1991R2568 — ET — 01.10.2008 — 022.001

Käesolev dokument on vaid dokumenteerimisvahend ja institutsioonid ei vastuta selle sisu eest

Muudetud:







(*) Käesolevat akti ei ole eesti keeles avaldatud.









▼B

KOMISJONI MÄÄRUS (EMÜ) nr 2568/91,

11. juuli 1991,

oliiviõlide ja pressimisjääkide omaduste ja asjakohaste analüüsimeetodite kohta







EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, võttes arvesse nõukogu 22. septembri 1966. aasta määrust nr 136/66/EMÜ õli- ja rasvaturu ühise korralduse kehtestamise kohta, ( 1 ) viimati muudetud määrusega (EMÜ) nr 3577/90, ( 2 ) eriti selle artiklit 35a, ning arvestades, et: ning arvestades, et: määruse nr 136/66/EMÜ lisas on kirjeldatud kõigis liikmesriikides turustatud ning liikmesriikide vahel, ühendusesiseses ja kolmandate riikidega peetava kaubavahetuse objektiks olevate oliiviõlide ja pressjääkoliiviõlide kirjeldused ja määratlused; ilma et see piiraks olemasolevate sätete kohaldamist, tuleks erinevat liiki õlide eristamiseks iga õli füüsikalised ja keemilised omadused ning neitsioliiviõli organoleptilised omadused määratleda asjaomaste toodete puhtuse ja kvaliteedi tagamiseks; erinevat liiki õlide omadused tuleks kogu ühenduses kindlaks määrata ühtsetel alustel; selleks tuleks kehtestada ühenduse keemilise analüüsi ja organoleptilise hindamise meetodid; üleminekuajal tuleks lubada kasutada ka teisi liikmesriikides kohaldatavaid analüüsimeetodeid tingimusel, et erinevate tulemuste korral on otsustavaks ühenduse meetodil saadud tulemused; seoses oliiviõli füüsikaliste ja keemiliste omaduste määratluse ja analüüsimeetoditega tuleb kaupade koondnomenklatuuri grupi 15 lisamärkusi muuta; neitsioliiviõli organoleptiliste omaduste hindamismeetod näeb ette valitud ja koolitatud degustaatorite hindamiskomisjonide loomise; seetõttu tuleks kindlaks määrata sellise struktuuri loomiseks vajalik ajavahemik; võttes arvesse raskusi, millega mõned liikmesriigid degustaatorite hindamiskomisjonide koostamisel kokku puutuvad, tuleks lubada ka teiste liikmesriikide hindamiskomisjonide kasutamist; oliiviõli pressimisjääkide impordi suhtes kohaldatava impordimaksusüsteemi nõuetekohase toimimise tagamiseks tuleks sätestada nende toodete õlisisalduse kindlaksmääramise ühtne meetod; selleks, et vältida kaubandushäireid, tuleks sätestada enne käesoleva määruse jõustumist pakendatud õli müümine teatud aja jooksul; komisjoni määrust (EMÜ) nr 1058/77, ( 3 ) viimati muudetud määrusega (EMÜ) nr 1858/88, ( 4 ) on asjakohane muuta; õli- ja rasvaturu korralduskomitee ei ole oma eesistuja määratud tähtaja jooksul arvamust esitanud, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:







▼M20

Artikkel 1

1. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktides 1 ja 2 sätestatutele, käsitatakse neitsioliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 1 alapunktide a ja b tähenduses.

2. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 3 sätestatutele, käsitatakse lambiõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 1 alapunkti c tähenduses.

3. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 4 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliiviõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 2 tähenduses.

4. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 5 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliiviõlist ja neitsioliiviõlist koosnevaks oliiviõliks määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 3 tähenduses.

5. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 6 sätestatutele, käsitatakse töötlemata oliivijääkõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 4 tähenduses.

6. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 7 sätestatutele, käsitatakse rafineeritud oliivijääk- õlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 5 tähenduses.

7. Õli, mille omadused vastavad käesoleva määruse I lisa punktis 8 sätestatutele, käsitatakse oliivijääkõlina määruse nr 136/66/EMÜ lisa punkti 6 tähenduses.

▼B

Artikkel 2

1. I lisas sätestatud õlide omadused määratakse kindlaks järgmiste analüüsimeetoditega:

— oleiinhappe protsendina väljendatud vabad rasvhapped määratakse kindlaks II lisas sätestatud meetodil,

— peroksiidarv määratakse kindlaks III lisas sätestatud meetodil,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— steroolisisaldus määratakse kindlaks V lisas sätestatud meetodil,

— erütrodiool ja uvalool määratakse kindlaks VI lisas sätestatud meetodil,

▼M21

— 2-glütserüülmonopalmitaadi protsendiline sisaldus määratakse kindlaks VII lisas sätestatud meetodil.

▼M20 —————

▼B

— spektrofotomeetriline analüüs tehakse IX lisas sätestatud meetodil,

— rasvhapete koostis määratakse kindlaks X A ja X B lisas sätestatud meetodil,

— halogeenitud lenduvad lahustid määratakse kindlaks XI lisas sätestatud meetodil,

— neitsioliiviõli organoleptilisi omadusi hinnatakse XII lisas sätestatud meetodil,

▼M20 —————

▼M11

— stigmastadieenide määramise korral meetod, mis on määratletud XVII lisas,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Lõikes 3 osutatud kontrollimiste läbiviimiseks viiakse II, III, IX, X ja XII lisas osutatud analüüsid ja vajaduse korral kõik siseriiklike seadustega nõutavad kontrollanalüüsid läbi enne minimaalse säilimisaja tähtpäeva. Kui proovid võetakse rohkem kui neli kuud enne minimaalse säilimisaja tähtpäeva, viiakse analüüsid läbi hiljemalt proovivõtmise kuule järgneva nelja kuu jooksul. Teiste nimetatud määruses sätestatud analüüside puhul ei kohaldata mingit tähtaega. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Artikkel 2a

Riigi ametiasutused või nende esindajad võivad kontrollida seda, kas proov vastab deklareeritud kategooriale:

a) viies selleks läbi, ükskõik millises järjekorras, I lisas osutatud analüüse;

b) või Ib lisa otsustamisskeemil sätestatud järjekorras, kuni saavutatakse mõni otsustamisskeemil nimetatud otsustest.

▼M19 —————

▼M5

Artikkel ►M19 3 ◄

Kui selgub, et õli organoleptilised omadused ei vasta selle kirjeldusele, kohaldab asjaomane liikmesriik halduslikke rahalisi karistusi, mis määratakse kindlaks eeskirjade eiramise raskusastet arvesse võttes, ilma et see piiraks teiste karistuste kohaldamist.

Eeskirjade eiramise hindamisel pööratakse tähelepanu eelkõige loomulikele muudatustele tavapärastes tingimustes hoitava õli omadustes.

Liikmesriigid teavitavad komisjoni iga poolaasta alguses eelmisel poolaastal avastatud eeskirjade eiramiste arvust ja liigist ning kohaldatud karistusest.

▼M5

Artikkel 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Kui liikmesriikidel on raskusi degusteerimiskomisjonide loomisega, võivad nad kasutada mõnes teises liikmesriigis heakskiidetud komisjoni.

3. Iga liikmesriik koostab kutseorganisatsioonide või kutsealadevaheliste organisatsioonide loodud degusteerimiskomisjonide loetelu vastavalt lõikes 1 sätestatud tingimustele ning tagab kõnealuste tingimuste järgimise.

▼M19 —————

▼B

Artikkel 6

1. Oliiviõli ekstraheerimisest tulenev õlikoogi ja muude jääkide õlisisaldus (CN-koodid 2306 90 11 ja 2306 90 19) määratakse kindlaks XV lisas sätestatud meetodil.

2. Lõikes 1 osutatud õlisisaldus väljendatakse õli massiprotsendina kuivaine massist.

▼M20

Artikkel 7

Kohaldatakse ühenduse sätteid, mis käsitlevad saasteainete olemasolu.

Halogeenitud lahustite puhul on kõikide oliiviõli kategooriate puhul piirmäärad järgmised:

— iga tuvastatud halogeenitud lahusti maksimaalne sisaldus: 0,1 mg/kg,

— iga tuvastatud halogeenitud lahusti maksimaalne üldsisaldus: 0,2 mg/kg.

▼B

Artikkel 8

1. Liikmesriigid teatavad komisjonile käesoleva määruse rakendamiseks võetud meetmetest.

2. Liikmesriigid saadavad komisjonile iga poolaasta alguses aruande eelmise poolaasta jooksul tehtud katsete analüütiliste andmete kohta.

Õli- ja rasvaturu korralduskomitee võtab tulemusi arvesse määruse nr 136/66/EMÜ artiklis 39 sätestatud korras.

Artikkel 9

Määrus (EMÜ) nr 1058/77 tunnistatakse kehtetuks.

Artikkel 10

1. Käesolev määrus jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas.

XII lisas sätestatud meetodit kohaldatakse siiski ►M1 1. november 1992 ◄ , välja arvatud sekkumissüsteemiga seotud toimingute puhul.

▼M5

Kõnealust meetodit ei kohaldata enne 1. novembrit 1992 pakendatud neitsioliiviõli suhtes.

▼B

2. Käesolevat määrust ei kohaldata enne käesoleva määruse jõustumist pakendatud ja kuni 31. oktoobrini 1992 turustatava oliiviõli ja oliivijääkõli suhtes.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.









LISAD

Kokkuvõte







I lisa: Oliiviõli omadused ▼M17 I A lisa: Kuni 100 l väikepakendites tarnitavast oliiviõlist või pressjääkoliiviõlist proovide võtmine ▼M20 I B lisa: Otsustamisskeem ▼B II lisa: ►M21 Vabade rasvhapete määramine külmmeetodil ◄ III lisa: Peroksiidarvu määramine IV lisa: ►M6 Vahasisalduse määramine kapillaargaasikromatograafia abil ◄ V lisa: Steroolide koostise ja sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga VI lisa: Erütrodiooli ja uvalooli määramine VII lisa: ►M21 2-glütserüülmonopalmitaadi protsendilise sisalduse määramine ◄ ▼M20 ————— ▼B IX lisa: Spektrofotomeetriline analüüs ultraviolettpiirkonnas X A lisa: Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline analüüs Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil XI lisa: Oliiviõli halogeenitud lenduvate lahustite määramine Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B XV lisa: Oliiviõli pressimisjääkide õlisisaldus XVI lisa: Joodiarvu määramine ▼M11 XVII lisa: Stigmastadieenide määramine taimeõlides ▼M13 Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with ECN42 ▼M19 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content

▼M21









I LISA

OLIIVIÕLIDE OMADUSED







Liik Happesus (%) (*) Peroksiidid mekv O2/kg (*) Vahad mg/kg (**) 2-glütserüülmonopalmitaat (%) Stigmastadieen mg/kg (1) ECN42 HPLC ja ECN42 vahe teoreetiline arvutus K232 (*) K270 (*) Δ-K (*) Organoleptiline hindamine puuduse mediaan (Md) (*) Organoleptiline hindamine viljale iseloomulikkuse mediaan (Mf) (*) 1. Ekstra neitsioliiviõli ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 % ≤ 1,0 kui palmitiinhappe % kokku > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Neitsioliiviõli ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 % ≤ 1,1 kui palmitiinhappe % kokku > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ ►M22 3,5 ◄ Mf > 0 3. Lambiõli > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 % ≤ 1,1 kui palmitiinhappe % kokku > 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > ►M22 3,5 ◄ (2) — 4. Rafineeritud oliiviõli ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 % ≤ 1,1 kui palmitiinhappe % kokku > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Rafineeritud oliiviõlidest ja neitsioliiviõlidest koosnev oliiviõlisegu ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 kui palmitiinhappe % kokku ≤ 14 % ≤ 1,0 kui palmitiinhappe % kokku > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Töötlemata oliivijääkõli — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafineeritud oliivijääkõli ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliivijääkõli ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Liik Hapete sisaldus (1) Oleiinhappe transisomeeride summa (%) Linool- ja linoleen-happe trans-isomeeride summa (%) Teerolide Koostis Steroolid kokku (mg/kg) Erütrodiool ja uvaool (%) (**) Müristiinhape (%) Linoleenhape (%) Arahiinhape (%) Eikoseenhape (%) Beheenhape (%) Lignotseriinhape (%) Kolesterool (%) Brassikasterool (%) Kampesterool (%) Stigmasterool (%) β-sitosterool (%) (2) Δ7-stigmastenool (%) 1. Ekstra neitsioliiviõli ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Neitsioliiviõli ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lambiõli ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafineeritud oliiviõli ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Rafineeritud oliiviõlidest ja neitsioliiviõlidest koosnev oliiviõlisegu ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Töötlemata oliivijääkõli ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Rafineeritud oliivijääkõli ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Oliivijääkõli ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









I A LISA

KUNI 100 L VÄIKEPAKENDITES TARNITAVAST OLIIVIÕLIST VÕI PRESSJÄÄKOLIIVIÕLIST PROOVIDE VÕTMINE

Seda proovivõtumeetodit kohaldatakse kuni 125 000 liitri suuruste oliiviõli või pressjääkoliiviõli tarnete suhtes, mille puhul on kontaktpakend kuni 100 liitrit.

Kui tarnitav kogus on üle 125 000 liitri, jagatakse see kuni 125 000liitristesse partiidesse. Kui tarnitav kogus on vähem kui 125 000 liitrit, moodustab see ühe partii. Seda meetodit kohaldatakse seejärel iga partii suhtes.

Võetavate üksikproovide minimaalne arv määratakse kindlaks partii suuruse alusel vastavalt punktis 1 esitatud tabelile.

Üksikproovi suurus määratakse kindlaks kontaktpakendi mahu alusel vastavalt punktis 2.1 esitatud tabelile.

Tarne, üksikproov ja laboriproov hõlmavad standardis EN ISO 5555 esitatud määratlusi.

Partii on hulk kaubaüksuseid, mis toodetakse, valmistatakse ja pakitakse sellistes tingimustes, et igas kaubaüksuses olev õli on kõikide analüütiliste omaduste osas homogeenne.

1. VÕETAVATE ÜKSIKPROOVIDE ARV

Võetavate üksikproovide minimaalne arv määratakse kindlaks partii suuruse alusel vastavalt punktis 1 esitatud tabelile:







Partiide suurus (liitrites) väiksem kui Minimaalne üksikproovide arv 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Üksikproovide hulgast valitud kontaktpakendid peavad partiis üksteise kõrval olema.

Kahtluse korral suurendavad liikmesriigid võetavate üksikproovide arvu.

2. ÜKSIKPROOVIDE SISALDUS

2.1. Üksikproovid peavad koosnema järgmisest:



Kui kontaktpakendi maht on: Üksikproovis sisaldab õli: a) 5 l või rohkem a) 3 kontaktpakendist b) 3 liitrit või rohkem, kuid vähem kui 5 liitrit b) 3 kontaktpakendist c) 2 liitrit või rohkem, kuid vähem kui 3 liitrit c) 3 kontaktpakendist d) 1 liitrit või rohkem, kuid vähem kui 2 liitrit d) 6 kontaktpakendist e) 0,75 liitrit või rohkem, kuid vähem kui 1 liiter e) 6 kontaktpakendist f) vähem kui 0,75 liitrit f) kolmekordse koguse õli miinimumarv pakenditest, mille üldmaht on rohkem kui 1,5 liitrit

2.2 Üksikproovid peavad olema kontaktpakendites kuni analüüsimise ajani. Üksikproovides olev õli jagatakse seejärel vajaduse korral kolmeks laboriprooviks, et viia läbi: a) II, III, IX ja X lisas nimetatud analüüsid, b) XII lisas osutatud analüüsid, c) muud analüüsid.

2.3 Pakendid, mis moodustavad üksikproovi, jagatakse kooskõlas siseriikliku seadusega sätestatud kontrollimenetlusega.

3. ANALÜÜSID JA TULEMUSED

a) Iga punktis 1 osutatud üksikproov jagatakse laboriproovideks kooskõlas standardi EN ISO 5555 punktiga 2.5 ja analüüsitakse järgmiselt: — määratakse kindlaks vabad rasvhapped, nagu artikli 2 lõike 1 esimeses taandes osutatud, — määratakse kindlaks peroksiidarv, nagu artikli 2 lõike 1 teises taandes osutatud, — viiakse läbi spektrofotomeetriline analüüs, nagu artikli 2 lõike 1 kaheksandas taandes osutatud, — määratakse kindlaks vabade rasvhapete koostis, nagu artikli 2 lõike 1 esimeses taandes osutatud.

b) Kui üks punktis a osutatud analüüside tulemustest ei vasta vähemalt ühe samast partiist võetud üksikproovi osas deklareeritud õli kategooriale, loetakse kogu asjaomane partii mittevastavaks. Kui punktis a osutatud analüüside tulemused ei ole ühest partiist võetud kõikide üksikproovide osas ühtlased, võttes arvesse asjaomaste meetodite korratavuse iseärasusi, loetakse kogu partii mittevastavaks ja iga üksikproovi osas viiakse läbi teine nõutav analüüs. Vastasel juhul tuleb nõutav analüüs läbi viia ühe selle partii proovi osas.

c) Kui üks punkti b teises taandes osutatud analüüside tulemustest ei vasta deklareeritud õli kategooria omadustele, loetakse kogu asjaomane partii mittevastavaks. Kui kõik punkti b teises taandes osutatud analüüside tulemused vastavad deklareeritud õli kategooria omadustele, loetakse kogu asjaomane partii vastavaks.

▼M20









I B LISA

OTSUSTAMISKAVA, ET KONTROLLIDA KAS OLIIVIÕLIPROOV VASTAB DEKLAREERITUD KATEGOORIALE

Analüüsi selleks, et kontorollida, kas oliiviõli või oliivijääkõli vastab deklareeritud kategooriale, võib läbi viia:

a) I lisas täpsustatud omadustele vastavuse kontrollimiseks kavandatud analüüsid juhuslikus järjekorras; või

b) otsustamiskavas täpsustatud analüüsid nimetatud kavas esitatud järjekorras, kuni üks otsustamiskavas esitatud otsus on saavutatud.

Eraldi tuleb läbi viia saasteainete analüüsid, mis on vajalikud selleks, et kontrollida vastavust Euroopa Ühenduse standarditele.

Otsustamiskava kohaldatakse kõikide oliiviõli ja oliivijääkõli kategooriate suhtes. See koosneb tabelitest 1–11, mida tuleb kasutada asjaomase õli osas deklareeritud kategooria alusel üldtabelis sätestatud järjekorras.

Tabelit 11 tõlgendatakse järgmiselt:

— võrdusmärk (=) osutab skeemile, mida järgitakse eelmises kastis täpsustatud kriteeriumitele vastavuse korral (positiivne vastus). Punktiir (…) osutab alternatiivsele skeemile, mida järgitakse mittevastavuse korral,

— tabelite 1–11 kastide pealkirjad osutavad käesolevas määruses sätestatud analüüsidele käesoleva lisa 1 liites sätestatud vastavustabeli alusel,

— tabelite 1–11 eitava vastuse ringides sulgudes olevad tähed ristviitavad käesoleva lisa 2. liites esitatud suunavale teabele. Tähed ise ei sisalda analüüsi läbiviimise kohustust ega sea kahtluse alla märgitud oletuse õigsust.









1. liide

Käesoleva määruse lisade ja otsustamiskavas täpsustatud analüüside vastavustabel







▼M21 – Happelisus II lisa Vabade rasvhapete määramine külmmeetodil ▼M20 – Peroksiidarv III lisa Peroksiidarvu määramine – UV spektromeetria IX lisa Spektrofotomeetriline analüüs – Organoleptiline hindamine XII lisa Neitsioliiviõli organoleptiline hindamine – 3,5-stigmastadieenid XVII lisa Taimeõlides stigmastadieenide määramise meetod – Rasvhapete trans-isomeerid Xa lisa ja Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline analüüs Xb lisa Rasvhapete metüülestrite ettevalmistamine – Rasvhapete sisaldus Xa lisa ja Rasvhapete metüülestrite gaasikromatograafiline analüüs Xb lisa Rasvhapete metüülestrite ettevalmistamine – ΔECN42 XVIII lisa HPLC-meetodiga triglütseriidide koostise määramine (erinevus HPLC-meetodiga määratud sisalduse ja teoreetilise sisalduse vahel) – Steroolide koostis ja üldsisaldus V lisa Steroolide koostise ja sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga – Erütrodiool ja uvalool VI lisa Erütrodiooli ja uvalooli määramine – Vahad IV lisa Vahasisalduse määramine kapillaargaasikromatograafia abil – Alifaatsed alkoholid XIX lisa Alifaatsete alkoholide sisalduse gaasikromatograafiline määramine kapillaarkolonniga ▼M21 – Küllastunud rasvhapped 2. positsioonis VII lisa 2-glütserüülmonopalmitaadi protsendilise sisalduse määramine ▼M20









2. liide

Tabel 1

a) Vt neitsioliiviõli või lambiõli (Kvaliteedikriteeriumid tabel 2, või Kvaliteedi ja puhtuse kriteeriumid tabel 4)

b) Vt lambiõli (Kvaliteedi ja puhtuse kriteeriumid tabel 4)

Tabel 2

a) Vt lambiõli (Kvaliteedi ja puhtuse kriteeriumid tabel 4)

b) Vaata ekstra neitsioliiviõli (Kvaliteedikriteeriumid tabel 1)

Tabel 3

a) Rafineeritud õli (oliiviõli või muu õli) sisaldus

b) Oliivijääkõli sisaldus

Tabel 4

a) Vt ekstra neitsioliiviõli ja neitsioliiviõli (Kvaliteedikriteeriumid tabel 1 ja tabel 2)

b) Rafineeritud õli (oliiviõli või muu õli) sisaldus

c) Oliivijääkõli sisaldus

d) Esterdatud õlide sisaldus

Tabel 7

a) Oliivijääkõli sisaldus

b) Esterdatud õlide sisaldus

Tabel 8

a) Rafineeritud õli (oliiviõli või muu õli) sisaldus

b) Vt lambiõli (Kvaliteedi ja puhtuse kriteeriumid tabel 4)

c) Esterdatud õlide sisaldus

Tabel 11

a) Esterdatud õlide sisaldus

▼B









II LISA

▼M21

VABADE RASVHAPETE MÄÄRAMINE KÜLMMEETODIL

▼B

1. HAPPESUSE MÄÄRAMINE

Vabade rasvhapete määramine oliiviõlis. Vabade rasvhapete sisaldust väljendatakse tavapärasel viisil arvutatud happesusena.

1.1. Põhimõte

Proov lahustatakse lahustite segus ja vabad rasvhapped tiitritakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahuses.

1.2. Reaktiivid

Kõik reaktiivid peaksid olema tunnustatud analüütilise kvaliteediga ja vesi peaks olema kas destilleeritud või samaväärse puhtusega.

1.2.1. Dietüüleetri ja 95 % etanooli (V/V) segu võrdsetes osades. Märkus: Dietüüleeter on väga kergesti süttiv ning võib moodustada plahvatusohtlikke peroksiide. Selle kasutamisel tuleks olla ettevaatlik. Segu neutraliseeritakse kasutamise hetkel kaaliumhüdroksiidi lahusega (1.2.2) lisades 100 ml segu kohta 0,3 ml fenoolftaleiini lahust (1.2.3). Märkus: Kui dietüüleetrit ei ole võimalik kasutada, võib kasutada etanooli ja tolueeni sisaldavate lahustite segu. Vajaduse korral võib etanooli asendada 2-propanool.

1.2.2. Kaaliumhüdroksiid, tiitritud etanoolilahusena, c(KOH) 0,1 mol/l või vajaduse korral c(KOH) 0,5 mol/l. Kaaliumhüdroksiidi etanoolilahuse täpne kontsentratsioon peab olema teada ning seda tuleb enne kasutamist vahetult kontrollida. Kasutatakse lahust, mis on valmistatud vähemalt viis päeva enne kasutamist, ning see dekanteeritakse kummist punniga tumedasse klaaspudelisse. Lahus peaks olema värvitu või helekollast värvi. Märkus: Kaaliumhüdroksiidi stabiilset värvusetut lahust saab valmistada järgmiselt: 1 000 ml etanooli lastakse koos 8 g kaaliumhüdroksiidi ja 0,5 g alumiiniumilaastudega keema ning keedetakse püstjahutiga kolvis tund aega. Destilleeritakse kohe. Destillaadis lahustatakse vajalik kogus kaaliumhüdroksiidi. Lahus jäetakse mitmeks päevaks seisma ja kaaliumkarbonaadi sademest dekanteeritakse selge supernatant. Lahuse võib valmistada ilma destilleerimiseta järgmiselt: 1 000 ml etanoolile lisatakse 4 ml alumiiniumbutülaati ja segu jäetakse mitmeks päevaks seisma. Supernatant dekanteeritakse ja selles lahustatakse vajalik kogus kaaliumhüdroksiidi. Lahus on kasutamisvalmis.

1.2.3. Fenoolftaleiin, 10 g/l lahus 95–96 % etanoolis (V/V) või alkalisinises, (väga tugeva värviga rasvade puhul) 20 g/l lahus 95–96 % etanoolis (V/V).

1.3. Seadmed

Tavalised laboriseadmed, sealhulgas:

1.3.1. analüütilised kaalud;

1.3.2. 250 ml Erlenmeyeri kolb;

1.3.3. 10 ml bürett, mõõtskaala ühikutega 0,05 ml.

1.4. Menetlus

1.4.1. Proovi ettevalmistamine analüüsiks (Katse tehakse filtreeritud prooviga. Kui niiskus ja lisandid on kokku alla 1 %, kasutatakse proovi ilma täiendava töötlemiseta; kui need on üle 1 %, tuleks proov filtreerida.)

1.4.2. Proovi võtmine Proov võetakse sõltuvalt eeldatavast happearvust järgmise tabeli alusel:



Hinnanguline happearv Proovi mass (g) Kaalumistäpsus (g) < 1 20 0,05 1–4 10 0,02 4–15 2,5 0,01 15–75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Proov kaalutakse Erlenmeyeri kolvis (1.3.2).

1.4.3. Määramine Proov (1.4.2) lahustatakse 50–150 ml dietüüleetri ja etanooli (1.2.1) varem neutraliseeritud segus. Lahus tiitritakse, segades sellesse kaaliumhüdroksiidi 0,1 mol/l lahusega (1.2.2) (vt märkus 2), kuni indikaator muutub (fenoolftaleiini roosa värvus püsib vähemalt 10 sekundit). Märkus 1. Kaaliumhüdroksiidi tiitritud etanoolilahuse (1.2.2) võib asendada kaalium- või naatriumhüdroksiidi vesilahusega tingimusel, et lisatud vee maht ei põhjusta faaside eraldumist. Märkus 2. Kui 0,1 mol/l kaaliumhüdroksiidilahust on vaja rohkem kui 10 ml, kasutatakse 0,5 mol/l lahust. Märkus 3. Kui lahus muutub tiitrimise ajal häguseks, tuleb lisada nii palju lahustit (1.2.1) kui on vaja selge lahuse saamiseks.

1.5. Happesus: väljendatud oleiinhappe protsendina

Happesus massiprotsendina on võrdne:

kus:

V on kasutatud tiitritud kaaliumhüdroksiidi maht milliliitrites;

c on täpne kontsentratsioon moolides kasutatud kaaliumhüdroksiidi tiitritud lahuse liitri kohta;

M on molaarmass grammides tulemuse väljendamiseks (282) kasutatud happe mooli kohta;

m on proovi mass grammides.

Tulemus ►M6 kahe arvutuse ◄ aritmeetiline keskmine.









III LISA

PEROKSIIDARVU MÄÄRAMINE

1. KOHALDAMISALA

Käesolevas standardis kirjeldatakse õlide ja rasvade peroksiidarvu määramise meetodit.

2. KASUTUSVALDKOND

Standardit kohaldatakse loomsete ja taimsete õlide ja rasvade suhtes.

3. MÄÄRATLUS

Peroksiidarv on nende proovis olevate ainete kogus aktiivse hapniku milliekvivalendina kilogrammi kohta, mis kirjeldatud töötamistingimustel kaaliumjodiidi oksüdeerivad.

4. PÕHIMÕTE

Katsekogust töödeldakse äädikhappe ja kloroformi lahuses kaaliumjodiidi lahusega. Eraldunud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi standardlahusega.

5. SEADMED

Seadmetel ei tohi olla redutseerivaid või oksüdeerivaid aineid.

Märkus: Lihvitud pindu ei tohi määrdeainega määrida.

5.1. 3 ml klaasist kühvel.

5.2. Lihvitud kaela ja punniga 250 ml mahuga kolvid, enne kuivatatud ja täidetud puhta kuiva väärisgaasiga (lämmastik või soovitatavalt süsinikdioksiid).

5.3. 25 või 50 ml bürett, jaotatud 0,1 ml ühikuteks.

6. REAKTIIVID

6.1. Analüütiliselt puhta reaktiivi kvaliteediga kloroform, millest hapnik on vabastatud puhta, kuiva inertgaasi barboteerimisel.

6.2. Analüütiliselt puhta kvaliteediga jää-äädikas, millest hapnik on vabastatud puhta, kuiva inertgaasi voolu barboteerimisel.

6.3. Kaaliumjodiidi küllastunud vesilahus, vahetult ette valmistatud ning joodi ja jodaatideta.

6.4. Naatriumtiosulfaat, 0,01 või 0,002 Mol/L täpsusega vahetult enne kasutamist standarditud vesilahust.

6.5. Tärklise lahus, 10 g/l vesilahus, värskelt looduslikust lahustuvast tärklisest valmistatud.

7. PROOV

Tagatakse proovi võtmine ja selle säilitamine varjus, jahedas ja täielikult täidetud klaasmahutites, mis on hermeetiliselt lihvkorgi või korgist punniga suletud.

8. TÖÖ KÄIK

Katsed tehakse hämara päevavalguse või kunstliku valgustusega. Klaasist kühvlisse (5.1) või selle puudumise korral kolbi (5.2) kaalutakse 0,001 g täpsusega järgmisele tabelile vastava massiga proov, mille aluseks on eeldatav peroksiidarv:







Hinnanguline peroksiidarv (meq) Katsekoguse mass (g) 0–12 5,0–2,0 12–20 2,0–1,2 20–30 1,2–0,8 30–50 0,8–0,5 50–90 0,5–0,3

Kolvilt (5.2) eemaldatakse punn ning sellesse pannakse klaasist kühvel, millel on katsekogus. Lisatakse 10 ml kloroformi (6.1). Katsekogus lahustatakse kiiresti segamise teel. Lisatakse 15 ml äädikhapet (6.2) ja seejärel 1 ml kaaliumjodiidi lahust (6.3). Kolvile pannakse kiiresti punn, loksutatakse üks minut ja jäetakse siis viieks minutiks temperatuurile 15–25 °C varju seisma.

Lisatakse umbes 75 ml destilleeritud vett. Vabastatud jood tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (6.4) (0,002 Mol/L lahus eeldatava väärtuse < 12 puhul ja 0,01 Mol/L eeldatava väärtuse >12 puhul), loksutatakse kõvasti, kasutades indikaatorina tärklise lahust (6.5).

Ühe ja sama prooviga tehakse 2 määramist.

Samal ajal tuleb teha ka pimekatse. Kui pimekatse tulemus on suurem kui 0,05 ml 0,01 Mol/L naatriumtiosulfaadi lahust (6.4), asendatakse puhastamata reaktiivid.

9. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Peroksiidarv aktiivse hapniku milliekvivalentidena kilogrammi kohta saadakse valemiga:

kus

V on katses kasutatud naatriumtiosulfaadi standardlahuse (6.4) milliliitrite arv, mida on pimekatse arvesse võtmiseks parandatud;

T on kasutatud naatriumtiosulfaadi lahuse (6.4) täpne molaarsus;

m on katsekoguse mass grammides.

Tulemus on kahe määramise aritmeetiline keskmine.

▼M21









IV LISA

VAHADE SISALDUSE MÄÄRAMINE KAPILLAARGAASIKROMATOGRAAFIA ABIL

1. EESMÄRK

Käesoleva meetodiga määratakse vahade sisaldust oliiviõlides. Vahade eraldamine toimub süsinikuaatomite arvu alusel. Meetodit võib eeskätt kasutada pressimisega saadud oliiviõlide eristamiseks ekstraheerimisega saadud õlidest (oliivijääkõlidest).

2. PÕHIMÕTE

Rasvainele lisatakse sobivat sisestandardit, seejärel fraktsioneeritakse kromatograafiliselt, kasutades hüdrateeritud silikageelkolonni; katse tingimustes esimesena elueeritav fraktsioon ainetega, mis on triglütseriididest vähem polaarsed, eraldatakse ning seda analüüsitakse kapillaargaasikromatograafia abil.

3. SEADMED

3.1. 25milliliitrine Erlenmeyeri kolb.

3.2. Klaasist gaasikromatograafiakolonn sisediameeteriga 15,0 mm ja pikkusega 30–40 cm, mis on varustatud kraaniga.

3.3. Sobiv kapillaarkolonniga gaasikromatograaf, mis on varustatud süsteemiga, mis võimaldab otse kolonni süstimist ja koosneb järgmistest osadest: 3.3.1. programmeeritava temperatuuriga termostaatkapp kolonnide jaoks; 3.3.2. külminjektor proovi viimiseks otse kolonni; 3.3.3. leekionisatsioondetektor ja muundurvõimend; 3.3.4. integraatormeerik, mida saab kasutada koos muundurvõimendiga (3.3.3), mille reageerimisaeg on alla 1 sekundi ning mille paberi kiirust saab muuta; (võib kasutada ka infotehnoloogiasüsteeme, milles gaasikromatograafia andmed edastatakse arvuti vahendusel); 3.3.5. klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn pikkusega 8–12 m ja sisediameetriga 0,25–0,32 mm, mis on seestpoolt kaetud jaotusvedelikuga, mille kihi paksus on ühtlaselt 0,10–0,30 mm (võib kasutada müügilolevaid SE 52 või SE 54 tüüpi jaotusvedelikke).

3.4. 10mikroliitrine mikrosüstal otse kolonni süstimiseks, mille nõelal on tugevdatud pinnakiht.

3.5. Elektriline vibraator.

3.6. Pöördaurusti.

3.7. Muhvelahi.

3.8. Analüütiline kaal, kaalumistäpsus ± 0,1 mg.

3.9. Tavalised klaasist laborinõud.

4. REAKTIIVID

4.1. Silikageel, tera suurus 60–200 μm. Geel pannakse vähemalt neljaks tunniks ahju temperatuuriga 500 °C. Lastakse jahtuda, seejärel lisatakse vett koguses, mis vastab 2 %le silikageeli massist. Segatakse korralikult ühtlase massi saamiseni. Hoitakse pimedas vähemalt 12 tundi enne kasutamist.

4.2. n-heksaan, kromatograafias kasutamiseks.

4.3. Etüüleeter, kromatograafias kasutamiseks.

4.4. n-heptaan, kromatograafias kasutamiseks.

4.5. Laurüülarahidaadi 0,1 % (m/V) standardlahus heksaanis (sisestandard) (võib kasutada ka palmitüülpalmitaati või müristüülstearaati). 4.5.1. Sudaan 1 (1-fenüül-aso-2-naftool).

4.6. Kandegaas: puhas vesinik või heelium, gaasikromatograafias kasutamiseks.

4.7. Abigaasid: — puhas vesinik, gaasikromatograafias kasutamiseks; — puhas õhk, gaasikromatograafias kasutamiseks.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Kromatograafiakolonni valmistamine

n-heksaanis (4.2) suspendeeritakse 15 g silikageeli (4.1) ning viiakse kolonni (3.2). Lastakse settida. Homogeensema kromatograafilise kolonni saamiseks töödeldakse settinud kolonni elektrilise vibraatoriga (3.5) ja lisandite eemaldamiseks voolutatakse kolonni 30 ml n-heksaaniga. 25 milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) kaalutakse täpselt kaalu (3.8) abil 500 mg proovi ning lisatakse sobiv kogus sisestandardit (4.5), arvestades eeldatavat vahasisaldust; nt oliiviõli puhul lisatakse 0,1 mg ja oliivijääkõli puhul 0,25–0,5 mg laurüülarahidaati. Eelkirjeldatud viisil ettevalmistatud proov kantakse kromatograafiakolonni, kasutades kahte n-heksaani (4.2) kogust mahuga à 2 ml.

Lahustil lastakse voolata, kuni absorbendi ülemise pinna kohale jääb 1 mm vedelikku, seejärel voolutatakse kolonni veel 70 ml n-heksaaniga, et eemaldada proovis tavaliselt sisalduvad n-alkaanid. Seejärel alustatakse voolutamist; kogutakse 180 ml n-heksaani-etüüleetri segu (vahekorras 99:1) voolukiirusel umbes 15 tilka 10 sekundi jooksul. Proovi elueerimine toimub toatemperatuuril 22 ± 4 °C.

NB:

— n-heksaani-dietüüleetri segu (99:1) tuleb valmistada igal päeval uuesti.

— Vahade nõuetekohase elueerimise visuaalseks kontrollimiseks võib proovi lahusele lisada 100 μl 1 % sudaani lahust elueerimissegus. Värvaine retentsiooniaeg on vahade ja triglütseriidide retentsiooniaegade vahel; kui värvaine jõuab kromatograafiakolonni põhjani, tuleb elueerimine peatada, sest kõik vahad on elueeritud.

Niimoodi saadud fraktsiooni aurustatakse pöördaurustis (3.6), kuni peaaegu kogu lahusti on eemaldatud. Viimased 2 ml lahustit eemaldatakse nõrga lämmastikuvoolu abil, seejärel lisatakse 2–4 ml n-heptaani.

5.2. Gaasikromatograafiline analüüs

5.2.1. Ettevalmistustööd

Kolonn pannakse gaasikromatograafi (3.3); sisselaskekoht ühendatakse on-column-süsteemiga ja väljalaskekoht detektoriga. Kontrollitakse, et gaasikromatograafiaseade oleks töökorras (gaasijuhtmete lekkekindlus, detektori tundlikkus, meerik jne).

Kui kolonni kasutatakse esimest korda, on soovitatav see tasakaalustada. Läbi kolonni hakatakse nõrga joana juhtima gaasi, seejärel lülitatakse gaasikromatograafiaseade sisse. Järk-järgult, 4 tunni jooksul, tõstetakse temperatuur 350 °C-ni. Sellist temperatuuri hoitakse vähemalt kaks tundi, seejärel reguleeritakse seade töörežiimile (reguleeritakse gaasivoolu kiirust, leegi süüdet, ühendatakse elektrilise meerikuga (3.3.4), reguleeritakse kolonni termostaatkapi temperatuuri, detektorit jne). Registreeritakse signaal vähemalt kaks korda suuremal tundlikkusel, kui on vaja analüüsi läbiviimiseks. Saadav nulljoon peaks olema sirge, ilma igasuguste piikideta, ning see ei tohiks kummalegi poole triivida.

Negatiivne sirge triiv näitab, et kolonn ei ole korralikult ühendatud; positiivne triiv osutab kolonni puudulikule tasakaalustamisele.

5.2.2. Töötingimuste valimine

Töötingimused on reeglina järgmised:

— kolonni temperatuur: —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min algul 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektori temperatuur: 350 °C;

— sisestatava aine kogus: 1 μl lahust n-heptaanis (2–4 ml);

— kandegaas: heelium või vesinik asjaomase gaasi optimaalsel voolukiirusel (vt liide);

— seadme tundlikkus peab vastama järgmistele tingimustele:

Olenevalt kolonni ja gaasikromatograafi omadustest võib tingimusi muuta, et saavutada kõikide vahade eraldumine, piikide rahuldav lahutus (vt joonis) ja et C32 sisestandardi retentsiooniaeg oleks 18 ± 3 minutit. Vaha kõige tüüpilisem piik peab olema vähemalt 60 % täisskaalast.

Piigi integreerimisparameetrid määratakse kindlaks nii, et uuritavate piikide pindalasid oleks võimalik õigesti hinnata.

NB: Arvesse võttes kõrget lõpptemperatuuri, on lubatav positiivne triiv, mis ei tohi ületada 10 % skaala ulatusest.

5.3. Analüüsi läbiviimine

10mikroliitrisesse mikrosüstlasse võetakse 1 μl lahust; kolb tõmmatakse tagasi, kuni nõel on tühi. Nõel viiakse injektsioonisüsteemi ning 1–2 sekundi pärast tehakse kiire süst. Umbes 5 sekundi pärast tõmmatakse nõel ettevaatlikult välja.

Detektori signaali registreeritakse seni, kuni vahad on täielikult elueeritud.

Nulljoon peab kogu aeg vastama nõuetele.

5.4. Piikide määramine

Piigid määratakse retentsiooniaja põhjal, võrdlusest samadel tingimustel analüüsitud teadaoleva retentsiooniajaga vahade segudega.

Joonisel on esitatud neitsioliiviõli vahade kromatogramm.

5.5. Kvantitatiivne hindamine

Sisestandardile ja alifaatsetele estritele C40–C46vastavate piikide pindalad arvutatakse integraatori abil.

Iga estri vahasisaldus milligrammides rasvaine kilogrammi kohta arvutatakse järgmiselt:

kus:

Ax = iga estri piigi pindala ruutmillimeetrites;

As = sisestandardi piigi pindala ruutmillimeetrites;

ms = lisatud sisestandardi mass milligrammides;

m = määramisel kasutatud proovi mass grammides.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Märgitakse erinevate C40- kuni C46-vahade sisalduste summa milligrammides rasva kilogrammi kohta (ppm).

NB. Määratavate koostisosade puhul osutatakse vahade piikidele, mis paiknevad paarisarvulise süsinikuaatomite arvuga estrite C40 ja C46 vahel, vastavalt järgneval joonisel esitatud oliiviõli vahade kromatogrammile. Kui ester C46 esineb kahekordsena, on soovitatav selle identifitseerimiseks analüüsida pressimisjääkide õli vahafraktsiooni, kus C46 piiki on kerge ära tunda, sest see on oluliselt suurem.

Tulemused väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

Joonis

Oliiviõli vahade kromatogramm ( 5 )

Tähistused:

I.S. = laurüülarahidaat

1. = diterpeenestrid

2 + 2′ = estrid C40

3 + 3′ = estrid C42

4 + 4′ = estrid C44

5. = estrid C46

6. = steroolestrid ja triterpeenalkoholid.









Liide

Gaasi voolukiiruse määramine

Kui gaasikromatograaf on viidud tavapärasesse töörežiimi, süstitakse kolonni 1–3 μl metaani või propaani ning mõõdetakse stopperiga aeg süstimise hetkest kuni piigi alguseni (tM); selle ajaga läks metaan või propaan läbi kolonni.

Voolukiirus (cm/s) määratakse valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on stopperiga mõõdetud aeg sekundites.

▼B









V LISA

STEROOLIDE KOOSTISE JA SISALDUSE GAASIKROMATOGRAAFILINE MÄÄRAMINE KAPILLAARKOLONNIGA

1. KOHALDAMISALA

Meetod kirjeldab rasvainete steroolide individuaalse ja üldsisalduse määramist.

2. PÕHIMÕTE

Rasvaine, millele on sisestandardina lisatud β-kolestanooli, seebistatakse kaaliumhüdroksiidiga etanoolilahuses ja seebistumatud komponendid ekstraheeritakse dietüüleetriga.

Steroolifraktsioon eraldatakse seebistamatust ekstraktist kromatograafiaga aluselise silikageeli plaadi põhjal. Silikageelist saadud steroolid töödeldakse trimetüülsilüüleetriteks ja neid analüüsitakse gaasikromatograafiliselt kapillaarkolonniga.

3. SEADMED

3.1. Püstjahutiga varustatud lihvühendustega 250 ml kolb.

3.2. 500 ml jaotuslehtrid.

3.3. 250 ml kolvid.

3.4. Täielikud seadmed planaarkromatograafiaga analüüsimiseks, kasutades 20 × 20 cm klaasplaate.

3.5. Ultraviolettlamp lainepikkusega 366 või 254 nm.

3.6. 100 ja 500 μl mikrosüstlad.

3.7. Silindriline filterlehter, mille poorne septum on G3 (15–40 μm), diameeter ligikaudu 2 cm ja sügavus 5 cm ning milles on vaakumfiltreerimiseks sobiv liide ja 12/21 lihvkern.

3.8. 50 ml vaakumkolb 12/21 lihvmuhviga, mida on võimalik paigaldada filterlehtrisse (3.7).

3.9. 10 ml katseklaas koonusekujulise põhja ja tihenduskitiga.

3.10. Gaasikromatograaf, mis võimaldab kasutada kapillaarkolonni ja on varustatud järgmistest seadistest koostatud jaotussüsteemiga: 3.10.1. termostateeritav kolonnikamber, mis hoiab nõutavat temperatuuri täpsusega ±1 °C; 3.10.2. reguleeritava temperatuuriga aurustamisseade, millel on silaniseeritud klaasist aurustaja; 3.10.3. leekionisatsioonidetektor ja muundurvõimendi; 3.10.4. meerikuga integraator, mida saab kasutada koos muundurvõimendiga (3.10.3), mille reageerimisaeg on kuni 1 sekund ning mille paberikiirust on võimalik muuta.

3.11. Klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn, mille pikkus on 20–30 m, sisediameeter 0,251–0,32 mm, üleni ühtlase 0,10–0,30 μm kihina kaetud SE-52 või SE-54 vedeliku või samaväärse vedelikuga.

3.12. l0 μl karastatud nõelaga gaasikromatograafias kasutatav mikrosüstal.

4. REAKTIIVID

4.1. Kaaliumhüdroksiid, umbes 2 mol/L etanoolilahus. 130 g kaaliumhüdroksiidi (väikseim kontsentratsioon 85 %) lahustatakse 85 % destilleeritud vees samal ajal jahutades ning täiendatakse kuni 1 liitri märgini etanooliga. Lahust tuleb hoida õhukindlalt suletud tumedates klaaspudelites.

4.2. Dietüüleeter, analüütiliselt puhas.

4.3. Veevaba naatriumsulfaat, analüütiliselt puhas.

4.4. Silikageeliga kaetud klaasplaadid, fluorestsentsindikaatorita, paksusega 0,25 mm (müügil kasutusvalmina).

4.5. Kaaliumhüdroksiid, 0,2 mol/L etanoolilahus. 13 g kaaliumhüdroksiidi lahustatakse 20 ml destilleeritud vees ning täiendatakse kuni 1 liitri märgini etanooliga.

4.6. Benseen, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2)

4.7. Atsetoon, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2)

4.8. Heksaan, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2)

4.9. Dietüüleeter, kromatograafia jaoks. (Vt. 5.2.2)

4.10. Kloroform, analüütiliselt puhas. (Vt. 5.2.2)

4.11. Planaarkromatograafia võrdluslahus: kolesterool või fütosteroolid, ►M6 2 % ◄ kloroformilahus.

4.12. 2,7-diklorofluorestseiin, 0,2 % etanoolilahus. Muudetakse kergelt aluseliseks mõne tilga 2 mol/L alkohoolse kaaliumhüdroksiidilahuse lisamisega.

4.13. Veevaba püridiin, kromatograafia jaoks.

4.14. Heksametüül disilasaan.

4.15. Trimetüülklorosilaan.

4.16. Sterooltrimetüülsilüüleetrite võrdluslahused. Valmistatakse kasutamise ajal puhastest steroolidest või steroole sisaldavatest õlidest saadud steroolisegudest.

4.17. β-kolestanool, 0,2 % kloroformilahus (m/V) (sisestandard).

4.18. Kandegaas: lämmastik või heelium, gaasikromatograafiliselt puhas.

4.19. Abigaasid: — vesinik, gaasikromatograafiliselt puhas, — õhk, gaasikromatograafiliselt puhas.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Mitteseebistuvate komponentide ettevalmistamine. 5.1.1. 250 ml kolbi viiakse 500 μl mikrosüstlaga selline kogus 0,2 % β-kolestanooli kloroformilahust (4.17), milles sisalduv kolestanooli kogus on umbes 10 % kolbis määratava alikvoodi steroolisisaldusest. Näiteks lisatakse 5grammise oliiviõli proovi puhul 500 μl 0,2protsendilist β-kolestanooli lahust ja ►M6 ————— ◄ oliivijääkõli proovi puhul 1 500 μl. Proov aurustatakse lämmastikuvoolus kuivaks ning samasse kolbi kaalutakse 5 grammi kuiva filtreeritud proovi. ►M6 Õlid ◄ puhul, mis sisaldavad palju kolesterooli, võib tekkida piik, mille peetumisaeg on sama kui kolestanooli peetumisaeg. Sellisel juhul tuleb steroolifraktsiooni analüüsida kaks korda, sisestandardiga ja ilma ►M6 või tuleb kolestanooli asemel kasutada betulinooli ◄ . 5.1.2. Lisatakse 50 ml 2 mol/L kaaliumhüdroksiidi etanoolilahust, käivitatakse püstjahuti ning kuumutatakse pidevalt kiiresti segades veevannil tasase keemiseni kuni seebistumiseni (lahus muutub selgeks). Kuumutatakse veel 20 minutit, seejärel lisatakse kondensaatori ülaosasse 50 ml destilleeritud vett, eemaldatakse püstjahuti ning kolb jahutatakse ligikaudu temperatuurini 30 oC. 5.1.3. Kolvi sisu valatakse kvantitatiivselt 500 ml jaotuslehtrisse ning seda loputatakse mitu korda kokku 50 ml destilleeritud veega. Lisatakse ligikaudu 80 ml dietüüleetrit, loksutatakse tugevasti umbes 30 sekundit ning jäetakse seisma (märkus 1). Põhjas olev veefaas kogutakse teise jaotuslehtrisse. Veefaasi ekstraheeritakse samal viisil veel kaks korda, kasutades selleks mõlemal korral 60–70 ml dietüüleetrit. Märkus 1. Võimalikku emulsiooni on võimalik eemaldada väikse koguse etanooli või metanooli sissepritsimisega. 5.1.4. Etüüleetri ekstraktid koondatakse jaotuslehtrisse ja pestakse destilleeritud veega (50 ml korraga), kuni pesuvesi annab neutraalse reaktsiooni. Kui pesuvesi on eemaldatud, kuivatatakse veevaba naatriumsulfaadiga ja filtreeritakse veevabal naatriumsulfaadil enne kaalutud 250 ml kolbi, pestes lehtrit ja filtrit väikse koguse dietüüleetriga. 5.1.5. Eeter destilleeritakse selliselt, et seda on vaid mõni ml, ning seejärel kuivatakse seda kerges vaakumis või lämmastikuvoolus ning lõpuks umbes veerand tundi ahjus temperatuuril 100 oC ning seejärel kaalutakse pärast jahutamist eksikaatoris.

5.2. Steroolifraktsiooni eraldamine. 5.2.1. Aluseliste plaatide ettevalmistamine. Silikageeli plaadid (4.4) kastetakse 10 sekundiks täielikult 0,2 mol/L kaaliumhüdroksiid etanoolilahusesse (4.5), lastakse kaks tundi tõmbekapis kuivada ning lõpuks asetatakse üheks tunniks ahju temperatuurile 100 oC. Seejärel võetakse silikageeli plaadid ahjust ning neid hoitakse kuni kasutamiseni kaltsiumkloriidi eksikaatoris (selliselt töödeldud plaadid tuleb kasutada 15 päeva jooksul). Märkus 2. Kui aluselisi silikageeli plaate kasutatakse steroolfraktsiooni eraldamiseks, ei ole mitteseebistuvaid komponente vaja alumiiniumoksiidiga töödelda. Selliselt jäävad kõik happelised ühendid (rasvhapped ja muud) lähtejoonele ja steroolivöönd eraldub selgelt alifaatsete alkoholide ja triterpeenalkoholide vööndist. 5.2.2. 95 (V/V) benseeni/atsetooni segu pannakse plaatide ilmutusnõusse umbes 1 cm sügavusele. Kasutada võib ka 65/35 (V/V) heksaani/etüüleetri segu. Ilmutusnõu suletakse nõuetekohase kaanega ning jäetakse umbes pooleks tunniks seisma, et tekiks vedeliku ja auru tasakaal. Ilmutusnõu siseseintele võib kinnitada filterpaberi ribad, mis ulatuvad eluendini. See vähendab ilmutusaega ligikaudu kolmandiku võrra ning komponentide elueerumine on ühtlasem ja korrapärasem. Märkus 3. Täielikult korratavate elueerimistingimuste saavutamiseks tuleb igaks katseks võtta uus ilmutussegu. 5.2.3. Valmistatakse umbes 5 % seebistumatute komponentide kloroformilahus (5.1.5) ning 100 μl mikrosüstlaga tõmmatakse 300 μl kromatograafiaplaadile (5.2.1) umbes 2 cm kaugusele plaadi servast võimalikult õhuke ja ühtlane viir. 2–3 μl sterooli võrdluslahust (4.11) asetatakse samale joonele plaadi ühte serva nii, et steroolivööndit oleks võimalik pärast ilmutamist identifitseerida. 5.2.4. Vastavalt punktile 5.2.2 ettevalmistatud plaat asetatakse ilmutusnõusse. Temperatuuri tuleks hoida vahemikus 15–20 oC. Ilmutusnõu suletakse kohe kaanega ning plaadil lastakse elueeruda, kuni lahusti serv ulatub umbes 1 cm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse ilmutusnõust välja ning lahusti aurustatakse kuuma õhu voolus või jättes selle lühikeseks ajaks ilma katteta. 5.2.5. Plaati pritsitakse kergelt ja ühtlaselt 2,7-diklorofluorestseiini lahusega. Kui plaati vaadeldakse ultraviolettvalguses, on sterooli vööndit võimalik identifitseerida selliselt, et see on samas kohas kui võrdluslahuse vöönd. Vööndi piirid märgitakse musta pliiatsiga mööda fluorestsentsi servi. 5.2.6. Metallspaatliga kraabitakse märgistatud alalt maha silikageel. Eemaldamisel saadav hästi peenestatud materjal pannakse filterlehtrisse (3.7). Lisatakse 10 ml kuuma kloroformi, segatakse hoolikalt metallist spaatliga ning filtreeritakse vaakumi all, seejärel kogutakse filtraat filterlehtriga ühendatud Erlenmeyeri kolbi (3.8). Jääki pestakse lehtris kolm korda dietüüleetriga (iga kord umbes 10 ml) ning filtraat kogutakse samasse lehtriga ühendatud kolbi. Filtraat aurustatakse ligikaudu 4–5 ml mahuni ning jääklahus valatakse enne kaalutud 10 ml katseklaasi (3.9), seejärel aurustatakse madala kuumutamise teel õrna lämmastiku voolu all kuivaks, täidetakse uuesti paari tilga atsetooniga, aurustatakse taas kuivaks ning asetatakse umbes 10 minutiks ahju temperatuurile 105 oC, lastakse eksikaatoris jahtuda ning kaalutakse. Katseklaasis olev jääk koosneb sterooli fraktsioonist.

5.3. Trimetüülsilüüleetrite ettevalmistamine. 5.3.1. Katseklaasis olevale steroolifraktsioonile lisatakse 50 μl igas katseklaasis oleva sterooli milligrammi kohta silüüliv reagent, mis koosneb mahus 9: 3: 1 (V/V/V) püridiini, heksametüüldisilasaani ja trimetüülklorosilaani segust (märkus 4), selliselt, et niiskus ei pääseks ligi (märkus 5). Märkus 4. Müügil on kasutusvalmid lahused. Müügil on ka muud silüülivad reagendid, näiteks bis-trimetüülsilüültrifluoratsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaan, mida tuleb lahjendada sama mahu veevaba püridiiniga. 5.3.2. Katseklaas suletakse punniga, loksutatakse hoolikalt (ilma et see ümber läheks), kuni steroolid on täielikult lahustunud. Lastakse ümbritseva õhu temperatuuril vähemalt 15 minutit seista ning seejärel tsentrifuugitakse paar minutit. Selge lahus on gaasikromatograafiliseks analüüsiks valmis. Märkus 5. Kerge opalestsentsi tekkimine on tavaline ning ei sega. Valge helbelise massi tekkimine või roosa värvuse ilmumine on niiskuse esinemise või reaktiivi halvenemise märgiks. Nende esinemise korral tuleb katset korrata.

5.4. Gaasikromatograafiline analüüs. 5.4.1. Eeltoimingud, kolonnide täitmine. 5.4.1.1. Kolonn pannakse gaasikromatograafi, sisselaskepunkt ühendatakse aurustiga, mis on seotud jaotussüsteemiga, ning väljalaskepunkt ühendatakse detektoriga. Tehakse gaasikromatograafi üldine kontroll (lekked gaasiliidetes, detektori, jaotussüsteemi ja registreerimissüsteemi toimimine jne). 5.4.1.2. Kui kolonni kasutatakse esimest korda, on soovitav see ette valmistada. Kolonni lastakse kerge gaasivool, seejärel lülitatakse tööle gaasikromatograaf ning alustatakse järkjärgulist kuumutamist temperatuurini, mis on vähemalt 20 oC võrra kõrgem kui töötemperatuur (märkus 6). Seda temperatuuri hoitakse vähemalt kaks tundi, seejärel pannakse terve seade tööasendisse (gaasi juurdevoolu ja jaotumise reguleerimine, leegi süütamine, elektrilise meerikuga ühendamine, kolonnahju, detektori ja injektori temperatuuri kohandamine jne) ning signaali tundlikkus reguleeritakse vähemalt kaks korda suuremaks, kui analüüsiks tegemiseks kavandatud. Tekkiv nulljoon peab olema lineaarne, ilma igasuguste piikideta, ja see ei tohi triivida. Negatiivne sirgjooneline triiv osutab lekkele kolonniühendustes. Positiivne triiv osutab kolonni puudulikule ettevalmistamisele. Märkus 6. Ettevalmistamisel on temperatuur kasutatava vedelfaasi maksimaalsest temperatuurist vähemalt 20 oC madalam. 5.4.2. Töötingimuste valik. 5.4.2.1. Töö põhitingimused on järgmised: — kolonni temperatuur: 260 ± 5 oC, — aurusti temperatuur: 280 oC, — detektori temperatuur: 290 oC, — kandegaasi voolukiirus: heelium 20–35 cm/s, vesinik 30–50 cm/s, — jaotussuhe: 1: 50 — 1: 100, — seadme tundlikkus: 4–16-kordne minimaalne sumbumine, — registreerimise tundlikkus: 1–2 mV fs, — paberi kiirus: 30–60 cm/h, — süstitava aine kogus 0,5–1 μl TMSE lahust. Olenevalt kolonni ja gaasikromatograafi karakteristikutest võib neid tingimusi muuta, nii et kromatogrammid vastaksid järgmistele nõuetele: — β-sitosterooli peetumisaeg peaks olema 20 ± 5 minutit, — kampesterooli piik peaks olema: oliiviõli puhul (keskmine sisaldus 3 %) 15 ± 5 % kogu mõõtepiirkonnast; sojaõli puhul (keskmine sisaldus 20 %) 80 ± 10 % kogu mõõtepiirkonnast, — kõik olemasolevad steroolid peavad olema eraldatud. Lisaks sellele peavad piigid olema ka täielikult eraldunud, see tähendab, et piigi jälg peab enne järgmise piigi juurde liikumist minema tagasi piigi nulljoonele. Puudulik resolutsioon on siiski lubatud tingimusel, et piiki on TRR 1,02 juures võimalik mõõta risti. 5.4.3. Analüüsi käik. 5.4.3.1. 10 μl mikrosüstlaga tõmmatakse 1 μl heksaani, seejärel 0,5 μl õhku ning lõpuks 0,5–1 μl proovilahust. Nõela kolbi tõstetakse veelgi nii, et nõel tühjendatakse. Nõel surutakse läbi injektorseadme kesta ning ühe või kahe sekundi pärast süstitakse kiiresti, seejärel tõmmatakse nõel umbes 5 sekundi pärast aeglaselt välja. 5.4.3.2. Jätkatakse registreerimist, kuni olemasolevate steroolide TMSE on täielikult elueeritud. Nulljoon peab vastama nõuetele (5.4.1.2). 5.4.4. Piigi määramine. Piigid määratakse peetumisaja põhjal ning samadel tingimusel analüüsitud steroolide TMSE segudega võrdlemise teel. Steroolid elueeritakse sellises järjekorras: kolesterool, brassikasterool, 24-metüleenkolesterool, kampesterool, kampestanool, stigmasterool, Δ-7-kampesterool, Δ-5,23-stigmastadienool, klerosterool, β-sitosterool, sitostanool, Δ-5-avenasterool, Δ-5,24-stigmastadienool, Δ-7-stigmastenool, Δ-7-avenasterool. Sitosterooli peetumisajad SE-52 ja SE-54 kolonnide puhul on esitatud tabelis 1. Joonised 1 ja 2 kirjeldavad mõnede õlide tüüpilisi kromatogramme. 5.4.5. Kvantitatiivne hindamine. 5.4.5.1. β-kolestanooli ja steroolipiikide pindala arvutatakse integraatoriga. Välja tuleb jätta nende ühendite piigid, mida ei ole tabelis 1 loetletud. β-kolestanooli kalibreerimistegur peab olema 1. 5.4.5.2. Iga sterooli kontsentratsioon milligrammides 100 g rasvaine kohta arvutatakse järgmiselt: kus Ax = sterooli x piigipindala ►M6 ————— ◄ ; As = α-kolestanooli piigipindala ►M6 ————— ◄ ; ms = lisatud α-kolestanooli mass (mg); m = määramisel kasutatud proovi mass grammides.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

6.1 Registreeritakse sterooli kontsentratsioonid milligrammides 100 g rasvaine kohta ning nende summa steroolide üldsisaldusena.

Iga sterooli protsent arvutakse vastava piigipindala ja steroolide piikide kogupindala suhtena.

kus

Ax = x'i piigi pindala;

ΣA = steroolide piigipindala kokku.









LIIDE

Gaasi voolukiiruse määramine

Normaalsetel töötingimustel gaasikromatograafi süstitakse 1–3 ml metaani (või propaani) ja mõõdetakse aeg, mis kulub gaasi voolamiseks läbi kolonni alates süstimisest kuni piigi ilmumiseni (tM).

Voolukiirus cm/S on esitatud valemiga L/tM, kus L on kolonni pikkus sentimeetrites ja tM on mõõdetud aeg sekundites.







Tabel 1 Steroolide suhtelised peetumisajad Piik Identifitseerimine Suhteline peetumisaeg SE 54 kolonn SE 52 kolonn 1 kolesterool Δ-5-kolesteen-3β-ool 0,67 0,63 2 kolestanool 5α-kolestaan-3β-ool 0,68 0,64 3 brassikasterool [24S]-24-metüül-Δ- 5,22-kolestadieen-3β-ool 0,73 0,71 4 24-metüleen-kolesterool 24-metüleen-Δ-5,24-kolesteen-3β-ool 0,82 0,80 5 kampesterool [24R]-24-metüül-Δ-5-kolestadieen-3β-ool 0,83 0,81 6 kampestanool [24R]-24-metüül-kolestaan-3β-ool 0,85 0,82 7 stigmasterool [24R]-24-etüül-Δ-5,22-kolestadieen-3β-ool 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterool [24R]-24-metüül-Δ-7-kolesteen-3β-ool 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stitmastadienool [24S, R]-24-etüül-Δ-5,23-kolestadieen-3β-ool 0,95 0,95 10 klerosterool [24S]-24-etüül-Δ-5,25-kolestadieen-3β-ool 0,96 0,96 11 β-sitosterool [24R]-24-etüül-Δ-5-kolestaan-3β-ool 1,00 1,00 12 sitostanool 24-etüül-kolestaan-3β-ool 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterool [24R]-24-etülideen-5-kolesteen-3β-ool 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stitmastadienool [24R, S]-24-etüül-Δ-5,24-kolestadieen-3β-ool 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenool [24R, S]-24-etüül-Δ-7,24-kolestadieen-3β-ool 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterool [24Z]-24-etülideen-Δ-7-kolesteen-3β-ool 1,16 1,16

Joonis 1

Rafineerimata oliiviõli sterooli fraktsiooni gaasikromatogramm

Joonis 2

Rafineeritud oliiviõli sterooli fraktsiooni gaasikromatogramm









VI LISA

ERÜTRODIOOLI JA UVALOOLI MÄÄRAMINE

SISSEJUHATUS

Erütrodiool (üldiselt mõeldakse selle all koos glükoole erütrodiool ja uvalool) on mõnele rasvainele iseloomulik seebistumatu fraktsiooni komponent. Erütrodiooli leidub ekstraheeritud oliiviõlis märkimisväärselt suuremas kontsentratsioonis kui teistes erütrodiooli sisalduvates õlides (pressitud oliiviõli ja viinamarjaseemneõli, jne) ning seetõttu võib selle esinemine osutada sellele, et lisatud on ekstraheeritud oliiviõli.

1. KOHALDAMISALA

Käesolev meetod kirjeldab erütrodiooli määramist rasvainetes.

2. PÕHIMÕTE

Rasvaine seebistatakse etanoolilahuses kaaliumhüdroksiidiga. Mitteseebistuvad fraktsioonid ekstraheeritakse dietüüleetriga ja puhastatakse läbi alumiiniumoksiidi kolonni juhtimise teel.

Seebistumatutele komponentidele tehakse silikageeli plaadil planaarkromatograafia, kuni sterooli ja erütrodiooli fraktsioonide vööndid on eraldunud. Plaadilt saadud steroolid ja erütrodiool muundatakse trimetüülsilüüleetriteks ning seda segu analüüsitakse gaasikromatograafiliselt.

Tulemus väljendatakse erütrodiooli protsendina erütrodiooli ja steroolide segus.

3. SEADMED

3.1. V lisas (steroolide sisalduse määramine) kirjeldatud seadmed.

4. REAKTIIVID

4.1. V lisas (steroolide sisalduse määramine) kirjeldatud reaktiivid.

4.2. Erütrodiooli standardlahus, 0,5 % lahus kloroformis.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Mitteseebistuvate komponentide ettevalmistamine.

Nagu V lisa lõikes 5.1.2 kirjeldatud.

5.2. Erütrodiooli ja steroolide eraldamine.

5.2.1. Vaata V lisa lõiget 5.2.1.

5.2.2. Vaata V lisa lõiget 5.2.2.

5.2.3. Valmistatakse seebistumatute komponentide 5 % kloroformilahus. 0,1 ml mikrosüstlaga tõmmatakse 0,3 ml kromatograafiaplaadile umbes 1,5 cm kaugusele plaadi alumisest servast võimalikult õhuke ja ühtlane viir. Ühele plaadiservale pannakse võrdluseks mõned mikroliitrid kolesterooli ja erütrodiooli lahust.

5.2.4. Vastavalt punktile 5.2.1 ette valmistatud plaat pannakse ilmutusnõusse. Ümbritseva õhu temperatuur peaks olema umbes 20 oC. Ilmutusnõu suletakse kohe kaanega ning plaadil lastakse elueerida, kuni lahusti serv ulatub umbes 1 cm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse ilmutusnõust välja ning lahusti aurustatakse kuuma õhu voolus.

5.2.5. Plaati pritsitakse kergelt ja ühtlaselt 2,7-diklorofluorestseiini lahusega. Kui plaati vaadeldakse ultraviolettvalguses, on sterooli ja erütrodiooli vööndit võimalik identifitseerida selliselt, et see on samas kohas kui võrdluslahuste vööndid. See vöönd tähistatakse täpiga vahetult fluorestsentsi piiridest väljapool.

5.2.6. Metallspaatliga kraabitakse märgistatud alalt maha silikageel. Plaadilt saadud materjal pannakse 50 ml kolbi. Lisatakse 15 ml kuuma kloroformi, loksutatakse hoolikalt ning filtreeritakse läbi lehtri, millel on paagutatud klaasketas nii, et silikageel jääb filtrisse. Pestakse kolm korda kuuma kloroformiga (iga kord 10 ml) ning filtraat kogutakse 100 ml kolbi. Filtraat aurustatakse ligikaudu 4–5 ml mahuni ning valatakse 10 ml tsentrifuugiküvetti, seejärel kuivatatakse õrna lämmastiku voolu all ning kaalutakse.

5.3. Trimetüülsilüülestrite valmistamine

Nagu V lisa lõikes 5.3 kirjeldatud.

5.4. Gaasikromatograafiline analüüs

Nagu V lisa punktis 5.4 kirjeldatud. Gaasikromatograafilise analüüsi tegemise tingimused peavad olema sellised, et need võimaldavad läbi viia sterooli analüüsi ning eraldada TMSE erütrodioolist ja uvaloolist.

Kui proov on injekteeritud, jätkatakse registreerimist, kuni proovis olevad steroolid, erütrodiool ja uvalool on elueeritud. Seejärel tehakse kindlaks piigid (erütrodiooli ja uvalooli peetumisajad on suhtes β-sitosterooliga vastavalt 1,45 ja 1,55) ning piigipindala arvutatakse nagu steroolide puhul.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

kus

A1 = erütrodiooli piigipindala ►M6 ————— ◄ ;

A2 = uvalooli piigipindala ►M6 ————— ◄ ;

Σ Asteroolid = steroolide piigipindala kokku ►M6 ————— ◄ .

Tulemus väljendatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

▼M21









VII LISA

2-GLÜTSERÜÜLMONOPALMITAADI PROTSENDILISE SISALDUSE MÄÄRAMINE

1. EESMÄRK JA RAKENDAMISALA

Käesoleva meetodiga määratakse triglütseriidide 2. positsioonis oleva palmitiinhappe protsendilist sisaldust 2-glütserüülmonopalmitaadi hindamise abil.

Seda meetodit saab kasutada toatemperatuuril (20 °C) vedelate taimeõlide puhul.

2. PÕHIMÕTE

Pärast õliproovi ettevalmistamist lastakse proovil reageerida pankrease lipaasiga – toimub triglütseriidi molekuli spetsiifiline osaline hüdrolüüs 1. ja 3. positsioonis, mille tulemusena tekivad 2-monoglütseriidid. 2-glütserüülmonopalmitaadi sisaldus monoglütseriidi fraktsioonis määratakse pärast silaanimist kapillaarkolonn-gaasikromatograafia abil.

3. KASUTATAVAD SEADMED JA MATERJALID

3.1. 25milliliitrine Erlenmeyeri kolb

3.2. 100-, 250- ja 300milliliitrised keeduklaasid

3.3. Klaasist kromatograafiakolonn sisediameetriga 21–23 mm ja pikkusega 400 mm, mis on varustatud klaasfilterketta ja kraaniga

3.4. Gradueeritud 10-, 50-, 100- ja 200milliliitrised mõõtesilindrid

3.5. 100- ja 250milliliitrised ümarkolvid

3.6. Pöördaurusti

3.7. 10milliliitrised lihvkorgiga tsentrifuugitopsid, millel on kooniline põhi

3.8. Tsentrifuug tööks 10- ja 100milliliitriste tsentrifuugitopsidega

3.9. Termostaat, mis võimaldab hoida temperatuuri 40 ± 0,5 °C

3.10. Gradueeritud 1- ja 2milliliitrised pipetid

3.11. 1milliliitrine hüpodermiline süstal

3.12. 100mikroliitrine mikrosüstal

3.13. 1 000 milliliitrine jaotuslehter

3.14. Kapillaarkolonniga gaasikromatograaf, mis on varustatud süsteemiga, mis võimaldab proovi otse külmalt kolonni süstimist, ja ahjuga, mis hoiab soovitud temperatuuri 1 °C täpsusega

3.15. Külminjektor proovi viimiseks otse kolonni

3.16. Leekionisatsioondetektor ja elektromeeter

3.17. Koos elektromeetriga kasutatav integraatormeerik, mille reageerimisaeg on kuni 1 sekund ning mille paberi kiirust saab muuta

3.18. Klaasist või sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonn pikkusega 8–12 m ja sisediameetriga 0,25–0,32 mm, mis sobib tööks kuni 370 °C juures ja mis on seestpoolt kaetud 5 % metüülpolüsiloksaani või fenüül-metüülpolüsiloksaani kihiga, mille paksus on 0,10–0,30 μm

3.19. Vähemalt 7,5 cm pikkune 10mikroliitrine mikrosüstal otse kolonni süstimiseks, mille nõelal on tugevdatud pinnakiht

4. REAKTIIVID

4.1. Silikageel tera suurusega 0,063–0,200 mm (sõelaava 70–280), mis on ette valmistatud järgmisel viisil. Silikageel pannakse portselankaussi, kuivatatakse kuivatuskapis 160 °C juures 4 tundi, lastakse eksikaatoris jahtuda toatemperatuurini. Lisatakse vett koguses, mis vastab 5 % le silikageeli massist, tehes seda järgmisel viisil: 500milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi kaalutakse 152 g silikageeli ja lisatakse 8 g destilleeritud vett, suletakse korgiga ja segatakse ettevaatlikult, et tagada vee ühtlane jaotumine. Enne kasutamist lastakse seista vähemalt 12 tundi.

4.2. n-heksaan, kromatograafias kasutamiseks

4.3. Isopropanool

4.4. Isopropanooli vesilahus (mahusuhe 1:1)

4.5. Pankrease lipaas. Kasutatava lipaasi aktiivsus peab olema vahemikus 2,0–10 lipaasiühikut mg kohta (müügilolevate lipaaside aktiivsus on 2–10 ühikut ensüümi mg kohta)

4.6. Puhverlahus: 1 M tris-hüdroksümetüülaminometaani lahuse pH reguleeritakse potentsiomeetriga kontrollides väärtusele 8, lisades selleks kontsentreeritud soolhapet (mahusuhe 1:1)

4.7. Naatriumkolaat, ensüümikvaliteediga, 0,1 % vesilahus (lahus tuleb ära kasutada 15 päeva jooksul pärast valmistamist)

4.8. Kaltsiumkloriid, 22 % vesilahus

4.9. Dietüüleeter, kromatograafias kasutamiseks

4.10. Elueerimislahus: n-heksaani ja dietüüleetri segu (mahusuhe 87:13)

4.11. Naatriumhüdroksiid, 12massiprotsendiline lahus

4.12. Fenoolftaleiin, 1 % lahus etanoolis

4.13. Kandegaas: vesinik või heelium gaasikromatograafias kasutamiseks

4.14. Abigaasid: kuiv vesinik, vähemalt 99 % puhtusega, ei tohi sisaldada orgaanilisi aineid; õhk kromatograafias kasutamiseks, sama puhtusastmega

4.15. Silaanimisreaktiiv: püridiini, heksametüüldisilasaani ja trimetüülklorosilaani segu (mahusuhe 9:3:1). (Müügil on vastavad valmissegud. Kasutada võib ka muid silaanimisreaktiive, näiteks bistrimetüülsilüültrifluoroatsetamiid + 1 % trimetüülklorosilaani, mis on lahustatud samas koguses veevabas püridiinis.)

4.16. Standardproovid: puhtad monoglütseriidid või proovile sarnaste mahusuhetega monoglütseriidide segud, mille teadaolevad mahusuhted on samad kui proovil.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Proovi ettevalmistamine

5.1.1. Õlisid, milles vabade hapete sisaldus on alla 3 %, ei ole vaja neutraliseerida enne kromatografeerimist silikageelkolonnis. Õlid, mille vabade hapete sisaldus on suurem kui 3 %, tuleb neutraliseerida vastavalt punktile 5.1.1.1. 5.1.1.1. 1 000 milliliitrisesse jaotuslehtrisse (3.13) kallatakse 50 g õli ja 200 ml n-heksaani. Lisatakse 100 ml isopropanooli ja selline kogus 12 % naatriumhüdroksiidi (4.11), mis on 5 % suurem kui vabade hapete kogus õlis. Loksutatakse tugevasti 1 minuti jooksul. Lisatakse 100 ml destilleeritud vett, loksutatakse uuesti ja lastakse seista. Pärast kihistumist eemaldatakse alumine kiht, mis sisaldab seepe. Eemaldatakse ka võimalikud vahepealsed kihid (lima ja mittelahustuvad ained). Neutraliseeritud õli lahust heksaanis pestakse järjestikuste 50–60milliliitriste isopropanooli vesilahuse (mahusuhe 1:1) (4.4) kogustega kuni fenoolftaleiini roosa värvuse kadumiseni. Vaakumdestilleerimisega (näiteks pöördaurusti abil) eemaldatakse suurem osa heksaanist ja õli kantakse üle 100milliliitrisesse ümarkolbi (3.5). Õli kuivatatakse vaakumis kuni lahusti täieliku eemaldamiseni. Selle toimingu tulemusena peab õli happelisus jääma alla 0,5 %.

5.1.2. 1,0 g eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud õli pannakse 25milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) ja lahustatakse 10 ml elueerimislahuses (4.10). Enne kromatografeerimist silikageelkolonnis lastakse lahusel vähemalt 15 minutit seista. Kui lahus on hägune, tsentrifuugitakse see, et luua optimaalsed tingimused kromatograafia jaoks. (On lubatud kasutada müügilolevaid valmis SPE silikageelipadruneid (500 mg)).

5.1.3. Kromatograafiakolonni valmistamine Kolonni (3.3) kallatakse ligikaudu 30 ml elueerimislahust (4.10), kolonni alumisse otsa viiakse klaaspulga abil vatitükk ja pressitakse seda õhu eemaldamiseks. Keeduklaasis valmistatakse suspensioon 25 g silikageelist (4.1) ja ligikaudu 80 ml elueerimislahusest; suspensioon kallatakse lehtri abil kolonni. Kontrollitakse, et kogu silikageel oleks viidud kolonni, loputatakse seda elueerimislahusega (4.10), avatakse kraan ja lastakse vedelikul voolata, kuni silikageeli kohale jääb ligikaudu 2 mm vedelikku.

5.1.4. Kolonnkromatograafia 25 milliliitrisesse Erlenmeyeri kolbi (3.1) kaalutakse täpselt 1,0 g punkti 5.1 kohaselt ettevalmistatud proovi. Proov lahustatakse 10 ml elueerimislahuses (4.10). Lahus kantakse üle punkti 5.1.3 kohaselt valmistatud kromatograafiakolonni. Tuleb vältida kolonnitäidise pinna liigutamist. Avatakse kraan ja proovi lahusel lastakse välja voolata seni, kuni tase jõuab silikageeli tasemeni. Elueeritakse 150 ml elueerimislahusega. Elueerimislahust lisatakse kiirusega 2 ml/min (150 ml lisamine kolonni võtab aega ligikaudu 60–70 min). Eluaat kogutakse eelnevalt kaalutud 250milliliitrisesse ümarkolbi. Lahusti aurustatakse vaakumis, viimased lahusti jäljed eemaldatakse lämmastikuvoolus. Ümarkolb kaalutakse ja arvutatakse eraldatud aine kogus. (Juhul kui kasutatakse müügilolevaid valmis SPE silikageelipadruneid, toimitakse järgmiselt: 1 ml lahust (5.1.2) viiakse padrunitesse, mis on eelnevalt ette valmistatud 3 ml n-heksaaniga. Pärast lahuse nõrgumist kolonni elueeritakse 4 ml n-heksaani-dietüüleetri lahusega (mahusuhe 9:1). Eluaat kogutakse 10milliliitrisesse katseklaasi ja aurustatakse lämmastikuvoolus kuivaks. Kuivaine hüdrolüüsitakse pankrease lipaasiga (5.2). Oluline on kontrollida rasvainete sisaldust enne ja pärast SPE-padruni kasutamist).

5.2. Hüdrolüüs pankrease lipaasiga

5.2.1. Tsentrifuugitopsi kaalutakse 0,1 g punkti 5.1 kohaselt ettevalmistatud proovi. Lisatakse 2 ml puhverlahust (4.6), 0,5 ml naatriumkolaadi lahust (4.7) ja 0,2 ml kaltsiumkloriidi lahust; pärast iga lahuse lisamist segatakse hoolikalt. Tops suletakse lihvkorgiga ja asetatakse termostaati temperatuuriga 40 + 0,5 °C.

5.2.2. Lisatakse 20 mg lipaasi, segatakse hoolikalt (vältides korgi kokkupuutumist lahusega) ning asetatakse tops täpselt 2 minutiks termostaati, seejärel võetakse see termostaadist välja, loksutatakse tugevasti täpselt ühe minuti jooksul ning lastakse jahtuda.

5.2.3. Lisatakse 1 ml dietüüleetrit, suletakse tops korgiga ja loksutatakse tugevasti, seejärel segu tsentrifuugitakse ning eetrilahus kantakse mikrosüstla abil puhtasse ja kuiva topsi.

5.3. Silaanitud ühendite valmistamine ja gaasikromatograafia

5.3.1. Mikrosüstla abil viiakse 100 μl lahust (5.2.3) 10milliliitrisesse koonilise põhjaga topsi.

5.3.2. Lahusti eemaldatakse nõrga lämmastikuvoolu all, lisatakse 200 μl silaanimisreaktiivi (4.15), tops suletakse korgiga ja lastakse seista 20 minuti jooksul.

5.3.3. 20 minuti pärast lisatakse 1–5 ml n-heksaani (sõltuvalt kromatograafia läbiviimise tingimustest) – saadav lahus on valmis gaasikromatograafia läbiviimiseks.

5.4. Gaasikromatograafia

Töö põhitingimused on järgmised:

— injektori (on-column-injektor) temperatuur on madalam lahusti keemistemperatuurist (68 °C);

— detektori temperatuur: 350 °C;

— kolonni temperatuur: ahju temperatuuri muudetakse järgmise programmi kohaselt: 60 °C 1 minuti jooksul, temperatuuri tõstetakse 15 °C minutis kuni temperatuurini 180 °C, seejärel 5 °C minutis kuni temperatuurini 340 °C, 340 °C 13 minuti jooksul;

— kandegaas: vesinik või heelium, mille lineaarkiirust reguleeritakse nii, et saada joonisel 1 kujutatud lahutus; triglütseriidi C54 retentsiooniaeg peab olema 40 + 5 minutit (vt joonis 2); (Need töö põhitingimused on ligikaudsed. Töö teostaja peab neid soovitud tulemuste saamiseks kohandama. 2-glütserüülmonopalmitaadi piigi kõrgus peab olema vähemalt 10 % registreerimisseadme skaala ulatusest.);

— kolonni süstitava aine kogus on 0,5–1 μl n-heksaani lahust (5 ml) (5.3.3).

5.4.1. Piikide määramine

Piigid määratakse retentsiooniaja põhjal, võrdlusest samadel tingimusel analüüsitud monoglütseriidide standardsegude puhul saadud tulemustega.

5.4.2. Kvantitatiivne hindamine

Elektroonilise integraatori abil leitakse iga piigi pindala.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

Glütserüülmonopalmitaadi protsendiline sisaldus arvutatakse vastava piigi pindala ja monoglütseriidide piikide kogupindala suhtena (vt joonis 2) vastavalt järgmisele valemile:

Gycéril monopalmitate (%):

kus:

Ax = glütserüülmonopalmitaadi piigi pindala;

ΣA = monoglütseriidide piikide kogupindala.

Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

7. ANALÜÜSI PROTOKOLL

Analüüsi protokollis tuleb esitada järgmine teave:

— viide käesolevale meetodile;

— kogu teave, mis on vajalik proovi täielikuks identifitseerimiseks;

— analüüsi tulemus;

— kõik kõrvalekaldumised käesolevast meetodist, kas asjaomaste poolte kokkuleppe tõttu või muudel põhjustel;

— andmed laboratooriumi kohta, analüüsi läbiviimise kuupäev ja analüüsi läbiviimise eest vastutavate isikute allkirjad.

Joonis 1

Silaanimisreaktsiooni saaduste kromatogramm (rafineeritud oliiviõlile on lisatud 20 % täielikult esterdatud õli, segu on töödeldud lipaasiga ja reaktsioonisaadused on silaanitud)

Kirjad joonisel: Acides gras libres = vabad rasvhapped Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = rafineeritud oliiviõli + 20 % esterdatud õli 1–2 monopalmitoléine = 1–2 monopalmitoleiin 1–2 monopalmitine = 1–2 monopalmitiin 1–2 monoC18 insat. = 1–2 monoC18 küllastamata Squalene = skvaleen]

Joonis 2

Kromatogramm:

A) esterdamata oliiviõli pärast lipaasiga töötlemist; pärast silüülimist; kõnealuste tingimuste juures (kapillaarkolonni pikkus 8–12 m) elueeritakse vahafraktsioon samaaegselt diglütseriidi fraktsiooniga või veidi hiljem. Pärast lipaasiga töötlemist ei tohi triglütseriidide sisaldus ületada 15 %. Tähistused: 1 = vabad rasvhapped 2 = monoglütseriidid 3 = diglütseriidid 4 = triglütseriidid * = 2-monopalmitiin ** = triglütseriid C54

Kromatogramm:

B) esterdatud õli pärast lipaasiga töötlemist; pärast silaanimist; kõnealuste tingimuste juures (kapillaarkolonni pikkus 8–12 m) elueeritakse vahafraktsioon samaaegselt diglütseriidi fraktsiooniga või veidi hiljem. Pärast lipaasiga töötlemist ei tohi triglütseriidide sisaldus ületada 15 %. Tähistused: 1 = vabad rasvhapped 2 = monoglütseriidid 3 = diglütseriidid 4 = triglütseriidid * = 2-monopalmitiin ** = triglütseriid C54

8. MÄRKUSED

LIPAASI VALMISTAMINE

Müügil on rahuldava aktiivsusega lipaase. Lipaasi saab valmistada ka laboris järgmisel viisil:

5 kg värsket seapankreast jahutatakse temperatuurini 0 °C. Eemaldatakse tahke rasvkude ja seda ümbritsev sidekude ning pankreas peenestatakse lõikenugadega peenestajas kuni ühtlase vedela massi saamiseni. Saadud massi segatakse 4–6 tunni jooksul 2,5 liitri veevaba atsetooniga, seejärel tsentrifuugitakse. Saadud jääki ekstraheeritakse veel kolm korda sama koguse veevaba atsetooniga, seejärel kaks korda sama koguse atsetooni/dietüüleetri seguga (mahusuhe 1:1) ning veel kaks korda dietüüleetriga.

Saadud jääki kuivatatakse 48 tunni jooksul vaakumis; tulemusena saadakse stabiilne pulber, mida on võimalik külmkapis kuivas pikemaajaliselt hoida.

LIPAASI AKTIIVSUSE KONTROLLIMINE

Valmistatakse oliiviõli emulsioon järgmisel viisil:

Mikseris segatakse 10 minuti jooksul järgmist segu: 165 ml kummiaraabiku lahust kontsentratsiooniga 100 g/l, 15 g purustatud jääd ja 20 ml eelnevalt neutraliseeritud oliiviõli.

50milliliitrisesse keeduklaasi viiakse 10 ml saadud emulsiooni, seejärel 0,3 ml naatriumkolaadi lahust kontsentratsiooniga 0,2 g/ml ja 20 ml destilleeritud vett.

Keeduklaas asetatakse termostaati temperatuuriga 37 °C, lahusesse viiakse pH-meetri elektroodid ja spiraalsegaja.

Büreti abil lisatakse tilkhaaval naatriumhüdroksiidi 0,1 N lahust, kuni pH saavutab väärtuse 8,3.

Lisatakse teatav kogus lipaasi suspensiooni vees (0,1 g/ml lipaasi). Kui pH-meeter näitab pH väärtust 8,3, käivitatakse stopper ja hakatakse tilkhaaval lisama naatriumhüdroksiidi lahust sellise kiirusega, et hoida pH-d väärtusel 8,3. Iga minuti möödudes märgitakse üles selleks kulunud lahuse kogus.

Andmed kantakse graafikule, võttes abstsissteljeks ajatelje ja kandes ordinaatteljele 0,1 N leelise lahuse kogused milliliitrites, mis on kulunud pH väärtuse hoidmiseks konstantsena. Graafik peab olema lineaarne.

Lipaasi aktiivsus, mida väljendatakse lipaasi ühikutes mg kohta, arvutatakse järgmise valemi abil:

kus:

A aktiivsus lipaasi ühikutes mg kohta;

V 0,1 N naatriumhüdroksiidi lahuse kulu milliliitrites minuti kohta (arvutatud graafiku alusel);

N naatriumhüdroksiidi lahuse normaalsus;

m prooviks võetud lipaasi mass, mg.

Lipaasi ühik on määratletud kui ensüümi kogus, mis vabastab 10 mikroekvivalenti hapet ühe minuti jooksul.

▼M20 —————

▼B









IX LISA

SPEKTROFOTOMEETRILINE ANALÜÜS ULTRAVIOLETTPIIRKONNAS

EESSÕNA

Spektrofotomeetriline analüüs ultraviolettpiirkonnas võib anda teavet rasva kvaliteedi, selle säilivuse ja tehnoloogilistest protsessidest tulenevate muutuste kohta.

Käesolevas meetodis kirjeldatud lainepikkustel esinev neeldumine on tingitud konjugeeritud dieeni ja trieeni süsteemide olemasolust. Need neeldumised on väljendatud eri-ekstinktsioonina E1 % 1 cm (ekstinktsioon, mis leiab aset teatud lahustist valmistatud 1protsendilise rasvalahuse 1 cm paksuses kihis), mida tavaliselt väljendatakse tähisega K (samuti tuntud ekstinktsiooni koefitsiendina).

1. KOHALDAMISALA

Käesolevas meetodis kirjeldatakse oliiviõli spektrofotomeetrilist analüüsi ultraviolettpiirkonnas.

2. PÕHIMÕTE

Rasv lahustatakse ettenähtud lahustis ja lahusti ekstinktsioon määratakse kindlaks teatud lainepikkusel kasutades võrdluslahusena puhast lahustit. Üksikekstinktsioonid arvutatakse spektrofotomeetri tulemuste põhjal.

3. VAHENDID

3.1. Spektrofotomeeter ekstinktsiooni mõõtmiseks ultraviolettpiirkonnas 220–360 nm vahel, mis võimaldaks tulemusi märkida ühe nanomeetri täpsusega.

3.2. Risttahukakujulised kaanega kvartsküvetid optilise pikkusega 1 cm. Vee või mõne muu sobiva lahustiga täitmise korral ei tohiks küvettide tulemuste erinevus olla suurem kui 0,01 ekstinktsiooniühikut.

3.3. 25 ml mõõtekolvid.

▼M6

3.4. Kromatograafia kolonn, mille ülemise osa pikkus on 270 mm ja läbimõõt 35 mm ning alumise osa pikkus 270 mm ja läbimõõt ligikaudu 10 mm.

▼B

4. REAKTIIVID

4.1. Spektrofotomeetriliselt puhas iso-oktaan (2,2,4-trimetüülpentaan). Võrreldes destilleeritud veega peab selle läbitustegur olema vähemalt 60 % 220 nm juures ja mitte alla 95 % 250 nm juures, või — spektrofotomeetriliselt puhas tsükloheksaan: võrreldes destilleeritud veega peab selle läbitustegur olema vähemalt 40 % 220 nm juures ja mitte alla 95 % 250 nm juures. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Aluseline alumiiniumoksiid kolonnkromatograafia jaoks, mis on valmistatud ja kontrollitud, nagu I liites kirjeldatud.

4.3. n-heksaan kromatograafia jaoks.

5. TÖÖ KÄIK

5.1. Kõnealune proov peab olema täiesti homogeenne ja heljuvate lisanditeta. Ümbritseva õhu temperatuuril vedelad õlid filtreeritakse läbi paberi temperatuuril ligikaudu 30 oC, tahked rasvad homogeniseeritakse ja filtreeritakse temperatuuril, mis võib olla rasva sulamistemperatuurist kuni 10 oC kõrgem.

5.2. 25 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,25 g eespool kirjeldatud viisil ettevalmistatud proovi, täidetakse kuni märgini ettenähtud lahustiga ning homogeniseeritakse. Tekkiv lahus peab olema täiesti selge. Opalestsentsi või hägususe korral tuleb proov kiiresti läbi paberi filtreerida.

5.3. Küvett täidetakse saadud lahusega ning ekstinktsioonid mõõdetakse nõutavatel lainepikkustel vahemikus 232–276 nm, kasutades selleks võrdluslahustina kasutatud lahustit. Registreeritud ekstinktsiooniväärtused peavad jääma vahemikku 0,1–0,8. Vastasel korral tuleb mõõtmisi korrata ja kasutada vajaduse korral suurema kontsentratsiooniga või rohkem lahjendatud lahuseid.

5.4. Kui pärast alumiiniumoksiidiga töötlemist on vaja määrata konkreetne ekstinktsioon, tehakse seda järgmiselt. Kromatograafia kolonni pannakse 30 grammi aluselist alumiiniumoksiidi heksaani suspensioonis. Pärast adsorbendi settimist eemaldatakse üleliigne heksaan selliselt, et seda on alumiiniumoksiidi peal umbes 1 cm. 10 g rasva, mis on punktis 5.1 kirjeldatud viisil homogeniseeritud ja filtreeritud, lahustatakse 100 ml heksaanis ning lahus valatakse kolonni. Eluaat kogutakse kokku ning lahusti aurustatakse vaakumi all temperatuuril alla 25 oC. Saadud rasva kasutades järgitakse punktis 5.2 kirjeldatud korda.

6. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

6.1. Registreeritakse individuaalsed ekstinktsioonid (ekstinktsiooni koefitsiendid) eri lainepikkustel, mis arvutatakse järgmise valemi alusel: kus Kλ = on konkreetne ekstinktsioon lainepikkuselλ; Eλ = on ekstinktsioon lainepikkusel λ; c = on lahuse kontsentratsioon g/100 ml; s = küveti paksus (cm). Tulemused väljendatakse kahe kümnendikkoha täpsusega.

6.2. Oliiviõli spektrofotomeetriline analüüs kooskõlas EMÜ ametliku meetodiga näeb ette konkreetse ekstinktsiooni määramise iso-oktaani lahuses lainepikkusel 232 ja 270 nm ning K määramist järgmise valemiga: kus Km on konkreetne ekstinktsioon lainepikkusel m, maksimaalse neeldumise lainepikkus on umbes 270 nm.









I LIIDE

Alumiiniumoksiidi ettevalmistamine ja selle aktiivsuse kontrollimine

A.1.1. Alumiiniumoksiidi ettevalmistamine

Ahjus temperatuuril 380–400 °C kolm tundi enne kuivatatud alumiiniumoksiid asetatakse hermeetiliselt suletavasse mahutisse, lisatakse destilleeritud vett 5 ml iga 100 g alumiiniumoksiidi kohta, seejärel suletakse mahuti kohe, loksutatakse korduvalt ning lastakse enne kasutamist vähemalt 12 tundi seista.

A.1.2. Alumiiniumoksiidi aktiivsuse kontrollimine

30 grammi alumiiniumoksiidiga valmistatakse ette kromatograafia kolonn. Toimitakse, nagu lõikes 5.4 kirjeldatud, ning läbi kolonni lastakse segu, mis koosneb:

— 95 % neitsioliiviõlist, mille konkreetne ekstinktsioon on 268 nm juures alla 0,18,

— 5 % maapähkliõlist, mida on rafineerimise ajal aktiivmullaga töödeldud ja mille konkreetne ekstinktsioon on 268 nm

jooksul mitte vähem kui 4.

Kui segu konkreetne ekstinktsioon on pärast kolonni läbimist 268 nm juures üle 0,11, on alumiiniumoksiid sobiv, kui ei, tuleb dehüdraatimise taset suurendada.









II LIIDE

Spektrofotomeetri kalibreerimine

A.2. Seadmeid tuleb korrapäraselt (vähemalt iga kuue kuu järel) kontrollida nii lainepikkuse vastavuse kui täpsuse suhtes.

A.2.1. Lainepikkust võib kontrollida elavhõbe-kvartslambi või sobivate filtritega.

A.2.2. Fotoelemendi ja fotokordisti tulemusi kontrollitakse järgmiselt: 1 000 ml mõõtekolbi kaalutakse 0,2000 g puhast kaaliumkromaati, see lahustatakse 0,05 N kaaliumhüdroksiidi lahuses ning täidetakse kuni 1 000 ml märgini. Seejärel võetakse 25 ml saadud lahust, kantakse 500 ml mõõtekolbi, ning täidetakse sama kaaliumhüdroksiidi lahusega märgini. Saadud lahuse ekstinktsioon mõõdetakse 275 nm juures, kasutades võrdluslahusena kaaliumhüdroksiidi lahust. 1 cm küvetiga mõõtmisel peaks ekstinktsioon olema 0,200 ± 0, 5000.









X A LISA

RASVHAPETE METÜÜLESTRITE GAASIKROMATOGRAAFILINE ANALÜÜS

1. KOHALDAMISALA

Käesoleva meetodiga antakse üldjuhised täidetud või kapillaarkolonniga gaaskromatograafia kohaldamiseks kooskõlas X B lisaga saadud rasvhapete metüülestrite segu kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise kindlakstegemisel.

Seda meetodit ei kohaldata polümeriseeritud rasvhapete suhtes.

2. REAKTIIVID

2.1. Kandegaas

Inertgaas (lämmastik, heelium, argoon, vesinik), põhjalikult kuivatatud ja hapnikusisaldusega kuni 10 mg/kg.

Märkus 1.

Vesinik, mida kasutatakse kandegaasina ainult kapilaarkolonnidega, võib analüüsi kiirust kahekordistada, kuid on ohtlik. Saadaval on ohutusseadmed.

2.2. Abigaasid

2.2.1. Lämmastik (puhtus ≥ 99,9 %), orgaaniliste lisanditeta.

2.2.2. Õhk või hapnik, orgaaniliste lisanditeta.

2.3. Võrdlusstandard

Puhaste rasvhapete metüülestrite segu või teadaoleva, eelistatult analüüsitava rasvainega sarnase koostisega rasva metüülestrid.

Tuleb tagada, et polüküllastumata rasvhapped ei oksüdeeruks.

3. SEADMED

Juhendid käsitlevad tavapäraseid gaasikromatograafia seadmeid, rakendades täidetud ja/või kapillaarkolonne ja leekionisatsioonidetektorit. Sobivad kõik punktis 4.1.2 nimetatud efektiivsuse ja resolutsiooniga seadmed.

3.1. Gaasikromatograaf

Gaasikromatograaf koosneb järgmistest elementidest.

3.1.1. Sissepritsesüsteem

Kasutatakse sissepritsesüsteemi, millel on:

a) täidetud kolonnid, väikseima võimaliku tühimahuga (sellisel juhul peab sissepritsesüsteemi olema võimalik kuumutada 20–50 oC kuumemaks kui kolonni); või

b) kapillaarkolonnid, sellisel juhul peab sissepritsesüsteem olema spetsiaalselt vastavaks otstarbeks kavandatud. See võib olla jaotatud või jaotamata vooluga injektor.

Märkus 2. Vähem kui 16 süsinikuaatomiga rasvhapete puudumise korral võib kasutada liikuva nõelaga injektorit.

3.1.2. Ahi

Kolonni peab olema võimalik ahjus kuumutada vähemalt temperatuurini 260 °C ning ahi peab soovitud temperatuuri hoidma täidetud kolonniga 1°C ja kapillaarkolonniga 0,1 °C täpsusega. Viimane nõue on eriti oluline juhul, kui kasutatakse kvartsklaasist kolonni.

Temperatuuriregulaatoriga kuumutamine on kõikidel juhtudel soovitav, eelkõige rasvhapete puhul, millel on vähem kui 16 süsinikuaatomit.

3.1.3. Täidetud kolonn

3.1.3.1. Kolonn, analüüsitava ainega inertsest materjalist (klaasist või roostevabast terasest), millel on järgmised mõõtmed. a) pikkus: 1–3 m. Kui esineb pikaahelalisi rasvhappeid (üle C20), tuleks kasutada suhteliselt lühikest kolonni. 4–6 süsinikuaatomiga hapete analüüsimisel on soovitav kasutada 2 m pikkust kolonni; b) sisediameeter: 2–4 mm. Märkus 3. Kui esineb rohkem kui kolme kaksiksidemega polüküllastumata komponente, võib need lagundada roostevabast terasest kolonnis. Märkus 4. Kasutada võib kahe täidetud kolonniga süsteemi.

3.1.3.2. Täitmine, kasutatakse järgmisi komponente: a) tugiaine: happega pestud ja silaanitud kobediatomiit või muu sobiv inertne kandegaas, millel on kitsas terasuuruste väärtus (25 μm ulatus 125–200 μm) ning tera keskmine suurus on seotud kolonni sisediameetri ja pikkusega; b) statsionaarne faas: polüestri tüüpi polaarne vedelik (nt detüleen-glükool-polüsuktsinaat, butanediool-polüsuktsinaat, etüleenglükool-polüadipaat jne), tsüanosilikoonid või mõni muu vedeldi, mis võimaldab vajaliku kromatograafilist eraldamist (vt punkt 4). Statsionaarse faasi osakaal peaks kolonni täitmisest moodustama 5–20 %. Teatavate eraldamiste puhul võib kasutada ka mittepolaarset statsionaarset faasi.

3.1.3.3. Kolonni tasakaalustamine Kui kolonn on võimaluse korral detektorist eraldatud, kuumutatakse ahju järk-järgult temperatuurini 185 °C ning vahetult ettevalmistatud kolonni lastakse sellel temperatuuril vähemalt 16 tunni jooksul inertgaasi vool kiirusega 20–60 ml/min ja täiendavalt 2 tunni jooksul temperatuuril 195 °C.

3.1.4. Kapillaarkolonn

3.1.4.1. Katseklaas, mis on valmistatud analüüsitava ainega inertsest materjalist (tavaliselt klaas või kvartsklaas). Sisediameeter on 0,2–0,8 mm. Sisekülge tuleb enne statsionaarse faasi kihiga katmist nõuetekohaselt töödelda (nt pinna ettevalmistamine, inaktiveerimine). Enamikul juhtudel on piisavaks pikkuseks 25 mm.

3.1.4.2. Statsionaarne faas, tavaliselt polüglükooli (polü(etüleenglükool)20 000), polüestri (butanediool-polüsuktsinaat) või polaar-polüsiloksaani (tsüanosilikoonide) tüüpi. Sobivad seotud (võrkstruktuuriga) kolonnid. Märkus 5. Polaar-polüsiloksaanid võivad raskendada linoleenhappe ja C20 hapete identifitseerimist ja eraldamist. Kiht peab olema õhuke, st 0,1–0,2 μm.

3.1.4.3. Kolonni monteerimine ja tasakaalustamine Järgitakse kapillaarkolonnide tavapäraseid ettevaatusabinõusid: kolonni asetus ahjus (tugirajatised), liitekohtade valik ja paigaldus (lekkekindlus), kolonni otste asetus injektoris ja detektoris (võimalikult vähe tühja ruumi). Läbi kolonni juhitakse kandegaas (nt 0,3 baari (30 kPa) läbi 25 mm pikkuse ja 0,3 mm sisediameetriga kolonni). Kolonn tasakaalustatakse ahju reguleerides selliselt, et temperatuur tõuseb ümbritseva õhu temperatuurilt 3 °C minutis, saavutades sellise temperatuuri, mis on 10 °C madalam kui statsionaarse faasi hajumistemperatuur. Ahju hoitakse sellisel temperatuuril tund aega, kuni nulljoon stabiliseerub. Temperatuuri alandatakse taas tagasi 180 oC-le ja katset jätkatakse isotermilistel tingimustel. Märkus 6. Nõuetekohaselt tasakaalustatud kolonnid on müügil.

3.1.5. Detektor, mida on soovitavalt võimalik kuumutada temperatuurini, mis on kolonni omast kõrgem.

3.2. Süstal

Süstla ülemine mõõtepiir on 10 ml ning mõõtskaala jagatud 0,1-milliliitristeks ühikuteks.

3.3. Meerik

Kui meeriku kõverat kasutatakse analüüsitava segu koostise arvutamiseks, on vaja väga täpset elektrimeerikut, mis sobib kokku kasutatavate seadmetega. Meerikul peavad olema järgmised omadused:

a) vastamisaeg alla 1,5 s, soovitavalt 1 s (vastamisaeg on aeg, mis kulub meeriku nõelal liikumiseks vahemikus 0–90 % pärast seda kui ootamatult antakse 100 % signaal;

b) paberi laius, vähemalt 20 cm;

c) paberi kiirus, mida on võimalik kohandada kiiruseni 0,4–2,5 cm/min.

3.4. Integraator

Elektroonilise integraatoriga on võimalik kiiresti ja täpselt arvutada. Elektroonilise integraatoriga on võimalik saavutada piisava tundlikkusega lineaarne vastus ning nulljoone kõrvalekalde korrektsioon on rahuldav.

4. TÖÖ KÄIK

Punktides 4.1–4.3 kirjeldatud toimingud käsitlevad leekionisatsioonidetektori kasutamist.

Kasutada võib ka gaasikromatograafi, milles on kataromeeter (töötab soojusjuhtivuse põhimõttel). Töötingimusi kohandatakse, nagu punktis 6 kirjeldatud.

4.1. Katsetingimused

4.1.1. Optimaalsete töötingimuste valik 4.1.1.1. Täidetud kolonn Katsetingimuste valimisel tuleks arvesse võtta järgmisi muutujaid: a) kolonni pikkus ja diameeter; b) statsionaarse faasi laad ja kogus; c) kolonni temperatuur; d) kandegaasi vool; e) nõutav resolutsioon; f) katsekoguse suurus, mis on valitud selliselt, et detektor ja elektromeeter annavad lineaarse tulemuse; g) analüüsi kestus. Tavaliselt annavad tabelis 1 ja 2 esitatud väärtused soovitud tulemuse, st vähemalt 2 000 teoreetilist plaati ühe kolonnimeetri kohta metüülstearaadile selle elueerimiseks 15 minutiga. Kui seadmed võimaldavad, peaks injektor olema temperatuuril ligikaudu 200 °C ja detektor kolonni temperatuuriga võrdsel või kõrgemal temperatuuril. Sõltuvalt kolonni diameetrist on leekionisatsioonidetektorisse suunatud lämmastiku voolukiiruse suhe võrreldes kandegaasi omaga reeglina 1: 2 kuni 1: 1. Hapniku voolukiirus on umbes 5–10 korda vesiniku omast kiirem.



Tabel 1 Kolonni sisediameeter mm Kandegaasi voolukiirus ml/min 2 15–25 3 20–40 4 40–60



Tabel 2 Statsionaarse faasi kontsentratsioon % (m/m) Kolonni temperatuur °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapillaarkolonn Kapillaarkolonni tõhusus- ja täituvusomadused tingivad selle, et koostisosade eraldamine ja analüüsi kestvus sõltuvad suuresti kandegaasi voolukiirusest kolonnis. Seetõttu on vaja töötingimusi optimeerida, muutes seda parameetrit (ehk kolonni survekadu) sõltuvalt sellest, kas soovitakse tõsta eraldamise kvaliteeti või muuta analüüsid kiiremaks.

4.1.2. Teoreetiliste plaatide arvu (tõhususe) ja resolutsiooni määramine (vt joonis 1). Tehakse võrdsetes kogustes oleva metüülstearaadi ja metüüloleaadi segu analüüs (näiteks kakaovõis olevad metüülestrid). Kolonni temperatuur ja kandegaasi voolukiirus valitakse selliselt, et umbes 15 minutit pärast lahusti piigi registreerimist registreeritakse võimalikult suur metüülstearaadi piik. Kasutada tuleb piisavat kogust metüülestrite segu, mis võimaldab metüülstearaadi piigil moodustada ¾ kogu skaalast. Arvutatakse teoreetiliste plaatide arv, n (tõhusus), kasutades järgmist valemit: ja resolutsioon, R, kasutades valemit: kus dr1 on peetumisdistants millimeetrites, kromatogrammi algusest kuni metüülstearaadi piigi maksimumini; ω1 ja ω2 on vastavalt metüülstearaadi ja metüüloleaadi piigilaiused millimeetrites, mis mõõdetakse kohas, kus piigikõvera lõikepunktid lõikuvad nulljoonega; Δ on metüülstearaadi ja metüüloleaadi piigimaksimumide distants millimeetrites; ▼M2 ja lahutusindeks lr, kasutades valemit: kus a = on väikseima piigi kõrgus, mõõdetuna põhijoonelt; b = on kahe külgneva piigi vahelise miinimumi madalaima punkti kõrgus, mõõdetuna põhijoonelt. ▼B Joonis 1 Kromatogramm teoreetiliste plaatide arvu (tõhususe) ja resolutsiooni määramiseks. Töötingimused tuleb valida selliselt, et metüülstearaadi jaoks saadakse vähemalt 2 000 teoreetilist plaati kolonnimeetri kohta ning resolutsioon on vähemalt 1,25.

4.2. Katsekogus

Süstlaga (3.2) võetakse 0,1–2 μl metüülestrite lahust, mis on valmistatud kooskõlas X B lisaga, ning süstitakse kolonni.

Kui estrid ei ole lahusena, valmistatakse ligikaudu 100 mg/ml kromatograafilise kvaliteediga heptaanilahust ja süstitakse seda lahust 0,1–1 ml.

Kui analüüsi käigus määratakse koostisosi, mida on vähe, võib katsekogust suurendada (kuni kümnekordseks).

4.3. Analüüs

Üldjuhul on töötingimused sellised, nagu punktis 4.1.1 kirjeldatud.

Siiski on võimalik töötada ka madalama kolonnitemperatuuriga juhul, kui on vaja määrata rasvhappeid, millel on vähem kui 12 süsinikuaatomit, või kõrgemal temperatuuril, kui on vaja määrata rasvhappeid, millel on rohkem kui 20 süsinikuaatomit. Nendel juhtudel on võimalik kasutada temperatuuri programmeerimist. Näiteks kui proov sisaldab rasvhapete metüülestreid, millel on vähem kui 12 süsinikuaatomit, süstitakse proov temperatuuril 100 °C (või 50–60 °C võihapet) ja tõstetakse kohe temperatuuri 4–8 °C võrra minutis, kuni saavutatakse optimaalne temperatuur. Teatavatel juhtudel on neid kahte meetodit võimalik ühendada.

Pärast programmeeritud kuumutamist jätkatakse elueerimist püsival temperatuuril, kuni kõik komponendid on elueeritud. Kui seade ei võimalda programmeeritud kuumutamist, kasutatakse kahte 100–195 °C vahel olevat kindlaksmääratud temperatuuri.

Vajaduse korral soovitatakse teha analüüs kahel erineva polaarsusega kindlaksmääratud faasil, et kontrollida varjatud piigi puudumist, näiteks kui proovis on üheaegselt konjugeeritud C18:3 ja C20:0, või C18:3 ja C18:2.

4.4. Võrdluskromatogrammi ja -graafikute ettevalmistamine

Analüüsitakse võrdlusstandardi lahust (2.3), kasutades selleks samu töötingimusi nagu proovi puhul, ning mõõdetakse lahuse rasvhapete peetumisajad või peetumisdistantsid. Iga küllastamatusmäära kohta konstrueeritakse poollogaritmilisel paberil graafikud, kus oleks süsinikuaatomite arvu funktsioonina näha peetumisaja või -distantsi logaritm. Isotermilistel tingimustel peaksid sama küllastamatusmääraga hargnemata ahelaga hapete graafikuteks olema sirgjooned. Need jooned peaksid olema enam-vähem paralleelsed.

Tuleks vältida tingimusi, milles võib esineda varjatud piike, st kus resolutsioon ei ole kahe koostisosa eraldamiseks piisav.

5. TULEMUSTE VÄLJENDAMINE

5.1. Kvalitatiivne analüüs

Proovi metüülestripiigid määratakse proovis punktis 4.4 koostatud graafikutega, vajaduse korral interpolatsiooni abil.

5.2. Kvantitatiivne analüüs

5.2.1. Koostise määramine

Välja arvatud erandjuhud, kasutatakse sisemise normaliseerimise meetodit, st oletatakse, et kromatogrammil on kõik proovi koostisosad ja kogu piigi pindala vastab koostisosadele 100protsendiliselt (täielik elueerumine).

Kui seadmed sisaldavad ka integraatoreid, kasutatakse integraatoriga saadud tulemusi. Kui integraator puudub, määratakse konkreetsed piigipindalad piigi kõrguse korrutamisega piigi laiusega kõrguse keskkohas, vajaduse korral võetakse arvesse erinevaid registreerimise ajal kasutatud sumbumisi.

5.2.2. Arvutamine

5.2.2.1. Üldjuhul Teatava komponendi i sisaldus väljendatuna metüülestrite massiprotsendina arvutatakse selliselt, et määratakse piigipindala suhteline osa kõikide piikide pindalast järgmise valemi alusel. kus Ai on komponendi i piigipindala; ΣA on piikide pindala summa. Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega. Märkus 7: Üldjuhul põhineb arvutustulemus sellel, et suhtelised pindalad vastavad massi protsentuaalsetele suhtetele. Kui seda üldistust ei saa kohaldada, vaadata punkti 5.2.2.2.

5.2.2.2. Parandustegurite kasutamine Teatavatel juhtudel, näiteks kui rasvhapetes on vähem kui kaheksa süsinikuaatomit või kui happes on sekundaarsed rühmad, või kui kasutatakse soojusjuhtivuse detektorit või kui on vaja maksimaalset täpsust, tuleks kasutada parandustegurit, et arvestada piigipindalade protsent ümber komponentide massiprotsentideks. Parandustegur määratakse kindlaks kromatogrammiga, mis saadakse teadaoleva koostisega metüülestrite võrdlussegu analüüsimisel proovi töötingimustega samadel töötingimustel. Selle võrdlussegu komponendi i massiprotsent määratakse järgmise valemiga: kus mi on komponendi i massi võrdlussegus; Σm on võrdlussegu erinevate komponentide üldmass. Võrdlussegu (4.4) kromatogrammi alusel arvutatakse komponendi i protsent (pindala/pindala) järgmiselt: kus Ai on komponendi i piigipindala; ΣA on piikide pindalade summa. Parandustegur arvutatakse järgmiselt: Tavaliselt väljendatakse parandustegureid suhtes KC16–ga, nii et parandustegurid on järgmised: Proovi iga komponendi i määr metüülestrite massiprotsendina on järgmine: Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

5.2.2.3. Sisestandardi kasutamine Teatavate analüüside puhul (nt kui kõikide rasvhapete määr ei ole teada, juhul kui nelja ja kuue süsinikuga hapete kõrval esinevad ka 16 ja 18 süsinikuga happed, või kui on vaja määrata proovis olevate rasvhapete absoluutsumma) on vaja kasutada sisestandardit. Sageli kasutatakse viie, 15 või 16 süsinikuga rasvhappeid. Tuleks kindlaks määrata sisestandardi parandustegur (juhul kui see on vajalik). Komponendi i massiprotsent väljendatuna metüülestritena arvutatakse valemiga: kus Ai on komponendi i piigipindala; As on sisestandardi piigipindala; K′i on komponendi i parandustegur (suhtes KC16–ga); K′i on sisestandardi parandustegur (suhtes KC16–ga); m on katsekoguse mass (mg); ms on sisestandardi mass (mg). Tulemus esitatakse ühe kümnendkoha täpsusega.

▼M2

6. ERIJUHT — TRANS-ISOMEERIDE MÄÄRAMINE

Trans-isomeeride sisaldust on võimalik 10–24 süsiniku aatomiga rasvhapetes määrata metüülestrite eraldamise teel konkreetse polaarsusega gaasikromatograafia kolonnide abil.

6.1. Ränidioksiidist kapilaarkolonn sisediameetriga 0,25–0,32 mm, pikkusega 50 m, kaetud 0,1–0,3 μm paksuse tsüanopropüsilikoonikihiga (tüüp SP 2380, C.P. sil 88, silor 88 ja sarnased tüübid).

▼M21

6.2. Metüülestrid valmistatakse XB lisas kirjeldatud meetodi B kohaselt. Rasvained, milles vaba happe sisaldus on suurem kui 3 %, tuleb eelnevalt neutraliseerida VII lisa punkti 5.1.1 kohaselt

▼M2

6.3. Gaasikromatograafi töötingimused on järgmised: — kolonni temperatuur programmeeritud vahemikus 150–230 °C (näiteks 15 minutit 165 °C, seejärel tõstetakse 5 °C võrra minutis kuni temperatuurini 200 °C), — injektori temperatuur: 250 °C jaotussüsteemi kasutamise korral või kolonni algtemperatuur, juhul kui kasutatakse on-column süsteemi, — detektori temperatuur: 260 °C, — kandegaasi voolukiirus (heelium ja vesinik): 1,2 ml minutis. Süstitav kogus peab olema selline, et kasutataval tundlikkusel on arahiinhappe metüülestrile vastava piigi kõrgus vähemalt 20 % skaala alumisest osast.

6.4. Eri metüülestrid määratakse peetumisaegade põhjal, mida võrreldakse võrdlussegude peetumisaegadega (nagu märgitud punktis 2.3). Transrasvhapete estrid elueeritakse enne vastavaid cis-isomeere. Kromatogrammi näide on esitatud joonisel 2. Joonis 2: Rasvhapete trans-isomeeride gaasikromatogramm kapillaarkolonni abil

6.5. Vastavalt punktile 4.1.2 kindlaksmääratud kolonni tõhusus peab võimaldama teatavate kriitiliste paaride eraldamist, näiteks trans-oleiinhappe ja oleiinhappe piigi massiiviga tekkiv paar, trans C 18:1/cis C 18:1, resolutsiooniindeksiga üle 2.

6.6. Erinevate transrasvhapete protsent arvutatakse asjakohase piigi pindala ja kõikide piikide pindalade summade suhte põhjal. Arvesse võetakse järgmiste hapete protsente: — trans-oktadekeenhapped (T 18:1), mis on esitatud käesoleva määruse I lisas trans-oleiinhappe isomeeride kogusummana, — cis-trans ja trans-cis oktadekadieenhapped [(CT/TC) 18:2], mis on esitatud käesoleva määruse I lisas trans-linoolhappe isomeeride kogusummana, — trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, oktadekatrieenhapped [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], mis on esitatud käesoleva määruse I lisas translinoolhappe isomeeride kogusummana. Märkus 8: Käesoleva meetodi eriomadusi silmas pidades tuleb tulemused esitada 2 kümnendkoha täpsusega.

▼B

7. ERIJUHT — KATAROMEETRI KASUTAMINE (SOOJUSJUHTIVUSE MUUTUSTE PÕHIMÕTTEL)

Rasvhappe metüülestrite segu kvalitatiivse ja kvantitatiivse koostise määramisel võib kasutada gaasikromatograafi, milles on soojusjuhtivuse muutuste põhimõttel töötav detektor (kataromeeter). Kataromeetri kasutamisel tuleb lõike 3 ja 4 tingimusi tabeli 3 alusel kohandada.

Kvantitatiivse analüüsi puhul tuleb kasutada punktis 5.2.2.2 määratletud parandustegureid.







Tabel 3 Muutujad Väärtus/tingimus Kolonn Pikkus: 2–4 m Sisediameeter: 4 mm Tugiaine Tera suurus 160–200 μm Statsionaarse faasi kontsentratsioon 15–25 % (m/m) Kandegaas Heelium või selle puudumisel vesinik, võimalikult madala hapnikusisaldusega Abigaasid Puuduvad Injektori temperatuur 4–60 oC kolonni temperatuurist kõrgem Kolonni temperatuur 180–200 oC Kandegaasi vool Tavaliselt 60–80 ml/min Süstitava katsekoguse suurus Tavaliselt 0,5–2 μl

8. KATSEPROTOKOLL

Katseprotokolli märgitakse metüülestrite valmistamisel ja gaasikromatograafilisel analüüsimisel kasutatud meetodid ning saadud tulemused. Selles märgitakse samuti kõik üksikasjad, mida ei ole nimetatud käesolevas rahvusvahelises standardis või mis on valikulised, samuti üksikasjad tulemust m