) on kuus kuni kümme 
päeva. Muda kõrvaldatakse ühega kahest meetodist. Uuritavat kemikaali lisatakse ainult ühte seadmetest sissevoolu (orgaaniline kasvukeskkond) kaudu tavaliselt kontsentratsiooniga vahemikus 10–20 mg/l lahustunud 
orgaanilist süsinikku. Teist seadet kasutatakse kontrollseadmena, et määrata 
orgaanilise kasvukeskkonna biolagunemist.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. Väljavooludest võetakse sageli proove ja määratakse nendes (eelistatult) 
lahustunud orgaaniline süsinik või siis keemiline hapnikutarve; selle seadme 
väljavoolust, kuhu lisatakse uuritavat kemikaali, määratakse spetsiifilise analüüsimeetodiga uuritava kemikaali kontsentratsioon (kui see on nõutav). Katse- ja kontrollseadme väljavoolus määratud lahustunud orgaanilise süsi ­
niku kontsentratsiooni või keemilise hapnikutarbe erinevus on eeldatavasti 
põhjustatud uuritavast kemikaalist või selle orgaanilistest metaboliitidest. Seda erinevust võrreldakse lisatud uuritavast kemikaalist põhjustatud lahus ­
tunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooniga või keemilise hapnikutarbega 
sissevoolus, et määrata uuritava kemikaali kõrvaldamise määr.
 
11. Biolagunemist võib tavaliselt eristada bioadsorptsioonist nii, et graafikul 
uuritakse hoolikalt, kuidas kõrvaldamismäär sõltub ajast, ning seda võib 
tavaliselt kinnitada kiire biolagundatavuse katsega, kasutades selle seadme 
aklimatiseeritud inokulumi, kuhu lisatakse uuritavat kemikaali.  
ANDMED UURITAVA KEMIKAALI KOHTA  
12. Tulemuste õigesti tõlgendamiseks on vaja teada uuritava kemikaali puhtust, 
vees lahustuvust, lenduvus- ja adsorptsiooniomadusi. Tavaliselt ei ole lendu ­
vaid ja lahustumatuid kemikaale võimalik katsetada ilma erimeetmeid võtmata (vt 5. liide). Samuti on vaja teada keemilist struktuuri või vähemalt empiirilist valemit, et arvutada teoreetilisi väärtusi ja/või kontrollida para ­
meetrite mõõdetud väärtusi, näiteks teoreetilist hapnikutarvet (ThOD), lahus ­
tunud orgaanilist süsinikku (DOC) ja keemilist hapnikutarvet (COD).
 
13. Sobivate katsekontsentratsioonide valimiseks võivad vajalikud olla andmed 
uuritava kemikaali mürgisuse kohta mikroorganismidele (vt 4. liide) ning vähese biolagundatavuse väärtuste õigeks tõlgendamiseks on sellised andmed hädavajalikud.
 
KÜNNISVÄÄRTUSED  
14. Käesoleva pindaktiivsete ainete esmase biolagundamise simulatsioonikatse 
(kinnitava katse) esimese rakendamise järel nõutakse konkreetse kemikaali kõrvaldamist rohkem kui 80 % ulatuses, et pindaktiivset ainet võiks lubada turule. Kui 80 % künniseni ei jõuta, võib rakendada kõnealust simulatsioo ­
nikatset (kinnitavat katset) ja pindaktiivset ainet võib turustada ainult juhul, 
kui sellega kõrvaldatakse rohkem kui 90 % konkreetsest kemikaalist. Kemi ­
kaalide puhul üldiselt ei teki lubamise/mittelubamise küsimust ja saavutatud kõrvaldamise protsentväärtust võib kasutada tõenäolise keskkonnakontsen ­
tratsiooni ligikaudsetes arvutustes, mida kasutatakse kemikaalide põhjustatud 
ohu hindamiseks. Tulemused järgivad üldjuhul põhimõtet „kõik või mitte midagi”. Puhaste kemikaalide mitmes uuringus leiti, et olulises ulatuses 
biolagunevatest kemikaalidest rohkem kui kolme neljandiku puhul on lahus ­
tunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määr > 90 % ning sellistest kemi ­
kaalidest rohkem 90 % puhul on see > 80 %.
 
15. Kõnealuses katses kasutatud kontsentratsioonidel (ligikaudu 10 mg C/l) 
esineb reovees suhteliselt väheseid kemikaale (näiteks pindaktiivseid aineid). Mõned kemikaalid võivad sellisel kontsentratsioonil inhibeerida ja mõne muu kemikaali kõrvaldamise kineetika võib väikesel kontsentratsioonil olla 
erisugune. Lagundamist oleks võimalik täpsemalt hinnata, kui kasutada 
muudetud meetodeid ja uuritava kemikaali realistlikult väikest kontsentrat ­
siooni ning selliselt kogutud andmeid saaks kasutada kineetiliste konstantide arvutamiseks. Vajalikke katsemeetodeid ei ole siiski veel täielikult validee ­
ritud ja biolagundamisreaktsioone kirjeldavad kineetilised mudelid ei ole 
veel kindlaks tehtud (vt 7. liide).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
VÕRDLUSKEMIKAALID  
16. Katse korraliku tegemise tagamiseks on kasulik kemikaalide uurimise ajal 
aeg-ajalt katsetada kemikaale, mille käitumine on teada. Sellised kemikaalid on näiteks adipiinhape, 2-fenüülfenool, 1-naftool, difeenhape, 1-naftoehape 
jne (9, 10, 11).
 
KATSETULEMUSTE REPRODUTSEERITAVUS  
17. Simulatsioonikatsete uuringute kohta on olnud märksa vähem teateid kui 
kiire biolagundatavuse katsete kohta. 80 % või rohkem lagundatavate uuri ­
tavate kemikaalide puhul on (samaaegsete) paralleelproovide reprodutseeri ­
tavus hea (10–15 % piires), kuid vähem lagundatavate kemikaalide puhul on 
hajuvus suurem. Üheksanädalases lagundamiskatses on eri juhtudel regist ­
reeritud ka mõne piiripealse kemikaaliga väga erinevaid tulemusi (näiteks 10 %, 90 %).
 
18. Kahte tüüpi seadmetega saadud tulemustes on leitud vähe erinevusi, kuid 
mõne kemikaali puhul toimub olmereovee kasutamisel ulatuslikum ja järje ­
pidevam lagunemine kui (OECD) sünteetilise reovee puhul.  
KATSEMEETODI KIRJELDUS  
Seadmed  
Katsesüsteem  
19. Ühe uuritava kemikaali katsetamise süsteem koosneb katseseadmest ja kont ­
rollseadmest, kuid vaid spetsiifiliste analüüside tegemisel (esmane biolagun ­
damine) on vaja ainult katseseadet. Mitme katseseadme kohta, milles uuri ­
takse kas üht ja sama kemikaali või erinevaid kemikaale, võib kasutada 
ainult ühte kontrollseadet. Ühendatud seadmete korral (3. liide) peab igal katseseadmel olema oma kontrollseade. Katsesüsteem võib olla kas aktiiv ­
mudapuhasti mudel, Husmanni seade (1. liite joonis 1) või poorne pott (1. 
liite joonis 2). Mõlemal juhul on sissevoolu ja väljavoolu jaoks vaja piisava 
suurusega säilitusnõusid ning pumpasid, et doseerida sissevoolu, kas eraldi või segatult uuritava kemikaali lahusega.
 
20. Iga aktiivmudapuhasti seade koosneb aeratsiooninõust, mille maht on teada, 
ligikaudu 3 liitrit aktiivmuda, ja separaatorist (teisesest selitist), mille maht 
on ligikaudu 1,5 liitrit. Mahte võib teatavas ulatuses separaatori kõrguse kohandamisega muuta. Eri suurusega nõude kasutamine on lubatud, kui neid käitatakse võrreldava hüdraulilise koormusega. Kui katseruumi tempe ­
ratuuri hoidmine soovitud vahemikus ei ole võimalik, soovitatakse kasutada 
veesärgiga nõusid, mille vee temperatuur on reguleeritav. Aktiivmuda taga ­
siviimiseks separaatorist aeratsiooninõusse kasutatakse suruõhupumpa või doseerimispumpa, mis töötab kas pidevalt või korrapäraste ajavahemike 
järel.
 
21. Poorse poti süsteem koosneb sisemisest poorsest silindrist, mille koonuseline 
alaosa asub mõnevõrra suuremas sama kujuga nõus, mis on valmistatud vett mitte läbi laskvast plastikmaterjalist. Poorse nõu jaoks on sobiv materjal poorne polüetüleen, mille pooride maksimaalne suurus on 90 μm ja paksus 
2 mm. Muda eraldamine töödeldud orgaanilisest kasvukeskkonnast toimub 
poorse seina diferentseeritud läbimise teel. Väljavool koguneb ringikujulisse alasse, kust see kandub ülevoolamise teel kogumisnõusse. Settimist ei toimu ja muda seega tagasi ei suunata. Kogu süsteemi võib paigutada termostaa ­
diga reguleeritavasse vesivanni. Poorsed potid ummistuvad algetappides ja 
võivad üle voolata. Sel juhul asendage poorne vooderdis puhtaga: kandke
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
kõigepealt muda potist sifooniga puhtasse ämbrisse ning kõrvaldage ummis ­
tunud vooderdis. Pärast mitteläbilaskva välissilindri puhtakspühkimist pange 
sisse puhas vooderdis ja kandke muda tagasi potti. Ummistunud vooderdise külge jäänud muda tuleb samuti hoolikalt maha kraapida ja tagasi potti kanda. Puhastage ummistunud pott kõigepealt peene veejoaga, et eemaldada 
külgejäänud muda, ning leotage potti siis lahjas naatriumhüpokloriti lahuses 
ja seejärel vees ning loputage siis põhjalikult veega.
 
22. Muda aereerimiseks mõlema süsteemi aeratsiooninõus tuleb kasutada sobivat 
meetodit, näiteks klaasfilteraeraatoreid (aeratsioonielement) ja suruõhku. Õhku puhastatakse vajaduse korral, suunates selle läbi sobiva filtri ja kasu ­
tades vesipuhastust. Läbi süsteemi tuleb suunata piisavas koguses õhku, et 
säilitada aeroobseid tingimusi ja hoida mudahelbed katse vältel kogu aeg 
hõljuvas olekus.
 
Filtrimisseade või tsentrifuug  
23. Seade proovide filtrimiseks, milles on sobiva poorisuurusega (ava nominaal ­
läbimõõt 0,45 μm) membraanfiltrid, mis adsorbeerivad lahustuvad orgaani ­
lised kemikaalid ja millest vabaneb võimalikult vähe orgaanilist süsinikku. Kui kasutatakse filtreid, millest vabaneb orgaanilist süsinikku, tuleb filtreid hoolikalt pesta kuuma veega, et eemaldada väljauhutav orgaaniline süsinik. 
Selle asemel võib kasutada tsentrifuugi, mis tagab 40 000 m/s
 2 . 
Analüüsiseadmed  
24. Seadmed, mis on vajalikud järgmise kindlaksmääramiseks:  
— lahustunud orgaaniline süsinik, orgaanilise süsiniku kogusisaldus või 
keemiline hapnikutarve;  
— konkreetne kemikaal, kui nõutakse selle määramist;  
— hõljuvaine, pH, hapniku kontsentratsioon vees;  
— temperatuur, happelisus ja leeliselisus;  
— ammoonium, nitrit ja nitraat, kui katse tehakse nitrifikatsiooni tingi ­
mustes.  
Vesi 
25. Kraanivesi, mis sisaldab vähem kui 3 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku. 
Määrake leeliselisus, kui see ei ole teada.  
26. Deioniseeritud vesi, mis sisaldab vähem kui 2 mg/l lahustunud orgaanilist 
süsinikku.  
Orgaaniline kasvukeskkond  
27. Orgaanilise kasvukeskkonnana võib kasutada sünteetilist reovett, olmereo ­
vett või nende segu. On tõendatud (11, 14), et ainult olmereovee kasutamise puhul saadakse sageli suurem lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise 
protsent ning sellest saab kõrvaldada ja biolagundada mõnda kemikaali, mis 
ei ole OECD sünteetilise reovee kasutamisel biolagundatavad. Ka pidev või korrapärane olmereovee lisamine stabiliseerib sageli aktiivmuda, sh võimaldab üliolulise omadusena head settimist. Seega on soovitatav kasu ­
tada olmereovett. Igas uues orgaanilise kasvukeskkonna partiis tuleb mõõta 
lahustuva orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kontsentratsioon. Orgaanilise kasvukeskkonna happelisus või leeliselisus peaks olema teada. Kui orgaanilise kasvukeskkonna happelisus või leeliselisus on vähene, võib 
see vajada sobiva puhvri lisamist (naatriumvesinikkarbonaat või kaaliumdi ­
vesinikfosfaat), et säilitada katse ajal aeratsiooninõus pH ligikaudu 7,5 ± 0,5. Lisatava puhvri kogus ja selle lisamise aeg tuleb igal eraldi juhul kindlaks määrata. Kui segusid kasutatakse kas pidevalt või aeg-ajalt, tuleb 
segu lahustunud orgaaniline süsinik (või keemiline hapnikutarve) hoida ligi ­
kaudu püsivana, näiteks veega lahjendamise teel.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Sünteetiline reovesi  
28. Ühes liitris kraanivees lahustatakse: 160 mg peptooni, 110 mg lihaekstrakti, 
30 mg karbamiidi, 28 mg veevaba dikaaliumvesinikfosfaati (K  2 HPO  4 ), 7 mg 
naatriumkloriidi (NaCl), 4 mg kaltsiumkloriiddihüdraati (CaCl  2 ·2H 2 O), 2 mg 
magneesiumsulfaatheptahüdraati (Mg  2 SO 4 ·7H 2 O). See OECD sünteetiline 
reovesi on näidis ja selle keskmine lahustunud orgaanilise süsiniku kontsen ­
tratsioon sissevoolus on ligikaudu 100 mg/l. Alternatiivselt võib kasutada muid koostisi, millel on ligikaudu sama lahustunud orgaanilise süsiniku 
kontsentratsioon ja mis on pärisreoveega sarnasemad. Kui on vajalik väik ­
sema kontsentratsiooniga sissevool, lahjendage sünteetilist reovett näiteks 1 : 1 kraaniveega, et saada kontsentratsioon ligikaudu 50 mg/l. Kõnealune väik ­
sema kontsentratsiooniga sissevool võimaldab nitrifitseerivatel organismidel 
paremini kasvada ja seda muutust tuleks kasutada juhul, kui on vajalik uurida nitrifitseerivate reoveepuhastite simuleerimist. Kõnealuse sünteetilise reovee kontsentraadi võib valmistada destilleeritud veega ja säilitada kuni 
ühe nädala temperatuuril 1 °C. Enne kasutamist lahjendatakse seda kraani ­
veega. (See kasvukeskkond ei ole rahuldav, näiteks lämmastiku kontsentrat ­
sioon on väga suur ja süsinikusisaldus on suhteliselt väike, kuid kasvukesk ­
konna parandamiseks on soovitatud üksnes lisada puhvrina suuremas 
koguses fosfaati ja rohkem peptooni).
 
Olmereovesi  
29. Kasutage värskelt settinud reovett, mida kogutakse iga päev peamiselt olme ­
reovett töötlevast veepuhastuskäitisest. Seda tuleks koguda enne esmast 
settimist esmase settimise paagi ülevoolu kanalist või aktiivmudapuhasti sissevoolust ja see peaks üldiselt olema ilma suurte osakesteta. Seda reovett saab enne kasutamist hoida mitu päeva temperatuuril ligikaudu 4 °C (kuid 
üldiselt ei tohiks seda hoida üle seitsme päeva), kui tõendatakse, et lahus ­
tunud orgaanilise süsiniku sisaldus (või keemiline hapnikutarve) ei ole hoid ­
mise ajal oluliselt vähenenud (s.o vähem kui 20 %). Süsteemi häirimise vähendamiseks tuleks igas uues partiis viia lahustunud orgaaniline süsinik 
(või keemiline hapnikutarve) enne kasutamist sobivale konstantsele väärtu ­
sele näiteks kraaniveega lahjendamise teel.
 
Aktiivmuda  
30. Koguge inokulatsiooniks aktiivmuda hästi käitatud reoveepuhasti või peami ­
selt olmereovee puhastamiseks kasutatava laborisuuruses aktiivmudaseadme aeratsiooninõust.
 
Uuritava kemikaali põhilahused  
31. Kui kemikaal on piisavalt lahustuv, valmistage sobiva kontsentratsiooniga 
(näiteks 1–5 g/l) põhilahus deioniseeritud vees või sünteetilise reovee mine ­
raalses osas (lahustumatute ja lenduvate kemikaalide korral vt 5. liide). 
Määrake kindlaks põhilahuse lahustunud orgaaniline süsinik ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus ning korrake mõõtmisi iga uue partii puhul. Kui lahustunud orgaanilise süsiniku ja orgaanilise süsiniku kogusisalduse 
erinevus on suurem kui 20 %, kontrollige uuritava kemikaali lahustuvust 
vees. Määrake põhilahuses lahustunud orgaanilise süsiniku või mõõdetud uuritava kemikaali kontsentratsioon spetsiifilise analüüsi abil ja võrrelge nimiväärtusega, et näha, kas määramise saagis on piisavalt hea (tavaliselt 
võib eeldada > 90 %). Veenduge (eelkõige dispersiooni korral), kas lahus ­
tunud orgaanilist süsinikku saab kasutada analüüsiparameetrina või tuleb kasutada ainult spetsiifilist analüüsimeetodit, millega saab määrata uuritavat kemikaali. Dispersiooni puhul on vaja proovid tsentrifuugida. Iga uue partii 
puhul määrake lahustunud orgaaniline süsinik, keemiline hapnikutarve või 
uuritav kemikaal spetsiifilise analüüsimeetodiga.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Määrake põhilahuse pH. Äärmuslikud väärtused osutavad, et kemikaali lisa ­
mine võib mõjutada aktiivmuda pH-d katsesüsteemis. Sel juhul neutralisee ­
rige põhilahus väikse koguse anorgaanilise happe või aluse lisamisega, et pH oleks 7 ± 0,5, kuid vältige uuritava kemikaali sadestamist.
 
KATSE KÄIK  
33. Siin on kirjeldatud aktiivmudapuhasti katset; poorse poti süsteemi puhul 
tuleb seda mõnevõrra kohandada.  
Inokulumi valmistamine  
34. Inokuleerige katsesüsteem katse alguses kas aktiivmuda või väikesekontsen ­
tratsioonilise mikroorganismide inokulumiga. Hoidke inokulumi toatempera ­
tuuril aereerituna kuni selle kasutamiseni ja kasutage ee ära 24 tunni jooksul. 
Aktiivmuda kasutamise korral võtke aktiivmuda proov tõhusalt käitatava bioloogilise reoveepuhasti aeratsiooninõust või labori puhastist, milles käideldakse peamiselt olmereovett. Kui simuleeritakse nitrifitseerivaid tingi ­
musi, võtke muda nitrifitseerivast reoveepuhastist. Määrake kindlaks hõljuv ­
aine kontsentratsioon ja vajaduse korral suurendage muda setitamise teel selle kontsentratsiooni, et katsesüsteemi lisatav maht oleks minimaalne. Kuivaine lähtekontsentratsioon peab olema ligikaudu 2,5 g/l.
 
35. Teisel juhul kasutage inokulumina väljavoolu bioloogilisest olmereovee 
puhastist koguses 2 ml/l kuni 10 ml/l. Võimalikult paljude eri bakteriliikide 
saamiseks võib olla kasulik eri allikatest, näiteks pinnaveest, saadud inoku ­
lumide lisamine. Sel juhul hakkab aktiivmuda katsesüsteemis arenema ja paljunema.
 
Orgaanilise kasvukeskkonna doseerimine  
36. Hoolitsege, et sisse- ja väljavoolunõud ning sissevoolunõust väljuvad ja 
väljavoolunõusse sisenevad torud on korralikult puhastatud, et seal katse alguses ja kogu katse vältel ei kasvaks mikroobe. Seadke katsesüsteem üles ruumis, mille temperatuuri saab reguleerida (üldiselt vahemikus 
20–25 °C) või kasutage veesärgiga katseseadmeid. Valmistage piisav 
kogus vajaminevat orgaanilist kasvukeskkonda (punktid 27–29). Täitke kõigepealt aeratsiooninõu ja separaator orgaanilise kasvukeskkonnaga ning lisage inokulum (punktid 34 ja 35). Alustage aereerimist nii, et muda jääks 
hõljuvasse ja aeroobsesse olekusse, ning alustage sissevooluvee doseerimist 
ja settinud muda ringlussevõttu. Doseerige hoiunõust orgaanilist kasvukesk ­
konda katse- ja kontrollseadmete aeratsiooninõudesse (punktid 20, 21) ning koguge vastavad väljavoolud samalaadsetesse kogumisnõudesse. Tavapärase 
kuuetunnise hüdraulilise retentsiooniaja saavutamiseks pumbatakse orgaani ­
list kasvukeskkonda juurde kiirusega 0,5 l/h. Selle kiiruse kontrollimiseks mõõtke iga päev doseeritud orgaanilise kasvukeskkonna kogus, märkides üles kasvukeskkonna koguse vähenemise hoiunõudes. Kemikaalide vahel ­
duva vabanemise ja koormuse järsu suurenemise mõju uurimiseks on vaja 
kasutada muid doseerimisrežiime.
 
37. Kui orgaaniline kasvukeskkond valmistatakse kasutamiseks rohkem kui ühe 
päeva jooksul, on vaja see jahutada temperatuurini umbes 4 °C või raken ­
dada muid asjakohaseid säilitusmeetodeid, et vältida mikroobide kasvu ja biolagunemist väljaspool katseseadet (punkt 29). Kui kasutatakse sünteetilist 
reovett, võib valmistada kontsentreeritud põhilahuse (näiteks tavapärasest 
kontsentratsioonist kümme korda suurema kontsentratsiooniga, punkt 28) ja seda säilitada ligikaudu 4 °C juures. Selle põhilahuse võib enne kasuta ­
mist hoolikalt segada vajaliku koguse kraaniveega; teise võimalusena võib 
seda ka otse katsenõusse pumbata, pumbates eraldi juurde vajaliku koguse 
kraanivett.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Uuritava kemikaali doseerimine  
38. Lisage vajalikus koguses uuritava kemikaali põhilahust (punkt 31) sisse ­
voolu vee nõusse või doseerige seda eraldi pumba abil otse aeratsiooni ­
nõusse. Sissevoolu tavaline keskmine kontsentratsioon peaks olema 10–20 
mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku ja ülempiir ei tohiks olla rohkem kui 
50 mg/l. Kui uuritav kemikaal vees hästi ei lahustu või võib avalduda toksilisus, vähendage katsekontsentratsiooni väärtusele 5 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku või veel väiksemale kontsentratsioonile, aga seda ainult 
juhul, kui on olemas asjakohane spetsiifiline analüüsimeetod ja seda kasu ­
tatakse (vees halvasti lahustuvat dispersiooni moodustavat uuritavat kemi ­
kaali võib lisada doseerimise erimeetodite abil, vt 5. liide).
 
39. Alustage uuritava kemikaali lisamist pärast ajavahemikku, mille jooksul 
süsteem on stabiliseerunud ja kõrvaldab tõhusalt orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilist süsinikku (ligikaudu 80 %). Enne uuritava kemikaali lisamist on tähtis kontrollida, et kõik seadmed töötaksid ühevõrra tõhusalt; 
kui need ei tööta ühevõrra tõhusalt, on üldiselt kasulik eri mudad kokku 
segada ja lisada eri seadmetesse uuesti võrdsed kogused muda. Kui kasuta ­
takse aktiivmuda inokulumi (ligikaudu) 2,5 g/l (kuivkaal), võib uuritava kemikaali lisada katse alguses, kuna algusest peale üha suuremate koguste 
otse lisamine võimaldab aktiivmudal uuritava kemikaaliga paremini koha ­
neda. Olenemata uuritava kemikaali lisamise viisist, soovitatakse korrapä ­
raste ajavahemike järel mõõta voolukiirust ja/või lahuste mahtu hoiu ­
nõu(de)s.
 
Aktiivmuda käsitlemine  
40. Aktiivmuda tahkete osakeste kontsentratsioon stabiliseerub üldiselt katse 
jooksul vahemikus 1–3 g/l (kuivkaal), olenemata kasutatud inokulumist, 
kuid sõltuvalt orgaanilise kasvukeskkonna kvaliteedist ja kontsentratsioonist, käitamistingimustest, mudas olevate mikroorganismide laadist ning uuritava kemikaali mõjust.
 
41. Määrake aeratsiooninõudes hõljuvaine sisaldus vähemalt iga nädal ja kõrval ­
dage liigne muda, et hoida kontsentratsioon vahemikus 1 g/l kuni 3 g/l (kuivkaal) või hoidke püsivana muda keskmist kasutusaega, üldiselt vahe ­
mikus 6–10 päeva. Kui muda retentsiooniajaks valitakse näiteks kaheksa 
päeva, siis eemaldage iga päev 1/8 aeratsiooninõu aktiivmuda kogusest ja kõrvaldage see. Tehke seda iga päev või eelistatavalt automaatselt vaheldu ­
valt sisselülituva pumba abil. Hõljuvaine kontsentratsiooni püsivana või 
kitsastes piirides hoidmisega ei säilitata püsivat muda retentsiooniaega, 
mis on käitamisnäitaja, mis määrab uuritava kemikaali kontsentratsioon väljavoolus.
 
42. Eemaldage kogu katse vältel vähemalt kord päevas aeratsiooninõu ja sepa ­
raatori seinte külge jäänud muda, et viia see tagasi suspensiooni. Kontrollige 
korrapäraselt kõiki torusid ja torustikku ning puhastage neid, et vältida biokile teket. Võtke separaatorist settinud muda aeratsiooninõus ringlusse, 
eelistatavalt vahelduva pumpamise teel. Poorse poti süsteemis ringlussevõttu 
ei toimu, kuid veenduge, et olete enne nõus mahu märkimisväärset suure ­
nemist pannud sisse puhtad sisemised potid (punkt 21).
 
43. Husmanni puhasti seadmetes võib muda halvasti settida ja võivad tekkida 
mudakaod. Seda on võimalik vältida, kui teha katse- ja kontrolliseadmetes 
paralleelselt järgmist:  
— korrapäraste ajavahemike järel, näiteks iga nädal, võib lisada värsket 
muda või flokulanti (näiteks igasse nõusse 2 ml FeCl  3 lahust kontsen ­
tratsiooniga 50 g/l), kuid tuleb veenduda, et FeCl  3 ei põhjusta uuritava 
kemikaali reaktsiooni või sadestumist;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— suruõhupumba võib asendada peristaltilise pumbaga, mis võimaldab 
kasutada sissevooluga ligikaudu võrdväärset muda ringlussevõtu voolu 
ja võimaldab luua settinud mudas anaeroobse ala (suruõhupumba geomeetria tõttu on tagasisuunatud muda minimaalne voolukiirus ligi ­
kaudu 12 korda suurem kui sissevoolu kiirus);
 
— muda võib pumbata separaatorist aeratsiooninõusse vahelduvalt 
sisselülituva pumbaga (näiteks 5 minutit iga 2,5 tunni tagant, et 
võtta muda ringlusse kiirusega 1–1,5 l/h);  
— vahutamiskadude vältimiseks võib kasutada minimaalsel kontsentrat ­
sioonil mittemürgist vahutamisvastast ainet (näiteks silikoonõli);  
— õhku võib separaatoris juhtida läbi muda lühikeste järskude purse ­
tena (näiteks 10 sekundit kord tunnis);  
— aeratsiooninõusse võib teatava ajavahemiku järel doseerida orgaani ­
list kasvukeskkonda (näiteks 3–10 minutit iga tund).  
Proovide võtmine ja analüüsimine  
44. Korrapäraste ajavahemike järel tuleb aeratsiooninõudes mõõta aktiivmuda 
lahustunud hapniku kontsentratsiooni, temperatuuri ja pH-d. Tuleb veen ­
duda, et alati on saadaval piisavalt hapnikku (> 2 mg/l) ja et temperatuuri hoitakse nõutavas vahemikus (üldiselt 20–25 °C). Hoidke pH-d vahemikus 
7,5 ± 0,5, doseerides aeratsiooninõusse või sissevoolu väikses koguses anor ­
gaanilist alust või hapet või suurendades orgaanilise kasvukeskkonna puhverdusvõimet (vt punkt 27). Nitrifitseerimise käigus tekib hapet, 1 mg 
N oksüdeerumisel tekib kogus, mis on ligikaudu võrdväärne kogusega 7 mg 
CO
 3 – . Mõõtmiste sagedus oleneb mõõdetavast parameetrist ja süsteemi 
stabiilsusest ning võib varieeruda ühest korrast päevas kuni ühe korrani nädalas.
 
45. Kontroll- ja katsenõude sissevoolus tuleb mõõta lahustunud orgaanilist süsi ­
nikku või keemilist hapnikutarvet. Katse sissevooluvees tuleb spetsiifilise 
analüüsiga mõõta uuritava kemikaali kontsentratsiooni või seda tuleb hinnata 
põhilahuse kontsentratsiooni (punkt 31), kasutatud mahu ja katseseadmesse doseeritud reovee koguse põhjal. Uuritava kemikaali kontsentratsiooni on soovitatav arvutada, et vähendada kontsentratsiooniandmete varieerumist.
 
46. Võtke kogutud väljavoolust vajalikud proovid (näiteks 24 tunni koond ­
proovid) ja filtrige need läbi membraani, mille poori suurus on 0,45 μm, 
või tsentrifuugige need 40 000 m/s  2 juures 15 minutit. Kui filtrida on raske, 
tuleb kasutada tsentrifuugimist. Määrake lahustunud orgaaniline süsinik või keemiline hapnikutarve vähemalt kaks korda, et mõõta täielikku biolagune ­
mist ja (kui seda nõutakse) uuritava kemikaali spetsiifilise analüüsiga esmast 
biolagunemist.
 
47. Keemilise hapnikutarbe kasutamine võib põhjustada analüüsiprobleeme 
väikestel kontsentratsioonidel ja seega soovitatakse seda ainult juhul, kui kasutatakse piisavalt suurt katsekontsentratsiooni (ligikaudu 30 mg/l). Tuge ­
vasti adsorbeeruva kemikaali puhul soovitatakse samuti mõõta mudas adsor ­
beeritud kemikaali, kasutades spetsiifilist uuritava kemikaali analüüsi meetodit.
 
48. Proovivõtu sagedus oleneb katse eeldatavast kestusest. Soovitatav sagedus 
on kolm korda nädalas. Kui seadmed töötavad tõhusalt, laske süsteemil pärast uuritava kemikaali lisamist 1–6 nädalat kohaneda, et saavutada koha ­
nemise statsionaarne olek. Platoofaasis (punkt 59), mis kestab tavaliselt 
kolm nädalat, mõõtke katsetulemuse hindamiseks, eelistatavalt vähemalt 15 kehtivat väärtust. Katse võib lõpetada, kui on jõutud piisava kõrvalda ­
mise määrani (näiteks > 90 %) ja saadud kõnealused 15 väärtust, mis väljen ­
davad kolme nädala jooksul igal tööpäeval tehtud analüüse. Katse ei tohiks 
pärast uuritava kemikaali lisamist üldiselt kesta üle 12 nädala.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Kui muda nitrifitseerib ja kui uuritakse kemikaali mõjusid nitrifitseerimisele, 
tuleb katse- ja kontrollseadmete väljavoolu proovides mõõta vähemalt kord 
nädalas ammooniumi- ja/või nitriti- ja nitraadisisaldust.  
50. Kõik analüüsid ja eelkõige lämmastikusisalduse määramine tuleks teha 
võimalikult kiiresti. Kui analüüsid tuleb edasi lükata, säilitage proove tihe ­
dalt suletud pudelis pimedas ja temperatuuril ligikaudu 4  o C. Kui proove 
tuleb säilitada kauem kui 48 tundi, siis kasutage säilitamiseks sügavkülmu ­
tamist, hapestamist (näiteks 1 liitri kohta 10 ml väävelhappelahuse (400 g/l) lisamisega) või asjakohase mürgise aine lisamist (näiteks 1 liitri kohta 20 ml 
elavhõbe(II)kloriidi lahuse (10 g/l) lisamisega). Kontrollige, et säilitamise 
meetod ei mõjutaks analüüsi tulemusi.
 
Katseseadmete ühendamine  
51. Kui kasutatakse ühendamist (3. liide), siis vahetage iga päev sama kogus 
aktiivmuda (150 ml kuni 1 500 ml 3 liitrit lahust sisaldavate aeratsiooni ­
nõude puhul) katseseadme ja selle kontrollseadme aeratsiooninõude vahel. 
Kui uuritav kemikaal adsorbeerub tugevasti muda külge, siis vahetage ainult separaatorite supernatanti. Mõlemal juhul kasutage katsetulemuste arvutami ­
seks parandustegurit (punkt 55).
 
ANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Tulemuste töötlemine  
52. Arvutage uuritava kemikaali lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise 
hapnikutarbe kõrvaldamise protsent igal mõõtmise ajal järgmise võrrandi 
abil: 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
kus 
D t = lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrval ­
damise protsent ajal t  
C s = uuritava kemikaali põhjustatud lahustunud orgaaniline süsinik või 
keemiline hapnikutarve sissevoolu vees, eelistatavalt hinnatud põhi ­
lahuse järgi (mg/l)  
E = katse väljavoolus ajal t mõõdetud lahustunud orgaanilise süsiniku 
või keemilise hapnikutarbe näitaja (mg/l)  
E o = kontrollseadme väljavoolus ajal t mõõdetud lahustunud orgaanilise 
süsiniku või keemilise hapnikutarbe näitaja (mg/l)  
53. Kontrollseadme orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilise süsiniku 
või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise määr on kasulik teave katse ajal aktiivmuda biolagundava aktiivsuse hindamiseks. Arvutage kõrvaldamise protsent järgmise võrrandi alusel:
 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
kus 
D B = kontrollseadme orgaanilises kasvukeskkonnas lahustunud orgaanilise 
süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise protsent ajal t  
C M = orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaaniline süsinik või 
keemiline hapnikutarve kontrollseadme sissevoolu vees (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Soovi korral võite arvutada orgaanilise kasvukeskkonna ja katseseadmes 
uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise 
hapnikutarbe kõrvaldamise protsendi järgmise võrrandi abil:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
kus 
D T = katse kogu sissevooluvee lahustunud orgaanilise süsiniku või keemi ­
lise hapnikutarbe kõrvaldamise protsent  
C T = katse kogu sissevooluvee või põhilahuse alusel arvutatud lahustunud 
orgaaniline süsinik või keemiline hapnikutarve (mg/l)  
54. Kui mõõdetakse uuritava kemikaali kõrvaldamist, arvutage see igal hinda ­
misajal spetsiifilise analüüsi meetodiga järgmise võrrandi abil:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
kus 
D ST = uuritava kemikaali esmase kõrvaldamise protsent ajal t  
S i = uuritava kemikaali mõõdetud või hinnatud kontsentratsioon katse 
sissevooluvees (mg/l)  
S e = uuritava kemikaali mõõdetud kontsentratsioon katse väljavooluvees 
ajal t (mg/l)  
55. Kui kasutatakse ühendatud režiimi, siis kompenseerige uuritava kemikaali 
lahjenemine aeratsiooninõus muda vahetuse tõttu parandusteguri abil (vt 3. liide). Kui kasutati keskmist hüdraulilist retentsiooniaega kuus tundi ja aerat ­
siooninõus poole aktiivmuda mahu vahetamist, tuleb igapäevaseid määratud 
kõrvaldamise näitajaid (D
 t , punkt 52) parandada, et leida tegelik uuritava 
kemikaali kõrvaldamise määr D  tc järgmise võrrandiga:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Katsetulemuste esitamine  
56. Koostage kõrvaldamisprotsendi D  t (või D  tc ) ja D  st (kui see on leitud) ajast 
sõltuvuse graafik (vt 2. liide). Uuritava kemikaali (kui niisuguse või lahus ­
tunud orgaanilise süsinikuna) kõrvaldamise kõvera kuju alusel võib teha 
järeldusi kõrvaldamisprotsessi kohta.  
Adsorptsioon  
57. Kui uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrval ­
damise määr on suur kohe katse algusest peale, siis kõrvaldatakse uuritavat 
kemikaali tõenäoliselt aktiivmuda tahketesse osakestesse adsorbeerimise teel. Seda on võimalik tõendada adsorbeerunud uuritava kemikaali määramisega spetsiifilise analüüsi abil. Tavaliselt ei jää adsorbeeritavast kemikaalist 
tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamine suureks kogu katse 
vältel; üldiselt toimub alguses suures koguses kõrvaldamine, mis langeb järk-järgult tasakaaluväärtusele. Kui adsorbeeritav uuritav kemikaal suudab siiski mingil viisil põhjustada mikroobipopulatsiooni aklimatiseerumise, siis 
suureneb seejärel uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsi ­
niku kõrvaldamise määr ja jõuab kõrge platooväärtuseni.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Ootefaas  
58. Nagu ka staatilistes sõelumiskatsetes, nii vajavad uuritavad kemikaalid enne 
täieliku biolagundamise toimumist sageli ootefaasi. Ootefaasis toimub lagun ­
davate bakterite aklimatiseerumine või kohanemine ja uuritavat kemikaali 
peaaegu ei kõrvaldata; seejärel toimub kõnealuste bakterite esialgne kasv. 
See faas lõpeb ja lagundamisfaasi alguseks peetakse hetke, kui ligikaudu 10 % uuritava kemikaali esialgsest kogusest on kõrvaldatud (võttes arvesse adsorptsiooni, kui see toimub). Ootefaasi pikkus võib olla väga erinev ja 
halvasti reprodutseeritav.
 
Platoofaas  
59. Pidevas katses kõrvaldamist näitava kõvera platoofaas on määratletud kui 
faas, milles lagundamine on maksimaalne. Platoofaas peaks kestma vähe ­
malt kolm nädalat ja selle käigus tuleks mõõta ligikaudu 15 kehtivat näitajat.  
Uuritava kemikaali keskmine kõrvaldamise määr  
60. Arvutage uuritava kemikaali kõrvaldamise näitaja (D  t ) väärtustest platoo ­
faasis keskväärtus. See on uuritava kemikaali kõrvaldamise määr ümarda ­
tuna lähima täisarvuni (1 %). Samuti soovitatakse arvutada keskväärtuse 95 % usaldusvahemik.
 
Orgaanilise kasvukeskkonna kõrvaldamine  
61. Koostage kontrollseadme orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilise 
süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamisprotsendi ajast sõltuvuse 
graafik (D  B ). Märkige keskmine kõrvaldamise määr samal viisil kui uuritava 
kemikaali puhul (punkt 60).  
Biolagundamise tunnused  
62. Kui uuritav kemikaal ei adsorbeeru märkimisväärselt aktiivmudasse ja 
kõrvaldamist näitaval kõveral on ootefaasiga, lagundamis- ja platoofaasiga biolagundamist näitava kõvera tavapärane kuju (punktid 58, 59), siis võib kindel olla, et mõõdetud kõrvaldamise on põhjustanud biolagundamine. Kui 
on toimunud suures koguses esialgne kõrvaldamine, siis ei suuda simulat ­
sioonikatse eristada bioloogilise ja abiootilise kõrvaldamise protsesse. Sellistel juhtudel ja muudel juhtudel, kui biolagundamise suhtes tekivad kahtlused (näiteks kui toimub väljapuhumine ( stripping )), tuleb analüüsida 
adsorbeerunud uuritavaid kemikaale või teha täiendavad staatilised biolagun ­
damise katsed täpselt bioloogilisi protsesse näitavate parameetrite alusel. Kõnealused katsed on hapniku sidumise meetodid (käesoleva lisa peatüki C.4 meetodid C.4-D, C.4-E ja C.4-F (6)) või katse, milles mõõdetakse 
süsinikdioksiidi tekkimist (käesoleva lisa peatüki C.4 meetod C.4-C (6)) 
või ISO  Headspace -meetod (18), kasutades simulatsioonikatsest eelnevalt 
kokku puutunud inokulumi. Kui mõõdetud on nii lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist kui ka konkreetse kemikaali kõrvaldamist, siis näitab 
kõrvaldamisprotsentide oluline erinevus (kui esimene on viimati nimetatust 
väiksem) orgaaniliste vahesaaduste olemasolu väljavoolus; selliseid vahesaa ­
dusi võib olla keerulisem lagundada kui lähtekemikaali.
 
Katsetulemuste kehtivus  
63. Inokulumi tavapärase biolagundamise käitumise kohta on saadud teavet, kui 
on määratud orgaanilise kasvukeskkonna kõrvaldamise määr (punkt 53) kontrollseadmes. Katset võib pidada kehtivaks, kui lahustunud orgaanilise 
süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise määr kontrollseadme(te)s 
on kahe nädala möödudes > 80 % ja ei ole täheldatud ebatavalisi asjaolusid.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Kui on kasutatud kiirelt biolagundatavat (võrdlus)kemikaali, peaks biolagu ­
nemise määr (D  t , punkt 52) olema > 90 %.  
65. Kui katse tehakse nitrifitseerivates tingimustes, peaks väljavoolude keskmine 
kontsentratsioon olema < 1 mg/l ammoniaaklämmastikku ja < 2 mg/l nitrit ­
lämmastikku.  
66. Kui need kriteeriumid (punktid 63–65) ei ole täidetud, siis korrake katset 
muust allikast pärit inokulumiga, katsetage võrdluskemikaali ja vaadake läbi 
kõigi katsete tegemise käik.  
Katseprotokoll  
67. Katseprotokollis esitatakse alljärgnev teave.  
Uuritav kemikaal:  
— tunnusandmed;  
— füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused.  
Katsetingimused:  
— katsesüsteemi tüüp, mis tahes muudatused lahustumatu või lenduva 
kemikaali katsetamiseks;  
— orgaanilise kasvukeskkonna tüüp;  
— tööstusliku reovee osakaal reovees ja selle laad, kui see on teada;  
— inokulum, laad ja proovivõtukoht (-kohad), kontsentratsioon ja kõik 
eeltöötlused;  
— uuritava kemikaali põhilahus: lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus ja 
orgaanilise süsiniku kogusisaldus; suspensiooni korral selle valmistamise viis; kasutatud katsekontsentratsioon; kui see on väljaspool vahemikku 
10–20 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku, siis selle põhjendus; lisa ­
mise meetod; esmakordse lisamise kuupäev; kõik muudatused;
 
— keskmine muda kasutamise aeg ja keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg; 
muda kõrvaldamise meetod; muda pundumise, kao jne vältimise 
meetodid;  
— kasutatud analüüsimeetodid;  
— katsetemperatuur;  
— muda pundumisomadused, muda mahuindeks ( sludge volume index , 
SVI), muda kontsentratsioon aktiivmudas ( mixed liquor suspended 
solids , MLSS);  
— kõik kõrvalekalded tavalisest katse käigust ja kõik asjaolud, mis võivad 
olla mõjutanud tulemusi.  
Katsetulemused:  
— kõik mõõdetud andmed (lahustunud orgaaniline süsinik, keemiline 
hapnikutarve, uuritava kemikaali määramine spetsiifilise analüüsimeeto ­
diga, pH, temperatuur, hapniku kontsentratsioon, hõljuvaine, N-kemikaalid (kui see on asjakohane));
 
— kõik D  t (või D  tc ), D  B , D St arvutatud väärtused tabelite kujul ja kõrval ­
damist näitavad kõverad;  
— teave ootefaasi ja platoofaasi, katse kestuse, uuritava kemikaali ja kont ­
rollseadme orgaanilise kasvukeskkonna kõrvaldamise määra kohta koos statistilise teabe ja kinnitustega biolagundatavuse ja katse kehtivuse kohta;
 
— tulemuste arutelu.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
KIRJANDUS  
1) Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, 1085 pp.  
2) German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in 
washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698–706.  
3) Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
 
4) Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. 
Res. 12: 909–915.  
5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
6) Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine”.  
7) Käesoleva lisa peatükk C.12 „Biodegradatsioon – modifitseeritud SCAS 
test”.  
8) Käesoleva lisa peatükk C.19 „Adsorptsiooniteguri (K  OC ) kindlaksmääramine 
mullas ja reoveesettes kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil”.  
9) Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157–173.
 
10) Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclu ­
sions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55.  
11) Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp 113–138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
12) ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biode ­
gradability of organic substances in an aqueous medium - activated sludge simulation test.
 
13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33–48.  
14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 
340–343.  
15) Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753–758.
 
16) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. 
Ökotox. 10: 214–220.  
17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 
91–98, ISBN 011 751661 9.  
18) ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
1. liide  
Joonis 1  
Seade biolagundatavuse hindamiseks  
Husmanni seade
  
A. Hoiunõu  
B. Doseerimispump  
C. Aeratsioonikamber (maht 3 l)  
D. Settimisnõu  E. Suruõhupump  
F. Kogumisnõu  
G. Aeraator  
H. Õhuvoolumõõtur  
Joonis 2  
Seade biolagundatavuse hindamiseks  
Poorne pott
  
A. Hoiunõu  
B. Doseerimispump  
C. Poorne aeratsiooninõu  
D. Mitteläbilaskev välimine nõu  E. Kogumisnõu  
F. Difusiooninõu  
G. Õhuvoolumõõtur  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Joonis 3  
Kolmeliitrise poorse poti aeratsiooninõu andmed
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
2. liide  
Kõrvaldamiskõvera näide
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
3. liide  
[TEADMISEKS]  
KATSESEADMETE ÜHENDAMINE  
Et proovida võrdsustada reovett ja katsekemikaali käitleva katseseadme ning 
ainult reovett käitleva kontrollseadme mudade mikroobipopulatsioone, võeti 
kasutusele mudade igapäevane vahetamine teineteisega (1). See tegevus nimetati ühendamiseks ja selle meetodi kohta kasutatakse nimetust ühendatud seadmed. Ühendamist kasutati esialgu Husmanni aktiivmuda seadmetes, kuid seda on 
tehtud ka poorse poti seadmetega (2, 3). Ühendamata ja ühendatud seadmete 
vahel ei leitud Husmanni seadmete ega ka poorse poti seadmete kasutamisel tulemustes märkimisväärseid erinevusi, seega ei anna seadmete ühendamiseks kulutatud aeg ja energia eeliseid.
 
Mudavahetused võivad jätta olulise kõrvaldamise mulje, kuna osa katsekemikaa ­
list kantakse üle ning katsekemikaali kontsentratsioonid katse- ja kontrollsead ­
mete väljavooludes muutuvad peaaegu võrdseks. Seega tuleb kasutada parandus ­
tegureid, mis olenevad vahetatud osa suurusest ja keskmisest hüdraulilisest retent ­
siooniajast. Arvutuste täpsemad kirjeldused on avaldatud (1).  
Lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise määra 
parandatud väärtused saab arvutada järgmise üldvalemi alusel:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ% 
kus 
D tc = lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise 
parandatud protsent  
D t = lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe kõrvaldamise 
määratud protsent  
a = aktiivmuda seadmete mahust vahetatud osa  
r = keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg (h)  
Kui vahetatakse näiteks pool aeratsiooninõu mahust (a = 0,5) ja keskmine 
hüdrauliline retentsiooniaeg on kuus tundi, on parandusteguri võrrand järgmine:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
KIRJANDUS  
1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units 
of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135.  
2) Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Acti ­
vated Sludge Simulation Test. pp. 113–138. In: Laboratory Tests for Simu ­
lation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
4. liide  
AKTIIVMUDA INHIBITSIOONI HINDAMINE  
Protsessi inhibeerimine uuritava kemikaali poolt  
1. Kemikaali (või reovett) ei pruugita simulatsioonikatse käigus lagundada või 
kõrvaldada ning see võib isegi inhibeerida muda mikroorganisme. Muid kemi ­
kaale biolagundatakse väikesel kontsentratsioonil, kuid neil on suuremal kont ­
sentratsioonil inhibeeriv mõju (hormees). Inhibeeriv mõju võib olla leitud juba varasemal etapil või selle võib kindlaks teha mürgisuse katsega, kasutades 
simulatsioonikatses kasutatavaga samalaadset või identset inokulumi (1). 
Kõnealused meetodid on hapniku tarbimise inhibitsioon (käesoleva lisa peatükk C.11 (2) ja ISO 8192 (3)) või muda organismide kasvu inhibitsioon (ISO 15522 (4)).
 
2. Simulatsioonikatses ilmneb inhibitsioon katsenõust ja kontrollnõust saadud 
väljavoolus lahustunud orgaanilise süsiniku või keemilise hapnikutarbe erine ­
vusena, mis on suurem kui uuritava kemikaalina lisatud lahustunud orgaani ­
line süsinik. Teisiti öelduna väheneb töötlemise käigus orgaanilise kasvukesk ­
konna lahustunud orgaanilise süsiniku (ja biokeemilise hapnikutarbe, keemi ­
lise hapnikutarbe ja/või NH  + 4 ) kõrvaldamise protsent uuritava kemikaali 
olemasolu tõttu. Sellisel juhul tuleks katset korrata, vähendades uuritava kemi ­
kaali kontsentratsiooni, kuni jõutakse tasemeni, mille juures inhibitsiooni ei teki, ja kui võib-olla vähendada kontsentratsiooni veel, hakatakse uuritavat 
kemikaali biolagundama. Kui uuritaval kemikaalil (või reoveel) on siiski 
protsessile kõigil katsetatud kontsentratsioonidel kahjulik mõju, näitab see seda, et kõnealust kemikaali on keeruline kui mitte võimatu bioloogiliselt töödelda, kuid otstarbekas võib olla korrata katset muust allikast pärit aktiiv ­
mudaga ja/või lastes mudal järkjärgulisemalt aklimatiseeruda.
 
3. Vastupidisel juhul, kui uuritav kemikaal simulatsioonikatses esimesel katsel 
biokõrvaldatakse, tuleks selle kontsentratsiooni suurendada, kui on vaja teada, 
kas kemikaalil võiks olla inhibeeriv mõju.  
4. Inhibitsiooni astmete määramisel tuleks meeles pidada, et aktiivmuda populat ­
sioon võib muutuda ja seega võivad mikroorganismid aja jooksul hakata inhibeerivat kemikaali taluma.
 
5. Inhibitsiooni määra arvutamine:  
katse- ja kontrollseadmete biokeemilise hapnikutarbe, lahustunud orgaanilise 
süsiniku, keemilise hapnikutarbe jne üldist kõrvaldamise protsenti R  o saab 
arvutada järgmise võrrandi alusel:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
kus: 
I = katse- ja kontrollnõu biokeemilise hapnikutarbe, lahustunud orgaanilise 
süsiniku, keemilise hapnikutarbe jne kontsentratsioon (mg/l) sisse ­
voolus,  
E = vastavad kontsentratsioonid (mg/l) väljavoolus.  
I ja E tuleb katseseadmetes uuritava kemikaalina lisatud lahustunud orgaani ­
lise süsiniku arvestamiseks parandada, muidu annavad inhibitsiooniprotsendi 
arvutused vale tulemuse.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Uuritavast kemikaalist tingitud inhibitsiooni määra saab arvutada järgmise 
võrrandi alusel:  
% inhibitsiooniprotsent  ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
kus: 
R c = kontrollnõudes kõrvaldamise protsent  
R t = katsenõudes kõrvaldamise protsent  
KIRJANDUS  
1) Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
2) Käesoleva lisa peatükk C.11 „Biodegradatsioon – aktiivmuda respiratsiooni 
pärssimise katse”.  
3) ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
4) ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
5. liide  
Vees halvasti lahustuvad uuritavad kemikaalid – lenduvad kemikaalid  
Vees halvasti lahustuvad kemikaalid  
Vees halvasti lahustuvate ja mittelahustuvate kemikaalide kasutamise kohta 
reovee puhastamist simuleerivates katsetes näib olevat avaldatud vähe töid 
(1, 2, 3).  
Ei ole ühtegi uuritava kemikaali hajutamise meetodit, mis oleks kohaldatav 
kõigile mittelahustuvatele kemikaalidele. Näib, et kaks neljast standardis ISO 
10634 (4) kirjeldatud meetodist on sobivad simulatsioonikatsetes uuritavate kemi ­
kaalide hajutamise proovimiseks; need on emulgaatorite ja/või ultrahelienergia kasutamine. Tuleks määrata niiviisi saadava dispersiooni püsivus vähemalt 24 
tunni jooksul. Asjakohaselt stabiliseeritud dispersioone, mida hoitakse pidevalt 
segatavas mahutis (punkt 38), tuleks seejärel doseerida aeratsiooninõusse eraldi olmereoveest (või sünteetilisest reoveest).
 
Kui dispersioon on stabiilne, siis tuleb uurida, kuidas uuritavat kemikaali saab 
hajutatud kujul määrata. Lahustunud orgaaniline süsinik tõenäoliselt selleks ei 
sobi, seega tuleks uuritava kemikaali jaoks leida spetsiifiline analüüsimeetod, mida võiks kasutada väljavoolude, väljavoolu tahkete osakeste ja aktiivmuda puhul. Aktiivmuda protsessi simuleerimisel uuritava kemikaaliga toimuvad reakt ­
sioonid tuleks seejärel määrata vedel- ja tahkes faasis. Seega määrataks massi ­
bilanss, et otsustada, kas uuritav kemikaal on biolagundatud. See näitaks siiski ainult esmast biolagunemist. Täieliku biolagunemise tõendamist tuleks proovida, kohaldades kiirele biolagundatavusele respiromeetrilist katset (käesoleva lisa 
peatüki C.4 (5) meetodid C.4-C, C.4-F või C.4-D), kasutades inokulumina simu ­
latsioonikatses uuritava kemikaaliga kokku puutunud muda.
 
Lenduvad kemikaalid  
Reovee puhastamise simulatsioonide kohaldamine lenduvatele kemikaalide on nii 
vaieldav kui ka problemaatiline. Nagu ka vees halvasti lahustuvate uuritavate kemikaalide puhul, näib olevat avaldatud vähe artikleid, milles kirjeldatakse 
lenduvate kemikaalide simulatsioonikatseid. Kasutatakse tavalist tüüpi täieliku 
segamise seadet ja tihendatud aeratsiooni- ja settenõusid, mõõdetakse ja kontrol ­
litakse voolumõõdikute abil õhuvoolu ning juhitakse väljuv gaas läbi separaato ­
rite, et koguda lenduvat orgaanilist ainet. Mõnikord kasutatakse vaakumpumpa, et 
juhtida väljuv gaas läbi külmseparaatori või läbipuhumisseparaatori, mis sisaldab 
gaaskromatograafiliste analüüside jaoks Tenaxit ja silikageeli. Separaatoris leiduva uuritava kemikaali saab määrata analüütiliselt.
 
Katse tehakse kahes osas. Seadmeid käitatakse kõigepealt ilma mudata, aga 
sünteetilise reoveega ja uuritava kemikaaliga, mida pumbatakse aeratsiooni ­
nõusse. Kogutakse sissevoolu, väljavoolu ja väljutatud gaasi proovid ning paari päeva jooksul analüüsitakse uuritava kemikaali olemasolu neis. Kogutud andmete 
alusel on võimalik arvutada süsteemist väljapuhutud uuritava kemikaali protsent 
(R
 vs ). 
Seejärel tehakse (mudaga) tavaline bioloogiline katse väljapuhumise uuringuga 
identsetes tingimustes. Samuti tehakse lahustunud orgaanilise süsiniku või keemi ­
lise hapnikutarbe mõõtmised, et kontrollida seadmete tõhusat toimimist. Katse 
esimese osa jooksul tehakse aeg-ajalt analüüse, et määrata uuritav kemikaal sisse ­
voolus, väljavoolus ja väljuvas gaasis; pärast aklimatiseerumist tehakse analüüse sagedamini. Statsionaarse oleku andmete põhjal võib arvutada uuritava kemikaali 
kõigi protsesside (füüsikaline ja bioloogiline) käigus vedelfaasist kõrvaldamise 
protsendi (R
 T ) ning samuti süsteemist väljapuhutud osa (R  V ). ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Arvutus  
a) Mittebioloogilises katses võib arvutada süsteemist väljapuhutud uuritava 
materjali protsendi (R  VP ) järgmise võrrandi alusel:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
kus 
R VP = uuritava kemikaali kõrvaldamine lendumise teel (%);  
S VP = separaatorisse kogutud uuritav kemikaal, väljendatuna vedelfaasi 
võrdväärse kontsentratsioonina (mg/l);  
S IP = uuritava kemikaali kontsentratsioon sissevoolus (mg/l).  
b) Bioloogilises katses võib arvutada süsteemist väljapuhutud uuritava materjali 
protsendi (R  V ) järgmise võrrandi alusel:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
kus 
R V = uuritava kemikaali kõrvaldamine lendumise teel bioloogilises katses 
(%); 
S V = separaatorisse kogutud uuritav kemikaal bioloogilises katses, väljen ­
datuna sissevooluvedeliku võrdväärse kontsentratsioonina (mg/l);  
S I = uuritava kemikaali kontsentratsioon sissevoolus (mg/l).  
c) Bioloogilises katses võib kõikides protsessides kõrvaldatud uuritava kemikaali 
protsendi (R  T ) leida järgmise võrrandi alusel:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
kus 
S E = uuritava kemikaali kontsentratsioon (vedelas) väljavoolus (mg/l).  
d) Seega on võimalik arvutada biolagundamise ja adsorptsiooni teel kõrvaldatud 
protsenti (R  BA ) järgmisest võrrandist:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Tuleks teha eraldi katsed, et teha kindlaks, kas uuritavat kemikaali adsorbee ­
ritakse; kui see on nii, siis võib teha täiendava paranduse.  
e) Bioloogilisest (R  v ) ja mittebioloogilisest (R  vp ) katsesüsteemist väljapuhutud 
uuritava kemikaali osakaalu võrdlemine näitab üldist mõju, mis bioloogilisel 
töötlemisel on uuritava kemikaali heitele atmosfääri.  
Näide:  benseen  
Muda retentsiooniaeg = neli päeva  
Sünteetilise reovee retentsiooniaeg = kaheksa tundi  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Seetõttu  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % ja R  BA = 85 %.  
Eeldati, et benseen ei adsorbeerunud mudale.  
KIRJANDUS  
1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854.  
2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
4) ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment 
of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 
5) Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine”.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
6. liide  
Muda retentsiooniaja mõju kemikaalide töödeldavusele  
SISSEJUHATUS  
1. Peamises tekstiosas kirjeldatud meetod kavandati selleks, et teha kindlaks, 
kas uuritavaid kemikaale (üldjuhul neid, mis on teadaolevalt iseeneslikult, 
aga mitte kohe biolagundatavad) on võimalik biolagundada reoveepuhastite piiratud tingimustes. Tulemused väljendatakse kõrvaldamise protsendina ja biolagundamise protsendina. Aktiivmuda seadmete käitamise tingimused ja 
sissevoolu valik võimaldavad uuritava kemikaali kontsentratsiooni puhul 
väljavoolus üpris suuri erinevusi. Katsed tehakse ainult ühel muda tahkete osakeste nominaalsel kontsentratsioonil või ühe nominaalse muda retentsioo ­
niajaga ning kirjeldatud muda kõrvaldamise režiimid võivad põhjustada 
muda retentsiooniaja väärtuse märkimisväärset erinemist katse vältel nii eri 
päevadel kui ka ühe päeva jooksul.
 
2. Selle variandi (1, 2) puhul kontrollitakse muda retentsiooniaega palju kitsa ­
mates piirides iga 24-tunnise ajavahemiku vältel (täpselt nagu suure ulatuse 
puhul), mille tulemusel saadakse püsivam kontsentratsioon väljavooludes. 
Soovitatakse kasutada olmereovett, kuna see annab kõrvaldamise püsivama ja suurema osakaalu. Samuti uuritakse mitme muda retentsiooniaja väärtuse mõju ning üksikasjalikumas uuringus võidakse määrata väljavoolu kontsen ­
tratsiooni sõltuvus temperatuurist.
 
3. Seni ei ole ühist arusaama selle kohta, millised kineetilised mudelid kirjel ­
davad kemikaali lagunemist reovee puhastamisel teatavatel tingimustel. Kogutud andmete kirjeldamiseks valiti bakterite kasvu ja substraadi kasuta ­
mise Monod’ mudel (1, 2), kuna meetodit oli kavas kasutada ainult suurtes 
kogustes toodetavate kemikaalide puhul, mille kontsentratsioon reovees on üle 1 mg/l. Lihtsustatud mudeli ja tehtud eelduste õigsust kontrolliti erineva esmase biolagundatavusega alkoholetoksülaatide seeria abil (2, 3).
 
Märkus.  Selles meetodi variandis on lähedaselt järgitud suurt osa käesoleva 
katsemeetodi C.10-A tekstist ning allpool on esitatud ainud need üksikasjad, mis on erinevad.
 
KATSE PÕHIMÕTE  
4. Aktiivmuda poorse poti seadmeid, mis on projekteeritud selleks, et võimal ­
dada (peaaegu) pidevat vedela segu kõrvaldamist ja muda retentsiooniaja 
(SRT või θ s ) väga täpset reguleerimist, kasutatakse ühendamata režiimis 
mitme muda retentsiooniajaga ning soovi korral mitmel temperatuuril. Retentsiooniaeg on tavaliselt vahemikus 2–10 päeva ja temperatuur on 
5–20 °C. Reovett (eelistatavalt olmereovett) ja uuritava kemikaali lahust 
doseeritakse seadmetesse eraldi sellise kiirusega, et saavutada nõutav reovee retentsiooniaeg (3–6 tundi) ja uuritava kemikaali nõutav kontsentratsioon sissevoolus. Kontrollseadmeid, kuhu uuritavat kemikaali ei lisata, käitatakse 
samal ajal võrdlusandmete saamiseks.
 
5. Võib kasutada muud tüüpi seadmeid, kuid tuleks olla väga hoolikas, et 
tagada muda retentsiooniaja hea reguleerimine. Näiteks settenõuga puhasti kasutamisel võib olla vaja võtta arvesse puhasti väljavoolu kaudu toimuvat 
tahkete osakeste kadu. Lisaks tuleks võtta erilisi ettevaatusabinõusid, et 
vältida vigu, mida põhjustab muda koguse varieerumine settenõus.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Seadmeid käitatakse iga valitud tingimuste komplektiga ja pärast tasakaa ­
luoleku saavutamist määratakse uuritava kemikaali väljavoolude keskmised 
statsionaarse oleku kontsentratsioonid ning soovi korral lahustunud orgaani ­
lise süsiniku näitajad ligikaudu kolmenädalase ajavahemiku vältel. Lisaks uuritava kemikaali ja, soovi korral, lahustunud orgaanilise süsiniku kõrval ­
damise protsendi hindamisele tuleb graafiliselt esitada väljavoolu kontsen ­
tratsiooni sõltuvus puhasti kasutustingimustest. Selle alusel saab arvutada esialgsed kineetilised konstandid ja ennustada tingimusi, milles võib töödelda uuritavat kemikaali.
 
ANDMED UURITAVA KEMIKAALI KOHTA  
7. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 12 ja 13.  
KÜNNISVÄÄRTUSED  
8. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 14 ja 15.  
VÕRDLUSALUSENA KASUTATAV UURITAV KEMIKAAL  
9. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 16.  
KATSETULEMUSTE REPRODUTSEERITAVUS  
10. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 17 ja 18.  
MEETODI KIRJELDUS  
Seadmed  
11. Sobiv seade on muudetud poorse poti süsteem (liide 6.1). See koosneb 
sisemisest nõust (või vooderdisest), mis on valmistatud poorsest polüpropü ­
leenist; vooderdise paksus on 3,2 mm ja poori suurus ligikaudu 90 μm. 
Nende omavaheline ühendus põkk-keevitatakse. (Nii saadakse töökindlam seade kui käesoleva peatüki C.10-A punktis 21 kirjeldatud seade). Vooderdis on paigutatud vett mitte läbi laskvasse polüetüleenist välisnõusse, 
mis koosneb kahest osast: ringikujuline alus, millesse on puuritud augud, et 
paigaldada kaks õhuvoolikut ja muda kõrvaldamise voolik, ning ülemine silinder, mis kruvitakse põhja külge ja millele on paigaldatud väljund, et tagada poorse poti teadaolev maht (3 liitrit). Üks õhuvoolikutest on varus ­
tatud õhuvoolu hajutava otsikuga (difuusorkiviga); teine on avatud otsaga ja 
asetatud potis kivi suhtes täisnurga all. Kõnealune süsteem tekitab keerise, mis on vajalik selleks, et poti sisu oleks täielikult segatud, ning tagab samuti lahustunud hapniku kontsentratsiooni üle 2 mg/l.
 
12. Vajalik arv seadmeid hoitakse reguleeritud temperatuuril vahemikus 
5–20 °C (±1 °C) kas veevannis või püsiva temperatuuriga ruumis. Pumbad on vajalikud, et doseerida aeratsiooninõudesse uuritava kemikaali lahust ja 
settinud reovett nõutava kiirusega (vastavalt 0–1,0 ml/min ja 0–25 ml/min) 
ning kolmas pump on vajalik selleks, et kõrvaldada reomuda aeratsiooni ­
nõudest. Vajalik väga väike reomuda voolukiirus saavutatakse pumbaga, mis on seatud suuremale kiirusele ja mis lülitatakse aeg-ajalt sisse taimeriga lüliti 
abil, näiteks lülitatakse sisse 10 sekundiks minutis, pumpamiskiirus on 3 
ml/min, mis annab kõrvaldamise kiiruse 0,5 ml/min.
 
Filtrimisseade või tsentrifuug  
13. Kohaldatakse peatüki C10-A punkti 23.  
Analüüsiseadmed  
14. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 24.  
Vesi ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 25 ja 26.  
Orgaaniline kasvukeskkond  
16. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 27.  
Sünteetiline reovesi  
17. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 28.  
Olmereovesi  
18. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkti 29.  
Aktiivmuda  
19. Kohaldatakse peatüki C10-A punkti 30.  
Uuritava kemikaali põhilahus  
20. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 31 ja 32.  
KATSE KÄIK  
Inokulumi valmistamine  
21. Kohaldatakse ainult peatüki C.10-A punkti 34; kasutage aktiivmuda (ligi ­
kaudu 2,5 g/l).  
Katseseadmete arv  
22. Lihtsa katse jaoks, s.o kõrvaldamise protsendi mõõtmiseks, on vajalik ainult 
üks muda retentsiooniaeg, kuid ligikaudsete kineetiliste konstantide arvuta ­
miseks vajalike andmete saamiseks on vaja 4 või 5 muda retentsiooniaja väärtust. Tavaliselt valitakse väärtused vahemikus 2–10 päeva. Praktilistel kaalutlustel on kasulik teha katse samal ajal 4 või 5 muda retentsiooniajaga 
ühel temperatuuril; pikendatud uuringute puhul kasutatakse muudel tempe ­
ratuuridel vahemikus 5–20 °C samu muda retentsiooniaja väärtusi või erinevat väärtuste vahemikku. Esmase biolagunemise (peamine kasutus) korral on ühe tingimuste komplekti jaoks vaja tavaliselt ainult ühte seadet. 
Täieliku biolagunemise korral on siiski iga tingimuste komplekti jaoks vaja 
kontrollseadet, millesse lisatakse reovett, kuid mitte uuritavat kemikaali. Kui arvatakse, et uuritavat kemikaali esineb kasutatavas reovees, oleks vaja 
kasutada esmase biolagunemise hindamisel kontrollseadmeid ja teha arvu ­
tustes vajalikud parandused.
 
Orgaanilise kasvukeskkonna ja uuritava kemikaali doseerimine  
23. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 36–39, kuid pange tähele, et uuritava 
kemikaali lahust doseeritakse eraldi ja kasutatakse erinevaid muda kõrvalda ­
mise määrasid. Samuti tuleb sagedasti jälgida (näiteks kaks korda päevas) sissevoolu, väljavoolu ja muda kõrvaldamise voolukiiruseid ning vajaduse 
korral neid kohandada, et erinevus soovitust oleks ±10 % piires. Kui olme ­
reovee kasutamisel tekivad analüüsimeetoditega seotud probleemid, siis tehke katse sünteetilise reoveega, aga tuleb tagada, et erinevad kasvukesk ­
konnad annavad võrreldavaid kineetilisi andmeid.
 
Aktiivmuda seadmete käsitsemine  
24. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 40–43, kuid reguleerige muda retent ­
siooniaega ainult muda „pideva” kõrvaldamise abil.  
Proovide võtmine ja analüüsimine  
25. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 44–50, selle erinevusega, et tuleb 
määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon ja soovi korral lahustunud 
orgaaniline süsinik; keemilist hapnikutarvet ei tohiks kasutada.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Tulemuste töötlemine  
26. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 52–54.  
Katsetulemuste esitamine  
27. Kohaldatakse peatüki C.10-A punkte 56–62.  
Kineetiliste konstantide arvutamine  
28. Esmase biolagundamise protsendi esitamise asemel on realistlikum esitada 
uuritava kemikaali keskmine statsionaarse oleku kontsentratsioon välja ­
voolus ja kirjeldada, kuidas see sõltub puhasti erinevatest käitamise tingi ­
mustest. Seda on võimalik teha liites 6.2 esitatud võrrandi 6 abil, millest 
võib leida K  S , μ m ja θ SC väärtused (muda kriitiline retentsiooniaeg).  
(Selle asemel võib leida K  S ja μm ligikaudsed väärtused, kasutades lihtsat 
arvutiprogrammi, millega võrrandi 2 (liide 6.2) järgi arvutatud teoreetilist kõverat sobitatakse saadud eksperimentaalsete väärtustega. Kuigi ühtki 
lahendust ei saa pidada ainsaks õigeks lahenduseks, on võimalik saada K
 S 
ja μ m mõistlikud ligikaudsed väärtused.)  
Tulemuste hajuvus  
29. On teada, et iga üksiku kemikaali jaoks saadud kineetiliste parameetrite 
väärtused hajuvad. Arvatakse, et muda kasvatamise tingimused ning samuti katses valdavalt esinenud tingimused (nagu punktis 5 ja muudes katsetes) 
mõjutavad saadud väärtusi oluliselt. Ühte sellise muutlikkuse tahku on 
arutanud Grady  et al.  (4), kes on soovitanud kasutada kineetilise eksperi ­
mendi käigus kultuuri saavutatava võimaliku füsioloogilise oleku kahe äärmusliku seisundi jaoks mõisteid „tegelikult esinev” ( extant ) ja 
„olemuslik” ( intrinsic ). Kui oleku muutumist katse jooksul ei lubata, väljen ­
davad kineetilise parameetri väärtused selle keskkonna tingimusi, kust mikroorganismid hangiti; neid väärtusi nimetatakse tegelikult või parajasti esinevaks. Teise äärmuse korral, kui katsetingimused võimaldavad valgusün ­
teesisüsteemi täielikku väljaarenemist ja seega maksimaalset võimalikku 
kasvukiirust, nimetatakse saadud kineetilisi parameetreid olemuslikuks ning need olenevad ainult substraadi laadist ja kultuuris sisalduvate bakterite tüüpidest. Juhinduda võib sellest, et tegelikult esinevad väärtused saadakse 
siis, kui substraadi kontsentratsiooni ja kompetentsete mikroorganismide 
suhe (S
 o / X  o ) hoitakse madal, näiteks 0,025, ning olemuslikud näitajad 
esinevad siis, kui suhe on kõrge, näiteks vähemalt 20. Mõlemal juhul peaks S
 o olema asjakohase poolküllastatuse konstandiga Ks võrdne või 
seda ületama.  
30. Tulemuste hajuvust ja muid biolagundamise kineetika tahke arutati hiljutises 
keskkonnatoksikoloogia ja -keemia ühingu õpikojas (5). Neist avaldatud ja kavandatavatest uuringutest peaks saama selgema arusaama reoveepuhastites 
toimivast kineetikast, mis lubab olemasolevaid andmeid paremini tõlgendada 
ning tulevasi katsemeetodeid paremini kavandada.
 
KIRJANDUS  
1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33–48.  
2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340–343.  
3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742–748.  
5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Liide 6.1  
Muda retentsiooniaja reguleerimisega poorne pott
  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Liide 6.2  
Kineetiliste konstantide arvutamine  
1. Kui eeldada Monod’ kineetika kehtivust ning võtta arvesse aktiivsete tahkete 
osakeste ja substraadi massibilanssi aktiivmuda süsteemis (1), on võimalik leida järgmised statsionaarse oleku näitajad:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
või 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2], 
kus 
S 1 = substraadi kontsentratsioon väljavoolus (mg/l)  
K S = poolküllastatuse konstant, kontsentratsioon, mille juures μ = μ m /2 
(mg/l)  
μ = kasvu erikiirus (d  –1 ) 
μ m = μ m (d –1 ) maksimumväärtus  
K d = aktiivsete tahkete osakeste kadumise erikiirus (d  –1 ) 
θ S = muda keskmine retentsiooniaeg, SRT (d)  
Selle võrrandi uurimisel võib teha järgmised järeldused:  
i) väljavoolu kontsentratsioon ei sõltu sissevoolu kontsentratsioonist (S  0 ); 
seega muutub biolagundamise protsent sissevoolu kontsentratsiooni S  0 
muutumisel;  
ii) ainus juhitav puhasti parameeter, mis mõjutab S  1 väärtust, on muda 
retentsiooniaeg θ S ; 
iii) sissevoolu kindla kontsentratsiooni S  0 puhul on olemas kriitiline muda 
retentsiooniaeg, mis vastab järgmistele tingimustele:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3], 
kus 
θ SC = kriitiline muda retentsiooniaeg, millest väiksema väärtuse puhul 
uhutakse kompetentsed mikroorganismid puhastist välja;  
iv) kuna võrrandi 2 muud parameetrid on seotud kasvu kineetikaga, 
mõjutab temperatuur tõenäoliselt substraadi sisaldust väljavoolus ja muda kriitilist vanust, s.o teatava töötlemismäära saavutamiseks vajalik 
muda retentsiooniaeg suureneb temperatuuri vähendamisega.
 
2. Poorse poti süsteemi tahkete ainete massibilansi alusel ja eeldades, et tahkete 
osakeste kontsentratsioon puhasti väljavoolus X  2 on väike aeratsiooninõu 
kontsentratsiooniga X  1 võrreldes, on muda retentsiooniaeg  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
ja, 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
kus 
V = aeratsiooninõu maht (l)  
X 1 = tahkete osakeste kontsentratsioon aeratsiooninõus (mg/l)  
X 2 = tahkete osakeste kontsentratsioon väljavoolus (mg/l)  
Q 0 = sissevoolu voolukiirus (l/d)  
Q 1 = reomuda voolukiirus (l/d)  
Seega on muda retentsiooniaega võimalik reguleerida mis tahes eelnevalt 
valitud väärtusele reomuda voolukiiruse Q  1 reguleerimisega.  
Järeldused  
3. Katse peamine eesmärk on seega võimaldada prognoosida kontsentratsiooni 
väljavoolus ja sellest tulenevalt uuritava kemikaali taset suublates.  
4. Kui koostada väljavoolukontsentratsiooni S  1 retentsiooniajast θ S sõltuvuse 
graafik, on mõnikord võimalik hinnata muda kriitilist retentsiooniaega θ SC , 
vt kõver 3 joonisel 1. Kui see ei ole võimalik, võib arvutada θ SC koos μ m ja 
K S ligikaudsete väärtustega, kui koostada S  1 sõltuvus S  1 •θ S -st. 
Võrrandi 1 teisendamisega saame:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Kui K  d on väike, siis 1 + θ s • K  d ~ 1 ja võrrandist 5 saame:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Seega peaks graafik olema sirge joon (vt joonis 2) tõusuga 1/ μ m ja 
alglõiguga K  S /μ m ; sellest tuleneb ka, et θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Joonis 1  
Kolm temperatuuri; viis muda retentsiooniaega
  
Joonis 2  
Muda retentsiooniaja regressioonijoon S  1 vs. S 1 T = 5 °C juures
  
Terminid:  
kontsentratsioon väljavoolus  
kõver  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
7. liide  
KATSE VÄIKESE KONTSENTRATSIOONI ( μg/l) VAHEMIKUS  
1. Paljud kemikaalid esinevad veekeskkonnas (isegi reovees) tavaliselt väga 
väheses kontsentratsioonis ( μg/l). Sellises kontsentratsioonis ei ole need 
tõenäoliselt peamised kasvu põhjustavad substraadid; on tõenäoline, et neid lagundatakse kasvu mittepõhjustavate teiseste substraatidena koos 
mitmesuguste looduslike orgaaniliste ainetega. Seega ei vasta selliste kemi ­
kaalide lagunemine 6. liites esitatud mudelile. Võib kasutada mitmeid mude ­
leid ja reoveepuhastites peamiselt esinevates tingimustes võib samal ajal olla kasutatav rohkem kui üks mudel. Selle asjaolu täpsustamiseks tuleb teha 
palju rohkem uurimistööd.
 
2. Seni võib järgida põhitekstis (peatükk C.10-A) kirjeldatud meetodit, aga 
ainult esmase biolagundatavuse puhul, kasutades sobivalt väikseid kontsen ­
tratsioone (< 100 μg/l) ja valideeritud analüüsimeetodit. Kui võetakse 
arvesse ka abiootilisi protsesse (adsorptsioon, lendumine jne), võib arvutada 
biolagundatavuse protsendi (vt käesoleva katsemeetodi punkt 54). Näitena võib kasutada Nyholmi ja tema kolleegide uuringut (1, 2), milles uuritavat kemikaali lisati neljatunnise tsükliga täitmise ja tühjendamise süsteemi ( fill 
and draw system ). Nad teatasid pseudo-esimese järgu kineetilised kons ­
tandid viie kemikaali jaoks, mis lisati sünteetilisse reovette kontsentrat ­
sioonil 5–100 μg/l. (Täieliku biolagundatavuse jaoks võib kasutada
 14 C 
märgistusega uuritavaid kemikaale.) Selle kirjeldamine jääb käesolevast 
katsemeetodist välja, kuna seni puuduvad kinnitatud meetodid, kuigi ISO 
14592 (3) jaoks välja pakutud meetod sisaldab suuniseid  14 C märgistusega 
kemikaalide kasutamise kohta.  
Poolpidev aktiivmudatest  
3. Hiljem pakuti välja lihtsam kahest etapist koosnev katse (4, 5, 6); poolpi ­
deva aktiivmudatesti (SCAS testi) meetodile järgnevad lühiajalised kineeti ­
lised katsed poolpideva aktiivmudatesti seadmetest võetud proovidega. Pool ­
pideva aktiivmudatesti süsteemi käitatakse muda kõrvaldamise teadaoleva määraga (erinevalt algsest katsemeetodist C.12) ja sinna lisatakse muudetud OECD sünteetilist reovett või olmereovett. Sünteetilist reovett muudeti (pH 
muutumise ja muda halva settivuse tõttu) ning lisati puhverdamiseks 
fosfaati, pärmiekstrakti, raud(III)kloriidi ja mikroelementide soolasid; selle keemiline hapnikutarve suurendati ligikaudu väärtuseni 750 mg/l peptooni ja lihaekstrakti kontsentratsiooni suurendamisega. Seadmeid käitati 24-tunnise 
tsükliga: aeratsioon 23 tunni vältel, muda kõrvaldamine, settimine, superna ­
tandi (väljavoolu) kõrvaldamine, millele järgnes sünteetilise reovee lisamine ja uuritava kemikaali lisamine kuni kontsentratsioonini 100 μg/l (s.o ligi ­
kaudu samal kontsentratsioonil, mida kasutati kiirkatses). Kord nädalas 
vahetati 10 % mudakogusest värske muda vastu, et säilitada tasakaalustatud 
mikroobipopulatsiooni.
 
4. Uuritava kemikaali kontsentratsiooni mõõdetakse alguses ja aeratsiooni 
lõpus ning katset jätkatakse, kuni saavutatakse uuritava kemikaali konstantse 
kiirusega kõrvaldamine; selleks võib kuluda üks nädal kuni mitu kuud.  
Kiirkatse  
5. Uuritava kemikaali lagunemise pseudo-esimest järku kiiruskonstandi määra ­
miseks teadaoleva, kuid erineva päritolu ja varasema kasutusega aktiivmudas 
kasutatakse kiirkatset (näiteks kaheksa tundi). Aklimatiseerumiskatse ajal (punktid 3 ja 4) võetakse poolpideva aktiivmudatesti reaktoritest muda proovid (aeratsiooni ajavahemiku lõpus, kui orgaanilise substraadi kontsen ­
tratsioon on väike). Võrdluseks võib võtta ka muda paralleelsest poolpideva 
aktiivmudatesti seadmest, mis ei ole uuritava kemikaaliga kokku puutunud.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
Muda segusid lisatud uuritava kemikaaliga (kaks või enam kontsentratsiooni 
vahemikus 1–50 μg/l) aereeritakse ilma sünteetilist reovett või muud orgaa ­
nilist substraati lisamata. Lahusesse alles jäänud uuritav kemikaal määra ­
takse korrapäraste ajavahemike järel, näiteks iga tund, olenevalt kemikaali lagundatavusest, kuni 24 tunni jooksul. Enne sobiva analüüsimeetodi kasu ­
tamist proovid tsentrifuugitakse.
 
Arvutused  
6. Poolpideva aktiivmudatesti seadmetega saadud andmeid kasutatakse uuritava 
kemikaali kõrvaldamise protsendi arvutamiseks (punkt 54). Samuti saab 
arvutada keskmise kiiruskonstandi K  1 (mis on hõljuvaine kontsentratsiooni 
järgi normaliseeritud) järgmisest võrrandist:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
kus 
t = aeratsiooniaeg (23 h)  
C e = kontsentratsioon aeratsiooniaja lõpus ( μg/l) 
C i = kontsentratsioon aeratsiooni alguses ( μg/l) 
SS = aktiivmuda tahkete osakeste kontsentratsioon (g/l)  
7. Kiirkatses koostatakse uuritava kemikaali allesoleva kontsentratsiooni log% 
ajast sõltuvuse graafik ning graafiku alguse (10–50 % lagunemist) tõus on 
võrdväärne pseudo-esimest järku kiiruskonstandiga K  1 . Konstant normeeri ­
takse muda tahkete osakeste kontsentratsiooniga: tõus jagatakse läbi muda tahkete osakeste kontsentratsiooniga. Teatatud tulemus peab samuti sisal ­
dama andmeid uuritava kemikaali ja hõljuvaine lähtekontsentratsioonide, 
muda retentsiooniaja, muda koguse ja päritolu kohta ning uuritava kemikaa ­
liga eelneva kokkupuute kohta (kui see on toimunud).
 
Tulemuste hajuvus  
8. Tulemuste hajuvust ja muid biolagundamise kineetika tahke arutati hiljutises 
keskkonnatoksikoloogia ja -keemia ühingu õpikojas (7). Neist avaldatud ja kavandatavatest uuringutest peaks saama selgema arusaama reoveepuhastites 
toimivast kineetikast, mis lubab olemasolevaid andmeid paremini tõlgendada 
ning tulevasi katsemeetodeid paremini kavandada.
 
KIRJANDUS  
1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz 
B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. 
Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.  
2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.
 
3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evalua ­
tion of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentra ­
tions in water.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
 
5) Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.  
6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegra ­
dability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
 
7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. 
King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4–6  th Sept. 1996. SETAC- Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: biokiled  
SISSEJUHATUS  
1. Simulatsioonikatseid kasutatakse enamasti selliste kemikaalide puhul, mis 
kiire biolagundatavuse sõelumiskatse (käesoleva lisa peatüki C.4 meetodid C.4-A kuni C.4-F (9)) kohaselt ei ole kiiresti biolagundatavad, kuid mis on siiski iseeneslikult biolagunevad. Erandkorras kasutatakse simulatsiooni ­
katset ka iga kemikaali puhul, mille kohta on vaja rohkem teavet, eelkõige 
masstootmises olevate kemikaalide puhul, ja tavaliselt kasutatakse aktiiv ­
muda katset (C.10-A). Mõnel juhul vajatakse siiski konkreetset teavet kemi ­
kaali käitumise kohta biokiledega seotud reovee puhastamise meetodite 
puhul, eelkõige nõrgfiltrite, pöörlevate bioloogiliste kontaktseadmete ja 
keevkihttehnoloogiate puhul. Selle vajaduse täitmiseks on välja töötatud mitmesugused vahendid.
 
2. Gerike  et al.  (1) kasutasid suuri pooltööstuslikke nõrgfiltreid ühendatud 
režiimis. Need filtrid võtsid palju ruumi ja vajasid suhteliselt palju reovett või sünteetilist reovett. Truesdale  et al.  (2) kirjeldasid väiksemaid filtreid 
(läbimõõduga 6 jalga × 6 tolli), millesse lisati pindaktiivseid aineid mitte 
sisaldavat naturaalset reovett, kuid nende jaoks oli siiski vaja suhteliselt suuri reoveekoguseid. Valmis (küpse) biokile loomiseks kulus 14 nädalat ning pärast pindaktiivse uuritava aine esmakordset lisamist kulus veel 4–8 
nädalat, enne kui biokile oli aklimatiseerunud.
 
3. Baumann  et al.  (3) töötasid välja palju väiksema filtri, milles biokilet toetava 
inertse kasvukeskkonnana kasutati eelnevalt aktiivmudas immutatud nn 
polüesterfliisi. Uuritavat kemikaali kasutati ainsa süsinikuallikana ja biola ­
gundatavust hinnati sissevoolus ja väljavoolus lahustunud orgaanilise süsi ­
niku mõõtmise teel ning väljunud gaasis CO  2 koguse hindamise alusel.  
4. Hoopis erinevat lähenemisviisi kasutasid Gloyna  et al . (4), kes leiutasid 
pöörleva torureaktori. Pöörleva toru sisepinnal kasvatati teadaoleval pindalal 
biokile, lastes läbi horisontaalsuuna suhtes väikese nurga all oleva toru 
ülemise osa kaudu lisatavat sissevoolu. Reaktorit on kasutatud pindaktiivsete ainete biolagundatavuse uurimiseks (5) ning samuti biokile optimaalse paksuse ja läbi kile difusiooni uurimiseks (6). Viimati nimetatud autorid 
arendasid reaktorit edasi, muu hulgas täiustades seda väljuvas gaasis CO
 2 
määramise võimaldamiseks.  
5. Pöörleva torureaktori kinnitas analüütikute alaline komitee (Ühendkuning ­
riik) kui standardmeetodi, millega hinnatakse kemikaalide biolagundatavust (7) ning reovete puhastatavust ja mürgisust (8). Siin kirjeldatud meetodi eelised on lihtsus, kompaktsus, korratavus ja orgaanilise kasvukeskkonna 
suhteliselt väikse koguse kasutamine.
 
KATSE PÕHIMÕTE  
6. Kaldu oleva aeglaselt pöörleva toru sisepinnale lisatakse sünteetilist või 
olmereovett ja uuritavat kemikaali kas seguna või eraldi. Sisepinnale tekib mikroorganismide kiht, mis on samalaadne biofiltrites esinevaga. Reaktori 
kasutamise tingimused valitakse sellised, et tagada orgaanilise aine piisav 
kõrvaldamine ja vajaduse korral ammooniumi oksüdeerumine.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Väljavool torust kogutakse ja kas setitatakse ja/või filtritakse enne lahus ­
tunud orgaanilise süsiniku ja/või uuritava kemikaali analüüsimist spetsiifilise 
meetodi abil. Samal ajal ja samadel tingimustel käitatakse võrdluseks kont ­
rollkatse seadmeid, kuhu uuritavat kemikaali ei lisata. Katse- ja kontroll ­
seadmete väljavoolus ilmnev lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentrat ­
siooni erinevus on eeldatavasti põhjustatud uuritavast kemikaalist ja selle 
orgaanilistest metaboliitidest. Seda erinevust võrreldakse lisatud uuritava kemikaali kontsentratsiooniga (väljendatud lahustunud orgaanilise süsini ­
kuna), et arvutada uuritava kemikaali kõrvaldamine.
 
8. Biolagunemist on bioadsorptsioonist üldiselt võimalik eristada nii, et uuri ­
takse hoolikalt kõrvaldamismäära ajast sõltuvuse graafikut. Tavaliselt saab 
seda kinnitada kiire biolagundatavuse katsega (hapniku sidumine või süsi ­
nikdioksiidi tekkimine), kasutades aklimatiseeritud inokulumi, mis on võetud katse lõpus nendest reaktoritest, kuhu on lisatud uuritavat kemikaali.
 
ANDMED UURITAVA KEMIKAALI KOHTA  
9. Tulemuste õigeks tõlgendamiseks peaksid olema teada uuritava kemikaali 
puhtus, vees lahustuvus ning lenduvuse ja adsorptsiooniga seotud omadused.  
10. Lenduvaid ja halvasti lahustuvaid kemikaale ei ole tavaliselt võimalik katse ­
tada ilma erimeetmeid võtmata (vt peatüki C.10-A 5. liide). Samuti peaks 
olema teada keemiline struktuur või vähemalt empiiriline valem, et arvutada 
teoreetilised väärtused ja/või kontrollida parameetrite mõõdetud väärtusi, nagu teoreetiline hapnikutarve, lahustunud orgaaniline süsinik.
 
11. Sobiva katsekontsentratsiooni valimisel võivad abiks olla andmed uuritava 
kemikaali mürgisuse kohta mikroorganismidele (vt peatüki C.10-A 4. liide); 
väikeste biolagundamise väärtuste õigeks tõlgendamiseks on need hädavaja ­
likud.  
KÜNNISVÄÄRTUSED  
12. Algul nõuti pindaktiivse kemikaali turule lubamiseks vähemalt 80 % esmast 
biolagundatavust. Kui 80 % künniseni ei jõuta, võib kohaldada kõnealust 
simulatsiooni (kinnitavat) katset ja pindaktiivset ainet võib turustada ainult juhul, kui rohkem kui 90 % konkreetsest kemikaalist kõrvaldatakse. Kemi ­
kaalide puhul üldiselt ei teki vastuvõetavuse/vastuvõetamatuse taseme küsi ­
must ja saavutatud kõrvaldamise protsentväärtust võib kasutada tõenäolise 
keskkonnakontsentratsiooni ligikaudsetes arvutustes, mida kasutatakse kemi ­
kaalist põhjustatud ohu hindamiseks. Puhaste kemikaalide mitmes uuringus leiti, et olulises ulatuses biolagunevatest kemikaalidest rohkem kui kolme 
neljandiku puhul on lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määr > 
90 % ning sellistest kemikaalidest rohkem kui 90 % puhul on see > 80 %.
 
VÕRDLUSKEMIKAALID  
13. Katse nõuetekohaseks tegemiseks on kasulik teha aeg-ajalt katseid võrdlus ­
kemikaalidega, mille käitumine on teada. Kõnealused kemikaalid on näiteks adipiinhape, 2-fenüülfenool, 1-naftool, difeenhape ja 1-naftoehape.
 
KATSETULEMUSTE REPRODUTSEERITAVUS  
14. Ühendkuningriigi labor leidis, et katsete suhteline standardhälve ühes laboris 
oli 3,5 % ja katsete vahel 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
MEETODI KIRJELDUS  
Seadmed  
Pöörlevad torureaktorid  
15. Seade (vt 8. liite joonised 1 ja 2) koosneb akrüültorude komplektist, milles 
iga toru pikkus on 30,5 cm ja siseläbimõõt 5 cm; torud asuvad kummiüm ­
brisega ratastel, mis paiknevad metallist tugiraamis. Igal torul on ligikaudu 0,5 cm võrra välja ulatuv äärik, et toru püsiks ratastel. Sisepind on muudetud jämeda traatvillaga karedamaks ning ülemises (sissevoolu) otsas 
0,5 cm võrra välja ulatuv sisemine äärik, mis hoiab vedelikku torus. Torud 
on rõhtasendi suhtes ligikaudu ühekraadise nurga all, et saavutada uuritava keskkonna läbi puhta toru suunamisel vajalik kokkupuuteaeg. Kummiümbri ­
sega rattaid pööratakse aeglase reguleeritava kiirusega mootori abil. Torude 
temperatuuri reguleeritakse sellega, et seade asub püsiva temperatuuriga 
ruumis.
 
16. Kui iga torureaktor pannakse mõnevõrra suuremasse korgiga torusse ja taga ­
takse ühenduste õhutihedus, on võimalik koguda väljuv gaasiline CO  2 hili­
semaks määramiseks leeliselahusesse (6).  
17. Iga toru jaoks hoitakse 20 l nõus (A) (vt joonis 2) 24-tunnist orgaanilise 
kasvukeskkonna varu, vajaduse korral koos lisatud uuritava kemikaaliga. 
Vajaduse korral võib eraldi doseerida uuritava kemikaali lahust. Iga sellise 
nõu põhja lähedal on väljalase, mis on sobiva (näiteks silikoonkummist) toru ja peristaltilise pumba (B) kaudu ühendatud klaasist või akrüülist pealevoo ­
lutoruga, mis ulatub 2–4 cm võrra kalduoleva toru ülemise (pealevoolu- 
)otsa (C) sisse. Väljavoolul lastakse kallutatud toru alumisest otsast tilkuda, 
et koguda see teise nõusse (D). Väljavool setitatakse või filtritakse enne analüüsi tegemist.
 
Filtrimisseade-tsentrifuug  
18. Proovide filtrimiseks mõeldud seade, milles on sobiva poorisuurusega (ava 
nominaalläbimõõt 0,45 μm) membraanfiltrid, mis adsorbeerivad orgaanilised 
kemikaalid ja millest vabaneb võimalikult vähe orgaanilist süsinikku. Kui kasutatakse filtreid, millest vabaneb orgaanilist süsinikku, tuleb filtreid hoolikalt pesta kuuma veega, et eemaldada väljauhutav orgaaniline süsinik. 
Selle asemel võib kasutada tsentrifuugi, mis tagab 40 000 m/s
 2 . 
19. Seadmed, mis on vajalikud järgmise kindlaksmääramiseks:  
— lahustunud orgaaniline süsinik, orgaanilise süsiniku kogusisaldus või 
keemiline hapnikutarve;  
— konkreetne kemikaal, kui nõutakse selle määramist (kõrgefektiivne vede ­
likkromatograafia, gaaskromatograafia jne);  
— pH, temperatuur, happelisus ja leeliselisus;  
— ammoonium, nitrit ja nitraat, kui katse tehakse nitrifikatsiooni tingi ­
mustes.  
Vesi 
20. Kraanivesi, mis sisaldab vähem kui 3 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku.  
21. Destilleeritud või deioniseeritud vesi, mis sisaldab vähem kui 2 mg/l lahus ­
tunud orgaanilist süsinikku.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Orgaaniline kasvukeskkond  
22. Orgaanilise kasvukeskkonnana võib kasutada sünteetilist reovett, olmereo ­
vett või nende segu. On tõendatud, et ainult olmereovee kasutamisel saadakse sageli suurem lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise prot ­
sent (aktiivmuda seadmetes) ning sellest saab biolagundada isegi mõnd 
sellist kemikaali, mis ei ole OECD sünteetilise reovee kasutamisel biolagun ­
datav. Seega on soovitatav kasutada olmereovett. Lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni (või keemilist hapnikutarvet) tuleb mõõta igas 
uues orgaanilise kasvukeskkonna partiis. On vaja teada orgaanilise kasvu ­
keskkonna happelisust või leeliselisust. Kui kasvukeskkonna happelisus või leeliselisus on väike, võib see vajada sobiva puhvri lisamist (naatriumvesi ­
nikkarbonaat või kaaliumvesinikfosfaat), et hoida katse ajal reaktoris pH 
väärtus ligikaudu 7,5 ± 0,5. Lisatava puhvri kogus ja lisamise aeg tuleb otsustada igal juhul eraldi.
 
Sünteetiline reovesi  
23. Ühes liitris kraanivees lahustatakse 160 mg peptooni, 110 mg lihaekstrakti; 
30 mg karbamiidi, 28 mg veevaba dikaaliumvesinikfosfaati (K  2 HPO  4 ), 7 mg 
naatriumkloriidi (NaCl), 4 mg kaltsiumkloriiddihüdraati (CaCl  2 ·2H 2 O), 2 mg 
magneesiumsulfaatheptahüdraati (Mg  2 SO 4 ·7H 2 O). See OECD sünteetiline 
reovesi on näidis ja selle keskmine lahustunud orgaanilise süsiniku kontsen ­
tratsioon sissevoolus on ligikaudu 100 mg/l. Alternatiivselt võib kasutada muid koostisi, millel on ligikaudu sama lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon ja mis on pärisreoveega sarnasemad. Kõnealuse sünteetilise 
reovee kontsentraadi võib valmistada destilleeritud veega ja hoida kuni ühe 
nädala temperatuuril 1 °C. Vajaduse korral lahjendatakse seda kraaniveega. (See kasvukeskkond ei ole rahuldav, näiteks lämmastiku kontsentratsioon on väga suur ja süsinikusisaldus on suhteliselt väike, kuid midagi paremat pole 
soovitatud, kuid kasvukeskkonna parandamiseks on soovitatud üksnes lisada 
puhvrina suuremas koguses fosfaati ja rohkem peptooni).
 
Olmereovesi  
24. Kasutage värskelt settinud reovett, mida kogutakse iga päev peamiselt olme ­
reovett töötlevast veepuhastuskäitisest. Seda tuleks koguda esmase settimise 
paagi ülevoolu kanalist või aktiivmudapuhasti sissevoolust ja see peaks üldiselt olema ilma suurte osakesteta. Seda reovett saab enne kasutamist 
hoida mitu päeva temperatuuril ligikaudu 4 °C, kui tõendatakse, et lahus ­
tunud orgaanilise süsiniku sisaldus (või keemiline hapnikutarve) ei ole hoid ­
mise ajal olulisel vähenenud (s.o vähem kui 20 %). Süsteemi häirimise vähendamiseks tuleks igas uues partiis viia lahustunud orgaaniline süsinik 
(või keemiline hapnikutarve) enne kasutamist sobivale konstantsele väärtu ­
sele näiteks kraaniveega lahjendamise teel.
 
Määrdeaine  
25. Peristaltilise pumba rullikute määrimiseks võib kasutada glütserooli või olii ­
viõli: mõlemad on sobivad silikoonkummist torudega kasutamiseks.  
Uuritava kemikaali põhilahused  
26. Kui kemikaal on piisavalt lahustuv, valmistage sobiva kontsentratsiooniga 
põhilahus (näiteks 1–5 g/l) deioniseeritud vees või sünteetilise reovee mine ­
raalses osas. Lahustumatu kemikaali kohta vt peatüki C.10-A 5. liide. Seda 
meetodit ei saa torureaktoreid muutmata (punkt 16) kasutada lenduva kemi ­
kaali puhul. Määrake põhilahuses lahustunud orgaaniline süsinik ja orgaa ­
nilise süsiniku kogusisaldus ning korrake mõõtmisi iga uue partii korral. Kui 
lahustunud orgaanilise süsiniku ja orgaanilise süsiniku kogusisalduse 
erinevus on suurem kui 20 %, siis kontrollige uuritava kemikaali lahustuvust  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
vees. Võrrelge lahustunud orgaanilist süsinikku või uuritava kemikaali kont ­
sentratsiooni, mis on mõõdetud põhilahuses spetsiifilise analüüsimeetodi 
abil, nimiväärtusega, et näha, kas määramise saagis on piisavalt hea (tava ­
liselt võib eeldada > 90 %). Veenduge (eelkõige dispersiooni korral), kas lahustunud orgaanilist süsinikku saab kasutada analüüsiparameetrina või 
tuleb kasutada ainult spetsiifilist analüüsimeetodit, millega saab määrata 
uuritavat kemikaali. Dispersiooni puhul tuleb proovid tsentrifuugida. Iga uue partii puhul määrake lahustunud orgaaniline süsinik, keemiline hapni ­
kutarve või uuritav kemikaal spetsiifilise analüüsimeetodi abil.
 
27. Määrake põhilahuse pH. Äärmuslikud väärtused osutavad, et kemikaali lisa ­
mine võib mõjutada aktiivmuda pH-d katsesüsteemis. Sel juhul neutralisee ­
rige põhilahust väikse koguse anorgaanilise happe või alusega, et pH oleks 7 
± 0,5, kuid vältige uuritava kemikaali sadestamist.  
KATSE KÄIK  
Orgaanilise kasvukeskkonna doseerimine  
28. Hoolitsege, et kõik sissevoolu- ja väljavoolunõud ning sissevoolunõust 
väljuv ja väljavoolunõusse sisenev toru on korralikult puhastatud, et seal katse alguses ja kogu katse vältel ei kasvaks mikroobe.
 
29. Valmistage värske sünteetiline reovesi (punkt 23) iga päev kas tahketest 
lähteainetest või kontsentreeritud põhilahusest, lahjendades seda vajaliku koguse kraaniveega. Mõõtke nõutav kogus silindriga välja ja viige see 
puhtasse sissevoolunõusse. Vajaduse korral lisage sünteetilisse reovette 
enne lahjendamist ka vajalik kogus uuritava kemikaali või võrdluskemikaali põhilahust. Kui nii on mugavam või saab sellega vältida uuritava kemikaali kadusid, siis valmistage eraldi mahutis uuritava kemikaali lahjendatud lahus 
ja sisestage see eraldi teise doseerimispumba abil kaldega torusse.
 
30. Teise võimalusena (ja eelistatavalt) kasutage settinud olmereovett (punkt 
24), mis kogutakse võimaluse korral iga päev uuesti.  
Pöörlevate torureaktorite käitamine  
31. Ühe uuritava kemikaali hindamiseks vajatakse kahte identset torureaktorit ja 
need seatakse üles püsiva temperatuuriga ruumis, tavaliselt 22 ± 2 °C.  
32. Reguleerige peristaltilisi pumpasid, et need pumpaksid orgaanilist kasvu ­
keskkonda (ilma uuritava kemikaalita; 250 ± 25 ml/h) kaldega torudesse, mida pööratakse kiirusel 18 ± 2 pööret minutis. Lisage pumba torudele katse 
alguses ja katse vältel regulaarselt määrdeainet (punkt 25), et tagada korralik 
toimimine ja pikendada torude kasutusiga.
 
33. Reguleerige torude kalle rõhtasendi suhtes nii, et sissevoolulahus viibiks 
puhtas torus 125 ± 12,5 s. Hinnake viibimisaeg sissevoolu mittebioloogilise markeri (näiteks NaCl, inertse värvaine) lisamise teel: keskmiseks viibimi ­
sajaks arvestatakse väljavoolus tippkontsentratsioonini jõudmiseks vajalikku 
aega (kui on tekkinud maksimaalne kile, võib viibeaeg suureneda kuni 
ligikaudu 30 minutini).
 
34. Selliste määrade, kiiruste ja aegade juures on täheldatud piisavat lahustunud 
orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kõrvaldamist (> 80 %) 
ning nitrifitseeritud väljavoolu tekkimist. Kui kõrvaldamine ei ole piisav või kui tuleb simuleerida konkreetse puhasti tulemusi, tuleks voolukiirust muuta. Viimati nimetatud juhul reguleerige orgaanilise kasvukeskkonna 
doseerimise kiirust, kuni reaktori töö tulemuslikkus vastab puhasti töö tule ­
muslikkusele.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inokulatsioon  
35. Kui kasutatakse sünteetilist reovett, võib mikroorganismide kasvu algatami ­
seks piisata õhukaudsest inokulatsioonist, vastasel juhul aga lisage sisestusse kolme päeva jooksul 1 ml/l settinud reovett.
 
Mõõtmised  
36. Kontrollige korrapäraste ajavahemike järel, et doosimäärad ja pöörlemiskii ­
rused oleksid vajalikes piirides. Samuti mõõtke väljavoolu pH-d, eelkõige 
siis, kui eeldatakse nitrifitseerimist.  
Proovide võtmine ja analüüsimine  
37. Proovide võtmise meetod, skeem ja sagedus valitakse katse eesmärgi järgi. 
Näiteks võib sissevoolust ja väljavoolust võtta hetkeproove ( snap/grab ) või 
koguda proov pikema aja, näiteks kolme kuni kuue tunni vältel. Esimesel 
ajavahemikul, mil uuritavat kemikaali veel sees ei ole, võtke proove kaks korda nädalas. Filtrige proovid läbi membraanide või tsentrifuugige neid kiirusel ligikaudu 40 000 m/s
 2 umbes 15 minutit (punkt 18). Enne läbi 
membraanide filtrimist võib olla vajalik lasta proovidel settida ja/või neid 
jämefiltriga filtrida. Määrake lahustunud orgaaniline süsinik (või keemiline hapnikutarve) vähemalt kaks korda ning vajaduse korral ka biokeemiline hapnikutarve, ammoonium ja nitrit/nitraat.
 
38. Kõik analüüsid tuleks teha pärast proovide kogumist ja ettevalmistamist 
võimalikult kiiresti. Kui analüüsid tuleb edasi lükata, säilitage proove tihe ­
dalt suletud pudelis pimedas ja temperatuuril ligikaudu 4 °C. Kui proove tuleb säilitada kauem kui 48 tundi, kasutage säilitamiseks sügavkülmutamist, hapestamist või sobiva mürgise kemikaali lisamist (näiteks 1 liitri kohta 20 
ml elavhõbe(II)kloriidi lahuse (10 g/l) lisamisega). Kontrollige, et säilitamis ­
meetod ei mõjutaks analüüsi tulemusi.
 
Sissetöötamisperiood  
39. Sellel ajavahemikul kasvab pinna biokile optimaalse paksuseni, milleks 
kulub tavaliselt ligikaudu kaks nädalat ja milleks ei tohiks kuluda üle 
kuue nädala. Lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamine (punkt 44) (või keemiline hapnikutarve) suureneb ja jõuab tasakaaluoleku väärtuseni. Kui torudes on jõutud sarnaste platooväärtusteni, valitakse üks toru 
ülejäänud katse vältel kontrollseadmena kasutamiseks ning sel ajal peaks 
torude tõhusus püsivaks jääma.
 
Uuritava kemikaali lisamine  
40. Sellel etapil lisage vajaliku kontsentratsiooniga (tavaliselt 10–20 mg C/l) 
uuritavat kemikaali teise reaktorisse. Kontrollseadmesse lisatakse jätkuvalt ainult orgaanilist kasvukeskkonda.
 
Aklimatiseerumise ajavahemik  
41. Jätkake lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) analüü ­
side tegemist kaks korda nädalas ja esmase biolagundatavuse hindamiseks mõõtke ka uuritava kemikaali kontsentratsiooni spetsiifilise analüüsimeetodi abil. Laske süsteemil pärast uuritava kemikaali esmakordset lisamist üks 
kuni kuus nädalat (või eritingimustes pikemalt) aklimatiseeruda. Kui kõrval ­
damise protsent (punktid 43–45) jõuab maksimumväärtuseni, mõõtke kesk ­
mise kõrvaldamisprotsendi hindamiseks platoofaasist ligikaudu kolme nädala vältel 12–15 kehtivat väärtust. Katse loetakse lõpetatuks, kui jõutakse piisa ­
valt suure kõrvaldamise määrani. Pärast uuritava kemikaali esmakordset 
lisamist ei peaks katse kestus tavaliselt ületama 12 nädalat.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Kile irdumine  
42. Torust liigse kile suures koguses äkiline irdumine ( sloughing ) toimub suhte ­
liselt korrapärase ajavahemiku järel. Selleks et kile irdumine ei mõjutaks tulemuste võrreldavust, peaks katse kestma vähemalt kaks täielikku kasva ­
mise ja irdumise tsüklit.
 
ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Tulemuste töötlemine  
43. Arvutage uuritava kemikaali lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise 
hapnikutarbe) kõrvaldamise protsent igal etteantud ajal järgmise võrrandi abil:
 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
kus 
D t = lahustunud orgaanilise süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kõrval ­
damise protsent ajal t;  
Cs = uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku (või 
keemilise hapnikutarbe) kontsentratsioon sissevoolus, mida hinna ­
takse eelistatavalt põhilahuse kontsentratsiooni ja selle lisatud koguse 
alusel (mg/l);  
E = katse väljavoolus ajal t mõõdetud lahustunud orgaanilise süsiniku 
(või keemilise hapnikutarbe) väärtus (mg/l);  
Eo = kontrollseadme väljavoolus ajal t mõõdetud lahustunud orgaanilise 
süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) väärtus (mg/l).  
Kui katsetatakse ka võrdluskemikaali, tehakse sama arvutus ka võrdluske ­
mikaaliga.  
Kontrollreaktori tõhusus  
44. Kontrollreaktori poolt orgaanilise kasvukeskkonna lahustunud orgaanilise 
süsiniku (või keemilise hapnikutarbe) kõrvaldamise määr (D  B ) on kasulik 
teave, mis aitab hinnata katse ajal biokile biolagundamise aktiivsust. Arvu ­
tage kõrvaldamise protsent järgmise võrrandi alusel:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
kus 
C m = lahustunud orgaaniline süsinik (või keemiline hapnikutarve) kont ­
rollseadme sissevoolu orgaanilises kasvukeskkonnas (mg/l).  
45. Arvutage spetsiifilise analüüsimeetodiga uuritava kemikaali kõrvaldamine 
(D ST ) (kui seda mõõdetakse) igal hindamisajal järgmise võrrandi abil:  
DST ¼ 100 ð1 Ä S e=S i Þ % 
kus 
S i = uuritava kemikaali mõõdetud või, eelistatavalt, hinnatud kontsentrat ­
sioon katse sissevoolus (mg/l);  
S e = uuritava kemikaali mõõdetud kontsentratsioon katse väljavoolus ajal t 
(mg/l).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Kui analüüsimeetod annab muutmata reovees positiivse näitaja (S  c , mg/l), 
siis arvutage kõrvaldamise protsent (D  SC ) järgmise võrrandi alusel:  
D SC ¼ 100ðS i Ä S e þ S c Þ=ðS i þ S c Þ % 
Katsetulemuste esitamine  
46. Koostage kõrvaldamise protsendi D  t ja D  ST (või D  SC ) (kui see on leitud) 
graafiline sõltuvus ajast (vt peatüki C.10-A 2. liide). Võtke platoofaasis 
määratud 12–15 D  T (ja D  ST , kui see on määratud) väärtustest uuritava 
kemikaali kõrvaldamise protsendi keskmine (väljendatud lähima täisarvuna) ja leidke standardhälve. Kõrvaldamise kõvera kujust saab teha järeldusi 
kõrvaldamises osalevate protsesside kohta.
 
Adsorptsioon  
47. Kui uuritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrval ­
damise määr on suur kohe katse alguses, kõrvaldatakse uuritavat kemikaali 
tõenäoliselt biokilele adsorbeerimise teel. Seda võib olla võimalik tõendada 
irdunud kilest tahketele osakestele adsorbeerunud uuritava kemikaali määra ­
misega. Tavaliselt ei jää adsorbeeritavast kemikaalist tingitud lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamine suuremahuliseks kogu katse vältel; üldi ­
selt toimub alguses suur kõrvaldamine, mis langeb järk-järgult tasakaalu ­
väärtusele. Kui adsorbeeritud uuritav kemikaal suudab aga põhjustada mikroobide populatsiooni aklimatiseerumise, siis suureneb seejärel uuritava kemikaali lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamine ja jõuab kõrge 
platooväärtuseni.
 
Ootefaas  
48. Nagu ka staatiliste sõelumiskatsete korral, nii vajavad mitmed uuritavad 
kemikaalid enne täieliku biolagunemise toimumist ootefaasi. Ootefaasis 
toimub kompetentsete bakterite aklimatiseerumine (või kohanemine) ja uuri ­
tavat kemikaali peaaegu ei kõrvaldata; seejärel toimub kõnealuste bakterite esialgne kasv. See faas lõpeb ja lagundamisfaasi alguseks loetakse hetke, kui 
ligikaudu 10 % uuritava kemikaali esialgsest kogusest on kõrvaldatud 
(võttes arvesse adsorptsiooni, kui see toimub). Ootefaasi pikkus võib olla väga erinev ja halvasti reprodutseeritav.
 
Platoofaas  
49. Pidevas katses kõrvaldamist näitava kõvera platoofaas on määratletud kui 
faas, milles lagundamine on maksimaalne. See faas peaks kestma vähemalt kolm nädalat ja selle käigus tuleks mõõta ligikaudu 12–15 kehtivat näitajat.
 
Uuritava kemikaali keskmine kõrvaldamise määr  
50. Arvutage uuritava kemikaali kõrvaldamise näitaja D  t (ja D  st , kui see on 
leitud) väärtuste alusel keskväärtus platoofaasis. See on uuritava kemikaali kõrvaldamise määr ümardatuna lähima täisarvuni (1 %). Samuti soovitatakse 
arvutada keskväärtuse 95 % usaldusvahemik. Arvutage samal viisil orgaani ­
lise kasvukeskkonna keskmine kõrvaldamise määr (D
 B ) kontrollnõus.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Biolagundamise tunnused  
51. Kui uuritav kemikaal biokile külge märkimisväärselt ei adsorbeeru ja kõrval ­
damise kõveral on ootefaasi, lagundamis- ja platoofaasiga biolagundamise kõvera tavapärane kuju (punktid 48, 49), võib olla kindel, et mõõdetud 
kõrvaldamine on põhjustatud biolagundamisest. Kui on toimunud suurema ­
huline esialgne kõrvaldamine, siis ei suuda simulatsioonikatse eristada bioloogilise ja abiootilise kõrvaldamise protsesse. Sellistel juhtudel ja muudel juhtudel, kui biolagundamise suhtes tekivad kahtlused (näiteks kui 
toimub väljapuhumine ( stripping )), tuleb analüüsida adsorbeerunud uuritavat 
kemikaali kile proovidel või teha täiendavad biolagundamise staatilised (sõelumis)katsed selgelt bioloogilisi protsesse näitavate parameetrite alusel. 
Kõnealused katsed on hapniku sidumise meetodid (käesoleva lisa peatüki 
C.4 meetodid C.4-D, C.4-E ja C.4-F) (9) või katse, millega mõõdetakse CO
 2 
tekkimist (käesoleva lisa peatüki C.4 meetod C.4-C või  Headspace -meetod) 
(10), kasutades inokulumina asjaomase reaktori eelnevalt kokkupuutunud 
biokilet.  
52. Kui mõõdetud on nii lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist kui ka 
konkreetse kemikaali kõrvaldamist, siis näitab kõrvaldamisprotsentide 
oluline erinevus (kui esimene nimetatutest on viimati nimetatust väiksem) 
orgaaniliste vahesaaduste olemasolu väljavoolus; selliseid vahesaadusi võib olla keerulisem lagundada ja neid tuleks uurida.
 
Katsetulemuste kehtivus  
53. Katset võib pidada kehtivaks, kui lahustunud orgaanilise süsiniku (või 
keemilise hapnikutarbe) kõrvaldamise määr (D  B ) kontrollseadmetes on 
kahe nädala möödumisel > 80 % ja ei ole täheldatud ebatavalisi asjaolusid.  
54. Kui on katsetatud kiirelt biolagundatavat (võrdlus)kemikaali, peaks biolagu ­
nemise määr olema > 90 % ja paralleelide erinevus ei tohiks olla suurem kui 5 %. Kui need kaks kriteeriumi ei ole täidetud, tuleb katse käik läbi vaadata 
ja/või hankida olmereovesi muust allikast.
 
55. Samuti ei tohiks uuritavat kemikaali töötlevate paralleelseadmete (kui neid 
kasutatakse) biolagundamise näitajate erinevus olla suurem kui 5 %. Kui see 
kriteerium ei ole täidetud, aga kõrvaldamise määr on suur, siis jätkake 
analüüsi veel kolme nädala vältel. Kui kõrvaldamise määr on väike, kont ­
rollige uuritava kemikaali inhibeerivat mõju, kui see ei ole teada, ja korrake 
katset uuritava kemikaali väiksemal kontsentratsioonil, kui see on teostatav.  
Katseprotokoll  
56. Katseprotokollis esitatakse alljärgnev teave.  
Uuritav kemikaal:  
— tunnusandmed;  
— füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused.  
Katsetingimused:  
— katsesüsteemi mis tahes muudatused, eelkõige lahustumatute või lendu ­
vate ainetega katsete tegemisel;  
— orgaanilise kasvukeskkonna tüüp;  
— tööstuslike jäätmete osakaal reovees ja nende laad, kui neid kasutatakse 
ja need on teada;  
— inokulatsioonimeetod;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— uuritava kemikaali põhilahus – lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus 
ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus; suspensiooni korral selle valmista ­
misviis; kasutatav(ad) katsekontsentratsioon(id), kui lahustunud orgaani ­
line süsinik jääb vahemikust 10–20 mg/l väljapoole, siis selle põhjendus; lisamise meetod; esmakordse lisamise kuupäev; mis tahes muutused 
kontsentratsioonis;
 
— keskmine hüdrauliline retentsiooniaeg (ilma kasvuta); toru pöörlemis ­
kiirus; ligikaudne kaldenurk, kui võimalik;  
— andmed kile irdumise kohta; aeg ja intensiivsus;  
— katsetemperatuur ja -vahemik;  
— kasutatud analüüsimeetodid.  
Katsetulemused:  
— kõik mõõdetud andmed (lahustunud orgaaniline süsinik, keemiline 
hapnikutarve, uuritava kemikaali määramine spetsiifilise analüüsimeeto ­
diga, pH, temperatuur, N-kemikaalid (kui see on asjakohane);  
— kõik arvutatud D  t (või D  tc ), D  B , D s näitajad tabelite kujul ja kõrvalda ­
mise kõverad;  
— teave ootefaasi ja platoofaasi, katse kestuse, uuritava kemikaali, võrdlus ­
kemikaali (kui seda katses kasutati) ja orgaanilise kasvukeskkonna (kont ­
rollseadmes) kõrvaldamise kohta koos statistilise teabe ja kinnitustega 
biolagundatavuse ja katse kehtivuse kohta;  
— tulemuste arutelu.  
KIRJANDUS  
1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753–758.  
2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444.
 
3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
 
4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling 
filter. JAOCS 43: 92–94.  
6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881.  
7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London.  
8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, London.
 
9) Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine”, meetodid 
C.4-A kuni C.4-F.  
10) ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
8. liide  
Joonis 1  
Pöörlevad torud
  
Sõnastik  
Pealtvaade  
Vaade A/B  
Veorattad  
Tühikäigurattad  
Ajami mootor  
Aeglustusülekanne (reduktor)  
Sisemine äärik  
Kallutusmehhanism  
Keskreduktor  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Joonis 2  
Vooskeem
  
A. Söötenõu  
B. Peristaltiline pump  
C. Pöörlev toru  
D. Väljavoolu kogumise nõu  
MÕISTED  
Uuritav kemikaal: iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. 
Kemikaalid: „tuleb silmas pidada, et mõistet „kemikaal” kasutatakse ÜRO 
keskkonna- ja arengukonverentsi lepingutes ja edasistes dokumentides laia mõis ­
tena, mis hõlmab aineid, tooteid, segusid, valmistisi või mis tahes muid mõisteid, mida võib olemasolevates süsteemides hõlmatuse märkimiseks kasutada”.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIODEGRADATSIOON  
AKTIIVMUDA RESPIRATSIOONI PÄRSSIMISE KATSE  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kirjeldatud meetodiga määratakse uuritava aine mõju mikroorganis ­
midele, mõõtes respiratsiooni intensiivsust uuritava aine erinevate kontsentratsioonide juures.
 
Selle meetodi eesmärk on saada kiire skriiningumeetod, millega 
kindlaks teha aineid, mis võivad kahjustavalt mõjuda aeroobsetele 
reoveepuhastitele, ja määrata sobivaid mitte-inhibeeriva toimega 
uuritava aine kontsentratsioone, mida saaks biodegradatsiooni testides kasutada.
 
Lõplikule testile eelneb sobiva vahemiku leidmise test. Selle tulemu ­
sena saab teavet kontsentratsioonivahemike kohta, mida põhikatses kasutada.
 
Uuringusse kaasatakse kaks kontrolli ilma uuritava aine sisalduseta, 
üks lisatakse katseseeria alguses ja teine lõpus. Samuti tuleb võrdlu ­
sainega kontrollida kõiki aktiivmuda partiisid.  
See meetod on sobivaim ainete puhul, mis seoses oma veeslahustu ­
vuse ja väikese lenduvusega jäävad tõenäoliselt vette.  
Uuritavas keskkonnas vähese lahustuvusega ainete puhul ei ole 
võimalik EC  50 määrata.  
Hapniku omastamisel põhinevad tulemused võivad anda ekslikke 
tulemusi, kui uuritava aine puhul esineb kalduvus vabastavale oksü ­
datiivsele fosforülatsioonile.  
Enne uuringu tegemist on kasulik teada järgmisi andmeid:  
— vees lahustuvus;  
— küllastunud aururõhk;  
— struktuurvalem;  
— uuritava aine puhtusaste.  
Soovitused  
Aktiivmuda võib sisaldada potentsiaalselt patogeenseid organisme, 
mistõttu tuleb seda käsitseda ettevaatlikult.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Respiratsiooni intensiivsus on hapniku tarbimine aeroobses mudas 
olevate reovee mikroorganismide poolt, mida väljendatakse tavaliselt 
O 2 /mg muda kohta ühes tunnis.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Uuritava aine kindla kontsentratsiooni inhibeeriva toime arvutami ­
seks väljendatakse respiratsiooni intensiivsust kahe respiratsiooni 
intensiivsuse keskmise kontrollnäitaja protsendina:  
Í 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Î 
Ü 100 ¼ inhibitsiooni protsent  
kus: 
R S = hapniku tarbimine katseaine uuritava kontsentratsiooni 
juures,  
R c1 = hapniku tarbimine, kontroll 1,  
R c2 = hapniku tarbimine, kontroll 2.  
EC 50 on käesoleva meetodi puhul uuritava aine kontsentratsioon, 
mille juures on respiratsiooni intensiivsus 50 % kontrolli puhul saavutatust kirjeldatud tingimuste juures.
 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Võrdlusainena soovitatakse kasutada tuntud respiratsiooni inhibee ­
rivat ainet 3,5-dikloorfenooli ja seda määrata EC  50 iga aktiivmuda 
partii puhul, et kontrollida, kas muda tundlikkus on normaalne.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Kunstliku muda standardsisaldusega aktiivmudas mõõdetakse respi ­
ratsiooni intensiivsust 30minutilise või kolmetunnise kokkupuuteaja 
järel (või mõlema järel). Samuti mõõdetakse sama aktiivmuda respi ­
ratsiooni intensiivsus erinevas kontsentratsioonis uuritava aine juure ­
solekul muidu samasuguste tingimuste juures. Uuritava aine pärssivat toimet kindla kontsentratsiooni juures väljendatakse protsendina kahe 
kontrolli keskmisest respiratsiooni intensiivsuse näitajast. EC
 50 
näitaja arvutatakse erinevate kontsentratsioonide juures saadud näita ­
jate põhjal.  
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Uuringu tulemused kehtivad, kui  
— erinevus kahe hingamise intensiivsuse kontrollnäitaja vahel on 
kuni 15 %;  
— 3,5-dikloorfenooli EC  50 (30 minutit ja/või kolm tundi) on ette ­
nähtud vahemikus 5–30 mg/l.  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Reagendid  
1.6.1.1. U u r i t a v a a i n e g a l a h u s e d  
Uuritavat ainet sisaldavad lahused valmistatakse vahetult uuringu 
alguses põhilahusega. Kui järgitakse allpool kirjeldatud protseduuri, 
on põhilahuse sobivaks kontsentratsiooniks 0,5 g/l.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. K o n t r o l l a i n e l a h u s  
5,5-dikloorfenooli lahuse saab näiteks valmistada 0,5 g 3,5-dikloor ­
fenool lahustamisel 10 ml 1 M NaOH lahuses, saadud lahus lahjen ­
datakse ligikaudu 30 ml destilleeritud veega, lisades samaaegsel 
segamisel 0,5 M H  2 SO 4 kuni sademe tekke alguseni – vajalik võib 
olla ligikaudu 8 ml 0,5 M H  2 SO 4 lahuse lisamine – ja lõpuks lahjen ­
datakse segu destilleeritud veega kuni ühe liitrini. Saadud lahuse pH peaks olema vahemikus 7 kuni 8.
 
1.6.1.3. K u n s t l i k r e o v e s i  
Kunstlikul reoveel põhinev sööde valmistatakse järgnevas koguses 
ainete lahustamisel ühes liitris vees:  
— 16 g peptooni;  
— 11 g lihaekstrakti;  
— 3 g uureat;  
— 0,7 g NaCl;  
— 0,4 g CaCl  2 .2H  2 O; 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O; 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Märkus 1.  Ära toodud kunstlik reovesi on 100 korda kontsentree ­
ritum, kui kirjeldatud OECD tehnilise raporti peatükis „Soovitatud 
meetodid sünteetilistes detergentides kasutatavate surfaktantide biodegradeeruvuse kindlaks tegemiseks” (11. juuni 1976), lisatud on kaaliumdivesinikfosfaati.
 
Märkus 2.  Kui valmistatud lahust ei kasutata kohe, tuleb seda säili ­
tada pimedas ruumis temperatuuril 0–4  o C mitte kauem kui üks 
nädal tingimustes, mis ei põhjusta muutusi aine koostises. Samuti 
võib lahust enne säilitamist steriliseerida või lisada peptoon ja lihaekstrakt vahetult enne katse tegemist. Enne kasutamist tuleks lahust põhjalikult segada ja selle pH kohandada vastavalt nõuetele.
 
1.6.2.  Aparatuur  
Mõõteaparatuur: täpselt samasugune ülesehitus ei ole vajalik. Siiski 
peaks aparaadil olema pealispind ja sond peaks tihedalt sobituma mõõtekolbi kaelaossa.
 
Vajalik on tavaline laborivarustus ja eelkõige järgmised seadmed:  
— mõõteaparatuur;  
— aeratsiooniseade;  
— pH-elektrood ja mõõtmisvarustus;  
— O  2 -elektrood.  
1.6.3.  Inokulaadi valmistamine  
Testi bakteriaalse inokulaadina kasutatakse aktiveeritud reovett, mis 
on pärit peamiselt olmereovett töötlevatest puhastussüsteemidest.  
Vajaduse korral võib suuri osakesi eemaldada sadestamise teel, kui 
jätta lahus lühiajaliselt (näiteks 15 minutiks) seisma ja dekanteerida 
ülemine väiksemate osakestega kiht kasutamiseks. Teise võimalusena 
võib reovett segada blenderiga mõne sekundi jooksul.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Kui kahtlustatakse inhibeeriva toimega lisandite juuresolekut, tuleks 
muda loputada kraanivee või isotoonilise lahusega. Pärast tsentrifuu ­
gimist supernatant eemaldatakse (seda protseduuri korratakse kolm korda).
 
Väike kogus muda kaalutakse välja ja kuivatatakse. Saadud tulemu ­
sest võib arvutada märja muda koguse, mida tuleb segada veega, et 
vedelikusegus suspendeeritud tahke aine kontsentratsioon oleks vahe ­
mikus 2–4 g/l. Sellisel juhul saavutatakse eksperimentaaltingimustes kontsentratsioonivahemik 0,8–1,6 g/l, tingimusel et järgitakse allpool 
soovitatud protseduuri.
 
Kui muda ei saa kasutada selle kogumise päeval, lisatakse 50 ml 
sünteetilist muda igale aktiivmuda kogusele, mis on valmistatud nagu eespool kirjeldatud; seda aereeritakse seejärel öö läbi 20 ± 2
 o C ning 
aereerimist jätkatakse kogu päeva. Enne kasutamist tuleb kontrollida 
pH-d ja vajaduse korral kohandada väärtuseni 6 kuni 8. Aktiivmuda kuivaine sisaldus tuleks kindlaks määrata, nagu eelmises lõigus kirjeldatud.
 
Kui järjestikustel päevadel (maksimaalselt neli päeva) on vaja kasu ­
tada sama muda partiid, lisatakse iga tööpäeva lõpus veel 50 ml kunstlikku reovett ühe liitri muda kohta.
 
1.6.4.  Katse käik  
Kestus/kokkupuuteaeg: 30 minutit ja/või kolm tundi, kogu aja 
vältel rakendatakse aereerimist 
Vesi: joogivesi (vajaduse korral deklooritud) Õhu lisamine: puhas, õlivaba õhk. Õhuvool 0,5–1 
l/minutis 
Mõõteaparatuur: lamedapõhjaline konteiner, näiteks 
BOD-konteiner 
Hapnikumõõtur: sobiv hapnikuelektrood koos registreeri ­
jaga 
Toitelahus: sünteetiline reovesi (vt eestpoolt) Uuritav aine: uuritav lahus valmistatakse värskena, 
vahetult enne testi alustamist 
Võrdlusaine: näiteks 3,5-dikloorfenool (vähemalt 
kolme erinevat kontsentratsiooni) 
Kontrollid: inokuleeritud proov, mis ei sisalda uuri ­
tavat ainet 
Temperatuur: 20 ± 2
 o C. 
Järgnevalt on kirjeldatud soovitatavaid katseprotseduure, mida võib 
järgida nii uuritava kui ka võrdlusaine puhul kolmetunnise kokku ­
puuteperioodi vältel.  
Kasutatakse mitmeid anumaid (näiteks üheliitriseid mõõteanumaid).  
Kasutada tuleks vähemalt viit kontsentratsiooni, mis erineksid mitte 
rohkem kui 3,2 korda.  
Ajahetkel 0 lahustatakse 16 ml kunstliku reovee toitelahust veega 
kuni 300 ml-ni. Lisatakse 200 ml mikrobiaalset inokulaati ja saadud 
segu (500 ml) valatakse esimesse anumasse (esimene kontroll C  1 ). ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Katsenõusid tuleb pidevalt aereerida, et lahustunud O  2 väärtus ei 
langeks alla 2,5 mg/l ja et vahetult enne hingamissageduse mõõtmist 
oleks O  2 kontsentratsioon ligikaudu 6,5 mg/l.  
Ajahetkel „15 minutit” (15 minutit on suvaline, kuid usaldusväärne 
ajavahemik) korratakse eespool kirjeldatut. Erinevuseks on 100 ml 
uuritavat ainet sisaldava põhilahuse lisamine 16 ml kunstlikku reovette enne vee lisamist (lahjendamiseks 300 ml-ni) ja mikro ­
biaalsesse inokulaati, et saada lõppkoguseks 500 ml. Saadud segu 
valatakse teise anumasse ja aereeritakse, nagu eespool kirjeldatud. 
Seda protsessi korratakse 15minutiliste intervallide järel erinevate uuritavat ainet sisaldava põhilahuse kogustega, et saada anumad uuritava aine erinevate kontsentratsioonidega. Lõpuks valmistatakse 
teine kontroll (C
 2 ). 
Kolme tunni pärast registreeritakse pH, esimese anuma sisust võetud 
korralikult segatud proov valatakse mõõteaparaati ja respiratsiooni 
intensiivsust mõõdetakse kuni 10 minuti vältel.  
Sama mõõtmist korratakse iga nõu sisuga 15minutiliste intervallide 
järel, sellisel juhul on iga anuma puhul kokkupuuteaeg kolm tundi.  
Võrdlusainet analüüsitakse iga partii bakteriaalse inokulaadiga 
samal viisil.  
Kui mõõtmisi tuleb teha 30 minutit pärast kokkupuudet, vajalik võib 
olla teistsugune režiim.  
Kui on vaja mõõta hapnikutarvet, valmistatakse ette uued anumad, 
mis sisaldavad uuritavat ainet, kunstlikku reovett ja vett, kuid mitte aktiivmuda. Hapniku tarbimist mõõdetakse ja registreeritakse pärast 30minutilist ja/või kolmetunnilist aereerimist (kokkupuuteaeg).
 
2. ANDMED JA HINDAMINE  
Respiratsiooni intensiivsust arvutatakse registreerija näidu vahemikus 
ligikaudu 6,5 mg O  2 /l kuni 2,5 mg O  2 /l või 10minutilises perioodis, 
kui respiratsiooni intensiivsus on väike. Respiratsiooni kõvera osa, 
mille ajal respiratsiooni intensiivsust mõõdetakse, peab olema 
lineaarne.  
Kui kahe kontrolli respiratsiooni intensiivsuse näitajate omavahelised 
erinevused ei ole 15 % sees või ei ole võrdlusaine EC  50 (30 minutit 
ja/või kolm tundi) aktsepteeritud vahemikus (5–30 mg/l 3,5-dikloor ­
fenooli), on katse kehtetu ja seda tuleb korrata.  
Iga uuringulahuse kontsentratsiooni kohta arvutatakse protsentuaalne 
inhibeerumine (vt 1.2). Graafiku teljestikule kantakse protsentuaalne inhibeerumine suhtes kontsentratsiooniga ning saadud EC
 50 väärtus.  
Standardprotseduuride kasutamisel saab EC  50 väärtuste kohta 
määrata 95 % usalduspiirid.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgnevat teavet:  
— uuritav aine: keemilised omadused;  
— uuringu süsteem: päritolu, kontsentratsioon ja võimalikud aktiiv ­
muda eeltöötlused;  
— katsetingimused:  
— reaktsioonisegu pH enne hingamise mõõtmist;  
— katsetemperatuur;  
— katse kestus;  
— võrdlusaine ja selle mõõdetud EC  50 ; 
— abiootiline hapniku omastamine (kui esineb);  
— tulemused:  
— kõik mõõdetud andmed;  
— inhibeerumise kõver ja EC  50 arvutusmeetod;  
— EC  50 ja võimaluse korral 95 % usalduspiirid, EC  20 ja EC  80 ; 
— kõik jälgimised ja võimalikud hälbed, mis võiksid tulemusi 
mõjutada.  
3.2. ANDMETE TÕLGENDAMINE  
EC 50 väärtust tuleks pidada vaid viiteks võimalikule uuritava aine 
toksilisusele kas reoveepuhastist saadud aktiivmudas või reovees sisalduvatesse mikroorganismidesse, kuna keskkonnas asetleidvaid 
keerukaid koosmõjusid ei saa laboritingimustes täpselt jäljendada. 
Lisaks võivad ka uuritavad ained põhjustada ebatüüpilisi inhibeeru ­
mise kõveraid, kuna võivad pärssivalt mõjuda ammoniaagi oksüdat ­
sioonile. Eeltoodust lähtuvalt tuleks selliseid kõveraid tõlgendada 
ettevaatusega.
 
4. VIITED  
1) International Standard ISO 8192-1986.  
2) Broecker, B., Zahn, R.,  Water Research  11, 1977, p. 165.  
3) Brown, D., Hitz, H. R, Schaefer, L.,  Chemosphere  10, 1981, p. 
245. 
4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries),  Recommendec Method No 103,  also 
described by:  
5) Robra, B.,  Wasser/Abwasser  117, 1976, p. 80.  
6) Schefer, W.,  Textilveredlung  6, 1977, p. 247.  
7) OECD, Paris, 1981, Test  Guideline 209,  Decision of the Council 
C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIODEGRADATSIOON  
MODIFITSEERITUD SCAS TEST  
1. MEETOD  
1.1. SISSEJUHATUS  
Meetodi eesmärk on hinnata veeslahustuvate, mittelenduvate orgaa ­
niliste ainete võimalikku lõpp-biodegra-deerumist kokkupuutel suhte ­
liselt suurte mikroorganismide kontsentratsioonidega pika aja jooksul. Mikroorganismide elusolek säilitatakse selles perioodis, 
toites aktiivmuda iga päev setitatud reovee lisamisega. (Nädalavahe ­
tuse vajaduste katmiseks võib reovett säilitada temperatuuril 4
 o C. 
Teise võimalusena võib kasutada OECD kunstlikku reovett.)  
Võimalik on füüsikalis-keemiline adsorptsioon suspendeeritud 
kuivainele, mida tuleks tulemuste interpreteerimisel arvestada (vt 3.2).
 
Seoses vedela faasi pika viibeaja perioodiga (36 tundi) ja vahepealse 
toitainete lisamisega ei jäljenda test neid tingimusi, mis tekivad 
reoveepuhastis. Erinevate uuritavate ainetega saadud tulemused 
viitavad sellele, et testi biodegradatsioonivõime on suur.  
Testis tekitatud tingimused on äärmiselt soodsad uuritavat 
ühendit degradeerivate mikroorganismide valikuks ja/või adaptatsioo ­
niks. (Protseduuri võib samuti kasutada aklimatiseeritud inokulaadi tekitamiseks, mida kasutada teistes testides.)
 
Selle meetodi puhul kasutatakse uuritava aine lõpliku biodegradat ­
siooni hindamiseks lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsiooni määramist. LOS-määramine pärast hapestamist ja puhastamist on 
eelistatum meetod kui lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentrat ­
sioonide erinevuse (C
 üld – C  anorgaaniline  ) arvutamine.  
Samaaegne spetsiifilise analüüsimeetodi kasutamine võib anda 
võimaluse aine esmase degradatsiooni hindamiseks (lähteühendi 
keemilise struktuuri kadumine).  
Meetod on kasutatav ainult nende uuritavate orgaaniliste ainete 
puhul, mis testis kasutatud kontsentratsiooni juures  
— on veeslahustuvad (vähemalt 20 mg lahustunud orgaanilist 
süsinikku/l);  
— omavad tühist küllastatud aururõhu väärtust;  
— ei ole bakterite suhtes pärssiva toimega;  
— ei adsorbeeru oluliselt testisüsteemi;  
— ei kao katselahusest vahu tekke tulemusena.  
Määrata tuleb orgaanilise süsiniku sisaldus uuritavas materjalis.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Uuringutulemuste tõlgendamisel on kasulik teada uuritava materjali 
põhikomponentide kohta käivat teavet. Seda eelkõige juhtudel, kui 
tulemused on väga väikesed või alammääralised.  
Informatsioon aine toksilisuse kohta mikroorganismidesse võib olla 
kasulik väikeste tulemuste interpreteerimisel ja katseks sobiva kont ­
sentratsiooni valimisel.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
C T = uuritava ühendi kontsentratsioon orgaanilise süsiniku juureso ­
lekul või setitatud reoveele lisamisel aeratsiooniperioodi alguses (mg/l),
 
C t = lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon, mis on 
sedastatud uuringu supernatantvedelikus aeratsiooniperioodi 
lõpus (mg/l),  
C c = lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon, mis on 
sedastatud kontrolli supernatantvedelikus aeratsiooniperioodi lõpus (mg/l).
 
Selle meetodi puhul defineeritakse biodegradatsiooni orgaanilise 
süsiniku kadumisena. Biodegradatsiooni saab väljendada järgmiselt.  
1. Iga päev lisatud ainekogusest eemaldatud D  da protsent:  
D da ¼ C t Ä ðC t Ä C c Þ 
C t Ü 100  [1] 
kus 
D da = degradatsioon/päevas lisamine.  
2. Tiga päeva alguses olemasolevast ainekogusest eemaldatud D  ssd 
protsent:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2 (a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2 (b)]  
kus 
D ssd = degradatsioon/aine päeva alguses;  
indeksid i ja (i+1) viitavad mõõtmispäevale.  
Valem 2a on soovitatav, kui väljavoolu LOS erineb päevast 
päeva, mille juures aga valemit 2b võib kasutada, kui väljavoolu 
LOS püsib päevast päeva suhteliselt konstantsena.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Osadel juhtudel võib uue aine uurimisel olla kasu võrdlusainete 
kasutamisest. Siinjuures ei tooda aga ära spetsiifilisi võrdlusaineid.  
Andmed ringtestides hinnatud ühendite kohta on äratoodud (vt liide 
1) peamiselt nii, et meetodi kalibreerimist võib teha pidevalt ja teist ­
suguse meetodi kasutamisel on võimalik tulemusi omavahel võrrelda.  
1.4. UURINGUMEETODI PÕHIMÕTE  
Reoveepuhastist pärit aktiivmuda asetatakse (SCAS) seadmeosasse. 
Lisatakse uuritav ühend ja setitatud olmereovesi ning segu aereeri ­
takse 23 tundi. Seejärel aereerimine peatatakse, lastakse mudal settida ja vedelik valatakse ära.
 
Aeratsioonikambrisse jäänud muda segatakse järgmise uuritava 
ühendi alikvoodi ja reoveega ning tsüklit korratakse.  
Biodegradatsioon tehakse kindlaks lahustunud orgaanilise süsiniku 
sisalduse põhjal supernatantvedelikus. Saadud tulemust võrreldakse näitajaga, mis on saadud ainult setitatud reoveest võetud kontrollist.
 
Kui kasutatakse spetsiifilist analüüsimeetodit, saab mõõta biodegra ­
datsioonist tingitud eellasmolekuli kontsentratsiooni muutusi (primaarne biodegradatsioon).
 
1.5. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
Selle lahustunud orgaanilise süsiniku eemaldamisel põhineva 
meetodi korduvteostatavust ei ole veel kinnitatud. (Kui kaalutakse primaarset biodegradatsiooni, saadakse väga täpsed andmed materja ­
lide kohta, mida ulatuslikult degradeeritakse.)
 
Käesoleva meetodi tundlikkuse määrab suures osas põhilahuse 
varieeruvus ning vähesemal määral lahustunud orgaanilise süsiniku määramise täpsus ja uuritava ühendi sisaldus vedelikus iga tsükli 
alguses.
 
1.6. KATSEPROTSEDUURI KIRJELDUS  
1.6.1.  Ettevalmistused  
Iga uuritava aine ja kontrolli jaoks ühendatakse piisav arv puhtaid 
aeratsiooniseadmeid (alternatiivina võib kasutada originaalset 1,5 l 
SCAS testi seadmeosa) ja õhu sisselaske torusid (joonis 1). Katse ­
seadmetesse suunatud suruõhk (puhastatud läbi puuvillase filtri) ei tohiks sisaldada orgaanilist süsinikku ja peaks olema eelnevalt 
küllastatud veega, et vähendada kadusid auramise tõttu.
 
Vedelikusegu proov, mis sisaldab 1–4 g suspendeeritud tahkeid 
osakesi/l saadakse peamiselt olmereovee puhastist pärit aktiivmu ­
dast. Iga aeratsiooniseadme kohta vajatakse ligikaudu 150 ml vede ­
likusegu.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Uuritava aine põhilahused valmistatakse destilleeritud vees; tavalisel 
juhul vajalik kontsentratsioon on 400 mg/l, kuna iga aeratsioonitsükli 
alguses annab orgaaniline süsinik uuritava ühendi kontsentratsiooniks 20 mg/l süsinikku, kui biodegradatsiooni ei teki.
 
Suuremad kontsentratsioonid on lubatud, kui toksilisus mikroorga ­
nismidele seda võimaldab.  
Määratakse põhilahuste orgaanilise süsiniku sisaldus.  
1.6.2.  Katsetingimused  
Katse tuleks teha temperatuuril 20–25  o C. 
Kasutatakse suuri aeroobsete mikroorganismide kontsentratsioone 
(1–4 g/l suspendeeritud kuivainet) ja efektiivne viibeaja periood on 36 tundi. Süsinikku sisaldavat materjali reovee söötmes oksüdeeri ­
takse ulatuslikult, tavaliselt kaheksa tundi alates iga aeratsioonitsükli 
algusest. Seejärel muda respireerib endogeenselt ülejäänud aeratsioo ­
niperioodi, mille käigus ainuke olemasolev substraat on uuritav ühend, kui see ei ole juba täielikult metaboliseeritud. Need omadused kombineerituna igapäevase testi reinokuleerimisega (kui keskkon ­
nana kasutatakse olmereovett), tagavad äärmiselt soodsad tingimused 
nii aklimatsiooniks kui ka ulatuslikuks biodegradatsiooniks.
 
1.6.3.  Katse käik  
Peamiselt olmereoveest pärit aktiivmudaga puhastist või laborisead ­
mest võetakse vedelikusegu proov ja seda hoitakse aeroobsetes tingi ­
mustes kuni laboris kasutamiseni. Iga aeratsiooniseade ja samuti kontrollseade täidetakse 150 ml vedelikuseguga (kui kasutatakse 
SCAS originaaltesti ühikut, tuleb kogus kümnekordistada) ja alusta ­
takse aereerimist. 23 tunni pärast aeratsioon peatatakse ja mudal lastakse settida 45 minutit. Järjekorras avatakse kõik torude kraanid ja 100 ml supernatantvedeliku osad eemaldatakse. Setitatud olme ­
reovee proov võetakse vahetult enne kasutamist ja 100 ml lisatakse 
igasse aeratsiooniühikusse jäänud muda kogusele. Alustatakse uuesti aereerimist. Selles staadiumis enam uuritavat materjali juurde ei lisata ja seadmeosadesse lisatakse toitelahusena üks kord päevas 
olemreovett kuni saadakse seismisel läbipaistev supernatandi vedelik. 
Tavaliselt läheb kuni kaks nädalat, et lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus supernatantvedelikus läheneks iga aeratsioonitsükli lõpus püsiväärtusele.
 
Selle perioodi lõpuks üksikud setitatud mudakogused segatakse 
kokku ja igasse seadmeossa lisatakse 50 ml saadud mudasegu.  
Kontrollanumatesse lisatakse 95 ml setitatud reovett ja 5 ml vett ning 
katseanumatesse lisatakse 95 ml setitatud reovett koos 5 ml sobivat uuritavat ühendit sisaldava põhilahusega (400 mg/l). Aeratsiooni 
alustatakse uuesti ja jätkatakse 23 tundi. Mudal lastakse seejärel 
settida 45 minutit, vedelik valatakse pealt ära ja analüüsitakse sellest lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldust.
 
Eespool kirjeldatud „täida-eemalda” -protseduuri korratakse iga päev 
kogu katse vältel.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Enne sadestamist võib olla vajalik anumate seinte puhastamine, et 
hoida ära tahkete osakeste kuhjumist üle vedelikunivoo. Ristkonta ­
minatsiooni vältimiseks kasutatakse iga seadme jaoks eraldi kaabitsat või harja.
 
Ideaaljuhul tuleks lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldust superna ­
tantvedelikus määrata iga päev, kuigi lubatud on ka harvemad analüüsid. Enne analüüsimist filtreeritakse vedelikud läbi pestud 0,45 μn membraanfiltrite või tsentrifuugitakse. Membraanifiltrid on 
sobivad, kui on tagatud, et nad ei lase läbi süsinikku ega absorbeeri 
ainet filtratsiooni etapis. Tsentrifuugis asuva proovi temperatuur ei tohi ületada 40
 o C. 
Vähese või mittemääratava biodegradatsiooniga ühenditega tehtava 
katse pikkus on kindlaks määramata, kuid kogemuse põhjal peaks see üldiselt olema vähemalt 12 nädalat, kuid mitte kauem kui 26 
nädalat.
 
2. ANDMED JA HINDAMINE  
Lahustunud orgaanilise süsiniku väärtused katse- ja kontrollanumate 
supernatantvedelikus kujutatakse graafikul võrdluses ajaga.  
Biodegradatsiooni saavutamisel läheneb uuritava aine osas sedastatud 
tase kontrolli puhul kindlaks tehtud näitajale. Kui kahe taseme vahel 
leitud erinevus püsib kolme järjestikuse mõõtmise puhul, tehakse 
veel selline arv edasisi mõõtmisi, et võimaldada andmete statistilist töötlust, ja arvutatakse uuritava ühendi protsentuaalne biodegradat ­
sioon (D
 da või D  ssd , vt 1.2).  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peaks võimaluse korral sisaldama järgmist teavet:  
— kogu teave, mis puudutab kasutatud reovett, seadmetüüpi, uuri ­
tava ainega seotud katsetulemusi, võrdlusainet, kui kasutati, ja põhilahust;
 
— temperatuur;  
— eemaldamiskõver koos kirjeldusega, arvutamisviis (vt 1.2);  
— kuupäev ja koht, kust võeti aktiivmuda ja reovee proovid, adap ­
tatsiooni seisund, kontsentratsioon jne;  
— kõikide uuringuprotseduuride muutuste teaduslik põhjendus;  
— allkiri ja kuupäev.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Kuna sellisel meetodil uuritud aine ei ole täielikult biolagundatav, 
eemaldub LOS ainult biodegradatsiooni tõttu normaalsel juhul järk- järgult päevi ja nädalaid, v.a juhtudel, kui aklimatsioon on toimunud 
äkki (näidatud äkki kadumisena mõne nädala möödumisel).
 
Mõnikord võib olulist rolli mängida füüsikalis-keemiline adsorpt ­
sioon. See on näidatud juhul, kui esineb täielik või osaline lisatud LOS-eemaldamine alguses. Edasine käik sõltub sellistest faktoritest 
nagu adsorptsiooni ulatus ja suspendeeritud kuivaine sisaldus välja ­
voolu vees. Tavaliselt suureneb erinevus LOS-kontsentratsioonide vahel kontrollis ja proovi supernatantvedelikus järk-järgult algselt madalalt tasemelt ja see erinevus jääb seejärel uuele tasemele 
ülejäänud eksperimendiks, v.a aklimatisatsiooni korral.
 
Kui biodegradatsiooni (või osalise biodegradatsiooni) ja adsorpt ­
siooni tuleb eristada, on vajalikud täiendavad katsed. Seda saab teha mitmel erineval viisil, kuid kõige usaldusväärsem on superna ­
tantvedeliku või muda kasutamine inokulaadina baasuuringu raames 
(eelistatult respiromeetriline uuring).
 
Selles uuringus tuleks kõrgeid, adsorptsiooni teel mitteeemaldatavaid 
LOS-tulemusi pidada potentsiaalselt biolagundatavateks. Osaline adsorptsiooni teel mitteeemaldamine viitab sellele, et kemikaal 
allub vähemalt osalisele biodegradatsioonile.
 
LOS-eemaldamise madalate või null-näitajate põhjuseks võib olla 
mikroorganismide pärssimine uuritava aine poolt ja selle võib vallan ­
dada ka muda lõhustamine või kadu, mis tekitab häguse superna ­
tandi. Testi tuleks korrata, kasutades uuritava aine madalamaid kont ­
sentratsioone.  
Spetsiifilise analüütilise meetodi või  14 C-märgistatud uuritava aine 
kasutamine võib anda suurema tundlikkuse.  14 C testi ühendi kasuta ­
misel  14 CO 2 sedastamine kinnitab biodegradatsiooni teket.  
Kui tulemusi antakse ka primaarse biodegradatsiooni kohta, tuleks 
võimaluse korral anda selgitus keemilise struktuuri muutustele, mis 
viib uuritava eellasühendi vastusreaktsiooni kadumisele.  
Analüütilise meetodi kinnitus tuleb edastada koos vastusega, mis 
saadi puhta katsekeskkonna kohta.  
4. VIITED  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
1. liide  
SCAS test: tulemuste näidised  
Aine C T 
(mg/l)) C t –C c 
(mg/l) Protsentuaalne 
biodegradatsioon 
D da Katse kestus 
(päevades)  
4-atsetüülaminobenseensulfonaat 17,2 2,0 85 40 
Tetrapropüleenbenseensulfonaat 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenool 16,9 0,8 95,3 40 
Dietüleenglükool 16,5 0,2 98,8 40 
Aniliin 16,9 1,7 95,9 40 Tsüklopentaantetrakarboksülaat 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
2. liide  
Uuringuseadme näidis
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOKONTSENTRATSIOON: KALADEGA LÄBIVOOLUKATSE  
1. MEETOD  
Käesolev biokontsentratsiooni meetod on OECD katsejuhendi nr 305 
(1996) koopia.  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev meetod kirjeldab ainete biokontsentratsiooni potentsiaali 
hindamist kalades läbivoolava vee tingimustes. Kuigi kindlalt tuleb 
eelistada läbivoolutingimustega katseid, on katsetes lubatav kasutada ka poolseisva vee tingimusi eeldusel, et valideerimisnõuded on 
täidetud.
 
Meetodi kirjeldus on piisavalt üksikasjalik katse tegemiseks, võimal ­
dades samas küllaldast vabadust katse kohandamiseks vastavalt konkreetsetele laboritingimustele ja uuritavate ainete omadustele. Meetod sobib kõige paremini stabiilsete orgaaniliste ainete hindami ­
seks, mille log P
 ow väärtus on 1,5 kuni 6,0 (1), kuid seda saab 
kasutada ka superlipofiilsete ainete jaoks, mille log P  ow > 6,0. 
Biokontsentratsiooni teguri (BCF) eelhinnang, mida tähistatakse ka kui K
 B , on selliste superlipofiilsete ainete jaoks eeldatavasti kõrgem 
kui laborikatsetest saadud püsioleku biokontsentratsiooni tegur 
(BCF  SS ). Biokontsentratsiooni teguri eelhinnanguid orgaaniliste 
kemikaalide jaoks, mille log P  ow väärtused on kuni 9,0, saadakse 
Bintein  et al  (2) võrranditest. Biokontsentratsiooni potentsiaali 
iseloomustavad parameetrid on seondumise kiiruskonstant (k  1 ) 
puhastumise kiiruskonstant (k  2 ) ja BCF  SS . 
Radiomärgistatud katseained lihtsustavad vee- ja kalaproovide 
analüüsimist ning neid võib kasutada otsustamisel, kas on vaja 
teha laguproduktide identifitseerimist ja kvantitatiivset analüüsi. 
Kogu radioaktiivse jäägi mõõtmisel (näiteks põletamisel või kudede lahustamisel) saadud BCF põhineb lähteainel, mis tahes säilinud metaboliitidel ja samuti assimileerunud süsinikul. Seetõttu ei ole 
kogu radioaktiivse jäägi mõõtmisel põhinev BCF otseselt võrreldav 
BCFiga, mis on saadud ainult lähteaine analüüsil teatud keemiliste meetoditega.
 
Radiomärgistamisega uuringutes võib lähteainel põhineva BCF 
määramisel kasutada puhastamismenetlust ja vajaduse korral iseloo ­
mustada peamiseid metaboliite. Lisaks on võimalik kombineerida kalade metabolismi uuringut biokontsentratsiooni uuringuga, analüü ­
sides ja identifitseerides kudedes jääke.
 
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Biokontsentratsioon/bioakumulatsioon on uuritava aine kontsentrat ­
siooni kasv organismis või selle pinnal (teatud kudedes) võrreldes 
uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas.  
Biokontsentratsiooni tegur (BCF või K  B ) akumulatsioonikatse seon ­
dumisfaasi mis tahes ajahetkel on uuritava aine kontsentratsioon kalades (kala pinnal) või teatud kudedes (C
 f , ühik μg/g (ppm)) jaga ­
tuna uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas (C  w , 
ühik μg/ml (ppm)).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCF  SS või K  B ) ei muutu 
märkimisväärselt pikemaajalise ajavahemiku vältel, kui uuritava 
aine kontsentratsioon ümbritsevas keskkonnas on selle ajavahemiku vältel konstantne.
 
Platoo või püsiolek saavutatakse kalades sisalduva uuritava aine 
kontsentratsiooni (C  f ) ja aja funktsiooni esitaval kõveral siis, kui 
see saab paralleelseks ajateljega ja vähemalt kahepäevaste intervalli ­
dega võetud proovide kolm järjestikust C  f analüüsi tulemust on 
üksteise suhtes ± 20 % ja kolme proovivõtmisperioodi vahel ei ole 
märkimisväärseid erinevusi. Ühendatud (puulitud) proovide analüü ­
simisel on nõutavad vähemalt neli järjestikust analüüsi. Aeglaselt seonduvate ainete jaoks on sobivamaks intervalliks seitse päeva.
 
Kineetilistest kiiruskonstantidest (k  1 /k 2 ) otse arvutatud biokontsen ­
tratsiooni tegurit nimetatakse kineetiliseks biokontsentratsiooni tegu ­
riks BCF  k . 
Jaotuskoefitsient oktanool/vesi (P  ow ) on aine lahustuvuse suhe n- 
oktanoolis ja vees tasakaalutingimustel (meetod A.8), seda tähistakse 
ka K  ow . P  ow logaritmi kasutatakse kemikaali biokontsentratsiooni 
potentsiaali tähistamiseks veeorganismides.  
Ekspositsiooni- või seondumisfaas on aeg, mille jooksul kala puutub 
kokku uuritava ainega.  
Seondumise kiiruskonstant (k  1 ) on numbriline väärtus, mis iseloo ­
mustab uuritava aine kontsentratsiooni kasvu kiirust kalas või kala pinnal (või teatud kudedes), kui kala puutub kokku selle ainega (k
 1 
ühik on päev  –1 ). 
Ekspositsioonijärgne või puhastumise (kao) faas on aeg, mis järgneb 
kala viimisele uuritavat ainet sisaldavast keskkonnast ilma selle aineta keskkonda, mille kestel uuritakse selle aine puhastumist (või summaarset kadu) kalast (või teatud kudedest).
 
Puhastumise (kao) kiiruskonstant (k  2 ) on numbriline väärtus, mis 
iseloomustab uuritava aine kontsentratsiooni vähenemise kiirust kalas (või teatud kudedes) pärast kala viimist uuritavat ainet sisalda ­
vast keskkonnast seda ainet mittesisaldavasse keskkonda (k
 2 ühik on 
päev  -1 ). 
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Katse koosneb kahest faasist: ekspositsiooni (seondumise) faas ja 
ekspositsioonijärgne (puhastumise) faas. Seondumisfaasi ajal viiakse sama liiki kalade erinevad rühmad kokku uuritava aine vähemalt 
kahe kontsentratsiooniga. Seejärel viiakse kalad puhastumisfaasi 
jaoks uuritava aine vabasse keskkonda. Puhastumisfaas on alati vajalik, välja arvatud juhul, kui aine seondumine seondumisfaasis oli tähtsusetu (näiteks BCF < 10). Uuritava aine kontsentratsiooni 
kalas või kala pinnal (või teatud kudedes) jälgitakse katse mõlema 
faasi kestel. Lisaks kahele katses kasutatud kontsentratsioonile hoitakse kontrollrühma kalu samalaadsetes tingimustes ilma uuritava aineta, et võrrelda biokontsentratsiooni katse vältel täheldatud võima ­
likke ebasoodsaid mõjusid vastava kontrollrühmaga ja teha kindlaks 
uuritava aine foonilist (mõju mitte avaldavat) kontsentratsiooni.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Seondumisfaas kestab 28 päeva või vähem, kui on võimalik tõestada, 
et tasakaal püstitus varem. Seondumisfaasi pikkust ja püsioleku 
saavutamiseks kuluvat aega saab hinnata 3. liites toodud võrrandi abil. Puhastumisperiood algab kala üleviimisega puhtasse nõusse, milles on sama keskkond, kuid mis ei sisalda uuritavat ainet. Võima ­
luse korral arvutatakse biokontsentratsiooni tegur nii kalas (C
 f ) ja 
vees (C  w ) sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni suhtena näivas 
püsiolekus (BCF  SS ) kui ka kineetilise biokontsentratsiooni tegurina 
(BCF  k ) seondumise kiiruskonstandi (k  1 ) ja puhastumise kiiruskons ­
tandi (k  2 ) suhtest eeldades, et protsessid on esimest järku kineeti ­
kaga. Kui ilmselgelt ei ole tegemist esimest järku kineetikaga, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (5. liide).
 
Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumis ­
faasi pikendama kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva pikku ­
seni, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse, misjärel alusta ­
takse puhastumisfaasi.  
Seondumise kiiruskonstant, puhastumise (kao) kiiruskonstant (või 
konstandid keerulisemate mudelite korral), biokontsentratsiooni tegur ja kus võimalik, iga nimetatud parameetri usalduspiirid arvu ­
tatakse mudelist, mis kirjeldab kõige paremini uuritava aine 
mõõdetud kontsentratsioone kalades ja vees.
 
BCF esitatakse kalade märgkaalu funktsioonina. Siiski võib eriees ­
märgil kasutada teatud kudesid või organeid (näiteks lihased, maks), 
kui kala on piisavalt suur või kui kala võib jagada söödavaks (filee) ja mittesöödavaks (sisikond) osaks. Kuna paljude orgaaniliste ainete potentsiaalse biokontsentratsiooni ja lipofiil-ipofiilsuse vahel on selge 
seos, siis on ka uuritava kala rasvasisalduse ja nende ainete vaadel ­
dava biokontsentratsiooni vahel vastav seos. Seetõttu peaks kõrge lipofiilsusega ainete (näiteks log P
 ow > 3) biokontsentratsiooni 
väljendama lisaks kogukaalule ka rasvasisalduse suhtes, et vähen ­
dada katsetulemuste varieeruvust.  
Võimaluse korral peaks rasvasisaldust määrama samast bioloogilisest 
materjalist, millest määrati uuritava aine kontsentratsioon.  
1.4. UURITAVA AINE ANDMED  
Enne biokontsentratsiooni katse tegemist peab uuritava aine kohta 
teadma järgmisi andmeid:  
— lahustuvus vees;  
— jaotuskoefitsient oktanool/vesi P  ow (tähistatakse ka kui K  ow ja 
määratakse HPLC meetodiga vastavalt punktile A.8);  
— hüdrolüüs;  
— fototransformatsioon vees, määratakse päikesekiirguse või simu ­
leeritud päikesekiirguse abil biokontsentratsiooni katse kiiritustin ­
gimustel (3);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— pindpinevus (ainete jaoks, mille log P  ow väärtust ei saa määrata);  
— aururõhk;  
— kohene biolagunduvus (vajaduse korral),  
Muu nõutav teave on uuritava aine toksilisus katses kasutatava kala ­
liigi suhtes, eelistatult asümptootiline LC  50 (st ajast sõltumatu). 
Teadaoleva mõõtetäpsusega, kordustäpsusega ja tundlikkusega 
sobilik meetod uuritava aine kvantitatiivse sisalduse määramiseks katselahustes ja bioloogilises materjalis peab olema kättesaadav koos üksikasjaliku kirjeldusega proovi ettevalmistamise ja säilitamise 
kohta. Samuti peab teadma testainete analüütilist määramispiiri vees 
ja kala kudedes.
 14 C-märgistatud uuritava aine kasutamisel on vaja 
teada ka lisanditest tingitud radioaktiivsuse protsenti.  
1.5. KATSE KEHTIVUS  
Katse kehtivuseks peavad olema täidetud alljärgnevad tingimused:  
— temperatuuride erinevus alla ± 2  o C; 
— lahustunud hapniku sisaldus ei tohi langeda alla 60 % küllastus ­
kontsentratsioonist;  
— seondumisfaasis hoitakse uuritava aine kontsentratsiooni kambris 
± 20 % piires mõõdetud väärtuste keskmisest;  
— suremus või muud ebasoodsad mõjud ja haigused kontroll- ja 
katserühma kaladel on katse lõpus alla 10 %; kui katse kestab 
mitmeid nädalaid või kuid, siis surm või muud ebasoodsad mõjud peavad mõlemas kalade rühmas olema vähem kui 5 % kuu kohta ja mitte ületama kokku 30 %.
 
1.6. VÕRDLUSAINED  
Vajaduse korral on katsemenetluse kontrollimiseks hea kasutada 
teadaoleva biokontsentratsiooni potentsiaaliga võrdlusaineid. Siiski 
ei saa veel soovitada konkreetseid aineid.  
1.7. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.7.1.  Seadmed  
Katseseadme kõikide osade korral peab vältima materjalide kasuta ­
mist, mis võivad lahustuda, sorbeeruda või leostuda ning millel on kaladele ebasoodne mõju. Kasutada võib keemiliselt inertsetest materjalidest valmistatud standardseid nelinurkseid või silindrilisi 
mahuteid, mille mahutavus on kooskõlas voolukiirusega. Vältima 
peaks pehmest plastmassist torude kasutamist. Eelistatult kasutatakse Teflon®ist (R), roostevabast terasest ja/või klaasist torustikku. Koge ­
mustest on teada, et vaja võib minna kõrge absorptsioonikoefitsien ­
diga aineid, nagu sünteetilised püretroidid, silaniseeritud klaas. 
Sellistel juhtudel peab seadmed pärast kasutamist ära viskama.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Vesi  
Tavaliselt kasutatakse katses looduslikku vett, mida peaks saama 
saastumata ja ühtlase kvaliteediga allikast. Lahjendusvesi peab olema sellise kvaliteediga, mis tagab valitud kalaliikide ellujäämise 
aklimatsiooni- ja katseperioodide vältel, ilma et tekiks mis tahes 
ebanormaalse välimuse või käitumise ilminguid. Ideaaljuhul peaks saama näidata, et uuritavad liigid jäävad ellu, kasvavad ja paljunevad lahjendusvees (näiteks laborikultuur või elutsükli toksilisuse test). 
Kasutatavas vees peaks eelnevalt määrama vähemalt pH, üldkare ­
duse, tahke jäägi, kogu orgaanilise süsiniku, eelistatult ka ammoo ­
niumi, nitriti sisalduse ja mereliikide korral ka soolsuse. Kalade 
optimaalseks kasvuks vajaminevad parameetrid on hästi teada, kuid 
liites 1 on toodud mitmete parameetrite soovituslikud maksimum ­
kontsentratsioonid mageda ja soolase vee katsetele.
 
Katseperioodi kestel peaks vesi olema konstantse kvaliteediga. Vee 
pH väärtus peaks olema vahemikus 6,0 kuni 8,5, kuid konkreetse katse ajal ei tohiks muutus olla suurem kui ± 0,5 pH ühikut. Selleks, 
et lahjendusvesi ei mõjutaks liialt katsetulemusi (näiteks moodus ­
tades uuritava ainega kompleksühendeid) või kalade seisundit, peab teatud ajavahemike järel analüüsima veeproove. Seal kus lahjendus ­
vesi on teadaolevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga peaks raskemetal ­
lide (näiteks Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), peamiste anioonide ja katioo ­
nide (näiteks Ca, Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), pestitsiidide (näiteks kõik 
fosfororgaanilised ja kõik kloororgaanilised pestitsiidid), üldise orgaanilise süsiniku ja suspendeerunud tahkete ainete sisaldust 
määrama näiteks iga kolme kuu järel. Kui vee kvaliteet on püsiv 
vähemalt ühe aasta vältel, siis võib erinevaid parameetreid analüüsida harvemini ja proovi võtmise ajavahemikke suurendada (näiteks iga kuue kuu järel).
 
Lahjendusvee loodusliku hõljuvaine (tahkete osakeste) sisaldus ja 
üldine orgaaniline süsinik (TOC) peaks olema võimalikult madalad, 
et vältida uuritava aine adsorptsiooni orgaanilisele hõljuvainele, mis võib vähendada selle biosaadavust (4). Tahkete osakeste maksi ­
maalne vastuvõetav sisaldus on 5 mg/l (kuivaine, mis ei läbi 
0,45 μm filtrit) ja üldise orgaanilise süsiniku sisaldus 2 mg/l (vt 1. 
liidet). Vajaduse korral peaks vett enne kasutamist filtrima. Kalade (väljaheidete) ja toidujääkide panus orgaanilise süsiniku sisaldusele peaks olema võimalikult madal. Kogu katse kestel ei tohiks orgaa ­
nilise süsiniku sisaldus katseanumas ületada uuritavast ainest ja solu ­
biseerijast (kui seda kasutatakse) pärineva orgaanilise süsiniku kont ­
sentratsiooni mitte rohkem kui 10 mg/l (±20 %) võrra.
 
1.7.3.  Katselahused  
Uuritava aine põhilahus valmistatakse sobiva kontsentratsiooniga. 
Põhilahus valmistatakse eelistatult uuritava aine segamisel või loksu ­
tamisel lahjendusvees. Lahustite või dispergeerijate (solubiliseerijate) 
kasutamine ei ole soovitatav, siiski võib see olla mõningatel juhtudel 
vajalik piisavalt kontsentreeritud põhilahuse valmistamisel. Sobivad lahustid on etanool, metanool, etüleenglükoolmonometüüleeter, etüleenglükooldimetüüleeter, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. 
Sobivad dispergaatorid on Cremophor RH40, Tween 80, metüültsel ­
luloos 0,01 % ja HCO-40. Kergesti biolagunevate ühendite kasuta ­
misega tuleb olla ettevaatlik, kuna need võivad läbivoolu katsetes põhjustada probleeme bakterite kasvuga. Uuritav aine võib olla 
radiomärgistatud ja ta peaks olema kõrgeima puhtusastmega (näiteks 
eelistatult > 98 %).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Läbivoolukatsete jaoks on nõutav süsteem (näiteks mõõtepump, 
proportsionaalne lahjendaja, küllastamissüsteem), mis jaotab ja 
lahjendab pidevalt uuritava aine põhilahust katsekambritesse. Katse ­
kambris peaks vesi eelistatult vahetuma vähemalt viis kambri mahtu ööpäevas. Eelistatud on läbivoolurežiim, kuid kui see pole võimalik 
(näiteks mõjutab see katseorganisme kahjulikult), võib kasutada 
poolseisva veega katset eeldusel, et valideerimisnõuded on täidetud. Põhilahuse ja lahjendusvee voolukiiruseid peab kontrollima 48 tundi enne katset ja seejärel vähemalt iga päev katse vältel. Voolukiiruse 
kontroll peab hõlmama igat katsekambrit ja sellega tagatakse, et 
voolukiirus ei varieeru rohkem kui 20 % ühe katsekambri piires või katsekambrite vahel.
 
1.7.4.  Liikide valik  
Liikide valikukriteeriumiteks on kättesaadavus, sobiv suurus ja 
võimalus kalu laboritingimustes rahuldavalt pidada. Muud kalaliikide 
valikukriteeriumid hõlmavad harrastuslikku, kaubanduslikku ja ökoloogilist väärtust, aga ka samaväärset tundlikkust, varasemat edukat kasutamist jms.
 
Soovitatavad katseloomade liigid on toodud 2. liites. Kasutada võib 
ka muid liike, kuid see võib eeldada katsemenetluse kohandamist sobivate katsetingimuste loomiseks. Sellisel juhul tuleb esitada 
liikide ja katsemeetodi valiku põhjendused.
 
1.7.5.  Kalade pidamine  
Kalavarude populatsioon peab aklimatiseeruma vähemalt kaks 
nädalat katse temperatuuril oleva veega ja saama piisavalt sööta, mis on sama tüüpi katses kasutatava söödaga.
 
Pärast 48tunnist sisseelamisperioodi märgitakse kalade suremus ja 
rakendatakse järgmisi kriteeriume:  
— suremus on suurem kui 10 % populatsioonist seitsme päeva 
jooksul: terve partii loetakse sobimatuks;  
— suremus on 5 % kuni 10 % populatsioonist seitsme päeva 
jooksul: kalu jälgitakse veel seitse päeva;  
— suremus on vähem kui 5 % populatsioonist seitsme päeva 
jooksul: kalad loetakse sobivaks, kuid kui järgmise seitsme päeva jooksul ületab suremus 5 %, siis loetakse terve partii sobi ­
matuks.
 
Eelnevalt peab veenduma, et katsetes kasutatavatel kaladel ei ole 
märgatavaid haigusi ja väärarenguid. Kõik haigestunud kalad tuleb 
jätta kõrvale. Kalu ei tohi ravida kaks nädalat enne katset või 
katse ajal.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. KATSE KÄIK  
1.8.1.  Eelkatse  
Eelkatse on vajalik selleks, et optimiseerida lõpliku katse tingimusi, 
näiteks uuritava aine kontsentratsioonid, seondumis- ja puhastumis ­
faaside kestus.  
1.8.2.  Ekspositsioonitingimused  
1.8.2.1. S e o n d u m i s f a a s i k e s t u s  
Seondumisfaasi kestust saab ennustada praktilisele kogemusele tugi ­
nedes (näiteks eelnevast uuringust või sarnase kemikaali akumulat ­
siooni andmetest) või teatud empiiriliste seoste põhjal, milles kasu ­
tatakse uuritava aine lahustuvust vees või jaotuskoefitsienti 
oktanool/vesi (vt 3. liidet).  
Seondumisfaas kestab 28 päeva või kuni tasakaalu püstitumiseni. 
Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seondumis ­
faasi pikendama ja sooritama lisamõõtmisi, kuni püsioleku saavuta ­
miseni või 60 päeva, olenevalt sellest, kumb neist esimesena saavu ­
tatakse.  
1.8.2.2. P u h a s t u m i s f a a s i k e s t u s  
Ajavahemik, mis võrdub poolega seondumisfaasi kestusest, on tava ­
liselt piisav aine sobivaks vähenemiseks (näiteks 95 %) kehakaalu kohta (vt 3. liide, hinnangute selgitused). Kui 95 % kao saavutami ­
seks vajalik ajavahemik on ebapraktiliselt pikk, ületades näiteks kaks 
korda seondumisfaasi normaalset kestust (st üle 56 päeva), siis võib kasutada lühemat perioodi (st kuni testaine kontsentratsioon on alla 10 % püsioleku kontsentratsioonist). Ainete korral, mille seondumine 
ja puhastumine on palju keerulisema skeemiga kui esimest järku 
kineetikaga ühekambriline kaladega mudel, on aine kadumise kiirus ­
konstantide määramiseks vajalik pikem puhastumisfaas. Nimetatud perioodi pikkus võib olla piiratud ajavahemikuga, mille kestel uuri ­
tava aine kontsentratsioon kalas jääb veel ülespoole analüütilisest 
määramispiirist.
 
1.8.2.3. K a l a d e a r v  
Kalade arv uuritava kontsentratsiooni kohta valitakse nii, et mini ­
maalselt neli kala on proovi kohta iga proovivõtu korra jaoks. Suurema statistilise usaldusväärsuse tagamiseks on vaja proovi kohta suuremat kalade arvu.
 
Täiskasvanud kalade kasutamisel tuleb üles märkida katses kasutatud 
kalade sugu. Kui katses kasutatakse mõlemast soost kalu, siis peab enne ekspositsiooni algust dokumentaalselt näitama, et sugudevahe ­
lised rasvasisaldused ei erine märkimisväärselt; kusjuures vajalik 
võib olla kõikide isaste ja emaste kalade puulimine.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Iga üksiku katse jaoks peab valima sarnase kaaluga kalu, nii et kõige 
väiksemad kalad moodustaksid vähemalt kaks kolmandikku kõige 
suuremate kalade kaalust. Kõik kalad peaksid olema ühevanused ja pärinema ühest allikast. Kuna kalade kaal ja vanus mõjutavad mõni ­
kord märkimisväärselt BCF väärtust (1), siis peab sellised üksikasjad 
täpselt kirja panema. Soovitatavalt võetakse enne katse algust kala ­
varudest väiksem valim, et hinnata kalade keskmist kaalu.
 
1.8.2.4. S i s s e l a s k m i n e  
Katse alguses kalade lisamisest põhjustatud C  w vähenemise minimi ­
seerimiseks ja lahustunud hapniku kontsentratsiooni alanemise välti ­
miseks kasutatakse suurt vee ja kalade suhet. Sisselaskmiskiirus peab 
sobima katses kasutatavatele liikidele. Kõikidel juhtudel soovitatakse 
normaalselt sisselaskmiskiirust 0,1 kuni 1,0 g kala (märgkaal) liitri vee kohta päevas. Kui uuritava aine nõutavat kontsentratsiooni saab hoida ± 20 % piirides ja lahustunud hapniku kontsentratsioon ei 
lange alla 60 % küllastumiskontsentratsioonist, siis võib kasutada 
ka suuremaid kiiruseid.
 
Sobivate sisselaskmisrežiimide valikul arvestatakse liigi normaalset 
looduslikku elukohta. Näiteks veekogu põhjas elavad kalad vajavad 
suuremat akvaariumi põhja pindala sama vee mahu korral võrreldes 
avamere liikidega.  
1.8.2.5. T o i t m i n e  
Aklimatsiooni ja katseperioodi vältel toidetakse kalu sobiva toiduga, 
mille rasva- ja valgusisaldus on teada ning mille kogus on piisav, et hoida neid tervetena ja säilitada kehakaalu. Kalu söödetakse iga päev 
kogu aklimatsiooniperioodi ja katse vältel sellises koguses, mis on 
umbkaudu 1–2 % kehakaalust; see hoiab katse ajal enamiku kalalii ­
kide rasvasisalduse suhteliselt püsival tasemel. Toidu kogust peab ümber arvutama näiteks korra nädalas, et säilitada ühtlast kehakaalu 
ja rasvasisaldust. Selle arvutuse jaoks võib kalade kaalu igas katse ­
kambris hinnata viimati võetud kalaproovi kaalu põhjal. Kambrisse jäävaid kalu ei tohi kaaluda.
 
Söömata toit ja väljaheited imetakse sifooniga katsekambrist välja 
iga päev kohe pärast toitmist (30 minutit kuni tund). Katse ajal 
hoitakse kambreid nii puhtana kui võimalik, et orgaanilise aine kont ­
sentratsioon oleks võimalikult madal, kuna orgaanilise süsiniku sisaldus võib piirata uuritava aine biosaadavust (1).
 
Kuna paljud toidusegud valmistatakse kalalihast, siis peab neis eelne ­
valt analüüsima uuritava aine sisaldust. Lisaks on soovitatav analüü ­
sida toidus pestitsiide ja raskemetalle.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. V a l g u s j a t e m p e r a t u u r  
Valgustusperiood on tavaliselt 12 kuni 16 tundi ja temperatuur 
(± 2  o C) peaks olema sobilik katses kasutatavatele liikidele (vt 2. 
liidet). Valgustuse tüüp ja omadused peavad olema teada. Ettevaatlik 
peab olema uuritava aine võimaliku fototransformatsiooni suhtes 
katses kasutatavatel valgustustingimustel. Vältimaks kalade kokku ­
puudet mittelooduspärase valguskiirgusega, peab kasutama sobivat valgustusallikat. Osadel juhtudel võib kasutada filtrit, mis neelab 
ultraviolettkiirgust lainepikkusega alla 290 nm.
 
1.8.2.7. U u r i t a v a d k o n t s e n t r a t s i o o n i d  
Kalu eksponeeritakse läbivoolu tingimustel vähemalt kahele uuritava 
aine kontsentratsioonile vees. Tavaliselt valitakse uuritava aine kõrge 
(või kõrgeim) kontsentratsioon, mis oleks umbes 1 % selle akuutsest asümptootilisest LC
 50 väärtusest ja see peaks olema vähemalt 10 
korda kõrgem kui selle aine määramispiir vees kasutatava analüüti ­
lise meetodiga.  
Kõrgeima katses kasutatava kontsentratsiooni määramiseks võib 
akuutse 96 tunni LC  50 väärtuse jagada sobiva akuutse ja kroonilise 
väärtuse suhtega (sobivad suhted võivad mõnede kemikaalide jaoks olla 3 kuni 100). Võimaluse korral tuleb kontsentratsioonid valida nii, et nad erineksid ülaltoodust 100 korda. Kui see ei ole võimalik 
1 % LC
 50 kriteeriumi ja analüütilise määramispiiri tõttu, siis peab 
kasutama väiksemat kordajat kui 100 või kaaluma  14 C-märgistatud 
uuritava aine kasutamist. Kasutatav kontsentratsioon ei tohi olla suurem kui uuritava aine lahustuvus.
 
Solubiliseerija kasutamisel ei tohi selle kontsentratsioon olla suurem 
kui 0,1 ml/l ja see peab olema ühesugune kõigis katseanumates. 
Solubiliseerija ja testaine osakaalu üldise orgaanilise süsiniku sisal ­
dusest katses kasutatavas vees peab teadma. Siiski tuleb võimaluse korral vältida selliste ainete kasutamist.
 
1.8.2.8. K o n t r o l l k a t s e d  
Lisaks katseseeriatele tuleb teha üks lahjendusvee kontrollkatse või 
üks kontrollkatse solubiliseerijaga eeldusel, et kasutatav ühend ei mõjuta kalu. Kui ühendi mõju pole kindel, siis peab tegema 
mõlemad kontrollkatsed.
 
1.8.3.  Vee kvaliteedi mõõtmise sagedus  
Katse ajal peaks kõikides kambrites mõõtma lahustunud hapniku, 
TOC, pH ja temperatuuri väärtusi. Vajaduse korral peaks mõõtma 
lisaks üldkaredust ja soolsust kontrollkatsetes ja ühes kõrge (või 
kõrgeima) kontsentratsiooniga kambris. Minimaalselt peaks lahus ­
tunud hapnikku ja soolsust mõõtma kolm korda – seondumisperioodi alguses, keskel ja lõpus ning puhastumisperioodi ajal korra nädalas. 
TOC peaks mõõtma katse alguses (24 tundi ja 48 tundi enne seon ­
dumisfaasi algust), enne kalade lisamist ja korra nädalas nii seon ­
dumis- kui ka puhastumisfaaside ajal. Temperatuuri peaks mõõtma iga päev, pH-d iga perioodi alguses ja lõpus ning karedust üks kord 
iga katse ajal. Eelistatult peaks temperatuuri jälgima pidevalt vähe ­
malt ühes katseanumas.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Kalade ja vee proovide võtmine ning analüüs  
1.8.4.1. K a l a d e j a v e e p r o o v i v õ t m i s e a j a k a v a  
Katsekambritest võetakse veeproove uuritava aine kontsentratsiooni 
määramiseks enne kalade sisselaskmist ning seondumis- ja puhastu ­
misfaaside ajal. Minimaalselt võetakse veeproove samal ajal kala ­
proovidega ning enne toitmist. Seondumisfaasi ajal määratakse uuri ­
tava aine kontsentratsiooni selleks, et kontrollida vastavust validee ­
rimisnõuetele.  
Kalaproove võetakse vähemalt viiel korral seondumisfaasi ajal ja 
vähemalt neljal korral puhastumisfaasi ajal. Kuna osadel juhtudel on keeruline arvutada rahuldava täpsusega BCF väärtuse hinnangut sellise arvu proovide põhjal, eriti kui tegemist ei ole esimest järku 
puhastumiskineetikaga, siis on soovitatav sagedasem proovivõtmine 
mõlema perioodi ajal (vt 4. liidet). Lisaproove säilitatakse ja analüü ­
sitakse vaid siis, kui esimese ringi analüüsitulemused ei ole piisavad BCF arvutamiseks soovitud täpsusega.
 
Vastuvõetava proovivõtu ajakava näide on toodud 4. liites. Muid 
ajakavasid saab hõlpsasti arvutada, kasutades P  ow oletatavaid väär ­
tusi, et arvutada 95 % seondumiseks vajaminevat ekspositsiooniaega.  
Proovivõtmist jätkatakse seondumisfaasi ajal kuni püsioleku saavu ­
tamiseni või 28 päeva möödumiseni, vastavalt kumb on lühem ajava ­
hemik. Kui püsiolekut ei saavutata 28 päeva jooksul, siis peab seon ­
dumisfaasi pikendama kuni püsioleku saavutamiseni või 60 päeva möödumiseni, sõltuvalt kumb neist esimesena saavutatakse. Enne puhastumisfaasi viiakse kalad puhastesse mahutitesse.
 
1.8.4.2. P r o o v i v õ t t j a p r o o v i e t t e v a l m i s t u s  
Analüüsimiseks imetakse veeproov sifooniga läbi inertse torustiku 
katsekambri keskosast. Kuna filtrimine või tsentrifuugimine ei lahuta 
alati uuritava aine mitte-biosaadavat fraktsiooni biosaadavast osast (eriti superlipofiilsed kemikaalid, näiteks mille log P
 ow > 5) (1) 
(5), siis alati ei tohi neid meetodeid kasutada.  
Selle asemel peab kasutama meetmeid mahutite hoidmiseks võima ­
likult puhtana ja orgaanilise süsiniku sisaldust peaks jälgima nii seondumis- kui ka puhastumisfaaside ajal.
 
Iga proovivõtuga eemaldatakse katsekambritest sobiv arv kalu (tava ­
liselt minimaalselt neli). Proovivõtu käigus püütud kalu loputatakse 
kiiresti veega, kuivatatakse, tapetakse kohe kõige sobivamal ja humaansemal viisil ning seejärel kaalutakse.
 
Eelistatult analüüsitakse kalu ja vett kohe pärast proovivõtmist, et 
vältida lagunemist või muid kadusid, ja katse jätkudes arvutatakse 
umbkaudsed seondumis- ja puhastumiskiirused. Kohene analüüs 
hoiab ära ka viivituse platoo saavutamise kindlaksmääramisel.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Kui kohene analüüs ei ole võimalik, siis säilitatakse proove sobival 
meetodil. Enne uuringu algust tehakse kindlaks sobiv meetod uuri ­
tava aine säilitamiseks, näiteks sügavkülmutamine, 4  o C juures hoid ­
mine, säilitamise kestus, ekstraktsioon jms.  
1.8.4.3. A n a l ü ü s i m e e t o d i k v a l i t e e t  
Kuna kogu protseduuri täpsuse määrab peamiselt ära uuritava aine 
määramiseks kasutatava analüüsimeetodi mõõtetäpsus, kordustäpsus 
ja tundlikkus, siis peab eksperimentaalselt kontrollima, kas keemilise analüüsi täpsus ja korratavus ning uuritava aine eraldamine veest ja kaladest rahuldab selle meetodi tingimusi. Lisaks peab kontrollima, 
et lahjendusvees ei oleks uuritavat ainet määramispiiri ületavas 
koguses.
 
Vajaduse korral parandatakse katsest saadud C  w ja C  f väärtusi kont ­
rollkatsetest saadud saagise ja foonilise kontsentratsiooni väärtustega. 
Kala ja vee proove käsitletakse nii, et saastumine ja kaod (näiteks adsorptsioon proovivõtuseadmesse) oleks võimalikult väikesed.
 
1.8.4.4. K a l a p r o o v i d e a n a l ü ü s  
Kui katses kasutatakse radiomärgistatud aineid, siis on võimalik 
analüüsida kogu radioaktiivsust (st lähteainete ja metaboliitide) või puhastada proovi nii, et lähteainet saaks eraldi analüüsida. Peamisi metaboliite võib määrata püsiolekus või seondumisfaasi lõpus, sõltu ­
valt kumb neist saabub varem. Kui BCF on üldiste radiomärgistatud 
jääkide osas ≥ 1 000 %, siis võib olla mõistlik (osade kemikaalide 
kategooriate, nagu pestitsiidide jaoks tungivalt soovitatav) nende laguproduktide identifitseerimine ja kvantitatiivne analüüs, mis 
moodustavad püsiolekus ≥ 10 % kogu jääkidest kala kudedes. Lagu ­
produktide, mis moodustavad ≥ 10 % kõikidest radiomärgistatud 
jääkidest kala kudedes, identifitseerimisel ja kvantitatiivsel analüüsil on soovitatav identifitseerida ja määrata nende kogus ka katsevees.
 
Igas kaalutud kalas peab määrama uuritava aine kontsentratsiooni. 
Kui see ei ole võimalik, siis võib iga proovivõtmise proovid liita (puulida), kuid selline liitmine piirab andmetega tehtavaid statistilisi 
arvutusi. Kui teatud statistilisi arvutusi ja suurt andmehulka peetakse 
tähtsaks, siis peab katses kasutama piisaval arvul kalu, et rahuldada soovitud liitmisprotseduuri ja andmehulga nõudeid (6, 7).
 
BCF esitatakse kogu märgkaalu funktsioonina ja kõrge lipofiilsusega 
ainete jaoks rasvasisalduse funktsioonina. Kalade rasvasisaldus määratakse võimaluse korral iga proovivõtu käigus. Rasvasisalduse määramiseks kasutatakse sobivaid meetodeid (3. liites viiteid 8 ja 2). 
Standardmeetodina võib soovitada kloroformi/metanooli ekstrakt ­
sioonitehnikat (9). Kuna erinevad meetodid ei anna samaseid tule ­
musi (10), siis on tähtis viidata kasutatavale meetodile. Võimaluse korral peaks rasvasisaldust analüüsima samas ekstraktis, mida kasu ­
tatakse uuritava aine analüüsiks, kuna lipiidid eemaldatakse sageli 
ekstraktist enne kromatograafilist analüüsi. Kala rasvasisaldus (mg/kg, märgkaal) ei tohiks katse lõpus erineda katse alguse väärtu ­
sest mitte rohkem kui ± 25 %. Kudede tahke jäägi sisalduse peab 
samuti ära märkima, et rasva kontsentratsiooni märgkaalus oleks 
võimalik ümber arvutada kala kuivkaalu kohta.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Uuritava aine seondumiskõver saadakse seondumisfaasi kontsentrat ­
siooni kalas või kala pinnal (või kindlaksmääratud kudedes) ja aja 
funktsioonina aritmeetilises skaalas. Kui kõver saavutab platoo ehk 
muutub ligikaudu asümptootiliseks ajateljega, siis arvutatakse püsio ­
leku BCF  SS järgmisest valemist:  
püsioleku C  f ðkeskmineÞ 
püsioleku C  w ðkeskmineÞ 
Kui püsiolekut ei saavutata, siis on võimalik ohtlikkuse hindamiseks 
arvutada BCF  SS piisava täpsusega „püsiolekust”, mis on 80 % tasa ­
kaaluolekust (1,6/k  2 ) või 95 % tasakaaluolekust (3,0/k  2 ). 
Lisaks saab määrata biokontsentratsiooni teguri (BCF  k ) kahe esimest 
järku kineetiliste konstantide k  1 /k 2 suhtena. Puhastumise kiiruskons ­
tant (k  2 ) määratakse tavaliselt puhastumiskõveralt (st testaine kont ­
sentratsiooni vähenemine kalades aja jooksul). Seondumise kiirus ­
konstant (k  1 ) arvutatakse k  2 ja C  f väärtuse järgi, mis leitakse seon ­
dumiskõveralt (vt 5. liidet). Eelistatud meetod BCF  k ja kiiruskons ­
tantide  k 1 ja k  2 määramiseks on mittelineaarne parameetrite hinda ­
mine arvutusprogrammiga (11).  k 1 ja k  2 arvutamiseks võib kasutada 
ka graafilisi meetodeid. Kui puhastumiskõver ei ole ilmselgelt 
esimest järku, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (vt 3. liites 
viiteid) ja biostatistika spetsialistide abi.  
2.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Tulemuste tõlgendamisel peab olema ettevaatlik, kui uuritava lahuse 
mõõdetud kontsentratsioonitasemed on analüüsimeetodi määramis ­
piiri ligidal.  
Selgelt määratletud seondumis- ja puhastumiskõverad viitavad hea 
kvaliteediga biokontsentratsiooni andmetele. Seondumis- ja puhastu ­
miskonstantide varieerumine kahe uuritava kontsentratsiooni vahel ei tohiks ületada 20 %. Täheldatud märkimisväärsed erinevused kahe 
kontsentratsiooni seondumis- ja puhastumiskiiruste vahel peab üles 
märkima ja andma võimalikud seletused. Üldiselt läheneb BCF usal ­
duspiir hästi kavandatud uuringutes ± 20 %.
 
3. ARUANDLUS  
Katsetulemused peavad sisaldama järgmist teavet.  
3.1. UURITAV AINE:  
— füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised 
omadused;  
— keemilised identifitseerimisandmed (sealhulgas vajaduse korral 
orgaanilise süsiniku sisaldus);  
— radiomärgistatud ühendite puhul märgistatud aatomite täpne 
asukoht ja lisanditega seotud radioaktiivsuse protsent.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. KATSES KASUTATAVAD LIIGID:  
— teaduslik nimetus, liin, allikas, olemasolul eeltöötlused, aklimati ­
seerumine, suuruste vahemik jms.  
3.3. KATSETINGIMUSED:  
— kasutatav katsemenetlus (läbivoolava või poolseisva veega);  
— kasutatava valgustuse tüüp ja omadused ning valgustuse 
kestus(ed);  
— katse ülesehitus (näiteks katsekambrite arv ja suurus, vee vahe ­
tumise kiirus, paralleelkatsete arv, kalade arv paralleelkatsetes, uuritud kontsentratsioonide arv, seondumis- ja puhastumisfaaside 
pikkus, vee ja kala proovide võtmise sagedus);
 
— põhilahuste valmistamismeetod ja uuendamise sagedus (solubili ­
seerija kasutamisel peab tooma selle kontsentratsiooni ja mõju orgaanilise süsiniku sisaldusele katsevees);
 
— nominaalsed uuritud kontsentratsioonid, mõõdetud väärtuste 
keskmised ja nende standardhälbed katsenõudes ning nende saamismeetod;
 
— lahjendusvee allikas, eeltöötluse kirjeldus, tõendid selle kohta, et 
kalad suudavad selles vees elada, ja vee omadused: pH, karedus, 
temperatuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, kloori jääksi ­
saldus (kui mõõdeti), üldine orgaaniline süsinik, hõljuvained, katsekeskkonna soolsus (kui on asjakohane) ja muud sooritatud 
mõõtmised;
 
— vee kvaliteet katseanumates, pH, karedus, TOC, temperatuur ja 
lahustunud hapniku kontsentratsioon;  
— üksikasjalik informatsioon kalade toitmise kohta (toidu tüüp, 
allikas, koostis (kui võimalik, siis vähemalt rasva- ja valgusi ­
saldus), toidu kogus ja toitmise sagedus);  
— andmed kala ja vee proovide töötlemise kohta, sealhulgas valmis ­
tamise üksikasjad, säilitamine, ekstraktsioon ning testaine ja rasvasisalduse (kui mõõdeti) analüütilised protseduurid (ja 
täpsus).
 
3.4. TULEMUSED:  
— eeluuringute tulemused (kui tehti);  
— kontrollkatse ja iga katsekambri kalade suremus ning mis tahes 
täheldatud ebanormaalne käitumine;  
— kalade rasvasisaldus (kui määratakse katses);  
— kõverad (sealhulgas mõõdetud andmed), mis näitavad uuritava 
aine seondumist ja puhastumist kalades, aeg püsioleku saavuta ­
miseks;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f ja C  w väärtused (kui on asjakohane, siis ka standardhälve ja 
määramispiirkond) kõikide proovivõtmisaegade jaoks (C  f ühik on 
μg/g märgkaal (ppm) terve keha või teatud kudede jaoks, nagu 
rasvad, ja Cw ühik on μg/ml (ppm)), lisaks peab esitama kont ­
rollkatsete C  w väärtused (samuti peab esitama fooni määramise 
katse andmed);  
— püsioleku biokontsentratsiooni tegur (BCF  SS ) ja/või kineetiline 
biokontsentratsiooni tegur (BCFk) ja sobivuse korral seondumise 
ja puhastumise (kao) kiiruskonstantide 95 % usalduspiirid (kõiki 
väljendatakse terve kala suhtes ja kui mõõdeti, siis looma või teatud kudede kogu rasvasisaldus), võimaluse korral usalduspiirid ja standardhälve ning uuritava aine iga kontsentratsiooni jaoks 
kasutatud arvutusmeetod ja andmetöötlus;
 
— radiomärgistatud ühendite kasutamisel võib vajaduse korral 
esitada andmed mis tahes määratud metaboliitide akumuleeru ­
mise kohta;  
— kõik ebatavaline katse kohta, mis tahes kõrvalekaldumine protse ­
duuridest ja muu asjakohane informatsioon.  
Tulemusi stiilis „ei määratud määramispiiri läheduses” peab vältima 
eelkatse meetodi arendamise ja eksperimentaalse ülesehitusega, kuna 
selliseid tulemusi ei saa kasutada kiiruskonstandi arvutamisel.  
4. VIITED  
1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
Toxicol. 102, pp. 117–156 17-156.  
2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear 
dependence of fishf fish bioconcentration on n-octanol/water 
partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.
 
3) OECD, Paris (1996).1996). Direct phototransformation of 
chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. 
No 3.
 
4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing 
methods; influence of particulate organic matter to the bioavai ­
lability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.  
5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initia ­
tive Technical Support Document for the Procedure to Deter ­
mine Bioaccumulation Factors. July 1994.  
6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
 
7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or animal 
Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research 
Triangle Park, N.C. 27711.
 
8) Compaan H. (19 8 0) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic 
environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2.3, 
Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099–1105.  
10) Randall R. C, Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431–1436.
 
11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow- 
through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final 
report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.  
12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
1. liide  
Kasutuskõlbliku lahjendusvee keemilised omadused  
Aine Piirkontsentratsioon  
1 Osakesed 5 mg/l 
2 Üldine orgaaniline süsinik 2 mg/l 3 Ioniseerumata ammoniaak 1 μg/l 
4 Kloori jäägid 10 μg/l 
5 Fosfororgaanilised pestitsiidid, üldsisaldus 50 ng/l 6 Kloororgaanilised pestitsiidid ja polükloreeritud bife ­
nüülid, üldsisaldus 50 ng/l 
7 Orgaanilise kloori üldsisaldus 25 ng/l 
8 Alumiinium 1 μg/l 
9 Arseen 1 μg/l 
10 Kroom 1 μg/l 
11 Koobalt 1 μg/l 
12 Vask 1 μg/l 
13 Raud 1 μg/l 
14 Plii 1 μg/l 
15 Nikkel 1 μg/l 
16 Tsink 1 μg/l 
17 Kaadmium 100 ng/l 18 Elavhõbe 100 ng/l 19 Hõbe 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
2. liide  
Katsetamiseks soovitatavad kalaliigid  
Soovitatav liik Soovitatav katse ­
temperatuuride 
vahemik (  o C) Soovitatav 
katseisendi täis ­
pikkus (cm)  
1 Danio rerio  ( 1 ) (Teleostei , Cyprinidae ) (Hamilton- 
Buchanan), sebrakala 20–25 3,0± 0,5 
2 Pimephales promelas  (Teleostei , Cyprinidae ) (Rafi­
nesque), pakspea lepamaim 20–25 5,0± 2,0 
3 Cyprinus carpio  (Teleostei , Cyprinidae ) (Linnaeus), 
karpkala 20–25 5,0± 3,0 
4 Oryzias latipes  (Teleostei , Poeciliidae ) (Temminck ja 
Schlegel), riisikala 20–25 4,0± 1,0 
5 Poecilia reticulata  (Teleostei , Poeciliidae ) (Peters), 
gupi 20–25 3,0± 1,0 
6 Lepomis macrochirus  (Teleostei , Centrarchidae ) 
(Rafinesque), suur päikeseahven 20–25 5,0± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss  (Teleostei , Salmonidae ) 
(Walbaum), vikerforell 13–17 8,0± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus  (Teleostei , Gasterosteidae ) 
(Linnaeus), harilik ogalik 18–20 3,0± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.  
Erinevates riikides on kasutatud mitmesuguseid suudmeala ja merelisi liike, näiteks: 
Kotkaskalalane  Leiostomus xanthurus 
Sheepshead minnow Cyprinodon variegatus  
Hõbekülg  Menidia beryllina  
Punnkõht (kirevahvenlane)  Cymatogaster aggregata  
Inglise merikeel  Parophrys vertulus  
Sarvikvõldas  Leptocottus armatus  
Harilik ogalik  Gasterosteus aculeatus  
Meriahven  Dicentracus labrax  
Harilik viidikas  Alburnus alburnus  
Kogumine  
Tabelis toodud mageveekalasid on lihtne kasvatada ja/või nad on laialt kättesaadavad aasta läbi, 
kuna aga mereliste ja suudmealade liikide kättesaadavus on piiratud vastavate riikidega. Neid saab 
kasvatada ja kultiveerida kalafarmides või laboratooriumis, haiguste ja parasiitide suhtes kontrollitud tingimustel nii, et katseloomad on terved ja teadaolevat päritolu. Need kalad on kättesaadavad paljudes maailma piirkondades.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
3. liide  
Seondumis- ja puhastumisfaaside kestuse hindamine  
1. Seondumisfaasi kestuse hindamine  
Enne katse tegemist saab k  2 ja seeläbi aega, mis on vajalik püsioleku 
saavutamiseks, hinnata empiirilisest seo k  2 ja jaotuskoefitsiendi n-oktanool/ ­
vesi (P  ow ) või k  2 ja vees lahustuvuse (s) vahel.  
k 2 (päev  -1 ) võib hinnata näiteks järgmisest empiirilisest seosest (1): 
log 10 k 2 =- 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47(r  2 = 0,95) (võrrand 1)  
Muude seoste kohta vaata viidet 2.  
Kui jaotuskoefitsient (P  ow ) ei ole teada, siis võib hinnang põhineda (3) 
kasutatava aine vesilahustuvusel (s): 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (võrrand 2)  
kus s = lahustuvus (mol/l): (n = 36).  
Need seosed kehtivad vaid kemikaalidele, mille log P  ow väärtused on vahe ­
mikus 2–6,5 (4).  
Aega, mis kulub püsioleku mingi protsendi saavutamiseks, võib leida seon ­
dumist ja puhastumist kirjeldavast üldisest kineetilisest võrrandist (esimest 
järku kineetika) saadud k  2 -hinnangu rakendamisel:  
dC f 
dt ¼ k 1 ·C w Ä k 2 ·C f 
või kui C  w on konstant: 
C f ¼ k 1 
k 2 ·C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (võrrand 3)  
Püsioleku saavutamisel (t → ∞) võib võrrandit 3 taandada (5, 6):  
C f ¼ k 1 
k 2:C w või C f / C w = k  1 /k 2 = BCF  
Siis läheneb k  1 /k 2 · C w kontsentratsioonini „püsiolekus” (C  f, s ). 
Võrrandit 3 võib esitada järgmiselt: 
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ or C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (võrrand 4)  
Võrrandi 4 rakendamisel võib püsioleku mingi protsendi saavutamise aega 
hinnata siis, kui k  2 väärtust on eelnevalt hinnatud võrrandi 1 või 2 põhjal.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Seondumisfaasi statistiliselt optimaalne kestus statistiliselt vastuvõetavate 
andmete (BCF  k ) saamiseks on selline ajavahemik, mis on vajalik, et uuri ­
tava aine kontsentratsiooni logaritmi ja lineaarse aja funktsiooni kujutav kõver saavutab keskpunkti või 1,6/k
 2 või 80 % püsiolekust, kuid mitte 
rohkem kui 3,0/k  2 või 95 % püsiolekust (7).  
Aeg, mis kulub püsioleku 80 % saavutamiseks (võrrand 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 või t  80 ¼ 1; 6 
k 2 (võrrand 5)  
Samamoodi on 95 % püsiolekust: 
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (võrrand 6)  
Näiteks seondumisfaasi (up) kestus testaine jaoks, mille log P  ow = 4, oleks 
(kasutades võrrandeid 1, 5 ja 6): 
log 10 k 2 = - 0,414 · (4) + 1,47 k  2 = 0,652 päeva  –1 
up (80 %) = 1,6/0,652, s.o 2,45 päeva (59 tundi)  
või up (95 %) = 3,0/0,652, s.o 4,60 päeva (110 tundi)  
Seondumisfaasi (up) kestus testaine jaoks, mille s = 10  –5 mol/l (log(s) 
= - 5,0), oleks (kasutades võrrandeid 1, 2, 5 ja 6):  
log 10 (P ow ) = - 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 k 2 = - 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 päeva  –1 
up (80 %) = 1,6/0,246, s.o 6,5 päeva (156 tundi)  
või up (95 %) = 3,0/0,246, s.o 12,2 päeva (293 tundi)  
Alternatiivselt võib võrrandit:  
t eq = 6,54 x 10  -3 P ow + 55,31 (tundi)  
kasutada efektiivse püsioleku saavutamiseks vajamineva aja arvutamiseks (4).  
2. Puhastumisfaasi kestuse hindamine  
Aega, mis kulub testaine vähenemiseks kalas mõne protsendi võrra esialg ­
sest kontsentratsioonist, saab hinnata üldvõrrandiga, mis kirjeldab seondu ­
mist ja puhastumist (esimest järku kineetika) (1, 8).  
Puhastumisfaasi jaoks eeldatakse, et C  w on null. Võrrandit võib taandada:  
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f või C  f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
kus C  f, o on kontsentratsioon puhastumisperioodi alguses. Siis 50 % puhas ­
tumine saavutatakse ajaga (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 või t  50 ¼ 0; 693 
k 2 
Samamoodi saavutatakse 95 % puhastumine ajaga:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Kui esimese perioodi jaoks kasutatakse 80 % seondumist (1,6/k  2 ) ja 95 % 
kadu puhastumisfaasis (3,0/k  2 ), siis puhastumisfaas on umbkaudu kaks 
korda pikem kui seondumisfaas.  
Tähtis on märkida, et hinnangud põhinevad eeldusel, et seondumise ja 
puhastumise skeemid järgivad esimest järku kineetikat. Kui see aga ei 
vasta ilmselgelt esimest järku kineetikale, siis peab kasutama keerulisemaid mudeleid (näiteks viide 1).
 
Viited  (3. liide)  
1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for descri ­
bing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309–320.
 
2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality 
Institute.  
3) Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), 
pp. 4–10.  
4) Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701–707.
 
5) Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). 
Transactions of the American Fisheries Society, 104(4), pp. 785–792.  
6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243 — 255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.
 
7) Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhoff 
M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to 
estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614–622.
 
8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chloro-benzenes by Guppies. 
Chemosphere, 9, pp. 3–19.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
4. liide  
Ainete, mille log P  ow = 4, biokontsentratsioonikatsete proovivõtu ajakava teoreetiline näide  
Kala proovivõtmine Proovivõtu ajakava 
Veeproovide arv Kalade arv proovi kohta Minimaalne nõutav 
sagedus (päevades) Lisa proovivõtmine  
Seondumisfaas –1 
0 2 (*) 
2 Lisada 45–80 kala 
1. 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2. 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3. 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4. 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5. 4,7 2 6 
Puhastumisfaas Viia kalad uuritavast 
ainest vabasse vette 
6. 5,0 5,3 4 
(4) 
7. 5,9 7,0 4 
(4) 
8. 9,3 11,2 4 
(4) 
9. 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Veeproov võtta pärast seda, kui vesi on vahetunud vähemalt kolme kambri mahu võrra. 
Sulgudes esitatud väärtused on lisaproovivõtmise korral võetav proovide (vesi, kalad) arv.  
NB! Katse-eelne k  2 väärtuse hindamise tulemus log P  ow = 4,0 jaoks on 0,652 päeva  -1 . Eksperimendi kogupikkus on 3 × up = 3 × 4,6 
päeva, s.o 14 päeva. Seondumisfaasi (up) hindamise kohta vaata 3. liidet.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
5. liide  
Mudeli valimine  
Enamikku biokontsentratsiooni andmeid saab eeldatavalt kirjeldada „piisavalt” 
hästi lihtsa kahekambrilise/kaheparameetrilise mudeliga, mida esitab sirgjoon, mis läheneb kalas puhastumisfaasi ajal määratud kontsentratsiooni punktideni, 
kui need kantakse poollogaritmilisele graafikule. (Kui neid punkte ei saa kanda 
sirgjoonele, peab kasutama keerulisemaid mudeleid, vt näiteks Spacie ja Hame ­
link, viide 1 liites 3).
 
Puhastumise (kao) kiiruskonstandi k  2 graafiline määramismeetod  
Igas kalaproovis määratud uuritava aine kontsentratsioon esitatakse aja funktsioo ­
nina poollogaritmilisel graafikul. Saadud joone tõus on k  2 . 
k 2 ¼ lnðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Peab mainima, et kõrvalekalded sirgjoonest võivad viidata keerulisemale puhas ­
tumise skeemile kui esimest järku kineetika. Puhastumise kõrvalekaldumisel 
esimest järku kineetikast võib kasutada graafilist meetodit, et kindlaks teha 
selle kõrvalekaldumise tüüpe.  
Seondumise kiiruskonstandi k  1 graafiline määramismeetod  
Antud k  2 korral arvutatakse k  1 järgmiselt: x 
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (võrrand 1)  
C f väärtus saadakse tasase seondumiskõvera keskpunktist, mis saadi kontsentrat ­
siooni logaritmi ja aja funktsiooni graafilisel kujutamisel (aritmeetilisel skaalal).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Seondumise ja puhastumise (kao) kiiruskonstantide määramine 
arvutiprogrammiga  
Eelistatud meetodid biokontsentratsiooni teguri ja kiiruskonstantide k  1 ja k  2 
määramiseks on mittelineaarne parameetrite hindamismeetod arvutiprogrammiga. 
Need programmid leiavad k  1 ja k  2 jaoks väärtusi järjestikuse aja ja kontsentrat ­
siooni andmete ja mudeli põhjal.  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ 0 < t < t  c (võrrand 2)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ðe Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Þ t < t  c (võrrand 3)  
kus t  c = aeg seondumisfaasi lõpus.  
See meetod annab k  1 ja k  2 standardhälvete hinnangu.  
Kuna k  2 saab enamikul juhtudel hinnata puhastumiskõveralt suhteliselt kõrge 
täpsusega ja kuna kahe parameetri k  1 ja k  2 vahel on tugev korrelatsioon, siis 
samaaegsel määramisel on soovitatav esmalt arvutada k  2 puhastumisandmetest ja 
seejärel arvutada k  1 seondumisandmetest, kasutades mittelineaarset regressiooni.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  NOORKALADE KASVUKATSE  
1. MEETOD  
Käesolev kasvu toksilisuse katsemeetod lähtub juhendist OECD TG 
215 (2000).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesoleva katse eesmärk on hinnata kemikaalidega pikaajalise 
kokkupuute mõju noorkalade kasvule. See põhineb meetodil, mis töötati välja ja mida on võrreldud laboritevaheliselt (1, 2) Euroopa Liidu piires, et hinnata kemikaalide mõju noorte vikerforellide  
(Oncorynchus mykiss)  kasvule läbivoolutingimustes. Võib kasutada 
ka teisi hästi dokumenteeritud liike. Näiteks on saadud kogemusi sebrakala  (Danio rerio)  (3, 4) ja jaapani riisikalaga  (Oryzias latipes)  
(5, 6, 7) tehtud kasvukatsetest.
 
Vt ka üldise sissejuhatuse C osa.  
1.2. MÕISTED  
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration, vähim toimet 
avaldav kontsentratsioon)  – madalaim uuritud uuritava aine kont ­
sentratsioon, mille puhul täheldatakse võrreldes kontrolliga aine 
märgatavat mõju (p < 0,05). Siiski peavad kõik uuritavad kontsen ­
tratsioonid, mis on suuremad kui LOEC, omama kahjulikku mõju, mis on võrdne või suurem kui LOEC korral täheldatud mõju.
 
NOEC (No Observed Effect Concentration – katsealustele orga ­
nismidele täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon)  – 
uuritav kontsentratsioon, mille väärtus jääb vahetult alla LOEC väär ­
tuse. 
EC x – käesolevas katsemeetodis uuritava aine kontsentratsioon, mis 
põhjustab x % muutuse kala kasvukiiruses võrreldes kontrollkatse ­
tega.  
Laadimisnorm  – kalade märgmass vee ruumala kohta.  
Loomkoormus  – kalade arv vee ruumala kohta.  
Üksikute kalade kasvu erikiirus  – väljendab ühe üksiku kala 
kasvukiirust selle esialgse kaalu alusel.  
Kasvu keskmistatud erikiirus mahutis  – väljendab mahutis oleva 
populatsiooni keskmist kasvukiirust ühe kontsentratsiooni piires.  
Kasvu pseudoerikiirus  – väljendab individuaalset kasvukiirust 
võrrelduna mahutis oleva populatsiooni keskmise esialgse kaaluga.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1146
 
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Eksponentsiaalses kasvufaasis olevad noorkalad kaalutakse ja aseta ­
takse katsekambritesse, kus nad eelistatult läbivoolutingimustes või, kui see ei ole võimalik, siis sobivates poolstaatilistes (staatiline – 
uuendamine) tingimustes puutuvad kokku vees lahustatud uuritava 
aine paljude subletaalsete kontsentratsioonidega. Katse kestab 28 päeva. Kalu toidetakse iga päev. Toiduratsioon põhineb kalade esialgsel kaalul ja selle võib ümber arvutada pärast 14. päeva. 
Katse lõppedes kaalutakse kalad uuesti. Mõju kasvukiirusele analüü ­
sitakse regressioonimudeli abil eesmärgiga määrata kindlaks kontsen ­
tratsioon, mis põhjustaks kasvukiiruses x % muutuse, st EC
 X (nt 
EC 10 , EC  20 või EC  30 ). Alternatiivina võib neid andmeid võrrelda 
ka kontrollväärtustega, et määrata kindlaks vähim toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC) ja seega ka täheldatavat toimet mitte ­
avaldav kontsentratsioon (NOEC).
 
1.4. TEAVE UURITAVA AINE KOHTA  
Akuutse toksilisuse katse tulemused (vt katsemeetod C.1), eelistata ­
valt samade liikide kohta, kes on valitud kõnealuse katse jaoks, peaksid olema kättesaadavad. See tähendab, et on teada uuritava aine lahustuvus vees ja aururõhk ja olemas on usaldusväärne analüü ­
tiline meetod aine kvantifitseerimiseks uuritavates lahustes teadao ­
leva ja dokumenteeritud täpsusega ja olemas on avastamispiir.
 
Kasulik teave on sealhulgas struktuurivalem, aine puhtus, püsivus 
vees ja valguse käes, pK  a , P ow ja kiire biolagunduvuse katse tule ­
mused (vt katsemeetod C.4).  
1.5. KATSE VALIIDSUS  
Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused:  
— kontroll-looma(de) suremus ei tohi katse lõpus ületada 10 %;  
— kalade keskmine kaal kontrollrühma(de)s peab olema piisavalt 
suurenenud, et võimaldada avastada kasvukiiruse juures oluliseks 
peetav minimaalne muutus. Laboritevaheline võrdlus (2) on näidanud, et vikerforelli puhul peab kalade keskmine kaal kont ­
rollrühmades suurenema 28 päeva jooksul vähemalt poole võrra 
(st 50 %) nende esialgsest kaalust; nt esialgne kaal: 1 g/kala 
(= 100 %), lõplik pärast 28. päeva: ≥ 1,5 g/kala ( ≥ 150 %);
 
— lahustunud hapniku kontsentratsioon peab olema vähemalt 60 % 
õhuga küllastamisel saadud väärtusest (ASV) kogu katse jooksul;  
— vee temperatuur ei tohi mis tahes ajal katse jooksul katsekam ­
brites erineda rohkem kui ± 1  o C ja see tuleks säilitada 2  o C 
piires katsealusele liigile ettenähtud temperatuurivahemikus 
(1. liide).  
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Seadmed  
Tavalised laboratooriumiseadmed, eeskätt järgmised:  
— hapniku- ja pH-mõõturid;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— seadmed vee kareduse ja leelisuse kindlaksmääramiseks;  
— asjakohased temperatuuri reguleerimise ja eelistatavalt pideva 
monitooringu seadmed;  
— keemiliselt inertsest materjalist soovitatud laadimisnormi ja loom ­
koormuse jaoks piisava suurusega mahutid (vt punkti 1.8.5 ja 1. liidet);
 
— sobiva täpsusega kaalud (st täpsus kuni ± 0,5 %).  
1.6.2.  Vesi  
Uuringus võib kasutada mis tahes sellist vett, milles katsealune liik 
kasvab ja milles tal on piisavalt pikk eluiga. Vesi peab olema katse ­
perioodi jooksul püsiva kvaliteediga. Vee pH peaks olema vahe ­
mikus 6,5–8,5, siiski ei tohiks see katse jooksul muutuda rohkem 
kui ± 0,5 pH-ühikut. Soovitatav vee karedus on üle 140 mg/l (väljen ­
datuna CaCO  3 -na). Et lahjendamiseks kasutatav vesi ei mõjutaks 
liigselt katsetulemusi (nt moodustades uuritava aine kompleksi), 
tuleb vaheaegade järel võtta analüüsimiseks proove. Raskmetallid 
(nt Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ja Ni), enamik anioone ja katioone (nt Ca, Mg, Na, K, Cl ja SO
 4 ), pestitsiidid (nt fosfororgaaniliste ja klooror ­
gaaniliste pestitsiitide kogusisaldus), kogu orgaanilise süsiniku ja 
heljuva tahke aine sisaldus tuleks määrata näiteks iga kolme kuu 
järel, kui lahjendamiseks kasutatav vesi teatakse olevat suhteliselt püsiva kvaliteediga. Kui vähemalt ühe aasta jooksul on tõestatud püsiv vee kvaliteet, võib neid määramisi teha harvemini ja intervalle 
pikendada (nt iga kuue kuu järel). 2. liites on esitatud mõned lahjen ­
damiseks kasutatava vee nõuetekohased keemilised omadused.
 
1.6.3.  Uuritavad lahused  
Valitud kontsentratsiooniga uuritavad lahused valmistatakse ette 
põhilahust lahjendades.  
Põhilahus tuleks eelistatavalt valmistada lihtsalt uuritava aine sega ­
mise või loksutamisega lahjendamiseks kasutatavas vees, kasutades 
selleks mehaanilisi vahendeid (nt segamist või ultraheli). Sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks võib kasutada küllastusko ­
lonne (lahustuvuskolonne).
 
Lahustite või dispergantide (solubiliseerivate ainete) kasutamine võib 
sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks olla teatud 
juhtudel nõutav. Sobivad lahustid on näiteks atsetoon, etanool, meta ­
nool, dimetüülsulfoksiid, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergandid on näiteks Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metüültselluloos ja HCO-40. Kergesti biolagunduvate ainete 
(nt atsetoon) ja/või väga lenduvate ainete kasutamisel tuleb olla ette ­
vaatlik, sest need võivad põhjustada probleeme bakterite kasvu tõttu läbivooluga katsetes. Solubiliseeriva aine kasutamisel ei tohi sellel olla märkimisväärset mõju kalade kasvule ega märgatavat negatiivset 
mõju noorkaladele, mida saab täheldada ainult lahustiga tehtava 
kontrollkatse abil.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Läbivooluga katsete puhul tuleb kasutada süsteemi, mis pidevalt 
jaotab ja lahjendab uuritava aine põhilahust (nt dosaatorpump, 
proportsionaallahjendusseade, küllastus seadmega süsteem), et viia katsekambritesse sisse erinevad kontsentratsioonid. Põhilahuste ja lahjendamiseks kasutatava vee voolukiirust tuleb kontrollida katse 
jooksul kindlate ajavahemike järel, eelistatavalt iga päev, ja need ei 
tohiks varieeruda rohkem kui 10 % kogu uuringu jooksul. Laborite ­
vaheline võrdlus (2) on näidanud, et vikerforelli puhul on aktseptee ­
ritav vee eemaldumiskiirus katse jooksul 6 liitrit grammi kala kohta 
päevas (vt punkti 1.8.2.2).
 
Poolstaatiliste (uuendamis)katsete puhul sõltub keskkonna uuenda ­
mine uuritava aine püsivusest, kuid vett soovitatakse uuendada iga 
päev. Kui esialgsetes püsivuskatsetes (vt punkti 1.4) ei ole uuritava aine kontsentratsioon uuendamise perioodil stabiilne (st on väljaspool 80–120 % nimiväärtuse ulatust või langeb alla 80 % esialgselt 
määratud kontsentratsioonist), tuleks kaaluda läbivoolukatse kasuta ­
mist.
 
1.6.4.  Liigi valimine  
Käesoleva katse puhul soovitatakse kasutada vikerforelli ( Oncor­
hynchus mykiss ), kuna enamik kogemusi on saadud selle liigi labo ­
ritevahelise võrdluse kaudu (1, 2). Siiski võib kasutada ka teisi hästi dokumenteeritud liike, kuid katsemenetlust võib olla tarvis kohan ­
dada, et oleks tagatud sobivad katsetingimused. Näiteks on olemas 
kogemused ka sebrakala ( Danio rerio ) (3, 4) ja jaapani riisikalaga 
(Oryzias latipes ) (5, 6, 7). Sellisel juhul tuleb liigi ja katsemeetodi 
valikut põhjendada.
 
1.6.5.  Kalade pidamine  
Katsealused kalad tuleb valida ühest populatsioonist, eelistatavalt 
samast pesakonnast, mida on hoitud vähemalt kaks nädalat enne katset sellistes veekvaliteedi ja valgustustingimustes, mis sarnanevad 
katses kasutatavatele. Kalade päevane toiduratsioon peaks moodus ­
tama vähemalt 2 % kehakaalust ja eelistatavalt 4 % kehakaalust päevas kogu pidamisperioodi ja katse jooksul.
 
Pärast 48tunnise kohanemisperioodi lõppu registreeritakse suremus ja 
kohaldatakse järgmisi kriteeriume:  
— kui suremus on suurem kui 10 % populatsioonist seitsme päeva 
jooksul: lükatakse kogu partii kõrvale;  
— kui suremus on populatsioonist 5–10 %: lastakse kaladel aklima ­
tiseeruda veel seitse päeva; kui nende järgmise seitsme päeva 
jooksul on suremus suurem kui 5 %, lükatakse kogu partii 
kõrvale;  
— kui suremus on seitsme päeva jooksul väiksem kui 5 % popu ­
latsioonist: võetakse partii vastu.  
Kalad ei tohiks saada haiguste ravi kaks nädalat enne katset ega 
katse ajal.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. KATSE KAVANDAMINE  
„Katse kavandamine” on seotud uuritavate kontsentratsioonide arvu 
ja vahemike, iga kontsentratsioonitaseme jaoks mahutite arvu valiku ja kalade arvu valikuga mahuti kohta. Ideaaljuhul tuleks katse kavan ­
dada vastavalt
 
— uuringu eesmärkidele;  
— kasutatava statistilise analüüsi meetodile;  
— katsevahendite olemasolule ja maksumusele.  
Eesmärkide aruanne peaks võimaluse korral määratlema statistilise 
võimsuse, millega antud erinevus (nt kasvukiiruses) tuleb tuvastada, 
või alternatiivina täpsus, millega tuleb määrata EC  X (nt x = 10, 20 
või 30 ja eelistatavalt mitte alla 10). Ilma selleta ei ole võimalik uuringu suurust kindlalt määratleda.
 
Tähtis on mõista, et plaan, mis on optimaalne (võimaldab ressursse 
kõige paremini ära kasutada) ühte statistilise analüüsi meetodit kasu ­
tades, ei ole ilmtingimata optimaalne teise jaoks. Seega ei ole soovi ­
tatav plaan LOEC/NOEC kindlaksmääramiseks sama, mida soovita ­
takse regressioonanalüüsi korral.  
Enamikul juhtudel eelistatakse regressioonanalüüsi dispersioonana ­
lüüsile põhjustel, mida on käsitlenud Stephan ja Rogers (8). Siiski, 
kui ei ole leitud sobilikku regressioonimudelit (r  2 < 0,9), tuleks 
kasutada NOEC/LOEC.  
1.7.1.  Regressioonanalüüsi kavandamine  
Regressioonalalüüsi kasutava katse kavandamisel tuleb silmas pidada 
järgmisi tähtsaid asjaolusid:  
— toimiv kontsentratsioon (nt EC  10, 20, 30  ) ja see kontsentratsiooni ­
vahemik, mis pakub uuritava aine toime seisukohalt huvi, 
peaksid kindlasti olema kaetud katses kasutatavate kontsentrat ­
sioonidega. Täpsus, millega saab hinnata toimivaid kontsentrat ­
sioone, on suurim siis, kui toimiv kontsentratsioon paikneb kasu ­
tatud kontsentratsioonivahemiku keskel. Katse esialgse vahemiku 
leidmiseks võib olla kasulik katses kasutatavate sobivate kontsen ­
tratsioonide valimisel;  
— selleks, et võimaldada rahuldavat statistilist modelleerimist, peaks 
katses kasutama vähemalt ühte kontrollmahutit ja viit erinevate kontsentratsioonidega lisamahutit. Solubiliseeriva aine kasuta ­
misel tuleks lisaks katseseeriale kasutada ka ühte kontrollkatset, 
kus kasutatakse solubiliseerivat ainet kõige suuremas uuritud 
kontsentratsioonis (vt punkte 1.8.3 ja 1.8.4);
 
— kasutada võib sobilikku geomeetrilist või logaritmilist jada (9) (vt 
3. liidet). Eelistada tuleb uuritavate kontsentratsioonide logaritmi ­
list jaotust;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— kui kasutatakse rohkem kui kuut mahutit, tuleks lisamahuteid 
kasutada kas selleks, et võimaldada dubleerimist või jaotada 
need ära kontsentratsioonivahemike vahel, et võimaldada lähe ­
dasem vahemik tasemete vahel. Need mõlemad meetmed on võrdselt soovitatavad.
 
1.7.2.  Dispersioonanalüüsi (ANOVA) kasutamine NOEC/LOEC 
määramise kavandamisel  
Eelistatavalt peaksid olema dubleerivad mahutid iga kontsentrat ­
siooni jaoks ja statistiline analüüs tuleks teha mahuti tasandil (10). 
Ilma dubleerivate mahutiteta ei tohi lubada mahutite vahel mingit 
varieerivust peale selle, mis on põhjustatud üksikutest kaladest. Siiski, kogemus on näidanud (10), et mahutitevaheline varieerivus oli võrreldes mahutisisese (st kaladevahelise) varieerivusega uuritud 
juhtumi korral väga väike. Seetõttu on statistilise analüüsi tegemine 
üksikute kalade põhjal suhteliselt aktsepteeritavaks alternatiiviks.
 
Tavapäraselt kasutatakse katses vähemalt viit kontsentratsiooni 
geomeetrilises jadas, mille tegur eelistatavalt ei ületa 3,2.  
Üldiselt, kui katsete tegemisel kasutatakse dubleerivaid mahuteid, 
peaks dubleerivate kontrollmahutite arv ja seega ka kalade arv olema kaks korda suurem iga uuritava kontsentratsiooni korral 
olevast arvust (12, 13, 14). Vastupidi, kui dubleerivaid mahuteid ei 
kasutata, peaks kontrollrühmas olevate kalade arv olema sama, mis iga uuritava kontsentratsiooni korral.
 
Kui ANOVA analüüs peab põhinema pigem mahutite kui üksikute 
kalade kohta käivatel andmetel (mis eeldaks kas iga kala märgista ­
mist või kasvu pseudoerikiiruse kasutamist (vt punkti 2.1.2)), peab 
dubleerivaid mahuteid olema piisavalt, et oleks võimalik kindlaks 
määrata sama uuritava kontsentratsiooniga mahutite korral saadud tulemuste standardhälvet. See tähendab, et vigasid puudutav vabadu ­
sastme arv dispersioonanalüüsis peaks olema vähemalt 5 (10). Kui 
dubleeritakse ainult kontrollkatseid, on oht, et vea varieeruvus 
moondub, sest see võib suureneda koos kõnealuse kasvukiiruse keskväärtusega. Kuna kasvukiirus kontsentratsiooni suurenedes tõenäoliselt aeglustub, toob see endaga kaasa varieerivuse liiga 
suureks hindamise.
 
1.8. KATSE KÄIK  
1.8.1.  Katsealuste kalade valik ja kaalumine  
Tähtis on minimeerida kalade kaalu varieerumine katse alguses. 1. 
liites esitatakse erinevate liikide sobivad suuruste vahemikud, mida 
soovitatakse käesolevas katses kasutada. Katses kasutatava terve kalapartii üksikute kalade kaal katse alguses peaks ideaaljuhul olema vahemikus ± 10 % aritmeetilisest keskmisest kaalust ja igal 
juhul ei tohiks see ületada 25 %. Soovitatav on varem kaaluda 
kalade näidispartii, et arvutada välja keskmine kaal.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Põhipopulatsiooni ei tohiks toita 24 tundi enne katse algust. Seejärel 
tuleks kalad valida välja juhuslikult. Kasutades üldanesteetikumi (nt 
100 mg/l trikaiinmetaansulfonaati (MS 222) sisaldavat vesilahust, mis on neutraliseeritud kahe osa naatriumvesinikkarbonaadi lisami ­
sega ühe osa MS 222 kohta), kaalutakse kalad üksikult märjalt 
(kuivaks pühituna) 1. liites toodud täpsusega. Kalad, kelle kaal on 
ettenähtud piirides, tuleks katsesse võtta ja jagada ära juhuslikult katseanumate vahel. Kalade kogu märgmass igas katsemahutis tuleks protokollida. Nii anesteetikumide kasutamine kui ka kalade käitle ­
mine (sealhulgas kuivatamine ja kaalumine) võib põhjustada stressi 
ja vigastusi noorkaladele, eriti väiksema suurusega liikidele. Seetõttu tuleks noorkalu käidelda äärmise ettevaatlikkusega, et vältida katse ­
loomadele stressi tekitamist ja nende vigastamist.
 
Kalad kaalutakse uuesti katse 28. päeval (vt punkti 1.8.6). Siiski, kui 
peetakse vajalikuks toiduratsioon ümber arvutada, võib kalu uuesti kaaluda ka katse 14. päeval (vt punkti 1.8.2.3). Kalade suuruse muutuste määramiseks võib kasutada ka teist meetodit, näiteks foto ­
grafeerimist, mille põhjal saab kohandada toiduratsioone.
 
1.8.2.  Kokkupuutetingimused  
1.8.2.1.  Kestus  
Katse kestus on ≥ 28 päeva.  
1.8.2.2.  Laadimisnormid ja loomkoormused  
On oluline, et laadimisnorm ja loomkoormus sobiksid kasutatavale 
katseliigile (vt 1. liidet). Kui loomkoormus on liiga suur, põhjustab 
ülekoormus stressi, mis omakorda aeglustab kasvamise kiirust ja 
võib põhjustada haigestumist. Kui see on liiga väike, võib see põhjustada territoriaalset käitumist, mis omakorda võib mõjutada kasvu. Igal juhul peaks laadimisnorm olema piisavalt väike, et 
õhustamiseta säilitada lahustunud hapniku kontsentratsioon, mis 
moodustab vähemalt 60 % õhuga küllastamisel saadavast väärtusest. Laboritevaheline võrdlus (2) on näidanud, et vikerforelli puhul on aktsepteeritav laadimisnorm 16 forelli (kaaluga 3–5 g) 40 liitris. 
Soovitatav vee eemaldumiskiirus katse jooksul on 6 liitrit grammi 
kala kohta päevas.
 
1.8.2.3.  Söötmine  
Kalu tuleks sööta sobiva toiduga (1. liide) piisaval määral, et esile 
kutsuda aktsepteeritavat kasvukiirust. Hoolt tuleb kanda mikroobide kasvu vältimise ja vee hägustumise eest. Vikerforelli puhul vastab 
4 %ne päevane kaaluiive tõenäoliselt nendele tingimustele (2, 15, 16, 
17). Päevase ratsiooni võib jagada kaheks võrdseks portsjoniks ja anda kaladele kaks korda päevas, vähemalt viietunnise vahega. Ratsioon põhineb kalade esialgsel kogukaalul iga katseanuma 
kohta. Kui kalad kaalutakse uuesti 14. päeval, arvutatakse ratsioon 
ümber. Kalu ei tohiks toita 24 tundi enne kaalumist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Söömata toit ja väljaheited tuleks eemaldada katseanumast iga päev, 
puhastades hoolikalt iga mahuti põhja imedes.  
1.8.2.4.  Valgus ja temperatuur  
Fotoperiood ja veetemperatuur peaksid olema sobivad katseliigile (1. 
liide).  
1.8.3.  Uuritavad kontsentratsioonid  
Tavaliselt nõutakse uuritava aine viit kontsentratsiooni hoolimata 
uuringu kavast (vt punkti 1.7.2). Eelnevad teadmised uuritava aine toksilisuse kohta (nt akuutsest katsest ja/või vahemiku määramise 
uuringutest) peaks aitama välja valida sobivad uuritavad kontsentrat ­
sioonid. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleb seda põhjendada. Kõige kõrgem uuritav kontsentratsioon ei tohiks ületada aine lahustuvuspiiri vees.
 
Kui põhilahuse valmistamisel kasutatakse solubiliseerivat ainet, ei 
tohiks selle lõplik kontsentratsioon olla suurem kui 0,1 ml/l ja see 
peaks eelistatavalt olema sama kõikides katseanumates (vt punkti 
1.6.3). Siiski tuleks tarvitusele võtta kõik meetmed, et vältida selliste kemikaalide kasutamist.
 
1.8.4.  Kontrollimised  
Lahjendamiseks kasutatava vee kontrollimiste arv sõltub uuringu 
kavast (vt punkte 1.7–1.7.2). Kui kasutatakse solubiliseerivat ainet, tuleks seda kontrollida sama arv kordi kui vett.
 
1.8.5.  Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus  
Katse jooksul määratakse uuritava aine kontsentratsioonid korrapä ­
raste ajavahemike tagant (vt allpool).  
Läbivoolukatsetes tuleb kontrollida lahusti ja mürkaine põhilahuse 
voolukiiruseid kindlate ajavahemike järel, eelistatavalt iga päev, ja need ei tohiks varieeruda rohkem kui 10 % kogu katse jooksul. Kui 
eeldatakse, et uuritava aine kontsentratsioonid on ± 20 % nimiväär ­
tusest (st vahemikus 80–120 %; vt punkte 1.6.2 ja 1.6.3), soovita ­
takse analüüsida vähemalt kõige kõrgemaid ja madalamaid uuritavaid kontsentratsioone katse alguses ja seejärel nädalaste vaheaegadega. 
Katse puhul, milles ei eeldata, et uuritava aine kontsentratsioon jääb 
vahemikku ± 20 % nimiväärtusest (uuritava aine püsivusandmete põhjal), on vajalik analüüsida kõiki uuritavaid kontsentratsioone, kuid järgides sama režiimi.
 
Poolstaatilistes (uuendamis)katsetes, kus eeldatakse, et uuritava aine 
kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, soovitatakse 
analüüsida vähemalt kõige kõrgemaid ja madalamaid kontsentrat ­
sioone kohe pärast valmistamist ja vahetult enne uuendamist uuringu alguses ja seejärel iga nädal. Katsete puhul, milles ei eeldata, et uuritava aine kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtu ­
sest, tuleb analüüsida kõiki uuritavaid kontsentratsioone, järgides 
sama režiimi, mida kasutatakse püsivamate ainete puhul.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
On soovitatav, et tulemused põhineksid mõõdetud kontsentratsioo ­
nidel. Siiski, kui on tõendeid selle kohta, et uuritava aine kontsen ­
tratsiooni lahuses on suudetud säilitada rahuldavalt vahemikus ± 20 % nimiväärtusest või esialgsest mõõdetud kontsentratsioonist kogu katse jooksul, võivad tulemused põhineda nimi- või mõõdetud 
väärtustel.
 
Proove võib olla vaja filtreerida (nt kasutades 0,45 μm suuruseid 
poore) või tsentrifuugimist. Tsentrifuugimine on soovitatav menetlus. Siiski, kui uuritav aine ei adsorbeeru filtritel, on ka filtreerimine 
aktsepteeritud.
 
Katse jooksul tuleks mõõta lahustunud hapniku kontsentratsiooni, 
pH-d ja temperatuuri kõikides katseanumates. Kontrollkatsetes ja suurima kontsentratsiooniga anumas mõõdetakse vee kogukaredust, leelisust ja soolsust (kui see on oluline). Lahustunud hapniku kont ­
sentratsiooni ja soolsust (kui see on oluline) tuleb mõõta minimaal ­
selt kolm korda (katse alguses, keskel ja lõpus). Poolstaatiliste katsete puhul soovitatakse lahustunud hapniku kontsentratsiooni 
mõõta sagedamini, eelistatavalt enne ja pärast iga vee uuendamist 
või vähemalt kord nädalas. pH tuleks määrata staatilistes uuendamise katsetes iga vee uuendamise alguses ja lõpus ning vähemalt kord nädalas läbivooluga katsetes. Karedust ja leelisust tuleks mõõta üks 
kord iga katse ajal. Temperatuuri tuleks eelistatavalt jälgida pidevalt 
vähemalt ühes katseanumas.
 
1.8.6.  Vaatlused  
Kaal: katse lõpus tuleb ära kaaluda kõik ellujäänud kalad märgmassi 
(kuivaks pühituna) saamiseks kas rühmana katseanuma kaupa või üksikult. Üksikute loomade kaalumisele, mis eeldab, et kõik kalad 
oleksid märgistatud, eelistatakse kaalumist katseanuma kaupa. Indi ­
viduaalkaalu mõõtmise korral üksikute kalade kasvu erikiiruse kind ­
laksmääramiseks peaks olema valitud selline märgistamismeetod, mis väldiks loomadele stressi tekitamist (sobida võivad külmmärgista ­
mise alternatiivid, nt peene värvilise õngenööri kasutamine).
 
Kalad tuleks katseperioodi jooksul üle vaadata iga päev ja mis tahes 
välised anomaaliad (nagu verejooks, värvimuutus) ja ebanormaalne käitumine kirja panna. Suremus tuleks registreerida ja surnud kalad 
eemaldada võimalikult kiiresti. Surnud kalu ei asendata, sest laadi ­
misnorm ja loomkoormus on piisavad, et vältida mahutis olevate kalade arvu muutuse mõju kasvule. Siiski tuleb kohandada söödarat ­
siooni.
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Katse kavandamisel ja analüüsimisel soovitatakse kaasata statistikut, 
kuna käesolev katsemeetod võimaldab märkimisväärset varieerumist eksperimentaalses plaanis, näiteks katsekambrite arvus, uuritavate kontsentratsioonide arvus, kalade arvus jne. Pidades silmas uuringu 
kavandamises olevaid võimalusi, ei ole siin antud konkreetseid juhi ­
seid statistiliste menetluste kohta.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Kasvukiirusi ei tuleks arvutada välja nende katseanumate kohta, 
milles suremus ületab 10 %. Siiski tuleks suremuse määr registree ­
rida kõikide uuritavate kontsentratsioonide kohta.  
Mis meetodit ka ei kasutata andemete analüüsimisel, keskseks kont ­
septsiooniks on kasvu erikiirus r aegade t  1 ja t  2 vahel. Seda võib 
väljendada erinevalt, sõltuvalt sellest, kas kõik kalad on märgistatud või mitte, või kas on tarvis keskmist väärtust mahuti kohta.
 
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
kus 
r 1 = üksikute kalade kasvu erikiirus  
r 2 = keskmine kasvu erikiirus mahutis  
r 3 = kasvu pseudoerikiirus  
w 1 , w 2 = ühe konkreetse kala kaal vastavalt ajahetkedel t  1 ja t  2 
log e w 1 = logaritm üksiku kala kaalust uuringuperioodi alguses  
log e w 2 = logaritm üksiku kala kaalust uuringuperioodi lõpus  
log e W 1 = w  1 väärtuste logaritmide keskmine kalade kohta 
mahutis uuringuperioodi alguses  
log e W 2 = w  2 väärtuste logaritmide keskmine kalade kohta 
mahutis uuringuperioodi lõpus  
t 1 , t 2 = aeg (päevades) uuringuperioodi alguses ja lõpus  
r 1 , r 2 , r 3 võib välja arvutada perioodi 0–28 päeva kohta ja vajaduse 
korral (st kui on tehtud mõõtmised 14. päeval) ka perioodide 0–14 ja 14–28 päeva kohta.
 
2.1.1.  Regressioonanalüüsi tulemused (kontsentratsioon – vastuse 
modelleerimine)  
Käesolev analüüsimeetod sobib esitama sobivat matemaatilist sõltu ­
vust kasvu erikiiruse ja kontsentratsiooni vahel ja seega võimaldab 
kindlaks määrata EC  X , st mis tahes nõutava EC väärtuse. Käesoleva 
meetodi kasutamisel ei ole r arvutamine üksiku kala jaoks (r  1 ) vajalik 
ja selle asemel võib analüüs põhineda keskmisel r väärtusel (r  2 ) 
mahuti kohta. Eelistatud on viimane meetod. See on samuti sobivam 
väiksemate liikide kasutamise korral.  
Mahuti keskmised spetsiifilised kasvu kiirused (r  2 ) tuleks j joones ­
tada graafiliselt kontsentratsiooniga suhestatuna, selleks et jälgida 
kontsentratsiooni-reaktsiooni suhet.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
r 2 ja kontsentratsiooni vahelise sõltuvuse väljendamiseks tuleks 
valida sobiv mudel ja selle valikut tuleb toetada sobiva 
põhjendusega.  
Kui ellujäänud kalade arv on erinevates mahutites erinev, peab 
mudeli sobitamisel kasutama kas lihtsaid või mittelineaarseid 
kaalutud mudeleid, mis võimaldavad kasutada erineva suurusega 
rühmasid.  
Mudeli sobitamise meetod peab võimaldama hinnangu andmist 
näiteks EC  20 -le ja selle dispersioonile (kas standardviga või usaldus ­
vahemik). Graafik sobitatud mudeli kohta tuleks andmete suhtes 
esitada nii, et mudeli sobivus oleks ilmne (8, 18, 19, 20).  
2.1.2.  Tulemuste analüüs LOEC kindlaksmääramiseks  
Kui katse sisaldab endas mahutite dubleerimist kõikidel kontsen ­
tratsioonitasanditel, peaks LOEC kindlaksmääramine põhinema 
mahutit iseloomustava keskmise kasvu erikiiruse (vt punkti 2.1) 
dispersioonanalüüsil (ANOVA), millele järgneb sobiv meetod (nt Dunnetti või Williamsi katse (12, 13, 14, 21) iga kontsentratsiooni keskmise r-väärtuse võrdlemiseks kontrollkatsete keskmise r-väärtu ­
sega eesmärgiga kindlaks määrata madalaim kontsentratsioon, mille 
jaoks see erinevus on oluline 0,05 tõenäosuse tasemel. Kui para ­
meetriliste meetodite eeldatavad nõuded ei ole täidetud –normaal ­
jaotusest erinev jaotus (nt Shapiro-Wilki katse) või heterogeenne 
dispersioon (Barletti katse) –, tuleks kaaluda andmete teisendamist 
homogeenseteks dispersioonideks enne ANOVA analüüsi või kaalutud ANOVA tegemist.
 
Kui katses ei dubleerita mahuteid igal kontsentratsioonitasemel, on 
mahutitel põhinev ANOVA vähetundlik või ei ole seda võimalik 
teha. Sellisel juhul oleks vastuvõetavaks kompromissiks võtta ANOVA aluseks üksikute kalade kasvu pseudoerikiirused r
 3 . 
Iga uuritava kontsentratsiooni r  3 keskväärtust võib seejärel võrrelda 
kontrollkatsete r  3 keskväärtusega. Seejärel võib kindlaks määrata 
LOEC nii nagu varem. Tuleb tunnistada, et kõnealune meetod ei võimalda mingil moel võtta arvesse suuremat mahutitevahelist varieeruvust kui see, mis on põhjustatud üksikute kalade vahelisest 
varieeruvusest, ega taga kaitset selle eest. Siiski on kogemus 
näidanud (8), et mahutitevaheline varieerivus oli väga väike võrreldes mahutisisese (st kaladevahelise) varieerivusega. Kui analüüs ei hõlma üksikuid kalu, tuleb esitada võõrväärtuste identifit ­
seerimise meetod ja õigustus selle kasutamiseks.
 
2.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Tulemuste tõlgendamisel tuleks olla ettevaatlik, kui uuritavates 
lahustes mõõdetud mürkaine kontsentratsioonid on analüütilise meetodi avastamispiiri lähedal või kui poolstaatilistes katsetes on 
uuritava aine kontsentratsioon enne uuendamist väiksem kui värskelt 
valmistatud lahuses.
 
2.3. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Uuritav aine:  
— füüsikaline loomus ning olulised füüsikalis-keemilised omadused;  
— keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas puhtus ja uuritava 
aine kvantifitseerimiseks kasutatav analüütiline meetod (vajaduse korral).
 
2.3.2.  Katsealused liigid:  
— võimaluse korral teaduslik nimi;  
— liin, suurus, tarnija, mis tahes eelnev ravi jms  
2.3.3.  Katsetingimused:  
— kasutatav katsemenetlus (nt poolstaatiline/uuendav, läbivool, 
laadimine, loomkoormus jne);  
— uuringu kava (nt katseanumate arv, uuritavad kontsentratsioonid 
ja dubleerivad anumad, kalade arv anuma kohta);  
— põhilahuse valmistamise meetod ja uuendamise sagedus (kui 
kasutatakse solubiliseerivat ainet, tuleb esitada ka selle kontsen ­
tratsioon);  
— uuritavate kontsentratsioonide nimiväärtused, uuritavas anumas 
mõõdetud keskväärtused ja nende standardhälbed ja nende 
saamismeetod ning tõendid selle kohta, et need mõõtmised 
vastavad uuritava aine kontsentratsioonidele tegelikus lahuses;  
— lahjendamiseks kasutatava vee omadused: pH, karedus, leelisus, 
temperatuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, kloori jääkta ­
semed (kui mõõdetakse), kogu orgaaniline süsinik, suspendee ­
ritud tahked ained, katsekeskkonna soolsus (kui mõõdetakse) ja 
mis tahes muud tehtud mõõtmised;  
— vee kvaliteet katseanumas: pH, karedus, temperatuur ja lahus ­
tunud hapniku kontsentratsioon;  
— üksikasjalik teave söötmise kohta (nt toidu (toitude) liik, päritolu, 
antav kogus ja sagedus).  
2.3.4.  Tulemused:  
— tõendid selle kohta, et kontrollkatsete korral kehtis valiidsuskri ­
teerium, ning andmed mis tahes kontsentratsiooni korral esineva 
suremuse kohta;  
— kasutatud statistilise analüüsi meetodid, dubleerimisel või kaladel 
põhinev statistika, andmete töötlemine ja kasutatud meetodite 
õigustus;  
— andmetabelid üksikute ja keskmiste kalakaalude kohta 0-, 14. 
(kui mõõdeti) ja 28. päeval, keskmise kasvu erikiiruse kohta mahutis või kasvu pseudoerikiiruse väärtused (vastavalt olukor ­
rale) perioodide 0–28 päeva või võimaluse korral 0–14 ja 14–28 
kohta;
 
— statistilise analüüsi tulemused (st regressioonanalüüs või 
ANOVA) eelistatavalt tabelite ja graafikute kujul ning LOEC 
(p = 0,05) ja NOEC või EC  x võimaluse korral koos vastavate 
standardvigadega;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— kalade ebatavalised reaktsioonid ja nähtavad mõjud, mida on 
põhjustanud uuritav aine.  
3. VIITED  
1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
WRc Report No PRD 1388-M/2.  
2) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on 
the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
3) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855–1870.  
4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brac ­
hydanio rerio): results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, pp. 157–164.
 
5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological 
field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
 
6) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., 
Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long- term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp. 287–297.
 
7) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
 
8) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Sympo ­
sium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328–338.
 
9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 pp.
 
10) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.  
11) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on 
Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 
1991.
 
12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096–1121.
 
13) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
14) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, pp. 103–117.  
15) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A 
technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncor ­
hynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, pp. 
123-133.
 
16) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish 
Biology, 37, pp. 33–41.
 
17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.
 
18) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 
11, pp. 1485–1494.  
19) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, 
J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Preci ­
sion of EPA seven-day fathead minnow larval survival and 
growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
 
20) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection 
Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.
 
21) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, pp. 510–531.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
1. liide  
KATSETEKS SOOVITATAVAD KALALIIGID JA SOBIVAD KATSETINGIMUSED  
Liik Soovitatav katse ­
temperatuuri 
vahemik 
( o C) Fotoperiood 
(tundides) Soovitatav 
vahemik kala 
algkaalu jaoks 
(g) Nõutav mõõtmis ­
täpsus Laadimisnorm 
(g/l) Loomkoormus 
(liitri kohta) Sööt Katse kestus 
(päevades)  
Soovitatavad liigid:  
Oncorhynchus mykiss  
Vikerforell 12,5–16,0 12–16 1–5 lähima 100 mg- 
ni 1,2–2,0 4 Kaubanduslik lõhelaste kala ­
maimude kuivtoit ≥ 28 
Teised hästi dokumenteeritud 
liigid:  
Danio rerio  
Sebrakala 21–25 12–16 0,050–0,100 lähima 1 mg-ni 0,2–1,0 5–10 Elustoit ( Brachionus Artemia ) ≥ 28 
Oryzias latipes  
Jaapani riisikala 21–25 12–16 0,050–0,100 lähima 1 mg-ni 0,2–1,0 5–20 Elustoit ( Brachionus Artemia ) ≥ 28
2. liide  
MÕNED AKTSEPTEERITAVA LAHJENDAMISEKS KASUTATAVA 
VEE KEEMILISEDOMADUSED  
Aine Kontsentratsioonid  
Tahked ained (mikroosakestena) < 20 mg/l 
Kogu orgaaniline süsinik < 2 mg/1 
Ammoniaak (ioniseerimata) < 1 μg/l 
Jääkkloor < 10 μg/l 
Fosfororgaaniliste pestitsiidide kogusisaldus < 50 ng/l Kloororgaaniliste pestitsiidide ja poluklooritud bifenüü ­
lide kogusisaldus < 50 ng/1 
Orgaanilistes ühendites oleva kloori kogusisaldus < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
3. liide  
Toksilisuse uuringuks sobivate kontsentratsioonide logaritmilised jadad (9)  
Veerg (kontsentratsioonide arv 100 ja 10 või 10 ja 1 vahel) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Veerust võib valida viiest (või enamast) järjestikusest kontsentratsioonist koosneva jada. Kontsentratsioonidevahelised kes kpunktid 
veerus (x) leitakse veerus (2x + 1). Loetletud väärtused võivad esindada kontsentratsioone, mida väljendatakse protsendina mahu  
või massi kohta (mg/l või μg/l). Väärtusi võib vajaduse korral korrutada või jagada 10 mis tahes astmega. 1. veergu võiks kasutada 
juhul, kui määramatus toksilisuse taseme kohta on suur.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  KALA EMBRÜO JA REBUKOTIGA VASTSETEGA TEHTAV 
LÜHIAJALINE TOKSILISUSE KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev lühiajaline toksilisuse katsemeetod lähtub juhendist OECD 
TG 212 (1998).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev lühiajaline toksilisuse katse kalaembrüote ja rebukotiga 
vastsetega on lühiajaline uuring, milles uuritava ainega kokkupuudet 
uuritakse alates värskelt viljastatud marjaterade arenguetapist kuni rebukotist väljatulekuetapi lõpuni. Embrüote ja rebukotiga vastsete katses ei toimu söötmist ja seega tuleks katse lõpetada ajal, kui 
rebukotiga vastsed toituvad veel rebukotist.
 
Katse eesmärk on kindlaks määrata kemikaalide letaalsed ja teatud 
ulatuses ka subletaalsed mõjud katses kasutatavate liikide konkreet ­
setes arenguetappides. Käesolevast katsest saadav teave oleks kasulik, kuna a) selle katse abil oleks võimalik ühendada letaalsed ja subletaalsed uuringud, b) seda võiks kasutada sõelkatsena kas 
täieliku varajaste eluetappide või kroonilise toksilisuse katsete 
jaoks ja c) sellega võiks uurida liike, mille kasvatamismeetodid ei ole piisavalt arenenud endogeensest toitumisest eksogeensele toitu ­
misele ülemineku perioodi jaoks.
 
Tuleks pidada meeles, et kemikaalide kroonilist pikaajalist toksilist 
toimet kaladele saab tavaliselt täpselt hinnata ainult katsete alusel, 
mis hõlmavad kala kõiki elutsükleid, ja et mis tahes vähendatud 
ulatuses kokkupuude ainult teatud eluetappidel võib vähendada tund ­
likkust ja seega võib tuua kaasa kroonilise toksilisuse alahindamise. Seetõttu eeldatakse, et embrüote ja rebukotiga vastsete katse on 
vähem tundlik kui täiemahuline varajaste eluetappide katse, eriti 
mis puutub kõrge lipofiilsusega kemikaalidesse (log P
 ow > 4) ja 
kemikaalidesse, millel on spetsiifiline toksiline toime. Siiski eelda ­
takse väiksemaid erinevusi tundlikkuses nende kahe katse vahel 
selliste kemikaalide puhul, millel on mittespetsiifiline narkootiline 
toime (1).  
Enne käesoleva katse avalikustamist saadi enamik embrüote ja rebu ­
kotiga vastsete katse kogemusi magevees elava kalaga  Danio rerio  
Hamilton-Buchanan ( Teleostei , Cyprinidae  – üldnimetus sebrakala). 
Üksikasjalikumad juhised katse tegemiseks kõnealuse liigiga on 
seetõttu esitatud 1. liites. Siiski ei välista see ka teiste liikide kasu ­
tamist, mille kohta on olemas kogemusi (tabelid 1A ja 1B).  
1.2. MÕISTED  
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration – vähim toimet 
avaldav kontsentratsioon)  – kõige madalam testitud uuritava aine 
kontsentratsioon, mille puhul täheldatakse aine märgatavat mõju (p < 0,05) võrreldes kontrolliga. Siiski peab kõikidel uuritavatel kontsen ­
tratsioonidel, mis on kõrgemad kui LOEC, olema kahjulik mõju, mis 
on võrdne või suurem kui LOECga täheldatud mõju.
 
NOEC (No Observed Effect Concentration – täheldatavat toimet 
mitteavaldav kontsentratsioon)  – uuritav kontsentratsioon, mis on 
vahetult alla LOEC väärtust.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. KATSE PÕHIMÕTE  
Embrüod ja rebukotiga vastsed viiakse kokku vees lahustatud uuri ­
tava aine erinevate kontsentratsioonidega. Uuringu võib vastavalt protokollile viia läbi kas poolstaatilisena või läbivoolu-uuringuna. 
Selle valik sõltub uuritava aine iseloomust. Katse algab viljastatud 
marjaterade asetamisega katsekambritesse ja lõpetatakse vahetult enne seda, kui mis tahes vastsete rebukott ükskõik millises katse ­
kambris on täielikult imendunud või enne nälga suremise algust 
kontrollkatsetes. Letaalset ja subletaalset mõju hinnatakse ja võrrel ­
dakse kontrollväärtustega, et kindlaks määrata vähim toimet avaldav kontsentratsioon ja seega ka kontsentratsioon, mille puhul toimet ei 
täheldata. Alternatiivina võib neid analüüsida regressioonimudeli 
abil, et kindlaks määrata kontsentratsioon, mis põhjustaks teatud protsentuaalse toime (nt LC/EC
 x , kus x on määratletud protsen ­
tuaalne toime).  
1.4. TEAVE UURITAVA AINE KOHTA  
Akuutse toksilisuse katse tulemused (vt meetodit C.1), eelistatavalt 
samade liikide kohta, kes on valitud kõnealuse katse jaoks, peaksid 
olema kättesaadavad. Tulemustest võib olla kasu uuritavate kontsen ­
tratsioonide sobiva vahemiku valimisel varajaste eluetappide katse jaoks. Teada peaksid olema uuritava aine lahustuvus vees (sealhulgas lahustuvus katses kasutatavas vees) ning aururõhk. Kättesaadavad 
peaksid olema usaldusväärne teadaoleva ja dokumenteeritud täpsu ­
sega analüütiline meetod uuritava aine kvantifitseerimiseks uurita ­
vates lahustes ning avastamispiir.
 
Uuritavat ainet puudutav teave, mis on kasulik katsetingimuste 
loomiseks, on muu hulgas struktuurivalem, aine puhtus, püsivus valguse käes, püsivus katsetingimustes, pKa, P
 ow ja kiire biolagun ­
duvuse katse tulemused (vt meetodit C.4).  
1.5. KATSE VALIIDSUS  
Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused:  
— viljastatud marjaterade üldine ellujäämine kontrollkatsetes ja, kus 
see on oluline, ka ainult lahustit sisaldavates anumates, peab 
olema suurem kui 2. ja 3. liites määratletud piirid või nende 
piiridega võrdne;  
— lahustunud hapniku kontsentratsioon peab olema vahemikus 
60–100 % õhuga küllastumisel saadud väärtusest (ASV) kogu katse jooksul;
 
— vee temperatuur ei tohi katsekambrites erineda rohkem kui 
± 1,5  o C või järjestikuste päevade lõikes mis tahes ajal katse 
jooksul ja see tuleks hoida katsealusele liigile ettenähtud tempe ­
ratuurivahemikus (2. ja 3. liidet).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Katsekambrid  
Kasutada võib igasuguseid klaasist või muust keemiliselt inertsest 
materjalist valmistatud anumaid. Anumate mõõtmed peaksid olema 
piisavalt suured, et võimaldada vastavust laadimisnormile (vt punkti 
1.7.1.2). Katsekambrid soovitatakse paigutada uuringupiirkonnas juhuslikult. Kui laboratooriumis on süstemaatilisi mõjusid, mida on võimalik kontrollida väljajätmise abil, eelistatakse täielikult randomi ­
seeritud süsteemile randomiseeritud plokksüsteemi, milles iga 
menetlus on esindatud igas plokis. Kui kasutatakse väljajätmist, tuleb seda võtta arvesse järgnevas andmete analüüsis. Katsekambrid 
tuleks varjestada soovimatute häirete eest.
 
1.6.2.  Kalaliigi valik  
Soovitatavad kalaliigid on toodud tabelis 1A. Siiski ei välista see ka 
teiste liikide kasutamist (näited on toodud tabelis 1B), kuid katseme ­
netlust võib olla tarvis kohandada sobivate katsetingimuste tagami ­
seks. Sellisel juhul tuleb liigi ja katsemeetodi valikut põhjendada.  
1.6.3.  Sugukalade pidamine  
Sugukalade karja rahuldavatel tingimustel pidamise üksikasjad võib 
leida OECD juhendist TG 210 (  1 ) 1 ja viidetes 2, 3, 4, 5, 6).  
1.6.4.  Embrüote ja vastsete käitlemine  
Embrüod ja vastsed võivad uuritava ainega puutuda kokku suures 
anumas olevates võrgust külgedega või otstega väiksemates anumates, mis võimaldavad uuritaval lahusel läbi anuma voolata. Keeristeta voolu 
läbi nende väikeste anumate võib tekitada nii, et anumad on riputatud 
kangi külge, mis liigutab neid üles ja alla, kuid hoiab organismid kogu aeg lahuses; kasutada võib ka sifooniga läbivoolutussüsteemi. Lõhe ­
liste viljastatud marjaterad võib asetada raamistikule või võrkudele, 
mille avad on piisavalt suured, et võimaldada vastsetel pärast kooru ­
mist sealt läbi kukkuda. Poolstaatilistes katsetes, milles kogu vedelik vahetatakse iga päev, võib kasutada Pasteuri pipette embrüote ja vast ­
sete eemaldamiseks (vt punkti 1.6.6).
 
Kui peamises katseanumas on marjaterade hoidmiseks kasutatud 
marjaterade konteinereid, reste ja võrke, tuleb need piirangud eemal ­
dada pärast vastsete koorumist, (  1 ) välja arvatud see, et võrgud tuleks 
säilitada kalade põgenemise vältimiseks. Kui on vajadus vastsed ümber paigutada, ei tohi nad kokku puutuda õhuga ning võrke ei 
tohi kasutada kalade vabastamiseks marjaterade konteineritest 
(mõnede vähem õrnade liikide nagu karpkala puhul ei ole selline ettevaatusabinõu vajalik). Selle ümberpaigutamise ajastamine erineb liigiti ja ümberpaigutamine ei pea alati olema vajalik. Poolstaatilise 
meetodi korral võib kasutada mõõteklaase või madalaid anumaid ja 
vajaduse korral võib asetada võrksõela mõõteklaasi põhjast natuke kõrgemale. Kui nende konteinerite ruumala on piisav, et vastata laadimisnõuetele (vt 1.7.1.2), ei ole embrüote või vastsete ümberpai ­
gutamine vajalik.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.
 1.6.5.  Vesi  
Katses kasutatavaks veeks sobib vesi, mis vastab 4. liites esitatud 
aktsepteeritava lahjendamiseks kasutatava vee keemilisi omadusi puudutavatele nõuetele ja milles katsealune liik püsib elusana vähe ­
malt sama kaua kui 2. ja 3. liites kirjeldatud vees. See peab olema 
katseperioodi jooksul püsiva kvaliteediga. pH peab jääma konstant ­
seks vahemikus ± 0,5 pH-ühikut. Selle tagamiseks, et lahjendamiseks kasutatav vesi ei mõjutaks liigselt katse tulemusi (näiteks moodus ­
tades uuritava ainega kompleksi) ega mõjutaks negatiivselt sugukarja 
võimet, tuleb vaheaegade järel võtta analüüsimiseks proove. Rask ­
metallid (nt Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ja Ni), enamik anioone ja katioone 
(nt Ca, Mg, Na, K, Cl ja SO
 4 ), pestitsiidid (nt fosfororgaaniliste ja 
kloororgaaniliste pestitsiidide kogusisaldus), kogu orgaanilise süsi ­
niku ja heljuva tahke aine sisaldus tuleks määrata näiteks iga kolme kuu järel, kui lahjendamiseks kasutatav vesi teatakse olevat 
suhteliselt püsiva kvaliteediga. Kui vähemalt ühe aasta jooksul on 
tõestatud püsiv vee kvaliteet, võib neid määramisi teha harvemini ja pikendada intervalle (nt iga kuue kuu järel).
 
1.6.6.  Uuritavad lahused  
Valitud kontsentratsiooniga uuritavad lahused valmistatakse ette 
põhilahust lahjendades.  
Põhilahus tuleks eelistatavalt valmistada lihtsalt uuritava aine sega ­
mise või loksutamisega lahjendamiseks kasutatavas vees, kasutades 
selleks mehaanilisi vahendeid (nt segamist või ultraheli). Sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks võib kasutada küllastusko ­
lonne (lahustuvuskolonne). Lahustite või dispergantide (solubiliseeri ­
vate ainete) kasutamist tuleks vältida nii palju kui võimalik; siiski 
võib teatud juhtudel neid ühendeid olla tarvis sobiva kontsentratsioo ­
niga põhilahuse valmistamiseks. Sobivad lahustid on näiteks atse ­
toon, etanool, metanool, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. 
Sobivad dispergandid on näiteks Cremophor RH40, Tween 80, 
0,01 % metüültselluloos ja HCO-40. Kergesti biolagunduvate ainete (nt atsetoon) ja/või väga lenduvate ainete kasutamisel tuleb olla ette ­
vaatlik, sest need võivad põhjustada probleeme bakterite kasvu tõttu 
läbivooluga katsetes. Solubiliseeriva aine kasutamisel ei tohi sellel olla märkimisväärset mõju kalade ellujäämisele ega märgatavat nega ­
tiivset mõju varajastele eluetappidele, mida saab täheldada ainult 
lahustiga läbiviidava kontrollkatse abil. Siiski tuleks tarvitusele 
võtta kõik meetmed, et vältida selliste kemikaalide kasutamist.
 
Poolstaatilise meetodi korral võib järgida kahte erinevat uuendamise 
menetlust; kas i) uued uuritavad lahused valmistatakse puhastes anumates ja ellujäänud embrüod ja vastsed paigutatakse ettevaatlikult 
ümber uutesse anumatesse koos väikese koguse vana lahusega, 
vältides kokkupuudet õhuga, või ii) katsealused organismid hoitakse anumas, sellal kui osa (vähemalt kolmveerand) katses kasutatavast veest vahetatakse välja. Keskkonna uuendamine sõltub uuritava aine 
püsivusest, kuid vett soovitatakse uuendada iga päev. Kui esialgsetes 
püsivuse katsetes (vt punkti 1.4) ei ole uuritava aine kontsentratsioon püsiv (st on väljaspool 80–120 % nimiväärtust või langeb alla 80 % mõõdetud esialgsest kontsentratsioonist) uuendamise perioodil, tuleks 
kaaluda läbivoolukatse kasutamist. Igal juhul tuleks vältida vastsetele 
stressi tekitamist vee uuendamise käigus.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Läbivooluga katsete puhul tuleb kasutada süsteemi, mis pidevalt 
jaotab ja lahjendab uuritava aine põhilahust (nt dosaatorpump, 
proportsionaallahjendusseade, küllastus seadmega süsteem), et viia katsekambritesse sisse erinevad kontsentratsioonid. Põhilahuste ja lahjendamiseks kasutatava vee voolukiirust tuleb kontrollida katse 
jooksul kindlate ajavahemike järel, eelistatavalt iga päev ja need ei 
tohiks varieeruda rohkem kui 10 % kogu uuringu jooksul. Sobivaks peetakse voolukiirust, mis vastab vähemalt katsekambri viiekordsele ruumalale 24 tunni jooksul (2).
 
1.7. KATSE KÄIK  
Kasulik teave kalaembrüote ja rebukotiga vastsetega tehtud toksili ­
suse katsete kohta on kättesaadav kirjandusest, millest mõned näited 
on esitatud käesoleva teksti kirjanduse jaos (7, 8, 9).  
1.7.1.  Kokkupuutetingimused  
1.7.1.1.  Kestus  
Katse peaks algama eelistatavalt 30 minuti jooksul pärast marjaterade 
viljastamist. Embrüod viiakse uuritavasse lahusesse enne või võima ­
likult kohe pärast looteketta jagunemise faasi algust ja kindlasti enne 
gastrulafaasi algust. Nende embrüote puhul, mis saadakse kauban ­
dusliku tarnija käest, ei pruugi olla võimalik alustada katset kohe pärast viljastamist. Kuna katse tundlikkust võib uuringu alguse edasi ­
lükkamine tõsiselt mõjutada, tuleks uuringut alustada kaheksa tunni 
jooksul pärast viljastamist. Kuna vastseid ei söödeta kokkupuutepe ­
rioodi kestel, tuleks katse lõpetada vahetult enne seda, kui mis tahes vastsete rebukott ükskõik millises katsekambris on täielikult imen ­
dunud, või enne nälga suremise algust kontrollikatsetes. Kestus 
sõltub kasutatavast liigist. Mõned soovitatavad kestused on toodud 
2. ja 3. liites.
 
1.7.1.2.  Laadimine  
Viljastatud marjaterade arv katse alguses peaks olema piisav, et 
vastata statistilistele nõuetele. Marjaterad tuleks jagada juhuvaliku alusel põhimõttel erinevate käitlusrühmade vahel ja ühe kontsentrat ­
siooni kohta tuleks kasutada vähemalt 30 viljastatud marjatera, võrd ­
selt jagatuna (või võimalikult võrdselt, kuna teatud liikide korral on raske saada võrdseid partiisid) vähemalt kolme dubleeriva katse ­
kambri vahel. Laadimisnorm (biomass uuritava lahuse ruumala 
kohta) peaks olema piisavalt väike, et õhustamiseta säilitada lahus ­
tunud hapniku kontsentratsioon, mis moodustab vähemalt 60 % õhuga küllastamisel saadavast väärtusest. Läbivooluga katsetes soovitatakse laadimisnormi, mis ei ületa 0,5 g/l 24 tunni kohta ega 
5 g/l lahust mis tahes ajal (2).
 
1.7.1.3.  Valgus ja temperatuur  
Fotoperiood ja katses kasutatava vee temperatuur peaksid olema 
sobivad katseliigile (2. ja 3. liide). Temperatuuri monitooringuks 
võib olla vajalik kasutada täiendavat katseanumat.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Uuritavad kontsentratsioonid  
Tavaliselt vajatakse uuritava aine viit kontsentratsiooni, mis erinevad 
konstantse kordaja võrra, mis ei ole suurem kui 3,2. Uuritavate kontsentratsioonide vahemiku valikul tuleks arvesse võtta LC
 50 ja 
kokkupuuteperioodi vahelist sõltuvust akuutsuse uuringu käigus. 
Teatud juhtudel võib olla sobiv kasutada vähem kui viit kontsentrat ­
siooni, näiteks piirsisalduskatsete korral, või kasutada kitsamat kont ­
sentratsioonivahemikku. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentrat ­
siooni, tuleb seda põhjendada. Aine kontsentratsioone, mis on 
suuremad kui 96 tunnile vastav LC  50 või 100 mg/l, ükskõik kumb 
neist on madalam, ei ole tarvis uurida. Aineid ei peaks uuringus 
kasutama kogustes, mis ületavad nende lahustuvuspiiri katses kasu ­
tatavas vees.  
Kui uuritava lahuse valmistamisel kasutatakse solubiliseerivat ainet 
(vt punkti 1.6.6), ei tohiks selle lõplik kontsentratsioon katseanumas 
olla suurem kui 0,1 ml/l ja see peaks olema sama kõikides katsea ­
numates.  
1.7.3.  Kontrollimised  
Lisaks katseseeriale tuleks kasutada ka ühte lahuse vee kontrollkatset 
(vajaduse korral dubleerituna) ning vajaduse korral ka ühte kontroll ­
katset, kus kasutatakse solubiliseerivat ainet (vajaduse korral dublee ­
rituna).  
1.7.4.  Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus  
Katse jooksul määratakse uuritava aine kontsentratsioonid korrapä ­
raste ajavahemike tagant.  
Poolstaatilistes katsetes, kus eeldatakse, et uuritava aine kontsentrat ­
sioon säilib vahemikus ± 20 % nimiväärtusest (st vahemikus 80–120 %; vt punkte 1.4 ja 1.6.6), soovitatakse analüüsida vähemalt kõige suuremaid ja madalamaid uuritavaid kontsentratsioone, nii 
värskelt valmistatuna kui ka vahetult enne uuendamist vähemalt 
kolmel korral võrdsete vahedega katse jooksul (st analüüsid tuleks teha samast lahusest saadud proovi põhjal – kui see on värskelt valmistatud ja uuendamisel).
 
Katsete puhul, milles ei eeldata, et uuritava aine kontsentratsioon 
jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest (uuritava aine püsivusand ­
mete põhjal), on vajalik analüüsida kõik uuritavad kontsentratsioonid 
nii värskelt valmistatuna kui ka uuendamisel, kuid järgides sama 
režiimi (st vähemalt kolmel korral võrdsete vahedega katse jooksul). Uuritava aine kontsentratsiooni määramine enne uuendamist tuleks teha ainult ühes dubleerivas anumas iga uuritava kontsentratsiooni 
korral. Määramiste vahe võib olla kõige rohkem seitse ööpäeva. On 
soovitatav, et tulemused põhineksid mõõdetud kontsentratsioonidel. Siiski, kui on tõendeid selle kohta, et uuritava aine kontsentratsiooni lahuses on suudetud säilitada rahuldavalt vahemikus ± 20 % nimi ­
väärtusest või esialgsest mõõdetud kontsentratsioonist kogu katse 
jooksul, võivad tulemused põhineda nimi- või mõõdetud algväär ­
tustel.
 
Läbivooluga katsete puhul sobib kasutada samasugust proovivõture ­ 
žiimi, mida kirjeldati poolstaatiliste katsete puhul (kuid sellisel juhul ei mõõdeta „vanu” lahuseid). Siiski, kui katse kestus ületab seitset päeva, võib olla soovitav suurendada nädalasi proovivõtmise 
kordasid (nt kolm mõõtmisseeriat), et kindlustada uuritavate kontsen ­
tratsioonide püsivus.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Proovid võivad eeldada tsentrifuugimist või filtreerimist (nt kasu ­
tades poore suurusega 0,45 μm). Siiski, kuna tsentrifuugimine ega 
filtreerimine ei tundu alati eraldavat uuritava aine biosaadavat osa mittebiosaadavast, ei tule proovidele ilmtingimata neid toiminguid teha.
 
Katse jooksul tuleks mõõta lahustunud hapniku kontsentratsiooni, 
pH-d ja temperatuuri kõikides katseanumates. Kontrollkatsetes ja 
kõige suuremat kontsentratsiooni sisaldavas anumas mõõdetakse vee kogukaredus ja soolsus (kui see on oluline). Lahustunud hapniku kontsentratsiooni ja soolsust (kui see on oluline) tuleb mõõta mini ­
maalselt kolm korda (katse alguses, keskel ja lõpus). Poolstaatiliste 
katsete puhul soovitatakse lahustunud hapniku kontsentratsiooni mõõta sagedamini, eelistatavalt enne ja pärast iga vee uuendamist või vähemalt kord nädalas. pH tuleks määrata poolstaatilistes uuen ­
damiskatsetes iga vee uuendamise alguses ja lõpus ning vähemalt 
kord nädalas läbivooluga katsetes. Karedust tuleks mõõta üks kord iga katse vältel. Temperatuuri tuleks mõõta kord ööpäevas ja seda tuleks eelistatavalt jälgida pidevalt vähemalt ühes katseanumas.
 
1.7.5.  Vaatlused  
1.7.5.1.  Embrüonaalse arengu staadium  
Embrüonaalne staadium (st gastrulafaas) uuritava ainega kokkupuute 
alguses tuleks võimalikult täpselt tõendada. Seda võib teha, kasu ­
tades sobivalt säilitatud ja puhastatud esinduslikku marjaterade proovi. Embrüonaalse staadiumi kirjeldamiseks ja illustreerimiseks 
võib tutvuda ka kirjandusega (2, 5, 10, 11).
 
1.7.5.2.  Koorumine ja ellujäämine  
Koorumise ja ellujäämise vaatlust tuleks teha vähemalt kord päevas 
ja vastavad arvud tuleks protokollida. Katse alguses võib olla soovi ­
tatav teha sagedasemaid vaatlusi (nt esimese kolme tunni jooksul iga 30 minuti järel), kuna teatud juhtudel võib eluspüsimise aeg olla olulisem kui ainult surmajuhtude arv (nt kui on tegemist akuutse 
toksilisuse mõjuga). Surnud embrüod ja vastsed tuleks eemaldada 
kohe, kui neid märgatakse, kuna need võivad kiiresti laguneda. Eriti hoolikas tuleks olla surnud isendite eemaldamisel, et mitte häirida või füüsiliselt kahjustada kõrvalolevaid marjaterasid/vastseid, 
kuna need on äärmiselt õrnad ja tundlikud. Kriteeriumid surma kohta 
varieeruvad vastavalt eluetapile:
 
— marjaterade puhul : eriti varastes etappides, märkimisväärne 
läbipaistvuse kadumine ja värvuse muutus, mis on põhjustatud valkainete koagulatsioonist ja/või sadestamisest, millele järgneb 
valge läbipaistmatu välimus;
 
— embrüote puhul : kehaliigutuste puudumine ja/või südamelöö ­
kide puudumine ja/või värvuse muutumine läbipaistmatuks sellisel liigil, mille embrüod on normaalselt läbipaistvad;
 
— vastsete puhul : liikumatus ja/või hingamise puudumine ja/või 
südamelöökide puudumine ja/või kesknärvisüsteemi värvumine 
valgeks ja läbipaistmatuks ja/või reaktsiooni puudumine mehaa ­
nilisele ärritajale.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Kõrvalekalded välimuses  
Vastsete arv, kelle kehakujus täheldatakse kõrvalekaldeid ja/või 
pigmentatsiooni, ja rebukoti imendumise etapp tuleks dokumentee ­
rida võrdsete vaheaegade järel sõltuvalt katse kestusest ja kirjeldatud 
kõrvalekallete iseloomust. Tuleks märkida, et embrüote ja vastsete 
kõrvalekalded esinevad loomuliku arengu käigus ja nende osakaal võib teatud liikidel olla mitmeid protsente kontrollkatse(te) suhtes. Kõrvalekaldega loomad tuleb lihtsalt eemaldada katseanumast, kui 
need surevad.
 
1.7.5.4.  Kõrvalekalded käitumises  
Kõrvalekalded käitumises, nt hingeldamine, koordineerimata ujumine 
ja ebatüüpiline liikumatus tuleks registreerida piisavate vaheaegade 
järel sõltuvalt katse kestusest. Need mõjud, kuigi neid on raske kvantifitseerida, võivad jälgimise korral aidata tõlgendada suremuse andmeid, st nendest võib saada teavet aine toksilisuse toimimisviisi 
kohta.
 
1.7.5.5.  Pikkus  
Katse lõpus on soovitatav mõõta individuaalsed pikkused; kasutada 
võib standardpikkust, pikkust ninamiku tipust kuni sabauime kesk ­
miste kiirte alguseni või kogupikkust. Kui siiski esineb sabapoolset uimemädanikku või uimede erosiooni, tuleks kasutada standardpik ­
kusi. Üldiselt peaks hästi läbiviidud katses pikkuse variatsioonikoe ­
fitsient dubleerivates kontrollkatsetes olema ≤ 20 %.
 
1.7.5.6.  Kaal  
Katse lõpus võib mõõta individuaalsed kaalud; kuivmasse (24 tundi, 
60 o C) eelistatakse märgmassidele (kuivaks pühituna). Üldiselt peaks 
hästi tehtud katses massi variatsioonikoefitsient dubleerivates kont ­
rollkatsetes olema ≤ 20 %.  
Nendest vaatlustest saadakse andmeid järgneva statistilise analüüsi 
jaoks:  
— kumulatiivne suremus;  
— tervete vastsete arv katse lõpus;  
— koorumise alguse ja lõppemise aeg (st 90 % koorumine igas 
dubleerivas proovis);  
— igal päeval kooruvate vastsete arv;  
— ellujäänud loomade pikkus (ja kaal) katse lõpus;  
— deformeerunud või ebatavalise välimusega vastsete arv;  
— ebatavaliselt käituvate vastsete arv.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Katse kavandamisel ja analüüsimisel soovitatakse kaasata statistikut, 
kuna käesolev meetod võimaldab märkimisväärset varieerumist 
eksperimentaalses plaanis, näiteks katsekambrite arvus, uuritavate 
kontsentratsioonide arvus, viljastatud marjaterade algses arvus ja mõõdetavates parameetrites. Pidades silmas katse kavandamises olevaid võimalusi, ei ole siin antud konkreetseid juhiseid statistiliste 
menetluste kohta.
 
Kui tuleb määrata LOEC/NOEC, tuleb variatsioone analüüsida igas 
dubleerivas rühmas, kasutades dispersioonanalüüsi (ANOVA) või 
kooslustabeli menetlusi. Selleks, et teha mitmekordseid võrdlusi üksikute kontsentratsioonide ja kontrollkatsete kontsentratsioonide korral saadud tulemuste vahel, võiks olla kasu Dunnetti meetodist 
(12, 13). Olemas on teisi kasulikke näiteid (14, 15). ANOVAt või 
teisi menetlusi kasutades saadud mõju suurus (st katse jõud) tuleks välja arvutada ja avaldada. Tuleb märkida, et kõik punktis 1.7.5.6 toodud vaatlused ei sobi statistiliseks analüüsiks ANOVA abil. 
Kumulatiivse suremuse ja katse lõpus tervete vastsete arvu analüü ­
simiseks võiks kasutada probitmeetodeid.
 
Kui tuleb kindlaks määrata LC/EC  X , tuleks sobiv(ad) kõver(ad), 
näiteks logistiline kõver, sobitada huvipakkuvate andmetega selliste statistilise meetodi abil nagu näiteks vähimruutude meetod või mitte ­
lineaarne vähimruutude meetod. Kõvera(te)s tuleks kasutada selliseid 
muutujaid, et oleks võimalik otseselt hinnata ära soovitud LC/EC
 X ja 
selle standardviga. See kergendab suuresti LC/EC  X jaoks usalduspiiri 
väljaarvutamist. Kui ei ole head põhjust eelistada erinevaid usaldus ­
nivoosid, tuleks määrata kahepoolne 95 % usaldusnivoo. Kõverate 
sobitamise menetlus peaks eelistatavalt andma aluse sobitamise oluli ­
suse või selle puudumise hindamiseks. Kõverate sobitamiseks võib kasutada graafilist meetodit. Regressioonanalüüs sobib kõikide punktis 1.7.5.6 esitatud vaatlusandmete kohta.
 
2.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Tulemuste tõlgendamisel tuleks olla ettevaatlik, kui uuritavates 
lahustes mõõdetud mürkaine kontsentratsioonid on analüütilise meetodi avastamispiiri lähedal. Tulemuste tõlgendamisel selliste 
kontsentratsioonide korral, mis on suuremad aine lahustuvusest 
vees, tuleks samuti olla ettevaatlik.
 
2.3. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
2.3.1.  Uuritav aine:  
— füüsikaline loomus ning olulised füüsikalis-keemilised omadused;  
— keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas puhtus ja uuritava 
aine kvantifitseerimiseks kasutatav analüütiline meetod (vajaduse 
korral).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Katsealused liigid:  
— teaduslik nimi, liin, eellasteks olnud kalade arv (st kui mitut 
emaskala kasutati katses vajaliku arvu marjaterade saamiseks), päritolu ja viljastatud marjaterade kogumise meetod ning edaspi ­
dine käitlemine.
 
2.3.3.  Katsetingimused:  
— kasutatav katsemenetlus (nt poolstaatiline või läbivooluga, aeg 
viljastamisest uuringu alguseni, laadimine jne);  
— fotoperiood(id);  
— katse kavandamine (nt katse- ja dubleerivate anumate arv, 
embrüote arv dubleerivas katses);  
— põhilahuse valmistamise meetod ja uuendamise sagedus (kui 
kasutatakse solubiliseerivat ainet, tuleb esitada ka selle kontsen ­
tratsioon);  
— uuritavate kontsentratsioonide nimiväärtused, mõõdetud väär ­
tused, nende saamise vahendid ja standardhälbed katseanumas 
ja meetod, mille alusel need on saadud, ning kui uuritava aine 
lahustuvus vees on uuritud kontsentratsioonidest väiksem, siis tuleks esitada tõendid selle kohta, et need mõõtmised vastavad uuritava aine kontsentratsioonidele lahuses;
 
— lahjendamiseks kasutatava vee omadused: pH, karedus, tempera ­
tuur, lahustunud hapniku kontsentratsioon, kloori jääktasemed 
(kui mõõdetakse), kogu orgaaniline süsinik, suspendeeritud 
tahked ained, katsekeskkonna soolsus (kui mõõdetakse) ja mis tahes muud tehtud mõõtmised;
 
— vee kvaliteet katseanumas: pH, karedus, temperatuur ja lahus ­
tunud hapniku kontsentratsioon.  
2.3.4.  Tulemused:  
— uuritava aine püsivuse esialgsete uuringute tulemused;  
— tõendid selle kohta, et kontrollkatsed vastasid katsealuste liikide 
korral üldisele aktsepteeritavale ellujäämise normile (2. ja 3. 
liide);  
— andmed suremuse/ellujäämise kohta embrüo ja vastse staadiu ­
mites ning üldine suremus/ellujäämine;  
— koorumiseks kulunud päevad ja koorunud isendite arv;  
— andmed pikkuse (ja kaalu) kohta;  
— võimalike morfoloogiliste kõrvalekallete esinemine ja kirjeldus;  
— võimalike käitumises ilmnenud mõjude esinemine ja kirjeldus;  
— statistiline analüüs ja andmete töötlemine;  
— katsete puhul, milles kasutatakse ANOVA analüüsi: vähim toimet 
avaldava kontsentratsiooni (LOEC) p = 0,05 korral täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) iga hinnatud 
vastuse kohta, kaasa arvatud kasutatud statistiliste menetluste 
kirjeldus ja viide selle kohta, milline oli avastatud mõju suurus;
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— katsete puhul, milles kasutatakse regressioonitehnikat: LC/EC  X ja 
usaldusvahemikud ning selle arvutamiseks kasutatud sobitatud 
mudeli graafik;  
— käesolevast katsemeetodist mis tahes kõrvalekallete selgitamine.  
3. VIITED  
1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Communities, 60 pp. June 1990.
 
2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage 
Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.
 
3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
 
4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological 
Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.  
5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish 
(Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, pp. 121–173.
 
6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachy ­
danio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328–330.  
7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. 
and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and 
Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, 
pp. 61–71.
 
8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining 
the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estima ­
ting Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807–821.
 
9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related 
Compounds. UI. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129–145.
 
10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Develop ­
ment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply 
Company.  
11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 pp.
 
12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096–1121.
 
13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, pp. 482–491.  
14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Statis ­
tical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings 
of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life 
Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321–334.  
16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 pp.
 
17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio 
rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, pp. 126–134.
 
18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic 
position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in 
developmental biology – an invitation to the comperative 
methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: pp. 231–236.
 
19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference 
Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Envi ­
ronmental Safety 32, pp. 19–28.  
20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.
 
21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. 
L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- 
and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 
1189–1203.
 
23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine 
and Marine fish.
 
24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, 280 pp.  
25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1–58.
 
Tabel 1a  
Katseks soovitatavad kalaliigid  
MAGEVEEKALAD  
Oncorhynchus mykiss  
Vikerforell (9, 16)  
Danio rerio  
Sebrakala (7, 17, 18)  
Cyprinus caprio  
Karpkala (8, 19)  
Oryzias latipes  
Jaapani riisikala (20, 21)  
Pimephales promelas  
Pakspea lepamaim (8, 22)  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabel 1b  
Näiteid teistest hästi dokumenteeritud liikidest, mida on samuti kasutatud  
MAGEVEEKALAD MEREKALAD  
Carassius auratus  
Hõbekoger (8)  Menidia peninsulae  
Tidewater silverside (23, 24, 25)  
Lepomis macrochirus  
Bluegill (8)  Clupea harengus  
Harilik heeringas (24, 25)  
Gadus morhua  
Tursk (24, 25)  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow (23, 24, 25)  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
1.liide  
JUHEND TOKSILISUSE KATSE TEGEMISEKS VÖÖDILISE 
PISIDAANIO ( BRACHYDANIO RERIO ) EMBRÜOTE JA REBUKOTIGA 
VASTSETEGA  
SISSEJUHATUS  
Vöödiline pisidaanio on pärit India Coromandeli rannikualalt, kus ta elutseb 
kiirevoolulistes jõgedes. Vöödiline pisidaanio on levinud akvaariumikala karpka ­
lalaste sugukonnast ja teavet tema hoolitsemise ja tema kasvatamise kohta võib leida tavalistes troopilisi kalu käsitlevates raamatutes. Ülevaate vöödilise pisi ­
daanio bioloogiast ja kasutamisest kalandusalastes uuringutes on koostanud 
Laale (1).
 
Kala kasvab harva pikemaks kui 45 mm. Keha on silindrikujuline 7–9 tumesinise 
horisontaalse hõbedase triibuga. Need triibud ulatuvad sabapoolsete ja anaalsete 
uimedeni. Selg on oliivrohelist värvi. Isaskalad on emaskaladest saledamad. 
Emaskalad on hõbedasemad ja nende alakeha on laienenud, eriti enne kudemist.  
Täiskasvanud kalad on võimelised taluma suuri temperatuuri-, pH- ja vee kare ­
duse kõikumisi. Siiski tuleb selliste tervete kalade saamiseks, kellelt saaks kvali ­
teetseid marjaterasid, tagada optimaalsed tingimused.  
Kudemise ajal ajab isaskala emaskala taga ja puksib teda ning kui emaskala 
väljutab marjaterad, siis need ka viljastatakse. Läbipaistvad ja mittekleepuvad marjaterad vajuvad põhja, kus täiskasvanud kalad võivad need ära süüa. Kude ­
mist mõjutab valgus. Kui valgustingimused on hommikul piisavad, koeb vöödi ­
line pisidaanio tavaliselt varajastel hommikutundidel pärast päikesetõusu.
 
Emaskala võib anda nädalaste vahedega mitmesajalisi marjaterade partiisid.  
EELLASTEKS OLNUD KALADE, PALJUNEMISE JA VARAJASTE ELUS ­
TAADIUMITE TINGIMUSED  
Välja tuleks valida sobiv arv terveid kalasid ja hoida need sobivas vees (nt 4. liide) 
vähemalt kaks nädalat enne planeeritud kudemist. Kalade rühmal tuleks võimaldada vähemalt ühe korra sigida enne katses kasutatava marjaterade partiide saamist. Kalade 
tihedus selle perioodi jooksul ei tohiks olla suurem kui 1 gramm kalu liitri kohta. 
Regulaarne veevahetus või puhastussüsteemi kasutamine võib võimaldada suuremat tihedust. Temperatuur hoiuanumates tuleks hoida 25 + 2
 o C. Kaladele tuleks anda 
vahelduvat toitu, mis võiks sisaldada näiteks sobivat kaubanduslikku kuivtoitu, 
elavaid just koorunuid soolavähikesi ( Arthemia ), surusääski, kiivrikke ( Daphnia ) ja 
valgeliimuklasi ( Enchytraeidae ). 
Allpool on visandatud kaks menetlust, mida kasutades on saadud katseks vaja ­
likul määral terveid, viljastatud marjaterasid.  
i) Kaheksa emaskala ja 16 isaskala pannakse anumasse, mis sisaldab 50 liitrit 
lahjendamiseks kasutatavat vett ja mis on varjatud otsese valguse eest ja mida häiritakse nii vähe kui võimalik vähemalt järgneva 48 tunni jooksul. Kude ­
miskandik asetatakse akvaariumi põhja katse algusele eelneva päeva pärast ­
lõunal. Kudemiskandik koosneb (pleksiklaasist või muust sobivast materjalist) 
raamist kõrgusega 5–7 cm, millel on 2–5 mm silmadega jämedakoeline võrk üleval ja 10–30 μm tihe võrk põhjas. Raami jämedakoelise võrgu külge 
kinnitatakse mitmeid lahti keeratud nailonnöörist tehtud „kudemispuid”. Kui 
kalad on olnud pimedas 12 tundi, süüdatakse nõrk lamp, mis algatab kude ­
mise. Kaks kuni neli tundi pärast kudemist eemaldatakse kudemiskandik ja marjaterad kogutakse kokku. Kudemiskandik takistab kaladel marjaterasid süüa ning samal ajal võimaldab see kergesti marjaterad kokku koguda. Kalade 
rühm peaks olema kudenud vähemalt ühe korra enne katses kasutatava marja ­
terade partii kudemist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) Viis kuni kümme isast ja emast kala hoitakse eraldi vähemalt kaks nädalat 
enne planeeritavat kudemist. 5–10 päeva pärast laienevad emaskalade 
alakehad ja nende genitaalide papillid muutuvad nähtavaks. Isakaladel nime ­
tatud papillid puuduvad. Kudemine toimub kudemisanumates, mis on varus ­
tatud võrgust tehtud väärpõhjaga (nagu eelpool). Anum täidetakse lahjenda ­
miseks kasutatava veega nii, et vee sügavus võrgu kohal on 5–10 cm. Päev 
enne planeeritavat kudemist asetatakse mahutisse üks emaskala ja kaks isas ­
kala. Vee temperatuuri tõstetakse, kuni see on ühe kraadi võrra kõrgem akli ­
matsioonitemperatuurist. Valgus kustutatakse ja anumat häiritakse nii vähe kui 
võimalik. Hommikul süüdatakse nõrk lamp, mis algatab kudemise. 2–4 tunni 
pärast eemaldatakse kalad ja marjaterad korjatakse kokku. Kui vajatakse suuremaid marjaterade partiisid kui need, mida saab ühelt emaskalalt, võib üles seada piisaval hulgal paralleelseid kudemisanumaid. Kui registreeritakse 
iga emaskala paljunemise edukust enne katset (partii suurus ja kvaliteet), võib 
sigimiseks välja valida suurima reproduktiivsusega emaskalad.
 
Marjaterad tuleks viia katseanumasse klaastorude abil (sisediameeter vähemalt 
4 mm), millel on elastne imiotsak. Marjaterade ümberpaigutamisel kaasamineva 
vee hulk peaks olema võimalikult minimaalne. Marjaterad on veest raskemad ja 
vajuvad torust välja. Hoolitseda tuleks selle eest, et marjaterad (ja vastsed) ei puutuks kokku õhuga. Tuleks teha partii(de) proovi(de) mikroskoopiline uuring, et kindlustada esimestes arengustaadiumides anomaaliate puudumine. Marjaterade 
desinfitseerimine ei ole lubatud.
 
Marjaterade suremuse määr on kõrgem esimese 24 tunni jooksul pärast viljasta ­
mist. Selle perioodi jooksul on suremus sageli 5–40 %. Ebaõnnestunud viljasta ­
mise või arengukahjustuste tulemusel marjaterad degenereeruvad. Marjaterade 
partii kvaliteet tundub sõltuvat emaskalast, kuna mõned emaskalad annavad pide ­
valt kvaliteetseid marjaterasid ja teised ei tee seda mitte kunagi. Samuti on erinevatel partiidel erinev arenemis- ja koorumiskiirus. Edukalt viljastatud marja ­
terade ja rebukotivastsete ellujäämus on hea, tavaliselt üle 90 %. 25
 o C juures 
kooruvad marjaterad 3.–5. päeval pärast viljastamist ning rebukott imendub ligi ­
kaudu 13. päeval pärast viljastamist.  
Embrüonaalset arengut on hästi kirjeldanud Hisaoka ja Battle (2). Tänu marjate ­
rade ja koorumisjärgsete vastsete läbipaistvusele on võimalik jälgida kalade 
arengut ja vaadelda väärarenguid. Ligikaudu neli tundi pärast kudemist on 
võimalik eristada viljastamata marjaterasid viljastatud marjateradest (3). Selle kindlakstegemiseks asetatakse marjaterad ja vastsed väikese ruumalaga katseanu ­
matesse ja neid uuritakse mikroskoobi all.
 
Katsetingimused, mida rakendatakse varajastel elustaadiumitel, on esitatud 2. 
liites. Optimaalne lahjendamiseks kasutatava vee pH ja karedus on vastavalt 7,8 ja 250 mg CaCO
 3 /l. 
ARVUTUSED JA STATISTIKA  
Pakutakse välja kaheetapiline lähenemine. Kõigepealt analüüsitakse statistiliselt 
suremuse, väärarengu ja koorumise aega puudutavaid andmeid. Seejärel hinna ­
takse statistiliselt keha pikkust nende kontsentratsioonide korral, mille puhul ei 
täheldatud nimetatud parameetritele negatiivset mõju. Selline lähenemine on 
soovitatav, kuna mürkaine võib valikuliselt surmata väiksemad kalad, aeglustada koorumiseks vajalikku aega ja põhjustada suuri väärarenguid, mis toob endaga kaasa nihkega pikkuse mõõtmised. Lisaks on sellisel viisil võimalik mõõta ligi ­
kaudu sama arvu kalu iga menetluse korral, mis kindlustab katsestatistika valiid ­
suse.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
LC 50 JA EC  50 MÄÄRAMINE  
Arvutatakse ellujäänud marjaterade ja vastsete arv ning seda korrigeeritakse 
vastavalt Abbotti valemile (4) suremusega kontrollkatsetes:  
P ¼ 100 Ä Í C Ä P 0 
C Ü 100 Î 
kus 
P = korrigeeritud ellujäämise protsent  
P' = uuritava kontsentratsiooni korral täheldatud ellujäämise protsent  
C = ellujäämine kontrollkatses  
Kui võimalik, määratakse katse lõpus sobivat meetodit kasutades LC  50 . 
Kui EC  50 statistikasse soovitakse lisada morfoloogiliste kõrvalekallete esinemist, 
võib vastavad juhised leida viitest Stephan (5).  
LOEC JA NOEC HINDAMINE  
Marjateradega ja rebukotiga vastsete uuringu eesmärk on võrrelda nullist erineva 
kontsentratsiooniga lahuseid kontrollkatsega, st kindlaks määrata LOEC. Seetõttu tuleks kasutada korduvaid võrdlusmenetlusi (6, 7, 8, 9, 10).
 
VIITED  
1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio 
rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121–173.
 
2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
pp. 
3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling 
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, pp. 173–181.
 
4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1–333.  
5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society 
for Testing and Materials, pp. 69–81.
 
6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096–1121.
 
7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a 
Control. Biometrics, 20, pp. 482–491.  
8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103–117.
 
9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519–531.  
10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
2. liide  
KATSETINGIMUSED, KESTUS JA ELLUJÄÄMISKRITEERIUMID SOOVITATAVATE LIIKIDE JAOKS  
Liik Temperatuur 
( o C) Soolsus 
(0/00) Fotoperiood 
(tundides) Etappide kestus 
(päevades) 
Tüüpiline katse kestus Ellujäämus kontrollkatses 
(minimaalne %) 
Embrüo Rebukotiga 
vastne Koorumisprot ­
sent Pärast koorumist  
MAGEVEEKALAD  
Brachydanio rerio  
Vöödiline pisidaanio 25 ± 1 — 12–16 3–5 8–10 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 5 päeva pärast koorumist (8–10 päeva) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Vikerforell 10 ± 1 (
 1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30–35 25–30 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 20 päeva pärast 
koorumist (50–55 päeva) 66 70  
Cyprinus carpio  
Harilik karpkala 21–25 — 12–16 5 > 4 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 4 päeva pärast koorumist (8–9 päeva) 80 75  
Oryzias latipes  
Jaapani riisikala 24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12–16 8–11 4–8 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 5 päeva pärast 
koorumist (13–16 päeva) 80 80  
Pimephales promelas  
Pakspea lepamaim 25 ± 2 — 16 4–5 5 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 4 päeva pärast 
koorumist (8–9 päeva) 60 70  
( 1 ) Embrüote puhul. 
( 2 ) Vastsete puhul. 
( a ) Embrüod ja vastsed pimeduses kuni üks nädal pärast koorumist, välja arvatud ülevaatamise ajal. Seejärel vähene valgus kogu ka tse jooksul.
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
3. liide  
Katsetingimused, kestus ja ellujäämiskriteeriumid teiste hästi dokumenteeritud liikide korral  
Liik Temperatuur 
( o C) Soolsus (0/00) Fotoperiood 
(Tundides) Etappide kestus (Päevades) 
Tüüpiline embrüote ja rebukotiga vastsete katse 
kestus Ellujäämus kontrollkatses 
(minimaalne %) 
Embrüo Rebukotiga 
vastne Koorumisprot ­
sent Pärast koorumist  
MAGEVEEKALAD  
Carassius auratus  
Kuldkala 24 ± 1 — — 3–4 > 4 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 4 päeva pärast 
koorumist (7 päeva) — 80  
Leopomis macrochirus  
Bluegill kuukala 21 ± 1 — 16 3 > 4 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 4 päeva pärast koorumist (7 päeva) — 75 
MEREKALAD  
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside 22–25 15–22 12 1,5 10 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 5 päeva pärast 
koorumist (6–7 päeva) 80 60  
Clupea harengus  
Heeringas 10 ± 1 8–15 12 20–25 3–5 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 3 päeva pärast 
koorumist (23–27 päeva) 60 80  
Gadus morhua  
Tursk 5 ± 1 5–30 12 14–16 3–5 Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 3 päeva pärast koorumist (18 päeva) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow 25 ± 1 15–30 12 — — Võimalikult kohe pärast viljastamist 
(varane gastrulafaas) kuni 4/7 päeva pärast 
koorumist (28 päeva) > 75 80
4. LIIDE  
MÕNED AKTSEPTEERITAVA LAHJENDAMISEKS KASUTATAVA 
VEE KEEMILISED OMADUSED  
Aine Kontsentratsioonid  
Tahked ained osakestena < 20 mg/l 
Kogu orgaaniline süsinik < 2 mg/l 
Ammoniaak (ioniseerimata) < 1 μg/l 
Jääkkloor < 10 μg/l 
Fosfororgaaniliste pestitsiidide kogusisaldus < 50 ng/l Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüü ­
lide kogusisaldus < 50 ng/l 
Kloori kogusisaldus orgaanilistes ühendites < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  MESILASED – AKUUTSE SUUKAUDSE TOKSILISUSE 
KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev akuutse toksilisuse katsemeetod lähtub juhendist OECD 
TG 213 (1998).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev toksilisuse katse on laboratoorne meetod, mis on kavan ­
datud taimekaitsetoodete ja teiste kemikaalide suukaudse akuutse toksilisuse hindamiseks täiskasvanud töömesilaste abil.
 
Ainete toksiliste omaduste hindamisel võib nõuda akuutse suukaudse 
toksilisuse kindlaksmääramist mesilaste puhul, st siis, kui mesilaste 
kokkupuutumine antud kemikaaliga on tõenäoline. Akuutse suukaudse toksilisuse uuring tehakse selleks, et määrata kindlaks pestitsiidide ja teiste kemikaalide toksilisus mesilatele. Käesoleva 
katse tulemusi tuleks kasutada edasise hindamise vajaduse määrami ­
seks. Täpsemalt võib seda meetodit kasutada programmides, milles pestitsiidide poolt mesilastele tekitatud ohte hinnatakse astmeliselt, ja mis põhinevad järjestikusel üleminekul toksilisuse laboratoorsete 
katsete juurest poolväli-ja välikatseteni (1). Pestitsiide võib uurida 
nii toimeainetena kui ka valmististena.
 
Mesilaste tundlikkuse ja katsemenetluse täpsuse kindlakstegemiseks 
tuleks kasutada toksilisuse standardit.  
1.2. MÕISTED  
Akuutne suukaudne toksilisus  – negatiivne mõju, mis ilmneb hilje ­
malt 96 tunni jooksul pärast uuritava aine ühe doosi suukaudset 
manustamist.  
Doos  – tarbitud uuritava aine kogus. Doosi väljendatakse uuritava 
aine massina ( μg) katselooma kohta ( μg/mesilane). Tegelikku doosi 
iga mesilase kohta ei saa välja arvutada, kuna mesilasi söödetakse 
kollektiivselt, kuid kindlaks on võimalik teha keskmine doos (kogu tarbitud uuritava aine/mesilaste arv ühes puuris).
 
LD 50 (letaalse doosi mediaan), suukaudne  – statistiliselt saadud 
aine ühekordne doos, mis võib suukaudsel manustamisel põhjustada 
surma 50 %-l isenditest. LD  50 väärtus avaldatakse uuritava aine 
mikrogrammides ( μg) mesilase kohta. Pestitsiidide korral võib 
uuritav aine olla kas toimeaine või valmistis, milles on üks või 
mitu toimeainet.  
Suremus  – isend loetakse surnuks, kui see on täielikult liikumatu.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Täiskasvanud töömesilased  (Apis mellifera)  viiakse kokku sahharoo ­
silahuses dispergeeritud uuritava aine erinevate doosidega. Seejärel söödetakse mesilastele sama toitu ilma uuritava aineta. Suremus registreeritakse iga päev vähemalt 48 tunni jooksul ja võrreldakse 
kontrollkatses saadud väärtustega. Kui suremuse määr suureneb 24 
h ja 48 h vahel ning kui suremus kontrollrühmas jääb aktsepteerita ­
vale tasemele, st < 10 %, on katse kestust sobiv maksimaalselt 96 tunnini pikendada. Tulemusi analüüsitakse, et arvutada välja LD
 50 
väärtused 24. ja 48. tunni jaoks ja juhul, kui uuringut pikendatakse, 
siis ka 72. ja 96. tunni jaoks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. KATSE VALIIDSUS  
Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused:  
— keskmine suremus kõikides kontrollkatsetes kokku ei tohi katse 
lõpul ületada 10 %;  
— toksilisuse standard LD  50 vastab kõnealusele vahemikule.  
1.5. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.5.1.  Mesilaste kogumine  
Kasutada tuleks sama tõugu noori töömesilasi, st mesilased peaksid 
olema samas vanuses, samamoodi toidetud jne. Mesilased peaksid 
olema pärit piisavalt toidetud, tervetest ja võimalikult haigusvabama ­
test mesilasemaga kolooniatest, millel on tuntud ajalugu ja füsioloo ­
giline staatus. Mesilased tuleks kokku koguda kasutamispäeva hommikul või katsele eelneval õhtul ja hoida uuringu tingimustes 
järgmise päevani. Sobivad on need mesilased, mis on kogutud raami ­
delt, millel ei ole pesakondi. Tuleks vältida kogumist varakevadel või hilissügisel, kuna mesilaste füsioloogia on sellel ajal muutunud. Kui katse tuleb teha varakevadel või hilissügisel, võib mesilastel 
lasta kooruda inkubaatoris ja neid võib kasvatada ühe nädala jooksul 
„mesilasleival” (kärjest kogutud õietolm) ja sahharoosilahusega. Toksilisuse katses ei tohiks kasutada mesilasi, keda on ravitud keemiliste ainetega, näiteks antibiootikumid, varroatoosivastased 
tooted jms nelja nädala jooksul alates viimase ravimenetluse lõpust.
 
1.5.2.  Pidamis- ja söötmistingimused  
Kasutatakse kergesti puhastatavaid ja hästiventileeritud puure. Kasu ­
tada võib mis tahes materjalist, nt roostevabast terasest, traatvõrgust, plastmassist puure või ühekordselt kasutatavad puupuure jms. Eelis ­
tatav mesilaste arv on kümme mesilast puuri kohta. Katsepuuri 
suurus peaks olema sobiv mesilaste arvuga, st tagama piisava ruumi.
 
Mesilased tuleks hoida katseruumis pimedas temperatuuril 25 ± 2  
o C. Kogu katse jooksul tuleks registreerida suhteline õhuniiskus, 
mis normaalselt on ligikaudu 50–70 %. Käitlemisemenetlusi, seal ­
hulgas ainega töötlemist ja vaatlusi, võib teha (päeva)valguses. Toiduks kasutatakse sahharoosi vesilahust, mille lõppkontsentrat ­
sioon on 500 g/l (50 massi-/mahuprotsenti). Pärast nimetatud uuri ­
tava doosi andmist tuleks toitu anda  ad libitum . Toitmissüsteem 
peaks võimaldama registreerida toidu manustamise iga puuri kohta (vt punkti 1.6.3.1). Kasutada võib klaastoru (ligikaudu 50 mm pikk ja 10 mm läbimõõduga, mille avatud ots kitseneb kuni ligikaudu 
2 millimeetrini).
 
1.5.3.  Mesilaste ettevalmistamine  
Kogutud mesilased jagatakse juhuvaliku alusel katsepuuridesse, mille 
paigutus katseruumis on juhuslik.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Mesilastele võib toitu mitte anda kuni 2 tundi enne katse algust. 
Mesilastele soovitatakse enne aine mõjule allutamist toitu mitte 
anda, et kõik mesilased oleksid katse alguses seedekulgla sisu mõttes võrdses olukorras. Surevaid mesilasi ei tuleks kasutada ja need asen ­
datakse enne katse algust tervete mesilastega.
 
1.5.4.  Dooside ettevalmistamine  
Kui uuritav aine on veega segunev ühend, võib selle dispergeerida 
kohe 50 % sahharoosilahuses. Tehniliste valmististe ja madala vees ­
lahustuvusega ainete korral võib kasutada kandeaineid, näiteks orgaanilised lahustid, mesilastele vähemürgised emulgaatorid või 
dispergandid (nt atsetoon, dimetüülformamiid, dimetüülsulfoksiid). 
Kandeaine kontsentratsioon sõltub uuritava aine lahustuvusest ja see peaks olema sama kõikide uuritavate kontsentratsioonide korral. Siiski on üldiselt sobiv kandeainekontsentratsioon 1 % ja seda ei 
tohiks ületada.
 
Tuleks valmistada sobivad kontroll-lahused, st kui uuritava aine 
lahustamiseks kasutatakse lahustit või disperganti, tuleks kasutada kahte iseseisvat kontrollrühma: vesilahust ja sahharoosilahust, milles 
lahusti/kandeaine kontsentratsioon on sama mis doseerimislahustes.
 
1.6. KATSE KÄIK  
1.6.1.  Katse- ja kontrollrühmad  
Uuritavate dooside ja duplikaatide arv peaks vastama statistilistele 
nõuetele LD  50 kindlaksmääramiseks 95 % usalduspiiriga. Tavaliselt 
nõutakse katse jaoks viit doosi geomeetrilises jadas, mille tegur ei ületa 2.2 ja mis katavad LD
 50 jaoks vajaliku vahemiku. Siiski tuleb 
lahjendusaste ja doseeritavate kontsentratsioonide arv kindlaks 
määrata vastavalt toksilisuskõvera (doos vs suremus) tõusule ja tule ­
muste analüüsimiseks valitud statistilisele meetodile. Vahemiku kind ­
laksmääramise katse võimaldab valida välja doseerimiseks sobivad kontsentratsioonid.
 
Iga uuritava kontsentratsiooniga lahust tuleks doseerida vähemalt 
kolmele dubleerivale katserühmale, milles igas on 10 mesilast. Lisaks katseseeriale tuleks kasutada vähemalt kolme kontrollpartiid, milles igaühes on 10 mesilast. Kontrollpartiid peaksid olema ka 
kasutatavate lahustite/kandeainete jaoks (vt punkti 1.5.4).
 
1.6.2.  Toksilisuse standard  
Katseseerias peaks olema ka toksilisuse standard. Eeldatava LD  50 
väärtuse katmiseks tuleks valida vähemalt kolm doosi. Iga uuritavat 
doosi tuleks kasutada vähemalt kolme dubleeriva puuri korral, milles 
igaühes on 10 mesilast. Eelistatav toksilisuse standard on dimetoaat, 
mille peroraalse LD  50 dokumenteeritud väärtus 24 tunni jaoks on 
vahemikus 0,10–0,35 μg toimeainet mesilase kohta (2). Siiski võib 
kasutada ka teisi toksilisuse standardeid juhul, kui on võimalik 
hankida piisavalt andmeid, et tõestada eeldatud reaktsiooni doosile 
(nt paratioon).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Kokkupuude  
1.6.3.1.  Doseerimine  
Igale mesilaste katserühmale tuleb anda 100–200 μl 50 % sahharoosi 
vesilahust, mis sisaldab sobivas kontsentratsioonis uuritavat ainet. 
Suuremat ruumala on vaja vähelahustuvate, madala toksilisusega 
või valmistises madala kontsentratsiooniga toodete korral, sest siis tuleb sahharoosilahuses kasutada suuremaid koguseid. Rühma kohta manustatud töödeldud toidu hulka tuleb jälgida. Pärast tarbimist 
(tavaliselt 3–4 tunni jooksul) tuleb toiteseade eemaldada puurist ja 
asendada teisega, mis sisaldab ainult sahharoosilahust. Sahharoosila ­
huseid antakse seejärel  ad libitum . Mõningate ühendite puhul võib 
suure kontsentratsiooniga uuritavatest doosidest keeldumine põhjus ­
tada selle, et toitu tarbitakse vähe või üldse mitte. Töödeldud toit, mida ei ole tarbitud maksimaalselt 6 tunni jooksul, tuleks asendada ainult sahharoosilahusega. Tarbitud töödeldud toidu hulka tuleks 
hinnata (nt järelejäänud töödeldud toidu ruumala/massi mõõtmine).
 
1.6.3.2.  Kestus  
Katse kestus on eelistatavalt 48 tundi alates uuritava lahuse asenda ­
misest ainult sahharoosi sisaldava lahusega. Kui suremus tõuseb 
jätkuvalt rohkem kui 10 % pärast esimest 24 tundi, tuleks katse kestust pikendada maksimaalselt 96 tunnini, eeldusel, et suremus kontrollrühmas ei ületa 10 %.
 
1.6.4.  Vaatlused  
Suremus registreeritakse 4. tunnil pärast katse algust ja seejärel 24. ja 
48. tunnil (st pärast doseerimist). Kui osutub vajalikuks pikendatud 
vaatlusperiood, tuleks edasisi hindamisi teha 24tunniste vahedega 
kuni 96. tunnini, eeldusel et suremus kontrollkatses ei ületa 10 %.  
Rühma kohta manustatud toidu hulk tuleb kindlaks määrata. 
Töödeldud ja töötlemata toidu tarbimismäärade võrdlemine antud 6 tunni jooksul võib anda teavet töödeldud toidu maitsvuse kohta.
 
Kõik katseperioodi jooksul tuvastatud kõrvalekalded käitumises 
tuleks registreerida.  
1.6.5.  Piirsisalduskatse  
Teatud juhtudel (nt kui eeldatakse, et uuritav aine on madala toksi ­
lisusega) tuleks teha piirsisalduskatse, kasutades 100 μg toimeainet 
mesilase kohta, eesmärgiga näidata, et LD  50 on sellest väärtusest 
suurem. Tuleks kasutada sama menetlust, st seal peaks olema kolm 
dubleerivat katserühma uuritava doosi kohta, asjaomased kontroll ­
katsed, tarbitud töödeldud toidu koguse hindamine ning toksilisuse standardi kasutamine. Kui esineb suremust, tuleks teha täielik uuring. 
Kui täheldatakse subletaalseid mõjusid (vt punkti 1.6.4), tuleks need 
registreerida.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. ANDMED  
Andmed tuleks kokku võtta tabelina, näidates ära iga menetlus ­
rühma, kontrollrühma ja toksilisuse standardi rühma kohta kasutatud 
mesilaste arvu, suremuse iga vaatlusaja kohta ja ebatavalise käitumi ­
sega mesilaste arvu. Suremuse andmeid tuleks analüüsida sobiva statistilise meetodiga (nt probitanalüüs, libisev keskväärtus, binomi ­
aalne tõenäosus) (3, 4). Doosi-reaktsiooni sõltuvused koostatakse iga 
soovitatava vaatlusaja kohta ja arvutatakse kõverate tõusud ning 
letaalse doosi mediaanid (LD
 50 ) 95 % usalduspiiri jaoks. Kontroll ­
rühma suremust võib korrigeerida, kasutades Abbotti korrigeerimist 
(4, 5). Kui töödeldud toit ei ole täielikult tarbitud, tuleks kindlaks 
määrata tarbitud uuritava aine doos rühma lõikes. LD  50 tuleks aval ­
dada uuritava aine μg-des mesilase kohta.  
2.2. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
2.2.1.  Uuritav aine:  
— füüsikaline loomus ning olulised füüsikalis-keemilised omadused 
(nt püsivus vees, aururõhk);  
— keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas struktuurivalem, 
puhtus (st pestitsiidide korral toimeaine(te) loomus ja kontsentrat ­
sioon).  
2.2.2.  Katsealused liigid:  
— teaduslik nimi, tõug, ligikaudne vanus (nädalates), kogumis ­
meetod, kogumise kuupäev;  
— teave katsemesilaste kogumiseks kasutatud kolooniate kohta, 
sealhulgas nende tervisliku seisundi, täiskasvanud isendite haiguste, eelneva ravi jms kohta.
 
2.2.3.  Katsetingimused:  
— katseruumi temperatuur ja suhteline õhuniiskus;  
— pidamistingimused, sealhulgas puuride tüüp, suurus ja materjal;  
— põhi- ja katselahuste valmistamismeetodid (kui kasutatakse 
lahustit, tuleb esitada ka selle nimetus ja kontsentratsioon);  
— katse kavandamine, nt kasutatavad uuritavad kontsentratsioonid 
ja nende arv, kontrollkatsete arv; iga uuritava kontsentratsiooni ja 
kontrollrühma kohta dubleerivate puuride arv ja mesilaste arv 
puuri kohta;  
— katse kuupäev.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Tulemused:  
— kui tehakse esialgse vahemiku leidmise uuring, siis selle tule ­
mused;  
— lähteandmed: suremus iga doosi lõikes igal vaatlushetkel;  
— doosi-reaktsiooni sõltuvuse graafik katse lõpus;  
— LD  50 väärtused 95 % usalduspiiriga iga soovitatava vaatlushetke 
lõikes uuritava aine ja toksilisuse standardi kohta;  
— LD  50 kindlaksmääramiseks kasutatud statistilised menetlused;  
— suremus kontrollrühmades;  
— muu täheldatud või mõõdetud bioloogiline mõju, nt kõrvale ­
kalded mesilaste käitumises (kaasaarvatud uuritavast doosist keel ­
dumine), toidu tarbimise määr töödeldud ja töötlemata rühmades;  
— mis tahes kõrvalekalle siinkirjeldatud katsemenetlustest ja muu 
oluline teave.  
3. VIITED  
1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151–165. March 
1993.
 
2) Gough, H. J., Mclndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, pp. 119–125.
 
3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99–113.
 
4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265–267.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  MESILASED – AKUUTSE KONTAKTTOKSILISUSE KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev akuutse toksilisuse katsemeetod lähtub juhendist OECD 
TG 214 (1998).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev toksilisuse katse on laboratoorne meetod, mis on kavan ­
datud taimekaitsetoodete ja teiste kemikaalide akuutse kontakttoksi ­
lisuse hindamiseks täiskasvanud töömesilastele.  
Ainete toksiliste omaduste hindamisel võib nõuda akuutse kontakt ­
toksilisuse kindlaksmääramist mesilaste puhul, st siis, kui on tõenäo ­
line mesilaste kokkupuutumine antud kemikaaliga. Akuutse kontakt ­
toksilisuse katse tehakse selleks, et kindlaks määrata pestitsiidide ja 
teiste kemikaalide toksilisus mesilastele. Käesoleva katse tulemusi 
tuleks kasutada edasise hindamise vajaduse määramiseks. Täpsemalt võib seda meetodit kasutada programmides, milles pestitsiidide poolt 
mesilastele tekitatud ohte hinnatakse astmeliselt ja mis põhinevad 
järjestikulisel üleminekul toksilisuse laboratoorsete katsete juurest poolväli- ja välikatseteni (1). Pestitsiide võib uurida nii toimeainetena kui ka valmististena.
 
Mesilaste tundlikkuse ja katsemenetluse täpsuse kindlakstegemiseks 
tuleks kasutada toksilisuse standardit.  
1.2. MÕISTED  
Akuutne kontakttoksilisus  – negatiivne mõju, mis ilmneb hiljemalt 
96 tunni jooksul pärast uuritava aine ühe doosi pealekandmist.  
Doos  – pealekantava uuritav aine kogus. Doosi väljendatakse uuritav 
aine massina ( μg) katselooma kohta ( μg/mesilane).  
LD 50 (letaalse doosi mediaan) kontakti korral  – statistiliselt 
saadud aine ühekordne doos, mis võib kontaktmanustamisel põhjus ­
tada surma 50 % isenditest. LD  50 väärtust väljendatakse uuritava 
aine mikrogrammides ( μg) mesilase kohta. Pestitsiidide korral võib 
uuritav aine olla kas toimeaine või valmistis, milles on üks või mitu 
toimeainet.  
Suremus  – isend loetakse surnuks, kui see on täielikult liikumatu.  
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Täiskasvanud töömesilased  (Apis mellifera)  viiakse kokku sobivas 
kandeaines lahustatud uuritava aine erinevate doosidega, kandes need otse rindkerele (tilkadena). Katse kestus on 48 tundi. Kui sure ­
muse määr suureneb 24 h ja 48 h vahel ning kui suremus kontroll ­
rühmas jääb aktsepteeritavale tasemele, st < 10 %, on sobiv katse 
kestust pikendada maksimaalselt 96 tunnini. Suremust registreeri ­
takse iga päev ja võrreldakse kontrollrühmas saadud väärtustega. Tulemused analüüsitakse, et arvutada välja LD
 50 väärtused 24. ja 
48. tunni jaoks ja juhul, kui uuringut pikendatakse, siis ka 72. ja 
96. tunni jaoks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. KATSE VALIIDSUS  
Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused:  
— keskmine suremus kõikides kontrollkatsetes kokku ei tohi katse 
lõpul ületada 10 %;  
— toksilisuse standard LD  50 vastab kõnealusele vahemikule.  
1.5. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.5.1.  Mesilaste kogumine  
Kasutada tuleks sama tõugu noori töömesilasi, st mesilased peaksid 
olema samas vanuses, samamoodi toidetud, sama tõugu jne. Mesi ­
lased peaksid olema pärit piisavalt toidetud, tervetest ja võimalikult 
haigusvabamatest mesilasemaga kolooniatest, millel on tuntud ajalugu ja füsioloogiline staatus. Mesilased tuleks kokku koguda kasutamispäeva hommikul või katsele eelneval õhtul ja hoida katse 
tingimustes järgmise päevani. Sobivad on need mesilased, mis on 
kogutud raamidelt, millel ei ole pesakondi. Tuleks vältida kogumist varakevadel või hilissügisel, kuna mesilaste füsioloogia on sellel ajal muutunud. Kui katse tuleb teha varakevadel või hilissügisel, võib 
mesilastel lasta kooruda inkubaatoris ja neid võib kasvatada ühe 
nädala jooksul „mesilasleival” (kärjest kogutud õietolm) ja sahharoo ­
silahusega. Toksilisuse katses ei tohiks kasutada mesilasi, keda on ravitud keemiliste ainetega, näiteks antibiootikumid, varroatoosivas ­
tased tooted jms, nelja nädala jooksul alates viimase ravimenetluse 
lõpust.
 
1.5.2.  Pidamis- ja söötmistingimused  
Kasutatakse kergesti puhastatavaid ja hästiventileeritud puure. Kasu ­
tada võib mis tahes materjalist, nt roostevabast terasest, traatvõrgust, 
plastmassist puure või ühekordselt kasutatavaid puupuure jms. Katse ­
puuride suurus peaks olema vastavauses mesilaste arvuga, st tagama piisava ruumi. Eelistatav mesilaste arv on kümme mesilast puuri 
kohta.
 
Mesilased tuleks hoida katseruumis pimedas temperatuuril 
25 + 2  o C. Kogu uuringu jooksul tuleks registreerida suhteline 
õhuniiskus, mis normaalselt on ligikaudu 50–70 %. Käitlemismenet ­
lusi, sealhulgas ainega töötlemist ja vaatlusi võib teha (päeva)val ­
guses. Toiduks tuleks kasutada sahharoosi vesilahust, mille lõppkont ­
sentratsioon on 500 g/l (50 massi-/mahuprotsenti) ja seda tuleks anda 
katse jooksul ad libitum, kasutades mesilaste toiteseadet. Selleks võib 
olla klaastoru (ligikaudu 50 mm pikk ja 10 mm läbimõõduga, mille avatud ots kitseneb kuni ligikaudu 2 millimeetrini).
 
1.5.3.  Mesilaste ettevalmistamine  
Pärast kogumist võib mesilased uuritava aine pealepanemiseks 
tuimestada süsinikdioksiidi või lämmastikuga. Kasutatava tuimasti kogus ja kokkupuuteaeg tuleks hoida minimaalsena. Surevaid mesi ­
lasi ei tuleks kasutada ja need asendatakse enne katse algust tervete 
mesilastega.
 
1.5.4.  Dooside ettevalmistamine  
Uuritav aine tuleb peale kanda kandeaines oleva lahusena, st orgaa ­
nilises lahustis või vesilahuses, mis sisaldab märgavat ainet. Orgaa ­
nilise lahustina eelistatakse atsetooni, kuid kasutada võib ka teisi 
mesilastele vähemürgiseid orgaanilisi lahusteid (nt dimetüülforma ­
miidi, dimetüülsulfoksiidi). Vees dispergeeritud valmistitse ja orgaa ­
nilistes kandelahustites mittelahustuvate väga polaarsete orgaaniliste ainete lahuseid on lihtsam kasutada siis, kui need on valmistatud 
müügiloleva märgava aine (nt Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, 
Tween) lahjas lahuses.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Valmistada tuleks sobivad kontroll-lahused, st kui kasutatakse 
lahustit või disperganti uuritava aine lahustamiseks, tuleks kasutada 
kahte iseseisvat kontrollrühma: üks, milles kasutatakse vett ja teine milles kasutatakse lahustit/disperganti.
 
1.6. KATSE KÄIK  
1.6.1.  Katse- ja kontrollrühmad  
Dooside ja uuritud duplikaatide arv peaks vastama statistilistele 
nõuetele LD  50 kindlaksmääramiseks 95 % usalduspiiriga. Tavaliselt 
nõutakse katse jaoks viit doosi geomeetrilises jadas, mille tegur ei 
ületa 2.2 ja mis katavad LD  50 jaoks vajaliku vahemiku. Siiski tuleb 
dooside arv kindlaks määrata vastavalt toksilisuskõvera (doos  vs 
suremus) tõusule ja tulemuste analüüsimiseks valitud statistilisele 
meetodile. Vahemiku kindlaksmääramise katse võimaldab valida välja sobivaid doose.
 
Iga uuritava kontsentratsiooniga lahust tuleks doseerida vähemalt 
kolmele dubleerivale katserühmale, milles igas on 10 mesilast.  
Lisaks katseseeriale tuleks kasutada vähemalt kolme kontrollpartiid, 
milles igaühes on 10 mesilast. Kui kasutatakse orgaanilist lahustit või 
märgavat ainet, tuleb kasutada lahusti või märgava aine kohta kolme täiendavat kontrollpartiid, milles igaühes on 10 mesilast.
 
1.6.2.  Toksilisuse standard  
Katseseerias peab olema ka toksilisuse standard. Eeldatava LD  50 
väärtuse katmiseks tuleks valida vähemalt kolm doosi. Iga uuritavat 
doosi tuleks kasutada vähemalt kolme dubleeriva puuri korral, milles 
igaühes on 10 mesilast. Eelistatav toksilisuse standard on dimetoaat, mille kontaktse LD
 50 dokumenteeritud väärtus 24 tunni jaoks on 
vahemikus 0,10–0,30 μg toimeainet mesilase kohta (2). Siiski võib 
kasutada ka teisi toksilisuse standardeid juhul, kui on võimalik 
hankida piisavalt andmeid, et tõestada eeldatud reaktsiooni doosile (nt paratioon).
 
1.6.3.  Kokkupuude  
1.6.3.1.  Doseerimine  
Tuimestatud mesilastele kantakse uuritavat ainet peale individuaal ­
selt. Mesilased määratakse juhuvaliku alusel erinevatele uuritavatele 
doosidele allutatavatesse rühmadesse ja kontrollrühmadesse. Iga mesilase rindkere selgmisele küljele määritakse peale mikroaplikaa ­
toriga 1 μl uuritavat ainet sobivas kontsentratsioonis sisaldavat 
lahust. Kasutada võib ka muid koguseid, kui see on õigustatud. 
Pärast pealekandmist jagatakse mesilased katsepuuridesse ja neile antakse sahharoosilahust.
 
1.6.3.2.  Kestus  
Katse kestus on eelistatavalt 48 tundi. Kui suremus tõuseb 24 ja 48 
tunni vahel rohkem kui 10 %, tuleks katse kestust pikendada maksi ­
maalselt 96 tunnini eeldusel, et suremus kontrollrühmas ei ületa 
10 %.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Vaatlused  
Suremus registreeritakse 4. tunnil pärast doseerimist ja seejärel 24. ja 
48. tunnil. Kui osutub vajalikuks vaatlusperioodi pikendada, tuleks teha edasisi hindamisi 24tunniste vahedega kuni 96. tunnini eeldusel, 
et suremus kontrollrühmas ei ületa 10 %.
 
Kõik katseperioodi jooksul tuvastatud kõrvalekalded käitumises 
tuleks registreerida.  
1.6.5.  Piirsisalduskatse  
Teatud juhtudel (nt kui eeldatakse, et uuritav aine on madala toksi ­
lisusega) tuleks teha piirsisalduskatse, kasutades 100 μg toimeainet 
mesilase kohta, eesmärgiga näidata, et LD  50 on sellest väärtusest 
suurem. Tuleks kasutada sama menetlust, st seal peaks olema kolm dubleerivat katserühma uuritava doosi kohta, asjaomased kontroll ­
katsed ning toksilisuse standardi kasutamine. Kui esineb suremust, 
tuleks teha täielik uuring. Kui täheldatakse subletaalseid mõjusid (vt punkti 1.6.4), tuleks need registreerida.
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. ANDMED  
Andmed tuleks kokku võtta tabelina, näidates ära iga menetlus ­
rühma, kontrollrühma ja toksilisuse standardi rühma kohta kasutatud 
mesilaste arvu, suremuse iga vaatlusaja kohta ja ebatavalise käitumi ­
sega mesilaste arvu. Suremuse andmeid tuleks analüüsida sobiva statistilise meetodiga (nt probitanalüüs, libisev keskväärtus, binomi ­
aalne tõenäosus) (3, 4). Sõltuvuse doos-reaktsioon koostatakse iga 
soovitatava vaatlusaja (st 24. h, 48. h ja kui kasutatakse, siis ka 72. h ja 96. h) kohta ja arvutatakse kõverate tõusud ning letaalse doosi mediaanid (LD
 50 ) 95 % usalduspiiri jaoks. Kontrollrühma suremust 
võib korrigeerida, kasutades Abbotti korrigeerimist (4, 5). LD  50 
tuleks avaldada uuritava aine μg-des mesilase kohta.  
2.2. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
2.2.1.  Uuritav aine:  
— füüsikaline loomus ning füüsikalis-keemilised omadused (nt 
püsivus vees, aururõhk);  
— keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas struktuurivalem, 
puhtus (st pestitsiidide korral toimeaine(te) loomus ja kontsentrat ­
sioon).  
2.2.2.  Katsealused liigid:  
— teaduslik nimi, tõug, ligikaudne vanus (nädalates), kogumis ­
meetod, kogumise kuupäev;  
— teave katsemesilaste kogumiseks kasutatud kolooniate kohta, 
sealhulgas nende tervisliku seisundi, täiskasvanud isendite 
haiguste, eelneva ravi jms kohta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Katsetingimused:  
— katseruumi temperatuur ja suhteline õhuniiskus;  
— pidamistingimused, sealhulgas puuride tüüp, suurus ja materjal;  
— uuritava aine manustamise meetodid, nt kasutatud kandelahus, 
pealekantud uuritava lahuse ruumala, kasutatud tuimasti;  
— katse kavandamine, nt kasutatud uuritavad doosid ja nende arv, 
kontrollkatsete arv; iga uuritava doosi ja kontrollrühma kohta 
dubleerivate puuride arv ja mesilaste arv puuri kohta;  
— katse kuupäev.  
2.2.4.  Tulemused:  
— kui tehakse esialgse vahemiku leidmise uuring, siis selle tule ­
mused;  
— lähteandmed: suremus iga uuritud kontsentratsiooni kohta igal 
vaatlushetkel;  
— doosi-reaktsiooni sõltuvuse graafik katse lõpus;  
— LD  50 väärtused 95 % usalduspiiriga iga soovitatava vaatlushetke 
lõikes uuritava aine ja toksilisuse standardi kohta;  
— LD  50 kindlaksmääramiseks kasutatud statistilised menetlused;  
— suremus kontrollrühmades;  
— muu täheldatud või mõõdetud bioloogiline mõju ja mesilaste mis 
tahes ebatavalised reaktsioonid;  
— mis tahes kõrvalekalded siinkirjeldatud katsemeetodi menetlustest 
ja muu oluline teave.  
3. VIITED  
1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151–165. March 
1993.
 
2) Gough, H. J., Mclndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981–1992. Journal of 
Apicultural Research 22, pp. 119-125.
 
3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99–113.
 
4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265–267.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  ADSORPTSIOON/DESORPTSIOON, KASUTADES PARTII 
TASAKAALUSTAMISE MEETODIT  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub OECD juhendist TG 106 mulla 
adsorptsiooni/desorptsiooni määramiseks, kasutades partii tasakaalus ­
tamise meetodit (2000).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev meetod võtab arvesse nii laboritevahelist võrdlust, adsorpt ­
sioonikatse tegemise jaoks mulla valikut puudutavat seminari (1, 2, 3, 4) kui ka riiklikul tasandil olemasolevaid juhiseid (5, 6, 7, 8, 9, 
10, 11).
 
Adsorptsiooni-/desorptsiooniuuringutest saadakse vajalikku teavet 
kemikaalide liikuvuse ja jaotumise kohta biosfääri maa-, vee- ja 
õhukihtides (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Seda teavet võib kasutada näiteks selleks, et prognoosida või hinnata kemikaalide 
lagunemist (22, 23), muundumist või organismide poolt omastamist 
(24), leostumist läbi mullakihtide (16, 18, 19, 21, 25, 26, 27, 28), lenduvust mullast (21, 29, 30) või uhtumist maapinnalt looduslikku vette (18, 31, 32). Adsorptsiooni puudutavaid andmeid võib kasutada 
võrdlemiseks ja modelleerimiseks (19, 33, 34, 35).
 
Kemikaali jagunemine mulla- ja vesifaasi vahel on keeruline prot ­
sess, mis sõltub paljudest erinevatest teguritest: aine keemilisest 
iseloomust (12, 36, 37, 38, 39, 40), mulla omadustest (4, 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49) ja kliimateguritest, nagu näiteks sademed, temperatuur, päikesevalgus ja tuul. Seega ei saa 
kemikaali mullal toimuva adsorptsiooniprotsessiga seotud paljusid 
erinevaid nähtusi ja mehhanisme täielikult määratleda lihtsustatud laboratoorse mudeli, näiteks käesoleva meetodi abil. Olenemata 
sellest, et käesoleva meetodiga ei ole võimalik katta kõiki kesk ­
konnas võimalikke juhtusid, annab see siiski väärtuslikku teavet kemikaali adsorptsiooni olulisuse kohta keskkonnale.
 
Vt ka üldist sissejuhatust.  
1.2. REGULEERIMISALA  
Selle meetodi eesmärk on kindlaks määrata kemikaalide 
adsorptsioon/desorptsioon mullas. Eesmärk on saada sorptsiooni ­
väärtus, mida saab kasutada jaotumuse prognoosimiseks erinevates 
keskkonnatingimustes; selleks määratakse kindlaks kemikaali tasa ­
kaalulised adsorptsioonitegurid erinevatele muldadele mullaomaduste funktsioonina (nt orgaanilise süsiniku sisaldus, savisisaldus, mullas ­
truktuur ja pH). Võimalikult laia konkreetse aine ja looduslike 
muldade vastastikuse mõju hõlmamiseks tuleb kasutada erinevaid 
mullatüüpe.
 
Käesolevas meetodis tähendab adsorptsioon kemikaali kinnitumis ­
protsessi mulla pinnale; selles ei eristata erinevaid adsorptsiooniprot ­
sesse (füüsikaline ja keemiline adsorptsioon) ega selliseid protsesse nagu pindkatalüseeritud lagunemine, koguadsorptsioon või keemiline 
reaktsioon. Mulla tekitatud kolloidosakestes (läbimõõduga < 0,2 μm) 
toimunud adsorptsiooni ei võeta arvesse.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Mullaparameetrid, mida peetakse adsorptsiooni puhul kõige tähtsama ­
teks, on: orgaanilise süsiniku sisaldus (3, 4, 12, 13, 14, 41, 43, 44, 45, 
46, 47, 48), savisisaldus ja mullastruktuur (3, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48) ning pH ioniseerivate ühendite jaoks (3, 4, 42). Muud mulla parameetrid, mis võivad mõjutada konkreetse aine adsorptsiooni/ ­
desorptsiooni, on efektiivne katioonide neelamismahutavus (ECEC), 
amorfse raua ja alumiiniumoksiidide sisaldus, eriti vulkaaniliste ja troopiliste muldade puhul (4), ja samuti eripindala (49).
 
Katse eesmärk on määrata kemikaali adsorptsioon erinevates mulla ­
tüüpides, millel on erinev orgaanilise süsiniku sisaldus, savisisaldus, 
mullastruktuur ja pH. See koosneb kolmest tasemest:  
1. tase : eelkatse, et teha kindlaks:  
— mulla/lahuse suhe:  
— adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise aeg ja adsor ­
beerunud uuritava aine kogus tasakaaluolekus;  
— uuritava aine adsorbeerumine katseanumate pindadel ja 
uuritava aine püsivus katseperioodi jooksul.  
2. tase : sõeluuring: adsorptsiooni uuritakse viie erineva mullatüübi 
puhul, kasutades adsorptsioonikineetikat ühel kontsentrat ­
sioonil ja määrates jaotustegurid K  d ja K  oc . 
3. tase : Freundlichi adsorptsiooniisotermide määramine, et oleks 
võimalik määrata kontsentratsiooni mõju mullas toimuva 
adsorptsiooni ulatusele.  
Desorptsiooniuuring, kasutades desorptsioonikineetikat/ ­
Freundlichi desorptsiooniisoterme (1. liide).  
1.3. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Tähis Mõiste Ühikud  
A t i adsorptsiooniprotsent ajahetkel t  i % 
A eq adsorptsiooniprotsent adsorptsiooni tasakaaluolekus %  
m ads 
s ðt i Þ mullal adsorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel t  i μg 
m ads 
s ðΔt i Þ mullal adsorbeerunud uuritava aine mass ajavahemikus Δt i μg 
m ads 
s ðeqÞ mullal adsorbeerunud uuritava aine mass adsorptsiooni 
tasakaaluolekus μg 
m 0 uuritava aine mass katseklaasis adsorptsioonikatse alguses μg 
m ads 
m ðt i Þ uuritava aine mass, mõõdetud alikvoodis ( v A 
a ) ajahetkel t  i μg 
m ads 
aq ðeqÞ aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus μg 
m soil mullafaasi kogus, väljendatud mulla kuivmassina g  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Tähis Mõiste Ühikud  
C st aine põhilahuse mas sikontsentratsioon μg cm  -3 
C 0 mullaga kokkupuutuva katselahuse esialgne massikontsen ­
tratsioon μg cm  -3 
C ads 
aq ðt i Þ aine massikontsentratsioon vesifaasis analüüsi tegemise 
ajahetkel t  i μg cm  -3 
C ads 
s ðeqÞ mullal adsorbeerunud aine sisaldus adsorptsiooni tasakaa ­
luolekus μg cm  -1 
C ads 
aq ðeqÞ aine massikontsentratsioon vesifaasis adsorptsiooni tasa ­
kaaluolekus μg cm  -3 
V 0 adsorptsioonikatse jooksul mullaga kokkupuutuva vesifaasi 
esialgne ruumala cm 3 
v A 
a alikvoodi ruumala, milles uuritavat ainet mõõdetakse cm  3 
K d adsorptsiooni jaotustegur cm  3 g -1 
K oc orgaanilise süsiniku suhtes normaliseeritud adsorptsiooni ­
tegur cm 3 g -1 
K om orgaanilise ainese suhtes normaliseeritud jaotustegur cm  3 g -1 
K ads 
F Freundlichi adsorptsioonitegur μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g –1 
1/n Freundlichi eksponent  
D t i desorptsiooniprotsent ajahetkel t  i % 
D Δt i desorptsiooniprotsent, mis vastab ajavahemikule Δt i % 
K des ilmne desorptsioonitegur cm  3 g –1 
K F des Freundlichi desorptsioonitegur μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g –1 
m des 
aq ðt i Þ mullast desorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel t  i μg 
m des 
aq ðΔt i Þ mullast ajavahemikus Δt i desorbeerunud uuritava aine 
mass μg 
m des 
m ðeqÞ aine analüütiliselt määratud mass vesifaasis desorptsiooni 
tasakaaluolekus μg 
m des 
aq ðeqÞ desorbeerunud uuritava aine kogumass desorptsiooni tasa ­
kaaluolekus μg 
m des 
s ðΔt i Þ aine mass, mis jääb mullale adsorbeerununa pärast ajava ­
hemiku Δt i möödumist μg 
m A 
aq osalisest ruumala asendusest tingitud ülejääva aine mass 
adsorptsiooni tasakaaluolekus μg 
C des 
s ðeqÞ mullale jääv adsorbeerunud uuritava aine sisaldus 
desorptsiooni tasakaaluolekus μg g  –1 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Tähis Mõiste Ühikud  
C des 
aq ðeqÞ uuritava aine massikontsentratsioon vesifaasis desorpt ­
siooni tasakaaluolekus μg cm  –3 
V T desorptsioonikineetika määramisel jadameetodiga mullaga 
kokku puutuva vesifaasi koguruumala cm 3 
V R adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise järel katseklaasist 
eemaldatud supernatandi ruumala, mis asendatakse sama 
ruumala 0,01 M CaCl  2 lahusega cm 3 
v a D desorptsioonikineetika määramisel jadameetodiga analüüti ­
lisel eesmärgil ajahetkel (i) võetud alikvoodi ruumala cm 3 
V ra i D uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist (i) võetud lahuse 
desorptsioonikineetika ruumala (paralleelmeetod) cm 3 
V r F uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist võetud lahuse 
ruumala desorptsiooni tasakaaluolekus cm 3 
MB massitasakaal % 
m E mullast ja katseanuma seintelt kahes etapis ekstraheeritud 
uuritava aine kogumass μg 
V rec adsorptsiooni tasakaaluoleku järel regenereeritud superna ­
tandi ruumala cm 3 
P ow jaotustegur oktanool/vesi 
pKa dissotsiatsioonikonstant 
S w lahustuvus vees g l  -1 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Uuritava aine lahuste teadaolevad ruumalad, märgistamata või radio ­
märgistatud, teadaolevate kontsentratsioonidena 0,01 M CaCl  2 -s lisa­
takse teadaoleva kuivmassiga mullaproovidele, mis on eeltasakaalus ­
tatud 0,01 M CaCl  2 -s. Segu segatakse piisava aja jooksul. Seejärel 
eraldatakse mullasuspensioonid tsentrifuugimise ja soovi korral 
filtreerimise teel ning analüüsitakse vesifaasi. Mullaproovile adsor ­
beerunud uuritava aine kogus arvutatakse algselt lahuses esinenud uuritava aine koguse ja katse lõpus järelejäänud uuritava aine koguse 
vahena (kaudne meetod).
 
Alternatiivina võib adsorbeerunud uuritava aine koguse määrata ka 
otse mullaanalüüsi teel (otsene meetod). Menetlust, mis sisaldab 
mulla astmelist eraldamist sobiva lahustiga, soovitatakse siis, kui aine kontsentratsiooni vahet lahuses ei ole võimalik täpselt määrata. Sellised juhud on näiteks: uuritava aine adsorptsioon katseanuma 
pinnale, uuritava aine ebastabiilsus katse tegemise jooksul, nõrk 
adsorptsioon, mis põhjustab lahuses vaid väikese kontsentratsiooni ­
muutuse; ja tugev adsorptsioon, mis põhjustab madala kontsentrat ­
siooni, mida ei ole võimalik täpselt määrata. Radiomärgistatud aine 
kasutamisel võib mulla eraldamise ära jätta, kui tehakse mullafaasi 
analüüs, kasutades põlemist ja vedelikstsintillatsiooniloendust. Vede ­
likstsintillatsiooniloendus on siiski mittespetsiifiline tehnika, millega ei saa teha vahet lähteainetel ja muundatud toodetel, seepärast tuleks 
seda kasutada ainult siis, kui uuritav aine on püsiv kogu uuringu 
jooksul.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. TEAVE UURITAVA AINE KOHTA  
Keemilised reaktiivid peavad olema analüütiliselt puhtad. Soovita ­
takse kasutada märgistamata uuritavaid aineid, mille koostis on teada ja mille puhtusaste on eelistatavalt vähemalt 95 %, või radio ­
märgistatud uuritavaid aineid, mille koostis ja radioaktiivsete isotoo ­
pide puhtusaste on teada. Kui märgistusainete poolestusaeg on lühike, tuleks kohaldada lagunemise korrigeerimist.
 
Enne adsorptsiooni-desorptsioonikatse tegemist peab uuritava aine 
kohta olema kättesaadav järgmine teave:  
a) lahustuvus vees (A.6);  
b) aururõhk (A.4) ja/või Henry konstant;  
c) abiootiline lagunemine: hüdrolüüs pH funktsioonina (C.7);  
d) jaotustegur (A.8);  
e) kiire biolagunduvus (C.4) või aeroobne ja anaeroobne muundu ­
mine mullas;  
f) ioniseerivate ainete pKa;  
g) otsene fotolüüs vees (st UV-Vis absorptsioonispekter vees, kvant ­
saagis) ja fotodegradatsioon mullas.  
1.6. KATSE KASUTATAVUS  
Katset kasutatakse keemiliste ainete puhul, mille kohta on olemas 
piisava täpsusega analüüsimeetod. Uuritava aine püsivus katse jooksul on tähtis parameeter, mis võib mõjutada tulemuste usaldata ­
vust, eriti kui kasutatakse kaudset meetodit. Seega tuleb aine püsi ­
vust kontrollida eeluuringuga; kui katse tegemise jooksul tuvasta ­
takse muundumine, soovitatakse põhiuuringu tegemiseks kasutada 
nii mulla- kui ka vesifaasi analüüsi.
 
Raskused võivad tekkida siis, kui katse tegemisel kasutatakse madala 
veeslahustuvusega uuritavaid aineid (S  w < 10  –4 g l -1 ) või suure 
laenguga aineid, kuna kontsentratsiooni vesifaasis ei ole võimalik 
analüütiliselt mõõta piisava täpsusega. Sellisel juhul tuleb võtta lisa ­
meetmeid. Juhised selliste probleemide korral käitumiseks esitatakse käesoleva meetodi asjakohastes jagudes.
 
Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleb hoolitseda selle eest, et uuringu 
jooksul ei tekiks kadusid.  
1.7. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.7.1.  Seadmed ja keemilised reaktiivid  
Harilik laboratooriumivarustus, eelkõige järgmine.  
a) Katseklaasid või anumad katsete tegemiseks. On oluline, et katse ­
klaasid või anumad:  
— sobiksid vahetult tsentrifuugi, et minimeerida käitlemisest ja 
ümberpaigutamisest tuleneda võivaid vigu;  
— oleksid tehtud inertsest materjalist, mis muudab uuritava aine 
adsorbeerumise nende pinnal minimaalseks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) Raputi: rippraputi või samalaadne seade; raputi peab raputamise 
ajal hoidma mulda suspensioonis.  
c) Tsentrifuug: eelistatavalt suure kiirusega, nt tsentrifugaaljõuga > 
3 000 g, reguleeritava temperatuuriga, võimeline eemaldama vesi ­
lahusest osakesi, mille läbimõõt on suurem kui 0,2 μm. Kontei ­
nerid peavad raputamise ja tsentrifuugimise jooksul olema 
suletud, et vältida ainete lenduvust ja veekadu; korkidele tekkiva adsorbeerumise minimeerimiseks tuleb kasutada deaktiveeritud korke, näiteks Teflon®iga kaetud keeratavad korgid.
 
d) Pole kohustuslik: filtreerimisseade; poorsusega 0,2 μm, steriilsed 
ja ühekordselt kasutatavad filtrid. Eriti tähelepanelikult tuleks valida filtri materjal, et vältida uuritava aine kadu sellesse; nõrgalt 
lahustuvate uuritavate ainete korral ei soovitata kasutada orgaani ­
list filtrimaterjali.
 
e) Analüüsivahendid, mis sobivad uuritava kemikaali kontsentrat ­
siooni mõõtmiseks.  
f) Laboratooriumiahi, mis on suuteline säilitama temperatuuri 
103–110  o C. 
1.7.2.  Mulla iseloomustamine ja valik  
Mulda tuleks iseloomustada kolme parameetri abil, mida peetakse 
enamasti vastutavaks adsorptsioonimahtuvuse eest: orgaaniline süsinik, savisisaldus ja mullastruktuur ning pH. Nagu juba nimetatud (vt „Reguleerimisala”), võivad ka muud mulla füüsikalis-keemilised 
omadused mõjutada konkreetse aine adsorptsiooni/desorptsiooni ja 
neid tuleks sellisel juhul arvestada.
 
Mulla iseloomustamisel on kasutatavad meetodid väga olulised ja 
need võivad tulemusi märkimisväärselt mõjutada. Seetõttu soovita ­
takse mulla pH-d mõõta 0,01 M CaCl  2 lahuses (st lahuses, mida 
kasutatakse adsorptsiooni-/desorptsioonikatses) vastava ISO meetodi (ISO-10390-1) kohaselt. Samuti soovitatakse teised olulised mulla 
omadused määrata vastavalt standardmeetoditele (nt ISO „Handbook 
of Soil Analysis”); see võimaldab kasutada sorptsiooniandmete analüüsi, tuginedes ülemaailmselt standarditud mullaparameetritele. Mõned olemasolevate mulla analüüsimise ja iseloomustamise stan ­
dardmeetodite juhised on esitatud viidetes (50–52). Mulla katsemee ­
todite kaliibrimiseks soovitatakse kasutada võrdlusmulda.
 
Juhised muldade valimiseks adsorptsiooni-/desorptsioonikatsete jaoks 
esitatakse tabelis 1. Seitse väljavalitud mulda hõlmavad erinevaid 
parasvöötme mullatüüpe. Ioniseeruvate uuritavate ainete jaoks peavad väljavalitud mullad hõlmama laia pH vahemikku, et oleks võimalik hinnata aine adsorptsiooni ioniseeritud ja ioniseerimata 
vormides. Juhised selle kohta, mitut erinevat mulda katse erinevates 
etappides kasutada, on esitatud punktis 1.9 „Katse käik”.
 
Kui eelistatakse teisi mullatüüpe, tuleks neid iseloomustada samade 
parameetritega ja neil peaks olema samalaadne omaduste varieeruvus 
nagu tabelis 1 kirjeldatud tüüpidel, isegi kui need ei vasta täpselt 
kriteeriumidele.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabel 1  
Juhised mullaproovide valimiseks adsorptsiooni-desorptsiooni jaoks  
Mullatüüp pH-vahemik (0,01 M 
CaCl  2 lahuses) Orgaanilise süsiniku 
sisaldus (%) Savisisaldus (%) Mulla struktuur (  1 ) 
1 4,5–015,5 1,0–2,0 65–80 savi 
2 > 7,5 3,5–5,0 20–40 gleistunud saviliiv 3 5,5–7,0 1,5–3,0 15–25 ladestunud saviliiv 
4 4,0–5,5 3,0–4,0 15–30 saviliiv 
5 < 4,0–6,0 (
 2 ) < 0,5–1,5 (  2 ), (  3 ) < 10–15 (  2 ) saviliivane liiv 
6 > 7,0 < 0,5–1,0 (  2 ), (  3 ) 40–65 gleistunud saviliiv/ ­
savi 
7 < 4,5 > 10 < 10 liiv/saviliivane liiv  
( 1 ) Vastavalt FAO ja US süsteemile (85). 
( 2 ) Vastavad muutujad peaksid eelistatavalt jääma esitatud vahemikku. Kui sobivat mullamaterjali on siiski raske leida, 
aktsepteeritakse ka märgitud miinimumist väiksemaid väärtusi. 
( 3 ) Mullad, mille orgaanilise süsiniku sisaldus on alla 0,3 %, võivad häirida orgaanilise aine sisalduse ja adsorptsiooni 
vahelist korrelatsiooni. Seetõttu on soovitatav kasutada muldasid, mille minimaalne orgaanilise süsiniku sisaldus on 
0,3 %.  
1.7.3.  Mullaproovide kogumine ja ladustamine  
1.7.3.1.  Kogumine  
Ei soovitata mingeid konkreetseid proovivõtmise tehnikaid ega 
vahendeid; proovivõtmise tehnika sõltub uuringu eesmärgist (53, 54, 55, 56, 57, 58).
 
Arvestada tuleks järgmist:  
a) vajalik on üksikasjalik teave väliplatsi ajaloo kohta; see sisaldab 
asukohta, taimkatet, pestitsiidide ja/või väetiste kasutamist, 
bioloogilisi lisandeid või juhuslikku reostust. Tuleks järgida ISO standardi soovitusi mullaproovide võtmiseks (ISO 10381-6) vastavalt proovivõtmise ala kirjeldusele;
 
b) proovivõtukohta tuleb määratleda vastavalt UTM-ile (Universal 
Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) või geograafilistele koordinaatidele; see võimaldab tulevikus konkreetset mulda uuesti koguda või aidata määratleda mulda 
erinevates riikides kasutatavate erinevate klassifitseerimissüstee ­
mide alusel. Samuti tuleks koguda ainult A-kihist kuni 20 cm sügavuselt. Eriti mullatüübi nr 7 korral, kui mullas esineb O
 h - 
kiht, tuleks see lisada proovile.  
Mullaproovid tuleks transportida konteinerites ja sellistel temperatuu ­
ritingimustel, mis tagavad, et mulla esialgsed omadused märkimis ­
väärselt ei muutu.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Ladustamine  
Eelistatakse mulda, mis on värskelt proovivõtualalt võetud. Ainult 
siis, kui see ei ole võimalik, võib mulda ladustada toatemperatuuril ja seda tuleks hoida õhukuivana. Ladustamisaega ei piirata, kuid üle 
kolme aasta ladustatud mulda tuleks enne kasutamist uuesti analüü ­
sida orgaanilise süsiniku sisalduse, pH ja katioonide neelamismahu ­
tavuse (CEC) suhtes.
 
1.7.3.3.  Mullaproovide käitlemine ja ettevalmistamine uuringuks  
Muld kuivatatakse õhu käes toatemperatuuril (eelistatavalt vahemikus 
20–25  o C). Kogused tuleks jaotada võimalikult ettevaatlikult, nii et 
mulla struktuur muutuks nii vähe kui võimalik. Muld sõelutakse kuni 
osakeste suuruseni ≤ 2 mm; sõelumisprotsessi puhul tuleks järgida 
ISO standardi soovitusi mullaproovide võtmiseks (ISO 10381-6). Soovitatakse hoolikat homogeenimist, sest see suurendab tulemuste reprodutseeritavust. Iga mulla niiskusesisaldus määratakse kindlaks 
kolme alikvoodiga, mida kuumutatakse temperatuuril 105
 o C, kuni 
märgatavat massimuutust enam ei esine (ligikaudu 12 tundi). Kõikide arvutuste puhul tähendab mulla mass ahjukuiva massi, st mulla massi, mis on korrigeeritud niiskusesisaldusega.
 
1.7.4.  Uuritava aine mullale lisamiseks ettevalmistamine  
Uuritav aine lahustatakse 0,01 M CaCl  2 destilleeritud või deionisee ­
ritud vee lahuses; CaCl  2 lahust kasutatakse kui vesilahuse faasi, et 
parandada tsentrifuugimist ja minimeerida katioonide neelamist. 
Põhilahuse kontsentratsioon peaks eelistatavalt olema kolm suurus ­
järku kõrgem kui kasutatava analüüsimeetodi avastamispiir. See lävi kaitseb mõõtmise täpsust vastavalt käesolevas meetodis kasutatavale metoodikale; lisaks sellele peaks põhilahuse kontsentratsioon olema 
allpool uuritava aine lahustuvuse piiri vees.
 
Põhilahus tuleks eelistatavalt ette valmistada vahetult enne selle lisa ­
mist mullaproovidele ja seda tuleks hoida suletuna pimedas tempe ­
ratuuril 4  o C. Hoiuaeg sõltub uuritava aine püsivusest ja selle kont ­
sentratsioonist lahuses.  
Ainult halvasti lahustuvate ainete puhul (S  w < 10  –4 g l -1 ) võib 
osutuda vajalikuks kasutada sobivat solubiliseerivat ainet, kui uuri ­
tavat ainet on raske lahustada. See solubiliseeriv aine: a) peaks 
segunema veega, nagu näiteks metanool või atsetonitriil; b) selle 
kontsentratsioon ei tohiks ületada 1 % põhilahuse koguruumalast ja peaks moodustama alla selle määra uuritava aine lahuses, mis puutub kokku mullaga (eelistatavalt alla 0,1 %); ja c) ei tohiks olla pindak ­
tiivne aine ega osaleda solvolüüsis uuritavate kemikaalidega. Solu ­
biliseeriva aine kasutamine tuleks sätestada ja uuringuaruandes ära põhjendada.
 
Teine võimalus halvasti lahustuvate ainete jaoks on uuritava aine 
lisamine uuritavasse süsteemi süstitavate portsjonite kaupa: uuritav aine lahustatakse orgaanilises lahustis, selle alikvoot lisatakse mullast 
ja 0,01 M CaCl
 2 lahusest destilleeritud või deioniseeritud veest koos ­
nevasse süsteemi. Orgaanilise lahusti sisaldus vesifaasis tuleks hoida võimalikult madalal, tavaliselt mitte üle 0,1 %. Spaikimine orgaani ­
lisest lahusest võib mõjutada negatiivselt mahu reprodutseeritavust. 
Seega on võimalik täiendava vea esinemine, kui uuritava aine ja 
kaaslahusti kontsentratsioonid ei ole samad kõikides katsetes.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. ADSORPTSIOONI-/DESORPTSIOONIKATSE TEGEMISE 
EELDUSED'  
1.8.1.  Analüüsimeetod  
Kõige tähtsamad parameetrid, mis võivad mõjutada sorptsiooni 
määramise täpsust, on nii lahuse-kui adsorptsioonifaaside analüüsi ­
misel kasutatava analüüsimeetodi täpsus, uuritava aine püsivus ja puhtus, sorptsiooni tasakaaluoleku püstitumine, lahuse kontsentrat ­
sioonimuutuse suurus, mulla/lahuse suhe ja muutused mulla struk ­
tuuris tasakaaluprotsessi jooksul (35, 59–62). 2. liites esitatakse 
mõningad näited täpsust puudutavate küsimuste kohta.
 
Kasutatud analüüsimeetodi usaldusväärsust tuleb kontrollida sellises 
kontsentratsioonivahemikus, mis võib tõenäoliselt esineda uuringu 
käigus. Uuringu läbiviija võib vabalt välja töötada sobiva meetodi 
koos asjakohase täpsuse, kordustäpsuse, reprodutseeritavuse, avasta ­
mispiiride ja regenereeritavusega. Juhised sellise uuringu tegemiseks antakse allpool kirjeldatud katsega.
 
Sobiv ruumala 0,01 M CaCl  2 lahust, nt 100 cm  3 , segatakse 4 tunni 
jooksul mulla kogusega (nt 20 g), mille adsorptsioonivõime on 
kõrge, st millel on kõrge süsiniku- ja savisisaldus; need kogused ja ruumalad võivad varieeruda sõltuvalt analüüsi tingimustest, kuid alguspunktiks on sobiv mulla/lahuse suhe 1:5. Segu tsentrifuugitakse 
ja vesifaasi võib filtreerida. Viimasele lisatakse teatav ruumala uuri ­
tava aine põhilahust, et saavutada nominaalne kontsentratsioon selles kontsentratsioonivahemikus, mis võib katse käigus tõenäoliselt esineda. See ruumala ei tohiks olla suurem kui 10 % vesifaasi lõpli ­
kust ruumalast, et võimalikult vähem muuta tasakaaluolekueelse 
lahuse omadusi. Lahust analüüsitakse.
 
Tuleb teha ka üks pimekatse ainult mulla ja CaCl  2 lahusega (ilma 
uuritava aineta), et oleks võimalik kontrollida analüüsimeetodist tule ­
nevaid artefakte ja pinnasest põhjustatud maatriksefekte.  
Analüüsimeetodid, mida võib kasutada sorptsiooni määramiseks, 
on gaasikromatograafia (GLC), kõrgsurvevedelikkromato ­
graafia (HPLC), spektromeetria (nt GC/massispektromeetria, HPLC/massispektromeetria) ja vedelikstsintillatsiooniloendus (radio ­
märgistatud ainete puhul). Kasutatavast analüüsimeetodist sõltumata 
loetakse sobivaks, kui taastumine jääb vahemikku 90–110 % nomi ­
naalväärtusest. Selleks, et võimaldada pärast jaotamist tulemust kind ­
laks määrata ja hinnata, peavad analüüsimeetodi avastamispiirid olema vähemalt kaks suurusjärku allpool nominaalset kontsentrat ­
siooni.
 
Adsorptsiooniuuringute tegemisel kasutatava analüüsimeetodi 
omadustel ja avastamispiiridel on katsetingimuste kindlaksmäära ­
misel oluline roll ja need mõjutavad kogu katse tulemusi. Kõnealuse meetodiga järgitakse üldiseid katsete tegemise reegleid ja sellega 
antakse soovitused ning juhtnöörid alternatiivsete lahenduste jaoks, 
kui analüüsimeetod ja laboratoorsed võimalused jäävad kitsaks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Optimaalsete mulla/lahuse suhete valimine  
Sobivate mulla/lahuse suhete valik sorptsiooniuuringute jaoks sõltub 
jaotustegurist K  d ja soovitavast suhtelisest adsorptsioonimäärast. 
Aine kontsentratsiooni muutus lahuses määrab ära adsorptsiooni 
võrrandil põhinevate määramiste statistilise täpsuse ja analüüsimee ­
todi piiri kemikaali kindlaksmääramisel lahuses. Seetõttu on üldises praktikas kasulik keskenduda mõnele fikseeritud suhtele, mille puhul adsorbeerumise protsent on üle 20 % ja soovitatavalt > 50 % (62), 
hoolitsedes samal ajal selle eest, et uuritava aine kontsentratsioon 
vesifaasis oleks selle täpseks määramiseks piisavalt kõrge. See on eriti oluline siis, kui adsorptsiooniprotsent on kõrge.
 
Otstarbekas lähenemine sobivate mulla/vee suhete valimiseks põhineb 
K d väärtuse hindamisel kas eeluuringute käigus või kindlaksmääratud 
hindamistehnikate abil (3. liide). Seega võib sobiva suhte valimine põhineda K
 d funktsioonina esitatud mulla/lahuse suhte graafiku põhjal 
fikseeritud adsorptsiooniprotsentidel (joonis 1). Selles graafikus eelda ­
takse, et adsorptsioonivõrrand on lineaarne. (  1 ) Kasutatav sõltuvus 
saadakse K  d avaldise (4) teisendamisel võrrandi (1) vormi:  
V 0 
m soil ¼ Í m 0 
m ads s ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
Või selle logaritmilisse vormi eeldades, et R = m  soil /V 0 ja A  eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Joonis 1.  Mulla/lahuse suhete ja K  d vaheline suhe uuritava aine 
erinevate adsorptsiooniprotsentide juures.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C ads 
s ðeqÞ ¼ K d ·C ads 
aq ðeqÞ
 Joonisel 1 esitatakse vajalikud mulla/lahuse suhted K  d funktsioonina 
erinevate adsorptsiooniastmete jaoks. Näiteks kui mulla/lahuse suhe 
on 1:5 ja K  d on 20, esineb ligikaudu 80 %ne adsorptsioon. Selleks, 
et sama K  d korral saada 50 %st adsorptsiooni, tuleb kasutada suhet 
1:25. Käesolev lähenemisviis sobivate mulla/lahuse suhete valimi ­
seks võimaldab uurijal paindlikult eksperimendi vajadustega arves ­
tada.  
Raskemini käsitletavad olukorrad on sellised, kus kemikaali adsorpt ­
sioon on väga tugev või nõrk. Madala adsorptsiooni korral on soovi ­
tatav kasutada mulla ja lahuse vahekorda 1:1, kuigi mõnede väga 
orgaanilist tüüpi muldade puhul võib suspensiooni saamiseks osutuda vajalikuks väiksem suhe. Lahuses väikeste kontsentratsioonimuutuste määramiseks kasutatava analüüsimeetodi korral tuleb olla ettevaatlik, 
vastasel korral võib adsorptsiooni määramine olla ebatäpne. Teisest 
küljest, kui jaotustegurid K
 d on väga kõrged, võib mulla/lahuse suhe 
tõusta kuni 1:100, et lahusesse jääks märkimisväärne kogus kemi ­
kaali. Siiski tuleb hoolitseda korraliku segamise eest ning süsteemile 
tuleb tasakaalu püstitumiseks anda piisavalt aega. Alternatiivseks 
lähenemiseks selliste ekstreemsete juhtudega tegelemisel, kui sobiv analüüsimeetod puudub, on prognoosida Kd väärtus, kasutades selli ­
seid hindamistehnikaid, mis põhinevad näiteks P
 ow väärtustel (3. 
liide). See võiks olla eriti kasulik nõrgalt adsorbeeruvate/polaarsete 
kemikaalide korral, mille P  ow < 20, ja lipofiilsete/väga sorbeeruvate 
kemikaalide korral, mille P  ow > 104.  
1.9. KATSE KÄIK  
1.9.1.  Katsetingimused  
Kõik katsed tehakse toatemperatuuril ja võimaluse korral konstantse 
temperatuuri juures, mis jääb vahemikku 20–25  o C. 
Tsentrifuugimisega peaks olema võimalik eraldada lahusest 
suuremad kui 0,2 μm suurused osakesed. Selle väärtusega tähista ­
takse väikseimat tahke osakese suurust ja see on piirväärtuseks 
tahkete ja kolloidosakeste vahel. Tsentrifuugimise tingimuste kind ­
laksmääramise juhised esitatakse 4. liites.  
Kui tsentrifuugimisega ei ole võimalik tagada suuremate kui 0,2 μm 
suuruste osakeste eraldamist, tuleks kasutada tsentrifuugimise ja 
0,2 μm suurusega filtreid kasutava filtreerimise kombinatsiooni. 
Need filtrid peaksid olema tehtud sobivast inertsest materjalist, et vältida uuritava aine kadu nendesse. Igal juhul tuleks tõestada, et filtreerimise jooksul ei esine uuritava aine kadu.
 
1.9.2.  1. tase – eeluuring  
Eeluuringu eesmärk on esitatud jaos „Reguleerimisala”. Juhised 
sellise uuringu ettevalmistamiseks esitatakse allpool kirjeldatud 
katsega.  
1.9.2.1.  Optimaalsete mulla/lahuse suhete valimine  
Kasutatakse kahte mullatüüpi ja kolme mulla/lahuse suhet (kuus 
katset). Ühel mullatüübil on kõrge orgaanilise süsiniku sisaldus ja 
madal savisisaldus ning teisel on madal orgaanilise süsiniku sisaldus 
ja kõrge savisisaldus. Soovitatakse järgmisi mulla/lahuse suhteid:  
— 50 g mulda ja 50 cm  3 uuritava aine vesilahust (suhe 1/1);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g mulda ja 50 cm  3 uuritava aine vesilahust (suhe 1/5);  
— 2 g mulda ja 50 cm  3 uuritava aine vesilahust (suhe 1/25).  
Minimaalne mulla kogus, mida võib katses kasutada, sõltub labora ­
tooriumi võimalustest ja kasutatavate analüüsimeetodite võimelisu ­
sest. Siiski soovitatakse kasutada vähemalt 1 g ja eelistatavalt 2 g, et uuringu tulemused oleksid usaldusväärsed.
 
Ühte kontrollproovi, milles on ainult uuritav aine 0,01 M CaCl  2 
lahuses (ilma mullata), käideldakse täpselt samamoodi kui katsesüs ­
teemigi, et kontrollida uuritava aine püsivust CaCl  2 lahuses ja selle 
võimalikku adsorptsiooni katseanumate seintele.  
Ühele pimekatsele sama koguse mullaga ja lahuse koguruumalaga 
50 cm  3 0,01 M CaCl  2 (ilma uuritava aineta) tehakse sama menetlus. 
See toimib taustkontrollina analüüside jooksul, et avastada häirivad 
ained või saastunud mullad.  
Kõiki katseid, sealhulgas kontrollid ja pimekatsed, tuleks teha vähe ­
malt kaks korda. Uuringu jaoks ettevalmistatavate proovide koguarvu võib arvutada vastavalt kasutatavale metoodikale.
 
Eeluuringu ja põhiuuringu meetodid on üldiselt samad, erandid on 
vajaduse korral mainitud.  
Õhu käes kuivatatud mullaproovid tasakaalustatakse, raputades neid 
koos minimaalselt 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 lahusega terve öö (12 
tundi) enne katse tegemise päeva. Hiljem lisatakse teatav kogus 
uuritava aine põhilahust, et saada lõplikuks mahuks 50 cm. Lisatava 
põhilahuse maht a) ei tohiks ületada 10 % vesifaasi lõplikust 50 cm  3 
suurusest mahust, et tasakaalustamiseelse lahuse omadused 
muutuksid võimalikult vähe, ja b) peaks olema eelistatavalt selline, 
et mullaga kokku puutuva uuritava aine esialgne kontsentratsioon 
(C 0 ) on analüüsimeetodi avastamispiiriga võrreldes vähemalt kaks 
suurusjärku kõrgem; see lävi võimaldab mõõtmisi täpselt teha isegi tugeva adsorptsiooni esinemise korral (> 90 %) ja hiljem määratleda 
adsorptsiooniisotermid. Samuti soovitatakse võimaluse korral, et aine 
esialgne kontsentratsioon (C
 0 ) ei oleks suurem kui pool selle lahus ­
tuvuse piirist.  
Allpool esitatakse näide põhilahuse kontsentratsiooni (C  st ) arvuta­
mise kohta. Eeldatakse, et avastamispiir on 0,01 μg cm–  3 ja 
adsorptsioon 90 %; seega peaks mullaga kokkupuutuva uuritava 
aine esialgne kontsentratsioon olema eelistatavalt 1 μg cm  –3 
(kaks suurusjärku kõrgem kui analüüsimeetodi avastamispiir). 
Eeldades, et lisatakse maksimaalne soovitatud põhilahuse ruumala, 
st 5–45 cm  3 0,01 M CaCl  2 tasakaalulahust (= 10 % põhilahust 
vesifaasi 50 cm  3 kogumahust), millega põhilahuse kontsentratsioon 
peaks olema 10 μg cm  -3 ; see on kolm suurusjärku kõrgem kui 
analüüsimeetodi avastamispiir.  
Vesifaasi pH tuleks mõõta enne ja pärast mullaga kokkupuutumist, 
kuna sellel on tähtis osa kogu adsorptsiooniprotsessis, eriti ionisee ­
ruvate ainete korral.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Segu raputatakse adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseni. Tasa ­
kaaluoleku püstitumise aeg muldade lõikes erineb suuresti sõltuvalt 
kemikaalist ja mullast; tavaliselt piisab 24 tunnist (77). Eeluuringus võib proovid koguda järjest 48tunnise segamisperioodi jooksul (näiteks 4., 8., 24. ja 48. tunnil). Siiski tuleks analüüsiajad määrata 
paindlikult, et võtta arvesse laboratooriumi töögraafikut.
 
Uuritava aine analüüsimiseks vesilahuses on kaks võimalust: a) 
paralleelmeetod ja b) jadameetod. Tuleks rõhutada, et kuigi paralleel ­
meetod on eksperimentaalselt töömahukam, on tulemuste matemaa ­
tiline töötlemine lihtsam (5. liide). Siiski jäetakse kasutatava meetodi valik katse läbiviijale, kes peab arvestama kasutatava laboratooriumi võimalusi ja ressursse.
 
a) Paralleelmeetod: valmistatakse ette nii palju sama mulla/lahuse 
suhtega proove, kui mitmes ajavahemikus soovitakse adsorpt ­
sioonikineetikat uurida. Pärast tsentrifuugimist ja soovi korral 
pärast filtreerimist regenereeritakse esimese katseklaasi vesifaas 
võimalikult täielikult ja mõõdetakse nt 4 tunni pärast, vastav teise katseklaasi oma pärast 8. tundi, kolmanda oma pärast 24. tundi jne.
 
b) Jadameetod: iga mulla/lahuse suhte kohta valmistatakse ette ainult 
üks kordusproov. Kindlaksmääratud ajavahemike vahel tsentrifuu ­
gitakse segu faaside eraldamiseks. Vesifaasist võetakse väike alikvoot, milles kohe analüüsitakse uuritavat ainet; seejärel jätkub 
katse esialgse seguga. Kui pärast tsentrifuugimist kasutatakse 
filtreerimist, peavad laboratooriumil olema vahendid väikeste vesialikvootide filtreerimiseks. On soovitatav, et võetud alikvoo ­
tide koguruumala ei ületaks 1 % lahuse koguruumalast, et mulla/ ­
lahuse suhe ei muutuks märkimisväärselt ning adsorptsiooniks olemasoleva soluudi mass ei väheneks uuringu kestel.
 
Adsorptsiooniprotsent  A t i arvutatakse igal ajahetkel (t  i ) nominaalse 
esialgse kontsentratsiooni alusel ja proovivõtmise hetkel (t  i ) 
mõõdetud kontsentratsiooni korrigeeritakse vastavalt pimekatse  A t i väärtusele. Tasakaaluolekule vastava platoo määramiseks koostatakse 
graafikud teljestikus aeg (5. liites joonis 1) (  1 ). Samuti arvutatakse 
välja K  d väärtus tasakaaluolekus. Selle K  d väärtuse põhjal valitakse 
jooniselt 1 välja sobivad mulla/lahuse suhted nii, et adsorptsiooni ­
protsent on üle 20 % ja eelistatavalt > 50 % (61). Kõik graafikutes 
kasutatavad võrrandid ja põhimõtted on esitatud punktis „Andmed ja 
aruandlus” ning 5. liites.  
1.9.2.2.  Adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise aja ja tasakaaluolekus 
adsorbeerunud uuritava aine koguse määramine  
Nii nagu juba mainitud, võimaldavad graafikud teljestikus  A t i or 
C ads 
aq – aeg hinnata adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumist ja adsor ­
beerunud uuritava aine kogust selles. 5. liites esitatud joonised 1 ja 2 on selliste graafikute näidisteks. Tasakaaluoleku püstitumise aeg on see aeg, mida süsteem vajab tasakaaluolekule vastava platoo saavu ­
tamiseks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Tasakaaluolekule vastava platoo püstitumise hindamiseks võib kasutada ka graafikuid, 
mis kirjeldavad vesifaasis oleva uuritava aine kontsentratsiooni  C ads 
aq ja aja suhet (vt 5. 
lisa joonist 2).
 Kui mõne konkreetse mulla puhul saavutatakse tasakaaluolekule 
vastava platoo asemel pidev kontsentratsiooni tõus, võib see olla 
tingitud segavatest teguritest, nagu näiteks biolagundamine või aeglane hajumine. Biolagundamist võib näidata, korrates katset steri ­
liseeritud mullaprooviga. Kui tasakaaluolekule vastavat platood ei 
saavutata ka selle prooviga, peaks katse läbiviija otsima muid 
nähtusi, mis võiksid olla seotud antud uuringuga; seda võib teha asjakohaste katsetingimuste muutmisega (temperatuur, raputamise ajad, mulla/lahuse suhted). Jäetakse katse tegija otsustada, kas jätkata 
uuringut, kuigi tasakaaluolek võib jääda püstitumata.
 
1.9.2.3.  Adsorptsioon katseanuma pinnal ja uuritava aine püsivus  
Mõningat teavet uuritava aine adsorptsiooni kohta katseanuma pinnal 
ning püsivuse kohta on võimalik tuletada kontrollproove analüüsides. Kui tuvastatakse kontsentratsiooni kahanemine, mis ületab analüüsi ­
meetodi standardvea, võib olla tegu abiootilise lagunemise ja/või 
adsorptsiooniga katseanuma pinnale. Neid kahte nähtust on võimalik eristada nii, et anuma seinad pestakse põhjalikult sobiva lahusti teadaoleva ruumalaga ja pesemislahuses analüüsitakse uuritava aine 
kogust. Kui adsorptsiooni katseanuma pinnal ei täheldata, tähistab 
kontsentratsiooni vähenemine abiootilist ebastabiilsust. Kui tuvasta ­
takse adsorptsioon, tuleb katseanuma materjal ära vahetada. Siiski ei või käesoleva katsega katseanuma pinnale adsorbeerumise kohta 
saadud teavet otse ekstrapoleerida mulla/lahuse katsele. Mulla olema ­
solu mõjutab seda adsorptsiooni.
 
Lisateavet uuritava aine püsivuse kohta on võimalik tuletada, 
määrates esialgse massitasakaalu aja jooksul. See tähendab, et 
uuritav aine määratakse vesifaasis, mullaproovides ja katseanuma seintel. Lisatud uuritava kemikaali massi ja vesifaasis oleva uuritava kemikaali masside ja mullast ning katseanuma seintelt saadud 
ekstraktide summa vaheline erinevus on võrdne alanenud ja/või 
lendunud ja/või mitteekstraheerunud massiga. Massitasakaalu määra ­
miseks peab adsorptsiooni tasakaaluolek püstituma katse tegemise aja jooksul.
 
Massitasakaal määratakse mõlema mulla ning ka iga mulla korral 
ühe muld/lahus suhte jaoks, mille korral on vaesustumine suurem kui 20 % ning eelistatavalt > 50 % tasakaaluolekuga võrreldes. Kui suhte leidmise katse lõpetatakse koos vesifaasist 48 tunni pärast 
võetud proovi analüüsimisega, eraldatakse faasid tsentrifuugimisega 
ja soovi korral filtreerides. Vesifaas regenereeritakse niipalju kui võimalik ja mullale lisatakse sobivat ekstrahanti (ekstraktsioonitegu ­
riga vähemalt 95 %), et uuritavat ainet ekstraheerida. Soovitatakse 
vähemalt kahte järjestikust ekstraheerimist. Määratakse uuritava aine 
kogus mullas ja katseanuma ekstraktides ja arvutatakse massitasakaal (võrrand 10, „Andmed ja aruandlus”). Kui see on alla 90 %, käsi ­
tatakse uuritavat ainet ebapüsivana uuringuks kuluva aja jooksul. 
Siiski võib uuringut jätkata, võttes arvesse uuritava aine ebapüsivust; 
sellisel juhul soovitatakse põhiuuringus analüüsida mõlemat faasi.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4.  2. tase – adsorptsioonikineetika ühel uuritava aine kontsentratsioonil  
Kasutatakse viit mulda, mis on valitud tabelist 1. Nende viie mulla 
hulka on soovitav lisada võimaluse korral mõned või kõik eeluu ­
ringus kasutatud mullad. Sellisel juhul ei tule 2. taset korrata eeluu ­
ringus kasutatud muldade puhul.  
Tasakaalu saavutamise aeg, mulla/lahuse suhe, mullaproovi mass, 
mullaga kokkupuutuva vesifaasi ruumala ja uuritava aine kontsentrat ­
sioon lahuses valitakse vastavalt eeluuringu tulemustele. Analüüs tuleks teha eelistatavalt siis, kui kokkupuutest on möödunud ligi ­
kaudu 2, 4, 6, 8 (võimaluse korral ka 10) ja 24 tundi; raputamise 
aega võib pikendada maksimaalselt 48 tunnini juhul, kui kemikaal tasakaalu saavutamiseks suhte leidmise tulemuste alusel on vaja rohkem aega. Siiski võib analüüsiaegadesse suhtuda paindlikult.
 
Iga katse (üks muld ja üks lahus) tehakse vähemalt kask korda, et 
määrata kindlaks tulemuste varieerumine. Iga katse kohta tehakse 
üks pimekatse. See koosneb mullast ja 0,01 M CaCl  2 lahusest ilma 
uuritava aineta ning selle mass ja ruumala peavad olema katses kasutatavatega identsed. Kontrollproovile, milles on ainult uuritav aine 0,01 M CaCl
 2 lahuses (ilma mullata), tehakse sama menetlus, 
et pakkuda kaitset ootamatuste vastu.  
Adsortpsiooniprotsent arvutatakse igal  A t i ja/või  A Δt i (vastavalt vaja ­
dusele) ja esitatakse graafiliselt ajateljel. Arvutatakse ka jaotustegur K
 d tasakaaluolekus ning orgaanilise süsiniku suhtes normaliseeritud 
adsorptsioonitegur K  oc (mittepolaarsete orgaaniliste kemikaalide 
puhul).  
Adsorptsioonikineetika uuringu tulemused  
Lineaarne K  d väärtus on üldiselt täpne sorptsioonilise käitumise 
kirjeldamiseks mullas (35, 78) ja väljendab kemikaalide loomulikku 
liikuvust mullas. Näiteks kemikaale, mille K  d ≤ 1 cm  3 g -1 , peetakse 
üldiselt kergesti liikuvateks. Sarnaselt on MacCall  et al . (16) välja 
töötanud Koc väärtustel põhineva liikuvuse klassifikatsiooniskeemi. Lisaks on olemas leostumise klassifikatsiooniskeemid, mis põhinevad 
K
 oc ja DT-50 suhtel (  1 ) (32, 79).  
Vastavalt veaanalüüsi uuringutele (61) ei ole samuti võimalik täpselt 
määrata K  d väärtusi, mis on alla 0,3 cm  3 g– 1 vesifaasi vähenenud 
kontsentratsiooni alusel, isegi siis, kui kasutatakse kõige soovita ­
vamat (täpsuse seisukohast) mulla/lahuse suhet, st 1:1. Sellisel 
juhul soovitatakse analüüsida nii mulla kui ka lahuse faasi.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: aeg, mille jooksul 50 % uuritavast ainest on hajunud.
 Seoses eelnevate märkustega soovitatakse kemikaali adsorptsioonilist 
käitumist ja selle võimalikku liikuvust mullas käsitlevat uuringut 
jätkata, määrates nendes süsteemides Freundlichi adsorptsiooniiso ­
termid, mille jaoks on võimalik K  d täpselt määrata, kasutades käes ­
olevas katsemeetodis järgitud katseprotokolli. Täpne määramine on 
võimalik, kui K  d ja mulla/lahuse suhte korrutis on > 0,3, siis kui 
määramine põhineb kontsentratsiooni langusele vesifaasil (kaudne meetod), või > 0,1, siis kui analüüsitakse mõlemat faasi (otsene meetod) (61).
 
1.9.2.5.  3. tase – adsorptsiooniisotermid ja desorptsioonikineetika/ ­
desorptsiooniisotermid  
1.9.2.5.1. A d s o r p t s i o o n i i s o t e r m i d  
Kasutatakse viit uuritava aine kontsentratsiooni, mis hõlmavad soovi ­
tavalt kahte suurusjärku; nende kontsentratsioonide valimisel tuleks võtta arvesse lahustuvust vees ja sellest tulenevaid vesilahuse tasa ­
kaalukontsentratsioone. Iga mulla kohta tuleks säilitada sama mulla/ ­
lahuse suhe kogu uuringu jooksul. Adsorptsioonikatse tehakse vasta ­
valt eespool kirjeldatule, välja arvatud see, et vesifaasi analüüsitakse ainult üks kord ajahetkel, mil on vaja saavutada tasakaal, nagu on 
määratletud eespool 2. taseme juures. Määratakse lahuse tasakaalu ­
kontsentratsioonid ja arvutatakse adsorbeerunud kogus uuritava aine vähenemise alusel lahuses või otsese meetodi abil. Adsorbeerunud mass mulla ühikumassi kohta esitatakse uuritava aine tasakaalukont ­
sentratsiooni funktsioonina (vt „Andmed ja aruandlus”).
 
Adsorptsiooniisotermide katse tulemused  
Siiani esitatud matemaatilistest adsorptsioonimudelitest on Freund ­
lichi isoterm üks kõige sagedamini kasutatav adsorptsiooniprotses ­
side kirjeldamise mudel. Üksikasjalikum teave adsorptsioonimude ­
lite tõlgendamise ja olulisuse kohta on esitatud viidetes (41, 45, 80, 81, 82).
 
Märkus . Tuleb märkida, et erinevate ainete K  F väärtuste (Freund ­
lichi adsorptsioonitegur) võrdlemine on võimalik ainult siis, kui need K
 F väärtused on väljendatud samades ühikutes (83).  
1.9.2.5.2. D e s o r p t s i o o n i k i n e e t i k a  
Käesoleva katse eesmärk on uurida, kas kemikaal on mullal adsor ­
beerunud pöörduvalt või mittepöörduvalt. See teave on oluline, sest 
desorptsiooniprotsessil on samuti tähtis osa kemikaali käitumises välitingimustes asuvas mullas. Lisaks on desorptsiooniandmed kasu ­
likuks sisendiks leostumist kirjeldava arvutiga modelleerimise puhul 
ja lahustunud aineid sisaldava äravoolusimulatsiooni korral. Desorpt ­
siooniuuringu puhul soovitatakse allpool kirjeldatud uuring teha iga süsteemi kohta, mille kohta oli eelneva adsorptsioonikineetika katse käigus võimalik määrata täpne K
 d . 
Nagu adsorptsioonikineetika katse puhul, on ka desorptsioonikinee ­
tika katse tegemiseks kaks võimalust: a) paralleelmeetod ja b) jada ­
meetod. Kasutatava meetodi valik jäetakse katse tegijale, kes peab 
arvestama kasutatava laboratooriumi võimalusi ja ressursse.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Paralleelmeetod: iga mulla kohta, mis valitakse desorptsiooniuu ­
ringu tegemiseks, valmistatakse ette sama mulla/lahuse suhtega 
nii palju proove, kui mitmes ajavahemikus soovitakse desorpt ­
sioonikineetikat uurida. Eelistatavalt tuleks kasutada samasid ajavahemikke, mida kasutati adsorptsioonikineetika katses; siiski 
võib kogu aeg vajaduse korral pikeneda, et süsteem jõuaks 
desorptsiooni tasakaaluoleku püstitamiseni. Iga katse (üks muld, üks lahus) korral tehakse üks pimekatse. See koosneb mullast ja 0,01 M CaCl
 2 lahusest ilma uuritava aineta ja selle mass ja 
ruumala peavad olema identsed katses kasutatavatega. Kontroll ­
proovile, milles on uuritav aine 0,01 M CaCl  2 lahuses (ilma 
mullata), tehakse sama menetlus. Kõiki mulla ja lahuse segusid raputatakse kuni adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseni (nagu 
on määratletud eespool 2. taseme juures). Seejärel eraldatakse 
faasid tsentrifuugimise teel ja vesifaas kõrvaldatakse nii suures ulatuses kui võimalik. Kõrvaldatud lahuse ruumala asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl
 2 lahusega, milles ei ole uuritavat 
proovi, ja uusi segusid raputatakse uuesti. Esimese katseklaasi 
vesifaas regenereeritakse nii täielikult kui võimalik ja mõõdetakse hiljem, nt 2 tunni pärast, vastav teise katseklaasi oma pärast 4. tundi, kolmanda oma pärast 6. tundi jne, kuni desorptsiooni tasa ­
kaaluolek on püstitunud.
 
b) Jadameetod: pärast adsorptsioonikineetika katset tsentrifuugitakse 
segu ja vesifaas kõrvaldatakse nii suures ulatuses kui võimalik. 
Kõrvaldatud lahuse ruumala asendatakse sama ruumala 0,01 M 
CaCl  2 lahusega, milles ei ole uuritavat ainet. Uut segu raputatakse 
desorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseni. Selle aja jooksul tsentrifuugitakse segu kindlaksmääratud ajavahemike järel faaside 
eraldamiseks. Vesifaasist võetakse väike alikvoot, milles kohe 
analüüsitakse uuritavat ainet; seejärel jätkub katse esialgse seguga. Iga individuaalse alikvoodi ruumala peaks olema kogu ­
mahust alla 1 %. Segule lisatakse sama ruumala värsket 0,01 M 
CaCl
 2 lahust mulla/lahuse suhte säilitamiseks ja raputamine 
jätkub järgmise ajavahemikuni.  
Desortpsiooniprotsent arvutatakse igal ajahetkel ( D t i ) ja/või ajavahe ­
mikul ( D t i ) (vastavalt uuringu vajadustele) ja esitatakse graafiliselt 
ajateljel. Samuti arvutatakse K  des desorptsioonitegur tasakaaluolekus. 
Kõik kasutatavad võrrandid on esitatud punktis „Andmed ja aruandlus” ja 5. liites.
 
Desorptsioonikineetika katse tulemused  
Teljestikus desorptsiooniprotsent  ðD t i Þ ja adsorptsiooniprotsendi  A t i – 
aeg koostatud graafikute abil on võimalik hinnata adsorptsiooniprot ­
sessi pööratavust. Isegi kui desorptsiooni tasakaaluoleku püstitumi ­
seks kulub kaks korda rohkem aega kui adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseks ja kogu desorptsioon on üle 75 % adsorbeerunud 
kogusest, loetakse adsorptsiooni pöörduvaks.
 
1.9.2.5.3. D e s o r p t s i o o n i i s o t e r m i d  
Freundlichi desorptsiooniisotermid määratakse muldades, mida on 
kasutatud adsorptsiooniisotermide katses. Desorptsioonikatse tehakse 
punktis „Desorptsioonikineetika” kirjeldatud viisil, välja arvatud see, 
et vesifaasi analüüsitakse ainult üks kord desorptsiooni tasakaaluo ­
lekus. Arvutatakse desorbeerunud uuritava aine kogus. Mullale jääv adsorbeerunud uuritava aine kogus desorptsiooni tasakaaluolekus 
esitatakse uuritava aine tasakaalukontsentratsiooni funktsioonina 
lahuses (vt „Andmed ja aruandlus” ja 5. liidet).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
Analüüsi andmed esitatakse tabelina (vt 6. liidet). Esitatakse indivi ­
duaalsed mõõtmised ja arvutatud keskmised. Adsorptsiooniisotermid esitatakse graafiliselt. Arvutused tehakse allpool kirjeldatud viisil.
 
Uuringu tegemisel arvestatakse, et 1 cm  3 vesilahuse mass on 1 g. 
Mulla/lahuse suhet võib väljendada nii massiprotsendi (w/w) kui ka mahuprotsendi (w/vol) ühikutes sama arvu abil.
 
2.1. ADSORPTSIOON  
Adsorptsiooni  A t i määratletakse kui mullal adsorbeerunud aine prot ­
senti katse alguses olemasolevast kogusest vastavalt katsetingimus ­
tele. Kui uuritav aine on püsiv ega adsorbeeru märkimisväärselt anuma seinal, arvutatakse
 A t i igal ajahetkel t  i vastavalt järgmisele 
võrrandile:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
kus: 
A t i = adsorptsiooniprotsent ajahetkel t  i (%); 
m s ads ðt i Þ = mullal adsorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel t  i (μg); 
m 0 = uuritava aine mass katseklaasis katse alguses ( μg). 
Üksikasjalik teave adsorptsiooniprotsendi  A t i arvutamise kohta paral ­
leel- ja jadameetodite kasutamise korral on esitatud 5. liites.  
Jaotustegur K  d on mullafaasis oleva aine sisalduse ja vesifaasis oleva 
aine massikontsentratsiooni vaheline suhe katsetingimustes, kui adsorptsiooni tasakaaluolek on püstitunud.
 
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
kus: 
C s ads ðeqÞ = mullal adsorbeerunud aine sisaldus adsorptsiooni tasa ­
kaaluolekus ( μg g  -1 ); 
C aq ads ðeqÞ = aine massikontsentratsioon vesifaasis adsorptsiooni 
tasakaaluolekus ( μg cm-  3 ). See kontsentratsioon 
määratakse analüütiliselt, võttes arvesse pimekatsetega saadud väärtusi;
 
m s ads ðeqÞ = mullal adsorbeerunud aine mass adsorptsiooni tasa ­
kaaluolekus ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus ( μg); 
m soil = mullafaasi kogus, väljendatud mulla kuivmassina (g);  
V 0 = mullaga kokkupuutuva vesifaasi esialgne ruumala 
(cm  3 ). 
A eq ja K  d vaheline suhe saadakse võrrandist:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
kus: 
A eq = adsorptsiooniprotsent adsorptsiooni tasakaaluolekus, %  
Orgaanilise süsiniku suhtes normaliseeritud adsorptsioonitegur K  oc 
seob jaotusteguri K  d mullaproovi orgaanilise süsiniku sisaldusega:  
K oc ¼ K  d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
kus: 
%OC = orgaanilise süsiniku protsent mullaproovis (g  -1 ). 
K oc -tegur esindab ühtset väärtust, mis iseloomustab peamiselt mitte ­
polaarsete orgaaniliste kemikaalide jaotumist mullas või sademes oleva orgaanilise süsiniku ja vee vahel. Nende kemikaalide adsorpt ­
sioon viiakse korrelatsiooni tahke sorbeeriva orgaanilise aine sisal ­
dusega (7); seega sõltuvad K
 oc väärtused humiinosakeste eriomadus ­
test, mille sorptsioonivõime on sõltuvalt päritolust, tekkest jne märki ­
misväärselt erinev.  
2.1.1.  Adsorptsiooniisotermid  
Freundlichi adsorptsiooniisotermide võrrand seob adsorbeerunud 
uuritava aine koguse uuritava aine kogusega lahuses tasakaaluolekus (võrrand 8).
 
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ ½C 0 Ä C aq ads ðeqÞâ: V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
Võrrand (8) on Freundlichi adsorptsioonivõrrand:  
C s ads ðeqÞ ¼ K  F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
või lineaarsena:  
log C  s ads ðeqÞ ¼ log K  F ads þ 1=n · log C  aq ads ðeqÞ (9) 
kus: 
K F ads = dimensiooni cm  3 l/m g  -1 
n = regressioonikonstant; l/n on tavaliselt vahemikus 0,7–1,0, 
mis näitab, et sorptsiooni puudutavad andmed on sageli 
natuke mittelineaarsed.  
Joonistatakse võrrandid 8 ja 9 ning arvutatakse  K ads 
F ja l/n väärtused 
regressioonanalüüsi abil, kasutades võrrandit 9. Arvutatakse ka loga ­
ritmvõrrandi korrelatsioonikordaja r  2 . Selliste graafikute näited esita ­
takse joonisel 2.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Joonis 2.  Freundlichi adsorptsioonigraafik, normaalne ja lineaarne.  
2.1.2.  Massitasakaal  
Massitasakaalu (MB) määratletakse kui pärast adsorptsiooniuuringut 
analüütiliselt regenereeritava aineprotsendi suhet aine nominaalsesse kogusesse uuringu alguses.
 
Andmete töötlemine erineb, kui lahusti lahustub vees täielikult. Vees 
lahustuva lahusti korral võib kohaldada punktis „Desorptsioon” kirjeldatud andmete töötlemist, et kindlaks määrata lahusti ekstrahee ­
rimise abil regenereeritud aine kogus. Kui lahusti veeslahustuvus on 
väiksem, tuleb regenereeritav kogus mõõta.
 
Massitasakaal MB adsorptsiooni jaoks arvutatakse järgmiselt: eelda ­
takse, et tegur (m  E ) vastab mullast ja katseanuma seintelt orgaanilise 
lahusti abil ekstraheeritud uuritavate kemikaalide masside summale:  
MB ¼ ðV rec · C ads 
aq ðeqÞ þ m E Þ·100 
V 0 · C 0 ð%Þ (10) 
kus: 
MB = massitasakaal (%)  
m E = mullast ja katseanuma seintelt kahes etapis väljutatud uuri ­
tava aine kogumass ( μg) 
C 0 = mullaga kokku puutuva katselahuse esialgne massikontsen ­
tratsioon ( μg cm  –3 ) 
V rec = adsorptsiooni tasakaaluoleku järel regenereeritud superna ­
tandi ruumala (cm  –3 ). 
2.2. DESORPTSIOON  
Desorptsiooni (D) määratletakse desorbeerunud uuritava aine prot ­
sendina eelnevalt adsorbeerunud aine koguse suhtes katsetingi ­
mustes:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
kus: 
D t i = desorptsiooniprotsent ajahetkel t  i (%); ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m des 
aq ðt i Þ = mullast desorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel t  i 
(μg); 
m ads 
s ðeqÞ = mullal adsorbeerunud uuritava aine mass adsorptsiooni 
tasakaaluolekus ( μg). 
Üksikasjalik teave, kuidas arvutada desorptsiooniprotsenti  D 
t i paral­
leel- ja jadameetodite korral, on esitatud 5. liites.  
Ilmne desorptsioonitegur (K  des ) on katsetingimustes mullafaasi 
jäänud aine sisalduse ja vesilahuses desorbeerunud aine massikont ­
sentratsiooni vaheline suhe, kui desorptsiooni tasakaaluolek on püsti ­
tunud:  
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
kus: 
K des = desorptsioonitegur (cm  3 g -1 ); 
m des 
aq ðeqÞ = desorbeerunud uuritava aine kogumass desorptsiooni 
tasakaaluolekus ( μg); 
V T = desorptsioonikineetika uuringu jooksul mullaga 
kokkupuutuva vesifaasi koguruumala (cm  3 ). 
Juhised  m des 
aq ðeqÞ arvutamiseks esitatakse 5. liites pealkirja „Desorpt ­
sioon” all.  
Märkus  
Kui eelnev adsorptsiooniuuring tehti paralleelmeetodiga, peetakse 
võrrandis (12) toodud ruumala V  T sama suureks kui V  0 . 
2.2.1.  Desorptsiooniisotermid  
Freundlichi desorptsiooniisotermide võrrand seob mullale jääva 
adsorbeerunud uuritava aine sisalduse uuritava aine kontsentratsioo ­
niga lahuses desorptsiooni tasakaaluolekus (võrrand 16).  
Iga katseklaasi kohta arvutatakse mullale jääv adsorbeerunud aine 
sisaldus desorptsiooni tasakaaluolekus järgmiselt:  
C des 
s ðeqÞ ¼ m ads 
s ðeqÞ Ä m des 
aq ðeqÞ 
m soil (μg g -1 ) (13) 
m des 
aq ðeqÞ määratletakse  
m des 
aq ðeqÞ ¼ m des 
m ðeqÞ · V 0 
V r F Ä m A 
aq (μg) (14) 
kus: 
C des 
s ðeqÞ = mulda jääv adsorbeerunud uuritava aine sisaldus 
desorptsiooni tasakaaluolekus ( μg g  -1 ); 
m des 
m ðeqÞ = aine analüütiliselt määratud mass vesifaasis desorpt ­
siooni tasakaaluolekus ( μg); ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m A 
aq = osalisest ruumala asendusest tingitud ülejääva uuri ­
tava aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus ( μg) 
m des 
aq ðeqÞ = aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus ( μg): 
m A 
aq ¼ m ads 
aq ðeqÞ · Í V 0 Ä V R 
V 0 Î (15) 
V r F = uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist võetud lahuse 
ruumala desorptsiooni tasakaaluolekus (cm  3 ); 
V R = adsorptsiooni tasakaaluoleku saavutamise järel katseklaasist 
eemaldatud supernatandi ruumala, mis asendatakse sama 
ruumala 0,01 M CaCl  2 lahusega (cm  3 ). 
Võrrand (16) on Freundlichi desorptsioonivõrrand:  
C des 
s ðeqÞ ¼ K F des · C des 
aq ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
või lineaarsena:  
logC  des 
s ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n · logC  des 
aq ðeqÞ (17) 
Kus: 
K F des = Freundlichi desorptsioonitegur;  
n = regressioonikonstant;  
C des 
aq ðeqÞ = aine massikontsentratsioon vesifaasis desorptsiooni 
tasakaaluolekus ( μg cm  –3 ). 
Võib joonestada võrrandid 16 ja 17 ning arvutada  K F des ja 1/n 
väärtused regressioonanalüüsi abil, kasutades võrrandit 17.  
Märkus  
Kui Freundlichi adsorptsiooni või desorptsiooni eksponent l/n on 
võrdne ühega, võrduvad siduvad Freundlichi adsorptsiooni ja desorptsiooni konstandid (
K ads 
F ja K F des ) adsorptsiooni või desorpt ­
siooni tasakaalukonstantidega (vastavalt K  d ja K  des ), ning C  s vs C  aq 
graafikud on lineaarsed. Kui eksponendid ei võrdu ühega, on graa ­
fikud teljestikus C  s vs C  aq mittelineaarsed ning adsorptsiooni ja 
desorptsioonikonstandid erinevad isotermide erinevates kohtades.  
2.2.2.  Katsearuanne  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet:  
— kasutatud mullaproovide täielik identifitseerimine, sealhulgas:  
— geograafiline viide asukohale (laiuskraad, pikkuskraad);  
— proovivõtu kuupäev;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— kasutusviis (nt põllumajandusmaa, mets jne);  
— proovivõtu sügavus;  
— liiva/saviliiva/savi sisaldus;  
— pH väärtused (0,01 M CaCl  2 lahuses);  
— orgaanilise süsiniku sisaldus;  
— orgaanilise ainese sisaldus;  
— lämmastiku sisaldus;  
— C/N suhe;  
— katioonide neelamismahutavus (mmol/kg);  
— kogu teave mullaproovide kogumise ja ladustamise kohta;  
— vajaduse korral kogu oluline teave uuritava aine adsorptsiooni/ ­
desorptsiooni tõlgendamiseks;  
— viited iga parameetri määratlemisel kasutatud meetoditele;  
— vajaduse korral teave uuritava aine kohta;  
— katsete temperatuur;  
— tsentrifuugimise tingimused;  
— uuritava aine analüüsimisel kasutatud menetlus;  
— uuritava aine põhilahuse ettevalmistamisel solubiliseeriva aine 
kasutamise põhjendus;  
— vajaduse korral arvutustes tehtud paranduste selgitamine;  
— andmed vastavalt tabeli vormile (6. liide) ja graafilisele esitlemi ­
sele; 
— kogu teave ja vaatlused, mis aitavad uuringu tulemusi tõlgen ­
dada.  
3. VIITED  
1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. 
UBA Report 106 02045, Part II.  
2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Repre ­
sentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I.
 
3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, 
ISPRA, December 1994.  
4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995 (June 1995).
 
5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
 
7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guide ­
lines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.  
9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dange ­
rous to health or especially harmful to the environment.  
11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
 
12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in Metho ­
dological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
 
13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena” in 
Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83–122.
 
14) Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments” in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31–44.
 
15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media”. 
Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), pp. 29–35.
 
16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger 
H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in Test 
Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. 
Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
 
17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. 
Weeds, 13, pp. 185–190.  
18) Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) „Determi ­
nation of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. 
J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524–528.  
19) Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agroc ­
hemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & 
Sons Ltd.  
20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. 
W. and Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the 
evaluation of the environmental behavior of pesticides”, IUPAC 
Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, pp. 901–932.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
 
22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), „Persistence of 
herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric, 18, pp. 269–273.  
23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. 
Sci. 12, pp. 45–52.
 
24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological availa ­
bility of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961–971.
 
25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, pp. 247–258.  
26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143–154.  
27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching 
experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.
 
28) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc, 35, pp. 732–210.  
29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization” in 
Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and 
J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49–143.  
30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, pp. 37–44.
 
31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
32) Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339–357.
 
33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil 
Sci., 28, pp. 340–350.  
34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, pp. 389–395.
 
35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates 
for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80–101,
 
36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, 
pp. 572–576.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils”. J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667–668.  
38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils”. Nature, 223, 1288.  
39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor”. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050–1059.
 
40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. 
Agric. Food Chem., 32, pp. 243–246.  
41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, pp. 29–92.
 
42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Romberg., (1968), „Adsorp ­
tion of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32 
pp. 222–234.
 
43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, pp. 833–846.
 
44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxicol. Safety 21, pp. 1–17.
 
45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), „Adsorption in 
organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49–143.
 
46) Deli J., and Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19: pp. 67–69.  
47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, pp. 454–457.
 
48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), „Methods for distri ­
buting pesticide loss in field runoff between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemi ­
cals, Run-off and Erosion from Agricultural Management 
Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
 
50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994).  
51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. 
E., eds. „Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes.  
54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques.  
55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling.  
56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils.  
57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and indus ­
trial sites.  
58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), „Precision in pesticide 
adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc, 34, pp. 
353–354.  
60) Grover R., and Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., pp. 109–138.
 
61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. 
Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31–41.  
62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106”. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
 
63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C, (1980), „Comportement de 
substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure 
chimique”. Weed Res. 21, pp. 227–231.  
64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Environ. ­
Qual., 10(3), pp. 382–386.  
65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), 
„Partition equilibria of non-ionic organic compounds between 
soil organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), 
pp. 227–231.  
66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic 
substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297–312.
 
67) Vowles P. D., and Mantoura R. F. C, (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), pp. 109–116.
 
68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods. Environmental 
Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
 
69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). „Relationship 
between water solubility, soil sorption, octanol-water partitio ­
ning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic 
Toxicology (eds J.G. Eaton, et al), pp.78-115, ASTM STP 707, 
Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds”. Science, Vol. 206, pp. 831–832.  
71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C, 
(1981), „Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, pp. 
38–42.
 
72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833–846.
 
73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilite-reactivite”. 
Revue de l'Agric., 34 (4), pp. 319–322.  
74) Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil”. Chemosphere, 32(12), pp. 2493–2504.  
75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), pp. 1373–1384.
 
76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – comparison of different stationary phases”. Chemosphere 27 (12), pp. 2341–2352.
 
77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed 
Research, Vol. 7, pp. 29–36.  
78) Koskinen W. C, and Harper S. S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. 
Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption 
isotherms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14–32.
 
81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, 
(1960), „Studies in adsorption: XL A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils”. J. Chem. Soc, pp. 3973–93.
 
82) Calvet R., Terce M., and Arvien J. C, (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiques 
generates de l'adsorption”. Ann. Agron. 31: pp. 239–251.  
83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.  
84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorption”, in Joint Interna ­
tional Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.
 
85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
1. liide  
Katse skeem
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
2. liide  
ANALÜÜSIMEETODI TÄPSUSE JA KONTSENTRATSIOONIMUUTUSE 
MÕJU ADSORPTSIOONITULEMUSTE TÄPSUSELE  
Amount of soil m  soil = 10 g 
Volume of solution V  0 = 100 cm  3 
m ads 
aq ðeqÞ 
(μg) C ads 
aq ðeqÞ 
(μg cm-  3 ) R m ads 
s ðeqÞä 
(μg) C ads 
s ðeqÞä 
(μg g-  1 ) R‡ K  d * R‡  
FOR A = 9 %
 m0 ¼ 110 μg or 
C0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 true value 10 1,00 true value 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
FOR A = 55 %
 m0 ¼ 110 μg or 
C0 ¼ 1; 100μg=cm3 
50,0 0,500 true value 60,0 6,00 true value 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
FOR A = 99 %
 m0 ¼ 110 μg or 
C0 ¼ 1; 100μg=cm3 
1,100 0,011 true value 108,9 10,89 true value 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
äm s ads ðeqÞ = m 0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = mass of the test substance in the soil phase at equilibrium, μg; 
m aq ads ðeqÞ = mass of the test substance in the aqueous phase at equilibrium, μg; 
C s ads ðeqÞ = content of the test substance in the soil phase at equilibrium, μg g -1 ; 
C aq ads ðeqÞ = mass concentration of the test substance in the aqueous phase at equilibrium, μg cm  -3 ; 
R = analytical error in the determination of the  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = calculated error due to the analytical error R.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
3. Liide  
K d HINDAMISE TEHNIKAD  
1. Hindamistehnikad võimaldavad ennustada K  d väärtusi, mis põhinevad 
korrelatsioonil, näiteks P  ow väärtustega (12, 39, 63–68), veeslahustuvust 
puudutavate andmetega (12, 19, 21, 39, 68-73) või polaarsust puudutavate 
andmetega, mis on saadud pöördfaasilise HPLC kasutamisel (74-76). Tabe ­
lites 1 ja 2 esitatud K  oc ja K  om väärtused on arvutatud nendest võrranditest 
ja seega K  d kaudselt võrranditest:  
K oc ¼ K  d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Nende korrelatsioonide kontseptsioon põhineb kahel eeldusel: 1) aine 
adsorptsiooni mõjutab peamiselt just mullas olev orgaaniline aines; ja 2) 
kaasatud interaktsioonid on peamiselt mittepolaarsed. Seetõttu 1) ei saa 
neid korrelatsioone kasutada täielikult või teatud ulatuses polaarsete ainete puhul ja 2) juhtudel, kui mullas esineva orgaanilise ainese sisaldus on väga väike (12). Lisaks, kuigi on avastatud rahuldavad korrelatsioonid P
 ow ja 
adsorptsiooni vahel (19), ei saa sama öelda veeslahustuvuse ja adsorpt ­
siooni ulatuse vahelise suhte kohta (19, 21); siiani on sellealased uuringud väga vasturääkivad.
 
3. Mõned näited adsorptsiooniteguri ja oktanooli-vee jaotusteguri vahelisest 
korrelatsioonist ja suhtest vees lahustuvusse on esitatud vastavalt tabelites 
1 ja 2.  
Tabel 1  
Näited adsorptsiooni jaotusteguri ja oktanooli-vee jaotusteguri vahelisest korrelatsioonist; rohkem näiteid 
viidetes 12, 68.  
Ained Korrelatsioonid Autorid  
Asendatud karbamiidid log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Aromaatsed klooritud ained log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (1983) (65) 
Erinevad pestitsiidid log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl ja Mingelgrin (1984) (66) 
Aromaatsed süsivesinikud log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles ja Mantoura (1987) (67)  
Tabel 2  
Näited adsorptsiooni jaotusteguri ja vees lahustuvuse vahelisest korrelatsioonist; rohkem näiteid viidetes 
68, 69.  
Ühendid Korrelatsioonid Autorid  
Erinevad pestitsiidid log K  om = 3,8 – 0,561 log S  w Gerstl ja Mingelgrin (1984) (66) 
Alifaatsed, aromaatsed kloo ­
ritud ained log K  om = (4,040 +/– 0,038) – (0,557 
+/– 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
α-naftool log K  oc = 4,273 – 0,686 log S  w Hasset  et al . (1981) (71) 
Tsüklilised, alifaatsed 
aromaatsed ained log K  oc = - 1,405 – 0,921 log S  w 
- 0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Erinevad ühendid log K  om = 2,75 – 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
4. liide  
ARVUTUSED TSENTRIFUUGIMISTINGIMUSTE MÄÄRAMISEKS  
1. Tsentrifuugimisaeg saadakse vastavalt järgmisele valemile, eeldades et 
osakesed on kerakujulised:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Lihtsustamise eesmärgil kirjeldatakse kõiki parameetreid SI-välistes 
ühikutes (g, cm).  
kus: 
ω = pöörlemissagedus (= 2 π rpm/60), rad s  –1 ; 
rpm = pööret minutis;  
η = lahuse viskoossus, g s  –1 cm –1 ; 
r p = osakese raadius, cm;  
ρ s = mulla tihedus, g cm  –3 ; 
ρ aq = lahuse tihedus, g cm  –3 ; 
R t = vahemaa tsentrifuugi rootori keskkohast tsentrifuugitorus 
oleva lahuse pinnani, cm;  
R b = vahemaa tsentrifuugi rootori keskkohast tsentrifuugitoru 
põhjani, cm;  
R b – R  t = mulla/lahuse segu pikkus tsentrifuugitorus, cm.  
Üldiselt kasutatakse täieliku eraldumise tagamiseks arvutatud aegade kahe ­
kordistamist.  
2. Võrrandit 1 on võimalik veel lihtsustada, kui oletada, et lahuse viskoossus 
(η) ja tihedus ( ρ aq ) on võrdsed vee viskoossuse ja tihedusega temperatuuril 
25 o C; seega, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 ja ρ aq = 1,0 g, cm  -3 . 
Seega saadakse tsentrifuugimisaeg võrrandiga 2:  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Võrrandist 2 ilmneb, et tsentrifuugimistingimuste, st aja (t) ja kiiruse (rpm) 
määratlemisel on tähtsad kaks parameetrit, et saavutada konkreetse suuru ­
sega osakeste jagunemine (meie puhul 0,1 μm raadiusega): 1) mulla tihedus 
ja 2) segu pikkus tsentrifuugitorus (R  b –R t ), st vahemaa, mille mullaosake 
läbib lahuse pinnalt toru põhjani; on selge, et fikseeritud ruumala korral sõltub segu pikkus torus toru raadiuse ruudust.
 
4. Joonisel 1 on näidatud, kuidas tsentrifuugimise kiiruse (rpm) funktsioonina 
esitatud tsentrifuugimise aeg (t) varieerub erinevate mulla tiheduste ( ρ s ) 
(joonis 1a) ja tsentrifuugitorus oleva segu erinevate pikkuste vahel (joonis 
1b). Joonisel 1a on selgesti näha mulla tiheduse mõju; näiteks klassikalise 3000 rpm tsentrifuugimisel on tsentrifuugimise aeg ligikaudu 240 minutit, kui mulla tihedus on 1,2 g/cm
 3 , ja vaid 50 minutit, kui tihedus on 2,0 
g/cm  3 . Samamoodi näitab joonis 1b, et klassikalise 3000 rpm tsentrifuugi ­
misel on tsentrifuugimise aeg ligikaudu 50 minutit, kui segu pikkus on 10 cm, ja vaid 7 minutit, kui pikkus on 1 cm. Siiski on tähtis leida optimaalne suhe võimalikult väikest pikkust nõudva tsentrifuugimise ja 
pärast tsentrifuugimist katse tegija poolt võimalikult lihtsalt faaside eralda ­
mise vahel.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Lisaks, kui määratakse katsetingimused mulla/lahuse faaside eraldamiseks, 
on tähtis arvestada võimaliku kolmanda „pseudofaasi”, kolloidide olema ­
solu. Nendel osakestel, mille suurus on alla 0,2 μm, võib olla tähtis mõju 
kogu aine adsorptsioonimehhanismile mulla suspensioonis. Kui tsentrifuu ­
gitakse eespool kirjeldatud viisil, jäävad kolloidid vesifaasi ja neid analüü ­
sitakse koos vesifaasiga. Seega jääb teave nende mõju kohta saamata.  
Kui uuringut tegeval laboratooriumil on ultratsentrifuugimise või ultrafil ­
treerimise võimalused, võib aine adsorptsiooni/desorptsiooni mullas uurida põhjalikumalt, kaasa arvatud teave aine adsorptsiooni kohta kolloididele. Sellisel juhul tuleks kasutada ultratsentrifuugimist 60 000 rpm/min või 
ultrafiltreerimist, kui filtri poorsus on 100 000 daltonit, et eraldada järg ­
mised kolm faasi: muld, kolloidid ja lahus. Katsearuannet tuleks samuti vastavalt muuta, et kõigis kolmes faasis ainet analüüsida.
 
Joonis 1a.
  
Tsentrifuugimise kiiruse (rpm) funktsioonina esitatud tsentrifuugimise aja 
(t) varieerumine erinevate mullatiheduste puhul ( ρ s ). R  t = 10 cm, R  b –R t = 
10 cm, η = 8,95 × 10  –3 g s –1 cm –1 ja ρ aq = 1,0 g cm  –3 temperatuuril 25  o C. 
Joonis 1b.
  
Tsentrifuugimise kiiruse (rpm) funktsioonina esitatud tsentrifuugimise aja 
(t) varieerumine erinevate pikkuste puhul tsentrifuugimistorus (R  b –R t ) = L; 
R t = 10 cm, η = 8,95 × 10  –3 g s –1 cm –1 , ρ aq = 1,0 g cm  –3 temperatuuril 
25 o C ja kui ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
5. liide  
ADSORPTSIOONI A (%) JA DESORPTSIOONI D ( %) ARVUTAMINE  
Menetluse ajagraafik on järgmine:
  
Kõikide arvutuste puhul eeldatakse, et uuritav aine on püsiv ega adsorbeeru 
märkimisväärselt konteineri seintele.  
ADSORPTSIOON A (A %)  
a) Paralleelmeetod  
Adsorptsiooniprotsent arvutatakse iga katseklaasi (i) kohta igal ajahetkel (t  j ) 
vastavalt võrrandile:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Selle võrrandi tegurid võib arvutada järgmiselt: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m  0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
kus: 
A t i = A  ti 
m ads 
s ðt i Þ = uuritava aine mass mullas ajahetkel t  i , kui analüüs tehakse 
(μg); 
m 0 = uuritava aine mass katseklaasis uuringu alguses ( μg); 
C 0 = mullaga kokkupuutuva katselahuse esialgne massikontsentrat ­
sioon (μg cm  -3 ); ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C aq ads ðt i Þ = aine massikontsentratsioon vesifaasis analüüsi tegemise 
ajahetkel t  i (μg cm  -3 ); see kontsentratsioon määratakse 
analüütiliselt, võttes arvesse pimekatsetega saadud väärtused;  
V 0 = mullaga kokkupuutuva uuritava lahuse esialgne ruumala 
(cm  3 ). 
Adsorptsiooniprotsendi väärtused Ati  A t i või C ads 
aq ðt i Þ esitatakse aja funkt ­
sioonina ja määratakse aeg, mis kulus sorptsioonitasakaaluoleku püstitumi ­
seks. Näited sellistest graafikutest esitatakse vastavalt joonisel 1 ja 2.
  
Joonis 1  
Adsorptsiooni tasakaaluoleku graafik
  
Joonis 2  
Uuritava aine massikontsentratsioon vesifaasis (C  aq ) aja funktsioonina  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Jadameetod  
Järgmistes võrrandites võetakse arvesse, et adsorptsioonimenetluseks 
mõõdetakse uuritavat ainet väikestes vesifaasi alikvootides määratletud ajavahemikel.
 
— Iga ajavahemiku jooksul arvutatakse mullal adsorbeerunud aine kogus 
järgmiselt:  
— esimese ajavahemiku puhul Δt 1 = t 1 – t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m  0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î (4) 
— teise ajavahemiku puhul Δt2 = t2 – t1  
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m  m ads ðt 1 Þ · V 0 
v A a Í Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— kolmanda ajavahemiku puhul Δt3 = t3 – t2  
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î (6) 
— n-nda ajavahemiku puhul Δtn = tn – tn-1  
m s ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Adsorptsiooniprotsent igas ajavahemikus,  A  Δt i , arvutatakse järgmise 
võrrandi abil:  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100ð%Þ (8) 
samal ajal kui desorptsiooniprotsent  A t i ajahetkel t  i saadakse võrrandist:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Adsorptsiooni väärtused  A t i või A Δt i (vastavalt uuringu vajadustele) 
esitatakse aja funktsioonina ja määratakse sorptsiooni tasakaaluoleku püstitumiseks kuluv aeg.
 
— Tasakaaluoleku püstitumise hetkel t  eq 
— mullal adsorbeerunud uuritava aine mass on:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— uuritava aine mass lahuses on:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— ja adsorptsiooniprotsent tasakaaluolekus on:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12) 
Eespool kasutatud parameetrid määratletakse järgmiselt:  
m ads 
s ðΔt 1 Þ; m ads 
s ðΔt 2 Þ; :::; m ads 
s ðΔt n Þ = mullal adsorbeerunud aine mass 
vastavalt ajavahemike Δ t1 , Δ t2 , ..., 
Δ tn jooksul (μg); 
m ads 
m ðt 1 Þ; m ads 
m ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = vastavalt ajahetkedel v A 
a t 1 , t 2 ,... , t  n 
(μg) 
m ads 
s ðeqÞ = mullal adsorbeerunud aine mass 
adsorptsiooni tasakaaluolekus ( μg); 
m ads 
aq ðeqÞ = aine mass lahuses adsorptsiooni 
tasakaaluolekus ( μg); 
v A 
a = alikvoodi ruumala, milles uuritavat 
ainet mõõdetakse (cm  3 ); 
A Δt i = adsorptsiooniprotsent, mis vastab 
ajavahemikule Δt i ( %);  
A eq = adsorptsiooniprotsent adsorptsiooni 
tasakaaluolekus ( %).  
DESORPTSIOON D ( %)  
Ajahetke t  0 , kui desorptsioonikineetika katse algab, peetakse selleks hetkeks, kui 
uuritava aine maksimaalne eemaldatud ruumala (pärast adsorptsiooni tasakaaluo ­
leku püstitumist) asendatakse sama ruumala 0,01 M CaCl  2 lahusega.  
a) Paralleelmeetod  
Ajahetkel t  i mõõdetakse uuritava aine mass katseklaasist i ( V i 
r ) võetud 
vesifaasis ja desorbeerunud uuritava aine mass arvutatakse vastavalt võrran ­
dile: 
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Desorptsiooni tasakaaluolekus t  i = t eq ja seega  m des 
aq ðt i Þ = m des 
aq ðeqÞ 
Ajavahemiku ( Δt i ) jooksul desorbeerunud uuritava aine mass saadakse 
võrrandist:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Desorptsiooniprotsent arvutatakse:  
ajahetkel t  i võrrandist:  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
ja ajavahemikul ( Δt i ) võrrandist:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
kus: 
D t i = desorptsiooniprotsent ajahetkel t  i ( %);  
D Δt i = desorptsiooniprotsent, mis vastab ajavahemikule Δt j ( %);  
m des 
aq ðt 1 Þ = desorbeerunud uuritava aine mass ajahetkel t  i (μg); 
m des 
m ðt i Þ = ajavahemikul Δt j desorbeerunud uuritava aine mass ( μg); 
m des 
m ðt i Þ = ajahetkel t  i analüütiliselt määratud uuritava aine mass lahuse 
ruumalas  V r i , mis võetakse analüüsi jaoks ( μg); 
m A 
aq = osalisest ruumala asendusest tingitud ülejääva uuritava aine 
mass adsorptsiooni tasakaaluolekus ( μg); 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m ads 
aq ðeqÞ = uuritava aine mass lahuses adsorptsiooni tasakaaluolekus ( μg); 
V R = adsorptsiooni tasakaaluoleku püstitumise järel katseklaasist 
eemaldatud supernatandi ruumala, mis asendatakse sama 
ruumala 0,01 M CaCl  2 lahusega (cm  3 ); 
V r i = uuritava aine mõõtmiseks katseklaasist (i) võetud lahuse 
ruumala desorptsioonikineetika katses (cm  3 ). 
Desorptsiooni väärtused  D t i või D t i (vastavalt uuringu vajadustele) esita ­
takse aja funktsioonina ja määratakse desorptsiooni tasakaaluoleku püstitu ­
miseks kuluv aeg.  
b) Jadameetod  
Järgmistes võrrandites võetakse arvesse, et eelnevaks adsorptsioonimenetlus 
viidi läbi, määrates uuritava aine väikestes vesifaasi alikvootides  ðv A 
a Þ 
(jadameetod punktis 1.9 „Katse käik”). Eeldatakse, et a) pärast adsorptsioo ­
nikineetika katset katseklaasist eemaldatud supernatandi ruumala asendati 
sama ruumala 0,01 M CaCl  2 lahusega (v  R ) ja b) desorptsioonikineetika 
katse jooksul mullaga kokkupuutuva vesifaasi koguruumala (v  T ) püsib 
konstantsena ja esitatakse võrrandiga:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Ajahetkel t  i : 
— määratakse uuritava aine mass väikeses alikvoodis  ðv a D Þ ja arvutatakse 
desorbeerunud mass vastavalt võrrandile:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— desorptsiooni tasakaaluolekus, t  i = t eq , seega m des 
aq ðt i Þ = m des 
aq ðeqÞ 
— desorptsiooniprotsent  D t i arvutatakse järgmisest võrrandist:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
Ajavahemikus ( Δt i ) 
Iga ajavahemiku jooksul arvutatakse desorbeerunud aine kogus järgmiselt:  
— esimese ajavahemiku puhul Δ t1 = t 1 – t 0 ja 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A ja m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21)  
— ajavahemiku n puhul Δt n = t n – t n-1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
ja 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— teise ajavahemiku puhul Δt2 = t2 – t1 ja  
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
ja 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Lõpuks arvutatakse desorptsiooniprotsent igas ajavahemikus,  D Δt i , kasutades järgmist võrrandit:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
samal ajal kui desorptsiooniprotsent  D t i ajahetkel t  i saadakse võrrandist:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
milles eespool kasutatud parameetrid määratletakse järgmiselt:  
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = aine mass, mis jääb 
mullale adsorbeerununa vastavalt pärast ajavahe ­
mike Δt
 1 , Δt 2 , ..., Δt n 
möödumist ( μg); 
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
aq ðΔt n Þ = uuritava aine mass, mis 
on desorbeerunud vasta ­
valt ajavahemike Δt 1 , 
Δt 2 , ..., Δt n jooksul ( μg); 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = vastavalt ajahetkedel ðv D 
a Þ 
t 1 , t 2 , ..., t  n (μg) 
V T = desorptsioonikineetika 
määramisel jadameetodiga mullaga Kokku puutuva 
vesifaasi koguruumala 
(cm
 3 ); 
m A 
aq = osalisest ruumala asendu ­
sest tingitud ülejääva 
uuritava aine mass 
adsorptsiooni tasakaaluo ­
lekus (μg) 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = adsorptsiooni tasakaaluo ­
leku püstitumise järel katseklaasist eemaldatud supernatandi ruumala, 
mis asendatakse sama 
ruumala 0,01 M CaCl
 2 
lahusega (cm  3 ); 
v D 
a = desorptsioonikineetika 
määramisel jadameetodiga 
analüütilisel eesmärgil katseklaasist (i) võetud alikvoodi ruumala (cm
 3 ); 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
6. lisa  
ADSORPTSIOON-DESORPTSIOON MULDADES: ANDMETE ESITAMISE LEHED  
Uuritud aine:  
Uuritud muld:  
Kuivaine sisaldus mullas (105  o C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Analüüsimeetodi sobivus  
Kaalutud muld g 
Muld: kuivmass g CaCl
 2 lahuse ruumala cm  3 
Lõpliku lahuse arvutatud kontsentratsioon μg cm  -3 
Lõpliku lahuse määratud kontsentratsioon μg cm  -3 
Kasutatud analüüsimeetodi põhimõte:  
Analüüsimeetodi kaliibrimine:  
Uuritud aine:  
Uuritud muld:  
Kuivaine sisaldus mullas (105  o C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Kasutatud analüüsimetoodika: Kaudne  □ Paralleelne  □ Jada  □ 
Otsene  □ 
Adsorptsiooni uuring: uuritavad proovid  
Tähis Ühikud Tasakaaluoleku 
saabumise aeg Tasakaaluoleku 
saabumise aeg Tasakaaluoleku 
saabumise aeg Tasakaaluoleku 
saabumise aeg  
Katseklaas nr 
Kaalutud muld — g Muld: kuivmass m
 soil g 
Vee ruumala kaalutud mullas 
(arvutatud) V WS cm 3 
Mulla tasakaalustamiseks kasu ­
tatud 0,01 M CaCl  2 lahuse 
ruumala cm 3 
Põhilahuse ruumala cm  3 
Mullaga kokkupuutuva vesifaasi 
koguruumala V 0 cm 3 
Uuritava lahuse esialgne kont ­
sentratsioon C 0 μg cm  -3 
Uuritava aine mass uuringu 
alguses m 0 μg ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Tähis Ühikud Tasakaaluoleku 
saabumise aeg Tasakaaluoleku 
saabumise aeg Tasakaaluoleku 
saabumise aeg Tasakaaluoleku 
saabumise aeg  
Pärast loksutamist ja tsentrifuugimist  
KAUDNE MEETOD 
Paralleelmeetod 
Uuritava aine kontsentratsioon 
vesifaasis, sisaldab pimekatsest tulenevat parandust
 C ads 
aq ðt i Þ μg cm  -3 
Jadameetod 
Uuritava aine mõõdetud mass 
alikvoodis  a A m ads 
m ðt i Þ μg 
OTSENE MEETOD 
Mullal adsorbeerunud uuritava 
aine mass  m ads 
s ðt i Þ μg 
Adsorptsiooni arvutamine 
Adsorptsioon  A  t i % 
A Δt i % 
Keskmised 
Adsorptsioonitegur K  d cm 3 g -1 
Keskmised 
Adsorptsioonitegur K  oc cm 3 g -1 
Keskmised  
Uuritud aine:  
Uuritud muld:  
Kuivaine sisaldus mullas (105  o C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorptsiooni uuring: pimekatsed ja kontroll  
Tähis Ühikud Pimekatse Pimekatse Kontroll  
Katseklaas nr 
Kaalutud mullad g 0 0 Vee kogus kaalutud mullas (arvutatud) cm
 3 — — 
Lisatud 0,01 M CaCl  2 lahuse ruumala cm  3 
Lisatud uuritava aine põhilahuse 
ruumala cm 3 0 0 
Vesifaasi koguruumala (arvutatud) cm  3 — —  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Tähis Ühikud Pimekatse Pimekatse Kontroll  
Uuritava aine esialgne kontsentrat ­
sioon vesifaasis μg cm  -3 
Pärast loksutamist ja tsentrifuugimist  
Kontsentratsioon vesifaasis μg cm  -3 
Märkus: Vajaduse korral lisada veerge.  
Uuritud aine:  
Uuritud muld:  
Kuivaine sisaldus mullas (105  o C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Massibilanss  
Tähis Ühikud  
Katseklaas nr 
Kaalutud muld — g Muld: kuivmass m
 soil g 
Vee ruumala kaalutud mullas (arvutatud) V  WS ml 
Mulla tasakaalustamiseks kasutatud 0,01 
M CaCl  2 lahuse ruumala ml 
Põhilahuse ruumala cm  3 
Mullaga kokkupuutuva vesifaasi kogu ­
ruumala V 0 cm 3 
Uuritava lahuse esialgne kontsentratsioon C  0 μg cm  -3 
Tasakaaluoleku saabumise aeg — h  
Pärast loksutamist ja tsentrifuugimist  
Uuritava aine kontsentratsioon vesifaasis 
tasakaaluolekus, sisaldab pimekatsest tulenevat parandust
 C ads 
aq ðeqÞ μg cm  -3 
Tasakaaluoleku saabumise aeg t  eq h 
Esimene lahjendamine lahustiga 
Eemaldatud vesifaasi ruumala V  rec cm 3 
Lisatud lahusti ruumala ΔV cm  3 
Esimene ekstraheerimine lahustiga 
Lahustis analüüsitud signaal S  E1 var. 
Uuritava aine kontsentratsioon lahustis C  E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Tähis Ühikud  
Mullast ja anuma seintelt ekstraheeritud 
aine mass m E1 μg 
Teine lahjendamine lahustiga 
Eemaldatud lahusti ruumala ΔV s cm 3 
Lisatud lahusti ruumala ΔV' cm  3 
Teine ekstraheerimine lahustiga 
Lahustifaasis analüüsitud signaal S  E2 var. 
Uuritava aine kontsentratsioon lahustis C  E2 μg cm  -3 
Mullast ja anuma seintelt ekstraheeritud 
aine mass m E2 μg 
Kahes etapis ekstraheeritud uuritava aine 
kogumass m E μg 
Massibilanss MB %  
Uuritud aine:  
Uuritud muld:  
Kuivaine sisaldus mullas (105  o C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorptsiooniisotermid  
Tähis Ühikud  
Katseklaas nr 
Kaalutud muld — g Muld: kuivmass E g Vee ruumala kaalutud mullas 
(arvutatud) V
 WS cm 3 
Mulla tasakaalustamiseks kasu ­
tatud 0,01 M CaCl  2 lahuse 
ruumala cm 3 
Lisatud põhilahuse ruumala cm  3 
Mullaga kokkupuutuva vesifaasi 
koguruumala (arvutatud) V 0 cm 3 
Lahuse kontsentratsioon C  0 μg cm  -3 
Tasakaaluoleku saabumise aeg — h  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Tähis Ühikud  
Pärast loksutamist ja tsentrifuugimist  
Aine kontsentratsioon vesifaasis, 
sisaldab pimekatsest tulenevat 
parandust  C ads 
aq ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatuur  o C 
Mullaühiku kohta adsorbee ­
runud mass  C ads 
s ðeqÞ μg g -1 
Regressioonanalüüs:  
K F ads väärtus:  
l/n väärtus:  
regressioonitegur r  2 : 
Uuritud aine:  
Uuritud muld:  
Kuivaine sisaldus mullas (105  o C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Kasutatud analüüsimetoodika: Kaudne  □ Paralleelne  □ Jada  □ 
Desorptsiooni uuring  
Tähis Ühikud Ajava­
hemik Ajava­
hemik Ajava­
hemik Ajava­
hemik  
Katseklaasi nr, saadakse adsorptsioonie ­
tapist 
Mullal adsorbeerunud aine mass adsorpt ­
siooni tasakaaluolekus  m ads 
s ðeqÞ μg 
Eemaldatud vesifaasi ruumala, mis asen ­
dati 0,01 M CaCl  2 -ga V R cm 3 
Mullaga kokkupuutuva 
vesifaasi koguruumala PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Osalisest ruumala asendusest tingitud 
ülejääva uuritava aine mass adsorptsiooni tasakaaluolekus
 m A 
aq μg 
Desorptsiooni kineetika  
Mullast desorbeerunud aine mõõdetud 
mass ajahetkel t  i m des 
m ðt i Þ μg 
Uuritava aine mõõtmiseks 
katseklaasist (i) võetud 
lahuse ruumala PM V  f i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Mullast desorbeerunud aine mass 
ajahetkel t  i (arvutatud)  m des 
aq ðt i Þ μg 
Mullast ajavahemikus Δt i desorbeerunud 
aine mass (arvutatud)  m des 
aq ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Tähis Ühikud Ajava­
hemik Ajava­
hemik Ajava­
hemik Ajava­
hemik  
Desorptsiooni protsent  
Desorptsioon ajahetkel t  i D ti % 
Desorptsioon ajavahemikus Δt i D Δt i % 
Näiline desorptsioonitegur K  des 
PM: paralleelmeetod  
SM: jadameetod  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  ADSORPTSIOONITEGURI ( K OC ) KINDLAKSMÄÄRAMINE ­
MULLAS JA REOVEESETTES KÕRGSURVEVEDELIKKRO ­
MATOGRAAFIA (HPLC) ABIL  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub OECD juhendist TG 121 (2000).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Ainete sorptsiooni muldadesse ja kanalisatsioonijääkidesse võib 
kirjeldada parameetrite abil, mida saab katseliselt kindlaks määrata meetodi C.18 abil. Üheks oluliseks parameetriks on adsorptsiooni ­
tegur, mida määratletakse kui suhet mullas/reoveesettes oleva aine 
kontsentratsiooni ja vesifaasis oleva aine kontsentratsiooni adsorpt ­
siooni tasakaalu tingimuste vahel. Mulla orgaanilise süsiniku sisal ­
duse suhtes normaliseeritud adsorptsioonitegur K
 oc on kasulik 
näitaja, mis iseloomustab kemikaali seostumisvõimet mulla orgaani ­
lise ainese või reoveesettega ning võimaldab võrrelda erinevaid 
kemikaale. Seda parameetrit võib hinnata veeslahustuvuse ja n- oktanooli/vee jaotusteguri vaheliste korrelatsioonide abil (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
 
Käesolevas uuringus kirjeldatud katsemeetodis kasutatakse HPLCd 
adsorptsiooniteguri K  oc määratlemiseks mullas ja reoveesettes (8). 
Need näitajad on usaldusväärsemad kui QSAR-arvutustega saadud näitajad (9). Kuna tegemist on hinnangulise meetodiga, ei saa see täielikult asendada katsemeetodis C.18 kasutatud partii tasakaalusta ­
mise katseid. Siiski võib kindlaksmääratud K
 oc väärtust kasutada 
selleks, et valida sobivad katseparameetrid adsorptsiooni/ ­
desorptsiooni uuringute jaoks vastavalt katsemeetodile C.18, arvu ­
tades K  d (jaotustegur) või K  f (Freundlichi adsorptsioonitegur) vasta ­
valt võrrandile 3 (vt punkti 1.2).  
1.2. MÕISTED  
K d – jaotustegur on lahustunud uuritava aine tasakaalukontsentrat ­
sioonide C suhe kahefaasilises süsteemis, mis koosneb sorbendist (muld või reoveesete) ja vesifaasist; see on dimensioonita väärtus, kui kontsentratsioonid mõlemas faasis on väljendatud massiprotsen ­
dina. Juhul kui kontsentratsioon vesifaasis esitatakse massi ja 
ruumala suhtena, on ühikuteks ml g
 -1 . K  d võib muutuda vastavalt 
sorbendi omadustele ning sõltuda kontsentratsioonist.  
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C aq (1) 
kus: 
C soil = uuritava aine tasakaalukontsentratsioon mullas ( μg· g -1 ) 
C sludge  = uuritava aine tasakaalukontsentratsioon jääkides ( μg· g -1 ) 
C aq = uuritava aine tasakaalukontsentratsioon vesifaasis 
(μg· g -1 , (μg· ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f – Freundlichi adsorptsioonitegur on uuritava aine kontsentratsioon 
mullas või reoveesettes (x/m), kui tasakaalukontsentratsioon Caq 
vesifaasis on üks; ühikud on μg· g -1 sorbenti. Väärtus võib muutuda 
sõltuvalt sorbendi omadustest.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n · logC  aq (2) 
kus: 
x/m = sorbendi kogusesse m (g) adsorbeerunud uuritava aine 
kogus x ( μg) tasakaaluolekus  
l/n = Freundlichi adsorptsiooniisotermi kõver  
C aq = uuritava aine tasakaalukontsentratsioon vesifaasis ( μg· ml  -1 ) 
AtC aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc – sorbendi orgaanilise süsiniku sisalduse (f  oc ) suhtes normalisee ­
ritud aine jaotustegur (K  d ) või Freundlichi adsorptsioonitegur (K  f ); 
eriti mitteioniseerumata kemikaalide korral on see ligikaudseks indi ­
kaatoriks aine ja sorbendi vahelise adsorptsiooni ulatuse määramisel ning võimaldab võrrelda erinevaid kemikaale. Olenevalt K
 d ja K  f 
mõõtmetest võib K  oc olla dimensioonita suurus või omada ühikuid 
ml· g–  1 või μg · g– 1 orgaanilist ainest.  
Koc ¼ Kd 
foc dimensionless or ml ·g Ä1 or Kf 
foc Ä μg·g Ä1 Ö Î Í (3) 
K oc ja K  d vaheline suhe ei ole alati lineaarne ja seega võivad K  oc 
väärtused mullati erineda, kuid nende varieerivus on palju väiksem 
võrreldes K  d või K  f väärtustega.  
Adsorptsioonitegur (K  oc ) tuletatakse võimsustegurist (k'), kasutades 
kaliibrimisgraafikut, milles log k' esitatakse log K  oc funktsioonina 
valitud võrdlusühendite kohta.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
kus: 
t R = uuritava aine ja võrdlusaine HPLC peetumisaeg (minutites)  
t 0 = HPLC surnud aeg (minutites) (vt punkti 1.8.2).  
P ow – oktanooli/vee jaotustegur on n-oktanooli ja vette lahustunud 
aine kontsentratsioonide suhe, mis on ilma dimensioonita väärtus  
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Enne meetodi kasutamist peavad olema teada struktuurivalem, 
puhtus ja dissotsiatsioonikonstant (vajaduse korral). Kasulik on ka 
teave vees ja orgaanilistes lahustites lahustuvuse, oktanooli/vee 
jaotusteguri ja hüdrolüüsi omaduste kohta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Selleks, et uuritava aine mõõdetud HPLC-retentsiooniandmeid saaks 
korrelleerida uuritava aine adsorptsiooniteguri K  oc -ga, tuleb joonis ­
tada kaliibrimisgraafik, milles log K  oc esitatakse log k' funktsioonina. 
Kasutada tuleks minimaalselt kuut võrdluspunkti, millest vähemalt üks on madalam ja üks kõrgem kui uuritava aine eeldatav väärtus. 
Meetodi täpsus paraneb märgatavalt, kui kasutatakse võrdlusaineid, 
mis on struktuurilt uuritava ainega seotud. Kui sellised andmed ei ole kättesaadaval, valib kasutaja ise sobivad kaliibrimisained. Sellisel juhul tuleks valida struktuuriliselt heterogeensed ained. Kasutamiseks 
sobivad ained ja K
 oc väärtused on esitatud reoveesette puhul liite 
tabelis 1 ja mulla puhul tabelis 3. Teiste kaliibrimisainete valikut tuleks põhjendada.
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
HPLC tehakse analüütilistes kolonnides, mis on täidetud müügiloleva 
tsüanopropüüli faasiga, mis sisaldab lipofiilseid ja polaarseid struk ­
tuuriühikuid. Kasutatakse mõõdukalt polaarset statsionaarset faasi, mis põhineb ränidioksiidmaatriksil: 
- O - Si - CH
 2 - CH  2 - CH  2 - CN 
Ränidioksiid Mittepolaarne spacer-aine Polaarne struktuuriühik  
Katsemeetodi põhimõte on sarnane meetodiga A.8 (jaotustegur, 
HPLC-meetod). Kui uuritav aine läbib kolonni koos liikuva faasiga, reageerib see statsionaarse faasiga. Kuna uuritav aine jaguneb liikuva 
ja statsionaarse faasi vahel, aeglustub selle liikumine. Kuna statsio ­
naarses faasis on nii polaarseid kui mittepolaarseid osasid, võivad molekulide polaarsed ja mittepolaarsed rühmad reageerida samal viisil kui orgaaniline aines mulla- või reoveesette maatriksites. See 
võimaldab määrata kolonniga seotud peetumisaja ja orgaanilise 
ainese adsorptsiooniteguri vahelise suhte.
 
pH-l on märkimisväärne mõju sorptsioonile, eriti polaarsete ainete 
puhul. Põllumajandusmaa või reoveepuhastusjaamade mahutite pH on tavaliselt vahemikus pH 5,5–7,5. Ioniseeruvate ainete korral tuleks teha kaks uuringut nii ioniseeritud kui ioniseerimata kujul 
sobivates puhverlahustes, kuid ainult siis, kui vähemalt 10 % katseü ­
henditest dissotsieerub vahemikus pH 5,5–7,5.
 
Kuna määramisel kasutatakse ainult HPLC-kolonniga seotud peetu ­
misaja ja adsorptsiooniteguri vahelist suhet, ei ole kvantitatiivset analüüsimeetodit tarvis ja määrata tuleb ainult peetumisaeg. Kui kasutatakse sobivaid võrdlusaineid ja katse tingimused on stan ­
dardsed, võimaldab see meetod kiiresti ja efektiivselt määrata 
adsorptsiooniteguri K
 oc . 
1.5. UURINGU KASUTATAVUS  
HPLC-meetod sobib selliste keemiliste ainete jaoks (märgistamata 
või märgistatud), mille jaoks on saadav sobiv tuvastamissüsteem 
(nt spektrofotomeeter, radioaktiivsuse detektor) ja mis on katse tege ­
mise jooksul piisavalt püsivad. See võib olla eriti kasulik selliste kemikaalide puhul, mida on raske uurida muude katsesüsteemidega 
(st lenduvad ained; ained, mis ei lahustu vees kontsentratsioonil, 
mida on võimalik analüütiliselt mõõta; inkubatsioonisüsteemide pinna suhtes suurt afiinsust omavad ained). Meetodit saab kasutada segude puhul, mille korral ei ole võimalik elueerimisribasid eristada. 
Sellisel juhul tuleks märkida ära uuritavate ainete segu ühendite log 
K
 oc väärtuste ülemine ja alumine piir.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Lisandid võivad mõnikord põhjustada probleeme HPLC-tulemuste 
tõlgendamisel, kuid need ei ole väga olulised, kui uuritavat ainet 
on võimalik analüütiliselt selgelt identifitseerida ja lisanditest eral ­
dada.  
See meetod on valideeritud liite tabelis 1 loetletud ainete jaoks ja 
seda on kasutatud ka paljude teiste kemikaalide puhul, mis kuuluvad 
järgmistesse kemikaalide klassidesse:  
— aromaatsed amiinid (nt trifluraliin, 4-klooraniliin, 3,5-dinitroani ­
liin, 4-metüülaniliin, N-metüülaniliin, 1-naftüülamiin);  
— aromaatsed karboksüülhappe estrid (nt bensoehappe metüülester, 
3,5-dinitrobensoehappe etüülester);  
— aromaatsed süsivesinikud (nt tolueen, ksüleen, etüülbenseen, 
nitrobenseen);  
— arüüloksüfenoksüpropioonhappe estrid (nt diklofop-metüül, 
fenoksaprop-etüül, fenoksaprop-P-etüül);  
— bensimidasool- ja imidasoolfungitsiidid (nt karbentasiim, fuberi ­
dasool, triasoksiid);  
— karboksüülhappe amiidid (nt 2-klorobensamiid, N,N-dimetüül ­
bensamiid, 3,5-dinitrobensamiid, N-metüülbensamiid, 2-nitroben ­
samiid, 3-nitrobensamiid);  
— klooritud süsivesinikud (nt endosulfaan, DDT, heksakloroben ­
seen, kintoseen, 1,2,3-triklorobenseen);  
— orgaanilist fosforit sisaldavad insektitsiidid (nt metüülasiinfoss, 
disulfotoon, fenamifoss, isofeenfoss, pürasofoss, sulprofoss, tria ­
sofoss);  
— fenoolid (nt fenool, 2-nitrofenool, 4-nitrofenool, pentaklorofe ­
nool, 2,4,6-triklorofenool, 1-naftool);  
— fenüülkarbamiidi derivaadid (nt isoproturoon, monolinuroon, 
pentsükuroon);  
— värvained (nt Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81);  
— polüaromaatsed süsivesinikud (nt atsenafteen, naftaleen);  
— 1,3,5-triasiinherbitsiidid (nt prometrüün, propasiin, simasiin, 
terbutrüün);  
— triasooli derivaadid (nt tebukonasool, triadimefoon, tradimenool, 
triapentenool).  
Meetodit ei kasutata ainete puhul, mis reageerivad kas eluendi või 
statsionaarse faasiga. Samuti ei kasutata seda ainete puhul, mis reageerivad spetsiifilisel viisil anorgaaniliste ühenditega (nt moodus ­
tavad klasterkomplekse savimineraalidega). Meetod ei pruugi toimida 
ka pindaktiivsete ainete, anorgaaniliste ühendite ja mõõdukalt tuge ­
vate või tugevate orgaaniliste hapete ja aluste korral. Kindlaks võib määrata log K
 oc väärtused vahemikus 1,5–5,0. Tuleb määrata ioni ­
seeruvad ained, kasutades puhverdatud liikuvat faasi, kuid hoolitseda 
tuleb selle eest, et puhvri komponendid ega uuritav aine ei sadestuks.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. KVALTITEEDIKRITEERIUMID  
1.6.1.  Täpsus  
Tavaliselt saab uuritava aine adsorptsiooniteguri määrata täpsusega 
± 0,5 logaritmiühikut perioodilise tasakaalu meetodiga määratud 
väärtusest (vt liites olevat tabelit 1). Suurema täpsuse võib saavutada, 
kui kasutatakse võrdlusaineid, mis on struktuurilt uuritava ainega seotud.
 
1.6.2.  Korratavus  
Määramised tuleks teha vähemalt kaks korda. Individuaalsetest 
määramistest tuletatud log K  oc väärtused peaksid jääma vahemikku 
0,25 logaritmiühikut.  
1.6.3.  Reprodutseeritavus  
Meetodi kasutamisest saadud kogemused toetavad selle valiidsust. 
HPLC-meetodi uurimine, milles kasutati 48 ainet (enamasti pestit ­
siidid), mille kohta on olemas usaldusväärsed mulla K  oc kohta 
käivad andmed, andis korrelatasioonikordaja R = 0,95 (10, 11).  
Meetodi tõhustamiseks ja valideerimiseks viidi läbi laboratooriumi ­
devaheline võrdlusuuring, milles osales 11 laboratooriumi (12). Tule ­
mused on esitatud liite tabelis 2.  
1.7. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.7.1.  Adsorptsiooniteguri esialgne määramine  
Oktanooli/vee jaotustegurit P  ow (= K  ow ) ja teatud ulatuses ka vees 
lahustuvust saab kasutada adsorptsiooni ulatuse indikaatoritena, eriti ioniseerimata ainete korral, ja seega kasutada esialgse ulatuse leid ­
miseks. Paljude kemikaalide rühmade kohta on avaldatud mitmeid 
kasulikke korrelatsioone (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
 
1.7.2.  Seadmed  
Vajalik on mittepulseeriva pumba ja sobiva tuvastamisseadmega 
vedelikkromatograafi olemasolu. Soovitatakse kasutada klapp- 
pihustit, millel on sisestus silmus. Kasutatakse müügilolevaid räni ­
dioksiidist alusega tsüanopropüülsidemega seotud vaike (nt Hypersil ja Zorbax CN). Sama aine juhtkolonni võib asetada sisestussüsteemi ja analüütilise kolonni vahele. Erinevate tarnijate kolonnid võivad 
oma eraldamise efektiivsuse suhtes märkimisväärselt varieeruda. 
Juhisena tuleks üritada saavutada järgmised võimsustegurid k': log k' > 0,0, kui log K
 oc = 3,0, ja log k' > – 0,4, kui log K  oc = 2,0, 
kasutades metanooli/vee suhet 55/45 % liikuva faasina.  
1.7.3.  Liikuvad faasid  
Uuritud on mitmeid liikuvaid faase ja soovitatakse kahte järgmist:  
— metanool/vesi (55/45 mahuprotsenti);  
— metanool/0,01 M tsitraatpuhver pH 6,0 (55/45 mahuprotsenti).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Elueerimislahusti valmistamiseks tuleb kasutada HPLC-puhast meta ­
nooli ja destilleeritud vett või tsitraatpuhvrit. Enne kasutamist 
segud degaseeritakse. Kasutada tuleb isokraatilist elueerimist. Kui metanooli/vee segud ei sobi, võib kasutada teisi orgaanilise lahusti ja vee segusid, näiteks etanooli ja vee segu või atsetonitriili ja vee 
segu. Ioniseeruvate ühendite korral soovitatakse kasutada puhverla ­
hust pH stabiliseerimiseks. Tuleb hoolitseda selle eest, et sool ei ladestuks ja kolonn ei manduks, mida võib mõningate orgaaniliste faaside/puhversegude korral esineda.
 
Kasutada ei tohi mingeid lisaaineid, nagu näiteks ioonpaari reaktiive, 
sest need võivad mõjutada statsionaarse faasi sorptsiooni omadusi. 
Sellised statsionaarse faasi muutused võivad olla pöördumatud. 
Seetõttu on kohustuslik lisaaineid kasutavad katsed viia läbi eraldi kolonnides.
 
1.7.4.  Soluudid  
Uuritavad ained ja võrdlusained tuleks lahustada liikuvas faasis.  
1.8. KATSE KÄIK  
1.8.1.  Katsetingimused  
Temperatuur mõõtmiste kestel tuleks dokumenteerida. Väga soovi ­
tatav on kasutada reguleeritava temperatuuriga kolonni, et tagada püsivad tingimused kaliibrimise ja hindamise katsete jooksul ning 
uuritava aine määramisel.
 
1.8.2.  Surnud aja t  0 määramine  
Surnud aja t  0 määramiseks võib kasutada kahte erinevat meetodit (vt 
ka punkti 1.2).  
1.8.2.1.  Surnud aja t  0 määramine, kasutades homoloogilist rida  
See menetlus on andnud usaldusväärseid ja standardiseeritud t  0 väär­
tusi. Üksikasju vt katsemeetodit käsitlevas punktis A.8: jaotustegur 
(n-oktanool/vesi), HPLC-meetod.  
1.8.2.2.  Surnud aja t  0 määramine inertsete ainete abil, mis ei jää kolonni  
See tehnika põhineb formamiidi, karbamiidi või naatriumnitraadi 
lahuste lisamisel. Määramisi tuleks teha vähemalt kaks korda.  
1.8.3.  Peetumisaegade t  R määramine  
Võrdlusained tuleks valida punktis 1.3 kirjeldatud viisil. Need võib 
sisestada segastandardina peetumisaegade kindlaksmääramiseks, 
tingimusel, et on tõendatud, et ühegi võrdlus standardi peetumisaega ei mõjuta teiste võrdlusstandardite juuresolek. Kaliibrimine tuleks teha korrapäraste ajavahemike tagant vähemalt kaks korda päevas, 
et oleks võimalik seletada kolonni tulemuste ootamatuid muutusi. 
Kaliibrimissisestused soovitatakse teha enne ja pärast uuritava aine sisestamist, et saada kinnitust selle kohta, et peetumisaeg ei ole muutunud. Uuritavad ained sisestatakse eraldi võimalikult väikestes 
kogustes (et vältida kolonni ülekoormust) ning nende peetumisajad 
määratakse kindlaks.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Määramiste usaldusväärsuse suurendamiseks tuleb need teha vähe ­
malt kaks korda. Individuaalsetest mõõtmistest tuletatud log K  oc 
väärtused peaksid jääma vahemikku 0,25 logaritmiühikut.  
1.8.4.  Hindamine  
Võimsustegurid k' arvutatakse valitud võrdlusainete surnud aja t  0 ja 
peetumisaegade t  R põhjal vastavalt võrrandile 4 (vt punkti 1.2). 
Seejärel joonistatakse graafik, milles võrdlusainete log k' andmed esitatakse liite tabelites 1 ja 3 toodud partii tasakaalustamise katsetest 
saadud vastavate log K
 oc väärtuste funktsioonina. Selle graafiku abil 
kasutatakse uuritava aine log k' väärtust selle log K  oc väärtuse 
määramiseks. Kui tegelikud tulemused näitavad, et uuritava aine log K
 oc on väljaspool kaliibrimisvahemikku, tuleks uuringut korrata, 
kasutades erinevaid, sobivamaid võrdlusaineid.  
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
Aruanne peab sisaldama järgmist teavet:  
— uuritavate ainete ja võrdlusainete identsus ja puhtus ning vaja ­
duse korral pK  a väärtused;  
— seadmete ja tegevustingimuste kirjeldus, nt analüütilise (ja juht-) 
kolonni tüüp ja mõõtmed, tuvastamisvahendid, liikuv faas (komponentide suhe ja pH), temperatuuri vahemik määramiste 
jooksul;
 
— surnud aeg ja selle määramiseks kasutatud meetod;  
— kolonni viidud uuritavate ainete ja võrdlusainete kogused;  
— kaliibrimiseks kasutatud võrdlusühendite peetumisajad;  
— joonestatud regressioonigraafiku (log k'  vs log K  oc ) üksikasjali ­
kud andmed ja graafik ise;  
— uuritud ühendi keskmised peetumisandmed ja määratud log K  oc 
väärtus;  
— kromatogrammid.  
3. VIITED  
1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 
4, McGraw-Hill, New York.  
2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC Chemosphere, 
17, 1 67.  
3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the 
parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050–1059.  
4) C T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227–231.
 
5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic subs ­
tances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 
pp. 297–312.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
6) C T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic 
compounds, Science, 106, pp. 831–832.  
7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833–846.
 
8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2), pp. 121–128.  
9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), pp. 2493–2504.  
10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 
27(12), pp. 2341–2352.
 
11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285–304.  
12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373–1384.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
liide 
Tabel 1  
Muldade ja reoveesette K  oc väärtuste ja HPLC-sõelumismeetodi alusel arvutatud väärtuste võrdlus  ( 1 )/ ( 2 ) 
Aine CASi nr log K  oc 
reoveesete log K  oc 
HPLC Δ log K  oc 
mullad log K  oc 
HPLC Δ 
Atrasiin 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuroon 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fentioon 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuroon 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantreen 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Bensoehappe fenüülester 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Bensamiid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-nitrobensamiid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Atseetaniliid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 
Aniliin 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 
2,5-dikloroaniliin 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121-128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), 107-119.  
Tabel 2  
HPLC-meetodi tõhustamiseks ja valideerimiseks tehtud laboratooriumidevahelise võrdlusuuringu (11 
laboratooriumi osalusel) tulemused  ( 1 ) 
Aine CASi nr log K  oc (OECD 106) K  oc log K  oc 
[HPLC-meetod][ [HPLC-meetod]  
Atrasiin 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuroon 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapentenool 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuroon 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fentioon 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabel 3  
Mulla adsorptsiooni käsitlevatel andmetel põhineva HPLC-sõelumismeetodi jaoks soovitatavad võrdlusained  
Võrdlusained CASi nr Partii 
tasakaaluolekust 
saadud log K  oc 
keskmised väär ­
tused K oc andmete 
number log S.D. Allikas  
Atseetaniliid 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenool 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobensamiid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-dimetiiiilbensamiid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-metüülbensamiid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Metüülbensoaat 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrasiin 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturoon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-nitrobensamiid 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Aniliin 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-dinitrobensamiid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Karbentasiim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenool 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triasoksiid 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triasofoss 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuroon 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftaleen 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfaandiool 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiokarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-triklorobenseen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
y-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fentioon 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pürasofoss 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-endosulfaan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diklofop-metüül 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantreen 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (segu) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R&D 
Report No 106 01044 (1994) 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, pp. 285-304. 
( c ) Tööstusest saadud andmed.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  HIIDKIIVRIKU  (DAPHNIA MAGNA)  SIGIVUSE KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev sigivust kahjustava toksilisuse katse lähtub OECD juhen ­
dist TG 211 (1998).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Katse põhieesmärk on hinnata kemikaalide mõju  Daphnia magna  
sigivusele.  
1.2. MÕISTED JA ÜHIKUD  
Vanemad –  katse alguse juures olevad emased kiivrikud, kelle sigi ­
vuse uurimine on katse eesmärk.  
Järglane –  noored kiivrikud, kelle vanemad on katse jooksul ilmale 
toonud.  
Vähim toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC)  – madalaim 
uuritud kontsentratsioon, mille puhul on ainel kindlaksmääratud 
kokkupuuteaja jooksul kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt märki ­
misväärne mõju sigivusele ja vanemate suremusele (p < 0,05). Kõigil LOECst suurematel uuritavatel kontsentratsioonidel on siiski kahjulik 
mõju, mis on samaväärne või suurem kui LOEC korral täheldatav 
mõju. Kui neid kaht tingimust ei ole võimalik täita, tuleb esitada selgitus selle kohta, kuidas LOEC (ja sellest tulenevalt ka NOEC) on valitud.
 
Katsealustele organismidele täheldatavat toimet mitte avaldav 
kontsentratsioon (NOEC)  – LOECst vahetult madalam uuritav 
kontsentratsioon, millel ei ole kindlaksmääratud kokkupuuteaja 
jooksul kontrollrühmaga võrreldes statistiliselt märkimisväärset mõju (p < 0,05).
 
EC X – vees lahustatud uuritava aine kontsentratsioon, mis põhjustab 
kiivrike sigivuse vähenemist kokkupuuteaja jooksul x %.  
Sisemise kasvu määr  – populatsiooni kasvu määr, milles ühenda ­
takse sigivus ja easpetsiifiline suremus (20, 21, 22). Stabiilsetes 
populatsioonides on see null. Kasvavate populatsioonide puhul on 
see positiivne ja kahanevate populatsioonide puhul negatiivne. Kaha ­
nevad populatsioonid ei ole ilmselt jätkusuutlikud ja surevad välja.  
Avastamispiir  – madalaim kontsentratsioon, mille olemasolu on 
võimalik avastada, kuid mille kogust ei saa kindlaks määrata.  
Määramispiir  – madalaim kontsentratsioon, mille koguse saab kind ­
laks määrata.  
Suremus  – loom loetakse surnuks, kui ta ei liiguta, st ei suuda 
ujuda, või kui 15 sekundit pärast katseanuma õrna liigutamist ei ole võimalik täheldada tundlate ja tagakeha liikumist. (Kui kasuta ­
takse teistsugust määratlust, tuleb sellest teatada koos vajalike viide ­
tega.)
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Noored emased kiivrikud (vanemad), kes on katse alguses alla 24 
tunni vanad, viiakse kokku veele lisatud uuritava ainega erinevates kontsentratsioonides. Katse kestab 21 päeva. Katse lõpus hinnatakse 
iga katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elus järglaste 
koguarvu. See tähendab, et saadud noorloomi, kes katse käigus surevad, ei arvestata. Vanemate sigivust saab väljendada ka muul moel (nt looma kohta päevas saadud elusate järglaste arv alates 
esimesest päevast, mil järglaste olemasolu märgati), kuid need tuleks 
edastada lisaks katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud noorloo ­
made koguarvule. Uuritava ainega kokkupuutunud loomade sigivust 
võrreldakse kontrollrühma(de) omaga, et teha kindlaks vähim toimet 
avaldav kontsentratsioon (LOEC) ja selle põhjal ka täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC). Lisaks sellele analüü ­
sitakse andmeid võimaluse korral regressioonimudeli abil, et hinnata 
kontsentratsiooni, mis põhjustaks sigivuse vähenemise x % (st EC
 50 , 
EC 20 või EC  10 ). 
Andmed tuleb esitada ka vanemate ellujäämise ja esimeste järglaste 
saamise aja kohta. Uurida võib ka muid ainega seotud mõjusid loomade näitajatele, näiteks kasvule (pikkus), ja võimaluse korral 
ka sisemise kasvu määra.
 
1.4. TEAVE UURITAVA AINE KOHTA  
Olemas peaksid olema andmed hiidkiivrikuga tehtud ägeda toksili ­
suse katse kohta (vt meetod C.2, I osa). Tulemused võivad aidata valida sigivust puudutavate katsete jaoks sobivaid uuritavate kontsen ­
tratsioonide vahemikke. Teada peaksid olema uuritava aine lahus ­
tuvus vees ja aururõhk ning olemas peaks olema usaldusväärne 
analüütiline meetod, mille abil määrata kindlaks aine kogus uuritavas lahuses ja mille kohta on teada tulemuslikkus ja määramispiir.
 
Katsetingimuste kindlaksmääramisel võib olla kasulik järgmine uuri ­
tavat ainet puudutav teave: struktuurivalem, aine puhtus, püsivus 
valguse käes, püsivus katsetingimustes, pKa, P  ow ja katse tulemused 
seoses biolagunduvusega (vt meetod C.4).  
1.5. KATSE VALIIDUSUS  
Katse valiidsuse kohta kehtivad järgmised tingimused (kontrollrüh ­
mades):  
— vanemate (emaste kiivrike) suremus ei ületa katse lõpus 20 %;  
— katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elusate järglaste 
keskmine arv on ≥ 60. 
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Seadmed  
Katseanumad ja muud seadmed, mis puutuvad kokku uuritava lahus ­
tega, peaksid olema üleni klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. Katseanumad on tavaliselt klaasist keeduklaasid.
 
Lisaks võib vaja minna veel järgmisi vahendeid:  
— hapnikumõõtja (mikroelektroodi või muu sobiva seadmega, mis 
võimaldaks mõõta lahustunud hapnikku väikese ruumalaga proo ­
vides);  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— temperatuuri reguleerimiseks vajalikud seadmed;  
— pH-meeter;  
— seadmed vee kareduse määramiseks;  
— seadmed vee summaarse orgaanilise süsiniku sisalduse määrami ­
seks või seadmed keemilise hapnikutarbe määramiseks;  
— sobivad seadmed valgusrežiimi kontrollimiseks ja valguse inten ­
siivsuse mõõtmiseks.  
1.6.2.  Katsealune organism  
Katses kasutatav liik on  Daphnia magna  Straus. Muid  Daphnia  liike 
võib kasutada tingimusel, et nad vastavad vajalikele valiidsuskritee ­
riumidele (kontrollrühma sigivusega seotud valiidsuskriteerium peaks olema  Daphnia  liikidele iseloomulik). Kui kasutatakse muid  
Daphnia  liike, tuleb nad selgelt identifitseerida ja nende kasutamine 
põhjendada.
 
Eelistatavalt tuleks kloon identifitseerida genotüübi määramise teel. 
Teadusuuringud (1) on näidanud, et klooni A (pärit IRCHAst Prant ­
susmaalt) (3) sigivuse puhul on keskmine valiidsuskriteerium järje ­
kindlalt ≥ 60 järglast ellujäänud vanema kohta, kui kultiveerimine 
toimub käesoleva meetodi tingimuste kohaselt. Vastuvõetav on ka 
muude kloonide kasutamine, kui tõendatakse, et kiivrike kultuur 
vastab katse valiidsuskriteeriumidele.  
Katse alguses ei tohi loomad olla üle 24 tunni vanad ning nad ei tohi 
olla esimese haudme järglased. Loomad peaksid olema terved (st neil ei tohi olla selliseid stressi tunnuseid nagu kõrge suremus, isaste ja rüpjade esinemine, esimese haudme saamise viibimine, loomade 
värvuse muutumine jms). Loomi tuleks säilitada katsetingimustega 
sarnastes kultiveerimistingimustes (valgus, temperatuur, katsevedelik, söötmine ja loomade arv ühikuruumala kohta). Kui katses kasutatav kiivriku kultiveerimise keskkond erineb keskkonnast, mida kasuta ­
takse kiivriku rutiinse kultiveerimise puhul, on hea tava kasutada 
vanemate stressi vältimiseks enne katset tavaliselt umbes kolme nädala pikkust (st üks põlvkond) aklimatiseerimisperioodi.
 
1.6.3.  Katsekeskkond  
Kõnealuses katses on soovitatav kasutada täielikult määratletud kesk ­
konda. See aitab vältida raskesti iseloomustatavate lisaainete (nt merevetikad, mullaekstraktid jms) kasutamist ja parandab seega labo ­
ritevahelise standardimise võimalusi. On leitud, et selleks otstarbeks 
sobivad keskkonnad on Elendt M4 (4) ja M7 (vt 1. liidet). Eeldusel, 
et kiivrikukultuur vastab katse valiidsuskriteeriumidele, on vastuvõe ­
tavad siiski ka muud keskkonnad (nt 5, 6).
 
Kui kasutatakse määratlemata lisaaineid sisaldavat keskkonda, tuleb 
need lisaained selgelt määratleda ning katsearuandes tuleks esitada teave koostise ja eelkõige süsinikusisalduse kohta, sest see võib 
toetada toiduvalikut. Soovitav on kindlaks määrata orgaanilise lisa ­
aine põhilahuse summaarne orgaanilise süsiniku sisaldus ja/või keemiline hapnikutarve ja hinnata sellest tulenev panus summaarses orgaanilises süsiniku sisalduses/keemilises hapnikutarbes katsekesk ­
konnas. Keskkonna summaarse orgaanilise süsiniku sisalduse tase 
(enne vetikate lisamist) võiks olla madalam kui 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Kui uuringud tehakse metalle sisaldavate ainetega, on oluline meeles 
pidada, et katsekeskkonna omadused (nt karedus, kelaatimisvõime) 
võivad mõjutada uuritava aine toksilisust. Seepärast on soovitav kasutada täpselt määratletud keskkonda. Praegu on ainsad täpselt määratletud keskkonnad, mis teadaolevalt sobivad  Daphnia magna  
pikaajaliseks kultiveerimiseks, Elendt M4 ja M7. Mõlemad kesk ­
konnad sisaldavad kelaativat ainet EDTA. Töö on näidanud (2), et kui sigivust puudutav katse sooritatakse M4 ja M7 keskkonnas, on kaadmiumi „näiline mürgisus” üldiselt madalam katsekeskkonna 
puhul, milles puudub EDTA. Seepärast ei soovitata M4 ja M7 kasu ­
tada uuringute tegemiseks metalle sisaldavate ainetega ning vältida tuleks ka muid keskkondi, mis sisaldavad teadaolevaid kelaativaid aineid. Metalli sisaldavate ainete puhul on soovitatav kasutada alter ­
natiivset keskkonda, näiteks ASTMi taastatud karedat magedat vett 
(7), mis ei sisalda EDTA-d ja millele on lisatud vetikaekstrakti (8). Kõnealune ASTMi taastatud kareda mageda vee ja vetikaekstrakti kombinatsioon on sobiv ka hiidkiivriku pikaajaliseks kultiveerimi ­
seks ja uuringute tegemiseks (2), kuigi lisatud vetikaekstrakti orgaa ­
nilise komponendi tõttu võib sellel olla kergelt kelaativ toime.
 
Katse alguses ja selle jooksul peaks lahustunud hapniku sisaldus 
olema üle 3 mg/l. pH peaks olema vahemikus 6–9 ning tavaliselt 
ei tohiks see ühe katse jooksul kõikuda rohkem kui 1,5 ühikut. Soovitatav karedus on üle 140 mg/l (väljendatud CaCO
 3 ). Kõnealu ­
sel tasemel tehtud katsete puhul on sigivus olnud vastavuses valiid ­
suskriteeriumidega (9, 10).  
1.6.4.  Uuritavad lahused  
Valitud kontsentratsiooniga uuritavad lahused valmistatakse tavaliselt 
põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahuse valmistamiseks on soovi ­
tatav lahustada aine katsekeskkonnas.  
Mõningatel juhtudel tuleb piisava kontsentratsiooniga põhilahuse 
saamiseks kasutada orgaanilisi lahusteid või dispergaatoreid, kuid selliste materjalide kasutamist tuleks igati vältida. Sobivad lahustid 
on näiteks atsetoon, etanool, metanool, dimetüülformamiid ja trietü ­
leenglükool. Sobivad dispergaatorid on näiteks Cremophor RH 40, 0,01 % metüültselluloos ja HCO-40. Mingil juhul ei tohiks uuritava aine hulk uuritavates lahustes ületada lahustuvuse piiri katsekesk ­
konnas.
 
Lahusteid kasutatakse selleks, et saada põhilahus, mida on võimalik 
täpselt vette annustada. Kui lahusti kontsentratsioon lõplikus katse ­
keskkonnas on soovitataval tasemel (st ≤ 0,1 ml/l), ei ole eespool 
loetletud lahustid toksilised ega suurenda aine lahustuvust vees.  
Dispergaatorid võivad kaasa aidata täpsele annustamisele ja disper ­
geerimisele. Kui dispergaatori kontsentratsioon lõplikus katsekesk ­
konnas on soovitataval tasemel ( ≤ 0,1 ml/l), ei ole eespool loetletud 
dispergaatorid toksilised ega suurenda aine lahustuvust vees.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. KATSE KAVANDAMINE  
Uuritava aine jaotamine katseanumatesse ja katseanumate hilisem 
käitlemine peaks toimuma korrapäratult. Kui nii ei tehta, võib see põhjustada nihke, mida võib tõlgendada kontsentratsiooni mõjuna. 
Eelkõige juhul, kui katseühikuid käideldakse jaotamise või kontsen ­
tratsiooni järjekorras, võib mõni ajaga seotud tegur, näiteks uuringu läbiviija väsimus või muu viga, põhjustada suurema kontsentrat ­
siooni korral tugevamaid mõjusid. Kui katse tulemusi võivad mõju ­
tada tingimused katse alguses või keskkonnatingimused, näiteks 
asukoht laboris, tuleks kaaluda katse katkestamist.
 
1.8. KATSE KÄIK  
1.8.1.  Kokkupuutetingimused  
1.8.1.1.  Kestus  
Katse kestab 21 päeva.  
1.8.1.2.  Laadimine  
Vanemad jaotatakse ükshaaval katseanumatesse üks loom anuma 
kohta, kus on 50–100 ml katsevedelikku.  
Vahel võib uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks kasutatava 
analüütilise menetluse nõuete täitmiseks kasutada suuremaid kogu ­
seid, kuid lubatud on ka dubleerivate proovide kogumine keemilise 
analüüsi jaoks. Kui kasutatava katsevedeliku ruumala on üle 100 ml, 
võib kiivrikutele antava toidu hulka suurendada, et tagada piisava toidu olemasolu ja vastavus valiidsuskriteeriumidele. Läbivoolukat ­
sete korral võib tehnilistel põhjustel kaaluda teistsugust uuringu 
kavandamist (nt neli kümnekiivrikulist rühma suuremas katseruu ­
malas), kuid kõigist uuringu plaani muudatustest tuleks teatada.
 
1.8.1.3.  Loomade arv  
Poolstaatiliste katsete puhul vähemalt 10 eraldi peetavat looma iga 
uuritava kontsentratsiooni kohta ja vähemalt 10 eraldi peetavat looma kontrollrühmas.
 
Läbivoolukatsete korral on osutunud sobivaks 40 looma kasutamine, 
kes on jagatud nelja kümneliikmelisse rühma iga uuritava kontsen ­
tratsiooni kohta (1). Kasutada võib ka väiksemat katsealuste organis ­
mide hulka ning soovitatav on kontsentratsiooni kohta vähemalt 20 looma, kes on jagatud kahe või enama võrdse loomade arvuga dubleeriva proovi vahel (nt neli dubleerivat proovi, igas neist viis 
kiivrikut). Tuleb märkida, et kui loomi peetakse rühmadena, ei saa 
sigivust väljendada iga katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elus järglaste koguarvuna, juhul kui vanemad surevad. Sellistel juhtudel tuleks sigivust väljendada katse alguses elus olnud iga 
vanema kohta saadud elus järglaste koguarvuna.
 
1.8.1.4.  Söötmine  
Poolstaatiliste katsete puhul peaks kiivrikke söötma iga päev ning 
soovitatavalt vähemalt kolm korda nädalas (st vastavalt katsekesk ­
konna vahetusele). Kõrvalekalletest (nt läbivoolukatsete korral) 
tuleks teatada.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Katse jooksul peaksid vanemate söödavaliku moodustama peamiselt 
ühe või mitme järgmise vetikaliigi elusad rakud:  Chlorella  sp., Sele­
nastrum capricornutum  (nüüd  Pseudokirchneriella subcapitata  (11)) 
ja Scenedesmus subspicatus.  Söödavaliku aluseks peaks olema igale 
vanemale pakutava orgaanilise süsiniku (C) kogus. Teadusuuringud 
(12) on näidanud, et hiidkiivrikute puhul on annus 0,1–0,2 mg süsi ­
nikku kiivriku kohta päevas piisav, et saada katse valiidsuskriteeriu ­
mide täitmiseks vajalik arv järglasi. Sööta võib anda püsiva kogu ­
sena kogu katseperioodi jooksul või soovi korral võib alguses kasu ­
tada väiksemat kogust, mida siis katse käigus suurendatakse, et võtta 
arvesse vanemate kasvamist. Sellisel juhul peaks sööda kogus jääma siiski soovitatava annuse piiresse 0,1–0,2 mg süsinikku kiivriku kohta päevas kogu katse vältel.
 
Kui nõutava annuse söötmisel kasutatakse asendusmeetmeid, näiteks 
vetikarakkude arvu või valguse neeldumist (näiteks lihtsustamise huvides, kuna süsinikusisalduse mõõtmine on aeganõudev), peab iga laboratoorium koostama oma nomogrammi, millelt oleks näha 
asendusmeetme ja vetikakultuuri süsinikusisalduse seos (nõuandeid 
nomogrammi koostamise kohta vt 2. liidet). Nomogramme tuleks kontrollida vähemalt kord aastas ja juhul, kui vetikakultuuri tingi ­
mused on muutunud, siis tihemini. On leitud, et süsinikusisalduse 
puhul on parem kasutada valguse neeldumist kui rakkude arvu (13).
 
Selleks, et minimeerida vetikakultuuri keskkonna sattumine katsea ­
numatesse, tuleks kiivrikuid sööta kontsentreeritud vetikasuspensioo ­
niga. Vetikaid saab kontsentreerida tsentrifuugimisega, millele 
järgneb resuspensioon destilleeritud vees, deioniseeritud vees või 
kiivrikute kasvukeskkonnas.  
1.8.1.5.  Valgus  
16 tundi valgust, mille intensiivsus ei ole suurem kui 15–20 
μE· m –2 · s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatuur  
Katsekeskkonna temperatuur peaks olema vahemikus 18–22  o C. Ühe 
individuaalse katse puhul ei tohiks temperatuur nimetatud piirides 
võimaluse korral siiski kõikuda rohkem kui 2  o C (st 18–20, 19–21 
või 20–22  o C). Temperatuuri jälgimiseks võib olla otstarbekas kasu ­
tada täiendavat katseanumat.  
1.8.1.7.  Õhustus  
Katseanumaid ei tohi katse käigus õhustada.  
1.8.2.  Uuritav kontsentratsioon  
Tavaliselt peaks kasutama vähemalt viit uuritavat kontsentratsiooni 
geomeetrilises jadas, mille eraldustegur ei tohiks soovitatavalt olla 
suurem kui 3,2, ning iga uuritava kontsentratsiooni puhul tuleks kasutada sobivat arvu dubleerivaid proove (vt punkti 1.8.1.3). Vähema kui viie kontsentratsiooni kasutamine tuleb põhjendada. 
Aineid ei tohiks uurida, kui kontsentratsioon katsekeskkonnas on 
kõrgem kui nende lahustuvuse piir.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Kontsentratsioonivahemike määratlemisel tuleks meeles pidada järg ­
mist:  
i) kui eesmärk on määrata kindlaks LOEC/NOEC, peab madalaim 
uuritav kontsentratsioon olema piisavalt madal, et sigivus sellise 
kontsentratsiooni juures ei oleks märkimisväärselt madalam kui 
kontrollrühmas. Vastupidisel juhul tuleb katset korrata väiksema madalaima kontsentratsiooniga;
 
ii) kui eesmärk on määrata kindlaks LOEC/NOEC, peab kõrgeim 
katsekontsentratsioon olema piisavalt kõrge, et sigivus sellise kontsentratsiooni juures oleks märkimisväärselt madalam kui kontrollrühmas. Vastupidisel juhul tuleb katset korrata suurema 
kõrgeima kontsentratsiooniga;
 
iii) kui hinnatakse EC  X mõju sigivusele, on soovitatav kasutada 
kontsentratsioone, mis oleksid piisavad, et määratleda EC  X vaja­
likul usaldusväärsuse tasemel. Kui hinnatakse EC  50 mõju sigivu ­
sele, on soovitatav, et kõrgeim uuritav kontsentratsioon oleks suurem kui kõnealune EC
 50 . Kuigi vastupidisel juhul on 
võimalik hinnata EC  50 , on EC  50 usaldusvahemik väga suur 
ning kasutatud mudeli adekvaatsuse hindamine rahuldaval moel 
ei pruugi olla võimalik;  
iv) uuritavate kontsentratsioonide vahemik ei tohiks hõlmata kont ­
sentratsioone, millel on statistiliselt märkimisväärne mõju täis ­
kasvanud isendite eluspüsimisele, kuna sellisel juhul ei uurita selle katsega enam mitte ainult sigivust, vaid sigivuse ja sure ­
muse kombinatsiooni, ning see eeldaks palju keerukama statisti ­
lise analüüsi kasutamist.
 
Eelnevad teadmised uuritava aine toksilisusest (nt ägeda toksilisuse 
katse ja/või vahemiku leidmise katsed) peaksid aitama sobivaid uuri ­
tavaid kontsentratsioone välja valida.  
Kui uuritava lahuse valmistamiseks kasutatakse lahustit või disper ­
gaatorit (vt punkti 1.6.4), ei tohiks selle lõplik kontsentratsioon 
katseanumas olla suurem kui 0,1 ml/l ning see kontsentratsioon 
peaks kõigis katseanumates olema sama.  
1.8.3.  Kontrollkatsed  
Lisaks katseseeriale tuleks teha üks katsekeskkonna kontrollkatsete 
seeria ja vajaduse korral ka üks lahustit või dispergaatorit sisaldav 
kontrollkatsete seeria. Lahusti või dispergaatori korral peaks nende kontsentratsioon olema sama mis uuritavat ainet sisaldavates anumates. Kasutada tuleks sobivat hulka dubleerivaid proove (vt 
punkti 1.8.1.3).
 
Tavaliselt peaks korralikult läbiviidud katse puhul olema kontroll ­
rühmas (kontrollrühmades) vanema kohta saadud elus järglaste kesk ­
mise arvu variatsioonikordaja ≤ 25 % ning see tuleks ära märkida, 
kui katses kasutatakse eraldi peetavaid loomi.  
1.8.4.  Katsekeskkonna uuendamine  
Katsekeskkonna uuendamise sagedus sõltub uuritava aine püsivusest, 
kuid see sagedus peaks olema vähemalt kolm korda nädalas. Kui 
esialgse püsivuse katse (vt punkti 1.4) käigus ilmneb, et maksimaalse 
uuendamisperioodi (st kolme päeva) jooksul ei ole uuritava aine kontsentratsioon püsiv (st väljaspool 80–120 % vahemikku või madalam kui 80 % esialgsest mõõdetud kontsentratsioonist), tuleks 
kaaluda katsekeskkonna sagedasemat uuendamist või kasutada läbi ­
voolukatset.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Kui katsekeskkonda uuendatakse poolstaatiliste katsete puhul, 
valmistatakse ette teine seeria katseanumaid ning vanemad teisalda ­
takse nendesse näiteks sobiva läbimõõduga klaaspipeti abil. Koos kiivrikutega teisaldatava katsevedeliku kogus peaks olema mini ­
maalne.
 
1.8.5.  Vaatlused  
Katse jooksul tehtud vaatluste tulemused tuleks panna kirja andme ­
lehtedele (vt näidiseid 3. ja 4. liites). Kui on vaja teha muid määra ­
misi (vt 1.3 ja 1.8.8), võib vajalikuks osutuda täiendavate vaatluste tegemine.
 
1.8.6.  Järglased  
Iga vanema järglased tuleks eelistatavalt pärast esimese haudme 
ilmumist iga päev eemaldada ja üle lugeda, et nad ei saaks ära 
süüa täiskasvanud isendile mõeldud sööta. Käesoleva meetodi puhul tuleb üle lugeda ainult elusad järglased, kuid kirja tuleks panna ka aborteerunud munad ja surnud järglased.
 
1.8.7.  Suremus  
Vanemate suremus tuleks registreerida soovitatavalt kord päevas 
vähemalt järglaste loendamisega samal ajal.  
1.8.8.  Muud parameetrid  
Kuigi selle meetodi põhieesmärk on hinnata mõjusid sigivusele, on 
võimalik ka muude mõjude esinemine piisavates kogustes selleks, et neid statistiliselt analüüsida. Väga soovitatav on kasvuandmete kogu ­
mine, sest see annaks teavet võimalike subletaalsete mõjude kohta, 
mis võivad olla kasulikumad kui ainult sigivust käsitlevate mõõt ­
miste tulemused; katse lõpus on soovitatav mõõta vanemate pikkus (st kehapikkus, v.a koja tagaotsas olev oga). Lisaks sellele võib 
mõõta või arvutada veel järgmised parameetrid: aeg esimese haudme 
(ja sellele järgnevate haudmete) saamiseni, haudmete arv ja suurus looma kohta, aborteerunud haudmete arv, isasloomade ja rüpjade esinemine ja populatsiooni kasvu sisemine määr.
 
1.8.9.  Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus  
Hapnikusisaldust, temperatuuri, vee karedust ja pH taset tuleks 
mõõta vähemalt kord nädalas värskes ja vanas katsekeskkonnas, kontrollrühmas (-rühmades) ja kõrgeima uuritava aine kontsentrat ­
siooniga katseanumas.
 
Katse käigus määratakse uuritava aine kontsentratsioon kindlaks 
korrapäraste ajavahemike järel.  
Poolstaatiliste katsete puhul, kui võib eeldada, et uuritava aine kont ­
sentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest (st vahemikku 
80–120 %; vt 1.4 ja 1.8.4), on soovitatav analüüsida vähemalt mada ­
laimat ja kõrgeimat uuritavat kontsentratsiooni vahetult pärast valmistamist ja uuendamise ajal üks kord esimese nädala jooksul (st analüüsida tuleks proovi, mis on võetud samast lahusest – kohe 
pärast valmistamist ja uuendamise ajal). Hiljem tuleks nimetatud 
määramisi korrata vähemalt iga nädala järel.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Kui katsete puhul ei eeldata, et uuritava aine kontsentratsioon jääb 
vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, tuleb analüüsida kõiki uuritavaid 
kontsentratsioone vahetult pärast valmistamist ja uuendamise ajal. Kui aga tegemist on katsega, mille puhul esialgne mõõdetud uuritava aine kontsentratsioon ei jää vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, kuid 
esitatakse piisavalt tõendeid selle kohta, et esialgsed kontsentrat ­
sioonid on korratavad ja püsivad (st jäävad vahemikku 80–120 % esialgsest kontsentratsioonist), võib katse teisel ja kolmandal nädalal keemilisi määramisi vähendada ja piirduda vaid kõrgeima ja mada ­
laima uuritava kontsentratsiooni analüüsimisega. Igal juhul tuleb 
enne uuendamist määrata uuritava aine kontsentratsioon ainult ühel dubleerivat proovi sisaldaval anumal iga uuritava kontsentratsiooni kohta.
 
Kui kasutatakse läbivoolukatset, on otstarbekas kasutada samasugust 
korda nagu poolstaatiliste katsete puhul kirjeldatud (kuid sellisel 
juhul ei ole võimalik mõõta „vanu” lahuseid). Siiski võib olla soovi ­
tatav suurendada proovide võtmise arvu esimesel nädalal (nt kolm mõõtmist), et tagada uuritavate kontsentratsioonide püsivuse säili ­
mine. Seda tüüpi katsete puhul tuleks lahjendusvedeliku ja uuritava 
aine voolukiirust kontrollida iga päev.
 
Kui on tõendeid selle kohta, et uuritava aine kontsentratsioon on 
kogu katse vältel püsinud rahuldaval moel vahemikus ± 20 % nimi ­
väärtusest või esialgselt mõõdetud kontsentratsioonist, võivad tule ­
mused põhineda nimiväärtusel või esialgselt mõõdetud väärtusel. Kui 
kõrvalekaldumine nimiväärtusest või esialgselt mõõdetud kontsen ­
tratsioonist on suurem kui ± 20 %, tuleks tulemused esitada aja- kaalu keskmistena (vt 5. liidet).
 
2. ANDMED JA ARUANDLUS  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Käesoleva katse eesmärk on määrata kindlaks uuritava aine mõju 
katse lõpus elus olevate vanemate kohta saadud elus järglaste 
koguarvule. Vanema kohta saadud järglaste koguarv tuleks arvutada 
iga katseanuma (st iga dubleeriva proovi) kohta. Kui mõnes dublee ­
rivas proovis kasutatav vanem sureb katse ajal või osutub isasloo ­
maks, jäetakse see dubleeriv proov analüüsist välja. Analüüsi aluseks 
võetakse sel juhul väiksem arv dubleerivaid proove.  
Kui hinnatakse kemikaali mõju sigivusele ja määratakse LOEC ja 
seega ka NOEC, tuleb arvutada keskmine sigivus dubleerivate proo ­
vide lõikes iga kontsentratsiooni puhul ja summaarse standardhälbe jääk ning seda saab teha dispersioonanalüüsiga (ANOVA). Seejärel tuleb iga kontsentratsiooni keskmist võrrelda kontrollrühma keskmi ­
sega, kasutades selleks sobivat mitmese võrdluse meetodit. Dunnetti 
ja Williamsi katsed võivad olla kasulikud (14, 15, 16, 17). Tuleb kontrollida, kas ANOVA eeldus dispersiooni homogeensuse kohta peab paika. Seda oleks soovitatav teha graafiliselt, mitte formaalse 
statistilise olulisuse katsega (18); alternatiivse võimalusena võib teha 
Bartletti katse. Kui see eeldus ei pea paika, tuleks kaaluda andmete teisendamist, et homogeniseerida dispersioon enne ANOVA tege ­
mist, või kaalutud ANOVA tegemist. ANOVA abil täheldatud 
mõju suurus (st väikseim tähendust omav erinevus) tuleks välja 
arvutada ja aruandesse kirja panna.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Sellise kontsentratsiooni hindamiseks, mis põhjustaks paljunemis ­
võime 50 % vähenemise (st EC  50 ), tuleks andmetega sobitada 
sobiv kõver, näiteks logistiline kõver, kasutades näiteks sellist statis ­
tikameetodit nagu vähimruutude meetod. Kõvera võiks parametrisee ­
rida nii, et EC  50 ja selle standardviga saaks vahetult hinnata. See 
hõlbustaks märkimisväärselt EC  50 usalduspiiri arvutamist. Kui 
puuduvad põhjused eelistada teistsuguseid usaldusnivoosid, tuleks kasutada kahepoolset 95 % usalduspiiri. Sobituskord võiks olla selline, et selle põhjal saaks hinnata sobivuse puudumise tähendust. 
Seda saab teha graafiliselt või jagades ruutude jääksumma sobivuse 
puudumise ja puhta vea komponentideks ning tehes sobivuse puudu ­
mise statistilise olulisuse katse. Selliste menetluste puhul, millega kaasneb sigivuse kõrge tase, on saadud noorloomade arvu disper ­
sioon tõenäoliselt suurem kui menetluse puhul, millega kaasneb sigi ­
vuse madal tase, ja seetõttu tuleks kaaluda täheldatud väärtuste kaalumist selliselt, et neis kajastuks erinev dispersioon eri menetlus ­
rühmades (taustainfo kohta vt viidet 18).
 
Lõpliku laboritevahelise võrdlusuuringu (2) andmete analüüsimiseks 
sobitati logistiline kõver järgmise valemi abil, kuid kasutada võib ka 
muid sobivaid valemeid:  
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
kus: 
Y = katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud noorloomade 
koguarv (arvutatud iga anuma kohta)  
x = aine kontsentratsioon  
c = noorloomade eeldatav arv, kui x = 0  
x 0 = populatsiooni EC  50 
b = tõusu iseloomustav parameeter.  
Nimetatud valem sobib tõenäoliselt suure hulga olukordade jaoks, 
kuid on olemas ka katseid, mille jaoks see ei sobi. Valemi valiidsust tuleks kontrollida eespool soovitatud viisil. Mõningatel juhtudel võib 
otstarbekaks osutuda hormeesivalem, mille puhul madalal kontsen ­
tratsioonil on märkimisväärne mõju (19).
 
Hinnata võib ka muid mõjuga seotud kontsentratsioone, näiteks EC  10 
ja EC  20 , kuigi valemi puhul võiks eelistada teistsugust parametrisee ­
rimist kui seda, mille abil hinnati EC  50 . 
2.2. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
2.2.1.  Uuritav aine:  
— füüsikaline loomus ja asjaomased füüsikalis-keemilised;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— omadused, keemilised identifitseerimisandmed, sealhulgas 
puhtus.  
2.2.2.  Katsealused liigid:  
— kloon (kas genotüüp on määratud), tarnija või päritolu (kui on 
teada) ja kasutatud kultiveerimistingimused. Kui kasutatakse 
muud hiidkiivriku liiki, tuleks see ära märkida ja seda põhjen ­
dada.  
2.2.3.  Katsetingimused:  
— kasutatud katsemeetod (nt poolstaatiline või läbivoolukatse, 
ruumala, kiivrikute arv liitri kohta);  
— fotoperiood ja valguse intensiivsus;  
— katse kavandamine (nt dubleerivate proovide arv, vanemate arv 
dubleeriva proovi kohta),;  
— andmed kasutatud kultiveerimiskeskkonna kohta;  
— vajaduse korral kasutatud orgaanilised lisaained, sh koostis, päri ­
tolu, valmistusmeetod, põhilahuse summaarne orgaanilise süsi ­
niku sisaldus/keemiline hapnikutarve, sellest tulenev summaarse 
orgaanilise süsiniku sisalduse/keemilise hapnikutarbe hindamine 
katsekeskkonnas;  
— üksikasjalikud andmed söötmise kohta, sealhulgas kogus (mg C 
kiivriku kohta päevas) ja ajakava (nt sööda (söötade) liik, sh 
vetikate puhul konkreetne (liigi) nimi ja võimaluse korral ka 
liin, kultiveerimistingimused);  
— põhilahuse valmistamise meetod ja uuendamissagedus (kui kasu ­
tatakse lahustit või dispergaatorit, tuleb esitada selle nimi ja kont ­
sentratsioon).  
2.2.4.  Tulemused:  
— võimalike uuritava aine püsivust käsitlevate eeluuringute tule ­
mused;  
— nominaalsed uuritavad kontsentratsioonid ja kõigi uuritava aine 
kontsentratsiooni määramiseks katseanumates tehtud analüüside tulemused (vt andmelehtede näidised 4. liites); esitada tuleks ka meetodi tulemuslikkus ja määramispiir;
 
— katseanumates oleva vee kvaliteet (st pH, temperatuur ja lahus ­
tunud hapniku sisaldus, summaarne orgaanilise süsiniku sisaldus ja/või keemiline hapnikutarve ja vajaduse korral vee karedus) (vt andmelehe näidist 3. liites);
 
— täielikud andmed iga vanema saadud elus järglaste kohta (vt 
andmelehe näidist 3. liites);  
— vanemate surmajuhtude arv ja surmapäev (vt andmelehe näidist 
3. liites);  
— kontrollrühma sigivuse variatsioonikordaja (katse lõpus elus 
oleva vanema kohta saadud elus järglaste koguarvu põhjal);  
— graafik, mis kirjeldab katse lõpus elus oleva vanema (iga dublee ­
riva proovi puhul) kohta saadud järglaste koguarvu suhet uuritava 
aine kontsentratsiooniga;  
— vähim sigivusele toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC), sh 
kasutatud statistiliste menetluste kirjeldus ja märge selle kohta, kui suurt mõju täheldati, ning sigivusele täheldatavat toimet 
mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC); vajaduse korral tuleks 
esitada LOEC/NOEC ka vanemate suremuse kohta;
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— vajaduse korral sigivuse EC  X ja usaldusvahemikud ja selle arvu ­
tamiseks kasutatud sobitatud valemi graafik, annuse-reaktsiooni 
kõvera tõusja selle standardviga;  
— muud täheldatud bioloogilised mõjud või mõõtmised; esitada 
tuleb andmed kõigi täheldatud või mõõdetud bioloogiliste mõjude kohta (nt vanemate kasv) koos võimalike asjakohaste 
põhjendustega;
 
— selgitused kõigi katsemeetodist kõrvalekaldumiste kohta.  
3. VIITED  
1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
 
2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on 
Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of 
the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.  
3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265.
 
4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.
 
5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine 
Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
 
6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, pp. 775-782.  
7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. 20 pp.
 
8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1stEuropean 
Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, 
H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148.
 
9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8.
 
10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196.
 
11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a stan ­
dard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459-466.
 
14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, pp. 1096-1121.  
15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.  
18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, pp. 93-96.  
20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Popula ­
tion Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, pp. 532.  
22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
1. liide  
TÄIELIKULT MÄÄRATLETUD ELENDTI KESKKONDADE M7 JA M4  
Valmistamine  
Kohanemine Elendti keskkondadega M7 ja M4  
Mõningates laboratooriumites on olnud raskusi kiivrikute viimisega otse kesk ­
konda m4 (1) ja m7. Mõningast edu on siiski saavutatud järkjärgulise aklimati ­
seerimisega, st viimine oma keskkonnast 30 % elendti sisaldusega keskkonda, 
seejärel 60 % ja siis 100 % elendti sisaldusega keskkonda. Kohanemisaeg võib kesta kuni kuu aega.
 
Valmistamine  
Mikroelemendid  
Kõigepealt valmistatakse sobiva puhtusastmega vees, nt deioniseeritud, destillee ­
ritud või pöördosmoosi teel puhastatud vees individuaalsete mikroelementide eraldi põhilahused (I). Nendest erinevatest põhilahustest (I) valmistatakse üks 
põhilahus (II), mis sisaldab kõiki mikroelemente (kombineeritud lahus), st:
 
Põhilahused I 
(üks aine) Vette lisatav hulk 
(mg/l) Kontsentratsioon 
(keskkonnas M4) 
(kordades) Kombineeritud põhilahuse II 
valmistamiseks lisada veele järgmine 
kogus põhilahust I 
(ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 * 2H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl2 * 6H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7H  2 O 1 991 2 000 — — 
Nii Na  2 EDTA kui ka FeSO  4 lahused valmistatakse eraldi, valatakse kokku ja autoklaavitakse kohe. Tulemuseks 
saadakse: 
21 Fe-EDTA lahus 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
Keskkonnad M4 ja M7  
Keskkondade M4 ja M7 valmistamiseks kasutatakse põhilahust II, makroele ­
mente ja vitamiine järgmiselt:  
Vette lisatav hulk 
(mg/l) Kontsentratsioon 
(keskkonnas M4) 
(kordades) Keskkonna valmistamiseks lisatud 
põhilahuse hulk 
(ml/l) 
M4 M7  
Põhilahus II, kombineeritud mikroelemendid 20 50 50 
Makroelementide põhilahused (üks aine) CaCl
 2 * 2H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KC1 58 000 10 000 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Kombineeritud vitamiinide lahus — 10 000 0,1 0,1 
Kombineeritud vitamiinide lahuse valmistamiseks lisatakse 3 vitamiini 1 liitrile veele järgmiselt: Tiamiinhüdrokloriid 750 10 000 — — Tsüanokobalamiin (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotiin 7,5 10 000 — —  
Kombineeritud vitamiinide lahust säilitatakse külmutatuna väikestes alikvootides. Vitamiinid lisatakse katsekeskkonnale vahetul t enne 
kasutamist.  
Märkused  Soolade sadestumise vältimiseks valmiskeskkonna valmistamisel lisatakse põhilahuse alikvoodid umbes 500–800 ml deioni ­
seeritud veele ning seejärel lisatakse juurde nii palju vett, et kokku saaks 1 liiter. 
M4 keskkonda käsitleva uuringu esimene väljaanne: Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural 
approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
2. liide  
SUMMAARSE ORGAANILISE SÜSINIKU SISALDUSE ANALÜÜS JA 
VETIKATEL PÕHINEVA SÖÖDA JAOKS SUMMAARSE ORGAANI ­
LISE SÜSINIKU SISALDUSE NOMOGRAMMI KOOSTAMINE  
On teada, et vetikatel põhineva sööda süsinikusisaldust ei mõõdeta tavaliselt otse, 
vaid asendusparameetrite mõõtmistest (nt vetikarakkude arv või valguse neel ­
duvus) tulenevate korrelatsioonide (st nomogrammi) põhjal.  
Summaarset orgaanilise süsiniku sisaldust tuleks mõõta pigem kõrgel temperatuuril 
toimuva oksüdatsiooni kui UV või persulfaatmeetodiga. (Vt: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Deter ­
minands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
 
Nomogrammi koostamiseks tuleks vetikad eraldada kasvukeskkonnast tsentrifuu ­
gimisega, mille järgneb resuspendeerimine destilleeritud vees. Asendusparameeter ja summaarne orgaanilise süsiniku sisaldus tuleb mõõta igas proovis kolm korda. Analüüsida tuleks ainult destilleeritud ve sisaldavaid proove ning summaarne 
orgaanilise süsiniku sisaldus leitakse saadud sisalduse lahutamisel vetikaproovi 
summaarse orgaanilise süsiniku sisaldusest.
 
Nomogramm peaks nõutava süsinikusisalduse vahemikus olema lineaarne. Näited 
on esitatud allpool.  
Märkus. Neid ei tohiks kasutada teisendamiseks; on oluline, et laboratooriumid 
koostaksid oma nomogrammid ise.
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
3. liide  
SELLISE ANDMELEHE NÄIDIS, MILLELE MÄRGITAKSE KESKKONNA UUENDAMINE, FÜÜSIKALISE/KEEMILISE JÄLGIMISE ANDMED, SÖÖTMINE, KIIVRIKUTE  
SIGIVUS JA TÄISKASVANUD ISENDITE SUREMUS  
Katse nr: Algkuupäev: Kloon: Keskkond: Sööda liik: Uuritav aine: Nimikontsentratsioon: 
Päev 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Keskkonna uuenda ­
mine (märkida 
ristiga) 
PH (*) uus 
vana 
O 2 mg/l (*) uus 
vana 
Temperatuur 
( o C) (*) uus 
vana 
Söötmine (märkida 
ristiga) 
Elus järglaste arv† (  † ) Kokku 
Anum 1 2 
3 
4 5
 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Katse nr: Algkuupäev: Kloon: Keskkond: Sööda liik: Uuritav aine: Nimikontsentratsioon: 
Päev 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Kokku 
Kumulatiivne täiskasvanud 
isendite suremus (
 ‡ ) 
(*) Märkida, millist anumat katseks kasutati. 
† Aborteerunud haudmed märkida vajalikku lahtisse lühendiga „AB”. 
‡ Täiskasvanud isendite suremus märkida vajalikku lahtrisse lühendiga „M”.
 4. liide  
SELLISE ANDMELEHE NÄIDIS, MILLELE MÄRGITAKSE KEEMILISE ANALÜÜSI TULEMUSED  
a) Mõõdetud kontsentratsioonid  
Nimikontsentrat ­
sioon 1. nädala proov 2. nädala proov 3. nädala proov 
Värske Vana Värske Vana Värske Vana  
b) Mõõdetud kontsentratsioon nimiväärtuse protsendimäärana  
Nimikontsentrat ­
sioon 1. nädala proov 2. nädala proov 3. nädala proov 
Värske Vana Värske Vana Värske Vana  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
5. liide  
AJA-KAALU KESKMISE ARVUTAMINE  
Aja-kaalu keskmine  
Arvestades, et uuritava aine kontsentratsioon võib keskkonna uuendamiste vahel 
väheneda, tuleb vaagida, milline kontsentratsioon on kiivrikute emasloomade 
keskkonnas esinenud kontsentratsioonide suhtes esindav. Valiku tegemisel tuleks 
lähtuda nii bioloogilistest kui ka statistilistest teguritest. Näiteks kui arvatakse, et sigivust mõjutab kõige enam kõrgeim kontsentratsioon, siis tuleks kasutada maksimaalset kontsentratsiooni. Kui aga arvatakse, et olulisem on toksilise aine 
akumulatiivne või pikaajaline mõju, siis on otstarbekam kasutada keskmist kont ­
sentratsiooni. Sellisel juhul on sobiv keskmisena kasutada aja-kaalu keskmist kontsentratsiooni, kuna selle puhul võetakse arvesse hetkekontsentratsioonide varieerumist aja jooksul.
 
Joonis 1.  
Aja-kaalu keskmise näide
  
Joonisel 1 on näide (lihtsustatud) katse kohta, mis kestis seitse päeva ja mille 
puhul vahetati keskkonda 0-, 2. ja 4. päeval.  
Peenike sakiline joon väljendab kontsentratsiooni igal ajahetkel. Eelda ­
takse, et kontsentratsiooni langus vastab eksponentsiaalsele lagunemis ­
protsessile.  
Kuus joonisele märgitud punkti kujutavad iga uuendamisperioodi alguses 
ja lõpus mõõdetud täheldatud kontsentratsioone.  
Jäme pidevjoon näitab aja-kaalu keskmise asukohta.  
Aja-kaalu keskmine arvutatakse selliselt, et aja-kaalu keskmise joone alla jääv ala 
on võrdne kontsentratsioonikõvera alla jääva alaga. Eespool toodud näidet käsit ­
levad arvutused on esitatud tabelis 1.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabel 1  
Aja-kaalu keskmise arvutamine  
Uuendami ne nr Päevad Conc0 Conc1 Ln(Conc0) Ln(Conc1) Pindala  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Päevad kokku: 7 Üldpindala 50,091 
Aja-kaalu 
keskmine 7,156
 
Päevad  tähistab uuendamisperioodi päevade arvu.  
Conc0  tähistab iga uuendamisperioodi alguses mõõdetud kontsentratsiooni.  
Conc1  tähistab iga uuendamisperioodi lõpus mõõdetud kontsentratsiooni.  
Ln(Conc0)  tähistab Conc0 naturaallogaritmi.  
Pindala  tähistab iga uuendamisperioodi eksponentsiaalkõvera alla jäävat ala. See arvutatakse 
järgmise valemi kohaselt:  
Ln(Concl)  tähistab Concl naturaallogaritmi.  
Pindala ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü Päevad  
Aja-kaalu keskmine on üldpindala, mis on jagatud päevade summaga.  
Kiivriku sigivuse katse puhul tuleb tabelit loomulikult pikendada selliselt, et see 
hõlmaks 21 päeva.  
On selge, et kui vaatlusi tehakse ainult iga uuendamisperioodi alguses ja lõpus, ei 
ole võimalik kinnitada, et lagunemisprotsess on tegelikult eksponentsiaalne. Teistsuguse kõvera puhul oleks pindala arvutamine teistsugune. Eksponentsiaalse 
lagunemisprotsessi olemasolu ei ole siiski ebatõenäoline ning seega on seda 
kirjeldava kõvera kasutamine muu teabe puudumise korral kõige otstarbekam.
 
Juhul, kui keemilise analüüsiga ei leita uuendamisperioodi lõpus jälgi uuritavast 
ainest, tuleb siiski olla ettevaatlik. Kui aine kadumise kiirust lahusest ei ole võimalik hinnata, on võimatu saada kõvera alla tõelevastavat pindala ja seega 
ei ole võimalik saada mõistlikku aja-kaalu keskmist.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  MULLAMIKROOBID: LÄMMASTIKU TRANSFORMAT ­
SIOONI KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 216 (2000).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mis on välja töötatud 
kemikaalide pikaajaliste mõjude uurimiseks mullamikroobide lämmastiku transformatsiooni suhtes pärast ühekordset kokkupuudet 
Katse põhineb peamiselt Euroopa ja Vahemeremaade taimekaitseor ­
ganisatsiooni soovitustel (1). Samuti võetakse arvesse muid juhised, sh Saksa Biologische Bundesanstalti (2), USA Keskkonnakaitseagen ­
tuuri (3), SETACi (4) ja Rahvusvahelise Standardiorganisatsiooni (5) 
juhiseid. Käesolevas katses kasutatavate mullaproovide arvu ja tüüpide 
osas lepiti kokku mulla ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (6). Mulla ­
proovide kogumist, käsitlemist ja säilitamist käsitlevad soovitused 
põhinevad ISO juhisdokumendil (7) ja Belgirate töörühma soovitustel. 
Katseainete toksiliste omaduste hindamisel võib osutuda vajalikuks määrata kindlaks mõjud mulla mikroobsele aktiivsusele, nt kui vaja ­
takse andmeid põllukultuuride kaitsevahendite võimalike kõrvalmõ ­
jude kohta mulla mikrofloora suhtes või kui eeldatakse mullamikroo ­
bide kokkupuudet muude kemikaalidega kui põllukultuuride kaitseva ­
hendid. Lämmastiku transformatsiooni katse tehakse selleks, et kind ­
laks määrata selliste kemikaalide mõju mulla mikrofloorale. Kui uuri ­
takse agrokemikaale (nt põllukultuuride kaitsevahendid, väetised, 
metsanduskemikaalid), sooritatakse nii lämmastiku transformatsiooni kui ka süsiniku transformatsiooni katse. Kui uuritakse muid kui agro ­
kemikaale, piisab lämmastiku transformatsiooni katsest. Kui selliste 
kemikaalide lämmastiku transformatsiooni katses saadud EC
 50 -väär­
tused on kaubanduslike nitrifikatsiooniinhibiitorite (nt nitrapüriin) esin ­
davas vahemikus, saab täiendava teabe kogumiseks teha süsiniku transformatsiooni katse.
 
Muld koosneb elusatest ja elututes koostisosadest, mis eksisteerivad 
keerukates ja heterogeensetes segudes. Mikroobid mängivad tähtsat rolli viljaka mulla orgaanilise aine hajutamisel ja muutmisel, ning 
mõned liigid mõjutavad mulla viljakuse erinevaid aspekte. Kõik 
nimetatud biokeemiliste protsesside pikaajalised häired võivad häirida toitaineringlust ja see võib muuta mulla viljakust. Süsiniku ja lämmastiku transformatsioon toimub kõikides viljakates muldades. 
Kuigi nimetatud protsesse põhjustavad mikroobikogumid on mullati 
erinev, on transformatsioonirajad oma olemuselt samad.
 
Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et avastada aine 
pikaajalisi negatiivseid mõjusid aeroobsete pinnamuldade lämmasti ­
kutransformatsiooni protsessile. Katsemeetod võimaldab samuti 
hinnata ainete mõjusid mulla mikrofloora süsiniku transformatsioo ­
nile. Nitraat tekib pärast süsinik-lämmastiksidemete lagunemist. Seetõttu kui nitraadi teke leitakse olevat samal tasemel katse- ja 
kontrollmuldades, on väga tõenäoline, et peamised süsinikusidemete 
lagunemisteed on puutumata ja toimivad hästi. Katses kasutatava substraadi (peenestatud lutsernijahu) süsiniku-lämmastiku suhe on soodne (tavaliselt 12/1 ja 16/1). Seetõttu ei vähendata süsiniku 
puudust katse käigus ja kui mikroobikogumeid kahjustab kemikaal, 
siis taastuvad need 100 päeva jooksul.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Käesoleva katsemeetodi aluseks olevad katsed töötati välja peamiselt 
ainete jaoks, mille pinnasesse jõudvat kogust saab ennustada. 
Sellised ained on näiteks põllukultuuride kaitsevahendid, mille annustamine põllule on teada. Agrokemikaalide puhul piisab sellest, kui uuritakse kahte annust oletatava annustamissageduse osas. Agro ­
kemikaalide puhul saab uurida toimeaineid (a.i.) või preparaate. 
Katse ei piirdu siiski vaid agrokemikaalidega. Muutes nii pinnasesse annustavaid katseaine koguseid kui ka seda, kuidas andmeid hinna ­
takse, saab kasutada katset kemikaalide puhul, mille pinnasesse 
jõudev kogus ei ole teada. Seega määratakse kindlaks muude kemi ­
kaalide kui agrokemikaalid puhul kontsentratsiooni ridade mõjud lämmastiku transformatsioonile. Nimetatud katsetest saadud andmeid kasutatakse annuse-reaktsiooni kõvera koostamiseks ja EC
 X väärtuste 
arvutamiseks, milles  x on mõju protsendina.  
1.2. MÕISTED  
Lämmastiku transformatsioon  – mikroobide tegevuse tulemusena 
ammonifikatsiooni- ja nitrifikatsiooniprotsessi kaudu toimuv, 
lämmastikku sisaldava orgaanilise aine lõplik lagunemine vastavaks 
anorgaaniliseks lõppsaaduseks, nitraadiks.  
EC X (efektiivkontsentratsioon)  – mullas esineva katseaine kontsen ­
tratsioon, mis tõkestab lämmastiku transformatsiooni nitraadiks x protsenti.
 
EC 50 (efektiivkontsentratsiooni mediaan)  – mullas esineva katse ­
aine kontsentratsioon, mis tõkestab lämmastiku transformatsiooni nitraadiks 50 protsenti (50 %).
 
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Sõelutud mulda parandatakse peenestatud taimejahuga ning seda kas 
töödeldakse seejärel katseainega või jäetakse töötlemata (kontroll ­
proov). Kui uuritakse agrokemikaale, on soovitav kasutada vähemalt 
kahte katsekontsentratsiooni ja need tuleks valida suurima kontsen ­
tratsiooni suhtes, mis eeldatavasti esineb põllul. Pärast inkubeerimise 0-, 7., 14. ja 28. päeva ekstraheeritakse katse- ja kontrollmullaproove sobiva lahustiga ning määratakse kindlaks ekstraktides esinevad 
nitraadikogused. Nitraaditekke kiirust katseproovides võrreldakse 
kiirusega kontrollproovides ning arvutatakse katse- ja kontrollproo ­
vide protsentuaalne hälve. Kõik katsed kestavad vähemalt 28 päeva. Kui 28. päeval on katse- ja kontrollmullaproovide vahelised erine ­
vused võrdsed või suuremad kui 25 %, jätkatakse mõõtmisi kuni 100 
päeva. Kui ei uurita agrokemikaale, lisatakse mullaproovidele katse ­
aine kontsentratsiooni ridu ning katse- ja kontrollproovides tekkinud nitraadikoguseid mõõdetakse pärast 28 inkubeerimispäeva. Mitme ­
kordseid kontsentratsioone käsitlevate katsete tulemusi analüüsitakse 
regressioonmudelit kasutades, ning arvutatakse väärtused (s.t EC
 50 , 
EC 25 ja/või EC  10 ). Vt mõisteid.  
1.5. KATSE VALIIDSUS  
Agrokemikaalidega tehtud katsete tulemuste hindamine põhineb 
suhtelistelt väikestel erinevustel (s.t keskmine väärtus on ± 25 %) kontroll- ja katsemullaproovide nitraadi kontsentratsioonide vahel, et kontrollproovide suured muutused võib viia väärate tulemusteni. 
Seetõttu peaksid paralleelsete kontrollproovide vahelised muutused 
olema väiksemad kui ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Seadmed  
Katsetes kasutatakse mahuteid, mis on valmistatud keemiliselt inert ­
sest materjalist. Mahutite mahutavus peaks vastama mullaproovide 
inkubeerimisprotseduurile, s.t üksikute mullaproovide massina või 
sarjana inkubeerimine (vt punkti 1.7.1.2). Tuleks tagada, et veekadu oleks katse käigus minimaalne ja gaasivahetus oleks võimalik (nt võib katsemahutid katta perforeeritud polüetüleenkilega). Kui uuri ­
takse lenduvaid aineid, tuleks kasutada mastabeeritavaid ja gaasi ­
kindlaid mahuteid. Need peaksid olema sellise suurusega, et ligi ­
kaudu üks neljandik nende mahust täidetakse mullaprooviga.
 
Katses kasutatakse järgmiseid standardseid laboriseadmeid:  
— segamisseade: mehaaniline segur või vastav seade;  
— tsentrifuug (3 000 g) või filtreerimisseade (kasutades nitraadivaba 
filterpaberit);  
— nitraadi analüüsi jaoks piisava tundlikkuse mõõteseade, mille 
mõõtmistulemus on korduvteostatav.  
1.6.2.  Mullaliikide valik ja arv  
Kasutatakse ühte mullaliiki. Soovitavad mullaomadused on järg ­
mised:  
— liivasisaldus: vähemalt 50 % ja kuni 75 %;  
— pH: 5,5–7,5;  
— orgaanilise süsiniku sisaldus: 0,5–1,5 %;  
— mikroobi biomassi tuleks mõõta (8, 9) ja selle süsinikusisaldus 
peaks olema vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku koguhul ­
gast. 
Enamikul juhtudel nimetatud omadustega muld esindab halvimat 
juhtu, kuna uuritava kemikaali absorbtsioon on minimaalne ja selle 
kättesaadavus mikrofloorale on suurim. Sellest tulenevalt ei ole katsed muude mullaliikidega üldiselt vajalikud. Teatud juhtudel, nt kui katseainet eeldatavasti kasutatakse peamiselt muldades, nt happe ­
lised metsamullad, või kui kemikaalid on elektrostaatiliselt laetud, 
võib osutuda vajalikuks kasutada ka muud mullaliiki.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Mullaproovide kogumine ja säilitamine  
1.6.3.1.  Kogumine  
Üksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema 
kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, 
põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste 
ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisa ­
mine või juhuslik saastumine. Mullaproovide kogumiseks valitud kohta peaks saama kasutada pikka aega. Sobivad on püsikarjamaad, 
üheaastaste teraviljakultuuridega (v.a mais) põllud või tihedalt 
külvatud haljaskesa. Valitud proovivõtukohta ei tohiks töödelda põllukultuuride kaitsevahenditega vähemalt ühe aasta jooksul enne 
proovide võtmist. Samuti ei tohiks kasutada orgaanilisi väetisi vähe ­
malt kuus kuud. Mineraalväetiste kasutamine on lubatud üksnes siis, kui see vastab põllukultuuride nõuetele ja mullaproove ei tohiks võtta vähemalt kolm kuud pärast väetise kasutamist. Biotsiidi mõjuga 
(nt kaltsiumtsüaanamiid) väetistega töödeldud mulla kasutamist 
tuleks vältida.
 
Proovide võtmist tuleks vältida pikkade (rohkem kui 30 päeva) põua- 
või vettimisperioodide ajal või vahetult pärast seda. Küntud muldade 
puhul tuleks proovid võtta 0–20 cm sügavuselt. Rohumaade (karja ­
maade) või muude muldade puhul, kui ei ole pikka aega küntud (vähemalt ühe kasvuperioodi vältel), peaks proovivõtu suurim 
sügavus olema veidi rohkem kui 20 cm (nt kuni 25 cm).
 
Mullaproovid tuleks transportida mahutites ja temperatuuridel, mis 
tagavad, et algseid mullaomadusi ei muudeta oluliselt.  
1.6.3.2.  Säilitamine  
Värskelt põllult kogutud mulla kasutamine on eelistatud. Kui ei 
säilitamine laboris on vältimatu, võib mullaproovid lahustada 
pimedas temperatuuril 4 ± 2  o C maksimaalselt kolmeks kuuks. 
Mullaproovide säilitamise ajal tuleb tagada aeroobsed tingimused. Kui mullaproovid kogutakse piirkondadest, kus maapind on vähe ­
malt kolm kuud aastas külmunud, saab kaaluda nende säilitamist 
kuueks kuuks miinus 18
 o C kuni miinus 22  o C juures. Säilitatud 
mullaproovide mikroobi biomassi mõõdetakse enne igat katset ja biomassis peaks olema süsinikku vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku kogusisaldusest (vt punkti 1.6.2).
 
1.6.4  Mullaproovide käsitlemine ja katseks ettevalmistamine  
1.6.4.1.  Eelinkubeerimine  
Kui mullaproovid säilitati (vt punkti 1.6.3.2), on soovitav eelinku ­
beerida 2–28 päeva. Mulla temperatuur ja niiskusesisaldus eelinku ­
beerimise ajal peaksid olema samasugused kui need, mida kasutati 
katses (vt punkte 1.6.4.2 ja 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Füüsikalis-keemilised omadused  
Muld puhastatakse käsitsi suurtest objektidest (nt kivid, taimeosad 
jne) ning seejärel märgsõelutakse ilma liigselt kuivatamata 2 mm või sellest väiksemateks osakeste suuruseks. Mullaproovi niiskusesisal ­
dust peaks reguleerima destilleeritud või deioniseeritud veega 
40–60 % maksimaalse veemahutavuseni.
 
1.6.4.3.  Parandamine orgaanilise substraadiga  
Mulda tuleks parandada sobiva orgaanilise substraadiga, nt peenes ­
tatud lutserni-rohujahu seguga (põhiline koostisosa on  Medicago 
sativa),  mille süsiniku-lämmastiku suhe on 12/1 ja 16/1. Soovitav 
lutserni-mulla suhe on 5 g lutserni ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass).
 
1.6.5.  Katseaine ettevalmistamine mulda annustamiseks  
Katseainet annustatakse tavaliselt kandeaine abil. Kandeaine võib 
olla vesi (veeslahustuvate ainete puhul) või inertne tahke aine, nt peen kvartsliiv (mille osakeste suurus on 0,1–0,5 mm). Vedelaid, veest erinevaid kandeaineid (nt orgaanilisi lahusteid, nagu atsetoon, 
kloroform) tuleks vältida, kuna nad võivad kahjustada mikrofloorat. 
Kui kasutatakse kandeainena liiva, saab selle katta katseainega, mis on sobivas lahustis lahustatud või suspendeeritud. Sellisel juhul 
tuleks lahusti eemaldada aurustumise teel enne mullaga segamist. 
Katseaine optimaalseks jaotumiseks mullas on soovitav suhe 10 g liiva ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass). Kontrollproove töödel ­
dakse sarnase veehulgaga ja/või üksnes kvartsliivaga.
 
Kui uuritakse lenduvaid kemikaale, tuleks vältida kadusid töötlemise 
ajal niipalju kui võimalik ja tuleks püüda tagada homogeenne jaotus mullas (nt katseainet tuleks injekteerida mulda mitmes kohas).
 
1.6.6.  Uuritavad kontsentratsioonid  
Kui uuritakse agrokemikaale, tuleks kasutada vähemalt kahte kont ­
sentratsiooni. Väiksem kontsentratsioon peaks kajastama vähemalt katseaine kasutamisel mulda jõudvat suurimat eeldatavat kogust ning suurem kontsentratsioon peaks olema väiksema kontsentrat ­
siooni kordne. Mulda lisatavate katseainete kontsentratsioonid arvu ­
tatakse eeldusel, et aine imendub ühtlaselt 5 cm sügavusele ja mulla lasuvustihedus on 1,5. Agrokemikaalide puhul, mida annustatakse otse mulda, või kemikaalide puhul, mille mulda jõudvat kogust 
saab ennustada, on soovitavad katsekontsentratsioonid suurimad 
arvutuskontsentratsioonid (PEC) ja neist viis korda suuremad kont ­
sentratsioonid. Uurides aineid, mida eeldatavasti annustatakse mulda mitmel korral ühel aastaajal, peaks katsekontsentratsioon olema 
saadud PEC korrutamisel suurima eeldatava annustamiste arvuga. 
Kõrgeim uuritav kontsentratsioon ei tohiks siiski olla suurem kui kümnekordne suurim üksikannus. Kui uuritakse muid kui agrokemi ­
kaale, tuleks kasutada vähemalt viie kontsentratsiooni geomeetrilist 
sarja. Uuritavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama EC
 x väärtuste 
kindlaksmääramiseks vajalikku vahemikku.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. KATSE KÄIK  
1.7.1.  Kokkupuute tingimused  
1.7.1.1.  Katse- ja kontrollproovid  
Kui uuritakse agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kolmeks 
võrdse massiga osaks. Kaks osa segatakse kandeainega, mis sisaldab 
katseainet, ning kolmas osa segatakse kandeainega, mis ei sisalda katseainet (kontrollproov). On soovitav kasutada vähemalt kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide korral. Kui uuri ­
takse muid kui agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kuueks 
võrdse massiga osaks. Viis proovi segatakse katseainet sisaldava kandeainega ja kuues proov segatakse kandeainega, mis ei sisalda 
kemikaali. On soovitav kasutada kolme paralleelset proovi nii katse- 
kui kontrollproovide korral. Tuleks tagada katseaine ühtlane jaotus katseproovide hulka kuuluvates mullaproovides. Segamise ajal tuleks vältida mulla pallideks vormimist.
 
1.7.1.2.  Mullaproovide inkubeerimine  
Mullaproove inkubeeritakse kahel moel: katse- ja kontrollmullaproo ­
vide koondproovina või katse ja kontrollmullaproovide üksikute ja võrdse suurusega osaproovide sarjana. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana. 
Kui mullaproovid inkubeeritakse koondproovina, valmistatakse ette 
katse- ja kontrollmullaproovide suured kogused ning vastavalt vaja ­
dusele analüüsitavad osaproovid katse käigus. Algselt iga katse- või kontrollproovi kohta ettevalmistatud kogus sõltub osaproovide suuru ­
sest, kasutatud paralleelsete proovide arvust ja suurimatest eeldata ­
vatest proovide võtmise aegadest. Koondproovina inkubeeritavad mullaproovid tuleks enne osaproovide võtmist hoolega segada. Kui mullaproovid inkubeeritakse üksikute mullaproovide sarjana, jaga ­
takse iga katse- ja kontrollmullaproovide koondproov soovitud 
arvuks osaproovideks, ning neid kasutatakse vastavalt vajadusele. Katsetest, kus eeldatakse rohkem kui kahte proovide võtmise aega, tuleks ette valmistada piisavalt osaproove kõikide paralleelproovide 
ja proovivõtuaegade jaoks. Vähemalt kolme uuritava mullaproovi 
paralleelproovi tuleks inkubeerida aeroobsetes tingimustes (vt punkti 1.7.1.1). Kõikide katsete käigus tuleks kasutada sobivaid mahuteid, milles on piisavalt õhuruumi, et vältida anaeroobsete tingimuste 
tekkimist. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada 
vaid üksikute osaproovide sarjana.
 
1.7.1.3.  Katsetingimused ja katse kestus  
Katset tehakse pimedas toatemperatuuril 20 ± 2  o C. Mullaproovide 
niiskusesisaldust tuleks säilitada katse käigus 40–60 % mulla suuri ­
mast veemahutavusest (vt punkti 1.6.4.2) vahemikus ± 5 %. Vaja ­
duse korral võib lisada destilleeritud, deioniseeritud vett.  
Katsete minimaalne kestus on 28 päeva. Kui uuritakse agrokemi ­
kaale, võrreldakse katse- ja kontrollproovides nitraaditekke kiirust. 
Kui need erinevad 28. päeval rohkem kui 25 %, jätkatakse katset seni, kuni erinevus võrdub või on väiksem kui 25 %, või maksi ­
maalselt 100 päeva, olenevalt sellest, kummaks kulub vähem aega. 
Muude kui agrokemikaalide puhul lõpetatakse katse pärast 28 päeva. 
Arvutatakse EC
 x väärtused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Mullaproovide võtmine ja analüüs  
1.7.2.1.  Mullaproovide võtmise ajakava  
Kui uuritakse agrokemikaale, analüüsitakse mullaproovides nitraati 
0-, 7., 14. ja 28. päeval. Kui on vaja katset pikendada, tuleks teha 
täiendavad mõõtmised 14päevaste intervallide tagant pärast 28. 
päeva.  
Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, kasutatakse vähemalt viit 
katsekontsentratsiooni ja analüüsitakse mullaproovides nitraati 
kokkupuute perioodi alguses (0-päev) ja lõpus (28. päev). Võib 
lisada vajaduse korral vahepealse mõõtmise, nt 7. päeval. 28. päeval saadud teavet kasutatakse kemikaali EC
 x väärtuse kindlaksmäära ­
miseks. Soovi korral võib kasutada 0-päeval kontrollproovidest 
saadud andmeid mullas nitraadi algkogusest teatamiseks.  
1.7.2.2.  Mullaproovide analüüs  
Igas katse- ja kontrollproovi paralleelproovis tekkinud nitraadi kogus 
määratakse kindlaks igal proovivõtuajal. Nitraat ekstraheeritakse 
mullast proovide raputamise teel sobiva ekstrahendiga, nt kaalium ­
kloriidilahus (0,1 M). Soovitav suhe on 5 ml KCl lahust mullaproovi ühe kuivmassi grammi kohta. Ekstraheerimise optimeerimiseks ei 
tohiks mulla ja ekstrahendi mahutid olla rohkem kui pooltäis. Segu 
raputatakse 150 rpm 60 minutit. Segusid tsentrifuugitakse või filtree ­
ritakse ning analüüsitakse vedelfaasist nitraat. Osakestevabad vedeli ­
kuekstraktid võib säilitada enne analüüsi miinus 20 ± 5
 o C juures 
kuni kuus kuud.  
2. TULEMUSED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Kui katseid tehakse agrokemikaalidega, tuleks registreerida igas 
mullaproovi paralleelproovis tekkinud nitraadikogus ja tuleks esitada kõikide paralleelproovide keskmised väärtused tabeli kujul. Lämmas ­
tiku transformatsiooni kiirusi tuleks hinnata sobivate ja üldiselt 
heakskiidetud statistiliste meetodite abil (nt F-katse, 5 % olulisu ­
saste). Tekkinud nitraadi koguseid väljendatakse mg nitraadina mulla kuivmassi kg kohta päevas. Nitraadi tekke kiirusi igas katse ­
proovis võrreldakse kiirustega kontrollproovis ning arvutatakse kont ­
rollproovide protsentuaalne hälve.
 
Kui katseid tehakse muude kui agrokemikaalidega, määratakse kind ­
laks igas paralleelproovis tekkinud nitraadi kogused ning koostatakse annuse-reaktsiooni kõver EC
 x väärtuste hindamiseks. Nitraadikogu ­
seid (s.t mg nitraati mulla kuivmassi kg kohta) katseproovides pärast 
28 päeva võrreldakse kontrollproovis olevate nitraadikogustega. Nimetatud andmete põhjal arvutatakse protsentuaalsed inhibitsiooni ­
väärtused iga katsekontsentratsiooni kohta. Need protsendimäärad 
registreeritakse kontsentratsioonina ning seejärel kasutatakse statisti ­
lisi protseduure EC
 x väärtuste arvutamiseks. Usalduspiirid (p = 0,95) 
arvutatud EC  x puhul määratakse samuti kindlaks standardprotseduu ­
ride abil (10, 11, 12).  
Katseained, mis sisaldavad lämmastiku suuri koguseid võivad mõju ­
tada katse käigus tekkivaid nitraadikoguseid. Kui nimetatud aineid 
uuritakse suurte kontsentratsioonidena (nt kemikaalid, mida eeldata ­
vasti annustatakse korduvalt), peaks katse sisaldama sobivaid kont ­
rolle (s.t mullaproov ja katseaine ilma taimejahuta). Nimetatud kont ­
rollidest saadud andmeid peab võtma arvesse EC  x väärtuste arvuta ­
misel.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Kui hinnatakse agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi ning 
nitraaditekke kiiruste erinevus madalamate katseaineannuste (mis vastab suurimale eeldatavale kontsentratsioonile) ja kontrollproovide 
vahel on võrdne või väiksem kui 25 % mis tahes proovivõtuajal 
pärast 28 päeva möödumist, saab hinnata, et katseainel ei ole pikaa ­
jalist toimet lämmastiku tekkele muldades. Kui muude kemikaalide kui agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi hinnatakse, kasuta ­
takse EC
 50 , EC  25 ja/või EC  10 väärtusi.  
3. ARUANDLUS  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Kasutatava mulla täielik identifitseerimine, kaasa arvatud:  
— geograafiline viide kohale (laiuskraad, pikkuskraad);  
— teave koha ajaloo kohta (s.t taimkate, põllukultuuride kaitseva ­
henditega töötlemine, väetistega töötlemine, juhuslik saastamine 
jne); 
— kasutusviis (nt põllumaa, mets jne):  
— proovivõtu sügavus (cm);  
— liiva-/aleuriidi-/savisisaldus (protsenti kuivmassist);  
— pH (vees);  
— orgaanilise süsiniku sisaldus (protsenti kuivmassist);  
— lämmastikusisaldus (protsenti kuivmassist);  
— algne lämmastikusisaldus (mg nitraati kg kuivmassi kohta);  
— katioonvahetusvõime (mmol/kg);  
— mikroobi biomass protsendina orgaanilise süsiniku koguhulgast;  
— viide iga parameetri määramismeetodi kohta;  
— kogu teave mullaproovide kogumise ja säilitamise kohta;  
— vajaduse korral üksikandmed mulla eelinkubeerimise kohta.  
Katseaine:  
— füüsiline laad ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;  
— vajaduse korral keemilised tunnusandmed, sh struktuurivalem, 
puhtus (s.t põllukultuuride kaitsevahendite toimeaine protsendi ­
määr), lämmastikusisaldus.  
Substraat:  
— substraadi allikas;  
— koostis (lutsernijahu, lutserni-rohujahu);  
— süsiniku-, lämmastikusisaldus (protsenti kuivmassist);  
— sõelaava suurus (mm).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Katsetingimused:  
— üksikasjalikud andmed mulla parandamise kohta orgaanilise 
substraadiga;  
— uuritava kemikaali kontsentratsioonide arv ja vajaduse korral 
valitud kontsentratsioonide põhjendus;  
— üksikasjalikud andmed katseaine mulda annustamise kohta;  
— inkubatsioonitemperatuur;  
— mulla niiskusesisaldus katse alguses ja kestel;  
— kasutatav mulla inkubeerimismeetod (koondproovina või üksi ­
kute osaproovide sarjana);  
— paralleelsete proovide arv;  
— proovivõtuajad;  
— nitraadi mullast ekstraheerimise meetod.  
Tulemused:  
— analüüsimeetod ja -seade, mida kasutatakse nitraadi analüüsimi ­
seks;  
— andmed tabeli kujul, sh nitraadi mõõtmiste üksikud ja keskväär ­
tused;  
— katse- ja kontrollproovide paralleelproovide vaheline muutus;  
— arvutustega tehtud paranduste selgitused, kui on vaja;  
— nitraadi tekke kiiruse protsentuaalne muutus igal proovivõtu ­
korral või vajaduse korral EC  50 väärtus 95 % usaldusvahemikus, 
muud EC  x väärtused (s.t EC  25 või EC  10 ) usaldusvahemikes ning 
annuse-reaktsiooni kõver;  
— tulemuste statistiline töötlemine;  
— kogu teave ja vaatlused, mis aitaksid tõlgendada tulemusi.  
4. VIITED  
1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil 
Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 
3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  
4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.
 
5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical 
Committee ISO/TC 190/SC 4: Sou Quality – Biological 
Methods.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 January 1995.  
7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling andstorageof soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.  
9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. Ther., 96, 99–113.
 
11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  MULLAMIKROOBID: SÜSINIKU TRANSFORMATSIOONI 
KATSE  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 217 (2000).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mis on välja töötatud 
selleks, et uurida põllukultuuride kaitsevahendite ja muude võimalike 
kemikaalide pikaajalisi mõjusid mullamikroobide süsiniku transfor ­
matsioonile ühekordse kokkupuute järel. Katse põhineb peamiselt Euroopa ja Vahemere taimekaitseorganisatsiooni soovitustel (1). 
Samuti võetakse arvesse muid juhised, sh Saksa Biologische Bunde ­
sanstalti (2), USA Keskkonnakaitseagentuuri (3) ja SETACi (4) juhi ­
seid. Käesolevas katses kasutatavate mullaproovide arvu ja tüüpide osas lepiti kokku mulla ja sedimentide valikut käsitlevas OECD 
töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (5). Mulla ­
proovide kogumist, käsitlemist ja säilitamist käsitlevad soovitused põhinevad ISO juhisdokumendil (6) ja Belgirate töörühma soovi ­
tustel.
 
Katseainete toksiliste omaduste hindamisel võib osutuda vajalikuks 
määrata kindlaks mõjud mulla mikroobsele aktiivsusele, nt kui vaja ­
takse andmeid põllukultuuride kaitsevahendite võimalike kõrvalmõ ­
jude kohta mulla mikrofloora suhtes või kui eeldatakse mullamikroo ­
bide kokkupuudet muude kemikaalidega kui põllukultuuride kaitse ­
vahendid. Süsiniku transformatsiooni katse tehakse selleks, et kind ­
laks määrata selliste kemikaalide mõju mulla mikrofloorale. Kui uuritakse agrokemikaale (nt põllukultuuride kaitsevahendid, väetised, metsanduskemikaalid), sooritatakse nii süsiniku transformatsiooni kui 
ka lämmastiku transformatsiooni katse. Kui uuritakse muid kui agro ­
kemikaale, piisab lämmastiku transformatsiooni katsest. Kui selliste kemikaalide lämmastiku transformatsiooni katses saadud EC
 50 väär­
tused on kaubanduslike nitrifikatsiooniinhibiitorite (nt nitrapüriin) 
esindavas vahemikus, saab täiendava teabe kogumiseks teha süsiniku 
transformatsiooni katse.  
Muld koosneb elusatest ja elututest koostisosadest, mis eksisteerivad 
keerukates ja heterogeensetes segudes. Mikroobid mängivad tähtsat rolli viljaka mulla orgaanilise aine hajutamisel ja muutmisel, ning 
mõned liigid mõjutavad mulla viljakuse erinevaid aspekte. Kõik 
nimetatud biokeemiliste protsesside pikaajalised häired võivad häirida toitaineringlust ja see võib muuta mulla viljakust. Süsiniku ja lämmastiku transformatsioon toimub kõikides viljakates muldades. 
Kuigi nimetatud protsesse põhjustav mikroobikogum on mullati 
erinev, on transformatsioonirajad oma olemuselt samad.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Käesolev katsemeetod on välja töötatud selleks, et avastada aine 
pikaajalisi negatiivseid mõjusid aeroobsete pinnamuldade süsiniku 
transformatsiooni protsessile. Katse on tundlik süsiniku transformat ­
sioonis osaleva mikroobikogumi suuruse ja tegevuse muutuste suhtes, kuna katses lastakse neil mikroobikogumitel osa saada nii 
keemilisest stressist kui ka süsinikupuudusest. Kasutatakse liivast 
mulda, mille orgaanilise aine sisaldus on madal. Seda mulda töödel ­
dakse katseainega ja inkubeeritakse tingimustes, mis võimaldavad kiiret mikroobide ainevahetust. Nimetatud tingimustes on kiirelt 
vähenenud kergesti kättesaadava süsiniku allikad mullas. See 
põhjustab süsiniku puudust, mis tapab mikroobirakud ning kutsub esile puhkeperioodi ja/või sporulatsiooni. Kui katset tehakse kauem kui 28 päeva, saab mõõta nimetatud reaktsiooni summat (töötlemata 
mulla) kontrollproovides metaboolselt aktiivse mikroobi biomassi 
järkjärgulise vähenemisena (7). Kui süsinikupuuduses vaevlevas mullas olevat biomassi mõjutab katsetingimustes kemikaali esine ­
mine, ei saa see pöörduda tagasi samale tasemele nagu kontroll ­
proovis olev biomass. Seetõttu katseaine põhjustatud häireid mis 
tahes ajal katse käigus kestavad tihti kuni katse lõpuni.
 
Käesoleva katsemeetodi aluseks olevad katsed töötati välja peamiselt 
ainete jaoks, mille pinnasesse jõudvat kogust saab ennustada. Sellised ained on näiteks põllukultuuride kaitsevahendid, mille 
annustamine põllule on teada. Agrokemikaalide puhul piisab sellest, 
kui uuritakse kahte annust oletatava annustamissageduse osas. Agro ­
kemikaalide puhul saab uurida toimeaineid (a.i.) või preparaate. Katse ei piirdu siiski vaid prognoositavaid arvestuskontsentratsioone 
omavate kemikaalidega. Muutes nii pinnasesse annustatavaid katse ­
aine koguseid kui ka seda, kuidas andmeid hinnatakse, saab kasutada katset kemikaalide puhul, mille pinnasesse jõudev kogus ei ole teada. Seega määratakse kindlaks muude kemikaalide kui agrokemikaalid 
puhul kontsentratsiooni ridade mõjud süsiniku transformatsioonile. 
Nimetatud katsetest saadud andmeid kasutatakse annuse-reaktsiooni kõvera koostamiseks ja EC
 X väärtuste arvutamiseks, milles x on 
mõju protsendina.  
1.2. MÕISTED  
Süsiniku transformatsioon  – orgaanilise aine lagundamine mikro ­
organismide poolt anorgaaniliseks lõppsaaduseks, süsinikdioksiidiks.  
EC X (efektiivkontsentratsioon)  – mullas esineva katseaine kontsen ­
tratsioon, mis tõkestab süsiniku transformatsiooni süsinikdioksiidiks 
x protsendiga.  
EC 50 (efektiivkontsentratsiooni mediaan)  – mullas esineva katse ­
aine kontsentratsioon, mis tõkestab süsiniku transformatsiooni süsi ­
nikdioksiidiks 50 protsendiga.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Puuduvad.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Sõelutud mulda töödeldakse kas katseainega või jäetakse töötlemata 
(kontroll). Kui uuritakse agrokemikaale, on soovitav kasutada vähe ­
malt kahte katsekontsentratsiooni ja need tuleks valida suurima kont ­
sentratsiooni suhtes, mis eeldatavasti esineb põllul. Pärast 0-, 7., 14. 
ja 28. inkubeerimispäeva segatakse katse- ja kontrollmullaproovid glükoosiga ning glükoosi põhjustatud hingamiskiirust mõõdetakse järjestikusel 12 tunnil. Hingamiskiirusi väljendatakse vabanenud 
süsinikdioksiidina (mg süsinikdioksiidi mulla kuivmassi kg kohta 
tunnis) või tarbitud hapnikuna (mg hapnikku kg mulla kohta tunnis). Keskmist hingamiskiirust katseproovides võrreldakse sama hingamis ­
kiirusega kontrollproovides ning arvutatakse katseproovi ja kontroll ­
proovi vaheline protsentuaalne hälve. Kõik katsed kestavad vähemalt 28 päeva. Kui 28. päeval on katse- ja kontrollproovide vahelised erinevused võrdsed või suuremad kui 25 %, jätkatakse mõõtmisi 
14päevaste intervallidega kuni maksimaalselt 100 päeva. Kui uuri ­
takse muid kemikaale kui agrokemikaalid, lisatakse mullaproovidele katseaine kontsentratsioonide sari ning mõõdetakse glükoosi põhjus ­
tatud hingamiskiirusi (s.t tekkinud süsinikdioksiidi või tarbitud 
hapniku koguste keskmine) pärast 28 päeva möödumist. Kontsentrat ­
sioonide sarja käsitlevate katsete tulemusi analüüsitakse regressioon ­
mudelit kasutades, ning arvutatakse EC
 X väärtused (s.t EC  50 , EC  25 
ja/või EC  10 ). Vt mõisteid.  
1.5. KATSE VALIIDSUS  
Agrokemikaalidega tehtud katsete tulemuste hindamine põhineb 
suhtelistelt väikestel erinevustel (s.t keskmine väärtus on ± 25 %) 
kontroll- ja katsemullaproovides vabanenud süsinikdioksiidi või 
tarbitud hapniku vahel, et kontrollproovide suured muutused võivad viia väärate tulemusteni. Seetõttu peaksid paralleelsete kontrollproo ­
vide vahelised muutused olema väiksemad kui ± 15 %.
 
1.6. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.6.1.  Seadmed  
Katsetes kasutatakse mahuteid, mis on valmistatud keemiliselt inert ­
sest materjalist. Mahutite mahutavus peaks vastama mullaproovide 
inkubeerimisprotseduurile, s.t üksikute mullaproovide massina või sarjana inkubeerimine (vt punkti 1.7.1.2). Tuleks tagada, et veekadu oleks katse käigus minimaalne ja gaasivahetus oleks võimalik (nt 
võib katsemahutid katta perforeeritud polüetüleenkilega). Kui uuri ­
takse lenduvaid aineid, tuleks kasutada mastabeeritavaid ja gaasi ­
kindlaid mahuteid. Need peaksid olema sellise suurusega, et ligi ­
kaudu üks neljandik nende mahust täidetakse mullaprooviga.
 
Glükoosi põhjustatud hingamise kindlaksmääramisel on nõutavad 
inkubeerimissüsteemid ja süsinikdioksiidi tootmise või hapniku tarbi ­
mise mõõtmisseadmed. Selliste süsteemide ja seadmete kohta käivad näiteid võib leida kirjandusviidetest (8, 9, 10, 11).
 
1.6.2.  Mullaliikide valik ja arv  
Kasutatakse ühte mullaliiki. Soovitavad mullaomadused on järg ­
mised:  
— liivasisaldus: vähemalt 50 % ja kuni 75 %,  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5–7,5;  
— orgaanilise süsiniku sisaldus: 0,5–1,5 %;  
— mikroobi biomassi tuleks mõõta (12, 13) ja selle süsinikusisaldus 
peaks olema vähemalt 1 % mulla orgaanilise süsiniku koguhul ­
gast. 
Enamikul juhtudel nimetatud omadustega muld esindab halvimat 
juhtu, kuna uuritava kemikaali absorbtsioon on minimaalne ja selle 
kättesaadavus mikrofloorale on suurim. Sellest tulenevalt ei ole katsed muude mullaliikidega üldiselt vajalikud. Teatud juhtudel, nt kui katseainet eeldatavasti kasutatakse peamiselt muldades, nt happe ­
lised metsamullad, või kui kemikaalid on elektrostaatiliselt laetud, 
võib osutuda vajalikuks kasutada ka muud mullaliiki.
 
1.6.3.  Mullaproovide kogumine ja säilitamine  
1.6.3.1.  Kogumine  
Üksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema 
kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, 
põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisa ­
mine või juhuslik saastumine. Mullaproovide kogumiseks valitud 
kohta peaks saama kasutada pikka aega. Sobivad on püsikarjamaad, 
üheaastaste teraviljakultuuridega (v.a mais) põllud või tihedalt külvatud haljaskesa. Valitud proovivõtukohta ei tohiks töödelda põllukultuuride kaitsevahenditega vähemalt ühe aasta jooksul enne 
proovide võtmist. Samuti ei tohiks kasutada orgaanilisi väetisi vähe ­
malt kuus kuud. Mineraalväetiste kasutamine on lubatud üksnes siis, kui see vastab põllukultuuride nõuetele ja mullaproove ei tohiks võtta vähemalt kolm kuud pärast väetise kasutamist. Biotsiidi mõjuga 
(nt kaltsiumtsüaanamiid) väetistega töödeldud mulla kasutamist 
tuleks vältida.
 
Proovide võtmist tuleks vältida pikkade (rohkem kui 30 päeva) põua- 
või vettimisperioodide ajal või vahetult pärast seda. Küntud muldade 
puhul tuleks proovid võtta 0–20 cm sügavuselt. Rohumaade (karja ­
maade) või muude muldade puhul, kui ei ole pikka aega küntud (vähemalt ühe kasvuperioodi vältel), peaks proovivõtu suurim sügavus olema veidi rohkem kui 20 cm (nt kuni 25 cm). Mulla ­
proovid tuleks transportida mahutites ja temperatuuridel, mis 
tagavad, et algseid mullaomadusi ei muudeta oluliselt.
 
1.6.3.2.  Säilitamine  
Värskelt põllult kogutud mulla kasutamine on eelistatud. Kui ei 
säilitamine laboris on vältimatu, võib mullaproove säilitada pimedas temperatuuril 4 ± 2
 o C maksimaalselt kolm kuud. Mullaproovide 
säilitamise ajal tuleb tagada aeroobsed tingimused. Kui mullaproovid 
kogutakse piirkondadest, kus maapind on vähemalt kolm kuud aastas külmunud, saab kaaluda nende säilitamist kuueks kuuks miinus 18
 o C juures. Säilitatud mullaproovide mikroobi biomassi mõõde ­
takse enne igat katset ja biomassis peaks olema süsinikku vähemalt 
1 % mulla orgaanilise süsiniku kogusisaldusest (vt punkti 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Mullaproovide käsitlemine ja katseks ettevalmistamine  
1.6.4.1.  Eelinkubeerimine  
Kui mullaproove säilitati (vt punkte 1.6.4.2 ja 1.7.1.3), on soovitav 
eelinkubeerida 2–28 päeva. Mulla temperatuur ja niiskusesisaldus 
eelinkubeerimise ajal peaksid olema samasugused kui need, mida 
kasutati katses (vt punktid 1.6.4.2 ja 1.7.1.3).  
1.6.4.2.  Füüsikalis-keemilised omadused  
Muld puhastatakse käsitsi suurtest objektidest (nt kivid, taimeosad 
jne) ning seejärel märgsõelutakse ilma liigselt kuivatamata 2 mm või sellest väiksemateks osakeste suuruseks. Mullaproovi niiskusesisal ­
dust peaks reguleerima destilleeritud või deioniseeritud veega 
40–60 % maksimaalse veemahutavuseni.
 
1.6.5.  Katseaine ettevalmistamine mulda annustamiseks  
Katseainet annustatakse tavaliselt kandeaine abil. Kandeaine võib 
olla vesi (veeslahustuvate ainete puhul) või inertne tahke aine, nt 
peen kvartsliiv (mille osakeste suurus on 0,1–0,5 mm). Vedelaid, 
veest erinevaid kandeaineid (nt orgaanilisi lahusteid nagu atsetoon, kloroform) tuleks vältida, kuna nad võivad kahjustada mikrofloorat. 
Kui kasutatakse kandeainena liiva, saab selle katta katseainega, mis 
on sobivas lahustis lahustatud või suspendeeritud. Sellisel juhul tuleks lahusti eemaldada aurustumise teel enne mullaga segamist. Katseaine optimaalseks jaotumiseks mullas on soovitav suhe 10 g 
liiva ühe kilogrammi mulla kohta (kuivmass). Kontrollproove töödel ­
dakse sarnase veehulgaga ja/või üksnes kvartsliivaga.
 
Kui uuritakse lenduvaid kemikaale, tuleks vältida kadusid töötlemise 
ajal niipalju kui võimalik ja tuleks püüda tagada ühtlane jaotus mullas (nt katseainet tuleks injekteerida mulda mitmes kohas).
 
1.6.6.  Uuritavad kontsentratsioonid  
Kui uuritakse põllukultuuride kaitsevahendeid või muid prognoosita ­
vaid arvestuskontsentratsioone omavaid kemikaale, tuleks kasutada vähemalt kahte kontsentratsiooni. Väiksem kontsentratsioon peaks kajastama vähemalt katseaine kasutamisel mulda jõudvat suurimat 
eeldatavat kogust ning suurem kontsentratsioon peaks olema väik ­
sema kontsentratsiooni kordne. Mulda lisatavate katseainete kontsen ­
tratsioonid arvutatakse eeldusel, et aine imendub ühtlaselt 5 cm süga ­
vusele ja mulla lasuvustihedus on 1,5. Agrokemikaalide puhul, mida 
annustatakse otse mulda, või kemikaalide puhul, mille mulda jõudvat 
kogust saab ennustada, on soovitavad katsekontsentratsioonid suurimad arvutuskontsentratsioonid (PEC) ja neist viis korda suuremad kontsentratsioonid. Uurides aineid, mida eeldatavasti 
annustatakse mulda mitmel korral ühel aastaajal, peaks katsekontsen ­
tratsioon olema saadud PEC korrutamisel suurima eeldatava annus ­
tamiste arvuga. Kõrgeim uuritav kontsentratsioon ei tohiks siiski olla suurem kui kümnekordne suurim üksikannus.
 
Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, tuleks kasutada vähemalt viie 
kontsentratsiooni geomeetrilist sarja. Uuritavad kontsentratsioonid 
peaksid hõlmama EC  X väärtuste kindlaksmääramiseks vajalikku 
vahemikku.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. KATSE KÄIK  
1.7.1.  Kokkupuute tingimused  
1.7.1.1.  Katse- ja kontrollproovid  
Kui uuritakse agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kolmeks 
võrdse massiga osaks. Kaks osa segatakse kandeainega, mis sisaldab 
katseainet, ning kolmas osa segatakse kandeainega, mis ei sisalda katseainet (kontrollproov). On soovitav kasutada vähemalt kolme paralleelset proovi nii katse- kui kontrollproovide puhul. Kui uuri ­
takse muid kui agrokemikaale, tuleks mullaproovid jagada kuueks 
võrdse massiga osaks. Viis proovi segatakse katseainet sisaldava kandeainega ja kuues proov segatakse kandeainega, mis ei sisalda 
kemikaali. On soovitav kasutada kolme paralleelset proovi nii katse- 
kui kontrollproovide korral. Tuleks tagada katseaine ühtlane jaotus katseproovide hulka kuuluvates mullaproovides. Segamise ajal tuleks vältida mulla pallideks vormimist.
 
1.7.1.2.  Mullaproovide inkubeerimine  
Mullaproove inkubeeritakse kahel moel: katse- ja kontrollmullaproo ­
vide koondproovina või katse ja kontrollmullaproovide üksikute ja võrdse suurusega osaproovide sarjana. Kui uuritakse lenduvaid 
aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana. 
Kui mullaproovid inkubeeritakse koondproovina, valmistatakse ette katse- ja kontrollmullaproovide suured kogused ning vastavalt vaja ­
dusele analüüsitavad osaproovid katse käigus. Algselt iga katse- või 
kontrollproovi kohta ettevalmistatud kogus sõltub osaproovide suuru ­
sest, kasutatud paralleelsete proovide arvust ja suurimatest eeldata ­
vatest proovide võtmise aegadest. Koondproovina inkubeeritavad mullaproovid tuleks enne osaproovide võtmist hoolega segada. Kui 
mullaproovid inkubeeritakse üksikute mullaproovide sarjana, jaga ­
takse iga katse- ja kontrollmullaproovide koondproov soovitud arvuks osaproovideks, ning neid kasutatakse vastavalt vajadusele. Katsetest, kus eeldatakse rohkem kui kahte proovide võtmise aega, 
tuleks ette valmistada piisavalt osaproove kõikide paralleelproovide 
ja proovivõtuaegade jaoks. Vähemalt kolme uuritava mullaproovi paralleelproovi tuleks inkubeerida aeroobsetes tingimustes (vt punkti 1.7.1.1). Kõikide katsete käigus tuleks kasutada sobivaid mahuteid, 
milles on piisavalt õhuruumi, et vältida anaeroobsete tingimuste 
tekkimist. Kui uuritakse lenduvaid aineid, tuleks katse sooritada vaid üksikute osaproovide sarjana.
 
1.7.1.3.  Katsetingimused ja katse kestus  
Katset tehakse pimedas toatemperatuuril 20 ± 2  o C. Mullaproovide 
niiskusesisaldust tuleks säilitada katse käigus 40–60 % mulla suuri ­
mast veemahutavusest (vt punkti 1.6.4.2) vahemikus ± 5 %. Vaja ­
duse korral võib lisada destilleeritud, deioniseeritud vett.  
Katsete minimaalne kestus on 28 päeva. Kui uuritakse agrokemi ­
kaale, võrreldakse katse- ja kontrollproovides vabanenud süsinik ­
dioksiidi või tarbitud hapniku koguseid. Kui need erinevad 28. 
päeval rohkem kui 25 %, jätkatakse katset seni, kuni erinevus võrdub 
või on väiksem kui 25 %, või maksimaalselt 100 päeva, olenevalt sellest, kummaks kulub vähem aega. Muude kui agrokemikaalide puhul lõpetatakse katse pärast 28 päeva. 28. päeval määratakse kind ­
laks katse- ja kontrollmullaproovides vabanenud süsinikdioksiidi või 
tarbitud hapniku kogused ja arvutatakse EC
 x väärtused.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Mullaproovide võtmine ja analüüs  
1.7.2.1.  Mullaproovide võtmise ajakava  
Kui uuritakse agrokemikaale, analüüsitakse mullaproovides glükoosi 
põhjustatud hingamiskiirusi 0., 7., 14. ja 28. päeval. Kui on vaja 
katset pikendada, tuleks teha täiendavad mõõtmised 14päevaste inter ­
vallide tagant pärast 28. päeva.  
Kui uuritakse muid kui agrokemikaale, kasutatakse vähemalt viit 
katsekontsentratsiooni ja analüüsitakse mullaproovides glükoosi 
põhjustatud hingamist kokkupuute perioodi alguses (0-päev) ja 
lõpus (28. päev). Võib lisada vajaduse korral vahepealse mõõtmise, nt 7. päeval. 28. päeval saadud teavet kasutatakse kemikaali EC
 x 
väärtuse kindlaksmääramiseks. Soovi korral võib kasutada 0-päeval 
kontrollproovidest saadud andmeid mullas metaboolselt aktiivse 
mikroobi biomassi algkogustest teatamiseks (12).  
1.7.2.2.  Glükoosi põhjustatud hingamiskiiruste mõõtmine  
Iga katseproovi ja kontrollproovi paralleelse proovi glükoosi põhjus ­
tatud hingamiskiirus määratakse kindlaks igal proovivõtukorral. Mullaproovidesse segatakse selline glükoosihulk, millest piisab 
vahetu suurima hingamisreaktsiooni põhjustamiseks. Nimetatud 
mullaproovis suurima hingamisreaktsiooni põhjustamiseks vajaliku glükoosi hulga saab kindlaks määrata eelkatses, kasutades glükoosi kontsentratsioonide sarja (14). Liivaste muldade puhul, mille orgaa ­
nilise süsiniku sisaldus on 0,5–1,5 %, piisab tavaliselt 2 000–4 000 
mg glükoosist mulla kuivmassi kg kohta. Glükoosi võib jahvatada pulbriks koos puhta kvartsliivaga (10 g liiva mulla kuivmassi kg kohta) ja segada ühtlaselt mullaga.
 
Glükoosiga parandatud mullaproove inkubeeritakse sobivas hinga ­
miskiiruste mõõtmisseadmes kas pidevalt, kord tunnis või kord 
kahe tunni jooksul (vt punkti 1.6.1) 20 ± 2  o C juures. Vabanenud 
süsinikdioksiidi või tarbitud hapnikku mõõdetakse 12 järjestikusel tunnil ning mõõtmisi tuleks alustada nii ruttu kui võimalik, s.t üks- 
kaks tundi pärast glükoosiga täiendamist. Mõõdetakse vabanenud 
süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku üldkoguseid 12 tunni jooksul ja määratakse keskmised hingamiskiirused.
 
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Kui katseid tehakse agrokemikaalidega, tuleks registreerida igas 
mullaproovi paralleelproovis vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud 
hapniku kogus ja tuleks esitada kõikide paralleelproovide keskmised väärtused tabeli kujul. Süsiniku transformatsiooni kiirusi tuleks hinnata sobivate ja üldiselt heakskiidetud statistiliste meetodite abil 
(nt F-katse, 5 % olulisusaste). Glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi 
väljendatakse mg süsinikdioksiidina mulla kuivmassi kg kohta tunnis või mg hapnikuna mulla kuivmassi kg kohta tunnis. Keskmist süsi ­
nikdioksiidi tekkekiirust või keskmist hapniku tarbimiskiirust igas 
katseproovis võrreldakse samade kiirustega kontrollproovis ning 
arvutatakse katse- ja kontrollproovi vaheline protsentuaalne hälve.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Kui katseid tehakse muude kui agrokemikaalidega, määratakse kindlaks 
igas paralleelproovis vabanenud süsinikdioksiidi või tarbitud hapniku 
kogused ning koostatakse annuse-reaktsiooni kõver EC  x väärtuste hinda ­
miseks. Katseproovi glükoosi põhjustatud hingamiskiirusi (s.t mg süsi ­
nikdioksiidi mulla kuivmassi kg kohta tunnis või mg hapnikku mulla 
kuivmassi kg kohta tunnis) pärast 28 päeva möödumist võrreldakse 
samade kiirustega kontrollproovis. Nimetatud andmete põhjal arvuta ­
takse protsentuaalsed inhibitsiooniväärtused iga katsekontsentratsiooni kohta. Need protsendimäärad registreeritakse kontsentratsioonina ning 
seejärel kasutatakse statistilisi protseduure EC
 x väärtuste arvutamiseks. 
Usalduspiirid (p = 0,95) arvutatud EC  X puhul määratakse samuti kind ­
laks standardprotseduuride abil (15, 16, 17).  
2.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Kui hinnatakse agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi ning 
hingamiskiiruste erinevus madalamate katseaineannuste (mis vastab suurimale eeldatavale kontsentratsioonile) ja kontrollproovide vahel on võrdne või väiksem kui 25 % mis tahes proovivõtuajal pärast 28 
päeva möödumist, saab hinnata, et katseaine ei oma pikaajalist 
toimet süsinikdioksiidi tekkele muldades. Kui muude kemikaalide kui agrokemikaalidega tehtud katsete tulemusi hinnatakse, kasuta ­
takse EC
 50 , EC  25 ja/või EC  10 väärtusi.  
3. ARUANDLUS  
3.1 KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Kasutatava mulla täielik identifitseerimine, kaasa arvatud:  
— geograafiline viide kohale (laiuskraad, pikkuskraad);  
— teave koha ajaloo kohta (s.t taimkate, põllukultuuride kaitseva ­
henditega töötlemine, väetistega töötlemine, juhuslik saastamine 
jne); 
— kasutusviis (nt põllumaa, mets jne);  
— proovivõtu sügavus (cm);  
— liiva-/aleuriidi-/savisisaldus (protsenti kuivmassist);  
— pH (vees);  
— orgaanilise süsiniku sisaldus (protsenti kuivmassist);  
— lämmastikusisaldus (protsenti kuivmassist);  
— katioonvahetusvõime (mmol/kg);  
— algne mikroobi biomass protsendina orgaanilise süsiniku kogu ­
hulgast;  
— viide iga parameetri määramismeetodi kohta;  
— kogu teave mullaproovide kogumise ja säilitamise kohta;  
— vajaduse korral üksikasjalikud andmed mulla eelinkubeerimise 
kohta.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Katseaine:  
— füüsiline laad ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;  
— vajaduse korral keemilised tunnusandmed, sh struktuurivalem, 
puhtus (s.t põllukultuuride kaitsevahendite toimeaine protsendi ­
määr), lämmastikusisaldus.  
Katsetingimused:  
— üksikasjalikud andmed mulla parandamise kohta orgaanilise 
substraadiga;  
— uuritava kemikaali kontsentratsioonide arv ja vajaduse korral 
valitud kontsentratsioonide põhjendus;  
— üksikasjalikud andmed katseaine mulda annustamise kohta;  
— inkubatsioonitemperatuur;  
— mulla niiskusesisaldus katse alguses ja kestel;  
— kasutatav mulla inkubeerimismeetod (koondproovina või üksi ­
kute osaproovide sarjana);  
— paralleelsete proovide arv;  
— proovivõtuajad.  
Tulemused:  
— hingamiskiiruste mõõtmismeetod ja -seade;  
— andmed tabeli kujul, sh süsinikdioksiidi või hapniku üksikud ja 
keskmised väärtused;  
— katse- ja kontrollproovide paralleelproovide vaheline muutus;  
— arvutustega tehtud paranduste selgitused, kui on vaja;  
— glükoosi põhjustatud hingamiskiiruse protsentuaalne muutus igal 
proovivõtukorral või vajaduse korral EC  50 väärtus 95 % usaldus ­
vahemikus, muud EC  x väärtused (s.t EC  25 või EC  10 ) usaldusva ­
hemikes ning annuse-reaktsiooni kõver;  
— vajaduse korral tulemuste statistiline töötlemine;  
— kogu teave ja vaatlused, mis aitaksid tõlgendada tulemusi.  
4. VIITED  
1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 
3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. 
SETAC-Europe, Brussels.  
5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory.  
7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microf ­
lora”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.  
8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. 
Agronomy Monograph Ns 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.
 
9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant 
and Soil, 116: 77-81.  
12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.  
13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
14) Malkomes, H.-P. (1986). EinfluE von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenuber Pflanzen ­
schutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. 
(Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on 
the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzen ­
schutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
 
15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99-113.  
16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON 
MULLAS  
1. MEETOD  
Käesolev katsemeetod lähtub juhendist OECD TG 307 (2002).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev katsemeetod põhineb olemasolevatel juhenditel (1, 2, 3, 4, 
5, 6, 7, 8, 9). Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud meetod töötati välja kemikaalide aeroobse ja anaeroobse transformatsiooni hindami ­
seks mullas. Katsete abil määratakse i) katseaine transformatsiooni ­
kiirus ja ii) selliste transformatsioonisaaduse laad, mida taimed ja 
mullaorganismid saavad mõjutada, ning nende moodustumis- ja hävi ­
miskiirus. Sellised uuringud tehakse kemikaalidega, mida levitatakse otse maapinda või mis tõenäoliselt jõuavad mullakeskkonda. Selliste 
laboriuuringute tulemusi võib samuti kasutada vastavates väliuurin ­
gutes kasutatud proovivõtu- ja analüüsiprotokollide koostamisel.
 
Transformatsiooniteede hindamiseks piisab üldjuhul aeroobsest ja 
anaeroobsest uuringust ühe pinnasetüübiga (8, 10, 11). Transformat ­
sioonikiirused tuleks kindlaks määrata veel lisaks vähemalt kolmes 
pinnasetüübis (8, 10).  
Käesolevas katses kasutatavate pinnaste arvu ja tüüpide osas lepiti 
kokku pinnase ja sedimentide valikut käsitlevas OECD töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (10). Uuritavad pinna ­
setüübid peaksid esindama keskkonnatingimusi, kus katseainet kasu ­
tatakse või kus vabastamised toimuvad. Näiteks, kemikaale, mis võidakse vabastada subtroopilises kuni troopilises kliimas, tuleks uurida Ferrasoli või Nitosoliga (FAO-süsteem). Töörühm tegi samuti 
soovitusi seoses mullaproovide kogumise, käsitlemise ja säilitami ­
sega, vastavalt ISO juhendile (15). Käesolevas meetodis võetakse samuti arvesse riisi kasvatamisel kasutatavaid pinnaseid.
 
1.2. MÕISTED  
Katseaine  – mis tahes aine, kas lähteühend või vastav transformat ­
sioonisaadus.  
Transformatsioonisaadused  – kõik katseaine biootilistes või abioo ­
tilistes transformatsioonireaktsioonides saadud ained, kaasa arvatud CO
 2 ja tooted, mis on seotud jääkides.  
Seotud jäägid  – pinnases, taimedes või loomades olevad ühendid, 
mis ekstraheerimise järel säilivad matriitsis lähteainena või selle 
metaboliidi(metaboliitide)/transformatsioonisaadustena. Ekstraheeri ­
mismeetod ei tohiks oluliselt muuta ühendit ennast või matriitsi struktuuri. Sideme olemust saab selgitada osaliselt matriitsi muutva 
ekstraheerimismeetodi ja täiustatud analüüsitehnikate abil. Tänaseni, 
näiteks, on sel viisil kindlaks tehtud kovalentsed ioonsidemed ja sorptsioonsidemed ning „lõksud”. Üldiselt vähendab seotud jääkide teke oluliselt bioloogilist kättesaadavust ja bioloogilist omastatavust 
(12) 1984. aasta IUPAC muudatus (13).
 
Aeroobne transformatsioon  – reaktsioonid, milles osaleb moleku ­
laarne hapnik (14).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaeroobne transformatsioon  – reaktsioonid, milles ei osale mole ­
kulaarne hapnik (14).  
Pinnas  – väikeste (peamiselt mikro)organismide poolt orgaaniliseks 
muudetav segu mineraalsetest ja orgaanilistest keemilistest koostisai ­
netest, mis hiljem sisaldab kõrge süsiniku- ja lämmastikusisaldusega 
ning suure molekulmassiga ühendeid. Pinnast võib töödelda kahes eri seisundis:
 
a) looduspärane, nagu see on aja jooksul arenenud pinnasetüüpide 
erinevateks iseloomulikeks kihtideks;  
b) häiritud, nagu see on tavaliselt esineb viljeluspõldudel või käes ­
olevas meetodis kasutamiseks kaevatud proovides (14).  
Mineralisatsioon  – orgaanilise ühendi täielik lagunemine CO  2 -ks ja 
H 2 O-ks aeroobsetes tingimustes ning CH  4 -ks, CO  2 -ks ja H  2 O-ks 
anaeroobsetes tingimustes. Käesoleva katsemeetodi kontekstis, kui kasutatakse
 14 C-märgistatud ühendit, tähendab mineralisatsioon 
ulatuslikku lagundamist, mille käigus märgistatud süsinikuaatom 
oksüdeerub ning vabaneb sobiv kogus  14 CO 2 (14).  
Poolestusaeg  – t  0,5 on aeg, mis kulub katseaine 50 %liseks transfor ­
matsiooniks, kui transformatsiooni saab kirjeldada esimese astme 
kineetika abil; poolestusaeg ei sõltu kontsentratsioonist.  
DT 50 (hävimisaeg 50)  – aeg, mille jooksul katseaine kontsentrat ­
siooni vähendatakse 50 % võrra; see on erinev poolestusajast t  0,5, 
mil transformatsioon ei järgi esimese astme kineetikat.  
DT 75 (hävimisaeg 75)  – aeg, mille jooksul katseaine kontsentrat ­
siooni vähendatakse 75 % võrra.  
DT 90 (hävimisaeg 90)  – aeg, mille jooksul katseaine kontsentrat ­
siooni vähendatakse 90 % võrra.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Võrdlusaineid tuleks kasutada transformatsioonisaaduste iseloomus ­
tamiseks ja/või identifitseerimiseks spektroskoopiliste ja kromato ­
graafiliste meetodite abil.  
1.4. KATSE KOHALDAMISALA  
Meetodit kohaldatakse kõikide keemiliste ainete suhtes (märgista ­
mata või radiomärgistatud, mille kohta on olemas piisavalt täpne ja 
tundlik analüüsimeetod. See on kohaldatav kergelt lenduvate, mitte ­
lenduvate, veeslahustuvate või vees mittelahustuvate ühendite suhtes. Katset ei kohaldata kemikaalide suhtes, mis kergesti lenduvad pinna ­
sest (nt fumigandid, orgaanilised lahustid) ja seega ei saa seda hoida 
pinnases käesolevates katsemeetodites.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. TEAVE KATSEAINE KOHTA  
Märgistamata või märgistatud katseainet saab kasutada transformat ­
sioonikiiruse mõõtmiseks. Märgistatud materjal on nõutav transfor ­
matsioonitee uurimiseks ja ainetaseme määramiseks.  14 C-märgistust 
soovitatakse, kuid muude isotoopide (näiteks  13 C, 15 N, 3 H, 32 P) 
kasutamine võib olla samuti kasulik. Niipalju kui võimalik tuleks märgistus asetada molekuli kõige stabiilsemale) osa(de) külge (
 1 ). 
Katseaine puhtus peaks olema vähemalt 95 %.  
Enne pinnases aeroobset ja anaeroobset transformatsiooni käsitleva 
katse tegemist peaks olema katseaine kohta kättesaadaval järgmine teave:
 
a) lahustuvus vees (meetod A.6);  
b) lahustuvus orgaanilistes lahustites;  
c) aururõhk (meetod A.4) ja Henry konstant;  
d) n-oktanooli/vee jaotustegur (meetod A.8);  
e) keemiline stabiilsus pimedas (hüdrolüüs) (meetod C.7);  
f) pK  a , kui molekulil on kalduvus protoneerumisele või deprotonee ­
rumisele (OECD juhend 112) (16).  
Muu vajalik teave võib sisaldada andmeid katseaine mürgisuse kohta 
mullamikroobide suhtes (katsemeetodid C.21 ja C.22) (16).  
Katseaine ja selle transformatsioonisaaduste kvantifitseerimise ja 
identifitseerimise analüüsimeetodid (sh ekstraheerimis- ja puhasta ­
mismeetodid) peaksid olema kättesaadavad.  
1.6. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Mullaproove töödeldakse katseainega ja inkubeeritakse pimedas 
Erlenmeyer kolbides või möödavoolusüsteemides kontrollitud labori ­
tingimustes (konstantse temperatuuri ning pinnaseniiskuse juures). 
Pärast sobivaid ajavahemikku ekstraheeritakse mullaproovid ja neid analüüsitakse lähteaine ja transformatsioonisaaduste suhtes. 
Lenduvad saadused kogutakse samuti analüüsiks sobivate absorbt ­
siooniseadmete abil. Kasutades
 14 C-märgistusega materjali, saab 
mõõta katseaine erinevaid mineralisatsioonikiiruseid eraldunud  
14 CO 2 kinni püüdes, ning saab määrata ainetaseme, sh pinnases 
seotud jäägid.  
1.7. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
1.7.1.  Saagis  
Vähemalt kahe mullaproovi ekstraheerimine ja analüüs kohe katse ­
aine lisamise järel annab esimesi märke analüüsimeetodi korratavuse kohta ning katseaine manustamise ühtsuse kohta Saagised katse hili ­
sematelt etappidelt on saadud vastavatelt ainetasemetelt. Saagised 
peaksid jääma vahemikku 90–110 % märgistatud kemikaalide puhul (8) ja 70–110 % märgistamata kemikaalide puhul (3).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Näiteks, kui katseaine sisaldab ühte rõngast, on nõutav see märgistada; kui katseaine 
sisaldab kahte või enamat rõngast, võib vaja minna eraldi uuringuid kummagi märgis ­
tatud rõnga säilimise hindamiseks ja sobiva teabe saamiseks transformatsioonisaaduste 
tekke kohta.
 1.7.2.  Analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkus  
Analüüsimeetodi korratavust (v.a alguses tehtud ektraheerimise 
tõhusus) katseaine ja transformatsiooni saaduste kvantifitseerimiseks saab kontrollida, korduvanalüüsides samast pinnasest tehtud 
ekstrakti, mida on inkubeeritud seni, kuni tekivad transformatsiooni ­
saadused.
 
Katseaine ja transformatsioonisaaduste puhul on analüüsimeetodi 
avastamislävi (LOD) peaks olema vähemalt 0,01 mg-kg  –1 mulla­
proovi (katseainena) või 1 % kasutatud annusest, olenevalt sellest, 
kumb on väiksem. Kvantifikatsioonilävi (LOQ) tuleks samuti 
määrata.  
1.7.3.  Transformatsioonist saadud andmete täpsus  
Katseaine kontsentratsioonide regressioonanalüüs ajafunktsioonina 
annab vajalikku teavet transformatsioonikõvera usaldusväärsuse kohta ning võimaldab arvutada poolestusaegade usalduspiire (näilise 
esimese astme kineetika puhul) või DT
 50 väärtused ja vajaduse korral 
DT 75 ja DT  90 väärtused.  
1.8. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.8.1.  Seadmed ja keemilised reaktiivid  
Inkubatsioonisüsteemid võivad olla staatiliselt suletud süsteemid või 
sobivad möödavoolusüsteemid (7, 17). Näited mullaproovide inku ­
batsioonil kasutatava möödavooluseadme ja Erlenmeyeri kolvi kohta 
on esitatud vastavalt joonistel 1 ja 2. Mõlemat tüüpi inkubatsiooni ­
süsteemidel on eelised ja puudused (7, 17).  
Nõutavad on standardsed laboriseadmed, eriti järgmised:  
— analüütilised seadmed, näiteks GLC, HPLC, TLC-seadmed, 
kaasa arvatud radiomärgistatud või märgistamata ainete analüü ­
simisel kohaldatavad avastamissüsteemid või pööratud isotoopide 
lahjendusmeetod;  
— identifitseerimisel kasutatavad seadmed (nt MS, GC-MS, HPLC- 
MS, NMR jne);  
— vedelikstsintsillaatsioonloendur;  
— oksüdeerija radioaktiivsete ainete põletamiseks;  
— tsentrifuug;  
— ekstraheerimisseade (nt tsentrifuugiküvetid külmekstraheerimi ­
seks ja Soxhlet’ seade pidevekstraheerimiseks püstjahuti all);  
— lahuste ja ekstraktide kontsentreerimise seadmed (nt pöördau ­
rusti);  
— veevann;  
— mehaaniline segamisseade (nt sõtkumismasin, pöörlev segisti).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Kasutatud keemilised reaktiivid, näiteks:  
— NaOH, analüütiliselt puhas, 2 mol · dm  –3 , või muu sobiv alus (nt 
KOH, etanoolamiin);  
— H  2 SO 4 , analüütiliselt puhas, 0,05 mol · dm  –3 ; 
— etüleenglükool, analüütiliselt puhas;  
— tahked absorbtsioonimaterjalid, nt naatronlubi ja polüuretaan ­
küünlad;  
— orgaanilised lahustid, analüütiliselt puhtad, nt atsetoon, meta ­
nool jt;  
— stsintsillatsioonvedelik.  
1.8.2.  Katseaine annustamine  
Mullaproovi lisamiseks või levitamiseks võib katseainet lahustada 
vees (deioniseeritud või destilleeritud) või vajaduse korral väheses koguses atsetoonis või muudes orgaanilistes lahustites (6), milles 
katseaine on piisavalt lahustuv ja stabiilne. Valitud lahusti kogusel 
ei peaks siiski olema olulist mõju mulla mikroobsele aktiivsusele (vt punkte 1.5 ja 1.9.2–1.9.3 Selliste mikrobioloogilist aktiivsust inhi ­
beerivate lahustite nagu kloroform, diklorometaan ja muud halogee ­
nitud lahustid kasutamist tuleks vältida.
 
Katseainet võib samuti lisada tahkel kujul, nt segatud kvartsliivaga 
(6) või mullaproovide väikeste osaproovidena, mida on õhkkuiva ­
tatud ja steriliseeritud. Kui katseainet lisatakse lahusti abil, tuleks lasta lahustil aurustuda enne katseainet sisaldava osaproovi lisamist 
algupärasesse ebasteriilsesse mullaproovi.
 
Üldkemikaalide puhul, mis sisenevad mulda üldiselt reoveesetete 
kaudu või põllumajanduslikul kasutamisel, tuleks katseainet esmalt 
lisada reovette, mida seejärel annustatakse mullaproovi (vt punkte 1.9.2 ja 1.9.3).
 
Preparaatide kasutamist tavaliselt ei soovitata. Nt nõrgalt lahustuva 
katseaine puhul võib siiski kasutada preparaati sobiva alternatiivina.  
1.8.3.  Pinnased  
1.8.3.1.  Pinnase valik  
Transformatsioonitee kindlaksmääramisel võib kasutada representa ­
tiivset pinnast; soovitav pinnasetüüp on saviliiv või liivsavi või 
savi või savine liiv (vastavalt FAO ja USDA klassifikatsioonile (18)), mille pH on 5,5–8,0, orgaanilise süsiniku sisaldus on of 0,5–2,5 % ja mikroobi biomass on vähemalt 1 % orgaanilise süsiniku 
koguhulgast (10).
 
Transformatsioonitee määramisel tuleks uurida vähemalt kolme 
representatiivset pinnast. Pinnaste orgaanilise süsiniku sisaldus, pH, 
savi sisaldus ja mikroobi biomass on erinevad (10).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Kõiki pinnaseid tuleks iseloomustada vähemalt nende tekstuuri (liiva, 
aluerüdi, savi (protsentides)) (vastavalt FAO ja USDA klassifikat ­
sioonile (18)), pH, katioonvahetusvõime, orgaanilise süsiniku, lasu ­
vustiheduse, veeläbilaskvusvõime (  1 ) ja mikroobi biomassi poolest 
(üksnes aeroobsetes uuringutes). Tulemuste tõlgendamisel võib 
osutuda kasulikuks lisateave pinnaseomaduste kohta. Pinnaseoma ­
duste kindlaksmääramiseks saab kasutada viidetes (19, 20, 21, 22, 23) soovitatud meetodeid. Mikroobi biomass tuleks määrata subs ­
traadi indutseeritud hingamise (SIR) meetodi (25, 26) või alternatiiv ­
sete meetodite abil (20).
 
1.8.3.2.  Mullaproovide kogumine, käsitlemine ja säilitamine  
Üksikasjalik teave proovikogumiskoha ajaloo kohta peaks olema 
kättesaadav. Üksikasjade hulka kuuluvad täpne asukoht, taimkate, 
põllukultuuride kaitsevahenditega töötlemise kuupäevad, orgaaniliste ja anorgaaniliste väetistega töötlemine, bioloogiliste materjalide lisa ­
mine või juhuslik saastumine. Kui pinnaseid on juba töödeldud 
katseainega või selle struktuursete analoogidega viimase nelja aasta jooksul, ei tuleks neid kasutada transformatsiooni uuringutel (10, 15).
 
Muld peaks olema värskelt kogutud põllult (A-horisondilt või ülemi ­
sest 20 cm kihist), ning selle veesisaldus peaks olema selline, et 
hõlbustaks sõelumist. Muude muldade kui riisipõldude muldade 
puhul tuleks vältida proovide võtmist pikkade (> 30 päeva) põua-, külmumis- või üleujutusperioodide jooksul või vahetult pärast neid (14). Proove tuleks transportida nii, et muutused mulla veesisalduses 
oleksid minimaalsed ja neid tuleks hoida pimedas võimalikult vaba 
õhujuurdepääsuga. Nõrgalt seotud polüetüleenkott on üldiselt selleks piisav.
 
Mulda tuleks töödelda nii ruttu kui võimalik pärast proovivõtmist. 
Taimed, suurem mullafauna ja kivid tuleks eemaldada enne mulla 
sõelumist läbi 2 mm sõela, mis eemaldab väikesed kivid, fauna ja 
taimejäätmed. Tuleks vältida mulla ulatuslikku kuivatamiste ja purus ­
tamist enne sõelumist (15).  
Kui põllult proovide võtmine on raske talvel (pinnas on külmunud 
või kaetud lumekihtidega), võib proove võtta mullapartiist, mida 
säilitatakse kasvuhoones taimkatte all (nt rohu või rohu-ristikheina segu all). Väga on eelistatud uuringud värskelt põllult kogutud muldadega, kuid kui kogutud ja töödeldud mulda tuleb säilitada 
enne uuringu algust, peavad säilitamistingimused olema piisavad ja 
üksnes piiratud aja jooksul (4 ± 2
 o C maksimaalselt kolm kuud), et 
säiliks mikroobne aktiivsus (  2 ). Üksikasjalikud juhendid selliste 
mullaproovide kogumiseks, käsitlemiseks ja säilitamiseks, mida 
kasutatakse biotransformatsioonikatsetes, on toodud viidetes (8, 10, 
15, 26, 27).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Pinnase veeläbilaskvusvõimet saab mõõta väliveemahutavusena, veemahutavuse või 
imirõhuna (pF). Selgitused on liites 1. Katseprotokollis tuleks edastada, kas pinnase 
veeläbilaskvusvõime ja lasuvustihedus määrati kindlaks looduspärastes väliproovides 
või häiritud (töödeldud) proovides. 
( 2 ) Viimased uurimistulemused viitavad sellele, et parasvöötmes kogutud mullaproove saab 
samuti säilitada –20  o C juures üle kolme kuu (28, 29) mikroobide aktiivsust oluliselt 
häirimata.
 Enne töödeldud pinnase kasutamist katses, tuleks seda eelinkubee ­
rida, et lasta seemnetel idaneda ja saaks need eemaldada ning taas ­
tada mikroobide ainevahetuse tasakaal pärast proovivõtu- ja säilita ­
mistingimuste muutumist inkubatsioonitingimusteks. 2–28 päeva vahel toimuv eelinkubeerimine ligikaudu samadel temperatuuri ja 
niiskuse tingimustel nagu tegelikus katseski on üldiselt piisav (15). 
Säilitamis- ja eelinkubeerimisperioodid kokku ei tohiks ületada kolme kuud.
 
1.9. KATSE KÄIK  
1.9.1.  Katsetingimused  
1.9.1.1.  Katsetemperatuur  
Kogu katseperioodi jooksul tuleks mullaproovid inkubeerida pimedas 
konstantsel temperatuuril, mis vastab kliimatingimustele, kus katseainet kasutati või kus toimus vabastamine. Kõikide paras ­
vöötmes pinnasesse jõudvate katseainete puhul on soovitav tempera ­
tuur 20 ± 2
 o C. Temperatuuri tuleks jälgida.  
Kemikaalide puhul, mida kasutatakse või mis vabanevad külmemas 
kliimas (nt põhjamaades, sügis/talveperioodil), tuleks inkubeerida 
lisaproove, kuid madalamal temperatuuril (nt 10 ± 2  o C). 
1.9.1.2.  Niiskusesisaldus  
Aeroobsetes tingimustes transformatsioonikatsete puhul tuleks mulla 
niiskusesisaldust (  1 ) reguleerida ja säilitada pF vahemikus 2,0–2,5 
(3). Mulla niiskusesisaldust väljendatakse veemassina kuiva mulla massi kohta ja seda tuleks korrapäraselt kontrollida (nt kahenädalaste intervallide tagant), kaaludes inkubatsioonikolbe ja veekadusid, mida 
täiendatakse vee lisamise teel (eelistatavalt steriilne filtreeritud kraa ­
nivesi). Tuleks püüda vältida või vähendada katseaine ja/või trans ­
formatsioonisaaduste kadu lendumise ja/või fotolagundamise (kui see juhtub) kaudu vedeliku lisamise käigus.
 
Anaeroobsetes tingimustes transformatsioonikatsete käigus küllasta ­
takse pinnast veega üleujutamise teel.  
1.9.1.3.  Aeroobsed inkubatsioonitingimused  
Möödavoolusüsteemides säilitatakse aeroobsed tingimused vahelduva 
loputamise või pidevalt niisutatud õhuga ventileerimise teel. Erlen ­
meyeri kolbides tagatakse õhuvahetus difusiooni abil.  
1.9.1.4.  Steriilsed aeroobsed tingimused  
Katseaine abiootilise transformatsiooni olulisuse kohta käiva teabe 
saamiseks võib mullaproovid steriliseerida (steriliseerimismeetodid 
on viidetes 16 ja 29), töödelda steriilse katseainega (nt lahuse lisa ­
mine läbi steriilse filtri) ja tuulutada niisutatud steriilse õhuga, nagu on kirjeldatud punktis 1.9.1.3. Riisipõldude mullaproovide puhul tuleks pinnast ja vett steriliseerida ja inkubeerida tuleks vastavalt 
punktile 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Mullaproov ei tohiks kunagi olla liiga märg või liiga kuiv, et säiliks mulla mikrofloora 
piisav ohutus ja toitumine. Soovituslikud niiskusesisaldused optimaalseks mikroobi 
kasvuks on 40–60 % veemahutavusest (WHC) ja 0,1–0,33 baari (6). Viimane vahemik 
on sama, mis 2,0–2,5 pF-vahemik. Erinevatele mullatüüpidele omased niiskusesisaldused 
on toodud 2. liites.
 1.9.1.5.  Aneroobsed inkubatsioonitingimused  
Anaeroobsete tingimuste loomiseks ja säilitamiseks katseainega 
töödeldud ja aeroobsetes tingimustes 30 päeva või ühe poolestusaja jooksul või DT
 50 ajal (olenevalt sellest, milleks kulub vähem aega) 
inkubeeritud pinnast küllastatakse seejärel veega (1–3 cm veekiht) ja 
inkubatsioonisüsteemi loputatakse inertse gaasiga (nt lämmastik või argoon) (
 1 ). (2) Katsesüsteem peab võimaldama järgmiseid mõõtmisi: 
pH, hapniku kontsentratsiooni ja redokspotentsiaali mõõtmised, ja 
sisaldama lenduvate saaduste püüdmise seadmeid. Erlenmeyeri kolbi ­
dest koosnev süsteem tuleb sulgeda, et vältida õhu sisenemist difu ­
siooni teel.  
1.9.1.6.  Niiske põllu mullaproovide inkubatsioonitingimused  
Riisipõllu mullaproovide transformatsiooni uurimisel ujutataks 
pinnas üle ligikaudu 1–5 cm veekihiga ja katseainet annustatakse 
veefaasi (9). Soovitav pinnasesügavus on vähemalt 5 cm. Süsteemi 
õhutatakse samamoodi nagu aeroobsetel tingimustel. Veekihi pH, hapniku kontsentratsiooni ja redokspotentsiaali tuleks jälgida ja sellest teatada. Vähemalt kahenädalane eelinkubatsiooniperiood on 
vajalik enne transformatsiooniuuringutega alustamist (vt punkt 
1.8.3.2).
 
1.9.1.7.  Katse kestus  
Kiirust ja transformatsiooniteed käsitlevad uuringud ei tohiks tavali ­
selt ületada 120 päeva (  2 ) (3, 6, 8), kuna seejärel eeldatakse, et 
väheneb mulla mikroobne aktiivsus tehislaborisüsteemis, kus ei 
täiene looduslikult toitainetagavarad. Kui katseaine vähenemist ja 
peamiste transformatsioonisaaduste teket ja vähenemist on vaja kirjeldada, tuleks uuringuid jätkata pikema aja jooksul (nt 6 või 12 kuud) (8). Pikemaid inkubatsiooniperioode tuleks põhjendada katse ­
protokollis ja sellele tuleks lisada biomassi mõõtmised nimetatud 
perioodide kestel ja lõpus.
 
1.9.2.  Katse käik  
Ligikaudu 50–200 g mulda (kuivmassina) asetatakse iga inkubatsioo ­
nikolvi põhja (vt 3. liites jooniseid 1 ja 2) ning mulda töödeldakse katseainega ühe punktis 1.8.2 kirjeldatud meetodi abil. Kui orgaani ­
lisi lahusteid kasutatakse katseaine annustamiseks, tuleks need 
eemaldada mullast aurustamise teel. Seejärel segatakse muld hooli ­
kalt spaatliga ja/või kolvi raputamise teel. Kui uuring tehakse niis ­
kete põldude tingimustes, tuleks mulda ja vett hoolikalt segada pärast 
katseaine lisamist. Väikeseid töödeldud muldade alikvoote (nt 1 g) 
tuleks analüüsida katseaine ühtlase jaotuse kontrollimiseks. Alterna ­
tiivne meetod on toodud allpool.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Aeroobsed tingimused domineerivad pindmises mullakihis ja isegi aluspõhjas, nagu on 
näidatud ELi rahastatud uurimisprojektis (K. Takagi  et al . (1992). Microbial diversity 
and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures 
and oxygen contents. Proc. Internal. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol, 
270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden). Anaeroobsed tingimused võivad esineda 
vaid juhuslikult pinnaste üleujutuste käigus pärast tugevaid sademeid või siis, kui on 
loodud niiske põllumajanduse tingimused riisipõldudel. 
( 2 ) Aeroobsed uuringud tuleks lõpetada palju varem kui 120 päeva, tingimusel et selgelt on 
selleks ajaks jõutud lõpliku transformatsiooniteeni ja lõpliku mineralisatsioonini. Katse 
lõpetamine on võimalik pärast 120 päeva või siis, kui vähemalt 90 % katseainest trans ­
formeeritakse, kuid tekkis ainult 5 % CO  2 .
 Annustatav kogus peaks vastama põllukultuuride kaitsevahendite 
kasutusjuhendites soovitatud suurimale annusele ja ühtset levimist 
sobivasse sügavusse (nt ülemisse 10 cm mullakihti (  1 ). Näiteks, 
kemikaalide puhul, mis levivad taimede lehtedesse või pinnasesse ilma, et need tungiksid taimedesse, sobiv sügavus selle arvutamiseks, 
kui palju kemikaali tuleks igasse kolbi lisada, on 2,5 cm. Pinnasesse 
tunginud kemikaalide puhul on sobiv sügavus kasutusjuhendis täpsustatud tungimissügavus. Üldkemikaalide puhul tuleks hinnata annustamist kõige sobivama pinnasesse tungimise tee põhjal, näiteks, 
kui peamine pinnasesse tungimise tee on läbi reoveesetete, tuleks 
kemikaali annustada reovette kontsentratsioonis, mis vastab oodatud reovee kontsentratsioonile, ja pinnasesse lisatud reovee hulk peaks vastama tavalisele põllumajanduses kasutatavate pinnaste reovee 
määrale. Kui see kontsentratsioon ei ole piisavalt suur peamiste 
transformatsioonisaaduste identifitseerimiseks, võib olla abiks erine ­
vate suuremaid kontsentratsioone sisaldavate mullaproovide inkubee ­
rimine, kuid tuleks vältida liiga suuri annusmäärasid, mis võivad 
mõjutada mulla mikroobide funktsioone (vt punkte 1.5 ja 1.8.2).
 
Alternatiivselt saab katseainega töödelda suuremat mullakogust (s.t 
1–2 kg), seda hoolikalt segades sobiva segamisseadme abil ja 
seejärel asetades need väikeste, 50–200 g osadena inkubatsioonikol ­
bidesse (nt proovijaoturite abil) Väikeseid töödeldud muldade alikvoote (nt 1 g) tuleks analüüsida katseaine ühtlase jaotuse kont ­
rollimiseks. Sellist protseduuri eelistatakse, kuna see võimaldab 
ühtlasemalt katseainet pinnasesse jagada.
 
Samuti inkubeeritakse töötlemata mullaproove samadel tingimustel 
(aeroobsed) nagu katseainega töödeldud proove. Nimetatud proove kasutatakse biomassi mõõtmistel uuringu käigus ja lõpus.
 
Kui katseainet lisatakse pinnasesse lahjendatuna orgaanilis(t)es lahus ­
ti(te)s, inkubeeritakse sama koguse lahusti(te)ga töödeldud mulla ­
proove samadel tingimustel (aeroobsed) kui katseainega töödeldud 
mullaproove. Nimetatud proove kasutatakse biomassi mõõtmistel 
uuringute alguses, kestel ja lõpus lahusti(te) mõjude kontrollimiseks mikroobi biomassi suhtes.
 
Töödeldud mullaproove sisaldavad kolvid kas kinnitatakse mööda ­
voolusüsteemi, mida on kirjeldatud joonisel 1, või suletakse absorbt ­
sioonikolonni, mis on toodud joonisel 2 (vt 3. liidet).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Järgmise võrrandi abil arvutatakse lähtekontsentratsioon pindala põhjal:  
C soil mg=kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg=kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d½kg soil=m 3 â 
C soil = lähtekontsentratsioon mullaproovis [mg ·kg -1 ] 
A = annustamine [kg · ha -1 ]; l = mullakihi paksus uuritavas keskkonnas [m]; d = kuivla ­
suvustihedus [kg · m -3 ]. 
Resikareegel on, et annustamisel 1 kg ha  -1 saadakse pinnase kontsentratsiooniks kigi ­
kaudu 1 mg kg  -1 kihis (oletades, et lasuvustihedus on 1 g · cm  -3 ).
 1.9.3.  Proovide võtmine ja mõõtmine  
Paralleelsed inkubatsioonikolvid eemaldatakse sobiva ajavahemiku 
tagant ja mullaproovid ekstraheeritakse erineva polaarsusega lahusti ­
tega ning analüüsitakse katseaine ja/või transformatsioonisaaduste 
osas. Hästi väljatöötatud uuringus on piisavalt kolbe, et igal proovi ­
võtukorral kasutatakse kahte kolbi. Samamoodi eemaldatakse absorbtsioonilahused või tahked absorbtsioonimaterjalid erinevate ajavahemike tagant (seitsmepäevane intervallid esimese kuu jooksul 
ja pärast ühe kuu möödumist 17päevased intervallid) iga mullaproovi 
inkubatsiooni kestel ja lõpus ning analüüsitakse lenduvate saaduste osas. Kohe katseaine manustamise järel (0-päeva proov) võetud 
mullaproovile lisaks tuleks katsetesse lisada vähemalt viis erinevat 
proovivõtukohta. Ajavahemikud tuleks valida nii, et katseaine vähe ­
nemisaegu ning transformatsioonisaaduste tekke- ja vähenemisaegu saaks määrata (nt 0, 1, 3, 7 päeva; 2, 3 nädalat; 1, 2, 3 kuud jne).
 
Kasutades  14 C-märgistusega katseainet, ekstraheerimata radioaktiiv ­
sete ainete määr määratakse põlemise teel ja ainetase arvutatakse iga 
proovivõtuaja kohta.  
Anaeroobsete ja niiske põllu proovide korral mulla- ja veefaase ning 
katseaine ja transformatsioonisaaduseid analüüsitakse või eraldatakse 
filtreerimise või tsentrifuugimise teel enne ekstraheerimist ja analüüsi.
 
1.9.4.  Valikkatsed  
Aeroobsetes, mittesteriilsetes uuringutes, milles kasutatakse muid 
temperatuure ja mullaniiskust, võib hinnata pinnase temperatuuri ja niiskuse mõju katseaine ja/või selle transformatsioonisaaduste trans ­
formatsioonikiirust pinnases.
 
Ekstraheerimata radioaktiivseid aineid võib lisaks proovida kirjeldada 
näiteks ülikriitilisel vedeliku ekstraheerimisel.  
2. ANDMED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Katseaine, transformatsioonisaaduste, lenduvate ainete (vaid protsen ­
dina) ja ekstraheerimata ainete kogused tuleks esitada protsendina 
lähtekontsentratsioonist ja vajaduse korral mg · kg–  1 mullaproove 
(tahke kuivmass) igas proovivõtuvahemikus. Ainetase tuleks esitada protsendina lisatud lähtekontsentratsioonist igas proovivõtuvahe ­
mikus. Katseaine graafiline esitamine aja funktsioonina aitab hinnata 
transformatsiooni poolestusaega või DT
 50 . Peamised transformatsioo ­
nisaadused tuleks identifitseerida ja nende kontsentratsioonid tuleks esitada aja funktsioonina, et näidata nende tekke- ja vähenemiskii ­
rust. Peamised transformatsioonisaadused on mis tahes saadused, 
mida esineb igal ajahetkel uuringu käigus ≥10 % katseaine annusest.
 
Kinnipüütud lenduvad ained annavad märke selle kohta, et katseaine 
ja selle transformatsioonisaaduste võimest pinnasest lenduda.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Sobivate kineetilise mudeli kohaste arvutuste põhjal peaks saama 
täpsemalt määrata poolestusajad või DT  50 väärtused ja vajaduse 
korral DT  75 ja DT  90 väärtused. Poolestusajad ja DT  50 väärtused 
tuleks teatada koos kasutatava mudeli, kineetika astme ja määramis ­
koefitsiendi (r  2 ) kirjeldusega. Esimese astme kineetika on soositud, 
välja arvatud juhul, kui r  2 < 0,7. Vajaduse korral tuleks arvutused 
teha peamiste transformatsioonisaaduste kohta. Sobivate mudelite näiteid kirjeldatakse viidetes 31–35.
 
Uurides erinevatel temperatuuridel kiiruseid, tuleks kirjeldada trans ­
formatsioonikiirust temperatuuri funktsioonina katsetemperatuuri 
vahemikus, kasutades Arrheniuse võrrandit kujul:  
k ¼ A·e ÄB=T or lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
kus In A ja B on kõige sobivama joone lõikepunktist ja tõusust 
saadavad regressioonkonstandid, mis saadakse ln k ja 1/T lineaarse regressioonanalüüsi tulemusena, k on kiirusekonstant temperatuuril T ja T on temperatuur Kelvini järgi. Kui transformatsiooni reguleerib 
mikroobide tegevus, tuleks võtta arvesse piiratud temperatuurivahe ­
mikku, milles Arrheniuse võrrand kehtib.
 
2.2. TULEMUSTE HINDAMINE JA TÕLGENDAMINE  
Kuigi uuringuid tehakse tehislaboritingimustes, saab tulemuste põhjal 
hinnata katseaine transformatsioonikiirust ja samuti transformatsioo ­
nisaaduste tekke- ja vähenemiskiirust välitingimustes (36, 37).  
Katseaine transformatsioonitee uuring annab teavet selle kohta, 
kuidas lisatud ainet struktuur pinnases muutub keemiliste ja mikroob ­
sete reaktsioonide abil.  
3. ARUANDLUS  
3.1. KATSEARUANNE  
Katsearuanne peab sisaldama järgmist teavet.  
Katseaine:  
— üldnimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem 
(tuues ära märgi/märkide asukoha, kui kasutatakse radiomärgis ­
tatud ainet) ja asjaomased füüsikalis-keemilised omadused (vt 
punkti 1.5);  
— katseaine puhtus (lisandid);  
— märgistatud kemikaali radiokeemiline puhtus ja spetsiifiline 
aktiivsus (vajaduse korral).  
Võrdlusained:  
— selliste võrdlusainete keemiline nimetus ja struktuur, mida kasu ­
tatakse transformatsioonisaaduste kirjeldamiseks ja/või identifit ­
seerimiseks.  
Katsepinnased:  
— üksikasjalikud andmed kogumiskoha koha;  
— mullaproovide võtmise kuupäev ja protseduur;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— pinnase omadused, nt pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, tekstuur 
(liiva-, aleuriidi-, saviprotsent), katioonvahetusvõime, lasuvusti ­
hedus, veeläbilaskvusvõime ja mikroobi biomass;  
— mullaproovide säilitamise kestus ja tingimused (kui need säilita ­
takse).  
Katsetingimused:  
— uuringute tegemise kuupäevad;  
— lisatud katseaine kogus;  
— kasutatud lahustid ja katseaine lisamise meetod;  
— töödeldud mullaproovide lähtemass ja nende mass analüüsi igal 
proovivõtukorral;  
— kasutatud inkubatsioonisüsteemi kirjeldus;  
— õhu voolukiirus (üksnes möödavoolussüsteemides);  
— katsesüsteemi temperatuur;  
— mullaproovide niiskusesisaldus inkubatsiooni ajal;  
— mikroobi biomass aeroobse uuringu alguses, kestel ja lõpus;  
— pH, hapniku kontsentratsioon ja redokspotentsiaal anaeroobsete 
ja niiske põllumaa uuringute alguses, kestel ja lõpus;  
— ekstraheerimismeetod;  
— katseaine ja peamiste transformatsioonisaaduste kvantifitseerimis- 
ja identifitseerimismeetodid mullaproovides ning ja absorbtsioo ­
nimaterjalides;  
— paralleelproovide arv ja kontrollproovide arv.  
Tulemused:  
— mikroobide tegevuse määramistulemus;  
— kasutatud analüüsimeetodite korratavus ja tundlikkus;  
— saagisemäärad (valiidse katse protsendimäärad on toodud punktis 
1.7.1);  
— tulemused tabeli kujul, väljendatuna protsendina lähteannusest ja 
vajaduse korral mg · kg –1 mullaproovi (kuivmass);  
— ainetase uuringute kestel ja lõpus;  
— pinnase ekstraheerimata (seotud) radioaktiivsuse või jääkide 
iseloomustamine;  
— vabanenud CO  2 ja muude lenduvate ühendite kvantifitseerimine;  
— katseaine ja vajaduse korral transformatsioonisaaduste kontsen ­
tratsioonid mullaproovis esitatud aja funktsioonina;  
— katseaine ja vajaduse korral transformatsioonisaaduste pooles ­
tusaeg või DT  50 , DT  75 ja DT  90 väärtused usaldusvahemikes;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— hinnang abiootilise lagunemise kiirusele steriilsetes tingimustes;  
— hinnang katseaine ja vajaduse korral peamiste transformatsiooni ­
saaduste transformatsioonikineetika kohta;  
— vajaduse korral eeldatavad transformatsiooniteed;  
— tulemuste arutelu ja tõlgendamine;  
— töötlemata tulemused (s.t proovide kromatogrammid, transformat ­
sioonikiirust käsitlevad arvutused ja transformatsioonisaaduste 
identifitseerimiseks kasutatavad vahendid).  
4. VIITED  
1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assess ­
ment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
 
2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the 
market. Annex II, Part A and Annex HI, Part A: Fate and 
Behaviour in the Environment.
 
4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in sou, water and air.  
5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prufung von Pflanzen ­
schutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
 
6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality – Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: 
Aerobic conditions.  
7) ISO 14239 (1997). Soil Quality- Laboratory incubation systems 
for measuring the mineralization of organic chemicals in soil 
under aerobic conditions.  
8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded).  
10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic 
Press, 123–157.  
12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).  
13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
15) ISO 10381-6 (199 3). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
16) Annex V to Dir. 67/548/EEC.  
17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114.
 
18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 3 3, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).  
19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Minera ­
logical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, 
Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.  
21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
 
22) Muckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologi ­
schen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologi ­
schen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method 
for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. 
Soil Biol. Biochem. 10, 215–221.  
25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
 
26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesti ­
cide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. 
Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45–60.  
27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesti ­
cides in aqueous environment. Proceedings of the 16 Sympo ­
sium on Environmental Science of Pesticide, 105–120.  
28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, 59–63 (SETAC-Europe).  
29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl-Svensson K., 
Stenstrom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesti ­
cides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68–69 (SETAC- 
Europe).
 
30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical charac ­
teristics. Plant and Soil 102, 197–200.  
31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Fesdegung von Diallat im Boden. 
Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. 
BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181–199.
 
33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. 
(1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environ ­
mental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V.H. Freed, 
Eds., 135–172.  
34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 
39, 188–204.
 
35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47–60.  
36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissi ­
pation in soil; a new model based on spatial variability. Envi ­
ronm. Sci. Technol. 24, 1032–1041.  
37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83–122.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
1. liide  
VEEPINEVUS, VÄLIVEEMAHUTAVUS (FC) JA VEEMAHUTAVUS (WHC)  ( 1 ) 
Veesamba kõrgus 
(cm) pF (  a ) baar (  b ) Märkused  
10 7 7 10  4 Kuiv pinnas 
1,6 · 10 4 4,2 16 Närbumispiir 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6 · 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Väliveemahutavuse ala (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHC (hinnang) 1 0 0,001 Veega küllastatud pinnas
 
( a ) pF = veesamba kõrguse (cm) logaritm. 
( b ) 1 baari = 10  5 Pa. 
( c ) Vastab ligikaudsele 10 %lisele veesisaldusele liivas, 35 %lisele mudas ja 45 %lisele savis. 
( d ) Väliveemahutavus ei ole konstantne, vaid see varieerub vastavalt mulla tüübile pF 1,5 ja 2,5 vahel.  
Veepinevust  mõõdetakse veesamba kõrgusena (cm) või baarides. Imirõhu laia ulatuse tõttu väljen ­
datakse seda üksnes pF väärtusena, mis vastab veesamba logaritmile.  
Väliveemahutavus  on määratletud veehulgana, mida võib säilitada atmosfäärirõhus looduspinnases 2 
päeva pärast pikemat vihmaperioodi või pärast piisavat kastmist. See määratakse looduspärases 
pinnases  in situ  põllul. Mõõtmist seega ei kohaldata pinnase häiritud laboriproovides. Häiritud 
mullaproovides määratud FC väärtused võivad esindada suuri süsteemseid muutusi.  
Veemahutavus  (WHC) määratakse kindlaks laboris looduspärases või häiritud mullas, küllastades 
mullasammast veega kapillaartranspordi teel. See on eriti kasulik häiritud mullaproovide teel ja võib 
olla kuni 30 % suurem kui väliveemahutavus (  1 ). Samuti võib olla seda katseliselt kergem määrata 
kui usaldusväärseid FC-väärtusi.  
Märkused  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
2. liide  
ERINEVATEST RIIKIDEST ERINEVATEST MULLATÜÜPIDEST VÕETUD 
MULLAPROOVIDE NIISKUSESISALDUS (g vett 100 g kuiva pinnase kohta)  
Niiskusesisaldus 
Mullatüüp Riik 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Liiv Saksamaa 28,7 8,8 3,9 
Mudane liiv Saksamaa 50,4 17,9 12,1 
Mudane liiv Šveits 44,0 35,3 9,2 
Aleuriitne muda Šveits 72,8 56,6 28,4 Savimuda Brasiilia 69,7 38,4 27,3 Savimuda Jaapan 74,4 57,8 31,4 Liivane muda Jaapan 82,4 59,2 36,0 Aleuriitne muda Ameerika Ühendriigid 47,2 33,2 18,8 Liivane muda Ameerika Ühendriigid 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Veemahutavus.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
3. liide  
Joonis 1  
Näide möödavooluseadmest, mida kasutatakse kemikaalide transformatsiooni uurimisel 
pinnases  ( 1 ) ( 2 )
 
Joonis 2  
Näide Erlenmeyeri kolvist, mida kasutatakse kemikaalide transformatsiooni uurimisel 
pinnases  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 C.24.  AEROOBNE JA ANAEROOBNE TRANSFORMATSIOON 
PÕHJASETTES  
1. MEETOD  
Käesolev meetod lähtub juhendist OECD TG 308 (2002).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Kemikaalid võivad pääseda madalasse või sügavasse pinnavette 
näiteks otse annustatuna, õhku pihustatuna, äravoolu või kuivenda ­
mise kaudu, jäätmete kõrvaldamisel, tööstusliku, kodumajapidamise või põllumajandusliku heitveena ja atmosfäärist väljasadenemisel. 
Käesolev katsemeetod kirjeldab laborimeetodit, mida kasutatakse 
orgaaniliste kemikaalide aeroobse ja anaeroobse transformatsiooni hindamiseks põhjasettes. See põhineb olemasolevatel juhenditel (1, 2, 3, 4, 5, 6). Käesolevas katses kasutatavate pinnaste arvu ja tüüpide 
osas lepiti kokku pinnase ja sedimentide valikut käsitlevas OECD 
töörühmas, mis tuli kokku Belgirates Itaalias 1995. aastal (7). Töörühm tegi samuti soovitusi seoses mullaproovide kogumise, käsitlemise ja säilitamisega, vastavalt ISO juhendile (8). Sellised 
uuringud tehakse kemikaalidega, mida levitatakse otse vette või 
mis tõenäoliselt jõuavad veekeskkonda eespool kirjeldatud viisil.
 
Loodusliku põhjasette tingimused on tihti aeroobsed ülemises 
veefaasis. Sette pinnakiht võib olla kas aeroobne või anaeroobne, kuigi sügavam sete on tavaliselt anaeroobne. Kõikide nende võima ­
luste hõlmamiseks kirjeldatakse käesolevas dokumendis nii aeroob ­
seid kui ka anaeroobseid katseid. Aeroobne katse simuleerib aeroobset veesammast, mille all on aeroobne settekiht ja mille all omakorda anaeroobne gradient. Anaeroobne katse simuleerib täieli ­
kult anaeroobset põhjasetet. Kui asjaolud viitavad sellele, et on vaja 
oluliselt kõrvale kalduda neist soovitustest, nt kasutades puutumata sette tuuma või setteid, mis võivad olla kokku puutunud katseaine ­
tega, on selleks kättesaadavad muud meetodid (9).
 
1.2. MÕISTED  
SI-ühikuid tuleks kasutada igal juhul.  
Katseaine  – mis tahes aine, kas lähteühend või vastav transformat ­
sioonisaadus.  
Transformatsioonisaadused  – kõik katseaine biootilistes või abioo ­
tilistes transformatsioonireaktsioonides saadud ained, kaasa arvatud 
CO 2 ja tooted, mis on seotud jääkides.  
Seotud jäägid  – pinnases, taimedes või loomades olevad ühendid, 
mis ekstraheerimise järel säilivad matriitsis lähteainena või selle metaboliidi(metaboliitide)/transformatsioonisaadustena. Ekstraheeri ­
mismeetod ei tohiks oluliselt muuta ühendit ennast või matriitsi 
struktuuri. Seose olemust saab selgitada osaliselt matriitsi muutva 
ekstraheerimismeetodi ja täiustatud analüüsitehnikate abil. Tänaseni, näiteks, on sel viisil kindlaks tehtud kovalentsed ioonsidemed ja sorptsioonsidemed ning „lõksud”. Üldiselt vähendab seotud jääkide 
teke oluliselt bioloogilist kättesaadavust ja bioloogilist omastatavust 
(10) (1984. aasta IUPACi muudatus (11)).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aeroobne transformatsioon  – (oksüdeeriv): reaktsioonid, milles 
osaleb molekulaarne hapnik (12).  
Anaeroobne transformatsioon  – (redutseeriv): reaktsioonid, milles 
ei osale molekulaarne hapnik (12).  
Looduslikud veed  – pinnaveed, mis on saadud tiikides, jõgedes, 
ojadest jm.  
Sete – segu mineraalsetest ja orgaanilistest keemilistest koostisaine ­
test, millest viimased sisaldavad kõrge süsiniku- ja lämmastikusisal ­
dusega ning suure molekulmassiga ühendeid. See sadestub loodus ­
likku vette, millega ta moodustab piirkihi.  
Mineralisatsioon  – orgaanilise ühendi täielik lagunemine CO  2 -ks ja 
H 2 O-ks aeroobsetes tingimustes ning CH  4 -ks, CO  2 -ks ja H  2 O-ks 
anaeroobsetes tingimustes. Käesoleva katsemeetodi kontekstis, kui 
kasutatakse radiomärgistatud ühendit, tähendab mineralisatsioon ulatuslikku lagundamist, mille käigus märgistatud süsinikuaatom oksüdeeritakse ning vabaneb sobiv kogus
 14 CO 2 või 14 CH 4 . 
Poolestusaeg,  t 0,5 – aeg, mis kulub katseaine 50 %liseks transfor ­
matsiooniks, kui transformatsiooni saab kirjeldada esimese astme kineetika abil; poolestusaeg ei sõltu lähtekontsentratsioonist.
 
DT 50 (hävimisaeg 50)  – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsen ­
tratsiooni vähendatakse 50 % võrra.  
DT 75 (hävimisaeg 75)  – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsen ­
tratsiooni vähendatakse 75 % võrra.  
DT 90 (hävimisaeg 90)  – aeg, mille jooksul katseaine lähtekontsen ­
tratsiooni vähendatakse 90 % võrra.  
1.3. VÕRDLUSAINED  
Võrdlusaineid tuleks kasutada transformatsioonisaaduste identifitsee ­
rimiseks ja/või kvantifitseerimiseks spektroskoopiliste ja kromato ­
graafiliste meetodite abil.  
1.4. TEAVE KATSEAINE KOHTA  
Märgistamata või isotoopmärgistatud katseainet saab kasutada trans ­
formatsioonikiiruse mõõtmiseks, kuigi eelistatakse märgistatud materjali. Märgistatud materjal on nõutav transformatsioonitee uuri ­
miseks ja ainetaseme määramiseks.
 14 C-märgistust soovitatakse, kuid 
muude isotoopide (näiteks  13 C, 15 N, 3 H, 32 P) kasutamine võib olla 
samuti kasulik. Niipalju kui võimalik tuleks märgistus asetada mole ­
kuli kõige stabiilsema(te) osa(de) külge (  1 ). Katseaine keemiline 
ja/või radiokeemiline puhtus peaks olema vähemalt 95 %.  
Enne katse sooritamist peaks katseaine kohta olemas olema järgmine 
teave:  
a) lahustuvus vees (meetod A.6);  
b) lahustuvus orgaanilistes lahustites;  
c) aururõhk (meetod A.4) ja Henry konstant;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Näiteks, kui aine sisaldab ühte rõngast, tuleb see rõngas märgistada. Kui katseaine 
sisaldab kahte või enamat rõngast, on vaja eraldi katseid teha, et hinnata iga märgistatud 
rõnga säilimise hindamiseks ning sobiva teabe saamiseks transformatsioonisaaduste tekke 
kohta.
 d) n-oktanooli/vee jaotustegur (meetod A.8);  
e) adsorptsioonikoefitsient (K  d , K f või K  oc vajaduse korral) (meetod 
C.18);  
f) hüdrolüüs (meetod C.7);  
g) dissotsiatsioonikonstant (pK  a ) (OECD juhend 112) (13);  
h) katseaine keemiline struktuur ja isotoopmärgistus(t)e asukoht, kui 
need esinevad.  
Märkus.  Tuleks märkida temperatuur, mille juures mõõtmisi tehakse.  
Muu kasuliku teabe hulka võivad kuuluda andmed katseaine mikro ­
organismidele mõjuva mürgisuse kohta, andmed kiire ja/või inhe ­
rentse biolagundatavuse kohta ning andmed aeroobse ja anaeroobse 
transformatsiooni kohta pinnases.  
Katseaine ja selle vees ja settes olevate transformatsioonisaaduste 
kvantifitseerimise ja identifitseerimise analüüsimeetodid (sh ekstra ­
heerimis- ja puhastamismeetodid) peaksid olema kättesaadavad (vt 
punkti 1.7.2).  
1.5. KATSEMEETODI PÕHIMÕTE  
Käesolevas katses kirjeldatud meetod kasutab aeroobseid ja anae ­
roobseid põhjasetteid (vt 1. liidet), mis võimaldavad:  
i) katseaine transformatsioonikiiruse mõõtmist põhjasettes;  
ii) katseaine transformatsioonikiiruse mõõtmist settes;  
iii) katseaine ja/või transformatsioonisaaduste mineralisatsioonikii ­
ruse mõõtmist (kui kasutatakse  14 C-märgistusega katseainet);  
iv) transformatsioonisaaduste identifitseerimine ja kvantifitseerimine 
vee- ja settefaasides, sh ainetase (kui kasutatakse märgistatud katseainet);
 
v) katseaine ja selle transformatsioonisaaduste jaotamise mõõtmine 
kahe faasi vahel inkubatsiooni ajal pimedas (et vältida, näiteks, vetikavohangut) konstantsel temperatuuril. Poolestusajad, DT
 50 , 
DT 75 ja DT  90 väärtused määratakse, kui andmed seda lubavad, 
kuid neid ei tohiks ekstrapoleerida pikalt üle katseperioodi (vt 
punkti 1.2).  
Vähemalt kaks setet ja nendega seotud veed on nõutavad nii aeroob ­
seks kui anaeroobseks katseks (7). Siiski võib esineda olukordi, kui 
tuleks kasutada rohkem kui kahte põhjasetet, näiteks, kemikaalide 
puhul, mis võivad esineda magevees ja/või merekeskkonnas.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. KATSE KOHALDAMISALA  
Meetodit kohaldatakse kõikide keemiliste ainete suhtes (märgista ­
mata või märgistatud, mille kohta on olemas piisavalt täpne ja tundlik analüüsimeetod. See on kohaldatav kergelt lenduvate, mitte ­
lenduvate, veeslahustuvate või vees halvasti lahustuvate ühendite 
suhtes. Katset ei kohaldata kemikaalide suhtes, mis kergesti lenduvad pinnasest (nt fumigandid, orgaanilised lahustid) ja seega ei saa seda hoida vees ja/või settes käesolevates katsemeetodites.
 
Meetodit on kohaldatud nii palju, et uurida kemikaalide transformat ­
siooni magevees ja setetes, kuid põhimõtteliselt võib seda kohaldada 
ka suudmealas ja merekeskkonnas. See ei sobi voolava vee (nt jõed) 
või avamere tingimuste simuleerimiseks.  
1.7. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
1.7.1.  Saagis  
Vähemalt kahe vee- ja setteproovi ekstraheerimine ja analüüs kohe 
katseaine lisamise järel annab esimesi märke analüüsimeetodi korra ­
tavuse kohta ning katseaine manustamise ühtsuse kohta Saagised katse hilisematelt etappidelt on saadud vastavatelt ainetasemetelt 
(kui kasutatakse märgistatud materjali). Saagised peaksid jääma 
vahemikku 90–110 % märgistatud kemikaalide puhul (6) ja 70–110 % märgistamata kemikaalide puhul.
 
1.7.2.  Analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkus  
Analüüsimeetodi korratavust (v.a alguses tehtud ekstraheerimise 
tõhusus) katseaine ja transformatsiooni saaduste kvantifitseerimiseks saab kontrollida, korduvanalüüsides samast veest või settest tehtud ekstrakti, mida on inkubeeritud seni, kuni tekivad transformatsiooni ­
saadused.
 
Katseaine ja transformatsioonisaaduste puhul peaks analüüsimeetodi 
avastamislävi (LOD) olema vähemalt 0,01 mg · kg–  1 vee- või sette ­
proovina (katseainena) või 1 % kasutatud lähteannusest, olenevalt 
sellest, kumb on väiksem. Kvantifikatsioonilävi (LOQ) tuleks samuti määrata.
 
1.7.3.  Transformatsioonist saadud andmete täpsus  
Katseaine kontsentratsioonide regressioonanalüüs ajafunktsioonina 
annab vajalikku teavet transformatsioonikõvera täpsuse kohta ning võimaldab arvutada poolestusaegade usalduspiire (näilise esimese astme kineetika puhul) või DT
 50 väärtused ja vajaduse korral DT  75 
ja DT  90 väärtused.  
1.8. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.8.1.  Katsesüsteem ja -seadmed  
Katse tuleks teha klaasmahutites (nt pudelid, tsentrifuugiküvetid), 
välja arvatud juhul, kui esialgne teave (nt (n-oktanooli-vee jaotus ­
tegur, sorbtsiooniandmed jne) viitab sellele, et katseaine võib kinni ­
tuda klaasile, mistõttu võiks kaaluda alternatiivse materjali kasuta ­
mist (nt Teflon®). Kui on teada, et katseaine kinnitub klaasile, võib 
olla võimalik leevendada seda probleemi, kasutades ühte või mitut 
järgmistest meetoditest:  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— määrata klaasile kinnitunud katseaine ja transformatsioonisaa ­
duste mass;  
— pesta kõik klaasnõud lahustiga katse lõpus;  
— kasutada preparaate (vt ka punkti 1.9.2);  
— kasutada katseaine süsteemi lisamisel kaaslahusti suurenenud 
kogust; kui kasutatakse kaaslahustit, peaks see olema selline, mis ei solvolüüsi katseainet.
 
Tüüpilise katseseadme näited, s.t gaasimöödavoolu- ja biomeetersüs ­
teemid, on toodud vastavalt 2. ja 3. liites (14). Muid kasulikke 
inkubatsioonisüsteeme on kirjeldatud viites 15. Katseseadme ülese ­
hitus peaks olema selline, et see võimaldab õhu või lämmastiku vahetust ning lenduvate ainete püüdmist. Seadme mõõdud peaksid vastama katsetingimustele (vt 1.9.1). Ventilatsioon tagatakse kas 
kerge mullitamise või viies õhu või lämmastiku veepinnale. Viimasel 
juhul on soovitav segada vett kergelt ülevalpool, et hapnik või lämmastik vees paremini leviks. CO
 2 -vaba õhku ei tohiks kasutada, 
kuna see võib põhjustada vee pH taseme tõusu. Igal juhul sette 
häirimine on ebasoovitav ja seda peaks vältima niipalju kui võimalik. 
Kergelt lenduvaid aineid tuleks uurida biomeetersüsteemis, veepinda kergelt segades. Samuti võib kasutada suletud anumaid, milles on kas atmosfääriõhuga või lämmastikuga õhuruum, ja sisemisi pudeleid 
lenduvate ainete püüdmiseks (16). Õhuruumi gaasi regulaarne vahe ­
tumine on nõutav aeroobses katses, et kompenseerida hapniku tarbi ­
mist biomassi poolt.
 
Lenduvate transformatsioonisaaduste kogumiseks sobivad lõksud 
sisaldavad, kuid mitte ainult 1 mol · dm  –3 kaaliumhüdroksiidi või 
naatriumhüdroksiidi lahuseid süsinikdioksiidi puhul (  1 ) ja etüleenglü ­
kooli, etanoolamiini või 2 % parafiini ksüleenis orgaaniliste ühendite puhul. Anaeroobsetes tingimustes tekkinud lenduvad ained, näiteks 
metaan, saab koguda, näiteks, molekulaarsõelade abil. Sellised 
lenduvad ained saab põletada, näiteks, CO
 2 -ks, viies gaasi CuO-ga 
täidetud kvartstorusse temperatuuril 900  o C ja püüdes absorberis 
tekkinud CO  2 leelisesse (17).  
Nõutavad on katseainete ja transformatsioonisaaduste keemilise 
analüüsi laboriseadmed (nt gaasvedelikkromatograafia (GLC), kõrge ­
fektiivne vedelikkromatograafia (HPLC), planaarkromatograafia (TLC), mass-spektroskoopia (MS), gaaskromatograaifa – mass-spek ­
troskoopia (GS-MS), vedelikkromatograafia – mass-spektromeetria 
(LC-MS), tuumamagnetresonants (NMR) jne), sh vajaduse korral 
radiomärgistatud või märgistamata kemikaalide avastamissüsteemid. Kui kasutatakse radiomärgistatud materjali, soovitatakse samuti vede ­
likstsintsillatsioonloendurit ja oksüdeerijat põletamiseks (setteproo ­
vide põletamiseks enne radioaktiivsuse analüüsi).
 
Muud standardlaboriseadmed füüsikalis-keemiliste ja bioloogiliste 
määramiste joaks (vt tabelit 1 punktis 1.8.2.2), klaasnõud, kemikaalid ja reaktiivid on nõutavad vastavalt vajadusele.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Kuna nimetatud leeliselised absorbtsioonilahused absorbeerivad ka õhutamisel süsinik ­
dioksiidi ning aeroobsetes katsetes hingamisel tekkinud süsinikdioksiidi, tuleb neid regu ­
laarselt vahetada, et vältida nende küllastumist ja seega nende absorbtsioonivõime hävi ­
mist.
 1.8.2.  Põhjasetete valik ja arv  
Proovivõtukohad tuleks valida vastavalt katse eesmärgile igas nime ­
tatud olukorras. Proovivõtukohtade valikul tuleks kaaluda valgla ja vee ülesvoolu võimalikke põllumajanduslikke, tööstuslikke või kodu ­
majapidamise sisendeid. Setteid ei tohiks kasutada, kui need on 
saastatud katseainega või selle struktuurse analoogiga viimase 4 aasta jooksul.
 
1.8.2.1.  Sette valik  
Tavaliselt kasutatakse aeroobsetes katsetes kahte setet (7). Need kaks 
setet peaksid erinema orgaanilise süsiniku sisalduse ja tekstuuri 
poolest. Ühel settel on kõrge orgaanilise süsiniku sisaldus (2,5–7,5 %) ja peen tekstuur, teisel on madal orgaanilise aine sisaldus (0,5–2,5 %) ja jäme tekstuur. Orgaanilise süsiniku sisaldused 
peaksid tavaliselt erinema vähemalt 2 %. „Peen tekstuur” tähendab 
määratluse järgi > 50 % [savi + aleuriidi] (
 1 ) sisaldust ja „jäme 
tekstuur” < 50 % [savi + aleuriidi] sisaldust. Kahe sette [savi + aleuriidi] sisaldus peaks tavaliselt erinema vähemalt 20 %. 
Juhul, kui kemikaal võib samuti jõuda merevette, peaks vähemalt üks 
põhjasete olema pärit merest.
 
Rangelt anaeroobses katses tuleks valida prooviks kaks setet (sh 
nendega seotud vesi) pinnaveemassist anaeroobselt alalt (7). Sette- 
ja veefaase tuleks käsitleda ja transportida ettevaatlikult hapnikuta 
tingimustes.  
Muud parameetrid võivad olla tähtsad setete valikul ja neid tuleks 
arvesse võtta iga üksikjuhtumi puhul eraldi. Näiteks, setete pH- 
vahemik on tähtis selliste kemikaalide uurimisel, mille transformat ­
sioon ja/või sorbtsioon sõltub pH-st. Sorbtsiooni pH-sõltuvust saab peegeldada katseaine pK
 a väärtuses.  
1.8.2.2.  Põhjasette proovide kirjeldamine  
Nii vee kui sette puhul peamised parameetrid, mida tuleb mõõta ja 
millest tuleb teatada (viidates katsemeetodile), ning katseetapp, 
milles need parameetrid määratakse, on esitatud kokkuvõtlikult siin toodud tabelis. Nende parameetrite määramismeetodid on toodud viidetes (18, 19, 20, 21).
 
Lisaks sellele võib osutuda vajalikuks mõõta ja teatada ka muudest 
parameetritest iga juhtumi puhul eraldi (nt magevee puhul: osakesed, aluselisus, kõvadus, elektrijuhtivus, NO
 3 /PO  4 (suhe ja üksikud väär ­
tused); setete puhul: katioonvahetusvõime, veemahutavus, karbonaat, 
kogulämmastik ja -fosfor, ning merede puhul: soolsus). Setete või vee analüüs nitraadi, sulfaadi, biokättesaadava raua ja muude võima ­
like elektronaktseptorite kohta võib olla kasulik redokstingimuste 
hindamisel, eriti seoses anaeroobse transformatsiooniga.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) [Savi + aleuriit] on sette mineraalfraktsioon, mille osakeste suurus on < 50 μm.
 Vee-setteproovide iseloomustamiseks kasutatavate parameetrite mõõtmine (7, 22, 23)  
Parameeter Katseprotseduuri etapp 
väliproovide 
võtmine järelkäsitle ­
mine kohanemise 
algus katse algus katse käigus katse lõpp  
Vesi 
Päritolu/allikas X Temperatuur (
 o C) X 
pH X X X X X 
Kogu orgaaniline süsinik X X X 
O 2 kontsentratsioon (*) X X X X X 
Redokspotentsiaal (*) X X X X  
Setted  
Päritolu/allikas X Kihi sügavus X pH X X X X X Osakeste jaotus X Kogu orgaaniline siisinik X X X X Mikroobi biomass (*) X X X Redokspotentsiaal (**) Vaatlused 
(värv/ 
lõhn) X X X X
 
(*) Aeroobsetes uuringutes mikroobide hingamiskiiruse meetod (26), suitsutusmeetod (27) või bakterite arvu määramine 
(nt bakterid, kiirikbakterid, seened ja kolooniate koguarv), anaeroobsetes uuringutes metanogeneesi kiirus. 
(**) Viimased uurimustulemused on näidanud, et vee hapniku kontsentratsioonide ja redokspotentsiaalide mõõtmistel ei 
ole mehhanistlikku ega ennustatavat väärtust, kui käsitletakse mikroobipopulatsioonide kasvu ja arengut pinnavetes 
(24, 25). Biokeemilise hapnikutarbe (BOD – määramine väliproovide võtmisel, katse alguses või lõpus) ja mikro/ makrotoitainete Ca, Mg ja Mn kontsentratsioonide määramine (katse alguses ja lõpus) vees ning kogulämmastiku ja 
kogukaaliumi mõõtmine setetes (väliproovide võtmise ajal ja katse lõpus) sobivad paremini aeroobse biotransformat ­
siooni kiiruste ja teede tõlgendamiseks ja hindamiseks.
 
1.8.3.  Kogumine, käsitlemine ja säilitamine  
1.8.3.1.  Kogumine  
ISO põhjasetteproovide võtmist käsitleva juhendi (8) eelnõud tuleks 
kasutada setteproovide võtmisel. Setteproovid tuleks võtta sette 
5–10 cm ülemisest kihist. Settega seotud vesi tuleks koguda samast kohast ja samal ajal kui sete. Anaeroobse katse puhul tuleks sette- ja sellega seotud vee proove võtta ja transportida hapnikuta (28) (vt 
punkti 1.8.2.1). Mõningaid proovivõtuseadmeid on kirjeldatud kirja ­
nduses (8, 23).
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2.  Käsitlemine  
Sete eraldatakse veest filtreerimise teel ja sete märgsõelutakse läbi 
2 mm sõelaava, kasutades liigsed proovivõtukohast võetud vett, mis seejärel visatakse minema. Seejärel segatakse soovitud suhtes (vt 
punkti 1.9.1) sette ja vee teadaolevad kogused inkubatsioonikolbides 
ja valmistataks ette kohanemiseks (vt punkti 1.8.4). Anaeroobse katse puhul tuleb sooritada kõik käsitlemisetapid hapniku puudu ­
misel (29, 30, 31, 32, 33).
 
1.8.3.3.  Säilitamine  
Värskelt võetud sette- ja veeproovide kasutamist soovitatakse väga, 
kuid kuna säilitamine on vajalik, tuleks sete ja vesi sõeluda selliselt, nagu on kirjeldatud eespool, ja säilitada koos, veega küllastatult 
(6–10 cm veekiht), pimedas, temperatuuril 4 ± 2
 o C (  1 ) maksimaal ­
selt 4 nädalat (7, 8, 23). Aeroobsetes katsetes kasutatud proovid tuleks säilitada vaba õhu juurdepääsuga (nt avatud mahutites), samas anaeroobsete katsete proovid tuleks säilitada ilma hapnikuta. 
Transportimisel ja säilitamisel ei tohi sette- või veeproove külmutada 
või setteproove kuivatada.
 
1.8.4.  Sette-/veeproovide katseks ettevalmistamine  
Kohanemisperiood peaks aset leidma enne katseaine lisamist, 
asetades iga sette-/veeproovi inkubatsiooninõusse, mida kasutatakse 
põhikatses, ja kohanemine toimub täpselt samades tingimustes nagu katseinkubatsioon (vt punkti 1.9.1). Kohanemisperiood on aeg, mis kulub süsteemi mõistliku stabiilsuse saavutamiseks, mida peegel ­
davad pH, hapniku kontsentratsioon vees, sette- ja veeproovi redoks ­
potentsiaal ning faaside makroskoopiline eraldamine. Kohanemispe ­
riood peaks tavaliselt kestma üks kuni kaks nädalat ja ei tohiks ületada nelja nädalat. Nimetatud perioodil tehtud määramiste tule ­
mused tuleks teha teatavaks.
 
1.9. KATSE KÄIK  
1.9.1.  Katsetingimused  
Katse tehakse inkubatsiooniseadmes (vt punkti 1.8.1), milles vee ja 
sette mahusuhe on 3:1 ja 4:1 ning settekiht on 2,5 cm (± 0,5 cm) (  1 ). 
Vähemalt 50 g setet (kuivmass) inkubatsioonianuma kohta on soovitav.
 
Katse tuleks sooritada pimedas konstantsel temperatuuril vahemikus 
10–30  o C. Temperatuur (20 ± 2)  o C on sobiv. Vajaduse korral võib 
kasutada täiendavaid madalamaid temperatuure (nt 10  o C) iga 
juhtumi puhul eraldi, sõltuvalt katse kohta nõutavast teabest. Inku ­
batsioonitemperatuuri tuleks jälgida ja sellest teatada.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Viimased uuringud on näidanud, et säilitamine temperatuuril 4  o C võib põhjustada sette 
orgaanilise süsiniku sisalduse vähenemist, mille võimalikuks tulemuseks on mikroobide 
tegevuse vähenemine (34).
 1.9.2.  Katseaine töötlemine ja lisamine  
Kasutatakse kemikaali ühte katsekontsentratsiooni (  1 ). Põllukultuu ­
ride kemikaalide puhul, mida lisatakse otse veemassi, tuleks tõlgen ­
dada suurima annusena märgistusel suurimat lisamiskiirust, mis on 
arvutatud katseanuma vee pindala põhjal. Kõikidel muudel juhtudel 
peaks kasutatav kontsentratsioon põhinema keskkonnaemissioonidest tehtud ennustuste põhjal. Tuleks püüda tagada seda, et katseainet lisatakse piisavas kontsentratsioonis selleks, et iseloomustada trans ­
formatsiooniteed ning transformatsioonisaaduste teke ja vähenemist. 
Võib osutuda vajalikuks lisada suuremaid annuseid (nt 10kordsed) olukordades, kus katseaine kontsentratsioonid on lähedal avastamis ­
piiridele katse alguses ja/või kui peamisi transformatsioonisaaduseid 
ei suudeta kohe avastada, kuna nende kontsentratsioon on 10 % katseaine annusemäärast. Kui kasutatakse suuremaid kontsentrat ­
sioone, ei tohiks neil olla olulist negatiivset mõju vee-settesüsteemi 
mikroobide tegevusele. Katseaine konstantse kontsentratsiooni saa ­
miseks erinevate mõõtmetega anumates võib pidada vajalikuks lisa ­
tava aine koguse kohandamist, mis põhineb veesamba sügavusel anumas seoses vee sügavusega uuritavas keskkonnas (mis eeldata ­
vasti on 100 cm, kuid võib kasutada ka muid sügavusi). Vt 4. lisa 
näidisarvutamise kohta.
 
Ideaaljuhul tuleks lisada katseainet vesilahusena katsesüsteemi 
veefaasi. Kui see on vältimatu, on lubatud kasutada veega segune ­
vate lahustite (nt atsetoon, etanool) väikeseid koguseid katseaine 
lisamiseks ja jaotamiseks, kuid see ei tohiks ületada 1 % v/v ja sellel 
ei tohiks olla kahjulikke mõjusid katsesüsteemi mikroobide tegevu ­
sele. Katseaine vesilahus tuleks teha hoolikalt – täieliku homogeen ­
suse tagamiseks võib vaja minna generaatorkolonne ja eelsegamist. 
Katsesüsteemi vesilahuse lisamise järel on soovitav veefaasi õrnalt 
segada, häirides setet nii vähe kui võimalik.  
Preparaatide kasutamist tavaliselt ei soovitata, kuna preparaatide 
koostisosad võivad mõjutada katseaine ja/või transformatsioonisaa ­
duste jaotumist vee- ja settefaaside vahel. Nt nõrgalt veeslahustuva 
katseaine puhul võib siiski kasutada preparaati sobiva alternatiivina.  
Inkubatsioonianumate arv sõltub proovivõtukordade arvust (vt punkti 
1.9.3). Katsesüsteeme peaks olema piisavalt, et igal proovivõtukorral 
võib kasutada kahte süsteemi. Kui iga põhjasettesüsteemi kohta 
tehakse kontrollproovid, ei tohiks neid töödelda katseainega. Kont ­
rollproove saab kasutada sette mikroobi biomassi ning vee- ja sette ­
proovide orgaanilise süsiniku koguarvu määramiseks katse lõpus. 
Kahte kontrollproovi (s.t üks kontrollproov iga põhjasette kohta) 
saab kasutada nõutud parameetrite jälgimiseks settes ja vees kohane ­
mise ajal (vt tabelit punktis 1.8.2.2). Tuleks teha kaks täiendavat kontrollproovi juhul, kui katseainet lisatakse lahusti abil, et mõõta 
kahjulikke mõjusid katsesüsteemi mikroobide tegevusele.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Katse tegemine teise kontsentratsiooniga võib olla kasulik kemikaalide puhul, mis 
jõuavad pinnavette erinevaid teid pidi oluliselt erinevate kontsentratsioonide tõttu, kuni 
saab analüüsida väiksemat kontsentratsiooni piisavalt täpselt.
 1.9.3.  Katse kestus ja proovide võtmine  
Katse ei tohiks tavaliselt kesta kauem kui 100 päeva (6) ning peaks 
jätkuma seni, kuni lagunemise ja vee/sette jaotamise kohta esitatakse selgitus või kui 90 % katseainest on hävinud transformatsiooni ja/või 
lendumise tõttu. Proovivõtukordade arv peaks olema vähemalt kuus 
(sealhulgas proovivõtu 0 kord), ja enne katset võib kasutada valiku ­
list eelkatset (vt punkti 1.9.4), mille käigus määratakse asjaomased proovivõturežiimid ja katse kestus, välja arvatud juhul, kui katseaine 
kohta on olemas piisavalt andmeid eelnevatest uuringutest. Hüdro ­
foobsete katseainete puhul võib vaja minna täiendavaid proovivõtu ­
hetki katse algperioodil, et määrata vee- ja settefaaside jaotamise 
kiirus.
 
Asjaomastel proovivõtuaegadel eemaldatakse analüüsis kõik inkubat ­
sioonianumad (paralleelproovides). Setet ja selle peal olevat vett 
analüüsitakse eraldi (  1 ). Pinnavesi tuleks hoolikalt eemaldada setet 
minimaalselt häirides. Katseaine ja transformatsioonisaaduste ekstra ­
heerimine ja karakteriseerimine peaksid järgima asjaomaseid analüü ­
tilisi protseduure. Tuleks hoolikalt eemaldada aine, mis võib olla 
adsorbeerunud inkubatsioonianumasse või lenduvate ainete püüdmis ­
torusse.  
1.9.4.  Valikulised eelkatsed  
Kui proovivõtu kestust ja režiimi ei saa hinnata muude, katseainet 
käsitlevate asjaomaste uuringute põhjal, võib pidada vajalikuks teha 
valikuline eelkatse, mis tuleks sooritada, kasutades samu katsetingi ­
musi, mis on välja pakutud lõppuuringuks. Asjaomased katsetingi ­
muste ja eelkatse tulemuste kohta, kui see on sooritatud) tuleks 
esitada lühiprotokoll.  
1.9.5.  Mõõtmised ja analüüs  
Katseaine a transformatsioonisaaduste kontsentratsiooni igal proovi ­
võtu korral vees ja settes tuleks mõõta ja neist teatada (lisatud kont ­
sentratsiooni ja protsendimäärana). Üldiselt tuleks identifitseerida 
transformatsoonisaadused, mis on avastatud ≥ 10 %na radioaktiivsest 
ainest vee-sette koguproovis igal proovivõtuajal, kui seda ei ole mõistlikult teisiti põhjendatud. Transformatsioonisaaduseid, mille 
kontsentratsioonid katse käigus pidevalt kasvavad, tuleks samuti 
identifitseerimisel arvesse võtta, isegi siis, kui nende kontsentrat ­
sioonid ei ületa eespool toodud piirnorme, kuna see võib viidata aine püsivusele. Viimast tuleks arvesse võtta iga juhtumi puhul 
eraldi, tuues põhjendused protokollis.
 
Gaaside/lenduvate ainete püüdmissüsteemide (CO  2 ja muud, s.t. 
lenduvad orgaanilised ühendid) tulemustest tuleks teatada igal proo ­
vivõtuajal. Tuleks teatada ka mineralisatsioonikiirus. Ekstraheerimata (seotud) jääkidest settes tuleks teatada igal proovivõtuhetkel.
 ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) Kui võib toimuda kiire anaeroobsete transformatsioonisaaduste reoksüdeerumine, tuleks 
säilitada anaeroobsed tingimused proovivõtu ja analüüsimise ajal.
 2. TULEMUSED  
2.1. TULEMUSTE TÖÖTLEMINE  
Lisatud radioaktiivse aine kogu ainetase või saagis (vt punkti 1.7.1) 
arvutatakse igal proovivõtukorral. Tulemustest tuleks teada anda 
lisatud radioaktiivse aine protsendimäärana. Radioaktiivse aine jaota ­
misest vee ja sette vahel tuleks teatada kontsentratsioonide ja prot ­
sendimääradena igal proovivõtukorral.  
Katseaine poolestusaeg, DT  50 ja vajaduse korral DT  75 ja DT  90 tuleks 
arvutada koos usalduspiiridega (vt punkti 1.7.3). Teavet katseaine 
hävimiskiiruse kohta vees ja settes võib saada sobivate hindamisprot ­
seduuride abil. Nende hulka kuuluvad näiline esimese astme kinee ­
tika, graafilisi või numbrilisi lahendeid kasutavad empiirilised kõvera 
moodustamise tehnika ning keerukamad hindamised, näiteks ühe või mitme lahtriga näidised. Täiendavaid üksikasju võib leida asja ­
omasest avaldatud kirjandusest (35, 36, 37).
 
Kõikidel lähenemistel on oma tugevad ja nõrgad küljed ning need 
erinevad märkimisväärselt oma keerukuse poolest. Esimese astme kineetika võib lagundamis- ja jaotamisprotsesse liiga lihtsustada, kuid võimaluse korral lisab suuruse (kiirusekonstant või pooles ­
tusaeg), mis on hõlpsasti mõistetav ja mis on väärtuslik simulatsioo ­
nimudelite koostamisel ja prognoositavate arvutuskontsentratsioonide arvutamisel. Empiiriliste lähenemiste või lineaarsete transformatsioo ­
nide käigus võidakse saada andmete jaoks paremini sobivaid kõve ­
raid ja seetõttu hinnata paremini poolestusaegasid, DT
 50 ja vajaduse 
korral DT  75 ja DT  90 väärtusi. Tuletatud konstantide kasutamine on 
siiski piiratud. Lahternäidiste abil võib luua riski hindamise jaoks kasulikke, väärtuslikke konstante, mis kirjeldavad lagunemiskiirust 
erinevates sektorites ja kemikaali jaotust. Neid tuleks samuti kasu ­
tada kiiruskonstantide hindamiseks peamiste transformatsioonisaa ­
duse tekkel ja lagunemisel. Kõikidel juhtudel tuleb valitud meetodit põhjendada ja eksperimenteerija peaks graafiliselt ja/või statistiliselt 
esitama sobivuse headuse.
 
3. PROTOKOLL  
3.1. KATSEPROTOKOLL  
Protokoll peab sisaldama järgmist teavet.  
Katseaine:  
— üldnimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuuri ­
valem (tuues ära märgi/märkide asukoha, kui kasutatakse 
radiomärgistatud ainet) ja asjaomased füüsikalis-keemilised omadused;
 
— katseaine puhtus (lisandid);  
— märgistatud kemikaali radiokeemiline puhtus ja molaarne 
aktiivsus (vajaduse korral).  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Võrdlusained:  
— selliste võrdlusainete keemiline nimetus ja struktuur, mida 
kasutatakse transformatsioonisaaduste kirjeldamiseks ja/või 
identifitseerimiseks.  
Uuritavad setted ja veed:  
— põhjasettest proovide võtmise koha (kohtade) asukoht ja 
kirjeldus, sh võimaluse korral saastumise ajalugu;  
— kogu teave vee-settesüsteemide kogumise, säilitamise (kui 
säilitatakse) ja kohanemise kohta;  
— vee-setteproovide tunnused, mis on loetletud punkti 1.8.2.2 
tabelis.  
Katsetingimused:  
— kasutatud katsesüsteem (nt möödavool, biomeeter, õhutamis ­
viis, segamismeetod, veemaht, settemass, nii vee- kui ka settekihi paksus, katseanumate mõõdud jne);
 
— katseaine lisamine katsesüsteemi: kasutatud katsekontsentrat ­
sioon, paralleelproovide ja kontrollproovide arv, katseaine 
lisamisviis (nt lahusti abil, kui seda kasutatakse) jne;  
— inkubatsioonitemperatuur;  
— proovivõtuajad;  
— ekstraheerimismeetodid ja -tõhusused ning analüüsimeetodid 
ja avastamispiirid;  
— transformatsioonisaaduste kirjeldamise/identifitseerimise 
meetodid;  
— kõrvalekalded katseprotokollist või katsetingimustest katse 
käigus.  
Tulemused:  
— representatiivsete analüüside töötlemata andmed (kõik töötle ­
mata andmed tuleb säilitada labori arhiivis);  
— kasutatud analüüsimeetodite korratavus ja tundlikkus;  
— saagisemäärad (valiidse katse protsendimäärad on toodud 
punktis 1.7.1);  
— tulemused tabeli kujul, väljendatuna katseaine ja vajaduse 
korral transformatsioonisaaduste ning ekstraheerimata radio ­
aktiivsete ainete protsendimäärana lähteannusest ja vajaduse korral mg · kg–
 1 vees, settes ja kogu süsteemis (vaid protsen ­
dina);  
— ainetase uuringute kestel ja lõpus;  
— vee- ja settefraktsioonides ning kogu süsteemis toimunud 
transformatsiooni (sh mineralisatsiooni) graafiline esitamine;  
— mineralisatsioonikiirused;  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— katseaine ja vajaduse korral peamiste transformatsioonisaa ­
duste poolestusaeg, DT  50 ja vajaduse korral DT  75 ja DT  90 
väärtused, kaasa arvatud usalduspiirid vees, settes ja kogu 
süsteemis;  
— hinnang katseaine ja vajaduse korral peamiste transformat ­
sioonisaaduste transformatsioonikineetika kohta;  
— vajaduse korral eeldatavad transformatsiooniteed;  
— tulemuste arutelu.  
4. VIITED  
1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
 
2) Commission for registration of pesticides: Application for regis ­
tration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The 
Netherlands.
 
3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guide ­
line for the conduct of biodegradability tests on pesticides in 
natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United- Kingdom.
 
4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada, pp. 35–3 7.
 
5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anae ­
robic aquatic metabolism.  
6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.  
7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 
8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments.  
9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080.  
10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
14) Scholz, K, Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149–158.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
15) Guth, JA. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
 
16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocula ­
tion and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631–637.
 
17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, 661–667.  
18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and 
Wastewater (17  th edition). American Public Health Association, 
American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
 
20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measu ­
rements. Anal. Chemistry 44, 1038–1039.  
22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests', 3-4 July 1991.
 
23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, 
P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.EA.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of 
environmental factors at field sites. Water Research 31, 
2858–2868.  
25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.EA.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329–338.  
26) Anderson, T.H., Domsch, KH. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197–203.
 
27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13–21.  
29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850–857.
 
30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U, 
Steber,]., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527–1550.
 
31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499–1509.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
32) Nuck, BA. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing 
the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597–3603.
 
33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemi ­
cals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 
712-C-98-090.  
34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961–968.
 
35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187–203.
 
36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47–60.  
37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and 
Diseases, pp. 1349–1354.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
1. liide  
JUHEND AEROOBSETE JA ANAEROOBSETE KATSESÜSTEEMIDE 
KOHTA  
Aeroobne katsesüsteem  
Käesolevas meetodis kirjeldatud aeroobne katsesüsteem sisaldab aeroobset 
veekihti (tüüpilised hapniku kontsentratsioonid on vahemikus 7–10 mg · l- 1 ) ja 
settekihti, mis on aeroobne pinnal ja anaeroobne pinna all (tüüpilised keskmised redokspotentsiaalid (E
 h ) sette anaeroobsel alal on vahemikus – 80 kuni – 
190 mV). Igas inkubatsiooniüksuses viiakse niisutatud õhk veepinnale piisava 
hapniku säilitamiseks õhuruumis.  
Anaeroobne katsesüsteem  
Anaeroobse katsesüsteemi puhul on katseprotseduur oma olemuselt samasugune 
kui aeroobses süsteemis, erandiks on see, et igas inkubatsiooniüksuses viiakse 
niisutatud lämmastik veepinnale lämmastiku õhuruumi säilitamiseks. Setet ja vett 
käsitletakse anaeroobsena, kui redokspotentsiaal (E  h ) on madalam kui – 100 mV.  
Anaeroobses katses sisaldab mineralisatsiooni hindamine tekkinud süsinikdiok ­
siidi ja metaani mõõtmisi.  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
2. liide  
GAASI MÖÖDAVOOLUSEADME NÄIDIS
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
3. liide  
BIOMEETRI NÄIDIS
  ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
4. Liide  
NÄIDISARVUTUS KATSEAINE ANNUSTAMISE KOHTA 
KATSEANUMATESSE  
Silindri siseläbimõõt: = 8 cm 
Veesamba sügavus, v.a sete: = 12 cm Pindala: 3,142 × 4
 2 = 50,3 cm  2 
Annusmäär: 500 g katseainet ha kohta vastab 5 
μg/cm  2 
Kokku μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Kohandada kogust seoses 100 cm sügavusega: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Veesamba maht: 50,3 × 12 = 603 ml 
Kontsentratsioon vees: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml või 50 μg/l ▼B 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AEROOBNE MINERALISEERUMINE PINNAVEES – 
BIOLAGUNEMISE MUDELKATSE  
1. METOODIKA  
Käesolev metoodika on samaväärne standardiga OECD TG 309 
(2004) (1).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesoleva katse eesmärk on mõõta uuritava aine biolagunemise 
sõltuvust ajast aeroobses looduslikus vees madalatel kontsentratsioo ­
nidel ja väljendada mõõtmistulemused kineetiliste seoste vormis. Kõnesolev mudelkatse on laboratoorne loksutatavas kolvis läbiviidav 
portskatse, millega saab määrata orgaanilise aine aeroobse biolagu ­
nemise kiiruse loodusliku pinnavee (mage-, riim- või merevee) proo ­
vides. Metoodika põhineb standardil ISO/DIS 14592–1 (2), kuid sisaldab ka metoodikate C.23 ja C.24 elemente (3, 4). Uuritava 
mikrokosmi seisundi halvenemise vältimiseks võib pika katseaja 
korral asendada portsrežiimi poolpideva režiimiga, kuid see ei ole kohustuslik. Mudelkatse peamine eesmärk on määrata uuritava aine mineraliseerumine pinnavees ja esitada selle alusel lagunemise kinee ­
tika. Katse teine (mittekohustuslik) eesmärk võib olla teabe saamine 
esmase lagunemise ja oluliste muundumissaaduste kohta. Muundu ­
missaaduste kindlakstegemine ja võimaluse korral nende sisalduse määramine on eriti oluline väga aeglaselt mineraliseeruvate ainete 
puhul (ained, mille
 14 C-märgisega jäägi üldine poolestusaeg on üle 
60 ööpäeva). Oluliste muundumissaaduste kindlakstegemiseks ja mõõtmiseks tuleb analüüsimeetodite piiratud võimaluste tõttu kasu ­
tada tavaliselt kõrgemaid uuritava aine kontsentratsioone (> 100 
μg/l).
 
Kõnesoleva katse puhul tähendab madal kontsentratsioon uuritava 
aine sisaldust (1–100 μg/l), mis on nii madal, et katses saadud biola ­
gunemise kineetika võiks kajastada eeldatavat kineetikat keskkonnas. Looduslikus katsevees leiduvate biolagundatavate süsiniksubstraatide üldmassiga võrreldes on madala kontsentratsiooniga uuritav aine 
sekundaarne substraat. Sellest järeldub, et biolagunemise kineetika 
on eeldatavalt esimest järku („ilma kasvuta kineetika”) ja uuritav aine laguneb „kometabolismi” teel. Esimest järku kineetika tähendab, et lagunemise kiirus (mg/l/ööpäev) on aja jooksul väheneva subs ­
traadi kontsentratsiooniga võrdeline. Tõelise esimest järku kineetika 
puhul on konkreetse aine lagunemise kiiruskonstant k sõltumatu ajast ja kontsentratsioonist. See tähendab, et k ei muutu märkimisväärselt katse jooksul ja on samasugune ka kõrgematel kontsentratsioonidel 
läbiviidud eri katsete puhul. Definitsiooni järgi on lagunemise kiirus ­
konstant k võrdne kontsentratsiooni suhtelise muutusega ajaühiku kohta: k = (1/C) · (dC/dt). Kuigi ettenähtud tingimustes on eeldatav kineetika tavaliselt esimest järku, võib esineda teatavaid olukordi, 
kus andmeid kirjeldab paremini muud tüüpi kineetika. Kõrvalekalle 
esimest järku kineetikast võib ilmneda näiteks siis, kui biomuundu ­
mist ei limiteeri bioloogilise reaktsiooni kiirus, vaid mingi massi ­
ülekande nähtus, nagu difusiooni kiirus. Siiski võib katseandmeid 
peaaegu alati kirjeldada pseudo-esimest järku kineetika abil, kui 
eeldada, et kiiruskonstant sõltub kontsentratsioonist.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Katseplaani koostamise ja tulemuste tõlgendamise hõlbustamiseks 
peavad enne katset olemas olema (nt standardsetest sõelkatsetest 
saadud) andmed uuritava aine biolagundatavuse kohta kõrgematel kontsentratsioonidel, abiootilise lagundatavuse, muundumissaaduste ja oluliste füüsikalis-keemiliste omaduste kohta. Täieliku biolagun ­
datavuse määramiseks kasutatakse
 14 C-märgisega uuritavat ainet ja 
määratakse  14 C jaotumine faaside vahel katse lõpus. Märgiseta uuri ­
tava aine puhul saab täielikku biolagundatavust määrata ainult kõrgete kontsentratsioonide kasutamisel ja tingimusel, et kõik 
olulised muundumissaadused on teada.
 
1.2. MÕISTED  
Esmane biolagunemine  on keemilise aine struktuuri muutumine 
(muundumine) mikroorganismide toimel, mille tulemusel aine kaotab 
oma keemilise identiteedi.  
Funktsionaalne biolagunemine  on keemilise aine struktuuri muutu ­
mine (muundumine) mikroorganismide toimel, mille tulemusena aine 
kaotab teatava omaduse.  
Täielik aeroobne biolagunemine  on hapniku juuresolekul mikroor ­
ganismide abil toimuv keemilise aine lagunemine (mineraliseeru ­
mine) süsinikdioksiidiks, veeks ja muude aines esinevate elementide anorgaanilisteks sooladeks ning uute mikrobioloogilise sünteesi 
produktide ja biomassi teke.
 
Mineraliseerumine  on keemilise aine või orgaanilise materjali lagu ­
nemine süsinikdioksiidiks, veeks ja muude aines esinevate elemen ­
tide anorgaanilisteks sooladeks mikroorganismide toimel.  
Ootefaas  on aeg katse algusest kuni hetkeni, millal lagundava 
toimega mikroorganismid on kohanenud ja keemilise aine või orgaa ­
nilise materjali biolagunemine on jõudnud avastatava tasemeni (10 protsendini maksimaalsest teoreetilisest lagunemisest või vähem, 
olenevalt mõõtemeetodi täpsusest).
 
Maksimaalne biolagunemise tase  on keemilise aine või orgaanilise 
materjali katses registreeritud biolagunemise määr protsentides, 
millest edasi biolagunemine katses enam ei lähe.  
Primaarne substraat  on looduslike süsiniku- ja energiaallikate 
kogum, mis tagab mikroorganismide biomassi kasvu ja elutegevuse.  
Sekundaarne substraat  on nii madala kontsentratsiooniga substraa ­
dikomponent, et selle lagundamisest saavad asjaomased mikroorga ­
nismid üksnes tähtsusetu koguse süsinikku ja energiat, võrreldes süsiniku- ja energiakogusega, mille nad saavad substraadi peamiste komponentide (primaarsete substraatide) lagundamisest.
 
Lagunemise kiiruskonstant  on esimest või pseudo-esimest järku 
kiiruskonstant k (ööpäev  –1 ), mis näitab lagunemise kiirust. Ports ­
katses määratakse k pärast ootefaasi saadud lagunemiskõvera 
esimese osa alusel.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Poolestusaeg t  1/2 (ööpäev)  on mõiste, mida kasutatakse esimest 
järku reaktsiooni kiiruse iseloomustamiseks. See on aeg, mille 
jooksul aine kontsentratsioon väheneb kaks korda. Poolestusaeg ja lagunemise kiiruskonstant on seotud valemiga t
 1/2 = ln2/k.  
Poollagunemisaeg, DT  50 (ööpäev)  on mõiste, mida kasutatakse 
biolagunemiskatse tulemuse väljendamiseks. See on 50-protsendili ­
seks biolagunemiseks vajalik aeg (koos ootefaasiga).  
Avastamislävi ja mõõtmislävi . Avastamislävi on aine kontsentrat ­
sioon, millest madalamal väärtusel ei saa aine identsust tõendavat 
signaali eristada analüüsi artefaktidest. Mõõtmislävi on aine kontsen ­
tratsioon, millest madalamal väärtusel ei saa kontsentratsiooni määrata nõutava täpsusega.
 
Lahustunud orgaaniline süsinik  on veeproovis leiduva orgaanilise 
süsiniku osa, mida ei saa eemaldada teatava faaside eraldamisviisi abil, näiteks tsentrifuugimisega 40 000 ms
 –2 juures 15 minuti jooksul või 
filtrimisega läbi membraani, mille poori läbimõõt on 0,2–0,45 μm. 
Orgaanilise  14 C üldaktiivsus  on orgaanilise süsinikuga seotud  14 C 
üldaktiivsus.  
Lahustunud orgaanilise  14 C aktiivsus  on lahustunud orgaanilise 
süsinikuga seotud  14 C üldaktiivsus.  
Tahkete osakestega seotud orgaanilise  14 C aktiivsus  on tahkete 
osakestega seotud orgaanilise  14 C üldaktiivsus.  
1.3. KATSE RAKENDATAVUS  
Kõnesolev mudelkatse on rakendatav lendumatu või vähelenduva 
orgaanilise aine madalate kontsentratsioonide puhul. Atmosfääriõhule 
avatud kolvi (nt puuvillvatikorgiga kolvi) puhul võib praktiliselt 
lendumatuks pidada ainet, mille Henry konstant on väiksem kui umbes 1 Pa·m
 3 /mol (umbes 10  –5 atm·m  3 /mol). Kui kasutatakse 
suletud kolbi vaba ruumiga ülaosas, on võimalik uurida ka vähele ­
nduvaid aineid (Henry konstant < 100 Pa·m  3 /mol või < 10  –3 
atm·m  3 /mol), ilma et süsteemist läheks ainet kaduma. Kui CO  2 
eemaldamisel ei kasutata vajalikke ettevaatusabinõusid, võib  14 C- 
märgisega ainet siiski kaotsi minna. Sel juhul võib olla vaja püüda 
CO 2 leelist sisaldavasse siseabsorberisse või kasutada välist CO  2 
absorberit (otsene  14 CO 2 määramine, vt 3. liide). Biolagunemise 
kineetika määramiseks peab uuritava aine kontsentratsioon olema madalam selle aine lahustuvusest vees. Tuleb siiski märkida, et kirja ­
nduses esitatud vesilahustuvus võib olla oluliselt suurem uuritava 
aine lahustuvusest looduslikus vees. Väga halvasti lahustuva uuritava aine puhul võib lahustuvuse määramiseks kasutada sama vett, mida kasutatakse katses, kuid see ei ole kohustuslik.
 
Käesolevat metoodikat võib kasutada biolagunemise modelleerimi ­
seks suuremaid osakesi mittesisaldavas pinnavees („pelaagiline 
katse”) või häguses pinnavees, mis võib esineda vee ja sette piir ­
pinna läheduses (hõljumikatse).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. KATSE PÕHIMÕTE  
Portskatses inkubeeritakse uuritavat ainet kas ainult pinnavees 
(pelaagiline katse) või pinnavees, millele on lisatud hõljuvainet (hõljumit) ja/või setet, nii et selle kuivmassi sisaldus on 0,01–1 g/l 
(hõljumikatse); viimasel juhul modelleeritakse veekogu, milles on 
hõljumit või taassuspendeeritud setet. Enamasti on pinnavee hõljumi ja/või hõljuvsette sisaldus eespool märgitud vahemiku madalamas osas. Katsekolbe inkubeeritakse valguse juurdepääsuta keskkonna ­
temperatuuril aeroobsetes tingimustes, segamisega. Lagunemise 
kineetika määratakse vähemalt kahel uuritava aine kontsentratsioonil. Kontsentratsioonid peavad teineteisest erinema 5–10 korda ja 
vastama uuritava aine eeldatavale kontsentratsioonivahemikule kesk ­
konnas. Uuritava aine maksimaalne kontsentratsioon ei tohi ületada 100 μg/l ja on parem, kui see on alla 10 μg/l, kuna sel puhul vastab 
biolagunemine esimest järku kineetikale. Minimaalne kontsentrat ­
sioon ei tohi ületada 10 μg/l ja on parem, kui see on 1–2 μg/l või 
isegi madalam kui 1 μg/l. Müügilolevate
 14 C-märgisega ainete kasu ­
tamisel saab nii madalaid kontsentratsioone tavaliselt hästi määrata. Muude analüüsimeetodite piiratud võimaluste tõttu on sageli võimatu 
mõõta uuritava aine kontsentratsiooni vajaliku täpsusega, kui selle 
algkontsentratsioon on ≤ 100 μg/l (vt punkt 1.7.2, teine lõik). Kui ei 
ole piisavalt madala avastamislävega analüüsimeetodit, siis võib oluliste muundumissaaduste identifitseerimiseks ja sisalduse mõõtmi ­
seks kasutada uuritava aine kõrgemaid kontsentratsioone (> 100 μg/l, 
mõnikord > 1 mg/l). Kui kasutatakse uuritava aine kõrget kontsen ­
tratsiooni, siis ei saa katsetulemustest võib-olla hinnata lagunemise esimest järku kiiruskonstanti ja poolestusaega, kuna lagunemine 
tõenäoliselt ei vasta esimest järku kineetikale.
 
Lagunemist registreeritakse sobiva aja tagant, mõõtes kas  14 C jääkak­
tiivsust või (kui kasutatakse spetsiifilist keemilist analüüsi) uuritava 
aine jääkkontsentratsiooni. Kõige stabiilsema molekuliosa märgista ­
mine  14 C-ga võimaldab mõõta täielikku mineraliseerumist, samas kui 
vähem stabiilse molekuliosa märgistamine  14 C-ga või spetsiifilise 
analüüsimeetodi kasutamine võimaldab hinnata esmast biolagune ­
mist. Kõige stabiilsem molekuliosa ei pruugi siiski sisaldada olulist 
funktsionaalosa, mida võib seostada aine teatava eriomadusega, nagu toksilisus, bioakumulatsioon jne. Selle eriomaduse kao jälgimiseks võib niisugusel juhul olla vaja kasutada
 14 C-märgistatud funktsionaa ­
losaga uuritavat ainet.  
1.5. ANDMED UURITAVA AINE KOHTA  
Käesolevas katses võib kasutada nii radioaktiivse märgisega kui ka 
märgiseta aineid. Soovitatakse kasutada märgistamist  14 C-ga, 
kusjuures märgis peab tavaliselt asuma kõige stabiilsemas (stabiilse ­
mates) molekuli osas (osades) (vt ka punkt 1.4). Rohkem kui ühe aromaatse tsükliga molekulis on soovitatav märgistada
 14 C-ga üks 
või mitu süsinikku igas tsüklis. Lisaks on soovitatav märgistada  
14 C-ga üks või mitu süsinikku mõlemal pool kergesti lõhustatavat 
sidet. Uuritava aine keemiline ja radiokeemiline puhtusaste peab olema > 95 %. Et hõlbustada
 14 C mõõtmist madala algkontsentrat ­
siooniga katsetes, kasutatakse radiomärgisega aineid, mille eriak ­
tiivsus on eelistatavalt umbes 50 μCi/mg (1,85 MBq) või kõrgem. 
Uuritava aine kohta on vaja teada järgmist:  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— lahustuvus vees [metoodika A.6];  
— lahustuvus orgaanilises (orgaanilistes) lahustis (lahustites) (aine 
puhul, mida lisatakse lahustis või mis lahustub vees halvasti);  
— dissotsiatsioonikonstant (pKa), kui aine seob või loovutab 
kergesti prootoneid [OECD TG 112] (5);  
— aururõhk [metoodika A.4] ja Henry konstant;  
— keemiline püsivus vees valguse juurdepääsuta (hüdrolüüs) 
[metoodika C.7].  
Kui uuritakse vees vähelahustuva aine lagunemist merevees, võib 
olla kasulik teada ka soolamiskonstanti (Setšenovi konstant) K  s , 
mis on määratud valemiga log(S/S') = K  s C m , kus S ja S' on aine 
lahustuvus vastavalt magedas vees ja merevees ja C  m on soola 
molaarne kontsentratsioon.  
Hõljumikatse puhul on vaja teada ka järgmist:  
— jaotuskoefitsient süsteemis n-oktanool-vesi [metoodika A.8];  
— adsorptsioonikoefitsient [metoodika C.18].  
Kasulik on teada veel järgmist:  
— uuritava aine kontsentratsioon keskkonnas, kui see on teada või 
seda on hinnatud;  
— uuritava aine toksilisus mikroorganismidele [metoodika C.11];  
— kergbiolagundatavus ja/või loomulik biolagundatavus [metoo ­
dikad C.4 A–F, C.12, C.9, OECD TG 302 (5)];  
— aeroobne või anaeroobne biolagundatavus mullas ja muundumis ­
katsed süsteemis setted-vesi [metoodikad C.23, C.24].  
1.6. STANDARDAINE  
Tavaliselt kasutatakse standardainena aeroobsetes tingimustes 
kergesti biolagundatavat ainet (nt aniliin või naatriumbensoaat). Aniliini ja naatriumbensoaadi eeldatav biolagunemise aeg on tavali ­
selt alla kahe nädala. Standardainega kontrollitakse, et katses kasu ­
tatava vee mikroorganismide aktiivsus oleks teatavates piirides, st et 
vees oleks aktiivne mikroorganismide populatsioon.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. KVALITEEDIKRITEERIUMID  
1.7.1.  Saagis  
Pärast uuritava aine lisamist kontrollitakse iga katsetatavat algkont ­
sentratsiooni kohe  14 C aktiivsuse mõõtmisega või, märgistamata aine 
puhul, keemilise analüüsiga vähemalt kahes paralleelproovis. Nii 
saadakse andmeid asjaomase analüüsimeetodi rakendatavuse ja korratavuse ning uuritava aine jaotuse ühtluse kohta. Edasisel andmete analüüsil ei kasutata tavaliselt nominaalset kontsentrat ­
siooni, vaid mõõdetud
 14 C algaktiivsust või uuritava aine algkont ­
sentratsiooni, kuna sellega kompenseeritakse sorptsioonist tingitud ainekaod ja doseerimisvead.
 14 C-märgisega uuritava aine korral 
võib aine saagise katse lõpus leida massibilansi koostamisega (vt 
punkt 1.8.9.4, viimane lõik). Paremal juhul on radiomärgisega aine massibilansist leitud saagis 90–110 %, samas kui radiomärgiseta aine saagis on olenevalt analüüsimeetodi täpsusest 70–110 %. Neid vahe ­
mikke ei tule pidada katse nõuetele vastavuse kriteeriumideks; neid 
tuleb tõlgendada sihtvahemikena. Analüüsi täpsuse võib määrata ka algkontsentratsioonist madalamal uuritava aine kontsentratsioonil ning oluliste muundumissaaduste puhul, kuid see ei ole kohustuslik.
 
1.7.2.  Analüüsimeetodi korratavus ja tundlikkus  
Et kontrollida analüüsimeetodi korratavust uuritava aine ja, vajaduse 
korral, muundumissaaduste sisalduse mõõtmisel (kaasa arvatud 
esmase ekstraheerimise tõhusus), tehakse viis pinnavee üksikekstrak ­
tide paralleelanalüüsi.  
Võimaluse korral ei tohiks uuritava aine ja muundumissaaduste 
puhul analüüsimeetodi avastamislävi olla kõrgem kui 1 % katsesüs ­
teemi lisatud aine algkontsentratsioonist. Mõõtmislävi ei tohiks 
ületada 10 % algkontsentratsioonist. Paljude orgaaniliste ainete ja nende muundumissaaduste keemiliseks analüüsiks on sageli vaja, et lisatud uuritava aine algkontsentratsioon oleks suhteliselt kõrge (> 
100 μg/l).
 
1.8. KATSEMEETODI KIRJELDUS  
1.8.1.  Seadmed  
Katse tehakse vajaliku mahuga (nt 0,5- või 1,0-liitristes) silikoon- 
või kummikorgiga suletud koonilistes kolbides, silindrikujulistes pudelites või CO
 2 -kindlalt (nt butüülkummist septumiga) suletud 
seerumipudelites. Üks võimalus on teha katse suure arvu nõudega 
ja võtta igal proovivõtuajal prooviks vähemalt kahe paralleelnõu kogu sisu (vt punkt 1.8.9.1, viimane lõik). Radiomärgiseta lendumatu uuritava aine korral ei ole gaasikindel kork või septum vajalik, selle 
asemel sobib mittetihe puuvillvatikork, mille abil välditakse saastu ­
mist õhu kaudu (vt punkt 1.8.9.1, teine lõik). Vähelenduvaid aineid katsetatakse biomeetrilaadses seadmes, milles veepinda nõrgalt sega ­
takse. Baktersaaste vältimiseks võib katsenõu enne kasutamist steri ­
liseerida kuumutamise või autoklaavimisega, kuid see ei ole kohus ­
tuslik. Lisaks sellele kasutatakse järgmisi tavalisi laboriseadmeid:
 
— plaatloksuti või magnetsegajad katsenõude pidevaks segamiseks;  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— tsentrifuug;  
— pH-meeter;  
— turbidimeeter hägususe nefelomeetriliseks määramiseks;  
— ahi või mikrolaineahi kuivmassi määramiseks;  
— membraanfiltrimise seade;  
— autoklaav või ahi klaasnõude kuumsteriliseerimiseks;  
— vahendid  14 C-märgisega aine käitlemiseks;  
— seade  14 C aktiivsuse mõõtmiseks süsinikdioksiidi neelavast lahu ­
sest võetud proovis ja vajaduse korral setteproovis;  
— analüüsiseade uuritava ja standardaine määramiseks, kui kasuta ­
takse spetsiifilist keemilist analüüsi (nt gaasikromatograaf, kõrge ­
fektiivne vedelikkromatograaf).  
1.8.2.  Uuritava aine põhilahus  
Uuritava ja standardaine põhilahuste valmistamiseks kasutatakse 
deioniseeritud vett (vt punkt 1.8.7, esimene lõik). Deioniseeritud vesi ei tohi sisaldada mikroorganismidele mürgiseid aineid ning üle 
1 mg/l lahustunud orgaanilist süsinikku (6).
 
1.8.3.  Pinnavee võtmine ja vedu  
Pinnavee võtmise koht valitakse igal konkreetsel juhtumil vastavalt 
katse eesmärgile. Veevõtukoha valikul tuleb arvestada võimalikke varasemaid põllumajanduse, tööstuse või olmemõjusid. Kui on 
teada, et eelneva nelja aasta jooksul saastati veekogu uuritava ainega 
või selle struktuurianaloogidega, ei tohi sellest veekogust katsevett võtta, välja arvatud juhul, kui uurija eesmärk ongi lagunemiskiiruse kindlakstegemine eelnevalt saasteainega kokku puutunud kesk ­
konnas. Veevõtukohas mõõdetakse vee pH ja temperatuur. Registree ­
ritakse proovivõtu sügavus ja antakse veeproovi väline iseloomustus (nt värvus ja hägusus) (vt punkt 3). Aeroobsete tingimuste olemasolu tõendamiseks mõõdetakse hapnikusisaldus ja/või redokspotentsiaal 
vees ja setete pinnakihis, kui aeroobsete tingimuste olemasolu ei 
ole ilmne juba eelnevast kogemusest ning veevõtukoha laadist. Pinnavett veetakse täiesti puhtas nõus. Transpordi ajal ei tohi proovi temperatuur oluliselt ületada katsetemperatuuri. Kui vedu kestab üle 
2–3 tunni, soovitatakse proov jahutada temperatuurini 4 °C. 
Veeproovi ei tohi külmutada.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Pinnavee hoidmine ja ettevalmistamine  
Katset on parem alustada üks ööpäev pärast proovivõttu. Kui vett on 
vaja säilitada, peab säilitusaeg olema võimalikult lühike ja ei tohi ületada nelja nädalat. Säilitamisel aereeritakse veeproovi 4 °C juures 
kuni kasutamiseni. Enne kasutamist kõrvaldatakse veeproovist 
suuremad tahked osakesed näiteks filtrimisega läbi nailonfiltri, mille ava läbimõõt on umbes 100 μm, läbi suurepoorilise paberfiltri 
või sadestamisega.
 
1.8.5.  Sette lisamine veele (mittekohustuslik)  
Hõljumikatseks vajaliku suspensiooni saamiseks lisatakse loodus ­
likku vett sisaldavasse nõusse pindmist setet (mis on filtritud suure ­
mate tahkete osakeste eemaldamiseks vastavalt punktile 1.8.4); suspendeeritud tahke aine sisaldus peab olema vahemikus 0,01–1 g/l. Pindmine sete peab pärinema veeprooviga samast kohast. Olene ­
valt konkreetsest veekeskkonnast võib pindmine sete olla suure 
orgaanilise süsiniku sisalduse (2,5–7,5 %) ja peeneteralise lõimisega või väikese orgaanilise süsiniku sisalduse (0,5–2,5 %) ja jämeteralise lõimisega (3). Pindmine sete valmistatakse ette järgmiselt: läbipaistva 
plasttoru abil võetakse mitu settesüdamikku; kohe pärast proovi 
võtmist lõigatakse ära iga südamiku ülemine aeroobne osa (kuni 5 mm paksune pindmine kiht) ja segatakse need osad kokku. Saadud setteproovi transporditakse nõus, mille ülaosas on palju õhuga 
täidetud ruumi, mis tagab settele aeroobsed tingimused (kui vedu 
kestab üle 2–3 tunni, jahutatakse nõu temperatuurini 4 °C). Sette ­
proov suspendeeritakse uuritavas vees, nii et proovi ja vee suhe oleks 1:10, ja hõljumit aereeritakse 4 °C juures kuni kasutamiseni. Kui 
setet on vaja säilitada, peab säilitusaeg olema võimalikult lühike 
ega tohi ületada nelja nädalat.
 
1.8.6.  Poolpidev menetlus (mittekohustuslik)  
Kui uuritava aine olulist lagunemist on võimalik mõõta alles pärast 
pika ootefaasi möödumist, võib olla vajalik pikk inkubatsioonipe ­
riood (mitu kuud). Kui see on teada uuritava ainega tehtud eelkatse ­
test, võib katse alguses kasutada poolpidevat režiimi, milles osa 
katsevett või hõljumit perioodiliselt uuendatakse (vt 2. liide). Teine 
võimalus on muuta tavaline portskatse poolpidevaks pärast seda, kui umbes 60 katsepäevaga ei ole portsrežiimis saavutatud uuritava aine lagunemist (vt punkt 1.8.8.3, teine lõik).
 
1.8.7.  Uuritava aine (või standardaine) lisamine  
Kui uuritav aine lahustub vees hästi (> 1 mg/l) ja on vähelenduv 
(Henry konstant < 1 Pa·m  3 /mol või < 10  –5 atm·m  3 /mol), võib põhi ­
lahuse valmistada deioniseeritud vees (vt punkt 1.8.2); vajaliku kont ­
sentratsiooni saamiseks lisatakse katsenõusse vajalik maht põhila ­
hust. Lisatava põhilahuse maht peab olema võimalikult väike (< 10 % vedeliku lõppmahust, kui võimalik). Teine võimalus on 
lahustada uuritav aine suuremas mahus katsevees, seda võib käsitleda 
alternatiivina orgaanilise lahusti kasutamisele.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Äärmisel juhul võib lendumatu vähelahustuva aine põhilahuse 
valmistada lenduvas orgaanilises lahustis, kuid katsesüsteemi lisatava 
lahusti kogus ei tohi ületada 1 mahuprotsenti ja pärssida mikroorga ­
nismide aktiivsust. Lahusti ei tohi mõjutada uuritava aine stabiilsust vees. Lahusti eemaldatakse, kuni lahusesse jääv väga väike lahusti ­
kogus enam oluliselt ei suurenda lahustunud orgaanilise süsiniku 
sisaldust katsevees või -hõljumis. Selle kontrollimiseks tehakse ainespetsiifiline analüüs või, võimaluse korral, lahustunud orgaanilise süsiniku analüüs (6). Lisatava lahusti kogus peab olema võimalikult 
väike ja uuritav aine peab olema täielikult lahustunud katsevee lõpp ­
mahus. Uuritava aine lisamiseks katsenõusse võib kasutada ka teisi publikatsioonides (7, 8) kirjeldatud võtteid. Kui uuritava aine lisami ­
seks kasutatakse orgaanilist lahustit, tuleb lahusti mõju kontrolliks 
ette nähtud katseveega nõu (mis ei sisalda lisatud aineid) ja katse ­
veega nõu, mis sisaldab lisatud standardainet, käidelda samal viisil kui tegelikku katsenõu, millesse on lisatud kandelahustis lahustatud uuritav aine. Lahusti mõju kontrollimise eesmärk on standardaine 
lagunemiskiiruse jälgimisega näidata, et lahusti ei pärsi mikroorga ­
nismide populatsiooni.
 
1.8.8.  Katsetingimused  
1.8.8.1.  Katsetemperatuur  
Inkubeerimine toimub (eelistatavalt) valguse juurdepääsuta või haju ­
valguses püsival temperatuuril (± 2 °C), milleks võib olla välistem ­
peratuur või standardtemperatuur (20–25 °C). Välistemperatuur võib olla kas tegelik proovi temperatuur proovi võtmisel või proovivõtu ­
koha keskmine temperatuur.
 
1.8.8.2.  Loksutamine või segamine  
Et tahked osakesed ja mikroorganismid püsiksid hõljumis, tuleb 
katsenõu pidevalt loksutada või segada. Loksutamine või segamine 
soodustab ka hapniku transporti nõus olevast õhust vedelikku, mis tagab nõutavate aeroobsete tingimuste püsimise. Katsenõud aseta ­
takse plaatloksutile (ligikaudu 100 võnget minutis) või magnetsega ­
jale. Loksutamine või segamine peab olema pidev. Loksutamine või segamine peab olema võimalikult nõrk, kuid tagama homogeense suspensiooni püsimise.
 
1.8.8.3.  Katse kestus  
Katse kestab tavaliselt kuni 60 ööpäeva, välja arvatud juhul, kui 
kasutatakse poolpidevat režiimi, milles katsehõljumit perioodiliselt 
uuendatakse (vt punkt 1.8.6 ja 2. liide). Kui uuritava aine lagune ­
mine algab 60 esimese katsepäeva jooksul, võib portskatset siiski pikendada kuni 90 ööpäevani. Lagunemist kontrollitakse vajaliku 
aja tagant lahuses oleva
 14 C jääkaktiivsuse või eraldunud  14 CO 2 
aktiivsuse määramisega (punkt 1.8.9.4) ja/või keemilise analüüsiga 
(punkt 1.8.9.5). Inkubatsiooniaeg peab olema piisav lagunemisprot ­
sessi hindamiseks. Oleks hea, kui katses laguneks üle 50 % ainest; 
aeglaselt laguneva aine korral peab lagunema piisavalt palju (tavali ­
selt üle 20 %) ainet selleks, et hinnata lagunemise kiiruskonstanti.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Katsesüsteemis mõõdetakse korduvalt pH-d ja hapnikusisaldust, kui 
eelnevad samalaadsed katsed samast kohast võetud vee- ja setteproo ­
videga ei ole näidanud, et sellist kontrollimist ei ole vaja. Mõnikord võib vees või settes palju kõrgemas kontsentratsioonis olevate primaarsete substraatide tarbimine põhjustada nii rohket CO
 2 eraldu­
mist ja hapnikukulu, et katse jooksul muutuvad oluliselt katsetingi ­
mused.  
1.8.9.  Katse läbiviimine  
1.8.9.1.  Nõude ettevalmistamine pelaagiliseks katseks  
Katsenõudesse pannakse sobiv kogus katsevett, nii et ligikaudu üks 
kolmandik nõu mahust oleks täidetud ja igas nõus oleks vähemalt 
100 ml vett. Kui katse tehakse suure arvu nõudega (ja igal proovi ­
võtuajal võetakse prooviks teatavate katsenõude kogu sisu), on katsevee vajalik maht samuti umbes 100 ml, sest liiga väike proovi 
maht võib mõjutada ootefaasi pikkust. Uuritav aine lisatakse põhila ­
husena, nagu on kirjeldatud punktides 1.8.2 ja 1.8.7. Lagunemise kineetika määramiseks ja lagunemise kiiruskonstandi arvutamiseks kasutatakse vähemalt kahte uuritava aine kontsentratsiooni, mille 
väärtused erinevad 5–10 korda. Mõlemad kontsentratsioonid peavad 
olema alla 100 μg/l ja eelistatavalt vahemikus 1–10 μg/l.
 
Katsenõud suletakse õhu- ja CO  2 -kindla korgi või kaanega.  14 C- 
märgiseta lendumatu uuritava aine korral sobib mittetihe puuvillva ­
tikork, mis hoiab ära saastumise õhu kaudu (vt punkt 1.8.1); 
seejuures peavad võimalikud peamised lagunemisproduktid olema teadaolevalt lendumatud ning CO
 2 määratakse kaudselt (vt 3. liide).  
Katsenõusid inkubeeritakse valitud temperatuuril (vt punkt 1.8.8.1). 
Keemiliseks analüüsiks või  14 C mõõtmisteks võetakse proovid katse 
alguses (enne biolagunemise algust; vt punkt 1.7.1) ja seejärel katse jooksul sobiva aja tagant. Proovivõtt seisneb kas igast paralleelnõust 
osaproovide võtmises (5 ml alikvoodid) või igal proovivõtuajal kogu 
katsenõu sisu ärakasutamises. Uuritava aine mineraliseerumist võib määrata kas kaudselt või otse (vt 3. liide). Kiiruskonstandi usaldus ­
väärse hinnangu saamiseks on tavaliselt vaja lagunemisfaasi jooksul 
(pärast ootefaasi lõppu) võtta proovid vähemalt viie andmepunkti 
jaoks; kiiresti laguneva aine korral võib piirduda kolme punktiga, kui saab tõendada, et neist piisab. Kui uuritav aine ei lagune kiiresti, on lagunemisfaasi ajal kerge teha ka rohkem mõõtmisi, sellepärast 
tuleks kineetilise konstandi hindamiseks kasutada rohkem andme ­
punkte. Kuna biolagunemise kiirused on erinevad, ei saa kindlat proovivõtu ajagraafikut ette anda; aeglase lagunemise korral soovi ­
tatakse siiski võtta proove üks kord nädalas. Kui uuritav aine on 
kiiresti biolagundatav, tuleb kolmel esimesel katsepäeval võtta 
proov iga päev ja seejärel igal teisel või kolmandal päeval. Mõni ­
kord, näiteks kui aine hüdrolüüsub väga kiiresti, võib olla vaja võtta proove iga tunni tagant. Enne katset soovitatakse teha eeluuring 
sobivate proovivõtuaegade kindlaksmääramiseks. Kui proove on 
vaja ka edasisteks keemilisteks analüüsideks, on soovitatav võtta rohkem proove ja seejärel valida katse lõpus analüüsitavad proovid tagurpidises järjekorras, st viimaseid proove analüüsitakse esimestena 
(proovide stabiilsuse tagamise kohta säilitamise ajal vt punkt 1.8.9.5, 
teine lõik).
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Katsenõude ja proovide arv  
Valmistatakse ette piisav arv katsenõusid, et oleksid:  
— katsenõud: vähemalt kaks (parem kolm) paralleelnõu igal uuri ­
tava aine kontsentratsioonil või (kui prooviks võetakse teatavate katsenõude kogu sisu) suur arv katsenõusid igal kontsentrat ­
sioonil (nõu tähis on F
 T ); 
— katsenõud massibilansi arvutamiseks: vähemalt kaks paralleelnõu 
igal uuritava aine kontsentratsioonil (nõu tähis on F  M ); 
— ilma uuritava aineta pimekatsenõu: vähemalt üks ainult katsevett 
sisaldav pimekatsenõu (nõu tähis on F  B ); 
— standardainega kontrollnõud: kaks paralleelnõu standardainega 
(nt aniliin või naatriumbensoaat, 10 μg/l) (nõu tähis on F  C ). 
Standardainega kontrollnõusid on vaja minimaalse mikroorganis ­
mide aktiivsuse olemasolu kinnitamiseks. Kui see on otstarbeko ­
hane, võib radiomärgisega standardainet kasutada ka siis, kui 
uuritava aine lagunemist jälgitakse keemilise analüüsiga;  
— steriilsed kontrollnõud: üks või kaks steriliseeritud katseveega 
nõu, et kontrollida uuritava aine võimalikku abiootilist lagune ­
mist või muud mittebioloogilist kadu (nõu tähis on F  S ). Bioloo­
gilise aktiivsuse võib kõrvaldada katsevee autoklaavimise 
(121 °C, 20 minutit), mürgi lisamise (nt naatriumasiid (NaN  3 ), 
10–20 g/l, elavhõbe(II)kloriid, HgCl  2 , 100 mg/l, või formaliin, 
100 mg/l) või gammakiirituse abil. Kui kasutatakse HgCl  2 , tuleb 
katsete jäätmed kõrvaldada mürgiste jäätmete eeskirjade kohaselt. 
Kui veele on lisatud rohkesti setet, on steriilsust raske saavutada; 
sellisel juhul soovitatakse näiteks kolmekordset autoklaavimist. Tuleb arvestada, et autoklaavimine võib mõjutada sette sorptsioo ­
niomadusi.
 
— lahusti kontrollnõud, milles on katsevesi ja katsevesi standardai ­
nega: kaks paralleelnõu, mille sisule on lisatud lahustit samas 
koguses ja samal viisil kui uuritava aine lisamisel. Neid nõusid on vaja, et standardaine lagunemise määramisega kontrollida lahusti võimalikku kahjulikku mõju.
 
Katse planeerimisel peab uurija arvestama, et parem on teha rohkem 
paralleelkatseid kui suurendada proovivõtukordade arvu. Vajalike 
nõude täpne arv oleneb lagunemise mõõtmise meetodist (vt punkt 
1.8.9.1, kolmas lõik; punkt 1.8.9.4 ja 3. liide).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
Igal proovivõtuajal võetakse igast katsenõust kaks osaproovi (nt 5 ml 
alikvoodid). Kui kasutatakse suurt arvu nõusid ja prooviks võetakse 
katsenõu kogu sisu, moodustatakse iga proov vähemalt kahe nõu sisust (vt punkt 1.8.9.1, esimene lõige).
 
1.8.9.3.  Nõude ettevalmistamine hõljumikatseks (mittekohustuslik)  
Katsenõudesse lisatakse nõutav maht katsevett ja vajaduse korral 
setet (vt punkt 1.8.5). Hõljumikatse nõud valmistatakse ette samal 
viisil kui pelaagilise katse nõud (vt punktid 1.8.9.1 ja 1.8.9.2). Parem 
on kasutada seerumipudeleid või samalaadse kujuga nõusid. Suletud nõud asetatakse loksutile horisontaalselt.
 14 C-märgiseta lendumatu 
uuritava ainega avatud nõud pannakse muidugi püstasendisse; sel 
juhul soovitatakse kasutada magnetsegajat ja klaasiga kaetud magne ­
tilisi segamispulkasid. Vajaduse korral aereeritakse pudeleid nõuete ­
kohase õhustatuse tagamiseks.  
1.8.9.4.  Radiokeemiline määramine  
Eraldunud  14 CO 2 mõõdetakse kaudselt ja otse (vt 3. liide).  14 CO 2 
kaudseks määramiseks kasutatakse järgmist vahet: katsevees või 
-hõljumis leiduva  14 C algaktiivsusest lahutatakse summaarne jääkak ­
tiivsus proovivõtuhetkel, mis mõõdetakse pärast proovi pH viimist väärtuseni 2–3 ja CO
 2 eemaldamist. Kuna anorgaaniline süsinik 
eemaldatakse, pärineb mõõdetav jääkaktiivsus üksnes orgaanilisest 
materjalist. Kaudset  14 CO 2 määramist ei kasutata, kui uuritava aine 
olulised muundumissaadused on lenduvad (vt 3. liide). Võimaluse korral tuleb igal proovivõtul mõõta otse vähemalt ühest katsenõust eralduv
 14 CO 2 (vt 3. liide); see meetod võimaldab kontrollida nii 
massibilanssi kui ka biolagunemist, kuid seda saab rakendada ainult 
suletud nõus tehtava katse korral.  
Katse jooksul eraldunud  14 CO 2 otseseks mõõtmiseks valmistatakse 
katseks ette rohkem nõusid. Otsest  14 CO 2 määramist soovitatakse 
siis, kui uuritava aine olulised muundumissaadused on lenduvad. 
Iga andmepunkti saamiseks viiakse katsenõu sisu pH väärtuseni 2–3 ja
 14 CO 2 kogutakse sise- või välisabsorberisse (vt 3. liide).  
14 C-märgisega uuritava aine ja oluliste muundumissaaduste kontsen ­
tratsioonid võib määrata kas radiokromatograafiliselt (õhukese kihi 
kromatograafia, radioloogiline õhukese kihi kromatograafia) või radiokeemilise detektsiooniga kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil.
 
Soovi korral võib määrata ka, kuidas on faaside vahel jaotunud 
jääkradioaktiivsus (vt 1. liide), lagunemata uuritav aine ja muundu ­
missaadused.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Massibilansi kontrollimiseks mõõdetakse katse lõpus otseselt  14 CO 2 , 
kasutades selleks eraldi katsenõu, millest ei ole katse käigus proove 
võetud (vt 3. liide).  
1.8.9.5.  Keemiline analüüs  
Tundliku analüüsimeetodi olemasolu korral võib esmase biolagune ­
mise hindamiseks kasutada radioaktiivse märgistamise asemel uuri ­
tava aine jääkkontsentratsiooni mõõtmist. Kui mineraliseerumise ulatuse mõõtmiseks kasutatakse radiomärgisega ainet, võib paralleel ­
selt teha ka keemilise analüüsi, mis võimaldab saada lisateavet ja 
kontrollida meetodit. Keemilist analüüsi võib kasutada ka uuritava aine lagunemise käigus tekkinud muundumissaaduste mõõtmiseks, seda soovitatakse ainete puhul, mille mineraliseerumise poolestusaeg 
on üle 60 ööpäeva. Igal proovivõtukorral mõõdetakse ning registree ­
ritakse (absoluutsetes ühikutes ja protsendina algsisaldusest) uuritava aine ja muundumissaaduste kontsentratsioonid. Üldiselt tuleb identi ­
fitseerida iga muundumissaadus, mille sisaldus teataval proovivõtu ­
korral on ≥ 10 % uuritava aine algkontsentratsioonist; identifitseeri ­
mata jätmine peab olema mõistlikult põhjendatud. Kui teatava muun ­
dumissaaduse kontsentratsioon katse jooksul pidevalt kasvab, võib 
see osutada selle saaduse püsivusele; sellepärast tuleb kaaluda sellise 
saaduse identifitseerimist ka siis, kui selle kontsentratsioon ei ületa eespool märgitud piirmäära. Kui uuritav aine võib kiiresti abiootili ­
selt muunduda (nt hüdrolüüsuda), tuleb kaaluda muundumissaaduste 
analüüsimist steriilsete kontrollkatsete abil. Muundumissaaduste 
identifitseerimise ja sisalduse mõõtmise vajadust kaalutakse iga juhtumi puhul eraldi ja põhjendatakse katseprotokollis. Orgaanilise lahustiga ekstraheerimist rakendatakse asjaomase analüüsimeetodi 
juhiste kohaselt.
 
Kui analüüs toimub hiljemalt 24 tundi pärast proovi võtmist, 
hoitakse proovi õhukindlas nõus 2–4 °C juures (eelistatav). Pikemaks säilitamiseks külmutatakse proov temperatuurini alla –18 °C või konserveeritakse keemiliselt. Proovi konserveerimiseks ei soovitata 
hapestamist, sest hapestatud proov võib olla ebapüsiv. Kui proovi 
ei analüüsita 24 tunni jooksul ja seda on vaja kauem säilitada, tuleb teha säilivusuuring ja tõendada, et uuritavad keemilised ained on temperatuuril alla –18 °C või konserveeritult säilitamisel stabiilsed. 
Kui asjaomane analüüsimeetod hõlmab ekstraheerimist lahustiga või 
tahkefaas-ekstraheerimist, tuleb aine ekstraheerida kohe pärast proovi võtmist või pärast proovi säilitamist külmutatult kuni 24 tundi.
 
Analüüsimeetodi tundlikkusest olenevalt võib olla vaja võtta suure ­
maid proove, kui on märgitud punktis 1.8.1. Katset on kerge teha 
2–3-liitristes nõudes: igasse nõusse pannakse 1 liiter katsevett ja 
võetakse umbes 100-milliliitriseid proove.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. KATSEANDMED JA NENDE ESITAMINE  
2.1. ANDMETE TÖÖTLEMINE  
2.1.1.  Andmete graafiline esitamine  
Proovivõtuajad ümardatakse täistundideks (välja arvatud juhul, kui 
aine laguneb oluliselt minutite või tundide jooksul), mitte täisööpäe ­
vadeks. Uuritava aine jääkaktiivsuse (  14 C-märgisega aine) või jääk ­
kontsentratsiooni (märgistamata aine) hinnatud väärtused esitatakse sõltuvalt ajast graafiliselt nii lineaarses kui ka poollogaritmilises 
skaalas (vt joonised 1a ja 1b). Kui on toimunud lagunemine, võrrel ­
dakse nõudega F
 T saadud tulemusi nendega, mis on saadud nõudega 
F S . Kui uuritava ainega nõude (F  T ) puhul saadud tulemuste 
keskväärtus erineb steriilsete nõudega (F  S ) saadud keskväärtusest 
vähem kui 10 %, võib oletada, et täheldatud lagunemine on valdavalt abiootiline. Kui lagunemise määr nõudes F
 S on väiksem, siis võib 
neid andmeid kasutada nõudes F  T toimunud biolagunemise määra 
hindamisel parandina (vastav arv lahutatakse). Kui tehakse mitteko ­
hustuslik oluliste muundumissaaduste analüüs, esitatakse lisaks uuri ­
tava aine vähenemise graafikule ka muundumissaaduste tekkimist ja kadumist kajastavad graafikud.
 
Ootefaasi kestuse t  L hindamiseks ekstrapoleeritakse lagunemiskõvera 
(poollogaritmilise graafiku) lineaarne osa null-lagunemise tasemeni 
või määratakse ligikaudu 10 % lagunemise aeg (vt joonised 1a ja 1b). Poollogaritmiliselt graafikult leitakse esimest järku kiiruskons ­
tandi k ja selle standardhälbe hinnang, kasutades lineaarset regres ­
siooni ln (
 14 C jääkaktiivsus või uuritava aine jääkkontsentratsioon)  
vs. aeg. Eriti  14 C mõõtmise puhul tuleb kasutada ainult neid 
andmeid, mis kuuluvad ootefaasile järgnevasse lagunemiskõvera esimesse lineaarsesse osasse; paljude suure määramatusega andmete 
asemel on parem koguda väiksem arv representatiivseid andmeid. 
Antud juhul hõlmab määramatus vigu, mis on seotud mõõdetud
 
14 C jääkaktiivsuse soovitatud otsese kasutamisega (vt edaspidi). 
Kui lagunemine on kahefaasiline, on mõnikord vaja arvutada kaks 
kiiruskonstanti. Selleks määratakse kindlaks lagunemiskõvera kaks 
faasi. Kui ühest ja samast nõust võetakse osaproove, arvutatakse kiiruskonstant k ja poolestusaeg t
 ½ = ln 2/k iga paralleelnõu jaoks 
eraldi; kui igal proovivõtukorral võetakse prooviks katsenõu kogu 
sisu, arvutatakse need parameetrid keskväärtuste alusel (vt punkt 
1.8.9.2, viimane lõik). Esimese meetodi korral esitatakse iga paral ­
leelnõu jaoks leitud kiiruskonstant ja poolestusaeg ning nende keskväärtused koos standardhälvetega. Uuritava aine kõrge kontsen ­
tratsiooni puhul võib lagunemiskõver (poollogaritmiline graafik) sirg ­
joonest märkimisväärselt kõrvale kalduda ja esimest järku kineetika ei kehti. Sel juhul ei ole poolestusaja määramisel mõtet. Piiratud andmevahemikus saab siiski rakendada pseudo-esimest järku kinee ­
tikat ja määrata poollagunemisaeg DT
 50 (aeg, mille jooksul laguneb 
50 % ainest). Ent tuleb silmas pidada, et DT  50 abil ei saa ennustada 
lagunemise ajalist kulgu väljaspool valitud andmevahemikku, sest DT
 50 iseloomustab ainult valitud andmekogumit. Kuna statistilisi 
arvutusi ja kõverate lähendamist hõlbustavad analüüsiprogrammid 
on kergesti kättesaadavad, on soovitatav kasutada asjaomast tarkvara.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Kui kasutatakse keemilist analüüsi, määratakse esmase lagunemise 
kiiruskonstant ja poolestusaeg samal viisil, nagu kirjeldati eespool 
mineraliseerumise üldmäära mõõtmise puhul. Kui esmane lagune ­
mine on limiteeriv protsess, võib mõnikord kasutada ka lagunemise üldmäära iseloomustavaid andmepunkte. Seda võib teha, kuna
 14 C 
aktiivsuse mõõtmisest erinevalt on antud juhul otsene mõõtmine.  
Kui kasutatakse  14 C-märgisega ainet, koostatakse vähemalt katse 
lõpus massibilanss, mis väljendatakse lisatud aine algkontsentrat ­
siooni protsentides.  
2.1.2.  Jääkaktiivsus  
Orgaanilise aine  14 C-märgisega osa lagunemisel läheb suurem osa 
isotoobist  14 C üle  14 CO 2 -ks; muu osa kasutatakse biomassi kasvata ­
miseks ja/või rakuväliste ainevahetussaaduste sünteesimiseks. Järeli ­
kult ei muundu aine täielikul „lõplikul” biolagunemisel kogu tema süsinik
 14 CO 2 -ks. Biosünteesi produktidesse seotud  14 C vabaneb 
aeglaselt  14 CO 2 -na hiljem toimuval teisesel mineraliseerumisel. Graa ­
fikutel, mis kajastavad orgaanilise  14 C jääkaktiivsuse (mõõdetakse 
pärast CO  2 eemaldamist) või eraldunud  14 CO 2 aktiivsuse sõltuvust 
ajast, esineb sellepärast pärast lagunemise lõppu järelfaas. See 
raskendab andmete kineetilist tõlgendamist ja sellepärast kasutatakse 
lagunemise kiiruskonstandi määramiseks tavaliselt ainult kõvera esimest osa, mis järgneb ootefaasile ja lõpeb enne, kui on lagunenud umbes 50 % ainest. Kui uuritav aine laguneb, on orgaanilise
 14 C 
üldine jääkaktiivsus alati suurem kui lagunemata uuritava ainega 
seotud  14 C aktiivsus. Kui uuritava aine lagunemine on esimest 
järku reaktsioon ja CO  2 -ni mineraliseerub konstantne osa α, on  14 C 
kadumise kõvera (summaarne orgaaniline  14 C vs. aeg) algtõus 
võrdne α ja uuritava aine (täpsemalt, uuritava aine  14 C-märgisega 
osa) kontsentratsiooni kajastava kõvera tõusu korrutisega. Järelikult, kui kasutatakse orgaanilise
 14 C summaarse aktiivsuse mõõtmise tule ­
musi ilma parandusteta, on arvutatud lagunemise kiiruskonstant tege ­
likust väiksem. Mitmesugustel lihtsustavatel eeldustel põhinevaid meetodeid, kuidas mõõdetud radiokeemilise aktiivsuse järgi hinnata uuritava aine kontsentratsiooni, on kirjeldatud reas publikatsioonides 
(2, 9, 10, 11). Neid meetodeid on kõige lihtsam kasutada kiiresti 
lagundatavate ainete puhul.
 
2.2. TULEMUSTE TÕLGENDAMINE  
Kui selgub, et k ei olene lisatud aine kontsentratsioonist (st uuritava 
aine eri kontsentratsioonidel arvutatakse enam-vähem ühesugused k väärtused), siis võib järeldada, et see esimest järku kiiruskonstant 
tõesti kirjeldab seda reaktsiooni kasutatud katsetingimustes (uuritav 
aine, veeproov, katsetemperatuur). Kuivõrd saadud tulemust võib üldistada või ekstrapoleerida muudele süsteemidele, tuleb selgitada eksperdihinnanguga. Kui kasutatakse uuritava aine kõrget kontsen ­
tratsiooni ja lagunemine ei järgi esimest järku kineetikat, ei saa 
katseandmeid kasutada esimest järku kiiruskonstandi või vastava poolestusaja otseseks määramiseks. Uuritava aine kõrgel kontsentrat ­
sioonil saadud katseandmeid võib siiski kasutada mineraliseerumise 
üldmäära hindamiseks ja/või muundumissaaduste identifitseerimiseks 
ja kvantitatiivseks kirjeldamiseks.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Kui on teada, millise kiirusega toimuvad teised aine kadu põhjus ­
tavad protsessid peale biolagunemise (nt hüdrolüüs või lendumine), 
võib biolagunemise ligikaudse kiiruse hindamisel lahutada need kiirused katses mõõdetud üldkiirusest. Andmeid hüdrolüüsi kohta võib saada näiteks steriilsest kontrollkatsest või kõrgemal uuritava 
aine kontsentratsioonil tehtud paralleelkatsest.
 
14 CO 2 kaudset ja otsest määramist (punkt 1.8.9.4 ja 3. liide) võib 
kasutada ainult selleks, et mõõta uuritava aine mineraliseerumist 
CO 2 -ni. 14 C-märgisega uuritava aine kontsentratsiooni ja oluliste 
muundumissaaduste tekke analüütiliseks määramiseks võib kasutada radiokromatograafiat (radioloogilist õhukese kihi kromatograafiat) 
või kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat (punkt 1.8.9.4, kolmas 
lõik). Poolestusaega saab otse määrata juhul, kui lagunemisel ei teki olulisi muundumissaadusi (definitsiooni kohaselt loetakse oluli ­
seks muundumissaaduseks ainet, mille kontsentratsioon on vähemalt 
10 % uuritava aine algkontsentratsioonist). Kui sellised olulised 
muundumissaadused siiski tekivad, tuleb andmeid üksikasjalikult hinnata. Selleks võib olla vaja muundumissaadusi korduvalt määrata ja/või identifitseerida (vt punkt 1.8.9.5, esimene lõik), välja arvatud 
juhul, kui muundumissaaduste edasist käitumist saab kogemuste (nt 
lagunemisteed käsitlevate andmete) alusel põhjendatult hinnata. Kuna see, millises ulatuses uuritava aine süsinik muundub CO
 2 -ks, sõltub 
oluliselt uuritava aine ja muude substraatide kontsentratsioonist, 
katsetingimustest ja mikroobikooslusest, ei saa kõnesoleva katsega, 
erinevalt lahustunud orgaanilise süsiniku kao mõõtmisest, otse määrata lõplikku biolagunemist, kuid tulemus on respiromeetrilise 
katse tulemusega sarnane. Mineraliseerumise määr on järelikult 
lõpliku biolagunemise minimaalsest tasemest väiksem või sellega võrdne. Täielikuma pildi saamiseks lõplikust biolagunemisest (mine ­
raliseerumine ja sidumine biomassi) tehakse katse lõpus
 14 C faasi­
jaotuse analüüs (vt 1. liide). Tahkete osakeste puuli seotud  14 C 
jaguneb baktermassi seotud  14 C-ks ja orgaanilistele tahketele osakes ­
tele sorbeerunud  14 C-ks.  
2.3. KATSE VASTAVUS NÕUETELE  
Kui standardaine ei lagune eeldatud aja jooksul (aniliini ja naatrium ­
bensoaadi eeldatav lagunemisaeg on tavaliselt alla kahe nädala), on katse nõuetelevastavus kaheldav ja vajab tõendamist; teine võimalus 
on korrata katset uue veeprooviga. Käesoleva meetodi kontrollimisel 
seitsme Euroopa labori vahelises ISO võrdluskatses oli aniliini lagu ­
nemise kiiruskonstandi väärtus 20 °C juures pärast kohanemisfaasi vahemikus 0,3–1,7 ööpäev
 –1 , keskväärtus 0,8 ööpäev  –1 ja standard ­
hälve ± 0,4 ööpäev  –1 (t ½ = 0,9 ööpäeva). Ootefaas oli tavaliselt 1–7 
ööpäeva. Kontrollitud veeproovides registreeriti bakterbiomassi sisal ­
duseks 10  3 –10  4 kolooniaid moodustavat üksust ühes milliliitris. 
Toitainerikastes Kesk-Euroopa veeproovides oli lagunemiskiirus 
suurem kui Põhja-Euroopa oligotroofsetes veeproovides; see võib 
olla tingitud kas erinevast troofsusest või erinevustest varasemas kokkupuutumises keemiliste ainetega.
 
Radiomärgisega ainete korral peaks kogu määramissaagis (massibi ­
lanss) katse lõpus olema 90–110 %; märgiseta ainete korral peaks algfaasi määramissaagis katse alguses olema 70–110 %. Need saagi ­
sevahemikud on esitatud siiski üksnes sihtvahemikena ja neid ei tule 
kasutada katse nõuetele vastavuse kriteeriumina.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. KATSEPROTOKOLL  
Katseprotokollis märgitakse selgesti, kas tegemist on pelaagilise või 
hõljumikatsega; lisaks sellele esitatakse vähemalt järgmine teave.  
Uuritav aine ja standardaine (standardained):  
— uuritava aine ja standardaine tavanimetused, keemilised nime ­
tused (soovitatavalt IUPACi ja/või CASi nimetused), CASi 
numbrid, struktuurivalemid (radiomärgisega aine puhul näida ­
takse  14 C asukoht) ning olulised füüsikalis-keemilised omadused 
(vt punktid 1.5 ja 1.6);  
— muundumissaaduste identifitseerimise ja mõõtmise standarditena 
kasutatud ainete keemilised nimetused, CASi numbrid, struktuu ­
rivalemid (radiomärgisega aine puhul näidatakse  14 C asukoht) 
ning olulised füüsikalis-keemilised omadused;  
— uuritava aine ja standardaine puhtusaste (lisandid);  
— märgisega kemikaalide radiokeemiline puhtusaste ja eriaktiivsus 
(vajaduse korral).  
Pinnavesi:  
Võetud veeproovi kohta esitatakse vähemalt järgmised andmed:  
— proovivõtukoha asukoht ja kirjeldus, kaasa arvatud saastelugu 
(võimaluse korral);  
— proovivõtu kuupäev ja aeg;  
— toitainesisaldus (üldlämmastik, ammoonium, nitritid, nitraadid, 
üldfosfor, lahustunud ortofosfaat);  
— proovivõtu sügavus;  
— proovi väline iseloomustus (nt värvus ja hägusus);  
— lahustunud ja summaarne orgaaniline süsinik;  
— biokeemiline hapnikutarve;  
— proovi võtmisel kohapeal määratud temperatuur ja pH;  
— hapnikusisaldus või redokspotentsiaal (nõutav, kui ei ole ilmne, 
et tegemist on aeroobsete tingimustega);  
— soolsus või juhtivus (mere- või riimvee puhul);  
— hõljumisisaldus (häguse proovi puhul);  
— proovivõtu asukohta käsitlev muu asjakohane teave, mis oli teada 
proovivõtu ajal (nt andmed jõe voolu- või merehoovuse kiiruse kohta proovi võtmise ajal või varem, naabruses esinenud suured 
heited ja nende laad, proovivõtule eelnenud ilmastikutingi ­
mused);
 
ning järgmised mittekohustuslikud andmed:  
— mikroorganismide biomass (nt otse loendatud akridiinoranžiga 
värvunud rakkude arv või kolooniaid moodustavate üksuste arv);  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— anorgaaniline süsinik;  
— klorofüll a kontsentratsioon, mis on vetikate biomassi kajastav 
spetsiifiline näitaja.  
Hõljumikatse korral esitatakse lisaks veel järgmised andmed sette 
kohta:  
— setteproovi võtmise sügavus;  
— sette väline iseloomustus (värvunud, muda-, aleuriit- või liivsete);  
— lõimis (jämeteralise liiva, peeneteralise liiva, aleuriidi ja savi 
protsent);  
— hõljuvaine kuivmassi sisaldus, g/l; orgaanilise süsiniku üldsi ­
saldus või põletuskadu, mis on orgaanilise aine sisalduse näitaja;  
— pH;  
— hapnikusisaldus või redokspotentsiaal (nõutav, kui ei ole ilmne, 
et tegemist on aeroobsete tingimustega).  
Katsetingimused:  
— proovivõtust katseni möödunud ajavahemik, proovi hoidmine ja 
ettevalmistamine, katsekuupäevad;  
— lisatud uuritava aine kogus, kontsentratsioon katses ja standard ­
aine;  
— uuritava aine lisamise viis, kaasa arvatud lahusti kasutamine;  
— kasutatud pinnavee ja sademe maht ning iga proovivõtukorra 
puhul analüüsitud osaproovi maht;  
— kasutatud katsesüsteemi kirjeldus.  
Kui katse ei toimunud valguse juurdepääsuta, märgitakse hajuvalgus ­
tuse tingimused;  
— teave steriilsete kontrollkatsete ettevalmistamise kohta (autoklaa ­
vimise temperatuur, aeg ja kordade arv);  
— inkubatsioonitemperatuur;  
— analüüsimeetodid ja radiokeemilise mõõtmise meetodid, massi ­
bilansi kontrollimiseks ja faasijaotuse mõõtmiseks (kui mõõdeti) 
kasutatud meetodid.  
— paralleelkatsete arv.  
Tulemused:  
— saagis protsentides (vt punkt 1.7.1);  
— kasutatud analüüsimeetodite korratavus ja tundlikkus, kaasa 
arvatud avastamislävi ja mõõtmislävi (vt punkt 1.7.2);  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— kõik mõõtmistulemused (koos proovivõtuaegadega) ja arvutatud 
väärtused esitatakse tabelina ja lagunemiskõverad graafiliselt; iga 
uuritava kontsentratsiooni ja iga paralleelnõu jaoks esitatakse logaritmilise graafiku tõusu iseloomustav lineaarse korrelatsiooni koefitsient, hinnanguline ootefaasi kestus ning (võimaluse korral) 
esimest järku või pseudo-esimest järku kiiruskonstant ja vastav 
poollagunemisaeg (või poolestusaeg, t
 50 ); 
— asjaomased väärtused (ootefaasi kestus, lagunemise kiiruskons ­
tant, poollagunemisaeg või poolestusaeg, t  50 ) esitatakse üksikute 
paralleelkatsete tulemuste keskmisena;  
— lagunemiskõvera laadi ja uuritava aine kontsentratsiooni võima ­
liku mõju alusel liigitatakse katsesüsteem kohanenud või koha ­
nemata süsteemiks;  
— lõpliku massibilansi kontrolli ja faasijaotuse mõõtmiste tule ­
mused;  
— mineraliseerunud  14 C osa ja esmase lagunemise lõpptase (kui see 
määrati analüüsiga);  
— (vajaduse korral) lisatud ainete ja oluliste muundumissaaduste 
identifitseerimisandmed, molaarne kontsentratsioon ja protsent 
(vt punkt 1.8.9.5, esimene lõik);  
— oletatav muundumistee (vajaduse korral);  
— tulemuste arutelu.  
4. KIRJANDUS  
1) OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water – 
Simulation Biodegradation Test.  
2) ISO/DIS 14592–1 (1999) Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions.  
3) Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in 
soil. 
4) Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments.  
5) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
6) ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determina ­
tion of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon 
(DOC).  
7) ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the preparation 
and treatment of poorly water-soluble organic compounds for 
the subsequent evaluation of their biodegradability in an 
aqueous medium.  
8) OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Assess ­
ment. No 22 (to be published summer 2000).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9) Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394–401.  
10) Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274–283.  
11) ISO/CD 14592–1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface 
water/sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
1. liide  
14 C jaotus faaside vahel  
Lisaks tavalistele orgaanilise  14 C jääkaktiivsuse mõõtmistele määratakse meetodi 
kontrollimiseks ka massibilanss, mille puhul mõõdetakse eraldunud  14 CO 2 otse 
pärast selle püüdmist absorberisse (vt 3. liide).  14 CO 2 eraldumine on biolagune ­
mise otsene tõend, kuna abiootilisel lagunemisel või muude kaomehhanismide, 
nagu lendumise või sorptsiooni korral seda ei esine. Kasulikku lisateavet biola ­
gunemise kohta annab mõõtmine, kuidas summaarne orgaaniline süsinik on jaotunud lahusefaasi (lahustunud orgaanilise
 14 C aktiivsus) ja osakestefaasi 
(tahkete osakestega seotud orgaanilise  14 C aktiivsus) vahel; tahked osakesed 
eraldatakse membraanfiltrimise või tsentrifuugimisega. Tahkete osakestega seotud orgaanilise
 14 C aktiivsusesse annavad panuse mikroobide biomassile ja muudele 
tahketele osakestele sorbeerunud uuritav aine ja uuritavast ainest pärinev süsinik, 
mida on kasutatud uue rakumaterjali sünteesiks ja seotud tahkete osakestena 
esineva biomassi fraktsiooni. Lahustunud orgaaniline  14 C määratakse biolagune ­
mise lõpus (kõveral lagunemine  vs. aeg esineva platoo järgi).  
Et valitud proovis määrata  14 C jääkaktiivsuse jaotus faaside vahel, filtritakse 
proov läbi membraanfiltri poori suurusega 0,22 või 0,45 μm, mis on valmistatud 
uuritavat ainet praktiliselt mitteadsorbeerivast materjalist (võib sobida polükarbo ­
naatfilter). Kui uuritava aine sorptsioon filtrile (kontrollitakse enne katset) on nii tugev, et seda ei saa jätta arvestamata, võib filtrimise asemel kasutada suure kiirendusega tsentrifuugimist (2 000 g; 10 min).
 
Filtraati või tsentrifugaati käideldakse 3. liites filtrimata proovi puhul kirjeldatud 
viisil. Membraanfilter lahustatakse sobivas stsintillatsioonivedelikus ja aktiivsus loendatakse tavalisel viisil, kusjuures kasutatakse kas ainult välisstandardi suhte meetodil saadud kustumisparandit või proovi oksüdeerijat. Tsentrifuugimise 
korral resuspendeeritakse tahkete osakeste sade 1–2 ml destilleeritud vees ja 
asetatakse stsintillatsioonipudelisse. Tsentrifuugitopsi pestakse kaks korda 1 ml destilleeritud veega ja pesuveed lisatakse stsintillatsioonipudelisse. Vajaduse korral võib hõljumi fikseerida vedelikstsintillatsioonloendamiseks ettenähtud 
geeli.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
2. liide  
Poolpidev meetod  
Raskesti lagunevate ainete piisavaks lagundamiseks võib olla vajalik kuudepik ­
kune inkubeerimine. Kui esmase veeproovi omaduste säilitamiseks katsehõljumit ei uuendata, ei peaks katse kestus ületama tavaliselt 60 ööpäeva. Kui uuritava 
aine lagunemine algab esimese 60 ööpäeva jooksul, võib katset siiski pikendada 
kuni 90 ööpäevani katsehõljumit uuendamata.
 
Mitmesuguste kaomehhanismide ning veeproovis leiduvate asendamatute toitai ­
nete ja esmaste süsiniksubstraatide ammendumise tõttu võib pika inkubatsioo ­
niaja jooksul väheneda mikroobikoosluse mitmekesisus. Sellepärast soovitatakse 
aeglaselt lagunevate ainete lagunemiskiiruse nõuetekohaseks määramiseks kasu ­
tada poolpidevat katset. Kui kogemuste põhjal võib eeldada, et 20 % aine lagu ­
nemiseks on proovi vaja inkubeerida kolm kuud, tuleb katset alustada poolpi ­
devas režiimis. Kui katset on alustatud portsrežiimis ja umbes 60 ööpäevaga ei 
ole nõutavat lagunemise määra saavutatud, võib hariliku portsrežiimi asendada 
poolpideva režiimiga. Kui on registreeritud oluline lagunemine (> 20 %), võib poolpideva režiimi peatada ja jätkata katset portsrežiimis.
 
Poolpideva katse puhul vahetatakse iga kahe nädala tagant umbes üks kolmandik 
katsehõljumi mahust värskelt võetud veega, millele on lisatud uuritavat ainet 
algkontsentratsioonini. Ka mittekohustusliku hõljumikatse korral lisatakse vahe ­
tusveele setet algkontsentratsioonini (0,01–1 g/l). Hõljumikatse puhul on oluline, et ka veevahetuse jooksul säiliks täielikult suspendeeritud süsteem ning tahke 
aine ja vee viibeajad oleksid samad, vastasel juhul läheks kaduma taotletud 
sarnasus homogeense, fikseeritud faasideta veesüsteemiga. Sellepärast tuleks poolpideva režiimi kasutamisel valida suspendeeritud sette kontsentratsioon pigem selle vahemiku madalamas osas.
 
Uuritava aine lisamine ettenähtud viisil tähendab, et katsesuspensiooni osalisel 
uuendamisel ei ületata uuritava aine algkontsentratsiooni ja järelikult välditakse 
kõrge uuritava aine kontsentratsiooni puhul sageli esinevat kohanemisfaasi. Kuna katse käigus toimub nii reinokuleerimine kui ka ammendatud toitainete ja esmaste substraadivarude täiendamine, taastatakse algne mikroobikoosluse 
mitmekesisus ja katset võib põhimõtteliselt pikendada lõpmatult. Poolpideva 
režiimi kasutamisel on oluline silmas pidada, et uuritava aine jääkkontsentrat ­
sioonis tuleb teha parandid, mis arvestavad iga veevahetusega lisatud ja eemal ­
datud uuritava aine koguseid. Vähesorbeeruva aine puhul ei ole vaja teha vahet 
lahustunud uuritava aine kontsentratsiooni ja uuritava aine üldkontsentratsiooni 
vahel. Ainete puhul, mille log K
 ow < 3 (ja tegemist on neutraalse lipofiilse 
ühendiga), on ettenähtud tingimustes (tahke aine sisaldus 0,1–1 g/l) sorptsioon tähtsusetu (< 5 %). Seda selgitab järgmine arvutusnäide. Tahke aine sisaldus 0,1 
g/l vastab süsiniku sisaldusele ligikaudu 10 mg/l (süsiniku osa, f
 C = 0,01). 
Eeldame, et  
uuritava aine log K  ow = 3, 
K oc = 0,42 × K  ow , 
jaotuskoefitsient K  d = f C × K  oc , 
järelikult avaldub üldkontsentratsiooni lahustunud fraktsioon (C-vesi (C  w )/C-üld 
(C t )) järgmiselt:  
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 
0,1 × 10  –3 ) = 0,999.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
3. liide  
14 CO  2 määramine  
14 CO  2 kaudne määramine  
Kui uuritav aine ei ole lenduv ega muundu lenduvateks muundumissaadusteks, 
on standardsete mõõtmiste korral kaudne meetod tavaliselt kõige väiksemat 
ajakulu nõudev ja kõige täpsem. Filtrimata 5-milliliitrised proovid pannakse liht ­
salt stsintillatsioonipudelitesse. Sobiv proovi algaktiivsus on 5 000 – 10 000 lagunemist minutis (80–170 Bq) ja minimaalne algaktiivsus umbes 1 000 lagu ­
nemist minutis. Pärast 1–2 tilga kontsentreeritud H
 3 PO 4 või HCl lisamist kesk ­
konna hapestamiseks pH-ni 2–3 eraldatakse CO  2 . CO  2 eraldamiseks võib barbo ­
teerida õhku läbi proovi ligikaudu ½–1 tunni jooksul. Teine võimalus CO  2 eral­
damiseks on loksutada proovi tugevasti 1–2 tundi (mikroplaatloksutil) või loksu ­
tada mõõdukalt hommikuni. CO  2 eraldumise täielikkust on vaja kontrollida 
(selleks pikendatakse barboteerimise või loksutamise aega). Seejärel lisatakse 
veeproovide puhul loendamiseks sobiv stsintillatsioonivedelik, proov homogeni ­
seeritakse keerissegistil ja määratakse radioaktiivsus vedelikstsintillatsiooniloen ­
duse abil, millest lahutatakse pimekatses leitud taustaktiivsus (F  B ). Kui katsevesi 
ei ole väga tugevasti värvunud ja tahkete osakeste sisaldus ei ole ülemäära suur, 
on kustumine kõigi proovide puhul tavaliselt ühetaoline ja piisab välisstandardi abil leitud kustumisparandist. Kui katsevesi on tugevasti värvunud, võib kustu ­
misparandi leidmiseks olla vajalik sisestandardi lisamine. Suure tahkete osakeste 
sisalduse korral võib homogeense lahuse või geeli saamine olla võimatu või 
kustumine võib erinevates proovides olla väga erinev. Sellisel juhul võib kasu ­
tada järgmist suspensioonide uurimiseks mõeldud loendusmeetodit.
 14 CO 2 kaud­
seks mõõtmiseks hõljumikatses eraldatakse faasid, tsentrifuugides 10 ml 
katsevee/katsehõljumi homogeenset proovi sobival kiirendusel (40 000 m/s  2 , 
15 minutit). Veefaasi käideldakse eespool kirjeldatud viisil.  14 C aktiivsuse määra ­
miseks tahkete osakeste faasis (tahkete osakestega seotud orgaanilise  14 CO 2 
aktiivsus) resuspendeeritakse sade väikeses koguses destilleeritud vees, kantakse 
suspensioon üle stsintillatsioonipudelitesse ja lisatakse geeli moodustav stsintil ­
latsioonivedelik (selleks on müügil spetsiaalsed stsintillatsioonivedelikud). Olene ­
valt tahkete osakeste laadist (nt orgaanilise aine sisaldusest) võib proovi digeree ­
rida koesolubilisaatoriga hommikuni, homogeniseerida keerissegistil ja lisada 
seejärel stsintillatsioonivedelik. Tahkete osakestega seotud orgaanilise  14 CO 2 
aktiivsuse määramiseks võib sademe ka põletada hapniku liias proovi oksüdeerija 
juuresolekul. Sellisel juhul tuleb alati kasutada sisestandardit, kusjuures kustu ­
misparandite arvestamiseks võib olla vaja lisada sisestandard igale proovile 
eraldi.  
14 CO  2 otsemääramine  
Kui eraldunud  14 CO 2 määratakse otse, tuleb katseks ette valmistada rohkem 
nõusid ja võtta iga mõõtepunkti puhul prooviks ühe katsenõu kogu sisu, hapes ­
tada see pH-ni 2–3 ja koguda  14 CO 2 siseabsorberisse (pannakse igasse katse ­
nõusse katse alguses) või välisabsorberisse. Absorbeeriva keskkonnana võib kasutada leelist (1 N NaOH lahus või NaOH graanulid), etanoolamiini või mõnda etanoolamiini baasil valmistatud müügil olevat absorbenti.
 14 CO 2 otse­
mõõtmise korral peavad katsenõud olema suletud butüülkummist septumitega.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Joonis 1a  
Naturaalses teljestikus (jääkaktiivsus  vs. aeg) esitatud katseandmete näide
  
Joonis 1b  
Poollogaritmilises teljestikus (naturaallogaritm jääkaktiivsusest  vs.  aeg) esitatud 
katseandmete näide
  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  LEMLE  LEMNA  SP. KASVU PIDURDAMISE KATSE  
1. METOODIKA  
Käesolev metoodika on samaväärne standardiga OECD TG 221 (2006) (1). ELi 
asutuste hulgas on jõutud laialdasele kokkuleppele, et intensiivse värvusega ühen ­
dite puhul on lemle kasvu pidurdamise katse sobiv asendusmeetod vetikal põhi ­
nevale katsele (2, 3).  
1.1. SISSEJUHATUS  
Käesolev metoodika on ette nähtud ainete mürgise mõju hindamiseks 
lemmeldel, perekonda  Lemna  kuuluvatel mageveetaimedel. See 
põhineb senistel juhenditel (4, 5, 6, 7, 8, 9), kuid neisse on tehtud 
muudatusi, mis kajastavad viimaste uuringute ja rea põhiküsimuste 
üle peetud nõupidamiste tulemusi. Soovitatav meetod on valideeritud rahvusvahelise laboratooriumidevahelise võrdluskatse abil (10).
 
Käesolevas metoodikas kirjeldatakse mürgisuse kontrollimist küür ­
lemlel ( Lemna gibba ) ja väiksel lemlel ( Lemna minor ), mida on 
ulatuslikult uuritud ja mis on eespool viidatud standardite kohased 
katseobjektid. Suure fenotüübilise varieeruvuse tõttu on lemle liikide (Lemna  spp.) taksonoomia keeruline. Kuigi lemle tundlikkuses 
mürgiste ainete suhtes võib esineda geneetilist varieeruvust, on 
andmeid selle varieeruvusallika kohta praegu liiga vähe selleks, et 
soovitada käesolevas metoodikas kasutamiseks mõnda konkreetset klooni. Tuleb märkida, et katset ei tehta puhaskultuuriga, kuid teata ­
vatel katseetappidel rakendatakse meetmeid, et saastumine muude 
organismidega oleks minimaalne.
 
Kirjeldatakse katse üksikasju uuendatava katselahuse (poolstaatilise 
ja läbivoolukatse) ning mitteuuendatava katselahuse (staatilise katse) korral. Olenevalt katsete eesmärgist ja eeskirjadest soovitatakse kaaluda poolstaatilise või läbivoolumeetodi kasutamist neil juhtudel, 
kui tegemist on näiteks ainetega, mis kaovad lahusest kiiresti lendu ­
mise, fotolagunemise, sadestumise või biolagunemise tõttu. Edasised juhendid on esitatud publikatsioonis (11).
 
1.2. MÕISTED  
Käesolevas metoodikas kasutatakse järgmisi mõisteid ja lühendeid.  
Biomass  on populatsiooni elusaine kuivmass. Käesoleva meetodi 
puhul mõõdetakse tavaliselt biomassi asendavaid näitajaid, nagu tallusjate võsude arv või pindala, seega osutatakse mõiste „biomass” kasutamisel ka nendele asendusnäitajatele.
 
Kloroos  on tallusja võsu koe kolletumine.  
Kloon  on organism või rakk, mis on tekkinud individuaalsest orga ­
nismist mittesugulise paljunemise tulemusena. Samast kloonist päri ­
nevad isendid on geneetiliselt identsed.  
Koloonia  on üksteisega liitunud tallusjate ema- ja tütarvõsude 
kogum (tavaliselt 2–4 tallusjat võsu). Mõnikord nimetatakse koloo ­
niat ka taimeks.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x on katsekeskkonnas lahustatud uuritava aine kontsentratsioon, 
mille puhul lemle kasv pidurdub x % (nt 50 %) võrra, kui see taim 
puutub ainega kokku teatava ajavahemiku jooksul (kui kokkupuu ­
teaeg erineb täielikust ehk tavaliselt katsetes kasutatavast kokkupuu ­
teajast, tuleb selle pikkus täpselt märkida). Kasvukiirusega seotud EC 
väärtuse ja saagisega seotud EC väärtuse üheseks tähistamiseks kasu ­
tatakse vastavalt sümboleid E  r C ja E  y C, mille järel märgitakse kasu ­
tatud mõõtemuutuja, nt E  r C (tallusjate võsude arv).  
Läbivoolukatse  on katse, mille käigus katselahus pidevalt vahetub.  
Tallusjas võsu  on individuaalne lehetaoline lemlestruktuur. See on 
väikseim paljunemisvõimeline üksus, st isend.  
Puhetumus  osutab kõverdunud või puhetunud tallusjale võsule.  
Kasv  on mõõdetava suuruse (nt tallusjate võsude arv, kuivmass, 
märgmass, tallusjate võsude pindala) suurenemine katse ajal.  
Kasvukiirus (keskmine kasvu erikiirus)  on biomassi logaritmiline 
suurenemine uuritava ainega kokkupuute ajal.  
Madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon  on madalaim 
uuritud kontsentratsioon, mille puhul on näidatud, et teatava kokku ­
puuteaja jooksul pidurdab uuritav aine kontrolliga võrreldes statisti ­
liselt oluliselt (p < 0,05) katseorganismi kasvu. Kõik madalaimast avastatava mõjuga kontsentratsioonist kõrgemad kontsentratsioonid 
peavad avaldama sama tugevat või tugevamat kahjulikku mõju kui 
madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon. Kui neid kahte tingi ­
must ei ole võimalik täita, tuleb anda täielik selgitus, kuidas valiti madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon (ja ka avastatava 
mõjuta kontsentratsioon).
 
Mõõtemuutuja  on mis tahes liiki muutuja, mida mõõdetakse, et ühe 
või mitme eri kostemuutuja kasutamisega väljendada katsetulem. Käesoleva meetodi puhul on mõõtemuutujad tallusjate võsude arv, tallusjate võsude pindala, elusmass ja kuivmass.
 
Monokultuur  on ühte liiki taimede kultuur.  
Nekroos  on surnud (nt valge või hügrofaanne) tallusja võsu kude.  
Avastatava mõjuta kontsentratsioon  on madalaimast avastatava 
mõjuga kontsentratsioonist allapoole järgmine uuritud kontsentrat ­
sioon.  
Fenotüüp  on organismi vaadeldavate tunnuste kogum, mille määrab 
tema geenide ja keskkonna vastastikune mõju.  
Kostemuutujad  on toksilisuse hindamiseks kasutatavad muutujad, 
mis tuletatakse biomassi kajastavatest mõõtemuutujatest mitmesu ­
guste arvutuste abil. Käesoleva meetodi puhul on kasvukiirus ja saagis kostemuutujad, mis tuletatakse sellistest mõõtemuutujatest 
nagu tallusjate võsude arv, nende pindala, elusmass või kuivmass.
 
Poolstaatiline (uuendatava lahusega) katse  on katse, mille käigus 
lahust perioodiliselt, kindla ajavahemiku järel vahetatakse.  
Staatiline katse  on katse, mille käigus lahust ei uuendata.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Katsetulem  on katse eesmärgile vastav üldise teguri muutus uuritava 
kemikaali mõjul võrreldes kontrollkultuuriga. Käesoleva meetodi 
puhul on katsetulem kasvu pidurdumine, mida võib väljendada erine ­
vate ühel või mitmel mõõtemuutujal põhinevate kostemuutujate abil.  
Katsekeskkond  on täissünteetiline toitelahus, millel kasvatatakse 
katsetaimi uuritava ainega kokkupuutumise ajal. Tavaliselt lahusta ­
takse uuritav aine katsekeskkonnas.  
Saagis  on kokkupuuteaja lõpus ja alguses leitud mõõtemuutuja väär ­
tuste vahe, mis väljendab katse kestel toimunud biomassi suurene ­
mist.  
1.3. KATSE PÕHIMÕTE  
Eksponentsiaalselt kasvavatel lemmelde perekonda ( Lemna ) kuulu­
vate taimede monokultuuridel lastakse kokku puutuda uuritava ainega erinevates kontsentratsioonides seitsme ööpäeva jooksul. Katse eesmärk on kvantitatiivselt kirjeldada uuritava aine mõju vege ­
tatiivsele kasvule katseaja jooksul, võttes aluseks valitud mõõtemuu ­
tuja hinnangud. Peamine mõõtemuutuja on tallusjate võsude arv. Kuna mõni aine võib mõjutada muid mõõtemuutujaid rohkem kui tallusjate võsude arvu, mõõdetakse ka vähemalt ühte täiendavat 
mõõtemuutujat (tallusjate võsude üldpindala, kuivmass või elus ­
mass). Uuritava aine mõju kvantitatiivseks iseloomustamiseks võrrel ­
dakse kasvu uuritavas lahuses kasvuga kontroll-lahuses ja määratakse kontsentratsioon, mis põhjustab kasvukiiruse pidurdumise teatava 
x % (nt 50 %) võrra; selle kontsentratsiooni tähis on EC
 x (nt EC  50 ). 
Katsetulem on kasvu pidurdumine, kusjuures kasvu väljendatakse 
mõõtemuutuja väärtuse logaritmi suurenemisena kokkupuuteaja 
jooksul (keskmine kasvu erikiirus). Katselahuste seerias määratud 
keskmistest kasvu erikiirustest leitakse kontsentratsioon, mis vähendab kasvukiirust teatava protsendimäära x võrra (näiteks 50 %); selle kontsentratsiooni tähis on E
 r C x (nt E  r C 50 ). 
Lisaks kasutatakse käesoleva meetodi korral kostemuutujana veel 
saagist, mida võib vaja olla teatavates riikides kehtestatud erieeskir ­
jade täitmiseks. Saagis on kokkupuuteaja lõpus ja alguses määratud mõõtemuutujate väärtuste vahe. Lähtudes katselahuse seeriate puhul 
registreeritud saagistest, arvutatakse kontsentratsioon, mis põhjustab 
saagise vähenemise teatava x % (nt 50 %) võrra; selle kontsentrat ­
siooni tähis on E
 y C x (nt E  y C 50 ). 
Lisaks sellele võib statistiliselt määrata madalaima avastatava mõjuga 
kontsentratsiooni ja ka avastatava mõjuta kontsentratsiooni.  
1.4. ANDMED UURITAVA AINE KOHTA  
Uuritava aine sisalduse määramiseks katsekeskkonnas peab olema 
piisavalt tundlik analüüsimeetod.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Katsetingimuste valimisel võib olla kasulik teada järgmisi uuritavat 
ainet iseloomustavaid näitajaid: struktuurivalem, puhtusaste, lahus ­
tuvus vees, püsivus vees, valguskindlus, pK  a , K ow , aururõhk ja biola ­
gundatavus. Lahustuvust vees ja aururõhku võib kasutada Henry konstandi arvutamiseks, mis näitab, kas katse ajal on tõenäoline 
märkimisväärne uuritava aine kadu. See aitab selgitada, kas aine 
kao ärahoidmiseks on vaja erimeetmeid. Kui andmeid aine lahustu ­
vuse ja püsivuse kohta on vähe, soovitatakse hinnata neid omadusi katsetingimustes, s.o sama toitelahuse, temperatuuri ja valgusrežiimi 
puhul nagu katseski.
 
Kui katsekeskkonna pH reguleerimine on eriti tähtis, nt hüdrolüüti ­
liselt ebapüsivate metallide või muude ainete mõju uurimisel, soovi ­
tatakse katselahusele lisada puhvrit (vt punkt 1.7.4, esimene lõik). 
Täiendavad juhised selliste ainete mõju uurimiseks, mille füüsikalis- keemilised omadused raskendavad seda uurimist, on esitatud publi ­
katsioonis (11).
 
1.5. STANDARDAINE  
Katse korrektse läbiviimise kontrollimiseks võib kasutada rahvusva ­
helistes võrdluskatsetes (10) kasutatavaid standardaineid, näiteks 3,5- 
diklorofenooli. Kontrolli standardainega soovitatakse teha vähemalt 
kaks korda aastas või, kui katseid tehakse harvemini, siis paralleelselt uuritava aine toksilisuse määramisega.
 
1.6. KATSE VASTAVUS NÕUETELE  
Et katse vastaks nõuetele, peab tallusjate võsude arvu kahekordistu ­
mise aeg kontrollkultuuride puhul olema alla 2,5 ööpäeva (alla 60 tunni), mis vastab ligikaudu seitsmekordsele kasvule seitsme ööpäeva jooksul ja keskmisele kasvu erikiirusele 0,275 ööpäev
 –1 . 
Käesolevas metoodikas kirjeldatud toitelahuste ja katsetingimuste 
puhul võib seda kriteeriumi täita staatilise katse tingimustes (8). Oletatavalt saab seda kriteeriumi täita ka poolstaatilise ja läbivoolu ­
katse tingimustes. Kahekordistumisaja arvutamist on selgitatud 
punktis 2.1.
 
1.7. MEETODI KIRJELDUS  
1.7.1.  Seadmed  
Kõik katsekeskkonnaga kokku puutuvad seadmed peavad olema 
valmistatud klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. 
Kultuuride kasvatamiseks ja katseteks kasutatavad klaasnõud peavad olema steriilsed ja puhastatud keemilistest saasteainetest, mis võiksid leostuda katsekeskkonda. Katsenõud peavad olema piisavalt laiad, et 
kontrollnõudes kasvavad eri kolooniate tallusjad võsud katse lõpus ei 
hakkaks üksteist katma. Ei ole tähtis, kas juured puudutavad katsenõu põhja, kuid on soovitatav, et nõu sügavus oleks vähemalt 20 mm ja maht vähemalt 100 ml. Kui need tingimused on täidetud, 
ei ole nõu tüübi valik tähtis. Sobivad nii nõuetekohaste mõõtmetega 
keeduklaasid, kristallisaatorid kui ka klaasist Petri tassid. Katsenõud peavad olema kaetud, et vähendada keskkonna aurumist ja juhus ­
likku saastumist, kuid samal ajal peab olema tagatud vajalik õhuva ­
hetus. Nõuetekohased katsenõud ja eriti nende kaaned ei tohi varjata 
valgust või muuta selle spektrit.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Kultuure ja katsenõusid ei hoita koos. Sellepärast on kõige parem 
kasutada eraldi fütotrone, inkubaatoreid või kasvukambreid. Valguse 
intensiivsus ja temperatuur peavad olema reguleeritavad ja need hoitakse konstantsed (vt punkt 1.7.8).
 
1.7.2.  Katseorganismid  
Käesolevas katses kasutatakse katseorganismina küürlemmelt ( Lemna 
gibba ) või väikest lemmelt ( Lemna minor ). Mürgisuse katsetes kasu ­
tatavate lemleliikide lühikirjeldus on esitatud 1. liites. Taimmaterjali 
võib saada kultuuride kollektsioonist, teisest laborist või loodusest. Loodusest kogutud materjali kasvatatakse enne kasutamist vähemalt kaheksa nädalat kultuuris samas toitelahuses, mida kasutatakse 
katsetes. Loodusliku lähtekultuuri kogumiskohta ei tohi mõjutada 
ilmsed saasteallikad. Teisest laborist või kultuuride kollektsioonist saadud taimmaterjali kasvatatakse enne kasutamist samal viisil vähe ­
malt kolm nädalat. Taimmaterjali allikas ning kasutatud liik ja kloon 
(kui see on teada) märgitakse katseprotokolli.
 
Tuleb kasutada monokultuure, mis ei ole nähtavalt saastatud muude 
organismidega, nagu vetikad või algloomad. Väikese lemle,  L. 
minor ’i terve taim moodustab 2–5 tallusjast võsust koosneva 
koloonia; küürlemle,  L. gibba  terve koloonia võib koosneda kuni 
seitsmest tallusjast võsust.  
Katses kasutatavate taimede kvaliteet ja ühetaolisus mõjutavad 
märkimisväärselt katsetulemust, sellepärast tuleb need valida hooli ­
kalt. Kasutatakse noori kiirekasvulisi taimi, millel pole nähtavaid kahjustusi või värvidefekte (kloroos). Hea kvaliteediga kultuuris on rohkesti vähemalt kahest tallusjast võsust koosnevaid kolooniaid. 
Üksikute tallusjate võsude rohkus osutab keskkonnastressile (nt 
toitainete vaegus); sellisest kultuurist saadud taimmaterjali ei tohi katses kasutada.
 
1.7.3.  Kasvatamine  
Kultuuri hooldamissageduse vähendamiseks (nt kui teatava aja 
jooksul ei kavandata katseid  Lemna ’ga) võib kultuure hoida vähen ­
datud valgustatuse ja madala temperatuuri (4–10 °C) juures. Kasva ­
tamise üksikasjad on esitatud 2. liites. Vetikate või muude organis ­
midega saastumise tunnuste ilmnemisel tuleb lemle tallusjate võsude 
osaproov pindmiselt steriliseerida ja seejärel üle kanda värskesse 
toitelahusesse (vt 2. liide). Ülejäänud saastunud kultuur visatakse sel juhul ära.
 
Vähemalt seitse päeva enne katset kantakse piisav arv kolooniaid 
aseptiliselt värskesse steriilsesse toitelahusesse ja neid kasvatatakse katsetingimustes 7–10 ööpäeva jooksul.
 
1.7.4.  Katsekeskkond  
Väikese lemle ja küürlemle puhul soovitatakse kasutada allpool 
kirjeldatud toitelahuseid. pH-d reguleeriva puhvri lisamist toitelahu ­
sesse tuleb hoolikalt kaaluda, kui oletatakse, et puhver võib reagee ­
rida uuritava ainega ja mõjutada toksilisuse avaldumist (väikese lemle toitelahusesse lisatakse 4-morfoliinpropaansulfoonhapet, CASi nr 1132–61–2; EINECSi nr 214–478–5, küürlemle toitelahusesse 
lisatakse NaHCO
 3 ). Võib kasutada ka Steinbergi toitelahust (12), 
kui nõuetele vastavuse kriteeriumid on täidetud.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Väikese lemle kasvatamiseks ja sellega katsete tegemiseks soovita ­
takse kasutada Rootsi standardiga (SIS) lemle kasvatamiseks ette 
nähtud toitelahuse modifikatsiooni. Selle toitelahuse koostis on esitatud 3. liites.
 
Küürlemle kasvatamiseks ja sellega katsete tegemiseks soovitatakse 
kasutada 3. liites kirjeldatud toitelahust 20X-AAP.  
Väikese lemle ja küürlemle puhul võib kasutada ka 3. liites kirjel ­
datud Steinbergi toitelahust, kui nõuetele vastavuse kriteeriumid on 
täidetud.  
1.7.5.  Katselahused  
Katselahused valmistatakse tavaliselt põhilahuse lahjendamise teel. 
Uuritava aine põhilahus valmistatakse tavaliselt aine lahustamisega 
toitelahuses.  
Tavaliselt ei tohi uuritava aine kõrgeim kontsentratsioon ületada aine 
lahustuvust vees katsetingimustes. Tuleb veel silmas pidada, et lemle liigid ujuvad pinnal ja võivad kokku puutuda vee ja õhu piirpinnale koguneva ainega (nt vees vähelahustuvad, hüdrofoobsed või pindak ­
tiivsed ained). Sel juhul puutub lemle kokku mitte lahuses oleva 
materjali kontsentratsiooniga, vaid see võib – olenevalt uuritava aine omadustest – olla kõrgem selle aine lahustuvusest vees. Vees vähelahustuva aine puhul võib olla vaja valmistada selle aine kont ­
sentreeritud põhilahus või dispersioon, kasutades orgaanilist lahustit 
või dispergeerivat ainet, et hõlbustada täpsete uuritava aine koguste lisamist katsekeskkonda ja soodustada aine lahustumist või pihustu ­
mist. Tuleb teha kõik sellise materjali kasutamise vältimiseks. Abila ­
husti või dispergeeriv aine ise ei tohi olla fütotoksiline. Tavaliselt kasutatavad lahustid, mis kuni kontsentratsioonini 100 μl·l
 –1 ei ole 
fütotoksilised, on näiteks atsetoon ja dimetüülformamiid. Kui kasu ­
tatakse lahustit või dispergeerivat ainet, peab selle lõppkontsentrat ­
sioon, mis märgitakse katseprotokolli, olema võimalikult madal (≤ 100 μl·l
 –1 ) ning kõigi katse- ja kontrollkultuuride puhul tuleb 
kasutada lahusti või dispergeeriva aine ühesugust kontsentratsiooni. 
Täiendavad juhised dispergeeriva aine kasutamise kohta on esitatud 
publikatsioonis (11).  
1.7.6.  Katse- ja kontrollrühmad  
Uuritava aine sobivate kontsentratsioonide valimiseks peaks eelne ­
valt näiteks mõjuvahemiku hindamise katsega välja selgitama, kui mürgine see aine on lemlele. Lõpliku katse tegemisel kasutatakse tavaliselt vähemalt viit geomeetrilise jadana järjestatud kontsentrat ­
siooni. Uuritavate kontsentratsioonide jada kordaja ei peaks üldiselt 
olema suurem kui 3,2, kuid lameda kontsentratsiooni-mõju kõvera korral võib kordaja siiski olla suurem. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleb seda põhjendada. Iga uuritava kontsen ­
tratsiooni puhul kasutatakse vähemalt kolme paralleelkultuuri.
 
Uuritavate kontsentratsioonide vahemiku valimisel (mõjuvahemiku 
hindamise katse ja lõpliku toksilisuskatse puhul) tuleb arvestada järg ­
mist. ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— EC  x määramisel peaks EC  x väärtus olema uuritavate kontsentrat ­
sioonide vahemikus, et tagada sobiv usaldusnivoo. Näiteks EC  50 
määramisel peab kõrgeim uuritav kontsentratsioon olema kõrgem 
kui EC  50 väärtus. Kui EC  50 väärtus jääb väljapoole uuritavate 
kontsentratsioonide vahemikku, on asjaomased usaldusvahe ­
mikud laiad ja lähendatud mudeli sobivust katseandmetega on 
raske statistiliselt hinnata.  
— Kui eesmärk on madalaima avastatava mõjuga kontsentratsiooni 
ja ka avastatava mõjuta kontsentratsiooni määramine, peab mada ­
laim uuritav kontsentratsioon olema nii madal, et kasv ei oleks 
oluliselt aeglasem kui kontrollkultuuris. Peale selle peab kõrgeim uuritav kontsentratsioon olema nii kõrge, et kasv oleks oluliselt aeglasem kui kontrollkultuuris. Kui see nii ei ole, tuleb katset 
korrata teise kontsentratsioonivahemikuga (kui kõrgeim uuritav 
kontsentratsioon ei ole juba võrdne lahustuvuse või kõrgeima nõutava piirkontsentratsiooniga, näiteks 100 mgl
 –1 ). 
Igas katses tehakse ka kontrollkultuurid, mille toitelahus, tallusjate 
võsude ja kolooniate arv, keskkonnatingimused ning määramiskatsed on samad kui katsenõude puhul, kuid millele ei ole lisatud uuritavat ainet. Kui kasutatakse abilahustit või dispergeerivat ainet, tuleb lisaks 
teha kontrollkultuur, milles lahusti või dispergeeriva aine kontsentrat ­
sioon on sama kui uuritavat ainet sisaldavates nõudes. Paralleelsete kontrollnõude (ja vajaduse korral lahustit sisaldavate kontrollnõude) arv peab olema vähemalt võrdne iga kontsentratsiooni korral kasu ­
tatavate nõude arvuga või paremal juhul sellest kaks korda suurem.
 
Kui avastatava mõjuta kontsentratsiooni määrata ei ole vaja, võib 
katseplaani muuta nii, et suurendatakse uuritavate kontsentratsioo ­
nide arvu ja vähendatakse paralleelkultuuride arvu ühe kontsentrat ­
siooni kohta. Kontrollkultuure peab siiski olema vähemalt kolm.  
1.7.7.  Kokkupuude uuritava ainega  
Aseptilistes tingimustes kantakse inokulum-kultuurist juhuvaliku alusel 
paigutatud katsenõudesse üle 2–4 nähtavast tallusjast võsust koosnevad 
kolooniad. Iga katsenõu peaks sisaldama kokku 9–12 tallusjat võsu. 
Tallusjate võsude ja kolooniate arv peab kõikides katsenõudes olema sama. Käesoleva meetodiga saadud kogemused ja laboratooriumideva ­
helised võrdluskatsed näitavad, et kasvukiiruse 4–7-protsendilise või 
saagise 10–15-protsendilise erinevuse määramiseks uuritava aine eri kontsentratsioonidel piisab, kui uuritava aine ühe kontsentratsiooniga tehakse paralleelkatsed kolmes nõus, kui katse alguses sisaldab iga paral ­
leelkultuuri nõu 9–12 tallusjat võsu (10).
 
Katsenõud paigutatakse inkubaatorisse juhuslikult, et vähendada 
paigutusest tingitud valgustatuse ja temperatuuri erinevuste mõju. Igal katseandmete registreerimisel või veelgi sagedamini on katse ­
nõud vaja ka kas rühmiti või juhuvaliku alusel vastastikku ümber 
paigutada.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Kui eelkatse näitab, et uuritava aine kontsentratsioon ei püsi 7- 
päevase katse jooksul samal tasemel (katse lõpus mõõdetud kontsen ­
tratsioon on alla 80 % mõõdetud algtasemest), soovitatakse kasutada poolstaatilist katserežiimi. Sel juhul lastakse kolooniatel katse jooksul vähemalt kahel korral (nt kolmandal ja viiendal katsepäeval) 
kokku puutuda värskelt valmistatud katselahusega ja kontroll-lahu ­
sega. Kui sageli lastakse kultuuril puutuda kokku värske katsekesk ­
konnaga, see oleneb uuritava aine püsivusest; kui aine on väga ebastabiilne või lenduv, siis ligikaudu püsiva kontsentratsiooni hoid ­
miseks peab see sagedus olema suurem. Mõnel juhul võib olla vaja 
kasutada läbivoolumeetodit (11, 13).
 
Käesolevas metoodikas ei käsitleta kokkupuutekatset, milles uuritav 
aine pritsitakse taimelehtedele (vt 14).  
1.7.8.  Inkubeerimistingimused  
Kasutatakse päevavalgus- või külmvalge spektriga pidevat fluorest ­
sentsvalgust, mille intensiivsus valitakse vahemikus 85–135 
μE·m  –2 s –1 (vastab 6 500 – 10 000 luksile); valgustatust mõõdetakse 
fotosünteesiks sobivas lainepikkuse vahemikus 400–700 nm punk ­
tides, mis on valgusallikast sama kaugel kui lemle tallusjad võsud. Katseala ulatuses ei tohi valgustatus erineda valitud väärtusest üle 
15 %. Valgustatuse mõõdetav väärtus sõltub mõõtmismeetodist ja 
eriti sensori tüübist. Ühest suunast langevat valgust mõõtvale senso ­
rile eelistatakse sfäärilist sensorit (reageerib nii ülalt- kui altpoolt mõõtetasapinda igast suunast langevale valgusele) või koosinussen ­
sorit (reageerib ülaltpoolt mõõtetasapinda igast suunast langevale 
valgusele); käesoleva meetodi kohase mitmepunktilise valgustuse puhul annavad need sensorid suuremaid väärtusi.
 
Katsenõude temperatuur peab olema 24 ± 2 °C. Katse ajal ei tohi 
kontrollkeskkonna pH tõusta enam kui 1,5 ühiku võrra. Kui pH 
tõuseb üle 1,5 ühiku, siis loetakse siiski, et katse vastab nõuetele, 
kui saab näidata, et nõuetele vastavuse kriteeriumid on täidetud. Erijuhtudel, nt ebapüsivate ainete või metallide mõju uurimisel tuleb pH nihkumisele pöörata erilist tähelepanu. Täiendavad juhised 
on esitatud publikatsioonis (11).
 
1.7.9.  Katse kestus  
Katse lõpetatakse 7 ööpäeva möödumisel taimede ülekandmisest 
katsenõudesse.  
1.7.10.  Mõõtmised ja analüütilised määramised  
Katse alguses loendatakse ja registreeritakse tallusjate võsude arv 
katsenõudes, jälgides, et kõik väljaulatuvad selgesti nähtavad 
tallusjad võsud oleksid arvesse võetud. Normaalse või ebanormaalse välimusega tallusjate võsude arv määratakse katse alguses, vähemalt üks kord kolme ööpäeva kohta (st vähemalt kaks korda 7-päevase 
katse jooksul) ja katse lõpus. Registreeritakse muutused taimede 
arengus, nt tallusjate võsude suurus, välimus, nekroosi, kloroosi või puhetumise ilmingud, kolooniate lagunemine, kolooniate ujuvuse halvenemine, juurte pikkuse ja välimuse muutused. Registreerida 
tuleb ka olulised tähelepanekud katsekeskkonna kohta (nt mittelahus ­
tunud materjali olemasolu, vetikate kasv katsenõudes).
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Lisaks tallusjate võsude arvu määramisele katse jooksul hinnatakse 
ka uuritava aine mõju ühele või mitmele järgmisele mõõtemuutujale:  
i) tallusjate võsude üldpindala;  
ii) kuivmass;  
iii) elusmass.  
Tallusjate võsude üldpindala eelis on, et seda saab määrata igas 
katse- ja kontrollnõus katse alguses, katse käigus ja lõpus. Kuiv- või elusmass määratakse katse alguses inokulum-kultuuri representa ­
tiivses proovis ning katse lõpus igast katse- ja kontrollnõust saadud 
taimmaterjali alusel. Kui tallusjate võsude üldpindala ei määrata, eelistatakse elusmassi määramisele kuivmassi määramist.
 
Tallusjate võsude üldpindala, kuivmass ja elusmass määratakse järg ­
miselt.  
i) Tallusjate võsude üldpindala . Kõigi kolooniate tallusjate võsude 
üldpindala võib määrata pildianalüüsi abil. Katsenõu ja taimede 
siluett jäädvustatakse videokaameraga (nt asetades katsenõu 
valguskastile) ja saadud kujutis digitaliseeritakse. Kasutades kali ­
breerimiseks teadaoleva pindalaga tasapinnalisi kujundeid, võib seejärel määrata katsenõus olevate tallusjate võsude üldpindala. 
Tuleb jälgida, et katsenõu serv ei segaks määramist. Teine, 
töömahukam meetod on teha katsenõu ja taimede fotokoopia, lõigata välja saadud kolooniate siluett ja määrata nende pindala lehepinnaanalüsaatori või millimeetripaberi abil. Võib kasutada 
ka muid määramismeetodeid (nt kolooniate siluetile ja ühikpin ­
dalale vastava paberi masside suhte määramine).
 
ii) Kuivmass . Igast katsenõust kogutakse kõik kolooniad ja neid 
loputatakse destilleeritud või deioniseeritud veega. Kolooniatest 
eemaldatakse filterpaberi abil ülemäärane vesi ja neid kuivata ­
takse 60 °C juures püsiva kaaluni. Kõik juuretükid võetakse määramisel arvesse. Kuivmass väljendatakse täpsusega vähemalt 0,1 mg.
 
iii) Elusmass . Kõik kolooniad kantakse üle eelnevalt kaalutud polüs ­
türeenist (või muust inertsest materjalist) katseklaasidesse, mille ümarates põhjades on väikesed (1 mm) avad. Katseklaase tsent ­
rifuugitakse toatemperatuuril kiirusel 3 000 pööret minutis 
10 minuti jooksul. Katseklaasid niimoodi kuivatatud koloonia ­
tega kaalutakse ja elusmassi leidmiseks lahutatakse saadud tule ­
musest tühja katseklaasi mass.
 
1.7.10.1.  Mõõtmiste ja analüütiliste määramiste sagedus  
Staatilise katse puhul mõõdetakse pH igas katsenõus katse alguses ja 
lõpus. Poolstaatilistes katsetes mõõdetakse värske katselahuse pH 
enne iga lahusevahetust ja määratakse ka iga „kasutatud” lahuse pH.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Valgustatus mõõdetakse fütotroni, inkubaatori või kasvukambri 
punktides, mis on valgusallikast samal kaugusel kui lemle tallusjad 
võsud. Valgustatust mõõdetakse katse jooksul vähemalt üks kord. Katsekeskkonna temperatuur fütotronis, inkubaatoris või kasvukam ­
bris samades tingimustes hoitavas asendusnõus registreeritakse vähe ­
malt üks kord päevas.
 
Uuritava aine kontsentratsioon määratakse katse ajal sobiva vaheaja 
tagant. Staatilise katse puhul tuleb uuritava aine kontsentratsioon 
määrata vähemalt katse alguses ja lõpus.  
Poolstaatilise katse puhul, kus oletatakse uuritava aine kontsentrat ­
siooni muutumist üle 20 % nominaalväärtusest, tuleb see kontsentrat ­
sioon määrata kõigis värskelt valmistatud katselahustes ja samades lahustes pärast nende asendamist (vt punkt 1.7.7, kolmas lõik). Kui 
uuritava aine mõõdetud algkontsentratsioon erineb nominaalsest 
enam kui 20 % võrra, kuid on piisavad tõendid, et algkontsentrat ­
siooni väärtus on korratav ja püsiv (st 80–120 % algkontsentratsioo ­
nist), võib keemilised määramised teha ainult kõrgeima ja madalaima 
uuritava kontsentratsiooni puhul. Kõigil juhtudel on aine kontsentrat ­
sioon igal uuritaval väärtusel vaja määrata enne katselahuse vaheta ­
mist ainult ühes paralleelkultuuri nõus (või paralleelkultuuridest kokku segatud proovis).
 
Läbivoolukatse puhul kasutatakse sama proovivõturežiimi kui pools ­
taatilises katses, kaasa arvatud analüüs katse alguses, katse käigus ja 
lõpus, selle erinevusega, et „kasutatud” lahust ei ole vaja analüüsida. 
Nendes katsetes kontrollitakse igal katsepäeval lahjenduslahuse ja uuritava aine või uuritava aine põhilahuse voolukiirust.
 
Kui on tõendatud, et uuritava aine kontsentratsioon püsib kogu katse 
ajal rahuldavalt nominaalse või mõõdetud algväärtuse läheduses täpsusega ± 20 %, võib katsetulemusi analüüsida nominaalse või 
mõõdetud algväärtuse põhjal. Kui kõrvalekalle nominaalsest või 
mõõdetud algväärtusest on suurem kui ± 20 %, analüüsitakse katse ­
tulemusi katse geomeetrilise keskmise kontsentratsiooni alusel või kasutatakse uuritava aine kontsentratsiooni kõrvalekaldeid kajasta ­
vaid mudeleid (11).
 
1.7.11.  Piirsisalduskatse  
Teatavatel asjaoludel, näiteks kui eelkatse näitab, et kontsentrat ­
sioonil kuni 100 mg·l  –1 või katsekeskkonnas lahustuvuse piirkont ­
sentratsioonil (olenevalt sellest, kumb on madalam) ei avalda uuritav 
aine toksilist mõju, võib teha piirsisalduskatse, milles võrreldakse kontrollrühmas ja ühes katserühmas (kontsentratsioonil 100 mg·l
 –1 
või lahustuvuse piirkontsentratsioonil) avalduvat mõju. Piirsisaldus ­
katse tegemisel soovitatakse kindlasti määrata ka kokkupuutekont ­
sentratsioon. Kõik eespool kirjeldatud katsetingimused ja nõuetele vastavuse kriteeriumid kehtivad ka piirsisalduskatse puhul, kuid uuri ­
tava ainega tuleb teha vähemalt kahekordne arv paralleelkatseid. 
Kasvu analüüsimiseks kontroll- ja katseseerias võib keskmisi väärtusi 
võrrelda statistilise kriteeriumi (nt Studenti t-kriteerium) abil.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. KATSEANDMED JA NENDE ESITAMINE  
2.1. KAHEKORDISTUMISAEG  
Tallusjate võsude arvu kahekordistumise aja (T  d ) määramiseks ja 
katse nõuetele vastavuse sellekohase kriteeriumi täitmise kindlakste ­
gemiseks (punkt 1.6) kasutatakse kontrollkultuuridega saadud 
andmeid ja järgmist valemit:  
T d = ln 2/μ 
kus μ on punkti 2.2.1 esimeses ja teises lõigus kirjeldatud viisil 
määratud keskmine kasvu erikiirus.  
2.2. KOSTEMUUTUJAD  
Kõnesoleva katse eesmärk on määrata uuritava aine mõju lemle 
vegetatiivsele kasvule. Kuna liikmesriikide eelistused ja reguleerimis ­
vajadused on erinevad, käsitletakse käesolevas metoodikas kahte kostemuutujat. Et katsetulemused oleksid vastuvõetavad kõikides 
liikmesriikides, tuleb uuritava mõju hindamisel kasutada mõlemat 
järgnevalt kirjeldatud kostemuutujat (a ja b).
 
a) Keskmine kasvu erikiirus. See kostemuutuja arvutatakse katse ajal 
toimuva tallusjate võsude arvu logaritmi muutuse ja veel ühe 
mõõtemuutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või elus ­
massi) logaritmi muutuse ning selleks kulunud aja (ööpäevades) alusel kontrollkultuurides ja igas uuritava ainega kultuuris. Seda nimetatakse mõnikord ka suhteliseks kasvukiiruseks (15).
 
b) Saagis. See kostemuutuja arvutatakse katse lõpuks toimunud 
tallusjate võsude arvu muutuse ja lisaks veel ühe mõõtemuutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmass või elusmass) muutuse alusel kontrollkultuurides ning igas uuritava ainega kultuuris.
 
Tuleb märkida, et nende kahe kostemuutuja abil arvutatud toksilisuse 
väärtused ei ole võrreldavad ning seda erinevust tuleb katsetulemuste kasutamisel arvestada. Kui järgitakse käesoleva metoodika tingimusi, on asjaomaste lähenemisviiside matemaatilise aluse eripära tõttu 
keskmisel kasvu erikiirusel põhinevad EC
 x väärtused (E  r C x ) üldiselt 
suuremad kui saagise alusel saadud tulemused (E  y C x ). Seda erinevust 
ei tuleks tõlgendada kahe kostemuutuja tundlikkuse erinevusena; asjaomased väärtused on lihtsalt matemaatiliselt erinevad. Keskmise 
kasvu erikiiruse mõiste põhineb lemmelde üldisel eksponentsiaalsel 
kasvul piiramata kultuuris, kusjuures toksilisus määratakse kasvukii ­
ruses avalduva mõju alusel ja see ei olene kontrollkultuuri kasvu erikiiruse absoluutsest tasemest, kontsentratsiooni-mõju kõvera 
tõusust või katse kestusest. Kui kostemuutujaks on saagis, siis 
sõltuvad tulemused aga kõikidest mainitud kõrvalmuutujatest. E
 y C x 
oleneb igas katses kasutatud lemleliigi kasvu erikiirusest ja maksi ­
maalsest kasvu erikiirusest, mis võib olla eri lemleliikide ja isegi eri 
kloonide puhul erinev. Seda kostemuutujat ei tohi kasutada, kui 
võrreldakse lemleliikide või -kloonide tundlikkust toksiliste ainete suhtes. Kuigi teaduslikust aspektist on toksilisuse määramiseks parem kasutada kasvu erikiirust, esitatakse käesolevas metoodikas 
teatavate liikmesriikide eeskirjade järgimiseks ka saagisel põhinev 
toksilisuse määramise käik.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Toksilisuse hinnang peab põhinema tallusjate võsude arvul ja ühel 
täiendaval mõõtemuutujal (tallusjate võsude üldpindala, kuivmass või 
elusmass), sest mõned ained võivad mõjutada muid mõõtemuutujaid palju enam kui tallusjate võsude arvu. See mõju jääks avastamata, kui toksilisuse määramiseks kasutataks ainult tallusjate võsude arvu.
 
Tallusjate võsude arv ja muud registreeritud mõõtemuutujad (tallus ­
jate võsude üldpindala, kuivmass, elusmass) kantakse iga mõõtmise puhul koos uuritava aine kontsentratsiooni väärtustega tabelisse. Avastatava mõjuta kontsentratsiooni, madalaima avastatava mõjuga 
kontsentratsiooni ja EC
 x määramiseks ei kasutata andmetöötluses 
mitte katseseeria jaoks arvutatud keskmisi väärtusi, vaid individuaal ­
sete paralleelkultuuridega saadud väärtusi.  
2.2.1.  Keskmine kasvu erikiirus  
Kontrollkultuuride ja uuritava ainega kultuuride puhul arvutatakse 
teatava ajavahemiku keskmine kasvu erikiirus igas nõus kasvu 
iseloomustavate muutujate – tallusjate võsude arvu ja ühe täiendava 
mõõtemuutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või elus ­
massi) – logaritmi suurenemise alusel järgmise valemi abil:  
μ iÄj ¼ ln ðN j Þ – ln ðN i Þ 
t 
kus: 
— μ i–j on keskmine kasvu erikiirus ajavahemikul i–j,  
— N  i on mõõtemuutuja väärtus katse- või kontrollkultuuri sisal ­
davas nõus ajahetkel i,  
— N  j on mõõtemuutuja väärtus katse- või kontrollkultuuri sisal ­
davas nõus ajahetkel j,  
— t on ajavahemik i–j.  
Iga katse- ja kontrollseeria puhul arvutatakse kasvukiiruse 
keskväärtus ja dispersiooni hinnang.  
Keskmine kasvu erikiirus arvutatakse kogu katseaja kohta (eespool 
esitatud valemis vastab katse algusele ajahetk i ja katse lõpule ajahetk j). Iga uuritava kontsentratsiooni ja kontrolli puhul arvuta ­
takse keskmise kasvu erikiiruse keskväärtus ja dispersiooni hinnang. 
Lisaks sellele hinnatakse kasvukiirust ka lõikude kaupa, et näiteks logaritmitud kasvukõverate uurimise abil hinnata uuritava aine mõju katse vältel. Lõikude kaupa leitud kasvukiiruste ja keskmise kasvu ­
kiiruse olulised erinevused osutavad kõrvalekaldumisele pidevast 
eksponentsiaalsest kasvust; sel juhul on kasvukõveraid vaja üksikas ­
jalikult uurida. Konservatiivse lähenemisviisi kohaselt tuleb sel juhul võrrelda uuritava ainega kultuurides maksimaalse pidurdumise ajava ­
hemikul määratud kasvu erikiirusi kontrollkultuurides samal ajavahe ­
mikul määratud kasvu erikiirustega.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Iga uuritava kontsentratsiooni (katseseeria) puhul arvutatakse järg ­
mise valemi abil kasvukiiruse pidurdumise protsent I  r : 
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
kus: 
— % I  r on keskmine kasvu erikiiruse pidurdumise määr protsen ­
tides,  
— μ C on keskmise kasvu erikiiruse ( μ) keskväärtus kontrollsee ­
rias, 
— μ T on keskmise kasvu erikiiruse ( μ) keskväärtus katseseerias.  
2.2.2.  Saagis  
Uuritava aine mõju saagisele määratakse kahe mõõtemuutuja – 
tallusjate võsude arvu ja ühe täiendava mõõtemuutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmass või elusmass) – alusel, mille väärtused mõõdetakse igas uuritavas kultuuris katse alguses ja lõpus. Kuiv ­
massi või elusmassi esialgne väärtus määratakse tallusjate võsude 
proovist, mis võetakse katsenõu inokuleerimiseks kasutatud kultuu ­
rist (vt punkt 1.7.3, teine lõik). Iga uuritava kontsentratsiooni ja kontrollkultuuri jaoks arvutatakse keskmine saagis ning dispersiooni 
hinnang. Iga katseseeria puhul arvutatakse saagise keskmine vähene ­
mine protsentides %I
 y : 
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
kus: 
— %I  y on saagise vähenemine protsentides,  
— b  C on lõppbiomassi ja algbiomassi vahe kontrollseeria puhul,  
— b  T on lõppbiomassi ja algbiomassi vahe katseseeria puhul.  
2.2.3.  Kontsentratsiooni-mõju kõvera ehitamine  
Ehitatakse kontsentratsiooni-mõju kõver, mis kajastab kostemuutuja 
protsentides väljendatud keskmise vähenemise määra (punkti 2.2.1 
või 2.2.2 viimase lõigu kohaselt arvutatud I  r või I  y ) sõltuvust uuri ­
tava aine kontsentratsiooni logaritmist.  
2.2.4.  EC  x hindamine  
EC x (nt EC  50 ) hinnangud tuleb leida nii keskmise kasvu erikiiruse 
kui ka saagise põhjal (vastavalt E  r C x ja E  y C x ), mis omakorda leitakse 
tallusjate võsude arvu ja ühe täiendava mõõtemuutuja (tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või elusmassi) põhjal. Selle põhjuseks on asjaolu, et teatavad uuritavad ained mõjutavad tallusjate võsude 
arvu ja muid mõõtemuutujaid erinevalt. Otsitavad toksilisusparamee ­
trid, mis tuleb arvutada iga pidurdustaseme x puhul, on järelikult neli EC
 x väärtust: E  r C x (leitakse tallusjate võsude arvu alusel), E  r C x 
(leitakse tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või elusmassi 
alusel), E  y C x (leitakse tallusjate võsude arvu alusel), E  y C x (leitakse 
tallusjate võsude üldpindala, kuivmassi või elusmassi alusel).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. STATISTILISED MEETODID  
Eesmärk on leida regressioonanalüüsi abil kvantitatiivne seos kont ­
sentratsiooni ja mõju vahel. Võib kasutada kaalutud lineaarset regres ­
siooni pärast kosteandmete lineariseerivat teisendamist näiteks 
probit-, logit- või Weibulli ühikute kujule (16), kuid eelistada tuleb 
siiski mittelineaarse regressiooni meetodeid, mis sobivad paremini vältimatute andmevigade ja sujuvast jaotusest kõrvalekallete puhul. Kui andmevead lähenevad null-pidurdusele või täielikule pidurdu ­
sele, võivad need teisendustel võimendada ja segada analüüsi (16). 
Tuleb silmas pidada, et probit-, logit- või Weibulli teisendusega standardsed analüüsimeetodid on ette nähtud kõik-või-mitte-midagi- 
andmete (nt suremus või elulemus) analüüsiks ja kasvukiiruse või 
biomassi andmete analüüsimiseks tuleb neid kohandada. Konkreetsed meetodid EC
 x väärtuste määramiseks pidevate andmete alusel on 
esitatud publikatsioonides (17, 18, 19).  
Kummagi kostemuutuja puhul arvutatakse kontsentratsiooni-mõju 
kõverast punkti EC  x hinnangud. Võimaluse korral määratakse iga 
hinnangu usaldusvahemik 95-protsendilise usaldusnivoo jaoks. Kosteandmete sobivust regressioonimudeliga hinnatakse graafiliselt või statistiliselt. Regressioonanalüüsiks ei kasutata katserühma 
keskväärtusi, vaid individuaalsete paralleelkultuuride koste väärtusi.
 
Kui tavalised regressioonimudelid ja -meetodid katseandmete puhul 
ei sobi, võib EC  50 hinnangute ja usaldusvahemike leidmiseks kasu ­
tada ka lineaarset interpolatsiooni koos andmete usaldusväärsuse 
iteratiivse kontrollimisega ( bootstrapping ) (20).  
Selleks et määrata madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon ja 
sellest ka avastatava mõjuta kontsentratsioon, on uuritava ainega kultuuride keskväärtusi vaja võrrelda dispersioonanalüüsi 
(ANOVA) abil. Iga kontsentratsiooni puhul leitud keskväärtust 
võrreldakse seejärel kontrollkultuuride keskväärtusega, kasutades sobivat mitmekordse võrdluse või trendikatse meetodit. Dunnetti või Williamsi test võib osutuda sobivaks (21, 22, 23, 24). Tuleb 
hinnata, kas kehtib dispersioonanalüüsi eeldus, et dispersioon on 
homogeenne. Selle hinnangu võib saada graafiliselt või formaaltesti abil (25). Sobivad Levene’i või Bartletti testid. Kui dispersioonide homogeensuse eeldus ei kehti, võib mõnikord olla abi andmete loga ­
ritmilisest teisendamisest. Kui dispersiooni heterogeensus on väga 
suur ja seda ei saa korrigeerida teisendamisega, tuleb kaaluda Jonk ­
heere alanevate astmetega trenditesti kasutamist. Täiendavad juhised avastatava mõjuta kontsentratsiooni määramiseks on esitatud publi ­
katsioonis (19).
 
Teaduse viimaste saavutuste põhjal on soovitatud loobuda avastatava 
mõjuta kontsentratsiooni mõistest ja asendada see regressioonist leitud punkti EC
 x hinnangutega. Kõnesoleva katse jaoks lemmeldel 
ei ole sobivat x väärtust veel kindlaks määratud. Nähtavasti on see 
väärtus 10–20 % vahemikus (olenevalt valitud kosteparameetrist); parem oleks esitada nii EC
 10 kui ka EC  20 . 
3. TULEMUSTE ESITAMINE  
3.1. KATSEPROTOKOLL  
Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.  
Uuritav aine:  
— füüsikaline iseloomustus ja füüsikalis-keemilised omadused, 
kaasa arvatud lahustuvus vees;  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— kemikaali identifitseerimiseks vajalikud andmed (nt CASi 
number), kaasa arvatud puhtusaste.  
Katseorganismi liik:  
— teaduslik nimi, kloon (kui see on teada) ja päritolu.  
Katsetingimused:  
— kasutatud katsemeetod (staatiline, poolstaatiline või läbivoolu ­
katse);  
— katse alustamise kuupäev ja kestus;  
— katsekeskkond;  
— katseplaani kirjeldus: katsenõud ja nõukatted, lahuste mahud, 
kolooniate ja tallusjate võsude arv ühe katsenõu kohta katse alguses;
 
— uuritavad kontsentratsioonid (nominaalsed või mõõdetavad, 
olenevalt sellest, mis sobib) ja paralleelkultuuride arv ühe kont ­
sentratsiooni kohta;  
— põhi- ja katselahuste valmistusviisid, sh lahusti või dispergeeriva 
aine kasutamine;  
— katsetemperatuur;  
— valgusallikas, valguse intensiivsus ja ühtlus;  
— katsekeskkonna ja kontrollkultuuri keskkonna pH väärtused;  
— uuritava aine kontsentratsioonid, analüüsimeetod ja asjakohased 
kvaliteedihinnangu andmed (valideerimisuuringud, analüüsiand ­
mete standardhälbed ja usaldusvahemikud);  
— tallusjate võsude arvu ja muude mõõtemuutujate (kuivmass, elus ­
mass, tallusjate võsude pindala) määramise meetodid;  
— kõik kõrvalekaldumised käesolevast metoodikast.  
Katsetulemused:  
— originaalandmed: tallusjate võsude arv ja muude mõõtemuutujate 
väärtused igas uuritava ainega kultuuris ja kontrollkultuuris iga vaatluse ja analüüsi korral;
 
— iga mõõtemuutuja keskväärtus ja standardhälve;  
— igale kontsentratsioonile vastav kasvukõver (soovitatakse esitada 
kasvukõver logaritmitud mõõtemuutuja järgi, vt punkt 2.2.1, 
teine lõik);  
— kontrollkultuuri kahekordistumise aeg või kasvukiirus, mis 
määratakse tallusjate võsude arvu järgi;  
— iga uuritava ainega paralleelkultuuri puhul arvutatud kostemuu ­
tujate väärtused, keskväärtused ja paralleelkultuuride variatsioo ­
nikordaja;  
— kontsentratsiooni-mõju sõltuvuse graafik;  
— kostemuutujate (nt EC  50 , EC  10 , EC  20 ) abil väljendatud toksilisuse 
hinnangud ja nende usaldusvahemikud. Madalaim avastatava mõjuga kontsentratsioon ja ka avastatava mõjuta kontsentratsioon 
(kui need arvutati) ning nende määramiseks kasutatud statistilised 
meetodid;
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— kui kasutati dispersioonanalüüsi (ANOVA), siis avastatava efekti 
suurus (nt väikseim oluline erinevus);  
— uuritava ainega kultuuris jälgitud kasvu stimuleerimine;  
— visuaalsed fütotoksilisuse tunnused ja tähelepanekud katselahuste 
kohta;  
— tulemuste arutelu, kaasa arvatud käesolevast metoodikast kõrva ­
lekaldumise võimalik mõju katsetulemustele.  
4. KIRJANDUS  
1) OECD TG 221 (2006)  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test.  
2) The use of  Lemna  studies for coloured substances is detailed in 
Section 13.5.3 of the EU Manual of Decisions dated July 2006, at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals.
 
3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, available at
 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ ­
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A.  
4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733–742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.  
5) USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  
Lemna  spp., „Public draft”. EPA 712-C-96–156. 8pp.  
6) AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10pp.  
7) SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duck­
weed. SS 02 82 13. 15pp. (Rootsi keeles.)  
8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37–120 pp.
 
9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.
 
10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.
 
11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assess ­
ment No.23.
 
12) ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3–77 108. September 1977.
 
14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioas ­
says with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed 
and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353–359.  
15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, 481–483.  
16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713–718.  
17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.
 
18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494.
 
19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096–1121.  
22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics, 20, 482–491.  
23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103–117.  
24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
1. liide  
Lemmelde liikide kirjeldus  
Üldnime lemled ( Lemna  spp.) all tuntud veetaimed kuuluvad lemleliste ( Lemna­
ceae) sugukonda, mis hõlmab paljusid ülemaailmse levikuga liike, mis kuuluvad 
nelja perekonda. Nende morfoloogilisi erinevusi ja taksonoomiat on kirjeldatud 
ammendavalt (1, 2). Toksilisuskatsetes kasutatakse üldiselt parasvöötmele iseloo ­
mulikku küürlemmelt ( Lemna gibba ) ja väikest lemmelt ( Lemna minor ). Mõlemal 
liigil on vee pinnal või vee sees ujuv litrikesetaoline vars (tallusjas võsu) ja iga tallusja võsu alakülje keskkoha külge kinnitunud väga peenike juur. Lemled 
õitsevad harva ja paljunevad peamiselt vegetatiivselt uute tallusjate võsude 
moodustamise abil (3). Vanemate taimedega võrreldes on noored taimed hele ­
damad, lühemate juurtega ja koosnevad kahest või kolmest erineva suurusega tallusjast võsust. Tänu lemle väiksusele, lihtsale ehitusele, mittesugulisele palju ­
nemisele ja lühikesele generatsiooniajale sobivad selle perekonna taimed väga 
hästi laboratoorseteks katseteks (4, 5).
 
Kuna tundlikkus uuritava aine suhtes on tõenäoliselt liigiti erinev, saab aineid 
võrrelda ainult ühe liigiga tehtud katsete alusel.  
Näiteid lemle liikide kasutamise kohta katsetes: viited  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935–941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. 
EPA 712-C-96–156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90–337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth 
inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). pp. 733–742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. EPA 
712-C-96–156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.  
Lemna liikide kollektsioonid  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2  
Tel: +1 4169783641  
Faks:+1 4169785878  
e-post: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695–8002  
United States  
Tel: +1 9195157572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 STOCKHOLM  
SWEDEN  
Tel: +46 86747240  
Faks +46 86747636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
Germany  
e-post: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
KIRJANDUS  
1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287.  
2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human 
utilization of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82–991150–0–0. The 
Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14.  
5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7–22.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
2. liide  
Tüvikultuuri säilitamine  
Tüvikultuure võib pikemat aega säilitada madalal temperatuuril (4–10 °C), ilma 
et oleks vaja alustada uut kultiveerimist. Lemle toitelahus võib olla sama, mida kasutatakse katsetes, kuid tüvikultuuride puhul võib kasutada ka muid toitaine ­
rikkaid lahuseid.
 
Teatav arv noori helerohelisi taimi kantakse kindlate ajavahemike tagant asepti ­
liselt üle värsket toitelahust sisaldavasse nõusse. Käesolevas lisas soovitatud madala temperatuuri korral võib subkultuuride inokuleerimise vaheaeg olla kuni kolm kuud.
 
Kasutatakse keemiliselt puhtaid (happega pestud) steriilseid klaasist kultiveeri ­
misnõusid ja aseptilist käitlustehnikat. Kui tüvikultuur saastub näiteks vetikate 
või seentega, tuleb võtta meetmeid saasteorganismide kõrvaldamiseks. Vetikate ja enamiku muude saastavate organismide korral võib seda saavutada pindmise steriliseerimise abil. Saastatud taimmaterjalist võetakse proov ja lõigatakse ära 
taimede juured. Materjali loksutatakse tugevasti puhtas vees ja see asetatakse 30 
sekundiks kuni 5 minutiks 0,5-mahuprotsendilisse naatriumhüpokloriti lahusesse. Seejärel loputatakse taimmaterjali steriilse veega ja kantakse siis mitme portsjo ­
nina värsket toitelahust sisaldavatesse kultiveerimisnõudesse. Sellise töötlemise 
tagajärjel surevad paljud tallusjad võsud, eriti kui töötlemisaeg on pikem, kuid üksikud ellujäänud tallusjad võsud on tavaliselt saasteorganismidest vabad. Neid tallusjaid võsusid võib kasutada uute kultuuride inokuleerimiseks.
 ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
3. liide  
Toitelahused  
Väikese lemle ja küürlemle jaoks soovitatakse erinevaid toitelahuseid. Väikese 
lemle puhul soovitatakse kasutada Rootsi standardi (SIS) kohase toitelahuse modifikatsiooni, samas kui küürlemle puhul soovitatakse kasutada toitelahust 
20X-AAP. Järgnevalt on esitatud mõlema toitelahuse koostised. Nende toitela ­
huste valmistamiseks kasutatakse analüütiliselt puhtaid reaktiive ja deioniseeritud vett.
 
Rootsi standardi (SIS) kohane lemle toitelahus  
— I–V põhilahus steriliseeritakse autoklaavimise (120 °C, 15 minutit) või 
membraanfiltrimise (pooride läbimõõt ligikaudu 0,2 μm) abil.  
— VI põhilahus (ja mittekohustuslik VII põhilahus) steriliseeritakse membraan ­
filtrimise abil, neid lahuseid ei autoklaavita.  
— Steriilseid põhilahuseid hoitakse jahedas kohas valguse juurdepääsuta. I–V 
põhilahus visatakse ära kuus kuud pärast valmistamist; VI põhilahuse (ja 
mittekohustusliku VII põhilahuse) säilimisaeg on üks kuu.  
Põhilahus nr Koostisaine Sisaldus põhila ­
huses (g· l  –1 ) Sisaldus toitela ­
huses (mg·l  –1 ) Toitelahus 
Element Sisaldus (mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO 4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 0,050 0,0050 
0,010 1,00 
0,20 
0,010 0,050 0,0050 
0,010 B 
Mn 
Mo Zn Cu 
Co 0,17 
0,056 
0,0040 0,011 0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (puhver) 490 490 — —  
— Ühe liitri SIS toitelahuse saamiseks lisatakse 900 ml deioniseeritud veele 
järgmised komponendid:  
— 10 ml I põhilahust;  
— 5 ml II põhilahust;  
— 5 ml III põhilahust;  
— 5 ml IV põhilahust;  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml V põhilahust;  
— 5 ml VI põhilahust;  
— 1 ml VII põhilahust (mittekohustuslik).  
Märkus.  Täiendav VII põhilahus (MOPS puhver) võib olla vajalik teatavate uuritavate 
ainete puhul (vt punkt 1.4, viimane lõik).  
— 0,1 või 1 M HCl või NaOH lisamisega reguleeritakse pH väärtusele 6,5 ± 0,2 
ja lahuse maht viiakse deioniseeritud veega ühe liitrini.  
Toitelahus 20X-AAP  
Põhilahuste valmistamiseks kasutatakse steriilset destilleeritud või deioniseeritud 
vett. 
Steriilseid põhilahuseid hoitakse jahedas kohas valguse juurdepääsuta. Nendes 
tingimustes on põhilahuste säilimisaeg vähemalt 6–8 nädalat.  
Toitelahuse 20X – AAP viie põhilahuse (A1, A2, A3, B, C) valmistamiseks 
kasutatakse keemiliselt puhtaid kemikaale. Toitelahuse saamiseks lisatakse ligi ­
kaudu 850 ml deioniseeritud veele 20 ml iga põhilahust. 0,1 või 1 M HCl või NaOH lisamisega reguleeritakse pH väärtusele 7,5 ± 0,1 ja lahuse maht viiakse deioniseeritud veega 1 liitrini. Seejärel filtritakse toitelahus läbi ligikaudu 0,2 μm 
pooridega membraanfiltri steriilsesse nõusse.
 
Katses kasutamiseks ette nähtud toitelahus tehakse valmis 1–2 päeva enne kasu ­
tamist, et pH saaks stabiliseeruda. Enne kasutamist kontrollitakse toitelahuse pH ja reguleeritakse seda vajaduse korral uuesti 0,1 või 1 M NaOH või HCl lisa ­
misega eespool kirjeldatud viisil.
 
Põhilahus nr Koostisaine Sisaldus põhila ­
huses (g·l  –1 ) (*) Sisaldus 
toitelahuses 
(mg·l  –1 ) (*) Toitelahus 
Element Sisaldus ­
(*)(mg·l  –1 ) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4; 3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Kui ei ole märgitud teisiti.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Märkus. Teoreetiliselt vajalik vesinikkarbonaadi lõppsisaldus (mille puhul ei ole vaja märki ­
misväärselt reguleerida pH-d) ei ole 300 mg/l, vaid 15 mg/l. Varem, kaasa arvatud 
laboratooriumidevahelistes võrdluskatsetes, on siiski kasutatud toitelahust 20X- AAP, mille vesinikkarbonaadisisaldus on 300 mg/l (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999)  The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test . Development and 
Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report  EMA 
003. WRc plc – Environment Agency.
 
Steinbergi toitelahus (vastab standardile ISO 20079)  
Koostisainete sisaldus ja põhilahused  
— Standardis ISO 20079 nähakse modifitseeritud Steinbergi toitelahuse kasuta ­
mine ette ainult väikese lemle,  Lemna minor ’i puhul (kuna üksnes väikest 
lemmelt seal lubataksegi kasutada), kuid katsed näitavad, et selle toitelahu ­
sega võib saada häid tulemusi ka küürlemle,  Lemna gibba  puhul.  
— Toitelahuse valmistamiseks kasutatakse keemiliselt või analüütiliselt puhtaid 
kemikaale ja deioniseeritud vett.  
— Toitelahuse valmistamiseks kasutatakse põhilahuseid või 10 korda kontsen ­
treeritumat toitelahust (see on kõrgeim kontsentratsioon, mille puhul koosti ­
sained veel ei sadestu).  
Tabel 1  
Stabiliseeritud pH-ga Steinbergi toitelahus (Altenburgeri modifikatsioon)  
Koostisaine Toitelahus  
Makroelemendid  molekulmass mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroelemendid  molekulmass μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA-dinaatriumdihüdraat 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabel 2  
Põhilahused (makroelemendid)  
1. Makroelemendid (50-kordselt kontsentreeritud)  g/l  
Põhilahus 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Põhilahus 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Põhilahus 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabel 3  
Põhilahused (mikroelemendid)  
2. Mikroelemendid (1 000-kordselt kontsentreeritud)  mg/l  
Põhilahus 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Põhilahus 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Põhilahus 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Põhilahus 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Põhilahus 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA-dinaatriumdihüdraat 1 500,00  
— Põhilahused 2 ja 3 võib kokku valada, samuti võib kokku valada ka põhila ­
hused 4–7 (arvestades vajalikke kontsentratsioone).  
— Säilimisaja pikendamiseks autoklaavitakse põhilahused 121 °C juures 
20 minuti jooksul või steriliseeritakse membraanfiltrimisega (0,2 μm). Põhi­
lahus 8 soovitatakse kindlasti steriliseerida membraanfiltrimisega (0,2 μm). 
Vajaliku lõppkontsentratsiooniga modifitseeritud Steinbergi toitelahuse 
valmistamine  
— Ligikaudu 900 ml deioniseeritud veele (et vältida sadestumist) lisatakse  à 
20 ml põhilahuseid 1, 2 ja 3 (vt tabel 2).  
— Lisatakse  à 1,0 ml põhilahuseid 4, 5, 6, 7 ja 8 (vt tabel 3).  
— Toitelahuse pH peab olema 5,5 ± 0,2 (pH reguleerimiseks lisatakse väikseim 
vajalik kogus NaOH või HCl lahust).  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Toitelahuse maht viiakse veega 1 000 milliliitrini.  
— Kui põhilahused on steriilsed ja kasutatakse nõuetekohast vett, ei ole lahust 
vaja täiendavalt steriliseerida. Kui valmis lahust steriliseeritakse, siis lisatakse 
põhilahus 8 pärast autoklaavimist (121 °C, 20 minutit).  
Pikemaks säilitamiseks mõeldud 10-kordse kontsentratsiooniga modifitsee ­
ritud Steinbergi toitelahuse valmistamine  
— Ligikaudu 30 ml deioniseeritud veele (et vältida sadestumist) lisatakse  à 
20 ml põhilahuseid 1, 2 ja 3 (vt tabel 2).  
— Lisatakse  à 1,0 ml põhilahuseid 4, 5, 6, 7 ja 8 (vt tabel 3). Lahuse maht 
viiakse veega 100 milliliitrini.  
— Kui põhilahused on steriilsed ja kasutatakse nõuetekohast vett, ei ole lahust 
vaja täiendavalt steriliseerida. Kui valmis lahust steriliseeritakse, siis lisatakse 
põhilahus 8 pärast autoklaavimist (121 °C, 20 minutit).  
— Lõppkontsentratsiooniga lahuse pH peab olema 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27.  SETTE-VEE MÜRGISUSKATSE SURUSÄÄSKLASTEL 
RIKASTATUD SETTE KASUTAMISEGA  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 218 (2004). 
Käesolev katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata pikaajalise kemi ­
kaalidega kokkupuute mõju setetes elavatele magevee kahetiivaliste ( Chiro­
nomus  sp.) vastsetele. See põhineb  Chironomus riparius’ e ja Chironomus 
tentans’ i kohta olemas olevatel mürgisuse määramise katse eeskirjadel, mis 
on koostatud Euroopas (1, 2, 3) ja Põhja-Ameerikas (4, 5, 6, 7, 8) ning mille 
puhul on tehtud laboritevahelised võrdluskatsed (1, 6, 9). Võib kasutada ka 
muid hästi dokumenteeritud surusääsklaste liike, näiteks  Chironomus yoshi ­
matsui’ d (10, 11).  
2. Käesolevas katsemeetodis kasutatav kokkupuutestsenaarium on sette rikas ­
tamine uuritava kemikaaliga. Sobiva kokkupuutestsenaariumi valimine 
oleneb katse kavandatud eesmärgist. Sette kemikaaliga rikastamise stsenaa ­
rium on kavandatud settes püsivate kemikaalide akumuleerunud tasemete simuleerimiseks. Käesolevas kokkupuutesüsteemis rikastatakse sette-vee 
katsesüsteemis setet kemikaaliga.
 
3. Ained, mille kohta on vaja teha katsed settes elavate organismidega, jäävad 
tavaliselt sellesse keskkonda pikaks ajaks püsima. Settes elavad organismid võivad kemikaaliga mitmel viisil kokku puutuda. Iga kokkupuutetee suhte ­
line tähtsus ja aeg, mis on iga kokkupuutetee puhul vajalik üldisse mürgi ­
susse panuse andmiseks, sõltub asjaomase kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Tugevasti adsorbeeruvate ainete (näiteks log K
 ow > 5) või 
settega kovalentseid sidemeid moodustavate ainete puhul võib tähtis kokku ­
puutetee olla manustamine saastunud toiduga. Väga lipofiilsete ainete mürgi ­
suse alahindamise vältimiseks võib kaaluda settele sööda lisamist enne uuri ­
tava aine kasutamist. Kõigi võimalike kokkupuuteteede arvessevõtmiseks on käesolevas katsemeetodis keskendutud pikaajalisele kokkupuutele.  C. ripa­
rius’ e ja C. yoshimatsui  puhul kestab katse 20–28 päeva ning  C. tentans’ i 
puhul 28–65 päeva. Kui konkreetsel põhjusel vajatakse andmeid lühema aja kohta, näiteks ebastabiilse kemikaali mõju uurimiseks, võib kümnepäevase ajavahemiku järel võtta täiendavad paralleelproovid.
 
4. Mõõdetavad näitajad on vastsetest arenenud valmikute koguarv ja nende 
arenemiseks vajalik aeg. Vastsete elulemust ja kasvu soovitatakse mõõta alles pärast kümnepäevase ajavahemiku möödumist; kui lisaks vajatakse andmeid lühema aja kohta, kasutatakse vajaduse korral täiendavaid paral ­
leelkatseid.
 
5. Soovitatakse kasutada spetsiaalselt koostatud setet. Spetsiaalselt koostatud 
settel on loodusliku sette ees mitmeid eeliseid:  
— väheneb katsete hajuvus, kuna nii saadakse reprodutseeritav standardi ­
seeritud maatriks ning kõrvaldatakse vajadus saastumata ja puhaste 
setteallikate leidmiseks;  
— katseid võib alustada ükskõik millal, ei tule arvestada katse setete hooa ­
jalist muutlikkust ja setet ei ole vaja eeltöödelda kohaliku fauna kõrval ­
damiseks; spetsiaalselt koostatud sette kasutamine vähendab samuti 
korrapäraseks katsetamiseks kohapeal piisavas koguses sette kogumisega seotud kulusid;
 
— spetsiaalselt koostatud sette kasutamine võimaldab mürgisust võrrelda ja 
selle põhjal aineid järjestada.  
6. Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
KATSE PÕHIMÕTE  
7. Kõigepealt puutuvad surusääsklaste esimese kasvujärgu vastsed kokku 
sette-vee süsteemis teatavas kontsentratsioonivahemikus oleva uuritava kemikaaliga. Uuritavat ainet lisatakse settesse ja esimese kasvujärgu vastsed 
lisatakse seejärel katsenõudesse, milles kontsentratsioonid settes ja vees on 
tasakaalustunud. Katse lõpus mõõdetakse surusääsklaste väljaarenemise määra ja arengu kiirust. Vastsete elulemust ja massi võidakse vajaduse korral mõõta ka kümne päeva möödumisel (kasutades vajaduse korral täien ­
davaid paralleelkatseid). Neid andmeid analüüsitakse kas regressioonimudeli 
abil, et hinnata kontsentratsioon, mis põhjustab valmikute väljaarenemise või vastsete elulemuse või kasvu x % vähenemise (näiteks EC
 15 , EC  50 jne), või 
kasutades täheldatava toimeta kontsentratsiooni / vähima täheldatava 
toimega kontsentratsiooni määramiseks statistilise hüpoteesi testimise meetodit. Viimati nimetatud juhul tuleb täheldatud mõju väärtusi võrrelda statistiliste testide abil kontrollkatses määratud väärtustega.
 
ANDMED UURITAVA AINE KOHTA  
8. Teada peaks olema uuritava aine lahustuvus vees, aururõhk, mõõdetud või 
arvutatud jaotumine settesse ning stabiilsus vees ja settes. Kättesaadav peaks olema usaldusväärne analüüsimeetod uuritava aine kvantitatiivseks määrami ­
seks katvas veekihis, poorivees ja settes; meetodi täpsus ja määramispiir 
peaksid olema teada. Kasulik on teada uuritava aine struktuurivalemit ja puhtust. Samuti on kasulik teada uuritava aine keemilist käitumist (näiteks hajumine, abiootiline ja biootiline lagunemine jne). Täiendavad juhised 
selliste ainete mõju uurimiseks, mille füüsikalis-keemilised omadused 
raskendavad selle katse tegemist, on esitatud väljaandes (12).
 
VÕRDLUSKEMIKAALID  
9. Katse-eeskirjade ja -tingimuste täitmise usaldusväärsuse tagamiseks võib 
korrapäraselt katsetada võrdluskemikaale. Laboritevahelistes võrdlustes ja valideerimisuuringutes edukalt kasutatud võrdlustoksikandid on näiteks lindaan, trifluraliin, pentaklorofenool, kaadmiumkloriid ja kaaliumkloriid 
(1, 2, 5, 6, 13).
 
KATSE KEHTIVUS  
10. Katse kehtivuse tõendamisel arvestatakse järgmist:  
— kontrollnõus peab katse lõpuks välja arenema vähemalt 70 % putukaid 
(1, 6);  
— C. riparius’ e ja C. yoshimatsui  valmikud peaksid kontrollnõudes välja 
arenema 12–23 päeva jooksul pärast nende viimist nõudesse;  C. 
tentans’ i puhul on vajalik ajavahemik 20–65 päeva;  
— katse lõpus tuleks igas nõus mõõta pH ja lahustunud hapniku kontsen ­
tratsioon. Hapnikukontsentratsioon peaks olema vähemalt 60 % õhuga küllastamisel saadud väärtusest kasutataval temperatuuril ja katva 
veekihi pH peaks kõigis katsenõudes olema vahemikus 6–9;
 
— vee temperatuur ei tohiks erineda rohkem kui ±1,0 °C võrra. Vee tempe ­
ratuuri on võimalik kontrollida isotermilise ruumi abil ja sel juhul peaks 
ruumi temperatuur olema sobivate ajavahemike järel kinnitatud.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
MEETODI KIRJELDUS  
Katsenõud  
11. Uuring tehakse 600 ml klaasist katsenõudega, mille läbimõõt on 8 cm. 
Muud nõud on sobivad, kuid need peaksid tagama katva veekihi ja sette vajaliku paksuse. Sette pind peaks olema piisav, et tagada vastse kohta 2–3 cm
 2 . Settekihi paksuse ja katva veekihi paksuse suhe peaks olema 1 : 
4. Katsenõud ja muud seadmed, mis katsesüsteemiga kokku puutuvad, 
peaksid olema valmistatud täies ulatuses klaasist või muust keemiliselt inert ­
sest materjalist (näiteks teflonist).  
Liigi valimine  
12. Katses kasutatav liik on eelistatavalt  Chironomus riparius . Chironomus 
tentans  on samuti sobiv, aga selle käsitlemine on keerukam ja see nõuab 
pikemat katseperioodi.  Chironomus yohimatsui  kasutamine on samuti 
võimalik. 2. liites on esitatud andmed  Chironomus riparius’ e kultuuri kasva ­
tamise meetodite kohta. Ka muude liikide, nagu  Chironomus tentans’ i (4) ja  
Chironomus yoshimatsui  (11) kultuuri kasvatamise tingimused on avaldatud. 
Enne katset tuleb kinnitada liigi määramist, aga seda ei nõuta enne iga katset, kui organismid pärinevad asutusesisesest kultuurist.
 
Sete 
13. Eelistatavalt tuleks kasutada spetsiaalselt koostatud setet (mida nimetatakse 
ka taastatud, tehislikuks või sünteetiliseks setteks). Loodusliku sette kasuta ­
mise korral tuleks seda iseloomustada (vähemalt pH, orgaanilise süsiniku 
sisaldus, samuti on soovitatav määrata muud parameetrid, nagu süsiniku- 
lämmastiku suhe ja granulomeetria) ning selles ei tohiks olla mingeid saas ­
teaineid ega muid organisme, kes võiksid surusääsklastega konkureerida või neid süüa. Enne loodusliku sette kasutamist surusääsklastel avalduva mürgi ­
suse katses on soovitatav seda seitsme päeva jooksul konditsioneerida 
samades tingimustes, mis valdavalt esinevad edasise katse käigus. Käesole ­
vas katses soovitatakse kasutada järgmist spetsiaalselt koostatud setet, mis põhineb katsemeetodis C.8 (14) kasutataval tehismullal (1, 15, 16):
 
a) 4–5 % (kuivmass) turvast: pH väärtus võimalikult lähedal vahemikule 
5,5–6,0; tähtis on kasutada peeneks jahvatatud (osakese suurus ≤ 
1 mm) pulbrilist turvast, mida on kuivatatud ainult õhu käes;  
b) 20 % (kuivmass) kaoliinsavi (kaoliniidisisaldus eelistatavalt üle 30 %);  
c) 75–76 % (kuivmass) kvartsliiva (see peaks peamiselt koosnema peenest 
liivast ja rohkem kui 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 50–200 μm);
 
d) lõplikus segus niiskusesisalduse 30–50 % saamiseks lisatakse deionisee ­
ritud vett;  
e) sette lõpliku segu reguleerimiseks pH vahemikku 7,0 ± 0,5 lisatakse keemi ­
liselt puhast kaltsiumkarbonaati (CaCO  3 ). Lõpliku segu orgaanilise süsiniku 
sisaldus peaks olema 2 % (±0,5 %) ja see tuleks õigeks seada sobivas 
koguses turba ja liiva kasutamisega kooskõlas alapunktidega a ja c.  
14. Turba, kaoliinsavi ja liiva päritolu peaks olema teada. Sette koostisosi tuleks 
kontrollida, et tõendada keemilise saaste puudumine (näiteks raskmetallid, 
kloororgaanilised ühendid, fosfororgaanilised ühendid jne). Spetsiaalselt koostatud sette valmistamise näidis on esitatud 3. liites. Kuivade koostiso ­
sade segamine on samuti lubatav, kui tõendatakse, et pärast katva veekihi 
lisamist ei toimu sette koostisosade eraldumist (näiteks turbaosakeste hõlju ­
mist) ja et turvas või sete on piisavalt konditsioneerunud.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Vesi 
15. Katseveeks sobib vesi, mis vastab 2. ja 4. liites esitatud lahjendamiseks 
kasutatava vee nõutavatele keemilistele omadustele. Kasvuveena ja katse ­
veena lubatakse kasutada iga sobivat vett, looduslikku vett (pinna- või 
põhjavesi), taastatud vett (vt 2. liide) või deklooritud kraanivett, kui suru ­
sääsklased jäävad selles kasvatamise ja katsetamise ajal ellu ega ilmuta stressi tunnuseid. Katse alguses peaks katsevee pH olema vahemikus 6–9 ja vee summaarne karedus ei tohiks olla suurem kui 400 mg/l CaCO
 3 -na. 
Kui oletatakse karedust tekitavate ioonide ja uuritava aine omavahelist mõju, 
tuleks kasutada siiski väiksema karedusega vett (ja seega ei tohiks sel juhul kasutada Elendti kasvukeskkonda M4). Kogu uuringu vältel tuleks kasutada 
sama tüüpi vett. 4. liites loetletud vee kvaliteedi omadusi tuleks mõõta 
vähemalt kaks korda aastas või siis, kui kahtlustatakse, et kõnealused omadused võivad olla oluliselt muutunud.
 
Põhilahused – rikastatud setted  
16. Tavaliselt valmistatakse valitud kontsentratsiooniga rikastatud setted uuritava 
aine lahuse otse settesse lisamise teel. Deioniseeritud vees lahustatud uuri ­
tava aine põhilahus segatakse spetsiaalselt koostatud settega rullimisseadme 
või söödasegaja abil või käsitsi. Vees halvasti lahustuva uuritava aine võib lahustada võimalikult väikses sobiva orgaanilise lahusti (näiteks heksaan, atsetoon või kloroform) koguses. See lahus segatakse ühes katsenõus 
seejärel 10 g peene kvartsliivaga. Lahustil lastakse auruda ja see tuleb liivast 
täielikult kõrvaldada; seejärel segatakse liiv katsenõu jaoks sobivas koguses settega. Uuritava aine solubiliseerimiseks, dispergeerimiseks või emulgeeri ­
miseks võib kasutada ainult kergesti lenduvaid aineid. Tuleks meeles pidada, 
et sette valmistamisel tuleb arvesse võtta uuritava aine ja liiva segust pärit liiva (s.o sete tuleks siis valmistada väiksema liivakogusega). Tuleks hoolit ­
seda, et settele lisatud uuritav aine oleks settes põhjalikult ja ühtlaselt 
jaotatud. Vajaduse korral võib homogeensuse taseme määramiseks analüü ­
sida alamproove.
 
KATSE KAVANDAMINE  
17. Katse kavandamine hõlmab katse kontsentratsioonide arvu ja vahemike vali ­
mist, iga kontsentratsioonitaseme jaoks nõude arvu ning igas nõus olevate 
vastsete arvu valimist. Kirjeldatud on, kuidas hinnata EC-punktide väärtusi 
ja täheldatava toimeta kontsentratsiooni ning teha piirsisalduskatset.  
Regressioonanalüüsi kavandamine  
18. Katses kasutatavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama toimet avaldavat 
kontsentratsiooni (nt EC  15 , EC  50 ) ja uuritava aine puhul huvi pakkuvat 
kontsentratsioonivahemikku. Tavaliselt paraneb toimet avaldavate kontsen ­
tratsioonide (EC  x ) hinnangute täpsus ja eelkõige kehtivus, kui toimet 
avaldav kontsentratsioon on uuritud kontsentratsioonide vahemikus. Tuleks vältida suurt ekstrapoleerimist allapoole väikseimat positiivset kontsentrat ­
siooni või ülespoole suuremat kontsentratsiooni. Eelnev annusevahemiku 
leidmise katse aitab valida kasutatavat kontsentratsioonivahemikku (vt 
punkt 27).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Kui tuleb hinnata EC  x , tuleks katse teha vähemalt viie kontsentratsiooniga ja 
iga kontsentratsiooni kohta tuleks kasutada kolme paralleelkatset. Igal juhul 
on mudeli korraliku hindamise jaoks soovitatav kasutada piisavaid uurita ­
vaid kontsentratsioone. Kontsentratsioonidevaheline kordaja ei tohiks olla suurem kui 2 (erandi võib teha juhul, kui doosi mõju graafiku tõus on 
madal). Iga doosi paralleelkatsete arvu võib vähendada, kui suurendatakse 
eri mõjuga uuritavate kontsentratsioonide arvu. Paralleelkatsete arvu suuren ­
damine või uuritavate kontsentratsioonide vahemiku vähendamine enamasti vähendab usaldusvahemikku. Kui on vaja hinnata vastsete elulemust ja 
kasvu kümne päeva järel, on vaja võtta täiendavaid paralleelproove.
 
Täheldatava toimeta kontsentratsiooni / vähima täheldatava toimega 
kontsentratsiooni hindamise kavandamine  
20. Kui hinnatakse täheldatava toimeta kontsentratsiooni või vähimat tähelda ­
tava toimega kontsentratsiooni, tuleks kasutada viit uuritavat kontsentrat ­
siooni vähemalt nelja paralleelkatsega ja kõnealuseid kontsentratsioone 
eraldav kordaja ei tohiks olla suurem kui 2. Paralleelkatsete arv peaks olema piisav, et tagada piisav statistiline võimsus, et tuvastada katse- ja kontrollseadme tulemuste 20 % erinevus 5 % statistilise olulisusega (p = 
0,05). Arengu kiiruse puhul on üldiselt asjakohane variatsioonanalüüs 
(ANOVA), näiteks Dunnetti test ja Williamsi test (17, 18, 19, 20). Väljaa ­
renemise suhte puhul võib kasutada Cochrani-Armitage’i testi, Fisheri täpset testi (Bonferroni parandusega) või Manteli-Haenszeli testi.
 
Piirsisalduskatse  
21. Kui esialgsetes annusevahemiku leidmise katsetes tulemusi ei saadud, võib 
teha piirsisalduskatse (üks katsekontsentratsioon ja kontroll). Piirsisaldus ­
katse eesmärk on teha katse kontsentratsioonil, mis on piisavalt suur, et otsustajad võiksid uuritava aine mürgisuse välistada, ning piirsisalduseks 
võetakse kontsentratsioon, mida eeldatavasti üheski olukorras ei teki. Soovi ­
tatakse kasutada 1 000 mg/kg (kuivmass). Enamasti tuleb nii töötlus- kui ka kontrollseadmetega teha vähemalt kuus paralleelkatset. Tuleks tõendada piisava statistilise võimsuse olemasolu, et tuvastada katse- ja kontrollseadme 
tulemuste 20 % erinevus 5 % statistilise olulisusega (p = 0,05). Mõõdetavate 
suuruste (arengu kiirus ja kaal) puhul, kui andmed vastavad käesoleva katse nõuetele (normaalsus, ühtlane hajumine), on asjakohane statistiline meetod t-kriteerium. Kui need nõuded ei ole täidetud, võib kasutada mittevõrdse 
hajumise t-kriteeriumi või mitteparameetrilist testi, näiteks Wilcoxoni- 
Manni-Whithey testi. Valmikute väljaarenemise suhte puhul on asjakohane kasutada Fisheri täpset testi.
 
KATSE KÄIK  
Kokkupuutetingimused  
Rikastatud sette-vee süsteemi valmistamine  
22. Uuritavate ainete lisamiseks soovitatakse kasutada rikastamismeetodit, mida 
on kirjeldatud katsemeetodis C.8 „Toksilisus vihmaussidele” (14). Rikas ­
tatud setted asetatakse nõudesse ja neile lisatakse kattev veekiht, et saada 
sette-vee ruumala suhe 1 : 4 (vt punktid 11 ja 15). Settekihi paksus peaks 
olema 1,5–3 cm. Sette osade eraldumise ja veesambas katsevee lisamisel peene materjali uue suspensiooni tekkimise vältimiseks võib sette katta vee valamise ajal plastikkettaga, mis pärast vee valamist kohe eemaldatakse. 
Võib kasutada ka muid võtteid.
 
23. Katsenõud peaksid olema kaetud (näiteks klaasplaadiga). Vajaduse korral 
lisatakse vee aurumise kompenseerimiseks ja uuringu algse veetaseme 
saavutamiseks vett. Soolade kogunemise vältimiseks tuleks lisada destillee ­
ritud või deioniseeritud vett.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Püsikindluse tagamine  
24. Kui rikastatud sete koos katva veekihiga on valmistatud, on soovitatav lasta 
uuritaval kemikaalil jaotuda vee ja sette vahel (3, 4, 6, 13). Seda tuleks eelistatavalt teha katses kasutatavates temperatuuri- ja õhustustingimustes. 
Vajalik tasakaalustumisaeg sõltub settest ja kemikaalist ning võib kesta 
tunde, päevi ja harvadel juhtudel isegi kuni mitu nädalat (4–5 nädalat). Kuna paljud kemikaalid võivad sellise aja jooksul laguneda, ei oodata tasa ­
kaaluoleku teket, vaid soovitatakse 48-tunnist tasakaalustamise ajavahe ­
mikku. Kõnealuse täiendava tasakaalustamise ajavahemiku lõpus tuleks 
mõõta uuritava aine kontsentratsioon katvas veekihis, poorivees ja settes vähemalt suurimal ja väiksemal kontsentratsioonil (vt punkt 38). Need uuri ­
tava aine analüütilised määramised võimaldavad arvutada massitasakaalu ja 
väljendada tulemusi mõõdetud kontsentratsioonide alusel.
 
Katseorganismide lisamine  
25. Neli kuni viis päeva enne katseorganismide lisamist katsenõudesse tuleks 
võtta kultuuridest munamassid ja asetada need väikestesse nõudesse kultuuri 
kasvukeskkonnas. Võib kasutada varukultuuri vana kasvukeskkonda või värskelt valmistatud kasvukeskkonda. Viimati nimetatu kasutamisel tuleks lisada kultuuri kasvukeskkonnale väikses koguses sööta, näiteks roheveti ­
kaid ja/või paar tilka peeneks jahvatatud helbelise kalasööda suspensiooni 
filtraadist (vt 2. liide). Tuleks kasutada ainult värskelt munetud munamasse. Tavaliselt hakkavad vastsed kooruma paari päeva möödumisel munade munemisest (2–3 päeva  Chironomus riparius’ e puhul temperatuuril 20 °C 
ning 1–4 päeva  Chironomus tentans’ i puhul temperatuuril 23 °C ja  Chiro­
nomus yoshimatui  puhul temperatuuril 25 °C) ja vastsed kasvavad neljas 
kasvujärgus, millest iga kasvujärk kestab 4–8 päeva. Katses tuleks kasutada 
esimese kasvujärgu vastseid (2–3 või 1–4 päeva pärast koorumist). Sääskede 
kasvujärke on võimalik kontrollida peakapsli laiuse mõõtmisega (6).
 
26. Tömbi pipeti abil jaotatakse 20 esimese kasvujärgu vastset juhuslikult igasse 
katsenõusse, mis sisaldavad rikastatud setet ja vett. Vee aereerimine tuleb vastsete katsenõudesse lisamise ajal peatada ja seda ei jätkata 24 tunni vältel 
pärast vastsete lisamist (vt punktid 25 ja 32). Kasutatava katsekava kohaselt 
(vt punktid 19 ja 20) on kasutatud vastsete arv kontsentratsiooni kohta toimet avaldava kontsentratsiooni (EC-punkti) hindamise korral vähemalt 60 ja täheldatava toimeta kontsentratsiooni määramise korral 80.
 
Uuritavad kontsentratsioonid  
27. Annusevahemiku leidmise katse võib aidata kindlaks teha lõpliku katse 
kontsentratsioonivahemikke. Selleks kasutatakse uuritava aine laiade vahe ­
dega kontsentratsioonide seeriat. Lõplikus katses kasutatavaga sama pindti ­
heduse tagamiseks iga surusääsklase kohta puutuvad surusääsklased kokku 
uuritava aine iga kontsentratsiooniga sellise ajavahemiku vältel, mis võimaldab hinnata asjakohaseid katsekontsentratsioone; paralleelproovid ei ole vajalikud.
 
28. Lõpliku katse kontsentratsioonid määratakse kindlaks annusevahemiku leid ­
mise katse tulemuse alusel. Tuleks kasutada vähemalt viit kontsentratsiooni 
ja need tuleks valida nii, nagu on kirjeldatud punktides 18–20.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontrollkatsed  
29. Katse peaks hõlmama vajalikku arvu paralleelseid settega kontrollkatse ­
nõusid, milles ei ole uuritavat ainet (vt punktid 19–20). Kui uuritava aine lisamiseks on kasutatud lahustit (vt punkt 16), siis tuleks teha settele lahusti 
lisamise kontrollkatse.
 
Katsesüsteem  
30. Kasutatakse staatilisi süsteeme. Erandjuhul võib kasutada poolstaatilisi või 
läbivooluga süsteeme koos katva veekihi vahelduva või pideva uuendami ­
sega, näiteks kui vee kvaliteet ei ole katseorganismile enam sobiv või 
mõjutab kemikaali tasakaaluolekut (näiteks lahustunud hapniku tase langeb liiga madalale, väljutatud saaduste kontsentratsioon muutub liiga suureks või settest leostuvad mineraalained, mis mõjutavad pH-d ja/või vee karedust). 
Tavaliselt on siiski piisavad ja eelistatavad muud katva veekihi kvaliteedi 
parandamise meetodid, näiteks aereerimine.
 
Sööt 
31. Vastseid tuleb sööta eelistatavalt iga päev või vähemalt kolm korda nädalas. 
Kalasööt (suspensioon vees või peeneks jahvatatud sööt, näiteks TetraMin 
või TetraPhyll; vt andmed, 2. liide) koguses 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg  C. 
yoshimatui  puhul) vastse kohta päevas näib olevat esimese kümne päeva 
jooksul noorte vastsete jaoks piisav. Vanemad vastsed võivad vajada mõne ­
võrra rohkem sööta: 0,5–1 mg vastse kohta päevas peaks olema piisav 
ülejäänud katse vältel. Söödakogust tuleks vähendada kõigi töötlemiste korral ja reguleerida, kui täheldatakse seente kasvu või kui kontrollkatses täheldatakse suremust. Kui seente kasvu ei ole võimalik peatada, tuleb katset 
korrata. Kui katseid tehakse tugevalt adsorbeeruva ainega (näiteks log K
 ow > 
5) või settega kovalentseid sidemeid tekitava ainega, võib enne stabilisee ­
rumise ajavahemikku lisada spetsiaalselt koostatud settele sellise söödako ­
guse, mis on vajalik organismide elulemuse ja loodusliku kasvu tagamiseks. 
Selleks tuleb kasutada kalasööda asemel taimset materjali, näiteks võib 
kasutada 0,5 % (kuivmass) kõrvenõgese ( Urtica dioica ), mooruspuu 
(Morus alba ), valge ristiku ( Trifolium repens ), spinati ( Spinacia oleracea ) 
peeneks jahvatatud lehti või muud taimset materjali ( Cerophyl  või alfatsel ­
luloos).  
Inkubeerimistingimused  
32. Eelistatavalt 24 tundi pärast vastsete lisamist hakatakse katsenõudes katvat 
veekihti kergelt aereerima, mida jätkatakse kogu katse vältel (tuleb olla 
hoolikas, et lahustunud hapniku kontsentratsioon ei langeks alla 60 % 
hapniku küllastuskontsentratsioonist). Aereerimiseks kasutatakse klaasist Pasteuri pipetti, mis on kinnitatud settekihi kohale 2–3 cm kõrgusele (üks või mõni mull sekundis). Lenduva kemikaali katsetamisel võib kaaluda 
sette-vee süsteemi aereerimisest loobumist.
 
33. Katse tehakse püsival temperatuuril 20 °C (±2 °C).  C. tentans’ i ja C. yoshi­
matui  puhul on soovitatavad temperatuurid vastavalt 23 °C ja 25 °C 
(±2 °C). Kasutatakse 16-tunnist valgustusperioodi ja valguse intensiivsus 
peaks olema 500 kuni 1 000 luksi.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Kokkupuute kestus  
34. Kokkupuude algab vastsete lisamisega rikastatud ja kontrollnõudesse. 
Maksimaalne kokkupuute kestus on 28 päeva  C. riparius’ e ja C. yoshi ­
matsui  puhul ning 65 päeva  C. tentans’ i puhul. Kui sääsed arenevad välja 
varem, võib katse lõpetada vähemalt viie päeva möödumisel pärast viimase 
valmiku väljaarenemist kontrollnõus.  
Vaatlused  
Väljaarenemine  
35. Tehakse kindlaks arengu aeg ning täielikult väljaarenenud isas- ja emassääs ­
kede koguarv. Isased on tänu sulgjatele tundlatele kergesti äratuntavad.  
36. Katsenõusid tuleks vaadelda vähemalt kolm korda nädalas, et hinnata 
visuaalselt iga ebatavalist käitumist (näiteks settest väljumine, ebatavaline 
ujumine) kontrollnõuga võrreldes. Oodataval valmikute ilmumise ajal loen ­
datakse sääski iga päev. Registreeritakse täielikult väljaarenenud sääskede sugu ja arv. Pärast tuvastamist kõrvaldatakse sääsed nõudest. Enne katse lõpetamist munetud munamassid tuleks registreerida ja seejärel eemaldada, 
et vältida settesse uute vastsete teket. Samuti registreeritakse nende nähta ­
vate nukkude arv, millest sääsk ei koorunud. Suunised väljaarenemise mõõt ­
mise kohta on esitatud 5. liites.
 
Kasvamine ja elulemus  
37. Kui on vaja esitada andmeid vastsete elulemuse ja kasvu kohta kümne päeva 
jooksul, tuleks katset alustada suurema arvu nõudega, et neid oleks võimalik 
seejärel kasutada. Kõnealuste täiendavate nõude setteid sõelutakse vastsete 
saamiseks 250 μm sõela abil. Surma tuvastamise kriteeriumid on liikumatus 
või reageerimatus mehaanilisele stiimulile. Vastsed, keda ei õnnestunud kätte saada, tuleks samuti surnuks lugeda (vastsed, kes surid katse alguses, 
võivad olla juba mikroobide poolt lagundatud). Tehakse kindlaks ellujäänud 
vastsete (tuhavaba) kuivmass katsenõu kohta ja arvutatakse keskmine indi ­
viduaalne kuivmass nõu kohta. Kasulik on määrata, millisesse kasvujärku ellujäänud vastsed kuuluvad; selleks võib mõõta iga isendi peakapsli laiust.
 
Analüütilised mõõtmised  
Uuritava aine kontsentratsioon  
38. Uuritava aine kontsentratsiooni analüütiliseks määramiseks settes võetakse 
sette proovid enne katse algust (s.o vastsete lisamist) vähemalt ühest nõust 
iga kokkupuutetaseme kohta. Soovitatakse, et katse alguses (vt punkt 24) ja 
lõpus analüüsitakse suurimal ja väikseimal kontsentratsioonil vähemalt katva veekihi, poorivee ja sette proove. Kõnealused uuritava aine kontsentratsiooni määramised annavad teavet uuritava aine käitumise/jaotumise kohta 
vee-sette süsteemis.
 
39. Kui tehakse vahepealseid mõõtmisi (näiteks seitsmendal päeval) või kui 
analüüsi jaoks on vaja suurt proovi, mida ei saa katsenõust ilma katsesüs ­
teemi mõjutamata võtta, tuleks analüüs teha samal viisil töödeldud, kuid 
bioloogilisteks vaatlusteks mitte kasutatavast täiendavast katsenõust (kus 
on ka katseorganismid) võetud proovist.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Tsentrifuugimine näiteks 10 000 g ja 4 °C juures 30 minuti vältel on soovi ­
tatav meetod poorivee eraldamiseks. Kui on tõendatud, et uuritav aine ei 
adsorbeeru filtritele, võib sobida ka filtrimine. Mõnel juhul ei pruugi liiga väikse proovi suuruse tõttu olla võimalik poorivee kontsentratsiooni määra ­
mine.
 
Füüsikalis-keemilised parameetrid  
41. Katsenõude pH-d ja temperatuuri (vt punkt 10) tuleks mõõta asjakohasel 
viisil. Katse alguses ja lõpus tuleks kontrollnõudes ja ühes suurima kontsen ­
tratsiooniga katsenõus mõõta karedust ja ammoniaaki.  
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Tulemuste töötlemine  
42. Kõnealuse katse eesmärk on teha kindlaks uuritava aine mõju isas- ja emas ­
sääskede arengu kiirusele ning täielikult välja arenenud sääskede koguarvule või kümnepäevase katse korral mõju vastsete elulemusele ja kehamassile. Kui puuduvad andmed sugude statistiliselt erineva tundlikkuse kohta, võib 
statistilistes analüüsides isaste ja emaste tulemused koondada. Sugude 
erinevat tundlikkust on võimalik statistiliselt hinnata näiteks χ
 2 -r × 2 tabeli 
testi abil. Vajaduse korral tuleb kümne päeva möödumisel teha kindlaks vastsete elulemus ja keskmine individuaalne kuivmass nõu kohta.
 
43. Toimet avaldavad kontsentratsioonid, mis põhinevad kuivmassil ja väljenda ­
takse kuivmassina, arvutatakse eelistatavalt katse alguses mõõdetud sette 
kontsentratsioonide alusel (vt punkt 38).  
44. EC  50 või muu EC  x -näitaja arvutamiseks võib tegelike paralleelproovidena 
kasutada nõude statistikat. Iga EC  x usaldusvahemiku arvutamisel tuleks 
arvesse võtta eri nõude tulemuste hajumist või tuleks näidata, et kõnealune hajumine on nii väike, et seda võib eirata. Kui andmeid töödeldakse mudeli 
parameetrite leidmiseks vähimruutude meetodiga, tuleks nõu statistikat 
teisendada, et dispersioon oleks ühtlasem. EC
 x -väärtused tuleks siiski arvu ­
tada pärast tulemuse esialgsele väärtusele tagasiteisendamist.  
45. Kui statistilise analüüsi eesmärk on teha hüpoteesi katsetamise abil kindlaks 
täheldatava toimeta kontsentratsioon / vähim täheldatava toimega kontsen ­
tratsioon, tuleb võtta arvesse nõudevahelist hajuvust, näiteks kasutada hierar ­
hilist dispersioonanalüüsi ( nested  ANOVA). Olukorras, kus tavapärased 
dispersioonanalüüsi (ANOVA) eeldused ei ole täidetud, võivad paremini sobida töökindlamad testid (21).
 
Väljaarenemise määr  
46. Väljaarenemise määrad on kõik-või-mitte-midagi-andmed ja neid on 
võimalik analüüsida astmeliselt kohaldatava Cochrani-Armitage’i testi abil, kus eeldatakse, et mõju sõltuvus doosist on monotoonne, ja need andmed on 
selle eeldusega kooskõlas. Vastasel juhul võib kasutada Fisheri täpset testi 
või Manteli-Haenszeli testi Bonferroni-Holmi kohandatud p-väärtustega. Kui on tõendeid, et ühe kontsentratsiooniga paralleelproovide hajuvus on suurem, kui eeldatakse binoomjaotuse dispersiooni puhul (nn ekstra-binoom ­
jaotuse dispersioon), tuleks kasutada töökindlat Cochrani-Armitage’i või 
Fisheri täpset testi, nagu on soovitatud (21).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Määratakse nõu kohta välja arenenud sääskede arv n  e , mis jagatakse lisatud 
vastsete arvuga n  a : 
ER ¼ n e 
n a 
kus: 
ER = väljaarenemise määr  
n e = nõu kohta välja arenenud sääskede arv  
n a = nõu kohta lisatud vastsete arv.  
47. Ekstra-binoomjaotuse dispersiooni korral on suurte valimite puhul kõige 
asjakohasem alternatiiv käsitleda väljaarenemise määra pideva vastusena ning kasutada selliseid meetodeid nagu Williamsi test, kui võib eeldada, 
et mõju sõltuvus doosist on monotoonne, kui see on kooskõlas kõnealuste 
väljaarenemise määra andmetega. Kui monotoonsust ei ole, on asjakohane kasutada Dunnetti testi. Suur valim on siinkohal määratletud kui väljaare ­
nenud sääskede arv ja väljaarenemata jäänud sääskede arv, mis mõlemad on 
suuremad kui viis paralleelproovi (nõu) kohta.
 
48. Dispersioonanalüüsi (ANOVA) meetodite kohaldamiseks tuleks väljaarene ­
mise määra väärtused kõigepealt teisendada arkussiinus-ruutjuure-teisenduse või Freemani-Tukey teisenduse abil, et saada ligikaudne normaaljaotus ja võrdsustada variatsioonid. Cochrani-Armitage’i testi, Fisheri täpse testi 
(Bonferroni) või Manteli-Haenszeli testi võib kasutada absoluutsete sage ­
duste kasutamisel. Arkussiinus-ruutjuure-teisendust kohaldatakse, arvutades väljaarenemise määra ruutjuure siinuse pöördarvu (sin
 –1 ). 
49. Väljaarenemise määrade puhul arvutatakse EC  x -väärtused regressioonana ­
lüüsi (või näiteks probit- (22) või logit-teisenduse, Weibulli meetodi, sobiva 
müügiloleva tarkvara jne) abil. Kui regressioonanalüüs ebaõnnestub (näiteks 
kui on vähem kui kaks osalist vastust), kasutatakse muid mitteparameetrilisi meetodeid, näiteks libisev keskmine või lihtne interpolatsioon.
 
Arengu kiirus  
50. Keskmine arengu aeg on keskmine ajavahemik vastsete lisamise (katse 
päev 0) ja sääskede katsekohordi tekke vahel. (Tegeliku arenguaja arvuta ­
miseks tuleks arvesse võtta vastsete vanust lisamise ajal.) Arengu kiirus on 
pöördvõrdeline arengu ajaga (ühik: 1/päev) ja väljendab vastsete arengu 
seda osa, mis toimub ühe päeva jooksul. Kõnealuste sette mürgisuse hinda ­
mise uuringute puhul eelistatakse arengu kiirust, kuna selle dispersioon on väiksem, homogeensem kui arenguaja puhul ja lähedasem normaaljaotusele. 
Seega võib arengu kiiruse puhul kasutada tugevaid parameetrilisi testimis ­
meetodeid, mida ei saa kasutada arenguaja puhul. Arengu kiiruse kui pideva vastuse jaoks saab EC
 x -väärtusi hinnata regressioonanalüüsiga (näiteks 23, 
24). 
51. Järgmiste statistiliste testide puhul eeldatakse, et kontrolli päeval x tähel ­
datud sääsed on välja arenenud keskmisel ajavahemikul päeva x ja päeva x 
– l vahel (l = kontrollimistevahelise ajavahemiku pikkus, tavaliselt üks päev). Keskmine arengu kiirus nõu kohta ( x) arvutatakse järgmise võrrandi 
alusel:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
kus: 
x – keskmine arengu kiirus nõu i kohta  
i – kontrollivahemiku indeks  
m – kontrollivahemike maksimaalne arv  
ƒ i – kontrollivahemikul i välja arenenud sääskede arv  
n e – katse lõpuks välja arenenud sääskede koguarv (=  P ƒ i ) 
x i – ajavahemikul i välja arenenud sääskede arengu kiirus  
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
kus: 
day  i (päev  i ) – kontrolli päev (lisamisest möödunud päevade arv)  
l i – kontrolli vahemiku pikkus i (päevades, tavaliselt üks päev).  
Katseprotokoll  
52. Katseprotokollis tuleks esitada vähemalt järgmine teave.  
Uuritav aine:  
— füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused 
(lahustuvus vees, aururõhk, jaotustegur mullas (või settes, kui see on 
määratud), stabiilsus vees jne);  
— kemikaali tunnusandmed (üldkasutatav nimetus, keemiline nimetus, 
struktuurivalem, CASi number jne), sh puhtus ja uuritava aine kvantita ­
tiivse analüüsi meetod.  
Katseorganismi liik:  
— kasutatud katseloom: liik, teaduslik nimetus, organismide päritolu ja 
kasvatustingimused;  
— teave munamasside ja vastsete käsitlemise kohta;  
— katseloomade vanus katsenõudesse sisestamise ajal.  
Katsetingimused:  
— kasutatud sete, s.o looduslik või spetsiaalselt koostatud sete;  
— loodusliku sette puhul setteproovi võtmise koha asukoht ja kirjeldus, sh 
võimaluse korral saastumise ajalugu; omadused: pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, süsiniku-lämmastiku suhe ja granulomeetria (kui see on asja ­
kohane);
 
— spetsiaalselt koostatud sette valmistamine: koostisosad ja omadused 
(orgaanilise süsiniku sisaldus, pH, niiskus jne katse alguses);  
— katsevee valmistamine (kui kasutatakse taastatud vett) ja omadused 
(hapnikusisaldus, pH, elektrijuhtivus, karedus jne katse alguses);  
— settekihi ja katva veekihi paksus;  
— katva veekihi ja poorivee maht; märja sette kaal koos pooriveega ja ilma 
selleta;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— katsenõud (materjal ja suurus);  
— sette rikastamise meetod: kasutatud uuritava kemikaali kontsentrat ­
sioonid, paralleelproovide arv ja lahusti kasutamine, kui seda tehti;  
— rikastatud sette-vee süsteemi stabiliseerimise tasakaaluoleku faas; kestus 
ja tingimused;  
— inkubatsioonitingimused: temperatuur, valgustusperiood ja valguse inten ­
siivsus, aereerimine (sagedus ja intensiivsus);  
— üksikasjalik teave söötmise kohta, sh sööda tüüp, valmistamine, kogus ja 
söötmise ajakava.  
Tulemused:  
— nominaalsed katsekontsentratsioonid, mõõdetud katsekontsentratsioonid 
ja kõigi nende analüüside tulemused, millega määrati uuritava aine kont ­
sentratsiooni katsenõus;  
— vee kvaliteet katsenõus, s.o pH, temperatuur, lahustunud hapnik, karedus 
ja ammoniaak;  
— aurustunud katsevee asendamine, kui seda tehti;  
— väljaarenenud isas- ja emassääskede arv iga nõu ja iga päeva kohta;  
— iga nõu kohta nende vastsete arv, kellest sääski ei arenenud;  
— vastsete keskmine individuaalne kuivmass iga nõu ja kasvujärgu kohta, 
kui see on asjakohane;  
— valmikute väljaarenemise protsent iga paralleelproovi ja katsekontsentrat ­
siooni kohta (isas- ja emassääsed kokku);  
— täielikult välja arenenud sääskede keskmine arengu kiirus iga paralleel ­
proovi ja katsekontsentratsiooni kohta (isas- ja emassääsed kokku);  
— mürgisuse näitajate hinnangud, näiteks EC  x (ja selle usaldusvahemik), 
täheldatava toimeta kontsentratsioon ja/või vähim täheldatava toimega 
kontsentratsioon ning nende määramiseks kasutatud statistilised 
meetodid;  
— tulemuste arutelu, kaasa arvatud käesolevast katsemeetodist kõrvalekal ­
dumise võimalik mõju katsetulemustele.  
KIRJANDUS  
1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
 
2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
 
4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; 
Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
 
5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
 
7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14) Käesoleva lisa katsemeetod C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.  
15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for  
Chironomus riparius  using a formulated sediment. Chemosphere 31: 
3291–3303.  
17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.  
18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482–491.  
19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103–117.  
20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48: 577–585.  
22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.  
24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
1. liide  
MÕISTED  
Käesolevas katsemeetodis kasutatakse järgmisi mõisteid järgmises tähenduses:  
spetsiaalselt koostatud sete  (ehk taastatud, tehislik või sünteetiline sete) – 
selliste materjalide segu, mida kasutatakse loodusliku sette füüsiliste koostisosade imiteerimiseks;
 
kattev veekiht  – vesi, mis pannakse katsenõus sette peale;  
poorivesi  – sette- või mullaosakeste vahelises ruumis olev vesi;  
rikastatud sete  – sete, millele on lisatud uuritavat ainet;  
uuritav kemikaal  – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
2. liide  
Chironomus riparius ’e kasvatamist käsitlevad soovitused  
1. Chironomus ’e vastseid võib kasvatada kristallisatsiooninõus või suuremas 
mahutis. Mahuti põhi kaetakse ligikaudu 5–10 mm paksuse peene kvarts ­
liiva kihiga. Diatomiit (näiteks Merck, Art 8117) on samuti tõendatult sobiv substraat (piisab õhemast kihist, isegi mõnest millimeetrist). Seejärel lisa ­
takse sobivat vett mitme cm paksuse kihina. Vett tuleks vajaduse korral 
lisada aurumiskadude asendamiseks ja kuivamise vältimiseks. Vee võib vajaduse korral välja vahetada. Tuleks tagada kerge aereerimine. Vastsete kasvatamise nõusid tuleks hoida vastavas puuris, millega takistatakse väljaa ­
renenud täiskasvanud isendite väljapääsu. Puur peaks olema piisavalt suur, 
et võimaldada väljaarenenud valmikute parvedesse kogunemist, vastasel juhul ei pruugi toimuda paljunemist (miinimumsuurus on ligikaudu 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Puure tuleks hoida toatemperatuuril või püsiva keskkonnaga ruumis tempe ­
ratuuril 20 ± 2 °C 16-tunnise valgustusperioodiga (intensiivsus ligikaudu 1 000 luksi) ja kaheksa tunni pimedusega. On teada, et vähem kui 60 %- line suhteline õhuniiskus võib paljunemist takistada.
 
Lahjendusvesi  
3. Võib kasutada mis tahes looduslikku või sünteetilist vett. Enamasti kasuta ­
takse kaevuvett, deklooritud kraanivett ja tehislikke kasvukeskkondi (näiteks 
Elendti kasvukeskkond M4 või M7, vt allpool). Vett tuleb enne kasutamist aereerida. Vajaduse korral võib kultuuri kasvuvett uuendada, eemaldades kasutatud vee kultuuri kasvunõudest ettevaatlikult valamise teel või sifoo ­
niga, kahjustamata vastsete kestasid.
 
Vastsete söötmine  
4. Chironomus ’e vastseid tuleks sööta helbelise kalasöödaga (TetraMin®, 
TetraPhyll® või muu samalaadne kaubanduslik kalasööda tootemark) koguses ligikaudu 250 mg nõu kohta päevas. Sööta võib anda kuiva jahva ­
tatud pulbrina või suspensioonina vees: 1,0 g helbelist kalasööta lisatakse 20 
ml lahjendusveele ja see segatakse homogeense segu saamiseni. Seda prepa ­
raati võib sööta koguses 5 ml nõu kohta päevas (preparaati tuleks enne kasutamist loksutada). Vanemad vastsed võivad vajada rohkem sööta.
 
5. Söötmist kohandatakse vee kvaliteediga. Kui kultuuri kasvukeskkond 
muutub häguseks, tuleks sööda hulka vähendada. Sööda lisamist tuleb hooli ­
kalt jälgida. Liiga vähe sööta põhjustab vastsete rände veesamba suunas ning liiga palju sööta hoogustab mikroobide tegevust ja vähendab vee hapnikusisaldust. Mõlemad tingimused võivad vähendada kasvu kiirust.
 
6. Uute kultuuri kasvunõude valmisseadmisel võib lisada ka mõne rohevetika 
(näiteks  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ) rakke.  
Väljaarenenud valmikute söötmine  
7. Mõned teadlased on soovitanud väljaarenenud valmikute söötmiseks kasu ­
tada küllastunud sahharoosilahuses niisutatud puuvillast lappi.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Väljaarenemine  
8. Ligikaudu 13–15 päeva möödumisel hakkavad temperatuuril 20 ± 2 °C 
vastsete kasvatamise nõudest väljuma valmikud. Isased on tänu sulgjatele tundlatele kergesti äratuntavad.
 
Munamassid  
9. Kui valmikud on paljundamispuuris, tuleks kõiki vastsete kasvatamise 
nõusid kontrollida kolm korda nädalas sinna želatiinjate munamasside lisan ­
dumise suhtes. Kui leitakse munamass, tuleks see hoolikalt kõrvaldada. See 
tuleks üle kanda väiksele tassile, mis sisaldab paljundusvee proovi. Muna ­
masse kasutatakse uue kasvunõu kasutusele võtmiseks (näiteks 2–4 muna ­
massi nõu kohta) või mürgisuse katsetes.  
10. Esimese kasvujärgu vastsed peaksid kooruma 2–3 päeva pärast.  
Uute kasvunõude ülesseadmine  
11. Kui kultuurid on loodud, peaks iga nädal (või katsenõuetest olenevalt väik ­
sema sagedusega) olema võimalik vastsete uute kasvunõude ülesseadmine, kõrvaldades vanemad nõud pärast täiskasvanud sääskede väljaarenemist. 
Seda süsteemi kasutades saadakse minimaalse vaevaga regulaarne valmikute 
varu.
 
Katselahuste M4 ja M7 valmistamine  
12. Elendt (1990) on kirjeldanud kasvukeskkonda M4. Kasvukeskkond M7 
valmistatakse samal viisil kui kasvukeskkond M4, v.a tabelis 1 nimetatud 
ainete puhul, mille kontsentratsioon kasvukeskkonnas M7 on kasvukeskkon ­
naga M4 võrreldes neli korda väiksem. Kasvukeskkonda M7 käsitlev artikkel on kirjutamisel (Elendt, isiklik teade). Katselahust ei tohiks koos ­
tada Elendti ja Biasi (1990) järgi, kuna põhilahuste valmistamiseks ei ole 
antud NaSiO
 3 · 5H  2 O, NaNO  3 , K 2 HPO  4 ja K  2 HPO  4 kontsentratsioon sobiv.  
Kasvukeskkonna M7 valmistamine  
13. Iga põhilahus (I) valmistatakse eraldi ja kombineeritud põhilahus (II) 
valmistatakse kõnealustest põhilahustest (I) (vt tabel 1). Kasvukeskkonna M7 valmistamiseks võetakse 50 ml kombineeritud põhilahust (II), lisatakse 
iga makrotoitaine põhilahuse kogused, mis on esitatud tabelis 2 ja täienda ­
takse deioniseeritud veega 1 liitrini. Vitamiinide põhilahuse valmistamiseks lisatakse deioniseeritud veele kolme vitamiini, nagu on näidatud tabelis 3, ja lõplikule M7 kasvukeskkonnale lisatakse vahetult enne selle kasutamist 0,1 
ml kombineeritud vitamiinide põhilahust. (Vitamiinide põhilahust säilita ­
takse külmutatult väikeste alikvootidena). Kasvukeskkonda aereeritakse ja see stabiliseeritakse.
 
KIRJANDUS  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabel 1  
Kasvukeskkondade M4 ja M7 mikroelementide põhilahused  
Põhilahus (I) Kogus (mg), mis 
täiendatakse 
deioniseeritud 
veega 1 liitrini Kombineeritud põhilahuse (II) 
valmistamiseks: segage 
põhilahuste (I) järgmised kogused 
(ml) ja täiendage need 1 liitrini 
deioniseeritud veega Lõppkontsentratsioonid katselahustes 
(mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Need ained on M4 ja M7 puhul erinevad, nagu on eespool viidatud. 
( 2 ) Need lahused valmistatakse eraldi, valatakse seejärel kokku ja autoklaavitakse viivitamata.  
Tabel 2  
Kasvukeskkondade M4 ja M7 makrotoitainete põhilahused  
Kogus, mis täienda ­
takse deioniseeritud 
veega 1 liitrini 
(mg) Kasvukeskkondade M4 ja 
M7 valmistamiseks lisatav 
makrotoitainete põhilahuste 
kogus 
(ml/l) Lõppkontsentrat ­
sioonid katselahustes 
M4 ja M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabel 3  
Kasvukeskkondade M4 ja M7 vitamiinide põhilahus. Vitamiinide ühe põhilahuse 
valmistamiseks valatakse kokku kõik kolm vitamiinilahus  
Kogus, mis täiendatakse 
deioniseeritud veega 1 
liitrini 
(mg) Kasvukeskkondade M4 ja M7 
valmistamiseks lisatav vita ­
miinide põhilahuse kogus 
(ml/l) Lõppkontsentratsioonid 
katselahustes M4 ja M7 
(mg/l)  
Tiamiinvesinikkloriid 750 0,1 0,075 
Tsüanokobalamiin 
(B12) 10 0,1 0,0010 
Biotiin 7,5 0,1 0,00075  
KIRJANDUS  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25–33.  
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
3. liide  
SPETSIAALSELT KOOSTATUD SETTE VALMISTAMINE  
Sette koostis  
Spetsiaalselt koostatud sette koostis peaks olema järgmine:  
Koostisosa Kirjeldus Sette 
kuivmassi protsent  
Turvas Turbasamblaturvas, mille pH 
on võimalikult lähedal vahe ­
mikule 5,5–6,0, nähtavad 
taimeosad puuduvad, peeneks jahvatatud (osakese suurus ≤ 
1 mm) ja õhu käes kuivatatud 4–5 
Kvartsliiv Tera suurus: > 50 % osakes ­
test peaksid olema vahemikus 
50–200 μm 75–76 
Kaoliinsavi Kaoliniidisisaldus ≥ 30 % 20 
Orgaaniline süsinik Reguleeritakse turba ja liiva 
lisamisega 2 (±0,5) 
Kaltsiumkarbonaat CaCO
 3 , pulbriks jahvatatud, 
keemiliselt puhas 0,05–0,1 
Vesi Juhtivus ≤ 10 μS/cm 30–50  
Valmistamine  
Turvas kuivatatakse õhu käes ja jahvatatakse peeneks pulbriks. Valmistatakse 
vajaliku turbapulbrikoguse suspensioon deioniseeritud vees, kasutades tõhusat 
homogenisaatorit. Selle suspensiooni pH reguleeritakse CaCO  3 abil vahemikku 
5,5 ± 0,5. Suspensiooni konditsioneeritakse vähemalt kaks päeva temperatuuril 20 ± 2 °C kerge segamisega, et stabiliseerida pH ja luua stabiilne mikroobikom ­
ponent; pH mõõdetakse uuesti ja see peaks olema 6,0 ± 0,5. Seejärel segatakse 
turba suspensioon muude koostisosadega (liiv ja kaoliinsavi) ning deioniseeritud veega, et saada homogeenne sete, mille veesisaldus on vahemikus 30–50 % sette kuivmassist. Lõpliku segu pH mõõdetakse uuesti ja see reguleeritakse vajaduse 
korral CaCO
 3 abil vahemikku 6,5–7,5. Kuivmassi ja orgaanilise süsiniku sisal ­
duse määramiseks võetakse sette proovid. Enne, kui spetsiaalselt koostatud setet kasutatakse surusääsklastele mürgisuse katses, on soovitatav seda seitsme päeva jooksul konditsioneerida samades tingimustes, mis valdavalt esinevad edasise 
katse käigus.
 
Säilitamine  
Tehisliku sette valmistamiseks kasutatavaid kuivi koostisosi võib säilitada kuivas 
ja jahedas kohas toatemperatuuril. Spetsiaalselt koostatud (märga) setet ei tohiks 
enne selle katses kasutamist säilitada. Seda tuleks kasutada viivitamata pärast seitsmepäevast kohandamisperioodi, millega selle valmistamine lõpetatakse.
 
KIRJANDUS  
Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
4. liide  
Kasutuskõlbliku lahjendusvee keemilised omadused  
Aine Kontsentratsioonid  
Tahked osakesed < 20 mg/l 
Orgaanilise süsiniku kogusisaldus < 2 mg/l Ioniseerimata ammoniaak < 1 μg/l 
Karedus CaCO
 3 -na < 400 mg/l (*) 
Jääkkloor < 10 μg/l 
Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus < 50 ng/l Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüü ­
lide üldsisaldus < 50 ng/l 
Orgaanilise kloori üldsisaldus < 25 ng/l
 
(*) Kui kahtlustatakse karedust tekitavate ioonide ja uuritava aine omavahelist mõju, tuleks 
kasutada väiksema karedusega vett (ja seega ei tohiks nimetatud olukorras kasutada 
Elendti kasvukeskkonda M4).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
5. liide  
Suunised surusääsklaste vastsete valmikuteks väljaarenemise seireks  
Katsenõudele paigaldatakse väljaarenenud valmikute püüdurid. Neid püüdureid 
vajatakse alates 20. päevast kuni katse lõpuni. Kasutatava püüduri näidis on esitatud allpool.
 
A – nailonvõrk  
B – tagurpidi pööratud plastiktopsid  
C – tilata kokkupuutenõu  D – sõelaga kaetud veevahetusavad  
E – vesi  
F – sete  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28.  SETTE-VEE MÜRGISUSKATSE SURUSÄÄSKLASTEL 
RIKASTATUD VEE KASUTAMISEGA  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 219 (2004). 
Käesolev katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata pikaajalise kemi ­
kaalidega kokkupuute mõju settes elavatele magevee kahetiivaliste ( Chiro­
nomus  sp.) vastsetele. See põhineb peamiselt BBA suunisel, milles kasuta ­
takse sette-vee katsesüsteemi tehisliku mullaga ning veesamba kokkupuute 
stsenaariumiga (1). Selles võetakse samuti arvesse  Chironomus riparius’ e ja 
Chironomus tentans’ i kohta olemas olevaid mürgisuse määramise 
katse-eeskirju, mis on koostatud Euroopas ja Põhja-Ameerikas (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) ning mille puhul on tehtud laboritevahelised võrdluskatsed (1, 6, 9). 
Võib kasutada ka muid hästi dokumenteeritud surusääsklaste liike, näiteks  
Chironomus yoshimatsui’ d (10, 11).
 
2. Käesolevas katsemeetodis kasutatud kokkupuutestsenaarium on vee rikasta ­
mine. Sobiva kokkupuutestsenaariumi valimine oleneb katse kavandatud eesmärgist. Vee kokkupuutestsenaarium, mis hõlmab veesamba rikastamist, 
on kavandatud simuleerima pihustatud pestitsiidide hõljumist ja hõlmab 
esialgseid maksimaalseid kontsentratsioone poorivees. See on kasulik ka muud tüüpi kokkupuudete puhul (sh keemilised lekked), v.a katseperioodist pikemate kogunemisprotsesside puhul.
 
3. Ained, mille kohta on vaja teha katsed settes elavate organismidega, jäävad 
tavaliselt sellesse keskkonda pikaks ajaks püsima. Settes elavad organismid 
võivad kemikaaliga mitmel viisil kokku puutuda. Iga kokkupuutetee suhte ­
line tähtsus ja aeg, mis on iga kokkupuutetee puhul vajalik üldisse mürgi ­
susse panuse andmiseks, sõltub asjaomase kemikaali füüsikalis-keemilistest 
omadustest. Tugevasti adsorbeeruvate ainete (näiteks log K  ow > 5) või 
settega kovalentseid sidemeid moodustavate ainete puhul võib tähtis kokku ­
puutetee olla manustamine saastunud toiduga. Väga lipofiilsete ainete mürgi ­
suse alahindamise vältimiseks võib kaaluda settele sööda lisamist enne uuri ­
tava aine kasutamist. Kõigi võimalike kokkupuuteteede arvessevõtmiseks on käesolevas katsemeetodis keskendutud pikaajalisele kokkupuutele.  C. ripa­
rius’ e ja C. yoshimatsui  puhul kestab katse 20–28 päeva ning  C. tentans’ i 
puhul 28–65 päeva. Kui konkreetsel põhjusel vajatakse andmeid lühema aja 
kohta, näiteks ebastabiilse kemikaali mõju uurimiseks, võib kümnepäevase ajavahemiku järel võtta täiendavad paralleelproovid.
 
4. Mõõdetavad näitajad on vastsetest arenenud valmikute koguarv ja nende 
arenemiseks vajalik aeg. Vastsete elulemust ja kasvu soovitatakse mõõta 
alles pärast kümnepäevase ajavahemiku möödumist; kui lisaks vajatakse 
andmeid lühema aja kohta, kasutatakse vajaduse korral täiendavaid paral ­
leelkatseid.  
5. Soovitatakse kasutada spetsiaalselt koostatud setet. Spetsiaalselt koostatud 
settel on loodusliku sette ees mitmeid eeliseid:  
— väheneb katsete hajuvus, kuna nii saadakse reprodutseeritav standardi ­
seeritud maatriks ja kõrvaldatakse vajadus saastumata ja puhaste setteal ­
likate leidmiseks;  
— katseid võib alustada ükskõik millal, ei tule arvestada katse setete hooa ­
jalist muutlikkust ja setet ei ole vaja eeltöödelda kohaliku fauna kõrval ­
damiseks; spetsiaalselt koostatud sette kasutamine vähendab samuti 
korrapäraseks katsetamiseks kohapeal piisavas koguses sette kogumisega 
seotud kulusid;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— spetsiaalselt koostatud sette kasutamine võimaldab mürgisust võrrelda ja 
selle põhjal aineid järjestada: mürgisuse andmed looduslike ja tehislike 
setetega tehtud katsetest olid mitme kemikaali puhul võrreldavad (2).  
6. Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.  
KATSE PÕHIMÕTE  
7. Kõigepealt puutuvad surusääsklaste esimese kasvujärgu vastsed kokku 
sette-vee süsteemis teatavas kontsentratsioonivahemikus oleva uuritava 
ainega. Katse alguses pannakse esimese kasvujärgu vastsed katsenõudesse, 
mis sisaldavad sette-vee süsteemi, ja seejärel lisatakse uuritav aine vette (vesi „rikastatakse” uuritava ainega). Katse lõpus mõõdetakse surusääsklaste väljaarenemise määra ja arengu kiirust. Vastsete elulemust ja massi võib 
vajaduse korral mõõta ka kümne päeva möödumisel (kasutades vajaduse 
korral täiendavaid paralleelkatseid). Neid andmeid analüüsitakse kas regres ­
sioonimudeli abil, et hinnata kontsentratsioon, mis põhjustab valmikute väljaarenemise või vastsete elulemuse või kasvu x % vähenemise (näiteks 
EC
 15 , EC  50 jne), või kasutades täheldatava toimeta kontsentratsiooni / 
vähima täheldatava toimega kontsentratsiooni määramiseks statistilise hüpo ­
teesi testimise meetodit. Viimati nimetatud juhul tuleb täheldatud mõju väärtusi võrrelda statistiliste testide abil kontrollkatses määratud väärtustega.
 
ANDMED UURITAVA AINE KOHTA  
8. Teada peaks olema uuritava aine lahustuvus vees, aururõhk, mõõdetud või 
arvutatud jaotumine settesse ning stabiilsus vees ja settes. Kättesaadav peaks 
olema usaldusväärne analüüsimeetod uuritava aine kvantitatiivseks määrami ­
seks katvas veekihis, poorivees ja settes; meetodi täpsus ja määramispiir peaksid olema teada. Kasulik on teada uuritava aine struktuurivalemit ja 
puhtust. Samuti on kasulik teada uuritava aine keemilist käitumist (näiteks 
hajumine, abiootiline ja biootiline lagunemine jne). Täiendavad juhised selliste ainete mõju uurimiseks, mille füüsikalis-keemilised omadused raskendavad selle katse tegemist, on esitatud (12).
 
VÕRDLUSKEMIKAALID  
9. Võrdluskemikaale võib katsetada regulaarselt, et tagada katse-eeskirjade ja 
katsetingimuste täitmise usaldusväärsus. Laboritevahelistes võrdlustes ja 
valideerimisuuringutes edukalt kasutatud võrdlustoksikandid on näiteks: lindaan, trifluraliin, pentaklorofenool, kaadmiumkloriid ja kaaliumkloriid (1, 2, 5, 6, 13).
 
KATSE KEHTIVUS  
10. Katse kehtivuse tõendamisel arvestatakse järgmist:  
— kontrollnõus peab katse lõpuks välja arenema vähemalt 70 % putukaid 
(1, 6);  
— C. riparius’ e ja C. yoshimatsui  valmikute väljaarenemine kontrollnõudes 
peaks toimuma 12–23 päeva jooksul pärast nende viimist nõudesse;  C. 
tentans’ i puhul on vajalik ajavahemik 20–65 päeva;  
— katse lõpus tuleks igas nõus mõõta pH ja lahustunud hapniku kontsen ­
tratsioon. Hapnikukontsentratsioon peaks olema vähemalt 60 % õhuga 
küllastamisel saadud väärtusest kasutataval temperatuuril ja katva 
veekihi pH peaks kõigis katsenõudes olema vahemikus 6–9;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— vee temperatuur ei tohiks erineda rohkem kui ±1,0 °C võrra. Vee tempe ­
ratuuri on võimalik kontrollida isotermilise ruumi abil ja sel juhul peaks 
ruumi temperatuur olema sobivate ajavahemike järel kinnitatud.  
MEETODI KIRJELDUS  
Katsenõud  
11. Uuring tehakse 600 ml klaasist katsenõudega, mille läbimõõt on 8 cm. 
Muud nõud on sobivad, kuid need peaksid tagama katva veekihi ja sette vajaliku paksuse. Sette pind peaks olema piisav, et tagada vastse kohta 2–3 cm
 2 . Settekihi paksuse ja katva veekihi paksuse suhe peaks olema 1 : 
4. Katsenõud ja muud seadmed, mis katsesüsteemiga kokku puutuvad, 
peaksid olema valmistatud täies ulatuses klaasist või muust keemiliselt inert ­
sest materjalist (näiteks teflonist).  
Liigi valimine  
12. Katses kasutatav liik on eelistatavalt  Chironomus riparius . Chironomus 
tentans  on samuti sobiv, aga selle käsitlemine on keerukam ja see nõuab 
pikemat katseperioodi.  Chironomus yohimatsui  kasutamine on samuti 
võimalik. 2. liites on esitatud andmed  Chironomus riparius’ e kultuuri kasva ­
tamise meetodite kohta. Ka muude liikide, nagu  Chironomus tentans’ i (4) ja  
Chironomus yoshimatsui  (11) kultuuri kasvatamise tingimused on avaldatud. 
Enne katset tuleb kinnitada liigi määramist, aga seda ei nõuta enne iga 
katset, kui organismid pärinevad asutusesisesest kultuurist.  
Sete 
13. Eelistatavalt tuleks kasutada spetsiaalselt koostatud setet (mida nimetatakse 
ka taastatud, tehislikuks või sünteetiliseks setteks). Loodusliku sette kasuta ­
mise korral tuleks seda iseloomustada (vähemalt pH, orgaanilise süsiniku 
sisaldus, samuti on soovitatav määrata muud parameetrid, nagu süsiniku- lämmastiku suhe ja granulomeetria) ning selles ei tohiks olla mingeid saas ­
teaineid ega muid organisme, kes võiksid surusääsklastega konkureerida või 
neid süüa. Enne loodusliku sette kasutamist surusääsklastel avalduva mürgi ­
suse katses on soovitatav seda seitsme päeva jooksul konditsioneerida samades tingimustes, mis valdavalt esinevad edasise katse käigus. Käesole ­
vas katses soovitatakse kasutada järgmist spetsiaalselt koostatud setet, mis 
põhineb katsemeetodis C.8 (14) kasutataval tehismullal (1, 15, 16):
 
a) 4–5 % (kuivmass) turvast: pH väärtus võimalikult lähedal vahemikule 
5,5–6,0; tähtis on kasutada peeneks jahvatatud (osakese suurus ≤ 
1 mm) pulbrilist turvast, mida on kuivatatud ainult õhu käes;  
b) 20 % (kuivmass) kaoliinsavi (kaoliniidisisaldus eelistatavalt üle 30 %);  
c) 75–76 % (kuivmass) kvartsliiva (see peaks peamiselt koosnema peenest 
liivast ja rohkem kui 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 
50–200 μm); 
d) lõplikus segus niiskusesisalduse 30–50 % saamiseks lisatakse deionisee ­
ritud vett;  
e) sette lõpliku segu reguleerimiseks pH vahemikku 7,0 ± 0,5 lisatakse 
keemiliselt puhast kaltsiumkarbonaati (CaCO  3 ); 
f) Lõpliku segu orgaanilise süsiniku sisaldus peaks olema 2 % (±0,5 %) ja 
see tuleks õigeks seada sobivas koguses turba ja liiva kasutamisega 
kooskõlas alapunktidega a ja c.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Turba, kaoliinsavi ja liiva päritolu peaks olema teada. Sette koostisosi tuleks 
kontrollida, et tõendada keemilise saaste puudumine (näiteks raskmetallid, 
kloororgaanilised ühendid, fosfororgaanilised ühendid jne). Spetsiaalselt koostatud sette valmistamise näidis on esitatud 3. liites. Kuivade koostiso ­
sade segamine on samuti lubatav, kui tõendatakse, et pärast katva veekihi 
lisamist ei toimu sette koostisosade eraldumist (näiteks turbaosakeste hõlju ­
mist) ja et turvas või sete on piisavalt konditsioneerunud.
 
Vesi 
15. Katseveeks sobib vesi, mis vastab 2. ja 4. liites esitatud lahjendamiseks 
kasutatava vee nõutavatele keemilistele omadustele. Kasvuveena ja katse ­
veena lubatakse kasutada iga sobivat vett, looduslikku vett (pinna- või põhjavesi), taastatud vett (vt 2. liide) või deklooritud kraanivett, kui suru ­
sääsklased jäävad selles kasvatamise ja katsetamise ajal ellu ega ilmuta 
stressi tunnuseid. Katse alguses peaks katsevee pH olema vahemikus 6–9 
ja vee summaarne karedus ei tohiks olla suurem kui 400 mg/l CaCO
 3 -na. 
Kui oletatakse karedust tekitavate ioonide ja uuritava aine omavahelist mõju, tuleks kasutada siiski väiksema karedusega vett (ja seega ei tohiks sel juhul 
kasutada Elendti kasvukeskkonda M4). Kogu uuringu vältel tuleks kasutada 
sama tüüpi vett. 4. liites loetletud vee kvaliteedi omadusi tuleks mõõta vähemalt kaks korda aastas või siis, kui kahtlustatakse, et kõnealused omadused võivad olla oluliselt muutunud.
 
Põhilahused – rikastatud vesi  
16. Katsekontsentratsioonid arvutatakse veesambas olevate kontsentratsioonide 
alusel, s.o setet katva veekihi alusel. Valitud kontsentratsiooniga uuritavad lahused valmistatakse tavaliselt põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahuse 
valmistamiseks on soovitatav lahustada uuritav aine katsekeskkonnas. 
Mõnel juhul võib sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks olla vajalik lahusti või dispergendi kasutamine. Sobivad lahustid on atse ­
toon, etanool, metanool, etüleenglükoolmonometüüleeter, etüleenglükooldi ­
metüüleeter, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool. Sobivad dispergendid 
on Cremophor RH40, Tween 80, metüültselluloos (0,01 %) ja HCO-40. Solubiliseeriva aine kontsentratsioon lõplikus katse kasvukeskkonnas peaks olema minimaalne (s.o ≤ 0,1 ml/l) ja see peaks olema sama kõigi töötlemiste 
puhul. Solubiliseeriva aine kasutamisel ei tohi sellel olla märkimisväärset 
mõju surusääsklaste vastsete elulemusele ega märgatavat negatiivset mõju surusääsklaste vastsetele, mida saab täheldada üksnes lahustiga tehtava kont ­
rollkatse abil. Siiski tuleks teha kõik, et vältida selliste kemikaalide kasuta ­
mist.
 
KATSE KAVANDAMINE  
17. Katse kavandamine hõlmab katse kontsentratsioonide arvu ja vahemike vali ­
mist, iga kontsentratsioonitaseme jaoks nõude arvu ning igas nõus olevate 
vastsete arvu valimist. Kirjeldatud on, kuidas hinnata EC-punktide väärtusi 
ja täheldatava toimeta kontsentratsiooni ning teha piirsisalduskatset. Regres ­
sioonanalüüs on eelistatav statistilise hüpoteesi kontrollimise lähenemisvii ­
sile. 
Regressioonanalüüsi kavandamine  
18. Katses kasutatavad kontsentratsioonid peaksid hõlmama toimet avaldavat 
kontsentratsiooni (nt EC  15 , EC  50 ) ja uuritava aine puhul huvi pakkuvat 
kontsentratsioonivahemikku. Tavaliselt paraneb toimet avaldavate kontsen ­
tratsioonide (EC  x ) hinnangute täpsus ja eelkõige kehtivus, kui toimet 
avaldav kontsentratsioon on uuritud kontsentratsioonide vahemikus. Tuleks  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
vältida suurt ekstrapoleerimist allapoole väikseimat positiivset kontsentrat ­
siooni või ülespoole suurimat kontsentratsiooni. Eelnev annusevahemiku 
leidmise katse aitab valida kasutatavat kontsentratsioonivahemikku (vt punkt 27).
 
19. Kui tuleb hinnata EC  x , tuleks katse teha vähemalt viie kontsentratsiooniga ja 
iga kontsentratsiooni kohta tuleks kasutada kolme paralleelkatset. Igal juhul on mudeli korraliku hindamise jaoks soovitatav kasutada piisavaid uurita ­
vaid kontsentratsioone. Kontsentratsioonidevaheline kordaja ei tohiks olla 
suurem kui 2 (erandi võib teha juhul, kui doosi mõju graafiku tõus on madal). Iga doosi paralleelkatsete arvu võib vähendada, kui suurendatakse eri mõjuga uuritavate kontsentratsioonide arvu. Paralleelkatsete arvu suuren ­
damine või uuritavate kontsentratsioonide vahemiku vähendamine enamasti 
vähendab usaldusvahemikku. Kui on vaja hinnata vastsete elulemust ja kasvu kümne päeva järel, on vaja võtta täiendavaid paralleelproove.
 
Täheldatava toimeta kontsentratsiooni / vähima täheldatava toimega kont ­
sentratsiooni hindamise kavandamine  
20. Kui hinnatakse täheldatava toimeta kontsentratsiooni või vähimat tähelda ­
tava toimega kontsentratsiooni, tuleks kasutada viit uuritavat kontsentrat ­
siooni vähemalt nelja paralleelkatsega ja kõnealuseid kontsentratsioone 
eraldav kordaja ei tohiks olla suurem kui 2. Paralleelkatsete arv peaks olema piisav, et tagada piisav statistiline võimsus, et tuvastada katse- ja kontrollnõu tulemuste 20 % erinevus 5 % statistilise olulisusega (p = 
0,05). Arengu kiiruse puhul on üldiselt asjakohane 
variatsioonanalüüs (ANOVA), näiteks Dunnetti test ja Williamsi test (17, 18, 19, 20). Väljaarenemise suhte puhul võib kasutada Cochrani-Armitage’i testi, Fisheri täpset testi (Bonferroni parandusega) või Manteli-Haenszeli 
testi.
 
Piirsisalduskatse  
21. Kui esialgsetes annusevahemiku leidmise katsetes tulemusi ei saadud, võib 
teha piirsisalduskatse (üks katsekontsentratsioon ja kontroll). Piirsisaldus ­
katse eesmärk on näidata, et uuritava aine mürgine kontsentratsioon on katsetatud piirkontsentratsioonist suurem. Käesolevas katsemeetodis soovi ­
tuslikku kontsentratsiooni ei esitata; see jäetakse reguleerivate asutuste 
otsustada. Enamasti tuleb nii töötlus- kui ka kontrollseadmetega teha vähe ­
malt kuus paralleelkatset. Tuleks tõendada piisava statistilise võimsuse olemasolu, et tuvastada katse- ja kontrollnõu tulemuste 20 % erinevus 5 % statistilise olulisusega (p = 0,05). Mõõdetavate suuruste (arengu kiirus 
ja kaal) puhul, kui andmed vastavad käesoleva katse nõuetele (normaalsus, 
ühtlane hajumine), on asjakohane statistiline meetod t-kriteerium. Kui need nõuded ei ole täidetud, võib kasutada mittevõrdse hajumise t-kriteeriumi või mitteparameetrilist testi, näiteks Wilcoxoni-Manni-Whithey testi. Valmikute 
väljaarenemise suhte puhul on asjakohane kasutada Fisheri täpset testi.
 
KATSE KÄIK  
Kokkupuutetingimused  
Rikastatud vee-sette süsteemi valmistamine  
22. Katsenõudesse lisatakse vähemalt 1,5 cm kihi tekitamiseks vajalik kogus 
spetsiaalselt koostatud setet (vt punktid 13-14 ja 3. liide). Vett lisatakse 6 cm paksuse kihini (vt punkt 15). Settekihi ja veekihi paksuse suhe ei tohiks ületada 1 : 4 ja settekihi paksus ei tohiks olla suurem kui 3 cm. 
Sette-vee süsteem tuleks jätta enne katseorganismide lisamist seitsmeks 
päevaks kerge aeratsiooni tingimustesse (vt punkt 14 ja 3. liide). Sette osade eraldumise ja veesambas katsevee lisamisel peene materjali uue suspensiooni tekkimise vältimiseks võib sette katta vee valamise ajal plas ­
tikkettaga, mis pärast vee valamist kohe eemaldatakse. Võib kasutada ka 
muid võtteid.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Katsenõud peaksid olema kaetud (näiteks klaasplaadiga). Vajaduse korral 
lisatakse vee aurumise kompenseerimiseks ja uuringu algse veetaseme 
saavutamiseks vett. Soolade kogunemise vältimiseks tuleks lisada destillee ­
ritud või deioniseeritud vett.  
Katseorganismide lisamine  
24. Neli kuni viis päeva enne katseorganismide lisamist katsenõudesse tuleks 
võtta kultuuridest munamassid ja asetada need väikestesse nõudesse kultuuri 
kasvukeskkonnas. Võib kasutada varukultuuri vana kasvukeskkonda või värskelt valmistatud kasvukeskkonda. Viimati nimetatu kasutamisel tuleks lisada kultuuri kasvukeskkonnale väikses koguses sööta, näiteks roheveti ­
kaid ja/või paar tilka peeneks jahvatatud helbelise kalasööda suspensiooni 
filtraadist (vt 2. liide). Tuleks kasutada ainult värskelt munetud munamasse. Tavaliselt hakkavad vastsed kooruma paari päeva möödumisel munade 
munemisest (2–3 päeva  Chironomus riparius’ e puhul temperatuuril 20 °C 
ning 1–4 päeva  Chironomus tentans’ i puhul temperatuuril 23 °C ja  Chiro­
nomus yoshimatui  puhul temperatuuril 25 °C) ja vastsed kasvavad neljas 
kasvujärgus, millest iga kasvujärk kestab 4–8 päeva. Katses tuleks kasutada 
esimese kasvujärgu vastseid (2–3 või 1–4 päeva pärast koorumist). Sääskede 
kasvujärke on võimalik kontrollida peakapsli laiuse mõõtmisega (6).
 
25. Tömbi pipeti abil jaotatakse 20 esimese kasvujärgu vastset juhuslikult igasse 
katsenõusse, mis sisaldavad rikastatud setet ja vett. Vee aereerimine tuleb vastsete katsenõudesse lisamise ajal peatada ja seda ei jätkata 24 tunni vältel pärast vastsete lisamist (vt punktid 24 ja 32). Kasutatava katsekava kohaselt 
(vt punktid 19 ja 20) on kasutatud vastsete arv kontsentratsiooni kohta 
toimet avaldava kontsentratsiooni (EC-punkti) hindamise korral vähemalt 60 ja täheldatava toimeta kontsentratsiooni määramise korral 80.
 
26. 24 tundi pärast vastsete lisamist rikastatakse uuritavat ainet katva veekihi 
sambasse ja alustatakse uuesti kerget aereerimist. Uuritava aine lahuseid lisatakse pipeti abil väikses koguses veepinna alla. Seejärel tuleks kattev 
veekiht ilma setet mõjutamata ettevaatlikult segada.
 
Uuritavad kontsentratsioonid  
27. Annusevahemiku leidmise katse võib aidata kindlaks teha lõpliku katse 
kontsentratsioonivahemikke. Selleks kasutatakse uuritava aine laiade vahe ­
dega kontsentratsioonide seeriat. Lõplikus katses kasutatavaga sama pindti ­
heduse tagamiseks iga surusääsklase kohta puutuvad surusääsklased kokku uuritava aine iga kontsentratsiooniga sellise ajavahemiku vältel, mis võimaldab hinnata asjakohaseid katsekontsentratsioone; paralleelproovid ei 
ole vajalikud.
 
28. Lõpliku katse kontsentratsioonid määratakse kindlaks annusevahemiku leid ­
mise katse tulemuse alusel. Tuleks kasutada vähemalt viit kontsentratsiooni 
ja need tuleks valida nii, nagu on kirjeldatud punktides 18–20.  
Kontrollkatsed  
29. Katse peaks hõlmama vajalikku arvu paralleelseid settega kontrollkatse ­
nõusid, milles ei ole uuritavat ainet (vt punktid 19-20). Kui uuritava aine 
lisamiseks on kasutatud lahustit (vt punkt 16), tuleks teha settele lahusti 
lisamise kontrollkatse.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Katsesüsteem  
30. Kasutatakse staatilisi süsteeme. Erandjuhul võib kasutada poolstaatilisi või 
läbivooluga süsteeme koos katva veekihi vahelduva või pideva uuendami ­
sega, näiteks kui vee kvaliteet ei ole katseorganismile enam sobiv või 
mõjutab kemikaali tasakaaluolekut (näiteks lahustunud hapniku tase langeb 
liiga madalale, väljutatud saaduste kontsentratsioon muutub liiga suureks või settest leostuvad mineraalained, mis mõjutavad pH-d ja/või vee karedust). Tavaliselt on siiski piisavad ja eelistatavad muud katva veekihi kvaliteedi 
parandamise meetodid, näiteks aereerimine.
 
Sööt 
31. Vastseid tuleb sööta eelistatavalt iga päev või vähemalt kolm korda nädalas. 
Kalasööt (suspensioon vees või peeneks jahvatatud sööt, näiteks TetraMin või TetraPhyll; vt andmed, 2. liide) koguses 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg  C. 
yoshimatui  puhul) vastse kohta päevas näib olevat esimese kümne päeva 
jooksul noorte vastsete jaoks piisav. Vanemad vastsed võivad vajada mõne ­
võrra rohkem sööta: 0,5–1 mg vastse kohta päevas peaks olema piisav ülejäänud katse vältel. Söödakogust tuleks vähendada kõigi kokkupuute- ja kontrollkatsete puhul, kui täheldatakse seente kasvu või kui kontrollkatses 
täheldatakse suremust. Kui seente kasvu ei ole võimalik peatada, tuleb katset 
korrata. Kui katseid tehakse tugevalt adsorbeeruva ainega (näiteks log K
 ow > 
5) või settega kovalentseid sidemeid tekitava ainega, võib enne stabilisee ­
rumise ajavahemikku lisada spetsiaalselt koostatud settele sellise söödako ­
guse, mis on vajalik organismide elulemuse ja loodusliku kasvu tagamiseks. 
Selleks tuleb kasutada kalasööda asemel taimset materjali, näiteks võib kasutada 0,5 % (kuivmass) kõrvenõgese ( Urtica dioica ), mooruspuu 
(Morus alba ), valge ristiku ( Trifolium repens ), spinati ( Spinacia oleracea ) 
peeneks jahvatatud lehti või muud taimset materjali ( Cerophyl  või alfatsel ­
luloos).
 
Inkubeerimistingimused  
32. Eelistatavalt 24 tundi pärast vastsete lisamist hakatakse katsenõudes katvat 
veekihti kergelt aereerima, mida jätkatakse kogu katse vältel (tuleb olla hoolikas, et lahustunud hapniku kontsentratsioon ei langeks alla 60 % 
hapniku küllastuskontsentratsioonist). Aereerimiseks kasutatakse klaasist 
Pasteuri pipetti, mis on kinnitatud settekihi kohale 2–3 cm kõrgusele (üks või mõni mull sekundis). Lenduva kemikaali katsetamisel võib kaaluda sette-vee süsteemi aereerimisest loobumist.
 
33. Katse tehakse püsival temperatuuril 20 °C (±2 °C).  C. tentans’ i ja C. yoshi­
matui  puhul on soovitatavad temperatuurid vastavalt 23 °C ja 25 °C 
(±2 °C). Kasutatakse 16-tunnist valgustusperioodi ja valguse intensiivsus peaks olema 500 kuni 1 000 luksi.
 
Kokkupuute kestus  
34. Kokkupuude algab vastsete lisamisega rikastatud ja kontrollnõudesse. 
Maksimaalne kokkupuute kestus on 28 päeva  C. riparius’ e ja C. yoshi ­
matsui  puhul ning 65 päeva  C. tentans’ i puhul. Kui sääsed arenevad välja 
varem, võib katse lõpetada vähemalt viie päeva möödumisel pärast viimase valmiku väljaarenemist kontrollnõus.
 
VAATLUSED  
Väljaarenemine  
35. Tehakse kindlaks arengu aeg ja täielikult väljaarenenud isas- ja emassääs ­
kede koguarv. Isased on tänu sulgjatele tundlatele kergesti äratuntavad.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Katsenõusid tuleks vaadelda vähemalt kolm korda nädalas, et hinnata 
visuaalselt iga ebatavalist käitumist (näiteks settest väljumine, ebatavaline 
ujumine) kontrollnõuga võrreldes. Oodataval valmikute ilmumise ajal loen ­
datakse sääski iga päev. Registreeritakse täielikult välja arenenud sääskede sugu ja arv. Pärast tuvastamist kõrvaldatakse sääsed nõudest. Enne katse 
lõpetamist munetud munamassid tuleks registreerida ja seejärel eemaldada, 
et vältida settesse uute vastsete teket. Samuti registreeritakse nende nähta ­
vate nukkude arv, millest sääsk ei koorunud. Suunised väljaarenemise mõõt ­
mise kohta on esitatud 5. liites.
 
Kasvamine ja elulemus  
37. Kui on vaja esitada andmeid vastsete elulemuse ja kasvu kohta kümne päeva 
jooksul, tuleks katset alustada suurema arvu nõudega, et neid oleks võimalik seejärel kasutada. Kõnealuste täiendavate nõude setteid sõelutakse vastsete 
saamiseks 250 μm sõela abil. Surma tuvastamise kriteeriumid on liikumatus 
või reageerimatus mehaanilisele stiimulile. Vastsed, keda ei õnnestunud kätte saada, tuleks samuti surnuks lugeda (vastsed, kes surid katse alguses, võivad olla juba mikroobide poolt lagundatud). Tehakse kindlaks ellujäänud 
vastsete (tuhavaba) kuivmass katsenõu kohta ja arvutatakse keskmine indi ­
viduaalne kuivmass nõu kohta. Kasulik on määrata, millisesse kasvujärku ellujäänud vastsed kuuluvad; selleks võib mõõta iga isendi peakapsli laiust.
 
Analüütilised mõõtmised  
Uuritava aine kontsentratsioon  
38. Katse alguses (eelistatavalt tund aega pärast uuritava aine lisamist) ja lõpus 
tuleb analüüsida suurimal ja väiksemal kontsentratsioonil vähemalt katva veekihi, poorivee ja sette proove. Kõnealused uuritava aine kontsentratsiooni määramised annavad teavet uuritava aine käitumise/jaotumise kohta 
vee-sette süsteemis. Setteproovi võtmine katse alguses võib katsesüsteemi 
mõjutada (näiteks katse vastsete eemaldamine), seega tuleks analüütiliste näitajate määramiseks kasutada katse alguses ja katse ajal vajaduse korral täiendavaid katsenõusid (vt punkt 39). Sette mõõtmised ei pruugi olla vaja ­
likud, kui uuritava aine jaotumine vee ja sette vahel on võrreldavates tingi ­
mustes (näiteks sette ja vee suhe, lisamise tüüp, sette orgaanilise süsiniku sisaldus) tehtud vee/sette uuringu käigus täpselt määratud.
 
39. Kui tehakse vahepealseid mõõtmisi (näiteks seitsmendal päeval) või kui 
analüüsi jaoks on vaja suurt proovi, mida ei saa katsenõust ilma katsesüs ­
teemi mõjutamata võtta, tuleks analüüs teha samal viisil töödeldud, kuid 
bioloogilisteks vaatlusteks mitte kasutatavast täiendavast katsenõust (kus on ka katseorganismid) võetud proovist.
 
40. Tsentrifuugimine näiteks 10 000 g ja 4 °C juures 30 minuti vältel on soovi ­
tatav meetod poorivee eraldamiseks. Kui on tõendatud, et uuritav aine ei adsorbeeru filtritele, võib sobida ka filtrimine. Mõnel juhul ei pruugi liiga 
väikse proovi suuruse tõttu olla võimalik poorivee kontsentratsiooni määra ­
mine.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Füüsikalis-keemilised parameetrid  
41. Katsenõude pH-d, lahustunud hapniku sisaldust katsevees ja temperatuuri 
tuleks mõõta asjakohasel viisil (vt punkt 10). Katse alguses ja lõpus tuleks kontrollnõudes ja ühes suurima kontsentratsiooniga katsenõus mõõta kare ­
dust ja ammoniaaki.
 
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Tulemuste töötlemine  
42. Kõnealuse katse eesmärk on teha kindlaks uuritava aine mõju isas- ja emas ­
sääskede arengu kiirusele ja täielikult välja arenenud sääskede koguarvule 
või kümnepäevase katse korral mõju vastsete elulemusele ja kehamassile. Kui puuduvad andmed sugude statistiliselt erineva tundlikkuse kohta, võib statistilistes analüüsides isaste ja emaste tulemused koondada. Sugude 
erinevat tundlikkust on võimalik statistiliselt hinnata näiteks χ
 2 -r × 2 tabeli 
testi abil. Vajaduse korral tuleb kümne päeva möödumisel teha kindlaks vastsete elulemus ja keskmine individuaalne kuivmass nõu kohta.
 
43. Toimet avaldavad kontsentratsioonid, mis põhinevad katva veekihi kontsen ­
tratsioonidel, arvutatakse eelistatavalt katse alguses mõõdetud kontsentrat ­
sioonide alusel (vt punkt 38).  
44. EC  50 või muu EC  x -näitaja arvutamiseks võib tegelike paralleelproovidena 
kasutada nõude statistikat. Iga EC  x usaldusvahemiku arvutamisel tuleks 
arvesse võtta eri nõude tulemuste hajumist või tuleks näidata, et kõnealune 
hajumine on nii väike, et seda võib eirata. Kui andmeid töödeldakse mudeli parameetrite leidmiseks vähimruutude meetodiga, tuleks nõu statistikat 
teisendada, et dispersioon oleks ühtlasem. EC
 x -väärtused tuleks siiski arvu ­
tada pärast tulemuse esialgsele väärtusele tagasiteisendamist.  
45. Kui statistilise analüüsi eesmärk on teha hüpoteesi katsetamise abil kindlaks 
täheldatava toimeta kontsentratsioon / vähim täheldatava toimega kontsen ­
tratsioon, tuleb võtta arvesse nõudevahelist hajuvust, näiteks kasutada hierar ­
hilist dispersioonanalüüsi ( nested  ANOVA). Olukorras, kus tavapärased 
dispersioonanalüüsi (ANOVA) eeldused ei ole täidetud, võivad paremini sobida töökindlamad testid (21).
 
Väljaarenemise määr  
46. Väljaarenemise määrad on kõik-või-mitte-midagi-andmed ja neid on 
võimalik analüüsida astmeliselt kohaldatava Cochrani-Armitage’i testi abil, 
kus eeldatakse, et mõju sõltuvus doosist on monotoonne, ja need andmed on selle eeldusega kooskõlas. Vastasel juhul võib kasutada Fisheri täpset testi või Manteli-Haenszeli testi Bonferroni-Holmi kohandatud p-väärtustega. Kui 
on tõendeid, et ühe kontsentratsiooniga paralleelproovide hajuvus on suurem 
kui eeldatakse binoomjaotuse dispersiooni puhul (nn ekstra-binoomjaotuse dispersioon), tuleks kasutada töökindlat Cochrani-Armitage’i või Fisheri täpset testi, nagu on soovitatud (21).
 
47. Määratakse nõu kohta välja arenenud sääskede arv n  e , mis jagatakse lisatud 
vastsete arvuga n  a : 
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
kus: 
ER = väljaarenemise määr  
n e = nõu kohta välja arenenud sääskede arv  
n a = nõu kohta lisatud vastsete arv.  
48. Ekstra-binoomjaotuse dispersiooni korral on suurte valimite puhul kõige 
asjakohasem alternatiiv käsitleda väljaarenemise määra pideva vastusena 
ning kasutada selliseid meetodeid nagu Williamsi test, kui võib eeldada, et mõju sõltuvus doosist on monotoonne, kui see on kooskõlas kõnealuste väljaarenemise määra andmetega. Kui monotoonsust ei ole, on asjakohane 
kasutada Dunnetti testi. Suur valim on siinkohal määratletud kui väljaare ­
nenud sääskede arv ja väljaarenemata jäänud sääskede arv, mis mõlemad on suuremad kui viis paralleelproovi (nõu) kohta.
 
49. Dispersioonanalüüsi (ANOVA) meetodite kohaldamiseks tuleks väljaarene ­
mise määra väärtused kõigepealt teisendada arkussiinus-ruutjuure-teisenduse 
või Freemani-Tukey teisenduse abil, et saada ligikaudne normaaljaotus ja võrdsustada variatsioonid. Cochrani-Armitage’i testi, Fisheri täpse testi (Bonferroni) või Manteli-Haenszeli testi võib kasutada absoluutsete sage ­
duste kasutamisel. Arkussiinus-ruutjuure-teisendust kohaldatakse, arvutades 
väljaarenemise määra ruutjuure siinuse pöördarvu (sin
 –1 ). 
50. Väljaarenemise määrade puhul arvutatakse EC  x -väärtused regressioonana ­
lüüsi (või näiteks probit- (22) või logit-teisenduse, Weibulli meetodi, sobiva müügiloleva tarkvara jne) abil. Kui regressioonanalüüs ebaõnnestub (näiteks 
kui on vähem kui kaks osalist vastust), kasutatakse muid mitteparameetrilisi 
meetodeid, näiteks libisev keskmine või lihtne interpolatsioon.
 
Arengu kiirus  
51. Keskmine arengu aeg väljendab keskmist ajavahemikku vastsete lisamise 
(katse päev 0) ja sääskede katsekohordi tekke vahel. (Tegeliku arenguaja arvutamiseks tuleks arvesse võtta vastsete vanust lisamise ajal.) Arengu kiirus on pöördvõrdeline arengu ajaga (ühik: 1/päev) ja väljendab vastsete 
arengu seda osa, mis toimub ühe päeva jooksul. Kõnealuste sette mürgisuse 
hindamise uuringute puhul eelistatakse arengu kiirust, kuna selle dispersioon on väiksem, homogeensem kui arenguaja puhul ja lähedasem normaaljaotu ­
sele. Seega võib arengu kiiruse puhul kasutada tugevaid parameetrilisi testi ­
mismeetodeid, mida ei saa kasutada arenguaja puhul. Arengu kiiruse kui 
pideva vastuse jaoks saab EC
 x -väärtusi hinnata regressioonanalüüsiga 
(näiteks 23, 24).  
52. Järgmiste statistiliste testide puhul eeldatakse, et kontrolli päeval x tähel ­
datud sääsed on välja arenenud keskmisel ajavahemikul päeva x ja päeva x 
– l vahel (l = kontrollimiste vahelise ajavahemiku pikkus, tavaliselt üks päev). Keskmine arengu kiirus nõu kohta ( x) arvutatakse järgmise võrrandi 
alusel:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
kus: 
x – keskmine arengu kiirus nõu i kohta  
i – kontrollivahemiku indeks  
m – kontrollivahemike maksimaalne arv  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i – kontrollivahemikul i välja arenenud sääskede arv  
n e – katse lõpuks välja arenenud sääskede koguarv (=  P ƒ i ) 
x i – ajavahemikul i välja arenenud sääskede arengu kiirus,  
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
kus: 
day  i (päev  i ) – kontrolli päev (lisamisest möödunud päevade arv)  
l i – kontrollivahemiku pikkus i (päevades, tavaliselt üks päev).  
Katseprotokoll  
53. Katseprotokollis tuleks esitada vähemalt järgmine teave.  
Uuritav aine:  
— füüsikaline olek ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused 
(lahustuvus vees, aururõhk, jaotustegur mullas (või settes, kui see on määratud), stabiilsus vees jne);
 
— kemikaali tunnusandmed (üldkasutatav nimetus, keemiline nimetus, 
struktuurivalem, CASi number jne), sh puhtus ja uuritava aine kvantita ­
tiivse analüüsi meetod.  
Katseorganismi liik:  
— kasutatud katseloom: liik, teaduslik nimetus, organismide päritolu ja 
kasvatustingimused;  
— teave munamasside ja vastsete käsitlemise kohta;  
— katseloomade vanus katsenõudesse sisestamise ajal.  
Katsetingimused:  
— kasutatud sete, s.o looduslik või spetsiaalselt koostatud sete;  
— loodusliku sette puhul setteproovi võtmise koha asukoht ja kirjeldus, sh 
võimaluse korral saastumise ajalugu; omadused: pH, orgaanilise süsiniku sisaldus, süsiniku-lämmastiku suhe ja granulomeetria (kui see on asja ­
kohane);
 
— spetsiaalselt koostatud sette valmistamine: koostisosad ja omadused 
(orgaanilise süsiniku sisaldus, pH, niiskus jne katse alguses);  
— katsevee valmistamine (kui kasutatakse taastatud vett) ja omadused 
(hapnikusisaldus, pH, elektrijuhtivus, karedus jne katse alguses);  
— settekihi ja katva veekihi paksus;  
— katva veekihi ja poorivee maht; märja sette kaal koos pooriveega ja ilma 
selleta;  
— katsenõud (materjal ja suurus);  
— põhilahuse valmistamise meetod ja uuritud kontsentratsioonide saamine;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— uuritava aine manustamine: kasutatud kontsentratsioonid, paralleelproo ­
vide arv ja lahusti kasutamine, kui seda tehti;  
— inkubatsioonitingimused: temperatuur, valgustusperiood ja valguse inten ­
siivsus, aereerimine (sagedus ja intensiivsus);  
— üksikasjalik teave söötmise kohta, sh sööda tüüp, valmistamine, kogus ja 
söötmise ajakava.  
Tulemused:  
— nominaalsed katsekontsentratsioonid, mõõdetud katsekontsentratsioonid 
ja kõigi analüüside tulemused, millega määrati uuritava aine kontsentrat ­
siooni katsenõus;  
— vee kvaliteet katsenõus, s.o pH, temperatuur, lahustunud hapnik, karedus 
ja ammoniaak;  
— aurustunud katsevee asendamine, kui seda tehti;  
— väljaarenenud isas- ja emassääskede arv iga nõu ja iga päeva kohta;  
— iga nõu kohta nende vastsete arv, kellest sääski ei arenenud;  
— vastsete keskmine individuaalne kuivmass iga nõu ja kasvujärgu kohta, 
kui see on asjakohane;  
— valmikute väljaarenemise protsent iga paralleelproovi ja katsekontsentrat ­
siooni kohta (isas- ja emassääsed kokku);  
— täielikult väljaarenenud sääskede keskmine arengu kiirus iga paralleel ­
proovi ja katsekontsentratsiooni kohta (isas- ja emassääsed kokku);  
— mürgisuse näitajate hinnangud, näiteks EC  x (ja selle usaldusvahemik), 
täheldatava toimeta kontsentratsioon ja/või vähim täheldatava toimega 
kontsentratsioon ning nende määramiseks kasutatud statistilised meetodid;
 
— tulemuste arutelu, kaasa arvatud käesolevast katsemeetodist kõrvalekal ­
dumise võimalik mõju katsetulemustele.  
KIRJANDUS  
1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. 
Köpp. Berlin 1995.  
2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
 
4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 
1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
 
5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated 
June 1994.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14) Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.  
15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for  
Chironomus riparius  using a formulated sediment. Chemosphere 31: 
3291–3303.  
17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.  
18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482–491.  
19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103–117.  
20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510–531.  
21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48:577–585.  
22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.  
24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
1. liide  
MÕISTED  
Käesolevas katsemeetodis kasutatakse järgmisi mõisteid järgmises tähenduses:  
spetsiaalselt koostatud sete  (ehk taastatud, tehislik või sünteetiline sete) – 
selliste materjalide segu, mida kasutatakse loodusliku sette füüsiliste koostisosade imiteerimiseks;
 
kattev veekiht  – vesi, mis pannakse katsenõus sette peale;  
poorivesi  – sette- või mullaosakeste vahelises ruumis olev vesi;  
rikastatud vesi  – katsevesi, millele on lisatud uuritavat ainet;  
uuritav kemikaal  – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
2. liide  
Chironomus riparius’ e kasvatamist käsitlevad soovitused  
1. Chironomus’ e vastseid võib kasvatada kristallisatsiooninõus või suuremas 
mahutis. Mahuti põhi kaetakse ligikaudu 5–10 mm paksuse peene kvarts ­
liiva kihiga. Diatomiit (näiteks Merck, Art 8117) on samuti tõendatult sobiv substraat (piisab õhemast kihist, isegi mõnest millimeetrist). Seejärel lisa ­
takse sobivat vett mitme cm paksuse kihina. Vett tuleks vajaduse korral 
lisada aurumiskadude asendamiseks ja kuivamise vältimiseks. Vee võib vajaduse korral välja vahetada. Tuleks tagada kerge aereerimine. Vastsete kasvatamise nõusid tuleks hoida vastavas puuris, millega takistatakse väljaa ­
renenud täiskasvanud isendite väljapääsu. Puur peaks olema piisavalt suur, 
et võimaldada väljaarenenud valmikute parvedesse kogunemist, vastasel juhul ei pruugi toimuda paljunemist (miinimumsuurus on ligikaudu 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Puure tuleks hoida toatemperatuuril või püsiva keskkonnaga ruumis tempe ­
ratuuril 20 ± 2 °C 16-tunnise valgustusperioodiga (intensiivsus ligikaudu 1 000 luksi) ja kaheksa tunni pimedusega. On teada, et vähem kui 60 %- line suhteline õhuniiskus võib paljunemist takistada.
 
Lahjendusvesi  
3. Võib kasutada mis tahes looduslikku või sünteetilist vett. Enamasti kasuta ­
takse kaevuvett, deklooritud kraanivett ja tehislikke kasvukeskkondi (näiteks 
Elendti kasvukeskkond M4 või M7, vt allpool). Vett tuleb enne kasutamist aereerida. Vajaduse korral võib kultuuri kasvuvett uuendada, eemaldades kasutatud vee kultuuri kasvunõudest ettevaatlikult valamise teel või sifoo ­
niga, kahjustamata vastsete kestasid.
 
Vastsete söötmine  
4. Chironomus’ e vastseid tuleks sööta helbelise kalasöödaga (TetraMin®, 
TetraPhyll® või muu samalaadne kaubanduslik kalasööda tootemark) koguses ligikaudu 250 mg nõu kohta päevas. Sööta võib anda kuiva jahva ­
tatud pulbrina või suspensioonina vees: 1,0 g helbelist kalasööta lisatakse 20 
ml lahjendusveele ja see segatakse homogeense segu saamiseni. Seda prepa ­
raati võib sööta koguses 5 ml nõu kohta päevas (preparaati tuleks enne kasutamist loksutada). Vanemad vastsed võivad vajada rohkem sööta.
 
5. Söötmist kohandatakse vee kvaliteediga. Kui kultuuri kasvukeskkond 
muutub häguseks, tuleks sööda hulka vähendada. Sööda lisamist tuleb hooli ­
kalt jälgida. Liiga vähe sööta põhjustab vastsete rände veesamba suunas ning liiga palju sööta hoogustab mikroobide tegevust ja vähendab vee hapnikusisaldust. Mõlemad tingimused võivad vähendada kasvu kiirust.
 
6. Uute kultuuri kasvunõude valmisseadmisel võib lisada ka mõne rohevetika 
(näiteks  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ) rakke.  
Väljaarenenud valmikute söötmine  
7. Mõned teadlased on soovitanud väljaarenenud valmikute söötmiseks kasu ­
tada küllastunud sahharoosilahuses niisutatud puuvillast lappi.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Väljaarenemine  
8. Ligikaudu 13–15 päeva möödumisel hakkavad temperatuuril 20 ± 2 °C 
vastsete kasvatamise nõudest väljuma valmikud. Isased on tänu sulgjatele tundlatele kergesti äratuntavad.
 
Munamassid  
9. Kui valmikud on paljundamispuuris, tuleks kõiki vastsete kasvatamise 
nõusid kontrollida kolm korda nädalas sinna želatiinjate munamasside lisan ­
dumise suhtes. Kui leitakse munamass, tuleks see hoolikalt kõrvaldada. See 
tuleks üle kanda väiksele tassile, mis sisaldab paljundusvee proovi. Muna ­
masse kasutatakse uue kasvunõu kasutusele võtmiseks (näiteks 2–4 muna ­
massi nõu kohta) või mürgisuse katsetes.  
10. Esimese kasvujärgu vastsed peaksid kooruma 2–3 päeva pärast.  
Uute kasvunõude ülesseadmine  
11. Kui kultuurid on loodud, peaks iga nädal (või katsenõuetest olenevalt väik ­
sema sagedusega) olema võimalik vastsete uute kasvunõude ülesseadmine, 
kõrvaldades vanemad nõud pärast täiskasvanud sääskede väljaarenemist. 
Seda süsteemi kasutades saadakse minimaalse vaevaga regulaarne valmikute varu.
 
Katselahuste M4 ja M7 valmistamine  
12. Elendt (1990) on kirjeldanud kasvukeskkonda M4. Kasvukeskkond M7 
valmistatakse samal viisil kui kasvukeskkond M4, v.a tabelis 1 nimetatud ainete puhul, mille kontsentratsioon kasvukeskkonnas M7 on kasvukeskkon ­
naga M4 võrreldes neli korda väiksem. Kasvukeskkonda M7 käsitlev 
artikkel on kirjutamisel (Elendt, isiklik teade). Katselahust ei tohiks koos ­
tada Elendti ja Biasi (1990) järgi, kuna põhilahuste valmistamiseks ei ole antud NaSiO
 3 · 5H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 ja K  2 HPO  4 kontsentratsioon sobiv.  
Kasvukeskkonna M7 valmistamine  
13. Iga põhilahus (I) valmistatakse eraldi ja kombineeritud põhilahus (II) 
valmistatakse kõnealustest põhilahustest (I) (vt tabel 1). Kasvukeskkonna 
M7 valmistamiseks võetakse 50 ml kombineeritud põhilahust (II), lisatakse iga makrotoitaine põhilahuse kogused, mis on esitatud tabelis 2, ja täienda ­
takse deioniseeritud veega 1 liitrini. Vitamiinide põhilahuse valmistamiseks 
lisatakse deioniseeritud veele kolme vitamiini, nagu on näidatud tabelis 3, ja lõplikule M7 kasvukeskkonnale lisatakse vahetult enne selle kasutamist 0,1 ml kombineeritud vitamiinide põhilahust. (Vitamiinide põhilahust säilita ­
takse külmutatult väikeste alikvootidena). Kasvukeskkonda aereeritakse ja 
see stabiliseeritakse.
 
Tabel 1  
Kasvukeskkondade M4 ja M7 mikroelementide põhilahused  
Põhilahus (I) Kogus (mg), mis 
täiendatakse 
deioniseeritud 
veega 1 liitrini Kombineeritud põhilahuse (II) 
valmistamiseks: segage 
põhilahuste (I) järgmised kogused 
(ml) ja täiendage need 1 liitrini 
deioniseeritud veega Lõppkontsentratsioonid katselahustes 
(mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Põhilahus (I) Kogus (mg), mis 
täiendatakse 
deioniseeritud 
veega 1 liitrini Kombineeritud põhilahuse (II) 
valmistamiseks: segage 
põhilahuste (I) järgmised kogused 
(ml) ja täiendage need 1 liitrini 
deioniseeritud veega Lõppkontsentratsioonid katselahustes 
(mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Need ained on M4 ja M7 puhul erinevad, nagu on eespool viidatud. 
( 2 ) Need lahused valmistatakse eraldi, valatakse seejärel kokku ja autoklaavitakse viivitamata.  
Tabel 2  
Kasvukeskkondade M4 ja M7 makrotoitainete põhilahused  
Kogus, mis täienda ­
takse deioniseeritud 
veega 1 liitrini 
(mg) Kasvukeskkonna M4 ja M7 
valmistamiseks lisatav 
makrotoitainete põhilahuste 
kogus 
(ml/l) Lõppkontsentrat ­
sioonid katselahustes 
M4 ja M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabel 3  
Kasvukeskkondade M4 ja M7 vitamiinide põhilahus  
Ühe vitamiinide põhilahuse valmistamiseks valatakse kokku kõik kolm vitamiinilahust.  
Kogus, mis täiendatakse 
deioniseeritud veega 1 
liitrini 
(mg) Kasvukeskkonna M4 ja M7 
valmistamiseks lisatav vita ­
miinide põhilahuse kogus 
(ml/l) Lõppkontsentratsioonid 
katselahustes M4 ja M7 
(mg/l)  
Tiamiinvesinikkloriid 750 0,1 0,075 
Tsüanokobalamiin 
(B12) 10 0,1 0,0010 
Biotiin 7,5 0,1 0,00075  
KIRJANDUS  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 
1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25–33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
3. liide  
SPETSIAALSELT KOOSTATUD SETTE VALMISTAMINE  
Sette koostis  
Spetsiaalselt koostatud sette koostis peaks olema järgmine:  
Koostisosa Kirjeldus Sette 
kuivmassi protsent  
Turvas Turbasamblaturvas, mille pH 
on võimalikult lähedal vahe ­
mikule 5,5–6,0, nähtavad 
taimeosad puuduvad, peeneks jahvatatud (osakese suurus ≤ 
1 mm) ja õhu käes kuivatatud 4–5 
Kvartsliiv Tera suurus: > 50 % osakes ­
test peaksid olema vahemikus 
50–200 μm 75–76 
Kaoliinsavi Kaoliniidisisaldus ≥ 30 % 20 
Orgaaniline süsinik Reguleeritakse turba ja liiva 
lisamisega 2 (±0,5) 
Kaltsiumkarbonaat CaCO
 3 , pulbriks jahvatatud, 
keemiliselt puhas 0,05–0,1 
Vesi Juhtivus ≤ 10 μS/cm 30–50  
Valmistamine  
Turvas kuivatatakse õhu käes ja jahvatatakse peeneks pulbriks. Valmistatakse 
vajaliku turbapulbrikoguse suspensioon deioniseeritud vees, kasutades tõhusat 
homogenisaatorit. Selle suspensiooni pH reguleeritakse CaCO  3 abil vahemikku 
5,5 ± 0,5. Suspensiooni konditsioneeritakse vähemalt kaks päeva temperatuuril 20 ± 2 °C kerge segamisega, et stabiliseerida pH ja luua stabiilne mikroobikom ­
ponent; pH mõõdetakse uuesti ja see peaks olema 6,0 ± 0,5. Seejärel segatakse 
turba suspensioon muude koostisosadega (liiv ja kaoliinsavi) ning deioniseeritud veega, et saada homogeenne sete, mille veesisaldus on vahemikus 30–50 % sette kuivmassist. Lõpliku segu pH mõõdetakse uuesti ja see reguleeritakse vajaduse 
korral CaCO
 3 abil vahemikku 6,5–7,5. Kuivmassi ja orgaanilise süsiniku sisal ­
duse määramiseks võetakse sette proovid. Enne, kui spetsiaalselt koostatud setet kasutatakse surusääsklastele mürgisuse katses, on soovitatav seda seitsme päeva jooksul konditsioneerida samades tingimustes, mis valdavalt esinevad edasise 
katse käigus.
 
Säilitamine  
Tehisliku sette valmistamiseks kasutatavaid kuivi koostisosi võib säilitada kuivas 
ja jahedas kohas toatemperatuuril. Spetsiaalselt koostatud (märga) setet ei tohiks 
enne selle katses kasutamist säilitada. Seda tuleks kasutada viivitamata pärast seitsmepäevast kohandamisperioodi, millega selle valmistamine lõpetatakse.
 
KIRJANDUS:  
Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
4. liide  
Kasutuskõlbliku lahjendusvee keemilised omadused  
Aine Kontsentratsioonid  
Tahked osakesed < 20 mg/l 
Orgaanilise süsiniku kogusisaldus < 2 mg/l Ioniseerimata ammoniaak < 1 μg/l 
Karedus CaCO
 3 -na < 400 mg/l (*) 
Jääkkloor < 10 μg/l 
Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus < 50 ng/l Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüü ­
lide üldsisaldus < 50 ng/l 
Orgaanilise kloori üldsisaldus < 25 ng/l
 
(*) Kui kahtlustatakse karedust tekitavate ioonide ja uuritava aine omavahelist mõju, tuleks 
kasutada väiksema karedusega vett (ja seega ei tohiks nimetatud olukorras kasutada 
Elendti kasvukeskkonda M4).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
5. liide  
Suunised surusääsklaste vastsete valmikuteks väljaarenemise seireks  
Katsenõudele paigaldatakse väljaarenenud valmikute püüdurid. Neid püüdureid 
vajatakse alates 20. päevast kuni katse lõpuni. Kasutatava püüduri näidis on esitatud allpool.
 
A – nailonvõrk  
B – tagurpidi pööratud plastiktopsid  
C – tilata kokkupuutenõu  D – sõelaga kaetud veevahetusavad  
E – vesi  
F – sete  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29. KIIRE BIOLAGUNDATAVUS – CO  2 SULETUD NÕUDES 
(VABARUUMI KATSE)  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 310 (2006). 
Käesolev katsemeetod on sõelumismeetod kemikaalide kiire biolagundata ­
vuse hindamiseks ning see annab samalaadset teavet kui käesoleva lisa peatüki C.4 meetoditena C.4-A kuni C.4-F kirjeldatud kuus katsemeetodit. Seega võib käesoleva katsemeetodi alusel positiivse tulemuse saanud kemi ­
kaali pidada kiiresti biolagundatavaks ning seepärast ka keskkonnas kiiresti 
lagunevaks.
 
2. Halvasti lahustuvate ja tugevasti adsorbeeruvate kemikaalide uurimisel on 
esimene valik tavaliselt olnud süsinikdioksiidi (CO  2 ) meetod (1), mida kasu ­
tatakse juba ammu ja mis põhineb Sturmi algsel katsel (2), millega hinna ­
takse orgaaniliste kemikaalide biolagundatavust mikroobide toimel moodus ­
tunud süsinikdioksiidi mõõtmise teel. Seda on samuti kasutatud lahustuvate (kuid mitte lenduvate) kemikaalide puhul, kuna süsinikdioksiidi teket peavad paljud ainsaks kindlaks tõendiks mikroobide tegevuse kohta. Lahustunud 
orgaanilise süsiniku kõrvaldamist võivad põhjustada füüsikalis-keemilised 
protsessid (adsorbeerumine, lendumine, sadestumine, hüdrolüüs) ning ka mikroobide tegevus ja mõned mittebioloogilised hapniku sidumise reakt ­
sioonid; harva tekib CO
 2 orgaanilistest kemikaalidest abiootilisel teel. 
Algses ja muudetud Sturmi katses (1, 2) kõrvaldatakse CO  2 vedelfaasist 
absorbeerimisnõudesse läbipuhumisega (s.o CO  2 kõrvaldamiseks töödeldud 
õhu barboteerimisega läbi vedeliku), aga Larsoni versioonis (3, 4) kantakse CO
 2 reaktsiooninõust üle absorbeerijasse CO  2 -vaba õhu suunamisega läbi 
vabaruumi ja katsenõu pideva raputamisega. Reaktsiooninõud raputatakse 
ainult Larsoni muudetud versiooni puhul; segamine on standardis ISO 9439 (5) ette nähtud ainult lahustumatute ainete puhul ja algses Ameerika 
Ühendriikide versioonis (6), mõlemas kasutatakse vabaruumi õhu asenda ­
mise asemel läbipuhumist. Teises Ameerika Ühendriikide keskkonnakaitsea ­
meti meetodis (7), mis põhineb Gledhilli meetodil (8), on raputatav reakt ­
siooninõu keskkonnast isoleeritud ja tekkiv CO
 2 kogutakse otse gaasifaasist 
sisemisse leelispüüdurisse nagu klassikalistes Warburgi-Barcrofti respiro ­
meetri kolbides.  
3. Mitme kemikaali puhul on näidatud, et standardse muudetud Sturmi katse 
kasutamisel koguneb anorgaaniline süsinik kasvukeskkonda (9). Aniliini (kontsentratsioon 20 mg C/l) lagundamisel leiti anorgaanilise süsiniku kont ­
sentratsioon olevat lausa 8 mg/l. Seega ei väljenda leelispüüdurisse kogutud 
CO
 2 lagunemise ajal mikrobioloogiliselt tekkinud CO  2 tegelikku kogust. 
Järelikult ei ole uuritava kemikaali kiiresti biolagunevaks klassifitseerimise tingimus, et > 60 % maksimaalsest teoreetiliselt tekkida võivast CO
 2 kogu­
sest tuleb koguda kümnepäevase ajavahemiku vältel (10 % biolagunemise 
saavutamisele vahetult järgnevad kümme päeva), täidetud mõne kemikaali puhul, mis lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise alusel klassifitsee ­
ritaks kiiresti biolagunevaks.
 
4. Kui lagunemise protsent on eeldatavast väiksem, võib anorgaaniline süsinik 
olla kogunenud katselahusesse. Sel juhul võib lagunemist hinnata muude 
kiire biolagundatavuse katsete abil.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Muud Sturmi meetodi puudused (keerukas, aeganõudev, suurem katsevea 
tekke tõenäosus, mitte kasutatav lenduva kemikaali puhul) sundisid varem 
otsima gaasi läbijuhtimise asemele Gledhilli meetodile alternatiivset suletud nõu meetodit (10, 11). Boatman  et al.  (12) vaatasid varasemad meetodid läbi 
ja võtsid kasutusele suletud vabaruumi süsteemi, milles CO
 2 lasti inkubat ­
siooni lõpus kasvukeskkonna hapestamise teel vabaruumi. CO  2 mõõdeti 
gaaskromatograafia / anorgaanilise süsiniku analüüsi abil vabaruumist auto ­
maatselt võetud proovides, aga vedelfaasis lahustunud anorgaanilist süsi ­
nikku ei võetud arvesse. Kasutatud nõud olid väga väiksed (20 ml) ja 
sisaldasid ainult 10 ml kasvukeskkonda, mis tekitas raskusi; näiteks oli 
raske lisada lahustumatu uuritava kemikaali vajalikku väga väikest kogust ja/või inokuleeritud kasvukeskkonnas ei pruukinud olla piisavalt või üldse mikroorganisme, kes suudavad uuritavat kemikaali lagundada.
 
6. Need probleemid on ületatud Struijsi ja Stoltenkampi (13) ning Birchi ja 
Fletcheri (14) sõltumatute uuringutega. Viimati nimetatud autoreid inspiree ­
risid nende kogemused seadmega, mida kasutati anaeroobse biolagunemise katses (15). Esimesena nimetatud meetodi (13) kohaselt mõõdeti CO
 2 vaba­
ruumis pärast hapestamist ja tasakaalustamist ning teise meetodi (14) puhul 
mõõdeti lahustunud anorgaaniline süsinik nii gaasilises kui ka vedelfaasis ilma töötlemiseta; üle 90 % tekkinud anorgaanilisest süsinikust leiti vedel ­
faasis. Mõlemal meetodil on eeliseid Sturmi katse ees, kuna nende katse ­
süsteem on kompaktsem ja lihtsamini kasutatav, saab uurida ka lenduvaid 
kemikaale ning tekkinud CO
 2 mõõtmise viivituste võimalus on välditud.  
7. Kaks nimetatud lähenemisviisi on ühendatud ISO vabaruumi CO  2 standard­
meetodis (16), millega on tehtud laboritevaheline võrdluskatse (17), nime ­
tatud standardmeetod on käesoleva katsemeetodi alus. Samal viisil on Ameerika Ühendriikide keskkonnakaitseameti meetodis (18) kasutatud kahte lähenemisviisi. Soovitatud on CO
 2 mõõtmise kahte meetodit, nimelt 
vabaruumi CO  2 pärast hapestamist (13) ja anorgaaniline süsinik vedelfaasis 
pärast leelise liia lisamist. Viimati nimetatud meetodi võttis kasutusele Peterson naftaettevõtjate Euroopa assotsiatsiooni keskkonna ning tööohutuse ja töötervishoiu toetamiseks (CONCAWE) tehtud kõnealuse vabaruumi 
meetodi (mida on muudetud iseenesliku biolagunemise mõõtmiseks) labori ­
tevahelise võrdluskatse ajal (19). Käesoleva lisa peatükis C.4 esitatud kiire biolagundatavuse meetodite läbivaatamisega seoses 1992. aastal tehtud muudatused (20) on kaasatud käesolevasse katsemeetodisse ja seega on 
tingimused (kasvukeskkond, kestus jne) muudel puhkudel samad kui läbi ­
vaadatud Sturmi katses (20). Birch ja Fletcher (14) on näidanud, et käes ­
oleva vabaruumi katsega väga sarnased tulemused saadi läbivaadatud katse ­
meetodite OECD laboritevahelises võrdluskatses samade kemikaalidega 
(21).
 
KATSE PÕHIMÕTE  
8. Uuritavat kemikaali, tavaliselt 20 mg C/l, kui ainsat süsiniku ja energia 
allikat inkubeeritakse puhvermineraalsoolade kasvukeskkonnas, millesse on külvatud mikroorganismide segapopulatsioon. Katse tehakse suletud pude ­
lites, milles on vaba ruum õhu jaoks; see tagab hapnikuvaru aeroobseks 
biolagunemiseks. Uuritava kemikaali täielikust aeroobsest biolagunemisest põhjustatud CO
 2 teke määratakse sel viisil, et mõõdetakse katsepudelites 
tekkinud anorgaaniline süsinik ja lahutatakse sellest inokuleerimata kasvu ­
keskkonda sisaldavates kontrollkatse nõudes tekkinud anorgaaniline süsinik. 
Biolagunemise ulatus väljendatakse protsendina anorgaanilise süsiniku tekki ­
mise maksimaalsest teoreetilisest kogusest, mis arvutatakse algselt lisatud uuritava kemikaali (orgaanilise süsiniku) koguse alusel.
 
9. Võimalik on mõõta ka lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamise määra 
ja/või uuritava kemikaali esmase biolagunemise ulatust (20).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
ANDMED UURITAVA KEMIKAALI KOHTA  
10. Lagunemise protsendi arvutamiseks peab uuritava kemikaali orgaanilise 
süsiniku sisaldus (massiprotsent) olema teada kas selle keemilise struktuuri põhjal või mõõtmise teel. Lenduva uuritava kemikaali puhul aitab mõõdetud 
või arvutatud Henry seaduse konstant leida sobiva vabaruumi ja vedeliku 
koguse suhte. Sobiva katsekontsentratsiooni valimiseks ning halba biolagun ­
datavust näitavate tulemuste tõlgendamiseks on kasulik omada teavet uuri ­
tava kemikaali mürgisuse kohta mikroorganismidele: kui ei ole teada, kas 
uuritav kemikaal inhibeerib mikroobide tegevust, soovitatakse kaasata inhi ­
bitsiooni kontrollrühm (vt punkt 24).
 
MEETODI KASUTUSALA  
11. Katset kasutatakse nii vees lahustuvate kui ka mittelahustuvate uuritavate 
kemikaalide puhul, kuid tuleks tagada uuritava kemikaali hea dispersioon. Soovitatud vabaruumi ja vedeliku koguse suhte 1 : 2 kasutamisel on 
võimalik uurida lenduvaid kemikaale Henry seaduse konstandiga kuni 50 
Pa·m
 3 ·mol  –1 , kuna vabaruumis oleva uuritava kemikaali osakaal ei ületa sel 
juhul veel 1 % (13). Lenduvama kemikaali uurimisel võib kasutada väik ­
semat vabaruumi, aga piiravaks teguriks võib olla selle biosaadavus, eriti kui 
kemikaal on vees halvasti lahustuv. Kasutaja peab siiski tagama, et vaba ­
ruumi ja vedeliku koguse suhe ning uuritava kemikaali kontsentratsioon on sellised, et täieliku aeroobse biolagunemise toimumiseks oleks piisavalt hapnikku (vältige näiteks substraadi suure kontsentratsiooni ja väikse vaba ­
ruumi mahu kasutamist). Suuniseid selle kohta võib leida väljaannetes (13, 
23).
 
VÕRDLUSKEMIKAALID  
12. Katse korrektse läbiviimise kontrollimiseks tuleks paralleelselt katsetada 
teadaoleva biolagunevusega võrdluskemikaali. Vees lahustuva uuritava kemikaali katsetamisel võib selleks kasutada aniliini, naatriumbensoaati või etüleenglükooli ja halvasti lahustuva uuritava kemikaali katsetamisel 
1-oktanooli (13). Nimetatud kemikaalide biolagunemine peab 14 päeva 
jooksul jõudma > 60 %-ni maksimaalsest teoreetiliselt võimalikust anorgaa ­
nilise süsiniku kogusest.
 
REPRODUTSEERITAVUS  
13. Meetodi ISO standardi kohases laboritevahelises võrdluskatses (17) saadi 
soovitatud tingimuste kasutamisel 20 mg C uuritava kemikaaliga liitri kohta järgmised tulemused.
 
Uuritav kemikaal Keskmine biolagun ­
damise protsent 
(28 päeva) Variatsioonikordaja 
(%) Laborite arv  
Aniliin 90 16 17 
1-oktanool 85 12 14  
Katsesisene variatsioon (korratavus) oli aniliini puhul hea ja variatsioonikor ­
dajad ei olnud peaaegu üheski katses suuremad kui 5 %. Kahel juhul, kui 
korratavus oli halvem, oli suurem variatsioon tõenäoliselt põhjustatud suure ­
mahulisest anorgaanilise süsiniku tekkimisest kontrollkatsetes. Korratavus oli 1-oktanooli puhul halvem, kuid jäi 79 % katsete puhul ikkagi alla 
10 %. See katsesisene suurem variatsioon võis olla põhjustatud doseerimis ­
vigadest, kuna suletud katsepudelitesse tuli lisada väike kogus (3–4 μl) 1- 
oktanooli. Uuritava kemikaali väiksema kontsentratsiooni kasutamisel on tulemuseks suuremad variatsioonikordajad, eelkõige kontsentratsioonil, mis 
on väiksem kui 10 mg C/l. Seda on võimalik osaliselt vältida, vähendades 
anorgaanilise süsiniku üldkontsentratsiooni inokulumis.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. ELi laboritevahelises võrdluskatses, milles lisati viit pindaktiivset ainet 
koguses 10 mg C/l (24), saadi järgmised tulemused.  
Uuritav kemikaal Keskmine biolagun ­
damise protsent 
(28 päeva) Variatsioonikor ­
daja 
(%) Laborite arv  
Tetrapropüleenben ­
seensulfonaat 17 45 10 
Diisooktüül-sulfosukt ­
sinaat 
(anioonne) 72 22 9 
Heksadetsüültrimetüü ­
lammooniumkloriid 
(katioonne) (*) 75 13 10 
Isononüülfenool(etok ­
sülaat)  9 
(mitteioonne) 41 32 10 
Kookosamiid-propüül- 
dimetüülhüdroksü- 
sulfobetaiin 
(amfoteerne) 60 23 11  
(*) Mürgisuse neutraliseerimiseks lisati SiO  2 . 
Tulemused näitavad, et enamasti oli variatsioon suurem halvemini lagu ­
nenud pindaktiivsete ainete puhul. Katsesisene variatsioon oli väiksem kui 15 % enam kui 90 % juhtudest ja suurim variatsioon jäi vahemikku 30–40 %.
 
MÄRKUS. Enamik pindaktiivseid aineid ei ole individuaalsed ained, vaid 
kujutavad endast selliste isomeeride, homoloogide jne segu, mis lagunevad pärast erinevaid iseloomulikke ooteperioode ja erineva kineetilise kiirusega. Seetõttu on kõverad „hägused”, 
venivad, mistõttu ei pruugita kümnepäevase ajavahemiku 
jooksul jõuda nõutava 60 % väärtuseni, kuigi iga aine eraldi katsetatuna jõuaks kümne päevaga > 60 % väärtuseni. Seda võib täheldada ka muude keerukate segude puhul.
 
MEETODI KIRJELDUS  
Seadmed  
15. Tavalised laboriseadmed ja  
a) klaasist seerumipudelid, mis on suletud butüülkummist korgi ja peale ­
valtsitava alumiiniumkapsliga. Soovitatav suurus on nn 125 ml pudel, 
mille kogumaht on ligikaudu 160 ml (sel juhul peaks iga pudeli maht 
olema teadaolevalt 160 ± 1 ml). Kui tulemused vastavad punktides 66 ja 67 kirjeldatud tingimustele, võib kasutada väiksemaid nõusid;
 
b) süsiniku analüsaator või muu mõõteseade (näiteks gaaskromatograaf) 
anorgaanilise süsiniku mõõtmiseks;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) suure täpsusega süstlad gaasi- ja vedelikeproovide võtmiseks;  
d) orbitaalloksuti reguleeritud temperatuuriga keskkonnas;  
e) varustatus CO  2 -vaba õhuga; selle tagamiseks juhitakse õhk läbi kaltsium ­
hüdroksiidi ja naatrium-/kaaliumhüdroksiidi segu graanulite või kasuta ­
takse (soovi korral) gaaside segu koostisega 80 % N  2 ja 20 % O  2 (vt 
punkt 28);  
f) membraanfiltrimisseade poori suurusega 0,20–0,45 μm (soovi korral);  
g) orgaanilise süsiniku analüsaator (soovi korral).  
Reagendid  
16. Kogu katse vältel tuleb kasutada analüütiliselt puhtaid reagente.  
Vesi 
17. Tuleks kasutada destilleeritud või deioniseeritud vett, mille orgaanilise süsi ­
niku kogusisaldus on ≤ 1 mg/l. See moodustab ≤ 5 % algsest orgaanilise 
süsiniku sisaldusest, mis lisatakse soovitatud doosi uuritava kemikaaliga.  
Mineraalsooli sisaldava kasvukeskkonna põhilahused  
18. Põhilahused ja mineraalsooli sisaldav kasvukeskkond on samalaadsed kui 
standardis ISO 14593 (16) ja meetodi C.4 kiire biolagundatavuse katsetes 
(20). Suurema ammooniumkloriidi kontsentratsiooni kasutamine (2,0 g/l 0,5 g/l asemel) peaks olema vajalik ainult väga erandlikel juhtudel, näiteks siis, kui uuritava kemikaali kontsentratsioon on > 40 mg C/l. Põhilahuseid tuleks 
säilitada jahutatult ja need tuleks ära visata kuue kuu möödumisel või 
varem, kui esineb sadestumise või mikroobide kasvu märke. Valmistatakse järgmised põhilahused:
 
a) kaaliumdivesinikfosfaat (KH  2 PO 4 ) 8,50 g;  
dikaaliumvesinikfosfaat (K  2 HPO  4 ) 21,75 g;  
dinaatriumvesinikfosfaatdihüdraat (Na  2 HPO  4 ·2H 2 O) 33,40 g;  
ammooniumkloriid (NH  4 Cl) 0,50 g.  
Lahustage vees ja lisage vett 1 liitrini. Lahuse pH peaks olema 7,4 
(±0,2). Kui see ei ole nii, tuleks valmistada uus lahus;  
b) kaltsiumkloriiddihüdraat (CaCl  2 ·2H 2 O) 36,40 g.  
Lahustage vees ja lisage vett 1 liitrini;  
c) magneesiumsulfaatheptahüdraat (MgSO  4 ·7H 2 O) 22,50 g.  
Lahustage vees ja lisage vett 1 liitrini;  
d) raud(III)kloriidheksahüdraat (FeCl  3 ·6H 2 0) 0,25 g.  
Lahustage vees ja lisage vett 1 liitrini ning lisage üks tilk kontsentreeri ­
tud HCl.  
Mineraalse kasvukeskkonna valmistamine  
19. Segage 10 ml lahust a ligikaudu 800 ml veega (punkt 17), seejärel lisage 1 
ml lahuseid b, c ja d ning lisage vett 1 liitrini (punkt 17).  
Muud reagendid  
20. Kontsentreeritud ortofosforhape (H  3 PO 4 ) (> 85 massiprotsenti).  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Naatriumhüdroksiidi lahus 7M  
21. Lahustage 280 g naatriumhüdroksiidi (NaOH) 1 liitris vees (punkt 17). 
Määrake saadud lahuses lahustunud anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon ja võtke seda näitajat katsetulemuse arvutamisel arvesse (vt punktid 55 ja 
61), pidades eelkõige silmas punktis 66 esitatud kehtivuse kriteeriumi (b). 
Kui lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentratsioon on liiga suur, siis valmistage uus lahus.
 
Uuritav kemikaal  
22. Valmistage vees (punkt 17) või kasvukeskkonnas (punkt 19) vees piisavalt 
lahustuva uuritava kemikaali põhilahus, mille kontsentratsioon on eelistata ­
valt 100 korda suurem kui katses kasutatav lõplik kontsentratsioon; vajalik võib olla põhilahuse pH reguleerimine. Põhilahust tuleks lisada mineraalsele 
kasvukeskkonnale, et saada lõplik orgaanilise süsiniku kontsentratsioon 
vahemikus 2–40 mg C/l, eelistatavalt 20 mg C/l. Kui kasutatakse sellest väiksemat kontsentratsiooni, võib väheneda katse täpsus. Täpse mõõtesüstla 
abil võib nõudesse lisada lahustuvat või lahustumatut vedelat kemikaali. 
Halvasti lahustuva või lahustumatu uuritava kemikaali puhul võib vaja minna erimeetodit (25). Valikud on järgmised:
 
a) teadaoleva kaalutud koguse otse lisamine;  
b) enne lisamist ultraheliga dispergeerimine;  
c) dispergeerimine emulgaatoriga; sel juhul tuleb enne lisamist kindlaks 
teha, kas emulgaator mõjutab (inhibeerib või stimuleerib) mikroobide 
tegevust;  
d) vedela uuritava kemikaali või sobiva lenduva lahusti abil saadud lahuse 
adsorbeerimine inertsele kandjale või tugimaterjalile (näiteks klaaskiud ­
filter), millele järgneb lahusti (kui seda kasutati) aurustamine ja teadao ­
leva koguse otse lisamine;  
e) teadaolev kogus uuritava kemikaali lahust kergesti lenduvas lahustis 
viiakse tühja katsenõusse ja aurustatakse seejärel lahusti.  
Alapunktide c, d ja e puhul kasutatavaid aineid või lahusteid tuleb katsetada, 
et teha kindlaks nende võimalik stimuleeriv või inhibeeriv mõju mikroobide 
tegevusele (vt punkti 42 alapunkt b).  
Võrdluskemikaal  
23. Valmistage vees (punkt 17) (lahustuva) võrdluskemikaali põhilahus, mille 
kontsentratsioon on eelistatavalt 100 korda suurem kui katses kasutatav 
lõplik kontsentratsioon (20 mg C/l).  
Inhibeerimise kontroll  
24. Uuritavad kemikaalid sageli ei lagune kiire biolagunemise hindamiseks 
kasutatavates tingimustes. Üks võimalikke põhjusi on see, et uuritav kemi ­
kaal inhibeerib katses kasutataval kontsentratsioonil inokulumi. Katsepro ­
jekti võib lisada inhibeerimise kontrollkatse, et teha (tagantjärele) kindlaks inhibeerimine kui võimalik põhjus või mõjutav tegur. Alternatiivselt võib inhibeerimise kontrollkatsega kõnealuse mõju välistada ja näidata, et lagu ­
nemise puudumine või vähene lagunemine on põhjustatud üksnes vastupi ­
davusest mikroobide rünnakule katse tingimustes. Et saada teavet uuritava kemikaali mürgisuse kohta (aeroobsetele) mikroorganismidele, valmistage katse kasvukeskkonnas lahus, mis sisaldab uuritavat kemikaali ja võrdluske ­
mikaali (punkt 19) vastavalt igal lisatud kontsentratsioonil (vt punktid 22 ja 
23).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inokulum  
25. Inokulumi saamiseks võib kasutada mitmeid allikaid: aktiivmuda; reovee 
väljavool (kloorimata); pinnavesi ja muld või nimetatute segu (20). Võrd ­
luskemikaali abil tuleks kontrollida sellise inokulumi biolagundavat toimet. 
Olenemata lähtematerjalist ei tohiks kasutada uuritava kemikaaliga varem 
kokku puutunud mikroorganisme, kui meetodit kasutatakse kiire biolagun ­
datavuse katsena.  
Hoiatus. Aktiivmuda, reovesi ja reovee väljavool sisaldavad haigusetekita ­
jaid ja neid tuleb käsitleda ettevaatusega.  
26. Kogemuste põhjal on optimaalne inokulumi kogus selline, mis  
— on piisav asjakohase biolagunemise tagamiseks;  
— lagundab võrdluskemikaali kindlaksmääratud protsendi võrra (vt punkt 
66); 
— tagab lõppsegus 10  2 – 10  5 kolooniaid moodustava ühiku olemasolu 
milliliitri kohta;  
— tagab aktiivmuda kasutamisel lõppsegus tavaliselt hõljuvaine kontsentrat ­
siooni 4 mg/l, võib kasutada kontsentratsioone kuni 30 mg/l, kuid need 
võivad märkimisväärselt suurendada CO  2 tekkimist kontrollkatsetes (26);  
— ei sisalda rohkem kui 10 % uuritava kemikaaliga lisatavast orgaanilise 
süsiniku lähtekontsentratsioonist;  
— võimaldab lisada tavaliselt 1–10 ml inokulumi 1 liitri katselahuse kohta.  
Aktiivmuda  
27. Aktiivmuda kogutakse värskelt reoveepuhasti või peamiselt olmereovett 
töötleva laborimõõdus seadme aeratsiooninõust. Vajaduse korral tuleks 
suured osakesed sõelumisega kõrvaldada (sõelaava näiteks 1 mm  2 ) ja 
muda tuleks hoida kuni kasutamiseni aeroobsena.  
28. Alternatiivselt võib aktiivmuda pärast suurte osakeste kõrvaldamist lasta 
settida või tsentrifuugida (näiteks 1 100 × g 10 minuti vältel). Supernatant valatakse ära. Muda võib pesta mineraalse lahusega. Suspendeerige kont ­
sentreeritud hõljuvaine mineraalses toitekeskkonnas, et saada kontsentrat ­
sioon 3–5 g tahkeid osakesi liitri kohta. Seejärel aereerige, kuni on vaja.
 
29. Muda tuleks võtta tavapärasest töökorras puhastist. Suure koormusega 
puhastist pärinevat või inhibiitoreid sisaldavat muda tuleks pesta. Pärast 
põhjalikku segamist resuspendeeritud muda setitatakse või tsentrifuugitakse, kõrvaldatakse supernatant ja suspendeeritakse muda uuesti järgmises koguses mineraalses toitekeskkonnas. Seda korratakse, kuni muda peaks 
olema vaba liigsest substraadist või inhibiitorist.
 
30. Täielikult resuspendeeritud või töötlemata mudast võetakse vahetult enne 
kasutamist proov hõljuvaine kuivkaalu määramiseks.  
31. Veel üks võimalus on aktiivmuda homogeniseerida (3–5 g hõljuvainet / l). 
Muda töödeldakse Waringi segistis keskmisel kiirusel 2 min. Segatud muda setitatakse 30 minutit või vajaduse korral kauem ja dekanteeritakse vedelik, 
mida kasutatakse inokulumina kontsentratsioonil u 10 mg/l mineraalse 
kasvukeskkonna kohta.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. CO  2 teket kontrollkatsetes on võimalik vähendada veel sellega, et muda 
aereeritakse järgmise päevani õhuga, mis ei sisalda CO  2 . Sellises katses 
kasutatakse inokulumi kontsentratsiooni 4 mg aktiivmuda tahkeid osakesi 1 liitri kohta (13).
 
Reovee teisene väljavool  
33. Inokulumi võib saada ka valdavalt olmereovett töötleva puhasti või labori ­
mõõdus seadme sekundaarsest väljavoolust. Säilitage proovi aeroobsetes tingimustes ja kasutage seda võtmise päeval või laske sellel vajaduse korral 
kohaneda. Väljavool tuleks filtrida läbi jämefiltri, et eemaldada suured 
osakesed, ja seejärel mõõta pH.
 
34. Väljavoolu anorgaanilise süsiniku sisalduse vähendamiseks puhutakse 
filtraadist läbi CO  2 -vaba õhku (punkti 15 alapunkt e) ühe tunni vältel, 
hoides ortofosforhappe abil pH väärtust 6,5 (punkt 20). Algne pH taasta ­
takse naatriumhüdroksiidiga (punkt 21) ja pärast ligikaudu üks tund kestnud settimist võetakse inokulatsiooniks vajalik kogus supernatanti. Sellise barbo ­
teerimisega vähendatakse inokulumis anorgaanilise süsiniku sisaldust. Kui 
inokulumina kasutati näiteks filtritud barboteeritud väljavoolu maksimaalset 
soovituslikku kogust (100 ml/l), jäi kontrollnõudes olev anorgaanilise süsi ­
niku kogus vahemikku 0,4 kuni 1,3 mg/l (14), mis moodustas 2–6,5 % uuritava kemikaaliga lisatud süsinikusisaldusest 20 mg C/l juures ja 
4–13 % 10 mg C/l juures.
 
Pinnavesi  
35. Proov võetakse asjakohasest pinnaveest. Seda tuleks hoida aeroobsetes tingi ­
mustes ja kasutada võtmise päeval. Proov peaks vajaduse korral olema kontsentreeritud filtrimise või tsentrifuugimisega. Igas katsenõus kasutatud inokulumi maht peaks vastama punktis 26 esitatud kriteeriumidele.
 
Muld  
36. Maapinnast kuni 20 cm sügavuselt võetakse asjakohane mullaproov. Kivid, 
taimejäänused ja selgrootud tuleks mullaproovist eemaldada enne selle 
sõelumist läbi 2 mm avaga sõela (kui proov on kohe sõelumiseks liiga märg, kuivatage seda sõelumise võimaldamiseks osaliselt õhu käes). Proovi tuleks hoida aeroobsetes tingimustes ja kasutada võtmise päeval (kui proovi 
transporditakse lõdvalt kinniseotud mustas polüetüleenkotis, siis võib seda 
kotis säilitada 2–4 °C juures kuni ühe kuu vältel).
 
Inokulumi kohanemine  
37. Inokulumil võib lasta kohaneda katsetingimustega, kuid mitte uuritava kemi ­
kaaliga. Kohanemine võib vähendada CO  2 teket kontrollkatsetes. Kohane ­
mine hõlmab aktiivmuda katsetemperatuuril aereerimist niiske CO  2 -vaba 
õhuga 5–7 päeva jooksul pärast muda lahjendamist katse kasvukeskkonnas 
kontsentratsioonini 30 mg/l.  
KATSE KÄIK  
Pudelite arv  
38. Katse jaoks vajalike pudelite arv (punkti 15 alapunkt a) oleneb analüüside 
sagedusest ja katse kestusest.  
39. On soovitatav analüüsida piisavate ajavahemike järel kolme pudelit, et oleks 
võimalik määrata kindlaks kümnepäevane ajavahemik. Katse lõpus analüü ­
sitakse vähemalt viit katsepudelit (punkti 15 alapunkt a) komplektidest a, b 
ja c (vt punkt 42), et saaks arvutada biolagunemise keskmise protsendilise 
näitaja 95 % usaldusvahemikku.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Inokuleeritud kasvukeskkond  
40. Inokulumi kasutatakse kontsentratsioonil 4 mg aktiivmuda tahkeid kuivi 
osakesi ühe liitri kohta. Vahetult enne kasutamist valmistage piisavalt inoku ­
leeritud kasvukeskkond, lisades näiteks 2 ml töödeldud aktiivmuda (punktid 
27–32) kontsentratsiooniga 2 000 mg/l 1 liitrile mineraalsooli sisaldavale 
kasvukeskkonnale (punkt 19). Reovee sekundaarse väljavoolu kasutamise korral lisage kuni 100 ml väljavoolu (punkt 33) 900 ml mineraalsooli sisal ­
davale kasvukeskkonnale (punkt 19) ja lahjendage kasvukeskkonnaga 1 
liitrini.
 
Pudelite ettevalmistamine  
41. Inokuleeritud kasvukeskkonna alikvoodid sisestatakse paralleelproovide 
pudelitesse, et saada vabaruumi ja vedeliku suhe 1 : 2 (näiteks 160 ml 
mahuga pudelitesse lisage 107 ml). Võib kasutada ka muud suhtarvu, 
kuid seejuures tuleb arvesse võtta punktis 11 esitatud hoiatust. Ükskõik kumba tüüpi inokulumi kasutamise puhul tuleb jälgida, et inokuleeritud kasvukeskkond oleks piisavalt segatud, et selle saaks ühtlaselt jaotada katse ­
pudelitesse.
 
42. Valmistatakse ette järgmise sisuga pudelite komplektid (punkti 15 alapunkt a):  
a) uuritavat kemikaali sisaldavad katsenõud (tähis F  T ); 
b) ainult katse kasvukeskkonda ja inokulumi sisaldavad kontrollnõud (tähis 
F B ); neisse tuleb lisada ka kõik kemikaalid, lahustid, ained või klaas ­
kiudfiltrid, mida kasutatakse uuritava kemikaali lisamiseks katsenõu ­
desse;  
c) nõud võrdluskemikaaliga (tähis F  C ) katse õige läbiviimise kontrollimi ­
seks;  
d) vajaduse korral uuritava kemikaali võimaliku inhibeeriva mõju kontrolli ­
mise nõud (tähis F  I ), mis sisaldavad nii uuritavat kemikaali kui ka võrd ­
luskemikaali samal kontsentratsioonil kui vastavalt pudelid F  T ja F  C 
(punkt 24);  
e) nõud (tähis F  S ) nagu punktis a võimaliku abiootilise lagunemise kont ­
rollimiseks, millesse lisatakse 50 mg/l HgCl  2 või mis steriliseeritakse 
muul viisil (näiteks autoklaavimine).  
43. Vees lahustuvad uuritavad kemikaalid ja võrdluskemikaalid lisatakse põhi ­
lahustena vees (punktid 22, 23 ja 24), et saada kontsentratsioon 10–20 mg C/l.
 
44. Lahustumatu uuritav kemikaal ja lahustumatu võrdluskemikaal lisatakse 
pudelitesse sobival viisil (vt punkti 22 alapunktid a–e), olenevalt uuritava 
kemikaali laadist ja lisamise meetodist kas enne või pärast inokuleeritud 
kasvukeskkonna lisamist. Kui kasutatakse punkti 22 alapunktides a–e nime ­
tatud meetodit, tuleks kontrollpudeleid F  B (punkti 42 alapunkt b) töödelda 
samal viisil, kuid ilma uuritavat kemikaali või võrdluskemikaali lisamata.  
45. Lenduv uuritav kemikaal tuleks mikrosüstla abil sisestada suletud pudelisse 
(punkt 47). Doos arvutatakse sisestatava koguse ja uuritava kemikaali tihe ­
duse alusel.  
46. Vajaduse korral tuleks nõudesse lisada vett, et kõigis nõudes oleks ühesu ­
gune vedelikukogus. Tuleb tagada, et vabaruumi ja vedeliku suhe (enamasti 
1 : 2) ning uuritava kemikaali kontsentratsioon on sellised, et vabaruumis on 
piisavalt hapnikku täieliku biolagunemise võimaldamiseks.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Kõik pudelid suletakse seejärel näiteks butüülkummist vahekorgi ja alumii ­
niumkapsliga. Lenduv uuritav kemikaal tuleks lisada selles etapis (punkt 
45). Kui katselahuses jälgitakse lahustunud orgaanilise süsiniku kontsentrat ­
siooni vähenemist ning kui anorgaanilise süsiniku algkontsentratsiooni (steriilne kontrollkatse, punkti 42 alapunkt e) või muid näitajaid määratakse 
aja nullpunktis, siis eemaldatakse asjaomane proov katsenõust. Katsenõu ja 
selle sisu tuleb seejärel kõrvaldada.
 
48. Suletud pudelid asetatakse pöördloksutile (punkti 15 alapunkt d), mille 
loksutuskiirus on piisav pudeli sisu hästi segatuna ja suspensioonis hoidmi ­
seks (näiteks 150 kuni 200 pööret minutis), ja inkubeeritakse pimedas temperatuuril 20 ± 1 °C.
 
Proovide võtmine  
49. Proovide võtmise kava sõltub ooteperioodist ja uuritava kemikaali biolagu ­
nemise kineetilisest kiirusest. Pudelid analüüsitakse proovivõtu päeval; proove võetakse vähemalt iga nädal või sagedamini (näiteks kaks korda nädalas), kui on vaja koostada täielik lagunemiskõver. Loksutist võetakse 
nõutav arv F
 T , F B ja F  C paralleelproovide pudeleid ning, kui neid kasuta ­
takse, siis ka F  I ja F  S pudeleid (vt punkt 42). Katse kestus on tavaliselt 28 
päeva. Kui biolagunemise kõver näitab, et enne 28 päeva möödumist on 
jõutud platooni, siis võib katse lõpetada enne 28. päeva. Võtke proovid 
viiest pudelist, mis on hoitud 28. päeva analüüsi jaoks, ja kasutage tulemusi, et arvutada biolagunemise protsendi usalduspiirid või variatsioonikordaja. Inhibeerimise ja abiootilise lagunemise kontrollkatsete pudeleid ei ole vaja 
võtta proovideks sama sagedasti kui teisi pudeleid; piisab proovi võtmisest 
1. ja 28. päeval.
 
Anorgaanilise süsiniku analüüs  
50. CO  2 tekkimine pudelites inkubeerimise ajal tehakse kindlaks anorgaanilise 
süsiniku kontsentratsiooni suurenemise mõõtmisega. Katse jooksul tekkinud 
anorgaanilise süsiniku koguse mõõtmiseks on kaks soovitatud meetodit, 
mida on kirjeldatud allpool. Kuna meetodid võivad anda veidi erineva tule ­
muse, tuleks katse vältel neist kasutada ainult ühte.  
51. Meetodit a soovitatakse juhul, kui kasvukeskkond võib tõenäoliselt sisaldada 
näiteks klaasfilterpaberi ja/või lahustumatu uuritava kemikaali jääke. Kui süsiniku analüsaatorit ei ole, siis võib selle analüüsi teha gaaskromatograa ­
figa. Vabaruumi gaasi analüüsimise käigus on tähtis, et pudelid oleksid 
katsetemperatuuril või sellele lähedal. Meetod b võib olla lihtsam laborile, kes kasutab anorgaanilise süsiniku mõõtmiseks süsiniku analüsaatorit. On tähtis, et CO
 2 karbonaadiks muundamiseks kasutatav naatriumhüdroksiidi 
lahus (punkt 21) oleks kas värskelt valmistatud või selle anorgaanilise süsi ­
niku sisaldus oleks teada, et seda saaks katsetulemuste arvutamisel arvesse võtta (vt punkti 66 alapunkt b.)
 
Meetod a: hapestamine pH-ni < 3  
52. Enne iga analüüside partiid kaliibritakse anorgaanilise süsiniku analüsaator 
asjakohase anorgaanilise süsiniku standardi abil (näiteks 1 massiprotsent CO
 2 N 2 -s). Läbi iga proovivõtuks kasutatava pudeli vahekorgi süstitakse 
kontsentreeritud ortofosforhapet (punkt 20), et viia kasvukeskkonna pH 
väärtusele < 3 (näiteks 107 ml katse kasvukeskkonnale lisatakse 1 ml). 
Pudelid pannakse tagasi loksutile. Pärast ühetunnilist loksutamist katsetem ­
peratuuril võetakse pudelid loksutilt, iga pudeli vabaruumist võetakse gaasi alikvoot (näiteks 1 ml) ja süstitakse anorgaanilise süsiniku analüsaatorisse. 
Anorgaanilise süsiniku mõõdetud kontsentratsioon väljendatakse ühikutes 
mg C/l.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Selle meetodi põhimõte seisneb asjaolus, et pärast hapestamist tasemele pH 
< 3 ja tasakaalustamist 20 °C juures on katsepudelites CO  2 vedela ja gaasi ­
faasi vahel jaotumise tasakaalukonstant 1,0, kui seda mõõdetakse kontsen ­
tratsioonina (13). Seda tuleks katsesüsteemi puhul vähemalt üks kord järg ­
miselt tõendada.  
Valmistage ette pudelid, mis sisaldavad 5 ja 10 mg/l anorgaanilist süsinikku, 
kasutades veevaba naatriumkarbonaadi (Na  2 CO 3 ) lahust CO  2 -vabas vees, 
mis on valmistatud kontsentreeritud ortofosforhappe abil (punkt 20) vee 
pH viimisega väärtuseni 6,5, lahuse barboteerimisega järgmise päevani CO
 2 -vaba õhuga ja pH viimisega neutraalseks leelise abil. Kontrollige, et 
vabaruumi mahu ja vedelikukoguse suhe oleks sama kui katsete puhul 
(näiteks 1 : 2). Hapestage ja tasakaalustage punktis 52 kirjeldatud viisil 
ning mõõtke anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon nii vabaruumis kui ka vedelfaasis. Kontrollige, et need kaks kontsentratsiooni langeksid katsevea piires kokku. Kui need kokku ei lange, peaks katse tegija meetodid üle 
vaatama. Seda anorgaanilise süsiniku vedela ja gaasifaasi vahel jaotumise 
kontrolli ei ole vaja teha iga katse puhul; seda võib eeldatavasti teha kali ­
breerimise ajal.
 
54. Kui mõõdetakse lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist (ainult vees 
lahustuvad uuritavad kemikaalid), tuleks proovid võtta eraldi (hapestamata) 
pudelite vedelfaasist, filtrida membraanfiltriga ja süstida lahustunud orgaa ­
nilise süsiniku analüsaatorisse. Neid pudeleid võib vajaduse korral kasutada muudeks analüüsideks, et mõõta esmast biolagunemist.
 
Meetod b: CO  2 muundamine karbonaadiks  
55. Enne iga analüüside partiid kaliibritakse anorgaanilise süsiniku analüsaator 
asjakohase standardi abil, näiteks naatriumvesinikkarbonaadi (NaHCO  3 ) 
lahusega CO  2 -vabas vees (vt punkt 53) anorgaanilise süsiniku vahemikus 
0–20 mg/l. Läbi iga proovivõtuks kasutatava pudeli vahekorgi süstitakse 
naatriumhüdroksiidi lahust (7M, punkt 21) (näiteks 107 ml kasvukeskkonna kohta lisatakse 1 ml) ja pudeleid loksutatakse tund aega katsetemperatuuril. Kõigisse konkreetsel päeval kasutatavatesse pudelitesse süstitakse sama 
NaOH lahust; katse eri proovivõtukordadel aga ei ole vaja kasutada sama 
lahust. Kui kõigil proovivõtukordadel on vaja mõõta anorgaanilise süsiniku absoluutsed väärtused kontrollkatsetes, tuleb iga kasutamise ajal määrata NaOH lahuses anorgaaniline süsinik. Pudelid võetakse loksutilt ja neil 
lastakse settida. Iga nõu vedelfaasist võetakse süstlaga vajalik kogus (näiteks 
50 – 1 000 μl). Proov süstitakse anorgaanilise süsiniku analüsaatorisse ja 
registreeritakse anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon. Kasutatav analü ­
saator peab olema kohandatud selle meetodiga saadavate leeliseliste proo ­
vide mõõtmiseks.
 
56. Selle meetodi põhimõte seisneb selles, et pärast leelise lisamist ja loksuta ­
mist on anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon vabaruumis ebaoluline. Katsesüsteemis tuleks seda vähemalt üks kord kontrollida anorgaanilise süsi ­
niku standardiga, leelise lisamise, tasakaalustamise ja anorgaanilise süsiniku 
kontsentratsiooni mõõtmisega nii vabaruumis kui ka vedelfaasis (vt punkt 
53). Kontsentratsioon vabaruumis peaks olema nullilähedane. Kõnealust CO
 2 peaaegu täieliku neeldumise kontrolli ei ole vaja teha iga katse puhul.  
57. Kui mõõdetakse lahustunud orgaanilise süsiniku kõrvaldamist (ainult vees 
lahustuvad uuritavad kemikaalid), tuleks eraldi pudelite vedelfaasist (leelist lisamata) võtta proovid, filtrida membraanfiltriga ja süstida lahustunud 
orgaanilise süsiniku analüsaatorisse. Neid pudeleid võib vajaduse korral 
kasutada veel muudeks analüüsideks, et mõõta esmast biolagunemist.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Tulemuste arvutamine  
58. Kui eeldada uuritava kemikaali 100 % mineraliseerumist CO  2 -ni, on kont ­
rollnõus tekkivale CO  2 -le lisandunud maksimaalne teoreetiliselt võimalik 
anorgaanilise süsiniku sisaldus (ThIC) võrdne igasse katsepudelisse katse alguses lisatud orgaanilise süsiniku kogusisaldusega (TOC), s.o:
 
ThIC ¼ TOC  
Anorgaanilise süsiniku kogumass TIC (mg) igas pudelis on: 
TIC ¼ ðmg C vedelikus þ mg C vabaruumisÞ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ võrrand 1,  
kus: 
V L = vedeliku kogus pudelis (liitrites);  
C L = anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon vedelikus (mg/l süsinikuna);  
V H = kogus vabaruumis (liitrites);  
C H = anorgaanilise süsiniku kontsentratsioon vabaruumis (mg/l süsini ­
kuna).  
Anorgaanilise süsiniku kogumassi (TIC) arvutamist käesolevas katses anor ­
gaanilise süsiniku mõõtmiseks kasutatud kahe analüüsimeetodi korral on 
kirjeldatud allpool punktides 60 ja 61. Biolagunemise protsent ( % D ) 
leitakse kummalgi juhul järgmiselt: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 võrrand 2,  
kus: 
TIC  t = anorgaanilise süsiniku kogumass (mg) katsepudelis ajal t;  
TIC  b = keskmine anorgaanilise süsiniku kogumass (mg) kontrollpudelis 
ajal t;  
TOC = katsenõusse algselt lisatud anorgaanilise süsiniku kogumass (mg).  
Biolagunemise protsent % D arvutatakse katse (F  T ), võrdluskatse (F  C ) ja 
(kui seda kasutatakse) inhibeerimise seire kontrollkatse (F  I ) pudelites kuni 
iga proovivõtuajani tekkinud anorgaanilise süsiniku kogumassi alusel.  
59. Kui katse vältel suureneb oluliselt anorgaanilise süsiniku kogumass steriil ­
setes kontrollnõudes (F  S ), siis võib järeldada, et uuritav kemikaal laguneb 
abiootiliselt, ja seda tuleb võrrandis 2 D arvutamisel arvesse võtta.  
Hapestamine pH väärtusele < 3  
60. Kuna hapestamisel pH väärtusele < 3 ja tasakaalustamisel muutuvad anor ­
gaanilise süsiniku kogumassi kontsentratsioonid vedelfaasis ja gaasifaasis 
võrdseks, siis on vaja mõõta ainult gaasifaasi anorgaanilise süsiniku kont ­
sentratsioon. Seega saab võrrandi 1 alusel tuletada  
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , kus V  B on seerumipudeli maht.  
CO  2 muundamine karbonaadiks  
61. Selle meetodi puhul tehakse arvutused võrrandi 1 järgi, aga ebaolulist anor ­
gaanilise süsiniku kogust gaasifaasis ei võeta arvesse, s.o  V H Ü C H ¼ 0, ja  
TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Tulemuste väljendamine  
62. Biolagunemise kõvera saamiseks kantakse graafikule biolagunemise protsent 
D sõltuvalt inkubatsiooniajast ning võimaluse korral näidatakse ootefaas, biolagunemise faas, kümnepäevane ajavahemik ja platoofaas (s.o faas, kus 
on jõutud maksimaalse lagunemiseni ja biolagunemise kõver muutub hori ­
sontaalseks). Kui F
 T paralleelkatsetes saadakse võrreldavad väärtused 
(erinevus < 20 %), koostatakse keskmistatud kõver (vt 2. liite joonis 1); kui tulemused ei ole võrreldavad, koostatakse kõver iga nõu kohta. Määra ­
takse platoofaasi biolagunemise protsendi keskväärtus või hinnatakse suurim 
väärtus (näiteks kui kõver hakkab platoofaasis langema); viimati nimetatud juhul on tähtis kontrollida, et väärtus ei oleks võõrväärtus. Katseprotokollis 
tuleb see biolagunemise maksimaalne tase märkida kui „uuritava kemikaali 
biolagunemise määr”. Kui katsenõude arv ei ole piisav platoofaasi kindlaks ­
tegemiseks, kasutatakse keskväärtuse arvutamiseks katse viimasel päeval mõõdetud andmeid. Viimane nimetatud väärtus, viie paralleelkatse kesk ­
mine, näitab biolagunemise protsendi määramise täpsust. Samuti tuleb regis ­
treerida kümnepäevase ajavahemiku lõpus saadud näitaja.
 
63. Samal viisil koostatakse võrdluskemikaali F  C biolagunemise kõver ning (kui 
seda kasutatakse) abiootilise kõrvaldamise kontrolli F  S ja inhibeerimise 
kontrolli F  I kõver.  
64. Uuritava kemikaalita kontrollkatsetes (F  B ) oleva anorgaanilise süsiniku 
kogumass registreeritakse; samuti toimitakse F  S (abiootiline kontroll) 
nõude puhul, kui katses kasutati kõnealuseid kontrollnõusid.  
65. F  I nõude puhul arvutatakse D teoreetiliselt võimaliku anorgaanilise süsiniku 
tekkimise alusel, lähtudes ainult segus oleva võrdluskemikaali sisaldusest. 
Kui 28. päeval [(D  FC ( 1 ) – D  FI) ( 2 ) / D  FC ] × 100 > 25 %, siis võib eeldada, et 
uuritav kemikaal inhibeeris inokulumi tegevust, ja see võib seletada katse tingimustes saadud D
 FT madalat väärtust. Sel juhul võib katset korrata, 
kasutades väiksemat uuritava kemikaali kontsentratsiooni ning eelistatavalt 
vähendades lahustunud anorgaanilise süsiniku sisaldust inokulumis ja uuri ­
tava kemikaalita kontrollnõudes tekkinud anorgaanilise süsiniku kogumassi, kuna vastasel juhul vähendab väiksem kontsentratsioon meetodi täpsust. 
Alternatiivselt võib kasutada muud inokulumi. Kui kolvis F
 S (abiootiline) 
täheldatakse anorgaanilise süsiniku kogumassi olulist suurenemist (> 10 %), siis võis esineda abiootilist lagunemist.
 
Tulemuste kehtivus  
66. Katset peetakse kehtivaks, kui  
a) võrdluskemikaali sisaldavates nõudes F  C on keskmine lagunemise prot ­
sent > 60 % inkubatsiooni 14. päevaks ja  
b) kontrollnõudes F  B on anorgaanilise süsiniku kogumassi keskmine kogus 
katse lõpus > 3 mg C/l.  
Kui need piirmäärad ei ole täidetud, tuleks katset korrata muust allikast pärit 
inokulumiga ja/või kasutatud meetodid tuleks läbi vaadata. Näiteks kui 
probleem on rohke anorgaanilise süsiniku tekkimine kontrollnõudes, tuleks kasutada punktides 27–32 kirjeldatud meetodit.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Lagunemise protsent F  C nõudes, mis sisaldavad võrdlusainet. 
( 2 ) Lagunemise protsent F  I nõudes.
 67. Kui uuritava kemikaali lagundamisel ei saavuta 60 % teoreetiliselt maksi ­
maalsest anorgaanilise süsiniku sisaldusest ja inhibeerivat mõju ei täheldatud 
(punkt 65), võib katset korrata inokulumi suurema kontsentratsiooniga (kuni 30 mg/l aktiivmuda ja 100 ml väljavoolu / l) või muudest allikatest saadud inokulumiga, eelkõige siis, kui lagunemine jäi vahemikku 20–60 %.
 
Tulemuste tõlgendamine  
68. Selles katses näitab biolagunemine > 60 % teoreetiliselt maksimaalsest anor ­
gaanilise süsiniku tasemest kümnepäevase ajavahemiku jooksul, et uuritav 
kemikaal on aeroobsetes tingimustes kiirelt biolagundatav.  
69. Kui nõutud kriteerium – 60 % teoreetiliselt maksimaalsest anorgaanilise 
süsiniku kogusest – ei ole täidetud, määratakse pudelites oleva kasvukesk ­
konna pH (ilma hapestamata või leelistamata); väärtus alla 6,5 võib viidata 
nitrifikatsiooni toimumisele. Sel juhul tuleb katset korrata puhverlahuse suurema kontsentratsiooniga.
 
Katseprotokoll  
70. Koostatakse tabel, milles on % D väärtused iga katse (F  T ), võrdluse (F  C ) ja 
(kui seda kasutati) inhibeerimise kontrollnõu (F  I ) iga proovivõtu päeva 
kohta. Kui paralleelproovide pudelite kohta saadakse võrreldavad tulemused, 
siis koostatakse keskmise % D ajast sõltuvuse graafik. Registreeritakse anor ­
gaanilise süsiniku kogumass kontrollnõudes (F  B ) ja lahustunud orgaaniline 
süsinik ja/või muud näitajad steriilsetes kontrollnõudes (F  S ) ning nende 
kõrvaldamise protsent.  
71. Määratakse % D keskväärtus platoofaasis või suurim väärtus, kui biolagu ­
nemise kõver platoofaasis langeb, ning esitatakse see uuritava kemikaali lagunemise määrana. Tähtis on tagada, et viimati nimetatud juhul ei oleks 
suurim näitaja võõrväärtus.
 
72. Katseprotokollis esitatakse alljärgnev teave.  
Uuritav kemikaal:  
— tavanimetus, keemiline nimetus, CASi number, struktuurivalem ja asja ­
kohased füüsikalis-keemilised omadused;  
— uuritava kemikaali puhtus (lisandid).  
Katsetingimused:  
— viide käesolevale katsemeetodile;  
— kasutatud katsesüsteemi kirjeldus (näiteks nõu maht, vabaruumi ja vede ­
liku suhe, segamise meetod jne);  
— uuritava kemikaali ja võrdluskemikaali lisamine katsesüsteemi: kasutatud 
kontsentratsioonid ja igasse katsepudelisse lisatud süsiniku kogus ning 
lahustite kasutamine;  
— andmed kasutatud inokulumi kohta, iga eeltöötlemine ja kohandamine;  
— inkubatsioonitemperatuur;  
— anorgaanilise süsiniku analüüsi põhimõtte valideerimine;  
— kasutatud anorgaanilise süsiniku analüsaatori (ja muude kasutatud 
analüüsimeetodite) peamised omadused;  
— paralleelproovide arv.  
Tulemused:  
— mõõdetud biolagundatavuse andmed ja arvutatud väärtused tabeli kujul;  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— katse- ja võrdluskemikaali lagunemise protsendi sõltuvus ajast graafi ­
kuna, ootefaas, lagunemisfaas, kümnepäevane ajavahemik ja tõus;  
— kõrvaldamise protsent platoofaasis, katse lõpus ja pärast kümnepäevast 
ajavahemikku;  
— iga katsetulemuste arvestamata jätmise põhjendus;  
— kõik muud andmed, mis on kasutatud katsemeetodi puhul asjakohased;  
— tulemuste arutelu.  
KIRJANDUS  
1) Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine – CO  2 
eraldumise katse (meetod C.4-C)”.  
2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159–167.
 
3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.  
4) Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide reco ­
very in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210.
 
5) ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
 
6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
 
7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.  
9) Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 
28: 801–812.  
10) Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biode ­
gradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.  
11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.  
12) Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measu ­
ring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
 
13) Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 
204–211.  
14) Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507–524.  
15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, 
and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegrada ­
tion. Chemosphere 19: 1527–1550.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
16) ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biode ­
gradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis 
of inorganic carbon in sealed vessels (CO  2 headspace test).  
17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, 
Chemosphere 34: 1813–1822.  
18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance, Washington, DC.  
19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 
3219–3235.
 
20) Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine”.  
21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
 
22) Käesoleva lisa peatükk C.11 „Aktiivmuda respiratsiooni pärssimise katse”.  
23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. 
Biodegradation 6: 319–327.  
24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, 
May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.  
25) ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalua ­
tion of their biodegradability in an aqueous medium.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
1. liide  
LÜHENDID JA MÕISTED  
IC –  anorgaaniline süsinik.  
ThCO  2 – teoreetiline süsinikdioksiid (mg) on arvutuslik süsinikdioksiidi kogus, 
mis tekib uuritava kemikaali teadaolevast või mõõdetud süsinikusisaldusest uuri ­
tava kemikaali täielikul mineraliseerumisel; seda väljendatakse ka uuritava kemi ­
kaali mg kohta tekkinud süsinikdioksiidi mg-dena.  
DOC –  lahustunud orgaaniline süsinik ( dissolved organic carbon ) on lahuses 
olev orgaaniline süsinik või süsinik, mis läbib 0,45-mikromeetrise filtri või jääb supernatanti 15-minutilisel tsentrifuugimisel ligikaudu 4 000 g (ligikaudu 40 000 m/s
 -2 ) juures.  
DIC –  lahustunud anorgaaniline süsinik ( dissolved inorganic carbon ). 
ThIC –  teoreetiline anorgaanilise süsiniku sisaldus ( theoretical inorganic 
carbon ). 
TIC –  anorgaanilise süsiniku kogusisaldus ( total inorganic carbon ). 
Kiiresti biolagundatav –  hinnanguline klassifikatsioon sellise kemikaali kohta, 
mis on läbinud konkreetsed kindlaks määratud lõpliku biolagunemise sõelumis ­
katsed; kõnealused katsed on nii ranged, et kõnealust kemikaali võib pidada 
kiiresti ja täielikult biolagundatavaks veekeskkonnas aeroobsetes tingimustes.  
Kümnepäevane ajavahemik –  10 % biolagunemise saavutamisele vahetult järg ­
nevad kümme päeva.  
Iseeneslik biolagundatavus –  klassifikatsioon kemikaalide kohta, mille (esmase 
või lõpliku) biolagunemise kohta on mis tahes biolagundatavuse katses saadud 
kindlad tõendid.  
Täielik aeroobne biolagunemine –  saavutatud lagunemise määr, mille korral 
mikroorganismid on uuritava kemikaali täielikult ära tarvitanud ja muutnud selle süsinikdioksiidiks, veeks, mineraalsooladeks ja uuteks mikroobirakkudeks 
(biomassiks).
 
Mineraliseerumine –  mineraliseerumine on orgaanilise kemikaali täielik lagune ­
mine CO  2 -ks ja H  2 O-ks aeroobsetes tingimustes ning CH  4 -ks, CO  2 -ks ja H  2 O-ks 
anaeroobsetes tingimustes.  
Ootefaas –  aeg katse algusest kuni ajani, millal lagundava toimega mikroorga ­
nismid on aklimatiseerunud ja/või kohanenud ja uuritava kemikaali või orgaani ­
lise aine biolagunemine on jõudnud avastatava tasemeni (näiteks 10 % maksi ­
maalsest teoreetilisest biolagunemisest või vähem, olenevalt mõõtemeetodi täpsu ­
sest).  
Lagunemisfaas –  aeg ootefaasi lõpust ajani, mil on saavutatud 90 % maksimaal ­
sest lagunemisest.  
Platoofaas –  platoofaas on faas, kus on jõutud maksimaalse lagunemiseni ja 
biolagunemise kõver muutub horisontaalseks.  
Uuritav kemikaal –  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
2. liide  
Biolagunemise kõvera näide  
Joonis 1  
1-oktanooli biolagunemine CO  2 vabaruumi katses
  
Mõisted  
biolagunemine  
lagunemisfaas  
biolagunemise maksimaalne tase  
platoofaas  
kümnepäevane ajavahemik  
katse aeg (päevad)  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30. BIOAKUMULATSIOON MULLA VÄHEHARJASUSSIDES  
SISSEJUHATUS  
1. Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 317 (2010). 
Keskkonnale avalduva mõjuga seotud katsemeetoditest avaldati „Biokont ­
sentratsioon: kaladega läbivoolukatse” (käesoleva lisa peatükk C.13 (49)) 
ja „Bioakumulatsioon setetes elavates põhjaloomadest väheharjasussides” (53) vastavalt 1996. aastal ja 2008. aastal. Vesikeskkonna bioakumulatsiooni andmete ekstrapoleerimine sellistele mullaorganismidele nagu vihmaussid on 
keeruline, kui üldse võimalik. Uuritava kemikaali lipofiilsusel põhinevaid 
mudelarvutusi, vt näiteks kirjanduse loetelust 14 ja 37, kasutatakse praegu mullas toimuva kemikaalide bioakumulatsiooni hindamiseks, näiteks ELi tehnilises juhenddokumendis (19). Keskkonnaosa-põhise katsemeetodi vaja ­
dusega on juba tegeldud, vt näiteks 55. Selline meetod on eelkõige tähtis 
teisese mürgisuse hindamiseks mullas elavate loomade toiduahelates (4). Mitmes riiklikus katsemeetodis käsitletakse bioakumulatsiooni muudes orga ­
nismides kui kalad, vt näiteks kirjanduse loetelust 2 ja 72. USA Materjalide 
Katsetamise Ühing (3) on välja töötanud meetodi bioakumulatsiooni mõõt ­
miseks saastunud mullas elavates vihmaussides ( Eisenia fetida,  Savigny) ja 
valgeliimuklastes. Rahvusvaheliselt tunnustatud meetod bioakumulatsiooni määramiseks rikastatud mullas parandab kemikaalide riskihindamist 
maapealsetes ökosüsteemides (vt näiteks 25, 29).
 
2. Mulda söövad selgrootud puutuvad kokku mullas olevate kemikaalidega. 
Nende loomade hulgas on mulla väheharjasussidel mulla struktuuri ja 
toime säilitamisel tähtis osa (15, 20). Mulla väheharjasussid elavad mullas ja osaliselt maapinnal (eelkõige metsavarise kihis); nad on biomassi mõistes sageli kõige rikkalikum liik (54). Mulla bioturbatsiooni teel ja olles toiduks 
teistele loomadele võivad need loomad suurel määral mõjutada kemikaalide 
biosaadavust muudele organismidele, nagu selgrootud röövloomad (näiteks röövlestad ja -põrnikad (näiteks 64) või selgroogsed röövloomad (näiteks rebased ja kajakad) (18, 62). Mõnd mulla väheharjasusside liiki, keda 
praegu ökotoksikoloogilistes katsetes kasutatakse, on kirjeldatud 5. liites.
 
3. USA Materjalide Katsetamise Ühingu standardjuhend mulla mürgisuse või 
bioakumulatsiooni laborikatsete tegemise kohta  Lumbricidae  sugukonda 
kuuluva vihmaussiga  Eisenia fetida  ja Enchytraeidae  sugukonda kuuluva 
valgeliimukaga  Enchytraeus albidus  (3) annab palju üliolulisi ja kasulikke 
andmeid käesoleva mullas toimuva bioakumulatsiooni katsemeetodi kasuta ­
mise kohta. Käesolevas katsemeetodis viidatud täiendavad dokumendid on 
käesoleva lisa peatükk C.13 „Biokontsentratsioon: kaladega läbivoolukatse” (49) ja OECD katsejuhend nr 315 „Bioakumulatsioon setetes elavates põhja ­
loomadest väheharjasussides” (53). Käesoleva katsemeetodi jaoks on tähtsad 
teabeallikad ka praktilised kogemused mulla bioakumulatsiooni uuringutega 
ja asjaomased väljaanded (näiteks 1, 5, 11, 12, 28, 40, 43, 45, 57, 59, 76, 78, 79).
 
4. Käesolev katsemeetod on peamiselt kasutatav stabiilsete neutraalsete orgaa ­
niliste kemikaalide puhul, mis kalduvad adsorbeeruma mullal. Käesoleva katsemeetodi abil võib olla võimalik uurida mullaga seonduvate stabiilsete 
metallorgaaniliste ühendite bioakumulatsiooni. Seda saab kasutada ka metal ­
lide ja muude mikroelementide puhul.
 
EELTINGIMUSED  
5. Mulla väheharjasussides kemikaali bioakumulatsiooni mõõtmise katseid on 
tehtud raskmetallidega (vt näiteks 63) ja püsivate orgaaniliste kemikaalidega, 
millel on väike log K  ow väärtus vahemikus 3,0–6,0, vt näiteks 40. Neid 
katseid kasutatakse järgmiste ainete puhul:  
— kemikaalid, mille log K  ow on suurem kui 6,0 (väga hüdrofoobsed kemi ­
kaalid);  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— kemikaalid, mis kuuluvad teadaolevalt elusorganismides bioakumulee ­
ruda võivate orgaaniliste kemikaalide hulka, näiteks pindaktiivsed või 
väga suure adsorptsioonivõimega kemikaalid;  
— kemikaalid, mille struktuuri alusel võib oletada bioakumulatsiooni, 
näiteks teadaolevalt bioakumuleeruvate kemikaalide analoogid;  
— metallid.  
6. Enne uuringu alustamist tuleks uuritava kemikaali kohta teha kindlaks 
sellised andmed nagu tavanimetus, keemiline nimetus (eelistatavalt Rahvus ­
vahelise Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liidu (IUPAC) nimetus), struk ­
tuurivalem, CASi registreerimisnumber, puhtus, ohutusabinõud, säilitamis ­
tingimused ja analüüsimeetodid. Lisaks peaks olema teada järgmine teave:  
a) lahustuvus vees;  
b) oktanooli/vee jaotuskoefitsient, K  ow ; 
c) mulla/vee jaotuskoefitsient, K  oc ; 
d) aururõhk;  
e) lagunduvus (näiteks mullas, vees);  
f) teada olevad metaboliidid.  
7. Võib kasutada radiomärgistatud või radiomärgistamata uuritavat kemikaali. 
Analüüsi lihtsustamiseks soovitatakse siiski kasutada radiomärgistatud kemi ­
kaali. Otsus tehakse tuvastuspiiride alusel või lähtudes sellest, kas on vaja mõõta uuritavat lähtekemikaali ja metaboliite. Kui kasutatakse radiomärgis ­
tatud uuritavat kemikaali ja mõõdetakse radioaktiivsete jääkide kogusisal ­
dust, siis on tähtis, et mullas ja katseorganismis leiduvates radiomärgisega 
jääkides määrataks uuritava lähtekemikaali panus ja muude märgisega kemi ­
kaalide panus, näiteks statsionaarses olekus või omastamisfaasi lõpus võetud proovides, et oleks võimalik arvutada uuritava lähtekemikaali ja asjakohaste 
mulla metaboliitide bioakumulatsioonitegur (vt punkt 50). Siin kirjeldatud 
meetodit võib olla vaja muuta, näiteks selleks, et tagada piisav biomass radiomärgistamata orgaanilise uuritava kemikaali või metallide mõõtmiseks. Kui mõõdetakse radioaktiivsete jääkide kogusisaldust (vedelik-stsintillat ­
siooni loenduriga pärast ekstraheerimist, põletamist või koe lahustamist), 
põhineb bioakumulatsioonitegur uuritaval lähtekemikaalil ja metaboliitidel. Eelistatavalt peaks bioakumulatsiooniteguri arvutamine põhinema uuritava lähtekemikaali kontsentratsioonil organismides ja radioaktiivsete jääkide 
kogusisaldusel. Seejärel tuleks arvutada bioakumulatsiooniteguri alusel 
elustiku-mulla akumulatsioonitegur, mis on normeeritud ussi lipiidisisalduse ja mulla orgaanilise süsiniku sisalduse järgi, et erinevate bioakumulatsiooni katsete tulemusi oleks võimalik võrrelda.
 
8. Peaks olema teada uuritava kemikaali mürgisus katses kasutatava liigi jaoks, 
näiteks toimet avaldav kontsentratsioon (ECx) või letaalne kontsentratsioon (LCx) omastamisfaasis (vt näiteks 19). Kasutatava analüüsimeetodi järgi 
tuleks uuritava kemikaali kontsentratsioon valida nii, et see oleks eelistata ­
valt ligikaudu 1 % kemikaali ägedast asümptootilisest LC
 50 väärtusest ja 
vähemalt kümme korda suurem kui kemikaali tuvastamispiir mullas. Andmete olemasolu korral tuleks eelistada subletaalsete näitajate pikaajaliste 
uuringutega saadud mürgisusnäitajaid (51, 52). Kui selliseid andmeid ei ole, 
annab kasulikku teavet ägeda mürgisuse katse (vt näiteks 23).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Kättesaadav peaks olema asjakohane teadaoleva täpsuse ja tundlikkusega 
analüüsimeetod kemikaali kvantitatiivse sisalduse mõõtmiseks katselahustes, 
mullas ja bioloogilises materjalis, samuti andmed proovi valmistamise ja säilitamise kohta ning materjali ohutuskaardid. Samuti peaksid teada olema uuritava aine analüütilised tuvastuspiirid mullas ja usside kudedes. 
Kui kasutatakse
 14 C-märgisega uuritavat kemikaali, peaks olema teada erira ­
dioaktiivsus (s.o Bq mol  –1 ) ja lisanditega seotud radioaktiivsuse protsent. 
Uuritava kemikaali eriradioaktiivsus peaks olema piisavalt suur, et võimal ­
dada analüüsi, ja katses kasutatavad kontsentratsioonid ei tohiks olla 
mürgised.  
10. Katset on võimalik teha tehismullaga või loodusliku mullaga. Enne katse 
algust tuleks teada kasutatava loodusliku mulla omadusi, näiteks mulla või 
selle koostisosade päritolu, pH-d, orgaanilise süsiniku sisaldust, osakeste 
suurusjaotust (liiva, tolmu ja savi protsent) ning veemahutavust (3, 48).  
KATSE PÕHIMÕTE  
11. Uuritava kemikaali bioakumulatsiooni iseloomustavate parameetrite hulka 
kuuluvad bioakumulatsioonitegur, omastamise kiiruskonstant (k  s ) ja kõrval ­
damise kiiruskonstant (k  e ). Mõisted on esitatud 1. liites.  
12. Katse koosneb kahest faasist: omastamise (kokkupuute) faas ja kõrvaldamise 
(kokkupuutejärgne) faas. Omastamisfaasi ajal puutuvad paralleelproovide usside rühmad kokku mullaga, mida on rikastatud uuritava kemikaaliga. 
Lisaks katseloomadele hoitakse identsetes tingimustes, aga ilma uuritava 
kemikaalita, usside kontrollrühmi. Mõõdetakse katseorganismide kuivkaalu ja lipiidisisaldust. Seda võib teha kontrollrühma ussidega. Kontrollrühma usside ja mullaproovide analüüsimise teel on võimalik leida analüütilised 
taustanäitajad (kontrollnäitajad). Kõrvaldamisfaasi ajaks kantakse ussid üle 
uuritava kemikaalita mulda. Kõrvaldamisfaas on alati vajalik, v.a juhul, kui kokkupuutefaasi ajal uuritavat kemikaali oluliselt ei omastatud. Kõrvalda ­
misfaas annab teavet kiiruse kohta, millega uuritavat kemikaali katseorga ­
nismidest väljutatakse (vt näiteks 27). Kui omastamisfaasi ajal statsionaarse 
olekuni ei jõuta, peaks kineetiliste parameetrite (kineetiline bioakumulatsioo ­
nitegur, omastamise ja kõrvaldamise kiiruskonstant/-konstandid) määramine põhinema eelistatavalt omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi tulemuste 
samaaegsel sobitamisel kineetilise mudeliga. Uuritava kemikaali kontsentrat ­
siooni ussides/ussidel jälgitakse katse kõigi faaside vältel.
 
13. Omastamisfaasi ajal tehakse mõõtmisi proovivõtu aegadel kuni 14 päeva 
(valgeliimuklased) või 21 päeva (vihmaussid), kuni on jõutud statsionaarse 
olekuni (11, 12, 67). Statsionaarne olek on saavutatud, kui ussides oleva kontsentratsiooni ajast sõltuvuse graafik jääb ajateljega paralleelseks ja vähe ­
malt kahepäevase vahemikuga võetud kolme järjestikuse proovi kontsentrat ­
sioonianalüüsi tulemused ei erine üksteisest statistiliste võrdluste (näiteks 
variatsioonanalüüs, regressioonanalüüs) alusel rohkem kui ±20 %.
 
14. Kõrvaldamisfaas hõlmab katseorganismide ülekandmist nõudesse, mis sisal ­
davad sama substraati ilma uuritava kemikaalita. Kõrvaldamisfaasi ajal 
tehakse mõõtmisi proovivõtu aegadel 14 päeva vältel (valgeliimuklased) või 21 päeva vältel (vihmaussid), v.a juhul, kui varasemad analüütilised määramised näitasid uuritava kemikaali jääkide 90 % vähenemist ussides. 
Uuritava kemikaali kontsentratsioon ussides kõrvaldamisfaasi lõpus teata ­
takse kõrvaldamata jääkidena. Statsionaarse oleku bioakumulatsioonitegur
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
arvutatakse eelistatavalt ussides oleva kontsentratsiooni (Ca) ja mullas oleva 
kontsentratsiooni (Cs) suhtena näilise statsionaarse oleku korral ja ka kinee ­
tilise bioakumulatsioonitegurina, mis on mullast omastamise kiiruskonstandi (k
 s ) ja kõrvaldamise kiiruskonstandi (k  e ) (vt mõisted, 1. liide) suhe; 
seejuures eeldatakse esimest järku reaktsiooni kineetikat (vt arvutused, 2. 
liide). Kui esimest järku reaktsiooni kineetika ei ole ilmselgelt kohaldatav, 
tuleks kasutada muid mudeleid.  
15. Omastamise kiiruskonstant, kõrvaldamise kiiruskonstant (või muude mude ­
litega seotud konstandid), kineetiline bioakumulatsioonitegur ja võimaluse 
korral iga nimetatud parameetri usalduspiirid arvutatakse teoreetilise mudeli 
võrranditest (vt juhised, 2. liide). Mudeli sobivust katseandmetega saab hinnata näiteks korrelatsioonikordaja või determinatsioonikordaja järgi (kui kordaja läheneb 1-le, kirjeldab mudel katseandmeid hästi) või hii-ruut- 
testiga. Mudeli sobivust võib samuti näidata määratava parameetri standard ­
hälbe või usaldusvahemiku suurus.
 
16. Väga lipofiilse uuritava kemikaali katsetulemuste varieeruvuse vähendami ­
seks tuleks bioakumulatsioonitegureid väljendada lipiidisisalduse ja orgaani ­
lise süsiniku sisalduse suhte alusel (kg mulla orgaanilist süsinikku ussi lipiidisisalduse kg kohta). See lähenemisviis põhineb asjaolul, et mõne kemikaaliklassi puhul on bioakumulatsiooni tõenäosus selgelt seotud lipo ­
fiilsusega; kalade puhul on see täpselt kindlaks tehtud (47). Kõnealuste 
kemikaalide bioakumulatsioon sõltub kalade lipiidisisaldusest. Põhjaloomade puhul on leitud samalaadseid korrelatsioone, vt näiteks 30, 44. See korrelat ­
sioon on samuti tõendatud mulla väheharjasusside puhul, vt näiteks 5, 6, 7, 
14. Kui usside biomassi on piisavalt, saab katseloomade lipiidisisalduse 
määrata samast bioloogilisest materjalist, millest määrati uuritava kemikaali kontsentratsiooni. Alternatiivselt võib lipiidisisalduse mõõtmiseks kasutada kontrollrühma loomi.
 
KATSE KEHTIVUS  
17. Katse kehtivuse tagamiseks peavad nii kontrollrühmade kui ka katserühmade 
puhul olema täidetud järgmised kriteeriumid:  
— katse lõpus ei tohiks kogusuremus omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi 
ajal ületada 10 % (vihmaussid) või 20 % (valgeliimuklased) kasutatud 
usside koguarvust;  
— Eisenia fetida  ja Eisenia andrei  puhul ei tohiks omastamisfaasi ja 
kõrvaldamisfaasi lõpus mõõdetud keskmine massi kadu ületada 20 % võrrelduna algse toorkaaluga kummagi faasi alguses.
 
MEETODI KIRJELDUS  
Katses kasutatavad liigid  
18. Bioakumulatsiooni katsetamisel soovitatakse kasutada mitut mulla vähehar ­
jasusside liiki. Enim kasutatavaid liike  Eisenia fetida  või Eisenia andrei 
(Lumbricidae)  või Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus  või Enchy­
traeus luxuriosus (Enchytraeidae)  on kirjeldatud 5. liites.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Seadmed  
19. Tuleks olla tähelepanelik, et vältida seadmete kõigis osades selliste materja ­
lide kasutamist, mis võivad lahustuda, uuritavat kemikaali adsorbeerida või muid kemikaale eraldada ja avaldada katseloomadele kahjulikku mõju. 
Kooskõlas koormuse määraga, s.o katseusside arvuga, võib kasutada tava ­
päraseid ristkülikukujulisi või silindrilisi nõusid, mis on valmistatud keemi ­
liselt inertsest materjalist ja on sobiva mahuga. Katse kasvukeskkonnaga kokku puutuvates seadmetes võib kasutada roostevaba terast, plastikut või 
klaasi. Katsenõud peaksid olema korralikult kaetud, et vältida usside põge ­
nemist, võimaldades samas piisavat õhuvarustust. Suure adsorptsioonikoefit ­
siendiga kemikaalide korral (näiteks sünteetilised püretroidid) võib olla vaja 
kasutada silaanitud klaasi. Sellistel juhtudel tuleb seadmed pärast kasutamist 
ära visata (49). Tuleks takistada radiomärgistatud uuritavate ainete ja lendu ­
vate kemikaalide väljapääsemist. Katsenõudest auruvate jääkide väljapääse ­
mise vältimiseks tuleks kasutada separaatoreid (näiteks klaaspudelid gaasi 
pesemiseks), mis sisaldavad sobivaid absorbente.
 
Muld  
20. Katsemuld peaks olema sellise kvaliteediga, mis võimaldab katseorganis ­
midel selles elada ja eelistatavalt paljuneda aklimatiseerumise ja katse ajava ­
hemike vältel, ilma et neil tekiks ebatavalisi muutusi välimuses või ebata ­
valist käitumist. Ussid peaksid saama mulda kaevuda.  
21. Katsetes soovitatakse substraadina kasutada käesoleva lisa peatükis C.8 (48) 
kirjeldatud tehismulda. Bioakumulatsiooni katsetes kasutatava tehismulla valmistamine ja soovitused tehismulla säilitamiseks on esitatud 4. liites. Õhu käes kuivatatud tehismulda võib kuni kasutamiseni säilitada toatempe ­
ratuuril.
 
22. Katsemullana ja/või kultuuri kasvumullana võib siiski kasutada looduslikku 
mulda saastumata kohtadest. Loodusliku mulla kirjeldamisel tuleks esitada 
vähemalt järgmised andmed: päritolu (võtmise koht), pH, orgaanilise süsi ­
niku sisaldus, osakeste suurusjaotus (liiva, aleuriidi ja savi protsent), maksi ­
maalne veemahutavus ja veesisalduse protsent (3). Kasulikku teavet peaks andma mulla või selle koostisosade mikrosaasteainete analüüsi tegemine 
enne kasutamist. Kui kasutatakse põllumulda, siis ei tohiks seda olla 
töödeldud taimekaitsevahenditega ega väetatud töödeldud loomade sõnnikuga vähemalt üks aasta ning orgaanilise väetisega vähemalt kuus kuud enne proovivõttu (50). Loodusliku mulla käsitlemise meetodeid enne 
väheharjasussidega tehtavates ökotoksikoloogilistes laborikatsetes kasutamist 
on kirjeldatud väljaandes 3. Loodusliku mulla puhul tuleks laboris säilita ­
mise aeg hoida võimalikult lühikesena.
 
Uuritava kemikaali kasutamine  
23. Uuritav kemikaal viiakse mulla sisse. Seejuures tuleks arvesse võtta kemi ­
kaali füüsikalis-keemilisi omadusi. Vees lahustuv uuritav kemikaal tuleks 
enne mullaga segamist vees täielikult lahustada. Halvasti vees lahustuva 
uuritava kemikaali puhul soovitatakse üks või mitu (tehisliku) mulla koosti ­
sosa katta uuritava kemikaaliga. Näiteks kvartsliiva või osa sellest võib immutada sobivas orgaanilises lahustis lahustatud uuritava kemikaaliga; 
seejärel aurustatakse lahusti aeglaselt kuni kuivamiseni. Kemikaaliga kaetud 
mullakomponendi saab seejärel segada niiske mulla sisse. Selle meetodi
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
peamine eelis on see, et lahustit mulda ei lisata. Kui kasutatakse looduslikku 
mulda, võib uuritavat kemikaali lisada mulla õhu käes kuivatatud osa rikas ­
tamise teel, nagu on kirjeldatud eespool tehisliku mulla puhul, või uuritava kemikaali ja niiske mulla segamisega, kasutades seejärel aurustamise etappi (kui kasutatakse lahustit). Üldiselt tuleks võimaluste piires vältida niiske 
mulla kokkupuudet lahustitega. Arvestada tuleks järgmist (3):
 
— kui vee asemel kasutatakse muud lahustit, peaks see olema veega 
segunev ja/või seda peaks olema võimalik kõrvaldada (näiteks aurus ­
tada), nii et mulda jääb ainult uuritav kemikaal;  
— kui kasutatakse lahusti kontrollrühma, ei ole negatiivne kontrollrühm 
vajalik. Lahusti kontrollkatses tuleks kasutada mullale lisatud lahusti suurimat kontsentratsiooni ja lahusti peaks olema samast partiist, mida kasutati põhilahuse valmistamisel. Sobiva lahusti valimisel peaksid 
peamised kriteeriumid olema lahusti mürgisus ja lenduvus ning uuritava 
kemikaali lahustuvus valitud lahustis.
 
24. Vees ja orgaanilistes lahustites halvasti lahustuva kemikaali korral võib 
soovitud katsekontsentratsiooni saamiseks segada uuritava kemikaali kogu ­
sega 2,0–2,5 g (näiteks uhmri ja nuia abil) peeneks jahvatatud kvartsliiva katsenõu kohta. See kvartsliiva ja uuritava kemikaali segu lisatakse eelnevalt 
niisutatud mullale ning segatakse sellega põhjalikult läbi ja lisatakse vajalik 
kogus deioniseeritud vett, et saada sobiv niiskusesisaldus. Lõplik segu jaota ­
takse katsenõudesse. Protseduuri korratakse iga katsekontsentratsiooni puhul ja samuti valmistatakse ette sobiv kontrollkatsenõu, kus on 2,0–2,5 g 
peeneks jahvatatud kvartsliiva katsenõu kohta.
 
25. Pärast rikastamist tuleks määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon mullas. 
Enne katseorganismide lisamist tuleks kontrollida, et uuritav kemikaal oleks 
mullas jaotunud ühtlaselt. Katseprotokollis kirjeldatakse rikastamiseks kasu ­
tatud meetodit ja esitatakse konkreetse rikastamismeetodi valimise põhjused (24).
 
26. Ideaaljuhul tuleks enne organismide lisamist kindlaks teha, et mulla- ja 
pooriveefaasi vahel on tekkinud tasakaaluolek; soovituslik on neljapäevane 
ajavahemik 20 °C juures. Vees halvasti lahustuva orgaanilise kemikaali 
puhul võib adsorbeerunud ja lahustunud fraktsiooni tegeliku tasakaaluole ­
kuni jõudmiseks kuluda päevi või kuid. Olenevalt uuringu eesmärgist, näiteks keskkonnatingimuste imiteerimisel, võib rikastatud mulda vanandada 
kauem, näiteks metallide puhul kolm nädalat temperatuuril 20 °C (22).
 
Katseorganismide kultuurid  
27. Usse tuleks eelistatavalt pidada alalises laborikultuuris. Suunised  Eisenia 
fetida  ja Eisenia andrei  ning  Enchytraeidae  sugukonna liikide laborikultuuri 
meetodite kohta on esitatud 5. liites (vt ka 48, 51, 52).  
28. Katsetes kasutatavatel ussidel ei tohiks olla nähtavaid haigusi, hälbeid ega 
parasiite.  
KATSE KÄIK  
29. Katseorganismid puutuvad uuritava kemikaaliga kokku omastamisfaasi ajal. 
Omastamisfaasi kestus peaks olema 14 päeva (valgeliimuklased) või 21 
päeva (vihmaussid), v.a juhul, kui tõendatakse statsionaarse olekuni jõud ­
mist. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Kõrvaldamisfaasi ajaks kantakse ussid üle uuritava kemikaalita mulda. 
Esimene proov tuleks võtta 4–24 tunni möödumisel kõrvaldamisfaasi 
algusest. 21-päevase omastamisfaasi ja 21-päevase kõrvaldamisfaasi proovi ­
võtu ajakavade näidised on esitatud 3. liites.  
Katseorganismid  
31. Mitme mulla valgeliimuklase liigi isendi kaal on väga väike (näiteks märg ­
kaal 5–10 mg isendi kohta  Enchytraeus albidus’ e puhul ja veel väiksem  
Enchytraeus crypticus’ e või  Enchytraeus luxuriosus’ e puhul); kaalu mõõt ­
miseks ja keemiliste analüüside tegemiseks võib olla vaja koondada paral ­
leelproovi katsenõude ussid (s.o ühe koeanalüüsi tulemuse saamiseks kasu ­
tatakse kõiki paralleelproovi nõu usse). Igale paralleelproovile lisatakse 20 
valgeliimuklase isendit ja kasutada tuleks vähemalt kolme paralleelproovi. 
Kui uuritava kemikaali analüütiline tuvastuspiir on kõrge, võib osutuda vajalikuks kasutada rohkem usse. Suurema isendi massiga katseliikide (Eisenia fetida  ja Eisenia andrei ) korral võib kasutada ühte isendit sisalda ­
vaid paralleelproovide nõusid.
 
32. Katses kasutatavad vihmaussid peaksid olema sarnase massiga (näiteks  
Eisenia fetida  ja Eisenia andrei  isendi mass peaks olema 250–600 mg). 
Valgeliimuklaste (näiteks  Enchytraeus albidus’ e) pikkus peaks olema ligi ­
kaudu 1 cm. Kõik konkreetses katses kasutatavad ussid peaksid olema sama päritoluga ja tegemist peaks olema  clitellum’ iga täiskasvanud isenditega (vt 
5. liide). Kuna looma mass ja vanus võivad bioakumulatsioonitegurit mõju ­
tada (näiteks erineva lipiidisisalduse ja/või munade olemasolu tõttu), tuleks 
need parameetrid täpselt registreerida ja neid tuleks tulemuste tõlgendamisel arvesse võtta. Lisaks sellele võivad kokkupuutefaasi vältel lisanduda 
kookonid, mis mõjutavad samuti bioakumulatsioonitegurit. Keskmiste 
märg- ja kuivmasside hindamiseks soovitatakse enne katset kaaluda katseus ­
side alamproovi.
 
33. Tuleks kasutada suurt mulla ja usside suhtarvu, et uuritava kemikaali kont ­
sentratsiooni vähenemine mullas omastamisfaasi ajal oleks minimaalne.  
Eisenia fetida  ja Eisenia andrei  korral on soovituslik vähemalt 50 g mulla 
kuivmassi ussi kohta ja valgeliimuklaste puhul vähemalt 10–20 g mulla kuivmassi katsenõu kohta. Nõud peaksid sisaldama 2–3 cm (valgeliimu ­
klased) või 4–5 cm (vihmaussid) mullakihti.
 
34. Katses kasutatud ussid kõrvaldatakse kultuurist (näiteks valgeliimuklased 
juveliiripintsettide abil). Täiskasvanud isendid kantakse üle töötlemata katse ­
mulda aklimatiseerumiseks ja neid söödetakse (vt punkt 36). Kui katsetin ­
gimused erinevad kultuuri tingimustest, peaks ussidele katsetingimustega kohanemiseks piisama 24–72-tunnisest aklimatiseerumisfaasist. Pärast akli ­
matiseerumist loputatakse vihmausse, tõstes nad puhta veega klaasnõusse 
(näiteks Petri tassile), ja seejärel kaalutakse vihmaussid enne katsemulda 
panemist. Enne kaalumist tuleks liigne vesi ussi küljest kõrvaldada, puudu ­
tades ussiga õrnalt tassi serva või kuivatades ettevaatlikult veidi niisutatud 
paberrätikuga.
 
35. Tuleks jälgida katseorganismide kaevumiskäitumist ja see tuleks registree ­
rida. Vihmaussidega tehtavates katsetes kaevuvad loomad (kontrollrühmas ja töötlusrühmas) tavaliselt paari tunniga mulla sisse; seda tuleks kontrollida 
usside katsenõudesse panemisest hiljemalt 24 tunni möödumisel. Kui 
vihmaussid mulda ei kaevu (näiteks omastamisfaasist rohkem kui poole
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
möödumisel rohkem kui 10 %), siis see näitab, et kas ei ole katsetingimused 
sobivad või ei ole katseorganismid terved. Sellisel juhul tuleks katse peatada 
ja seda tuleks korrata. Valgeliimuklased elavad peamiselt mullaosakesteva ­
helistes poorides ja nende välispind võib ümbritseva substraadiga sageli ainult osaliselt kokku puutuda; kaevunud ja mittekaevunud valgeliimuklaste 
kokkupuude eeldatakse olevat samaväärne ning eeldatakse, et valgeliimu ­
klaste mittekaevumise puhul ei pruugi katse kordamine vajalik olla.
 
Söötmine  
36. Vähese orgaanilise süsiniku kogusisaldusega mulla kasutamise korral tuleks 
ette näha söötmine. Tehismulla kasutamise korral soovitatakse vihmaussi ­
dele iga nädal (s.o usse tuleks sööta kord nädalas) sööta 7 mg kuivatatud sõnnikut mulla kuivmassi g kohta ja valgeliimuklaste puhul iga nädal 2–2,5 
mg jahvatatud kaerahelbeid mulla kuivmassi g kohta (11). Esimene sööda ­
kogus tuleks segada mullaga vahetult enne katseorganismide lisamist. Eelis ­
tatavalt tuleks kasutada sama tüüpi sööta, mida kasutatakse kultuuris (vt 5. liide).
 
Valgus ja temperatuur  
37. Katse tuleks teha kontrollitud valgustustsükliga 16 tundi valgust / 8 tundi 
pimedust, valgustatus katsenõu piirkonnas eelistatavalt 400–800 luksi (3). 
Katsetemperatuur peaks olema kogu katse vältel 20 ± 2 °C.  
Katsekontsentratsioonid  
38. Kasutatakse ühte kontsentratsiooni. Täiendava(te) kontsentratsiooni(de) 
kasutamise vajadust tuleks põhjendada. Kui uuritava kemikaali mürgisus 
(ECx) on ligilähedane analüütilise tuvastuspiiriga, siis on soovitatav kasu ­
tada suure eriradioaktiivsusega radiomärgistatud uuritavat kemikaali. Metal ­
lide puhul peaks kontsentratsioon ületama koe ja mulla tausttaset.  
Paralleelproovid  
39. Kineetiliste mõõtmiste puhul (omastamisfaas ja kõrvaldamisfaas) peaks 
kemikaaliga töödeldud paralleelproovide arv olema vähemalt kolm iga proo ­
vivõtupunkti kohta. Ettevalmistatud paralleelproovide koguarv peaks olema 
piisav, et hõlmata kõik proovivõtuajad omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi ajal.
 
40. Kui lahustina kasutatakse ainult vett, tuleks bioloogiliste vaatluste ja mõõt ­
miste jaoks (näiteks kuiv- ja märgmassi suhe, lipiidisisaldus) ning usside ja 
mulla taustkontsentratsioonide analüüsiks ette näha vähemalt 12 negatiivse 
kontrollrühma paralleelproovinõu (millest neljast võetakse proov alguses, neljast omastamise lõpus ja neljast kõrvaldamise lõpus). Kui uuritava kemi ­
kaali lisamiseks kasutatakse lahustavat ainet, tuleks lisaks kemikaaliga 
töödeldud paralleelproovidele kasutada ka lahusti kontrollrühma (neljast 
paralleelproovi nõust tuleks võtta proov alguses, neljast omastamisfaasi lõpus ja neljast kõrvaldamisfaasi lõpus), mis hõlmab kõiki koostisosi peale uuritava aine. Sel juhul võib samuti ette näha negatiivse kontrollrühma neli 
täiendavat paralleelproovi nõud (ilma lahustita) valikuliseks proovivõtuks 
omastamisfaasi lõpus. Neid paralleelproove võib võrrelda bioloogiliselt lahusti kontrollrühmaga, et saada teavet lahusti võimaliku mõju kohta katseorganismile. Soovitatakse ette näha piisav kogus täiendavaid paralleel ­
proovi varunõusid (näiteks kaheksa) kemikaaliga töötlemise ja kontrollrüh ­
ma(de) jaoks.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Mulla kvaliteedi mõõtmise sagedus  
41. Mulla pH-d, niiskusesisaldust ja temperatuuri (pidevalt) katseruumis tuleks 
mõõta omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi alguses ja lõpus. Kord nädalas tuleks kontrollida mulla niiskusesisaldust, kaaludes katsenõusid ja võrreldes 
tegelikku massi katse alguse esialgse massiga. Veekadu tuleks kompensee ­
rida deioniseeritud vee lisamisega.
 
Usside ja mulla proovide võtmine ja analüüsimine  
42. Vihmausside ja valgeliimuklaste bioakumulatsiooni katsete omastamisfaasi 
ja kõrvaldamisfaasi ajakava näidis on esitatud 3. liites.  
43. Katsenõudest võetakse mullaproov, et määrata uuritava kemikaali kontsen ­
tratsioon enne usside lisamist ning omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi ajal. 
Katse ajal määratakse uuritava kemikaali kontsentratsioonid ussides ja 
mullas. Tavaliselt mõõdetakse mulla kogukontsentratsioone. Soovi korral võib mõõta poorivee kontsentratsioone; sel juhul tuleks enne uuringu alus ­
tamist formuleerida põhjendus ja ette näha asjakohased meetodid ning 
esitada need katseprotokollis.
 
44. Ussidest ja mullast võetakse proovid vähemalt kuuel korral omastamisfaasi 
ja kõrvaldamisfaasi vältel. Kui on tõendatud, et uuritav kemikaal on 
stabiilne, võib mullaproovide arvu vähendada. Omastamisfaasi alguses ja 
lõpus soovitatakse analüüsida vähemalt kolme paralleelproovi. Kui omasta ­
misfaasi lõpus mõõdetud kontsentratsioon mullas erineb algsest kontsentrat ­
sioonist rohkem kui 30 %, tuleks analüüsida ka muudel kuupäevadel võetud 
mullaproove.  
45. Kõrvaldage konkreetse paralleelproovi ussid igal proovivõtukorral mullast 
(näiteks pärast paralleelproovi mulla laotamist madalale alusele ja kasutades 
usside tõstmiseks pehmeid juveliiripintsette) ja loputage neid kiiresti veega 
madalas klaasis või terasalusel. Eemaldage liigne vesi (vt punkt 34). Tõstke ussid ettevaatlikult eelnevalt kaalutud nõusse ja kaaluge nad, sh nende 
soolestiku sisu, viivitamata.
 
46. Vihmaussidel ( Eisenia  sp.) tuleks lasta seejärel oma soolestiku sisu öö 
jooksul väljutada, näiteks kaetud Petri tassil olevale niiskele filterpaberile 
(vt punkt 34). Pärast väljutamist tuleks teha kindlaks usside kaal, et hinnata 
katse vältel võimalikku biomassi vähenemist (vt kehtivuse kriteeriumid punktis 17). Valgeliimuklaste kaalumine ja kudede analüüs viiakse ellu ilma väljutamiseta, kuna see on nende usside väiksuse tõttu tehniliselt 
keerukas. Pärast lõplikku massi määramist tuleks ussid viivitamata kõige 
asjakohasema meetodi abil surmata (näiteks vedela lämmastiku abil või külmutamisega temperatuurini alla –18 °C).
 
47. Kõrvaldamisfaasi ajal asendavad ussid saastunud soolestiku sisu puhta 
mullaga. See tähendab, et vahetult enne kõrvaldamisfaasi võetud väljutamata soolestiku sisuga usside (praegusel juhul valgeliimuklased) proovid sisal ­
davad saastunud mulda. Veekeskkonna väheharjasusside puhul eeldatakse, 
et pärast esialgset 4–24-tunnist kõrvaldamisfaasi on enamik saastunud 
soolestiku sisust asendatud puhta settega, vt näiteks 46. Samalaadsetest tulemustest on teatatud vihmausside puhul radiomärgistatud kaadmiumi ja tsingi akumulatsiooni uuringutes (78). Väljutamata soolestiku sisuga valge ­
liimuklaste puhul võidakse käsitada kõnealust kõrvaldamisfaasi esimese 
proovi kontsentratsiooni kui kudede kontsentratsiooni pärast soolestiku tühjendamist. Uuritava aine kontsentratsiooni saastamata mullast tingitud lahjenemise arvessevõtmiseks kõrvaldamisfaasis võib hinnata soolestikusi ­
salduse massi ussi märgmassist / ussi tuha massist või ussi kuivmassi / 
ussi tuha massi suhetest.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Mulla- ja ussiproove tuleks eelistatavalt analüüsida viivitamata pärast 
kõrvaldamist (s.o 1–2 päeva jooksul), et vältida lagunemist või muid 
kadusid, ja katse vältel on soovitatav arvutada ligikaudseid omastamis- ja kõrvaldamismäärasid. Kui analüüs tehakse hiljem, tuleks proove säilitada sobiva meetodi abil, näiteks sügavkülmutamise teel ( ≤ –18 °C).
 
49. Tuleks kontrollida, et keemilise analüüsi täpsus ja reprodutseeritavus ning 
uuritava kemikaali saagis mulla- ja ussiproovidest oleks kõnealuse meetodi jaoks rahuldav; tuleks registreerida ekstraktsiooni tõhusus, tuvastuspiir ja 
määramispiir. Samuti tuleks kontrollida, et kontrollnõudes ei oleks uuritava 
kemikaali kontsentratsioon suurem tausttasemest. Kui uuritava kemikaali kontsentratsioon katseorganismis Ca on kontrollrühma ussides > 0, tuleks seda arvestada kineetiliste parameetrite arvutamisel (vt 2. liide). Kõiki 
proove tuleks kogu katse vältel käsitleda nii, et minimeeritaks kaod ja 
saastumine (näiteks proovivõtuseadmele uuritava kemikaali adsorbeerumise tõttu).
 
50. Radiomärgistatud uuritava kemikaaliga töötamisel on võimalik analüüsida 
lähteainet ja metaboliite. Uuritava lähtekemikaali ja metaboliitide kvantita ­
tiivne määramine statsionaarses olekus või omastamisfaasi lõpus annab olulist teavet. Proove tuleks seejärel „puhastada”, et oleks võimalik määrata 
eraldi uuritava lähtekemikaali kogust. Kui mõne metaboliidi radioaktiivsus 
moodustab üle 10 % analüüsitud proovi(de) koguradioaktiivsusest, on soovi ­
tatav kõnealused metaboliidid tuvastada.
 
51. Uuritava kemikaali üldsaagis ning ussidest, mullast ja aurunud uuritava 
kemikaali püüdmiseks kasutatavatest absorbente sisaldavatest püüduritest (kui neid kasutatakse) määratud saagised tuleks registreerida ja esitada katse ­
protokollis.
 
52. Konkreetsest katsenõust võetud isendite proovide koondamine on lubatav 
vihmaussist väiksemate valgeliimuklaste puhul. Kui koondamine tähendab 
paralleelproovide arvu vähenemist, piirab see statistilisi meetodeid, millega 
on võimalik andmeid töödelda. Kui on vaja kasutada teatavat statistilist meetodit ja tagada andmete täpsus, tuleks proovide koondamist arvestades kasutada katses piisavat arvu paralleelproovidega katsenõusid selle tagami ­
seks.
 
53. On soovitatav, et bioakumulatsioonitegur oleks väljendatud nii summaarse 
kuivmassi funktsioonina kui ka vajaduse korral (näiteks väga hüdrofoobse 
kemikaali puhul) lipiidisisalduse funktsioonina. Lipiidisisalduse määrami ­
seks tuleks kasutada asjakohaseid meetodeid (selleks tuleks kasutada mõnd olemasolevat meetodit, vt näiteks 31, 58). Nende meetodite puhul kasutatakse ekstraheerimist kloroformi/metanooliga. Klooritud lahustite 
kasutamise vältimiseks tuleks siiski kasutada Blighi ja Dyeri meetodi (9) 
muudetud versiooni (17). Kuna eri meetodid ei pruugi anda sama tulemust, on tähtis kirjeldada kasutatud meetodit. Kui see on võimalik, s.o kui usside kude on piisavalt, tuleks lipiidide analüüs teha ideaaljuhul sama proovi või 
ekstraktiga, mida kasutati uuritava kemikaali analüüsiks, kuna lipiidid tuleb 
ekstraktist sageli kõrvaldada, enne kui ekstrakti on võimalik kromatograafi ­
liselt analüüsida (49). Alternatiivselt võib lipiidisisalduse mõõtmiseks kasu ­
tada kontrollrühma loomi; lipiidisisaldust on vaja teada bioakumulatsiooni ­
teguri näitajate normeerimiseks. Viimasel juhul väheneb seadmete saastu ­
mine uuritava kemikaaliga.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE  
Tulemuste töötlemine  
54. Uuritava kemikaali omastamise kõvera saamiseks kantakse aritmeetilises 
skaalas graafikule kemikaali kontsentratsioon ussides/ussidel omastamis ­
faasis sõltuvana ajast. Kui kõver on jõudnud platoole või statsionaarsesse olekusse (vt mõisted, 1. liide), arvutatakse statsionaarse oleku bioakumulat ­
sioonitegur järgmise võrrandi alusel:
 
C a stats : olekus võiomastamisfaasi lõpus  ðkeskmineÞ 
C s stats : olekus või omastamisfaasi lõpus  ðkeskmineÞ 
C a on uuritava kemikaali kontsentratsioon katseorganismis;  
C s on uuritava kemikaali kontsentratsioon mullas.  
55. Kui statsionaarse olekuni ei jõuta, tuleks statsionaarse oleku bioakumulat ­
siooniteguri asemel määrata kiiruskonstantidel põhinev kineetiline bioaku ­
mulatsioonitegur, nagu on kirjeldatud allpool:  
— määratakse akumulatsioonitegur (BAF  K ) suhtena k  s /k e ; 
— omastamise ja kõrvaldamise kiirused arvutatakse eelistatavalt ühel ajal 
(vt 2. liide, võrrand 11);  
— kõrvaldamise kiiruskonstant (k  e ) määratakse tavaliselt kõrvaldamise 
kõvera alusel (s.o kõrvaldamisfaasis ussides leiduva uuritava aine kont ­
sentratsiooni graafikust). Omastamise kiiruskonstant k  s arvutatakse 
seejärel k  e ja C  a väärtuse alusel, mis tuletatakse omastamise kõverast 
– nende meetodite kirjeldus on esitatud 2. liites. Kineetilise bioakumu ­
latsiooniteguri ja kiiruskonstantide k  s ja k  e saamiseks eelistatud meetod 
on kasutada arvutis mittelineaarseid parameetri hindamise meetodeid. 
Kui kõrvaldamine ei ole ilmselgelt esimest järku, tuleks kasutada keeru ­
kamaid mudeleid.  
Katseprotokoll  
56. Katseprotokollis esitatakse alljärgnev teave.  
Uuritav kemikaal:  
— kogu kättesaadav teave, milles käsitletakse uuritava kemikaali ägedat ja 
pikaajalist mürgisust (näiteks EC  x , LC  x , täheldatava toimeta kontsentrat ­
sioon) mullas elavatele väheharjasussidele;  
— puhtus, füüsikaline olek ja füüsikalis-keemilised omadused, näiteks log 
K ow , lahustuvus vees;  
— kemikaali tunnusandmed; uuritava aine päritolu, kasutatud lahusti 
nimetus ja kontsentratsioon;  
— kui kasutatakse radiomärgistatud uuritavat kemikaali, siis märgistatud 
aatomite täpne asukoht, eriradioaktiivsus ja radiokeemiline puhtus.  
Katseliik:  
— teaduslik nimetus, liin, päritolu, kõik eeltöötlused, aklimatiseerumine, 
vanus, suuruse vahemik jms.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Katsetingimused:  
— kasutatud katsemeetod;  
— kasutatud valgustuse tüüp ja omadused ning valgustuse kestus(ed);  
— katse kava (näiteks katsenõude arv ja suurus, mulla mass ja mullakihi 
paksus, paralleelproovide arv, usside arv paralleelproovi kohta, katse ­
kontsentratsioonide arv, omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi kestus, proo ­
vivõtu sagedus);  
— katsenõu materjali valiku põhjendus;  
— uuritava aine valmistamise ja kasutamise meetod ning samuti konkreetse 
meetodi valimise põhjused;  
— nominaalsed katsekontsentratsioonid, mõõdetud väärtuste keskmised ja 
nende standardhälbed katsenõudes ning hälvete arvutamise meetod;  
— tehismulla koostisosade päritolu või looduslike kasvukeskkondade kasu ­
tamisel mulla päritolu, eeltöötlemise kirjeldus, kontrollrühmade tule ­
mused (elulemus, biomassi teke, paljunemine), mulla omadused (pH, orgaanilise süsiniku kogusisaldus, osakeste suurusjaotus (liiva, aleuriidi 
ja savi protsent), maksimaalne veemahutavus, veesisalduse protsent katse 
alguses ja lõpus ning kõik muud tehtud mõõtmised);
 
— üksikasjalik teave mulla- ja ussiproovide töötlemise kohta, sh andmed 
uuritava aine valmistamise, säilitamise, rikastamismeetodite, ussidest ja mullast ekstraheerimise ja analüüsimise meetodite (ning täpsuse) kohta ning lipiidisisalduse kohta (kui mõõdeti) ja uuritava aine analüüsisaagiste 
kohta.
 
Tulemused:  
— kontrollrühma usside ja iga katsenõu usside suremus ning mis tahes 
täheldatud ebatavaline käitumine (näiteks mulla vältimine, mittepaljune ­
mine valgeliimuklastega tehtavates bioakumulatsiooni katsetes);  
— mulla ja katseorganismide kuivmassi ja märgmassi suhe (mis on vajalik 
normeerimise jaoks);  
— usside märgmassid igal proovivõtuajal; vihmausside puhul märgmassid 
katse alguses ja igal proovivõtukorral enne ja pärast soolestiku tühjen ­
damist;  
— katseorganismide lipiidisisaldus (kui määrati);  
— kõverad, mis näitavad uuritava kemikaali omastamise ja kõrvaldamise 
kineetikat ussides ja statsionaarse olekuni jõudmiseks vajalikku aega;  
— C  a ja C  s (standardhälbe ja vahemikuga, kui see on asjakohane) kõigi 
proovivõtuaegade kohta (C  a väljendatud g-des kogu keha märg- ja kuiv ­
massi kg  –1 kohta, C  s väljendatud g-des mulla märg- ja kuivmassi kg  –1 
kohta). Kui on vaja leida elustiku-mulla akumulatsioonitegur (näiteks eri 
lipiidisisaldusega loomadega tehtud katsete tulemuste võrdlemiseks), 
võib C  a olla väljendatud ka g-des organismi lipiidisisalduse kg  –1 kohta 
ja C  s võib olla väljendatud g-des mulla orgaanilise süsiniku kg  –1 kohta;  
— samuti võib esitada järgmised näitajad: bioakumulatsioonitegur (väljen ­
datuna mulla kg alusel ussi kg  –1 kohta), mullast omastamise kiiruskons ­
tant k  s (väljendatuna mulla g alusel usside kg  –1 ja päeva  –1 kohta) ning 
kõrvaldamise kiiruskonstant k  e (väljendatuna päeva  –1 kohta); 
elustiku-mulla akumulatsioonitegur (väljendatuna mulla kg-des orgaani ­
lise süsiniku kg  –1 kohta ja ussi lipiidisisalduse alusel);  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— kui neid mõõdetakse, siis lähtekemikaali protsendid, metaboliidid ja 
seotud jäägid (s.o uuritava kemikaali protsent, mida ei saa tavapäraste 
ekstraheerimismeetodite abil ekstraheerida), mis on tuvastatud mullas ja katseloomades;
 
— andmete statistiliste analüüside jaoks kasutatud meetodid.  
Tulemuste hindamine:  
— tulemuste vastavus kehtivuskriteeriumidele, mis on loetletud punktis 17;  
— ootamatud või ebatavalised tulemused, näiteks uuritava kemikaali mitte ­
täielik kõrvaldamine katseloomadest.  
KIRJANDUS  
1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.  
2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
 
3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Interna ­
tional, E1676-04: 26 pp.  
4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): 
Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin 
Heidelberg: 235–276.
 
5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.  
6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens 
J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms 
(Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 
154–165.  
7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms 
(Eisenia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191.  
8) Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.  
9) Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.  
10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, 
Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.  
11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). 
Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestri ­
schen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency 
(Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.  
12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioac ­
cumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchy­
traeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, 
Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196.  
13) Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13–20.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
14) Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.  
15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2–29.  
16) Didden WAM (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. 
Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science 
Ltd., The Netherlands, pp. 555–576.  
17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. 
Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
 
18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bach ­
mann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following 
field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145.
 
19) Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 1907/2006, 18. detsember 
2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu 
määrus (EMÜ) nr 793/93, komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti 
nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ (ELT L 396, 30.12.2006, lk 1).
 
20) Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.  
21) OECD (2008). Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligoc ­
haetes, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris.  
22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardi ­
sierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). 
Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Allalaaditav aadressil 
http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
 
23) Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI 
Technical Report 325: 57 pp.
 
24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.
 
26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.  
27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501–1514.  
28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6- 
Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbri ­
cidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflan ­
zenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 
78–84.  
30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcen ­
tration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.  
31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for 
lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.
 
32) Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 
701–707.  
33) Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sedi ­
ments 1: 15–20.  
34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxi ­
kologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.  
35) ISO 11268-2 (1998). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
36) Jaenike J (1982). „ Eisenia foetida ” is two biological species. Megadrilogica 
4: 6–8.  
37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090.
 
38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  
(Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.  
39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong 
A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of poly ­
cyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligochaeta) 
in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 
22: 767–775.  
40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.  
41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Compa ­
rison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
 
42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.  
43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, 137 pp.  
44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.  
45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accu ­
mulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26.  
46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
48) Käesoleva lisa peatükk C.8 „Toksilisus vihmaussidele”.  
49) Käesoleva lisa peatükk C.13 „Biokontsentratsioon: kaladega läbivoolu ­
katse”.  
50) Käesoleva lisa peatükk C.21 „Mullamikroobid: lämmastiku transformat ­
siooni katse”.  
51) OECD (2004a). Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.  
52) OECD (2004b). Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia 
Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris.  
53) OECD (2008). Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligoc ­
haetes, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
 
54) Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.  
55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 
1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.  
56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
 
57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.  
59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an inter ­
national ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
 
61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
 
62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on 
Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, 
Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127.  
63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
 
64) Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 
413–433.
 
65) Schmelz R and Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93–100.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
66) Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
 
68) Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.  
69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins 
RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxico ­
logy. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac 
Press, Pensacola, 67–81.
 
70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. 
Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171.
 
71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of 
sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, 
MN, March 2000.  
73) Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277–285.  
74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxi ­
city of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earth ­
worms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
75) Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. 
Chemosphere 21: 1023–1033.  
76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.  
77) Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.  
78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated floodplain 
soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
 
79) Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
1. liide  
MÕISTED  
Bioakumulatsioon  – uuritava kemikaali kontsentratsiooni suurenemine orga ­
nismis või organismil, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooniga ümbrit ­
sevas kasvukeskkonnas. Bioakumulatsioon on biokontsentratsiooni ja biomagni ­
fikatsiooni (vt allpool) tulemus.  
Biokontsentratsioon  – uuritava kemikaali kontsentratsiooni suurenemine orga ­
nismis või organismil ainult ümbritsevast kasvukeskkonnast kemikaali omasta ­
mise teel (näiteks keha pinna ja allaneelatud mulla kaudu), võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooniga ümbritsevas kasvukeskkonnas.
 
Biomagnifikatsioon  – uuritava kemikaali kontsentratsiooni suurenemine orga ­
nismis või organismil peamiselt saastunud toidu või saagi kaudu omastamise 
teel, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooniga toidus või saagis. Biomag ­
nifikatsioon võib viia uuritava aine ülekandumise või kogunemiseni toiduvõrgus ­
tikes.  
Uuritava kemikaali  kõrvaldamine  – kemikaali kadumine katseorganismi kude ­
dest aktiivsete või passiivsete protsesside tõttu, mis tekivad, sõltumata uuritava 
aine olemasolust või selle puudumisest ümbritsevas kasvukeskkonnas.  
Bioakumulatsioonitegur  (BAF) – uuritava kemikaali kontsentratsioon katseor ­
ganismis/katseorganismil (C  a , g-des ussi kuivmassi kg kohta) kõnealuse bioaku ­
mulatsiooni katse omastamisfaasis igal ajamomendil jagatuna kemikaali kontsen ­
tratsiooniga ümbritsevas kasvukeskkonnas (C  s , g-des mulla kuivmassi kg kohta); 
bioakumulatsiooniteguri ühikud on mulla kg ussi kg kohta.  
Statsionaarse oleku bioakumulatsioonitegur  (BAF  ss ) – bioakumulatsioonitegur 
statsionaarse oleku puhul, see ei muutu oluliselt pika ajavahemiku jooksul; uuri ­
tava kemikaali kontsentratsioon ümbritsevas kasvukeskkonnas (C  s , g-des mulla 
kuivmassi kg kohta) jääb selle ajavahemiku vältel püsivaks.  
Bioakumulatsioonitegurid , mis arvutatakse otse mullast omastamise kiiruskons ­
tandist ja kõrvaldamise kiiruskonstandist (k  s ja k  e , vt allpool), on  kineetilised  
bioakumulatsioonitegurid (BAF  K ). 
Elustiku-mulla akumulatsioonitegur  (BSAF) – lipiidide suhtes normeeritud 
uuritava kemikaali kontsentratsioon katseorganismis/katseorganismil, jagatuna uuritava kemikaali orgaanilise süsiniku suhtes normeeritud kontsentratsiooniga 
mullas statsionaarses olekus. C
 a on sel juhul väljendatud g-des organismi lipii ­
dide kg kohta ja C  s g-des mulla orgaanilise aine kg kohta; elustiku-mulla akumu ­
latsiooniteguri ühikud on kg orgaanilist süsinikku lipiidi kg kohta.  
Platoo  või statsionaarne olek  – määratletud kui tasakaaluolek omastamise ja 
kõrvaldamise protsesside vahel, mis toimuvad kokkupuutefaasis ühel ja samal ajal. Statsionaarne olek saavutatakse bioakumulatsiooniteguri ajast sõltuvuse 
graafikul, kui kõver muutub ajateljega paralleelseks ja vähemalt kahepäevase 
vahemikuga võetud proovide bioakumulatsiooniteguri kolm järjestikust analüüsi jäävad üksteisest 20 % piiresse ning kolme proovivõtu ajavahemiku vahel ei ole 
statistiliselt olulisi erinevusi. Uuritavate kemikaalide puhul, mida omastatakse 
aeglasemalt, oleksid sobivamad seitsmepäevased ajavahemikud (49).
 
Orgaanilise süsiniku-vee jaotuskoefitsient  (K  oc ) – kemikaali kontsentratsiooni 
suhe mulla orgaanilise süsiniku fraktsioonis/fraktsioonil ja kemikaali kontsentrat ­
sioon vees tasakaaluoleku puhul.  
Oktanooli-vee jaotuskoefitsient  (K  ow ) – kemikaali lahustuvuse suhe 
n-oktanoolis ja vees tasakaaluolekus, mida vahel tähistatakse ka P  ow -ga. K  ow 
logaritmi (log K  ow ) kasutatakse kui kemikaali võimaliku veeorganismidesse 
kogunemise (bioakumulatsiooni) üht näitajat.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Omastamis- või kokkupuutefaas  – aeg, mille vältel katseorganismid puutuvad 
kokku uuritava kemikaaliga.  
Mullast omastamise kiiruskonstant  (k s ) – numbriline väärtus, millega määra ­
takse uuritava aine kontsentratsiooni suurenemise kiirus katseorganismil/katseor ­
ganismis, mille on põhjustanud omastamine mullafaasist; k  s mõõdetakse mulla 
g-des usside kg ja päeva kohta.  
Kõrvaldamisfaas  – aeg, mis järgneb katseorganismide ülekandmisele uuritava 
ainega rikastatud kasvukeskkonnast uuritava aineta kasvukeskkonda, mille vältel 
uuritakse kemikaali kõrvaldamist katseorganismidest (või netokadu).  
Kõrvaldamise kiiruskonstant  (k  e ) – numbriline väärtus, millega määratakse 
uuritava aine kontsentratsiooni vähenemise kiirus katseorganismil/katseorga ­
nismis pärast katseorganismide ülekandmist uuritavat ainet sisaldavast kasvukesk ­
konnast uuritava aineta kasvukeskkonda; k  e ühik on d  –1 . 
Uuritav kemikaal –  iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi 
abil. ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
2. liide  
Omastamise ja kõrvaldamise parameetrite arvutamine  
Bioakumulatsiooni katse peamine näitaja on bioakumulatsioonitegur, BAF. Bioa ­
kumulatsioonitegurit on võimalik mõõtmistulemustest arvutada, kui statsionaarse oleku kontsentratsioon katseorganismis (C
 a ) jagatakse kontsentratsiooniga mullas 
(C s ). Kui omastamisfaasi ajal statsionaarse olekuni ei jõuta, siis arvutatakse 
kiiruskonstantidest statsionaarse oleku bioakumulatsiooniteguri asemel kineetiline 
bioakumulatsioonitegur. Siiski tuleks ära märkida, kas bioakumulatsioonitegur põhineb statsionaarse oleku kontsentratsioonidel või mitte.
 
Tavapärane meetod kineetilise bioakumulatsiooniteguri (BAF  K ), mullast omasta ­
mise kiiruskonstandi (k  s ) ja kõrvaldamise kiiruskonstandi (k  e ) leidmiseks on 
kasutada arvutitöötluses mittelineaarseid parameetri hindamise meetodeid, näiteks väljaandes 68 kirjeldatud mudelite alusel. Järjestikuste kontsentratsiooni ajast sõltuvuse andmete komplekti ja mudeli võrrandite puhul 
C
 a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [võrrand 1]  
või 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [võrrand 2],  
kus 
C a = kemikaali kontsentratsioon ussides (g märg- või kuivmassi kg  –1 ) 
k s = omastamise kiiruskonstant koes (mulla g ussi kg  –1 d –1 ) 
C s = kemikaali kontsentratsioon mullas (g märg- või kuivmassi kg  –1 ) 
k e = kõrvaldamise kiiruskonstant (d  –1 ) 
t c = aeg omastamisfaasi lõpus,  
saab nende arvutiprogrammidega arvutada BAF  K , k s ja k  e väärtused.  
Kui kontrollkatse (kemikaaliga mitte kokkupuutuvate) usside taustkontsentrat ­
sioon, näiteks päeval 0, erineb märkimisväärselt nullist (see võib nii olla näiteks metallide puhul), tuleks kõnealune taustkontsentratsioon (C
 a,0 ) lisada võrrandi ­
tesse, muutes neid järgmiselt: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [võrrand 3]  
ja 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [võrrand 4]  
Kui täheldatakse uuritava kemikaali kontsentratsiooni märkimisväärset vähene ­
mist mullas omastamisfaasi vältel, võib kasutada järgmisi mudeleid (67, 79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 
0 t Þ [võrrand 5],  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
kus 
C s = kemikaali kontsentratsioon mullas (g märg- või kuivmassi kg  –1 ) 
k 0 = lagunemise kiiruskonstant mullas (d  –1 ) 
C 0 = kemikaali esialgne kontsentratsioon mullas (g märg- või kuivmassi kg  –1 ) 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [võrrand 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [võrrand 7],  
kus 
C a = kemikaali kontsentratsioon ussides (g märg- või kuivmassi kg  –1 ) 
k s = omastamise kiiruskonstant koes (mulla g ussi kg  –1 d –1 ) 
k 0 = lagunemise kiiruskonstant mullas (d  –1 ) 
k e = kõrvaldamise kiiruskonstant (d  –1 ) 
t c = aeg omastamisfaasi lõpus.  
Kui statsionaarse olekuni jõutakse omastamisfaasi vältel (s.o t = ∞), siis võib 
võrrandi 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [võrrand 1]  
taandada kujule:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
või 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [võrrand 8]  
Sel juhul on k  s /k e × C  s lähenemine uuritava aine kontsentratsioonile ussi kudedes 
statsionaarses olekus (C  a,ss ). 
Elustiku-mulla akumulatsioonitegurit (BSAF) saab arvutada järgmiselt: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [võrrand 9],  
kus f  oc on mulla orgaanilise süsiniku fraktsioon ja f  lip on ussi lipiidifraktsioon, 
mis on mõlemad eelistatavalt määratud katse ajal võetud proovidest ja põhinevad vastavalt kas kuivmassil või märgmassil.
 
Kõrvaldamise kineetikat on võimalik modelleerida, kasutades kõrvaldamisfaasi 
andmeid ja kohaldades järgmist mudelvõrrandit ning arvutipõhist mittelineaarset 
parameetri hindamise meetodit. Kui aja järgi graafikule kantud andmepunktid näitavad pidevat eksponentsiaalset uuritava aine kontsentratsiooni vähenemist loomades, siis võib ajast sõltuva kõrvaldamise kirjeldamiseks kasutada ühe- 
kambri-mudelit (võrrand 9). 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [võrrand 10]  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Kõrvaldamisprotsessid näivad vahel olevat kahefaasilised, näidates C  a kiiret 
vähenemist kõrvaldamisfaasi alguses, mis hiljem muutub uuritava aine aeglase ­
maks kaoks kõrvaldamise hilisemates järkudes, vt näiteks 27, 68. Kahte faasi on võimalik tõlgendada eeldusega, et organismis on kaks eraldi kambrit, millest uuritav aine kaob erineva kiirusega. Neil juhtudel tuleks vaadata asjakohaseid 
väljaandeid, näiteks 38, 39, 40, 78.
 
Eespool esitatud mudelvõrrandite abil võib kineetilised parameetrid (k  s ja k  e ) 
arvutada ka korraga, kohaldades esimese järgu kineetika mudelit korraga kõigile omastamisfaasi ja kõrvaldamisfaasi andmetele. Omastamise ja kõrvaldamise kiiruskonstantide sellise kombineeritud arvutamise meetodi kirjeldus on esitatud 
väljaannetes 40, 72 ja 69. 
C
 a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[võrrand 11]  
Märkus.  Kui omastamise ja kõrvaldamise parameetreid hinnatakse korraga 
omastamise ja kõrvaldamise ühendatud andmetest, võimaldab võrrandis 11 kasutatud näitaja m arvutiprogrammil seostada võrrandi alamliik ­
meid vastava faasi andmekomplektidega ja võrrandit õigesti rakendada 
(m = 1 omastamisfaasi korral; m = 2 kõrvaldamisfaasi korral).
 
Sellest hoolimata tuleks mudelvõrrandeid kasutades olla ettevaatlik, eelkõige kui 
katse ajal võib muutuda uuritava kemikaali biosaadavus või esineb kemikaali (bio)lagunemine (vt näiteks 79).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
3. liide  
MULLA BIOAKUMULATSIOONI KATSETE AJAVAKAVADE NÄITED  
Katse vihmaussidega  
a) Omastamisfaas kineetika arvutamiseks kasutatava kaheksa proovivõtu 
kuupäevaga  
Päev Tegevus  
–6 Ettevalmistatud mulla kohandamine 48 tunni vältel. 
–4 Mulla fraktsiooni rikastamine uuritava kemikaali lahusega; lahusti 
aurustamine; mulla koostisosade segamine; mulla jaotamine katsenõudesse; katsetingimustel tasakaalustamine nelja päeva 
vältel (kolme nädala vältel metalliga rikastatud mulla korral). 
–3 kuni –1 Katseorganismide eraldamine kultuurist aklimatiseerumiseks; 
mulla koostisosade ettevalmistamine ja niisutamine. 
0 Temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mullaproovide võtmine 
töödeldud nõudest ja lahusti kontrollkatse nõudest uuritava kemi ­
kaali kontsentratsiooni määramiseks; söödaratsiooni lisamine; 
usside kaalumine ja randomiseeritud jaotamine katsenõudesse; usside piisavate allproovide säilitamine analüütiliste taustnäita ­
jate, märg- ja kuivmassi ning lipiidisisalduse määramiseks; 
kõigi katsenõude kaalumine mulla niiskuse kontrollimiseks; 
õhuvarustuse kontrollimine, kui kasutatakse suletud katsesüs ­
teemi. 
1 Õhuvarustuse kontrollimine, usside käitumise ja temperatuuri 
registreerimine; mulla- ja usside proovide võtmine uuritava aine 
kontsentratsiooni määramiseks. 
2 Sama kui päeval 1. 3 Õhuvarustuse, usside käitumise ja temperatuuri kontrollimine. 4 Sama kui päeval 1. 
5–6 Sama kui päeval 3. 
7 Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine; mulla niiskuse kont ­
rollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise 
kompenseerimine. 
8–9 Sama kui päeval 3. 
10 Sama kui päeval 1. 
11–13 Sama kui päeval 3. 
14 Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine; mulla niiskuse kont ­
rollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise kompenseerimine. 
15–16 Sama kui päeval 3. 
17 Sama kui päeval 1. 
18–20 Sama kui päeval 3.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Päev Tegevus  
21 Sama kui päeval 1; temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mulla 
niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel; omasta ­
misfaasi lõpp; usside ülekandmine allesolevatest kokkupuute 
paralleelproovidest kõrvaldamisfaasi jaoks puhast mulda sisalda ­
vatesse nõudesse (ilma soolestiku tühjendamiseta); mulla- ja usside proovide võtmine lahusti kontrollrühmades. 
Kokkupuute-eelsed tegevused (tasakaalustamise faas) tuleks 
ajakavas määrata uuritava kemikaali omadusi arvesse võttes. 
Päeva 3 jaoks kirjeldatud tegevusi tuleks korrata igal päeval 
(vähemalt tööpäeviti).
 
b) Kõrvaldamisfaas  
Päev Tegevus  
–6 Mulla koostisosade ettevalmistamine ja niisutamine; ettevalmis ­
tatud mulla kohandamine 48 tunni vältel. 
–4 Mulla koostisosade segamine; mulla jaotamine katsenõudesse; 
inkubeerimine katsetingimustes neli päeva. 
0 (omastamisfaasi 
lõpp) Temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; usside kaalumine ja rando ­
miseeritud jaotamine katsenõudesse; söödaratsiooni lisamine; usside ülekandmine allesolevatest kokkupuute paralleelproovidest puhast mulda sisaldavatesse nõudesse; mulla- ja usside proovide 
võtmine 4–6 tunni pärast uuritava kemikaali kontsentratsiooni 
määramiseks. 
1 Õhuvarustuse kontrollimine, usside käitumise ja temperatuuri 
registreerimine; mulla- ja usside proovide võtmine uuritava kemi ­
kaali kontsentratsiooni määramiseks. 
2 Sama kui päeval 1. 3 Õhuvarustuse, usside käitumise ja temperatuuri kontrollimine. 4 Sama kui päeval 1. 
5–6 Sama kui päeval 3. 
7 Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine; mulla niiskuse kont ­
rollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise kompenseerimine. 
8–9 Sama kui päeval 3. 
10 Sama kui päeval 1. 
11–13 Sama kui päeval 3. 
14 Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine; mulla niiskuse kont ­
rollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurustumise kompenseerimine. 
15–16 Sama kui päeval 3. 
17 Sama kui päeval 1.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Päev Tegevus  
18–20 Sama kui päeval 3. 
21 Sama kui päeval 1; temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mulla 
niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel; mulla- ja usside proovide võtmine lahusti kontrollrühmadest. 
Mulla ettevalmistamine enne kõrvaldamisfaasi tuleks teha samal 
viisil kui enne omastamisfaasi. 
Päeva 3 jaoks kirjeldatud tegevusi tuleks korrata igal päeval 
(vähemalt tööpäeviti).
 
Katse valgeliimuklastega  
a) Omastamisfaas kineetika arvutamiseks kasutatava kaheksa proovivõtu 
kuupäevaga  
Päev Tegevus  
–6 Ettevalmistatud mulla kohandamine 48 tunni vältel. 
–4 Mulla fraktsiooni rikastamine uuritava kemikaali lahusega; lahusti 
aurustamine; mulla koostisosade segamine; mulla jaotamine katsenõudesse; katsetingimustel tasakaalustamine nelja päeva 
vältel (kolme nädala vältel metalliga rikastatud mulla korral). 
–3 kuni –1 Katseorganismide eraldamine kultuurist aklimatiseerumiseks; 
mulla koostisosade ettevalmistamine ja niisutamine. 
0 Temperatuuri ja mulla pH mõõtmine; mullaproovide võtmine 
töödeldud nõudest ja lahusti kontrollkatse nõudest uuritava kemi ­
kaali kontsentratsiooni määramiseks; söödaratsiooni lisamine mulda; usside kaalumine ja randomiseeritud jaotamine katsenõu ­
desse; usside piisavate allproovide säilitamine analüütiliste taust ­
näitajate, märg- ja kuivmassi ning lipiidisisalduse määramiseks; kõigi katsenõude kaalumine mulla niiskuse kontrollimiseks; õhuvarustuse kontrollimine, kui kasutatakse suletud katsesüs ­
teemi. 
1 Õhuvarustuse kontrollimine, usside käitumise ja temperatuuri 
registreerimine; mulla- ja usside proovide võtmine uuritava aine kontsentratsiooni määramiseks. 
2 Sama kui päeval 1. 3 Õhuvarustuse, usside käitumise ja temperatuuri kontrollimine. 4 Sama kui päeval 1. 
5–6 Sama kui päeval 3. 
7 Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine mulda; mulla niis ­
kuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel ja vee aurus ­
tumise kompenseerimine. 
9 Sama kui päeval 1. 
10 Sama kui päeval 3.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Päev Tegevus  
11 Sama kui päeval 1. 
12–13 Sama kui päeval 3. 
14 Sama kui päeval 1; söödaratsiooni lisamine mulda; temperatuuri 
ja mulla pH mõõtmine; mulla niiskuse kontrollimine katsenõude uuesti kaalumise teel; omastamisfaasi lõpp; usside ülekandmine 
allesolevatest kemikaaliga kokkupuute paralleelproovidest kõrval ­
damisfaasi jaoks puhast mulda sisaldavatesse nõudesse (ilma soolestiku tühjendamiseta); mulla- ja usside proovide võtmine lahusti kontrollkatse rühmades. 
Kokkupuute-eelsed tegevused (tasakaalustamise faas) tuleks 
ajakavas määrata kemikaali omadusi arvesse võttes. 
Päeva 3 jaoks kirjeldatud tegevusi tuleks korrata igal päeval 
(vähemalt tööpäeviti).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
4. liide  
Tehismuld – soovitused valmistamise ja säilitamise kohta  
Kuna konkreetsest allikast looduslik muld ei pruugi olla kogu aasta vältel kätte ­
saadav ja katset võivad mõjutada seal elavad organismid ning samuti mikrosaas ­
teained, on soovitatav kasutada katses tehislikku substraati, tehismulda, vastavalt käesoleva lisa peatükile C.8 „Toksilisus vihmaussidele”(48). Selles mullas saavad ellu jääda, kasvada ja paljuneda mitmed katseliigid ning tagatakse katse- ja 
kultuuritingimuste maksimaalne standardiseeritus ning samuti laborisisene ja 
laboritevaheline võrreldavus.
 
Mulla koostisosad 
Turvas: 10 % Turbasammal kooskõlas OECD suunisega 
207 (48). 
Kvartsliiv: 70 % Tööstuslik kvartsliiv (õhu käes kuivatatud); 
tera suurus: rohkem kui 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 50–200 μm, kuid 
kõik osakesed peaksid olema ≤ 2 mm. 
Kaoliinsavi: 20 % Kaoliniidisisaldus ≥ 30 %. 
Kaltsiumkarbonaat: ≤ 1 % CaCO
 3 , pulbriks jahvatatud, keemiliselt 
puhas.  
Soovi korral võib tehismulla orgaanilise süsiniku sisaldust vähendada, vähen ­
dades näiteks turbasisaldust 4–5 %-le kuivast mullast ja suurendades vastavalt liivasisaldust. Sellise orgaanilise süsiniku sisalduse vähendamise teel võib uuri ­
tava kemikaali mullal adsorbeerumise (orgaaniline süsinik) võimalus väheneda ja 
uuritava kemikaali saadavus ussidele võib suureneda (74). On tõendatud, et  
Enchytraeus albidus  ja Eisenia fetida  suudavad täita paljunemist käsitleva kehti ­
vuskriteeriumi, kui neid katsetatakse põllumullas, millel on väiksem orgaanilise süsiniku sisaldus, näiteks 2,7 % (33, 61), ja seniste kogemuste põhjal on seda 
võimalik saavutada 5 % turbasisaldusega tehismullas.
 
Valmistamine  
Mulla kuivad koostisosad segatakse põhjalikult (näiteks suuremahulises laborise ­
gistis). Seda tuleks teha enne katse alustamist ligikaudu nädala jooksul. Segatud 
kuiva mulla koostisosi tuleks niisutada deioniseeritud veega vähemalt 48 tundi 
enne uuritava aine lisamist, et tasakaalustada/stabiliseerida happesust. pH määra ­
miseks kasutatakse mulla ja 1 M KCl lahust suhtega 1 : 5. Kui pH ei ole nõutud 
vahemikus (6,0 ± 0,5), lisatakse mullale piisavas koguses CaCO  3 või valmista ­
takse ette uus mullapartii.  
Tehismulla maksimaalne veemahutavus määratakse kooskõlas standardiga ISO 
11268-2 (35). Kuiva tehismulda niisutatakse vähemalt kaks päeva enne katse 
alustamist, lisades piisavalt deioniseeritud või taastatud vett, et saada ligikaudu 
pool lõplikust veesisaldusest. Lõplik veesisaldus peaks olema 40–60 % maksi ­
maalsest veemahutavusest. Katse alguses jagatakse eelnevalt niisutatud muld nii mitmeks partiiks, kui on katse vältel kasutatud katsekontsentratsioone ja kont ­
rollrühmi, ning niiskusesisaldus reguleeritakse 40–60 %-le maksimaalsest veema ­
hutavusest, kasutades uuritava aine lahust ja/või lisades deioniseeritud või taas ­
tatud vett. Niiskusesisaldus määratakse katse alguses ja lõpus (105 °C juures). See peaks olema optimaalne liikide vajaduste jaoks (niiskusesisaldust võib samuti 
kontrollida järgmiselt: kui mulda käes kergelt vajutatakse, siis peaksid sõrmede 
vahele tekkima väiksed veepiisad).
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Säilitamine  
Tehismulla kuivi koostisosi võib toatemperatuuril säilitada kuni kasutamiseni. 
Valmistatud eelnevalt niisutatud mulda võib säilitada jahedas kohas kuni kolm 
päeva enne rikastamist; tuleks olla hoolikas, et vältida vee aurumist. Uuritava ainega rikastatud mulda tuleks kasutada viivitamata, v.a juhul, kui on andmeid selle kohta, et konkreetset mulda saab säilitada ilma uuritava aine mürgisust ja 
biosaadavust mõjutamata. Rikastatud mulla proove võidakse seejärel säilitada 
kuni analüüsini konkreetse uuritava aine jaoks soovitatavates tingimustes.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
5. liide  
Mulla väheharjasusside liigid, keda soovitatakse kasutada mullast toimuva 
bioakumulatsiooni katsete tegemiseks  
Vihmaussid  
Soovitatav katseliik on  Eisenia fetida  (Savigny 1826), kes kuulub  Lumbricidae  
sugukonda. Alates 1972. aastast on see jaotatud kahte alamliiki ( Eisenia fetida  ja 
Eisenia andrei  (10)). Jaenike (36) kohaselt on need täiesti eraldi liigid.  Eisenia 
fetida  on kergesti äratuntav oma heledate segmentidevaheliste kollaste triipude 
poolest, aga  Eisenia andrei  värvus on ühtlaselt tumepunane. Need liigid on 
tõenäoliselt pärit Musta mere piirkonnast ja neid esineb praegu kõikjal maailmas eelkõige inimeste tekitatud elupaikades, nagu kompostihunnikud. Mõlemat liiki 
saab kasutada ökotoksikoloogilisteks ja bioakumulatsiooni katseteks.
 
Eisenia fetida  ja Eisenia andrei  on kaubanduslikult saadaval näiteks kalasöödana. 
Võrreldes muude  Lumbricidae  sugukonda kuuluvate vihmaussidega on neil 
lühike elutsükkel ja nad saavad (toatemperatuuril) täiskasvanuks ligikaudu kahe 
kuni kolme kuu vanusena. Nende optimaalne temperatuur on ligikaudu 
20–24 °C. Nad eelistavad suhteliselt niiskeid substraate, mille pH on peaaegu neutraalne ja orgaanilise materjali sisaldus on suur. Kuna neid liike on standar ­
ditud ökotoksikoloogilistes katsetes ligikaudu 25 aasta vältel laialdaselt kasutatud, 
on nende kultuuris kasvatamine hästi dokumenteeritud (48, 77).
 
Mõlemat liiki saab kasvatada mitmesugustes loomsetes jäätmetes. ISO (35) alusel 
soovitatud kasvatamise keskkond on hobuse- või veisesõnniku ja turba segu 50 : 50. Kasvukeskkonna pH peaks olema ligikaudu 6–7 (reguleeritakse kaltsiumkar ­
bonaadiga), kasvukeskkonnal peaks olema vähene ioonjuhtivus (vähem kui 6 
mS/cm või vähem kui 0,5 % soola kontsentratsioon) ja see ei tohiks olla ammo ­
niaagi või loomauriiniga liigselt saastunud. Samuti võib kasutada müügil olevat aiamulda, mis ei sisalda lisandeid, või tehismulda OECD (48) kohaselt või nende 
mõlema segu 50 : 50. Substraat peaks olema niiske, kuid mitte liiga märg. 
Sobivad on 10- kuni 50-liitrised kasvatuskastid.
 
Standardse vanuse ja massiga usside saamiseks on parim alustada kultuuri kooko ­
nitega. Seepärast lisatakse värsket substraati sisaldavasse kasvatuskasti täiskas ­
vanud ussid kookonite saamiseks. Praktilised kogemused on näidanud, et popu ­
latsiooni tihedus ligikaudu 100 täiskasvanud ussi substraadi (märgmassi) kg kohta annab head paljunemismäärad. Pärast 28 päeva möödumist täiskasvanud ussid eemaldatakse. Kookonitest koorunud vihmausse kasutatakse katsetamiseks 
vähemalt 2 kuu ja mitte kauem kui 12 kuu möödumisel täiskasvanuks saamisest.
 
Eespool kirjeldatud liiki usse saab pidada terveks, kui nad liiguvad kogu subs ­
traadis, ei proovi substraadist lahkuda ja paljunevad pidevalt. Väga aeglane liik ­
umine või kollane tagaosa ( Eisenia fetida  puhul) viitab substraadi kurnatusele. 
Sel juhul soovitatakse kasutada värsket substraati ja/või väiksemat arvu loomi kasti kohta.
 
Täiendavad valitud viited  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1–58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1–81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 
909, 86 S.  
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49–55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180–201.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1–171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331–338 pp.
 
Valgeliimuklased  
Soovitatav katseliik on  Enchytraeus albidus,  Henle 1837 (valgeliimukas).  Enchy­
traeus albidus  on üks suurimaid (kuni 15 mm) rõngusside hõimkonna vähehar ­
jasusside klassi  Enchytraeidae  sugukonna liike ja seda leidub kogu maailmas, vt 
näiteks 8.  Enchytraeus albidus ’t leidub merelistes, siseveekogude ja mullastiku 
elupaikades peamiselt lagunevas orgaanilises aines (vetikad, kompost) ja harvadel 
juhtudel niitudel (42). Kõnealune lai ökoloogiline taluvus ja mõni morfoloogiline erinevus näitab, et kõnealusel liigil võib olla erinevaid liigisiseseid rühmi.
 
Enchytraeus albidus  on kaubanduslikult saadaval, seda müüakse kalasöödana. 
Tuleks kontrollida, kas kultuur on saastunud muude, enamasti väiksemate liik ­
idega (60). Kui saastumine on toimunud, siis tuleks kõiki usse pesta veega Petri tassis. Seejärel valitakse (stereomikroskoobi abil) uue kultuuri alustamiseks  
Enchytraeus albiduse  suured isendid. Kõik muud ussid visatakse ära. Liigi elut ­
sükkel on lühike ja täiskasvanuks saadakse 33 päevaga (18 °C juures) kuni 74 
päevaga (12 °C juures). Katses tuleks kasutada ainult kultuure, mida on ilma probleemideta laboris hoitud vähemalt viis nädalat (üks põlvkond).
 
Muud  Enchytraeus ’e perekonna liigid on samuti sobivad, eelkõige  Enchytraeus 
luxuriosus.  See liik elab tegelikult mullas ja seda on hiljuti kirjeldatud väljaandes 
(65). Kui kasutatakse muud  Enchytraeus ’e perekonna liiki, tuleks see selgelt 
tuvastada ja liigi valimist tuleks põhjendada.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide ja Graefe 1992) on liik, mis kuulub samasse 
rühma kui  Enchytraeus luxuriosus . Selle leidumist looduses ei ole veel kindlalt 
tuvastatud, seda on ainult kirjeldatud vihmausside kultuurides ja kompostihunni ­
kutes (Römbke 2003). Selle algsed ökoloogilised nõuded ei ole seega teada. 
Hiljutised laboriuuringud erinevate alade muldadega on kinnitanud, et sellel liigil 
on laialdane taluvus mulla omaduste (nagu pH ja tekstuur) suhtes (Jänsch  et al.  
2005). Viimastel aastatel on seda liiki sageli kasutatud ökotoksikoloogilistes uuringutes, kuna seda on lihtne kasvatada ja katsetada, näiteks Kuperman  et 
al. 2003. Isendid on siiski väiksed (3–12 mm; keskmiselt 7 mm) (Westheide & 
Müller 1996), mis muudab käsitlemise  Enchytraeus albidus ’ega võrreldes keeru ­
kamaks. Selle liigi kasutamisel  Enchytraeus albidus ’e asemel võib katsenõu olla 
väiksem, aga ei pruugi seda olla. Lisaks sellele tuleks arvesse võtta, et see liik 
paljuneb väga kiiresti. Selle põlvkond saab 20 ± 2 °C juures küpseks vähem kui 
20 päevaga (Achazi  et al.  1999) ja kõrgemal temperatuuril isegi kiiremini.
 
Enchytraeidae  sugukonda kuuluvad  Enchytraeus albidus ’e liigi isendeid (ning 
samuti muude  Enchytraeus ’e perekonna liikide isendeid) on võimalik kasvatada 
suurtes plastkastides (näiteks 30 × 60 × 10 cm või 20 × 12 × 8 cm, mis on 
sobivad väikeste usside kasvukultuuri jaoks), mis on täidetud tehismulla ja müügil oleva ilma lisanditeta saastumata aiamulla seguga. Kompostmaterjali tuleks vältida, kuna see võib sisaldada mürgiseid kemikaale, nagu raskmetalle. 
Fauna tuleks kasvumullast enne kasutamist kolmekordse sügavkülmutamise teel 
eemaldada. Võib kasutada ka puhast tehismulda, aga paljunemiskiirus selles võib segatud substraatidega võrreldes olla väiksem. Substraadi pH peaks olema 6,0 ± 0,5. Kultuuri hoitakse ilma valguseta inkubaatoris temperatuuril 15 ± 2 °C. Igal 
juhul tuleks vältida kõrgema temperatuuri kui 23 °C kasutamist. Tehismuld / 
looduslik muld peaks olema niiske, aga mitte märg. Kui mulda käega õrnalt vajutatakse, peaksid ilmuma ainult väiksed veepiisad. Igal juhul tuleks vältida hapnikuvaegust (näiteks kaane kasutamisel peaks kaane aukude arv olema piisa ­
valt suur, et tagada piisav õhuvahetus). Kasvumulda tuleks kord nädalas hoolika 
segamisega aereerida.
 ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Usse tuleks vähemalt korra nädalas valitud ajal sööta valtsitud kaeraga, mis 
asetatakse mulda tehtud auku ja kaetakse mullaga. Kui mahutisse jääb eelmisest 
söötmise kuupäevast sööta, tuleks antava sööda kogust sellele vastavalt kohan ­
dada. Kui allesolevale söödale kasvavad seened, tuleks see asendada valtsitud kaera uue kogusega. Paljunemise stimuleerimiseks võib valtsitud kaera täiendada 
iga kahe nädala tagant müügil oleva vitamiinidega täiendatud valgupulbriga. 
Kolme kuu möödumisel kantakse loomad üle värskelt valmistatud kultuuri või kasvusubstraati. Valtsitud kaer, mida tuleb säilitada suletud nõudes, tuleks enne kasutamist aidalestade (näiteks  Glyzyphagus  sp., Astigmata , Acarina ) või rööv ­
lestadega (näiteks  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , Gamasida , Acarina ) saastu­
mise vältimiseks autoklaavida või läbi kuumutada. Pärast desinfitseerimist jahva ­
tatakse sööt nii, et seda oleks lihtne mulla pinnale puistata. Muud võimalikud söödaallikad on pagaripärm või kalasööt TetraMin
 ® . 
Üldjoontes on kasvukultuuri tingimused piisavalt head, kui ussid ei proovi subs ­
traadist lahkuda, liiguvad mullas kiiresti, nende välispind on läikiv ilma selle 
külge jäänud mullaosakesteta, ussid on üldjoontes valkja värvusega ja kui näha on erinevas vanuses usse. Tegelikult saab usse pidada terveks, kui nad pidevalt paljunevad.
 
Täiendavad valitud viited  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.
 
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. 
Reviews 13: 51–83.  
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligoc­
haeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the 
nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.  
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607–616.  
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.  
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.  ▼M4 2008R0440 — ET — 24.08.2014 — 005.001 — 1467