A.

Tehakse blokeeriv või võistlev ELISA test vastavalt järgmisele protokollile: Monoklonaalseid antikehi 3-17-A3 kasutav võistlev ELISA test suudab tuvastada kõiki lammaste katarraalse palaviku (BTV) tuntud serotüüpe. Testi põhimõte on BTV antigeeni ja grupispetsiifilise monoklonaalse antikeha (3-17-A3) vahelise reaktsiooni takistamine uuritavate seerumite lisamisel. Uuritavates seerumites olevad BTV antikehad blokeerivad monoklonaalse antikeha (MAK) seondumise ning selle tulemusena väheneb ensüümiga märgistatud hiirevastase antikeha ja kromogeeni/substraadi lisamise järel tekkiva värvusreaktsiooni intensiivsus. Seerumeid võib testida ühekordsete lahjendustena 1:5 (tilktest – 1. lisa) või tiitrimise teel (seerumi tiitrimine – 2. lisa), et leida lahuse lõpptiiter. 50 % ületavaid inhibitsiooniväärtused loetakse positiivseks. Materjal ja reagendid: 1. ELISA mikrotiiterplaadid. 2. Antigeen: tarnitakse rakust ekstraheeritud kontsentraadina, valmistatakse vastavalt allpool esitatud kirjeldusele ja säilitatakse temperatuuril – 20 °C või – 70 °C. 3. Blokeeriv puhver: fosfaadiga puhverdatud keedusoolalahus, mis sisaldab 0,3 % BTV-negatiivset täiskasvanud veise seerumit ja 0,1 mahuprotsendilist Tween-20 (polüoksüetüleensorbitoonmonolauraatsiirupina) fosfaadiga puhverdatud soolalahuses. 4. Monoklonaalne antikeha: grupispetsiifilise polüpeptiidi VP7 vastane 3-17-A3 (hübridoomi rakukultuuri supernatandina), säilitatakse – 20 °C juures või külmkuivatatakse, enne kasutamist lahjendatakse blokeeriva puhvriga vahekorras 1:100. 5. Konjugaat: küüliku hiirevastane globuliin (absorbeeritud ja elueeritud), mis on konjugeeritud mädarõika peroksüdaasiga ja hoitud pimedas 4 °C juures. 6. Kromogeen ja substraat: ortofenüleendiamiin (OPD-kromogeen) lõplikul kontsentratsioonil 0,4 mg/ml steriilses destilleeritud vees. Vahetult enne kasutamist lisatakse 0,05 mahuprotsendiline vesinikperoksiid (30 % massi/mahu-substraat; 5 μl H2O2 10 ml OPD kohta). (NB! Ettevaatust OPDga töötamisel tuleb kanda kummikindaid! Oletatav mutageen.) 7. 1 M väävelhape: 26,6 ml hapet lisatakse 473,4 ml destilleeritud veele. (NB! Alati lisatakse hapet veele, mitte kunagi vett happele!) 8. Orbitaalsegisti. 9. ELISA plaadilugeja (testi tulemusi võib lugeda ka visuaalselt). Tööplaan Cc: konjugaadi kontroll (ilma seerumita/ilma monoklonaalse antikehata); C++: tugev positiivne kontrollseerum; C+: nõrk positiivne kontrollseerum; C-: negatiivne kontrollseerum; Cm: monoklonaalse antikeha kontroll (ilma seerumita).



1. LIIDE Tilklahjendus (1:5) (40 seerumit plaadil) Kontrollid Uuritavad seerumid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



2. LIIDE Seerumi tiitrimine (10 seerumit plaadil) Kontrollid Uuritavad seerumid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Tööprotokoll: Konjugaadi kontroll (Cc) : augud 1A ja 1B on pimekontrollid, mis sisaldavad BTV antigeeni ja konjugaati. Seda rida võib kasutada pimereana ELISA plaadilugeja jaoks. Monoklonaalse antikeha (MAK) kontroll (Cm) : veerud 1 ja 2, read G ja H on monoklonaalse antikeha kontrollimiseks ning need sisaldavad BTV antigeeni, monoklonaalset antikeha ja konjugaati. Neis aukudes tekib tugevaim värvumine. Selle kontrollrea optilise tiheduse näitude keskmine väärtus vastab 0 % inhibitsiooniväärtusele. Positiivne kontroll (C++, C+) : veerud 1 ja 2, read C-D-E-F. Nendes aukudes on BTV antigeen, vastavalt BTV tugev ja nõrk positiivne seerum, MAK ja konjugaat. Negatiivne kontroll (C-) : augud 2A ja 2B on negatiivse kontrolli lahtrid, mis sisaldavad BTV antigeeni, BTV negatiivset antiseerumit, monoklonaalset antikeha ja konjugaati. Uuritavad seerumid : suuremahuliste seroloogiliste uuringute ja kiirseire puhul võib seerumit testida ühekordse lahjendusena 1:5 (1. liide). Alternatiivina võib 10 seerumit uurida lahjendustes 1:5 kuni 1:640 (2. liide). See võimaldab hinnata uuritavate seerumite antikeha-tiitrit. Töö käik: 1. BTV antigeen lahjendatakse PBSis varem tiitritud kontsentratsioonini, töödeldakse lühidalt ultraheliga agregeerunud viiruse hajutamiseks (sonikaatori puudumisel pipetitakse tugevasti) ning lisatakse 50 μl kõikidesse ELISA plaadi aukudesse. Antigeeni ühtlaseks jaotumiseks koputatakse plaadi servadele. 2. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 60 minutit. Plaadid pestakse, täites ja tühjendades auke kolm korda mittesteriilse PBSiga, ning klopitakse filterpaberil kuivaks. 3. Kontrollaugud: Cc aukudesse lisatakse 100 μl blokeerivat puhverlahust. Lisatakse 50 μl positiivset ja negatiivset kontrollseerumit lahjenduses 1:5 (10μl seerumit + 40 μl blokeerivat puhverlahust) vastavatesse aukudesse C-, C+ ja C++. MAKi kontrollaukudesse lisatakse 50 μl blokeerivat puhverlahust. Tilktiitrimise meetod: veergude 3–12 topeltaukudesse lisatakse iga uuritavat seerumit, mida on lahjendatud blokeerivas puhverlahuses vahekorras 1:5 (10 μl seerumit + 40 μl blokeerivat puhverlahust), või seerumi tiitrimise meetod: blokeerivas puhverlahuses valmistatakse iga uuritava proovi kahekordsete lahjenduste rida (lahjendusastmelt 1:5 astmeni 1:640), iga veeru 3–12 kaheksas augus. 4. Kohe pärast uuritavate seerumite lisamist lahjendatakse MAK blokeerivas puhvris vahekorras 1:100 ja lisatakse 50 μl plaadi igasse auku, välja arvatud pimekontrolli augud. 5. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 60 minutit. Pestakse kolm korda PBSiga ja klopitakse filterpaberil kuivaks. 6. Küüliku hiirevastase globuliini kontsentraat lahjendatakse 1/5000 blokeerivas puhvris ja lisatakse 50 μl plaadi igasse auku. 7. Inkubeeritakse 37 °C juures 60 minutit. Pestakse kolm korda PBSiga ja klopitakse filterpaberil kuivaks. 8. O-fenüleendiamiini dihüdrokloriid (OPD) sulatatakse ja vahetult enne kasutamist lisatakse sellele 5 μl 30 % vesinikperoksiidi iga 10 ml OPD kohta. Plaadi igasse auku lisatakse 50 μl. Lastakse värvusel tekkida umbes 10 minutit ja peatatakse reaktsioon 1 M väävelhappega (50 μl augu kohta). Värvumine peaks toimuma MAKi kontrollaukudes ja selliste seerumitega täidetud aukudes, mis ei sisalda antikehi. 9. Plaate uuritakse ja tulemused protokollitakse visuaalselt või spektromeetri abil. Tulemuste analüüs: Arvutiprogrammi abil prinditakse välja uuritava ja kontrollseerumi optilise tiheduse (OD) väärtused ning inhibitsiooni protsent (PI) lähtuvalt neljas augus registreeritud antigeeni kontrollseerumi keskmisest väärtusest. OD ja PI väärtusi kasutatakse testi usaldatavuse üle otsustamiseks. Monoklonaalse antikeha kontrolli (antigeen pluss monoklonaalne antikeha ilma uuritava seerumita) ülemised (ÜPV) ja alumised (APV) piirväärtused on OD väärtuste vahemikus 0,4–1,4. Plaadid, mis ei vasta nimetatud kriteeriumitele, loetakse mitterahuldavaks. Arvutiprogrammi puudumisel prinditakse OD väärtused välja ELISA printeriga. Arvutatakse antigeeni kontrollaukude keskmine OD väärtus, mis on samaväärne 100 % väärtusega. Määratakse kindlaks 50 % OD väärtus ja arvutatakse välja iga proovi positiivsus ja negatiivsus. Inhibitsiooni protsendimäära (PI) väärtus = 100 – (iga uuritava kontrolli OD/Cm keskmine OD) × 100. Negatiivse kontrollseerumi dubleeritud augud ja tühikatse dubleeritud augud peavad andma PI väärtuse vahemikus vastavalt + 25 % ja – 25 % ning + 95 % ja + 105 %. Kui tulemus jääb väljapoole nimetatud väärtusi, ei tähenda see, ei plaadi tulemused on kehtetud, vaid seda, et taustavärvus veel muutub. Tugev ja nõrk positiivne kontrollseerum peaksid andma PI väärtuse vahemikus vastavalt + 81 % ja + 100 % ning + 51 % ja + 80 %. Uuritava seerumi diagnoosimise lävi on 50 % (PI 50 % või OD 50 %). Proovid, mille PI väärtused on >50 %, loetakse negatiivseteks. Proovid, mille PI väärtused on dubleeritud aukude lävest ülal- või allpool, tuleb lugeda kahtlasteks; selliseid proove võib uuesti testida tilktestmeetodil ja/või tiitrimise teel. Positiivseid proove võib samuti tiitrida positiivsuse astme kindlaksmääramiseks. Tulemuse visuaalne lugemine: positiivsed ja negatiivsed proovid on palja silmaga kergesti eristatavad; nõrgalt positiivsete või tugevate negatiivsete proovide palja silmaga tõlgendamine võib olla raskem. BTV ELISA antigeeni valmistamine: 1. 40–60 ühtlaselt BHK-21 rakkudega täidetud Roux' anumat pestakse kolm korda seerumivaba Eagle’i söötmega ja nakatatakse BTV serotüübiga 1 seerumivabas Eagle’i söötmes. 2. Inkubeeritakse 37 °C juures ja jälgitakse iga päev tsütopaatilise efekti (TPE) teket. 3. Kui TPE on hõlmanud 90 % –100 % kõikide Roux' anumate rakukihist, kogutakse viirus kokku, raputades veel kinnitunud rakud klaasi küljest lahti. 4. Tsentrifuugitakse kiirusel 2 000–3 000 pööret minutis rakkude sadestamiseks. 5. Supernatant kõrvaldatakse ja rakud resuspendeeritakse umbes 30 ml PBSis, mis sisaldab 1 % sarkosüüli ja 2 ml fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi (lüüsipuhver). Selle tulemusena võivad rakud moodustada geeli, efekti vähendamiseks võib lisada lüüsipuhvrit. (NB! Fenüülmetüülsulfonüülfluoriid on ohtlik, seda tuleb käsitseda äärmiselt ettevaatlikult!) 6. Rakke lõhustatakse 60 sekundit, kasutades ultrahelisondi amplituudil 30 mikronit. 7. Tsentrifuugitakse 10 minutit kiirusel 10 000 pööret minutis. 8. Supernatant säilitatakse + 4 °C juures ja järelejäänud rakukogum resuspendeeritakse 10–20 ml lüüsipuhvris. 9. Töödeldakse ultraheliga ja selitatakse kolm korda, säilitades iga etapi supernatandi. 10. Supernatandid pannakse kokku ja tsentrifuugitakse 120 minutit kiirusel 24 000 pööret minutis (100,000 g) + 4 °C juures (5 ml 40 % sahharoosi lahusega (w/v PBSis)), kasutades Beckmanni 30 ml tsentrifuugitopse ja SW 28 rootorit. 11. Supernatant kõrvaldatakse, vedelik eemaldatakse topsidest täielikult ning sade resuspendeeritakse PBSis ultrahelitöötlusega. Antigeen säilitatakse väikestesse kogustesse jaotatuna – 20 °C juures. BTV ELISA antigeeni tiitrimine: Lammaste katarraalse palaviku ELISA antigeen tiitritakse kaudse ELISAga. Antigeeni kahekordsed lahjendused tiitritakse, kasutades monoklonaalse antikeha 3-17-A3 konstantset lahjendust (1:100). Protokoll on järgmine: 1. Vahekorras 1:20 lahjendatud BTV antigeen tiitritakse mikrotiiterplaadil kahekordsete lahjendustena (50 μl augu kohta), kasutades mitmekanalilist pipetti. 2. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund. 3. Plaadid pestakse kolm korda PBSiga. 4. Mikrotiiterplaadi igasse auku lisatakse 50 μl monoklonaalset antikeha 3-17-A3 (lahjenduses 1:100). 5. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund. 6. Plaate pestakse kolm korda PBSiga. 7. Mikrotiiterplaadi igasse auku lisatakse 50 μl küüliku hiirevastast globuliini, mis on konjugeeritud mädarõika peroksüdaasiga ja lahjendatud varem tiitritud optimaalse kontsentratsioonini. 8. Inkubeeritakse orbitaalsegistil 37 °C juures 1 tund. 9. Lisatakse substraat ja kromogeen, nagu eespool kirjeldatud. Reaktsioon peatatakse 10 minuti pärast, lisades 1 M väävelhapet (50 μl augu kohta). Võistleva testi puhul tuleb monoklonaalset antikeha võtta liiaga, seetõttu valitakse antigeeni lahjendus, mis langeb tiitrimiskõverale (mitte platoole) ning mis annab 10 minuti jooksul OD väärtuseks umbes 0,8.