ANEXO I

Métodos de análisis para la detección e identificación de la plaga especificada a que se refiere el artículo 3, apartado 2

1. Prueba por medio de las esporas

Para la detección e identificación se utilizan esporangios de verano y esporas latentes, que se obtienen del suelo después del tamizado, o directamente del material vegetal.

2. Métodos de detección:

Para la extracción de esporas de la plaga especificada del suelo, se utilizará uno de los métodos siguientes:

a) método de tamizado del suelo descrito por Pratt (1976) (1);

b) método de tamizado del suelo descrito por Van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) técnica de centrifugación zonal para el tratamiento de muestras de alto rendimiento descrita por Wander et al. (2007) (3).

3. Métodos de identificación

Tras la extracción, las esporas de la plaga especificada se identificarán mediante uno de los métodos siguientes:

a) identificación morfológica con un microscopio óptico a 100-400 aumentos;

b) PCR convencional utilizando cebadores basados en Lévesque et al. (2001) (4) y van den Boogert et al. (2005) (5);

c) PCR en tiempo real utilizando cebadores y sondas conforme a Van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) PCR en tiempo real utilizando cebadores y sondas conforme a Smith et al. (2014) (7).

4. Viabilidad de las esporas latentes

La determinación de la viabilidad de las esporas latentes puede lograrse mediante un examen microscópico o un bioensayo. La viabilidad de los esporangios puede determinarse mediante un examen microscópico de los esporangios montados en lactofenol o en agua (Przetakiewicz 2015) (8). Los esporangios con contenido granular o protoplasma ligeramente esférico pueden considerarse viables. Aquellos en un estado de plasmólisis permanente o sin contenido aparente se considerarán muertos.

Como alternativa, o en caso de duda, podrá realizarse un bioensayo, tal como se describe en el punto 3 del anexo IV.

5. Determinación de los patotipos

La determinación de los patotipos requerirá verrugas nuevas.

El inóculo para la prueba se producirá mediante uno de los métodos siguientes:

a) método de SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), que consta de las dos etapas siguientes: i) producción del inóculo El tejido viejo (pardo) de la verruga deberá descomponerse en unidades más pequeñas y secarse al aire a temperatura ambiente hasta que se vuelva duro. El tejido duro se triturará manual o mecánicamente. El material triturado se tamizará en seco, recogiendo la fracción de 25 a 75 μm, y posteriormente se extraerá utilizando el método de cloroformo de Pratt (1976)1; ii) producción de verrugas nuevas Se rociarán unos 10 mg de esporas latentes extraídas sobre la superficie de 10 ml de agua destilada estéril en una pequeña placa de Petri de plástico y se incubarán en un lugar oscuro a 20 °C hasta su germinación. Los tubérculos de patata con brotes pequeños de entre 1 y 2 mm de longitud se colocarán en cajas de plástico transparentes revestidas de un pañuelo de papel humedecido con los brotes anillados orientados hacia arriba. Los brotes se anillarán con vaselina fundida utilizando una jeringa. El anillo deberá no tener fisuras y tener la suficiente altura como para mantener la suspensión de esporas sin fugas. Los 10 ml de esporas latentes en germinación se diluirán hasta los 20 ml con agua estéril y se introducirán en los anillos utilizando una pipeta o una botella flexible hasta que el brote quede completamente sumergido en la suspensión de esporas. Las cajas de plástico se taparán y se incubarán durante 4 días a 10 °C, transcurridos los cuales se destaparán, el inóculo y los anillos de vaselina se retirarán y las cajas se colocará en un invernadero con condiciones de humedad a una temperatura de entre 15 y 18 °C (16 h de luz);

b) método de Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

c) método de Potoček et al. (1991) (10);

d) método de Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble & Glynne 1970 (13)).

Para la determinación de todos los patotipos que se sabe que son pertinentes para la Unión [1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) y 38 (Nevşehir)] se utilizará una prueba de infección diferencial con diversas variedades del vegetal especificado tal como se indica en el cuadro. La prueba de infección se realizará siguiendo el protocolo mencionado en la letra d) (método Glynne-Lemmerzahl).

Sensibilidad selectiva de los cultivares de patata para la determinación de los patotipos de S. endobioticum

Cultivar Patotipos de S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R «S»: sensible «R»: resistente *: Indica una sensibilidad débil de la variedad a S. endobioticum («presencia de superficies de soros no necróticos sin formación de verrugas»).

(1) Pratt M.A. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21-29.

(2) Van Leeuwen G.C.M., Wander J.G.N., Lamers J., Meffert J.P., van den Boogert P.H.J.F., Baayen R.P. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25-31.

(3) Wander J.G.N., van den Berg W., van den Boogert P.H.J.F., Lamers J.G., van Leeuwen G.C.M., Hendrickx G., Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165-174.

(4) Lévesque C.A., de Jong S.N., Ward L.J. & de Boer S.H. (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200-201.

(5) Van den Boogert P.H.J.F., van Gent-Pelzer M.P.E., Bonants P.J.M., de Boer S.H., Wander J.G.N., Lévesque C.A., van Leeuwen G.C.M., Baayen R.P. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47-57.

(6) Van Gent-Pelzer M.P.E., Krijger M., Bonants P.J.M. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129-133.

(7) Smith D.S., Rocheleau H., Chapados J.T., Abbott C., Ribero S., Redhead SA, Lévesque C.A., De Boer S.H. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422-432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92: 704-708.

(9) Spieckermann A., Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114-115.

(10) Potoček J., Krajíčková K., Klabzubová S., Krejcar Z., Hnízdil M., Novák F., Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191-205.

(11) Glynne M.D. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34-60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288-297.

(13) Noble M., Glynne M.D. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125-135.