REGLAMENTO (CEE) N° 2568/91 DE LA COMISIÓN

de 11 de julio de 1991

relativo a las características de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva y sobre sus métodos de análisis

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,

Visto el Reglamento n° 136/66/CEE del Consejo, de 22 de septiembre de 1966, por el que se establece la organización común de mercados en el sector de las materias grasas (1), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CEE) n° 3577/90 (2), y, en particular, su artículo 35 bis,

Considerando que en el Anexo del Reglamento

n° 136/66/CEE se establecen las denominaciones y definiciones de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva comercializados dentro de cada Estado miembro, así como en los intercambios intracomunitarios y con terceros países;

Considerando que, para poder distinguir los diferentes tipos de aceite, procede definir las características fisicoquímicas de cada uno de ellos, así como las características organolépticas de los aceites vírgenes, a fin de garantizar así la pureza y calidad de estos productos, sin perjuicio de otras disposiciones existentes en la materia;

Considerando que conviene determinar de manera uniforme en toda la Comunidad la presencia de las características de los diferentes tipos de aceite; que, para ello, procede establecer los métodos comunitarios de análisis químico y de valoración organoléptica; que conviene, sin embargo, permitir que durante un período transitorio se utilicen otros métodos de análisis que sean aplicados en los Estados miembros, estableciendo al mismo tiempo que en caso de presentarse resultados divergentes prevalezcan los obtenidos a través del método común;

Considerando que la definición de las características fisicoquímicas de los aceites de oliva y de sus métodos de análisis comporta la adaptación de las notas complementarias del capítulo 15 de la nomenclatura combinada;

Considerando que el método de valoración de las características organolépticas de los aceites vírgenes requiere la creación de unos paneles de catadores seleccionados y

especialmente adiestrados; que conviene, por lo tanto, prever el plazo necesario para instaurar una estructura de este tipo; que, dadas las dificultades a las que se enfrentarán determinados Estados miembros para crear dichos paneles, procede autorizar que se recurra a paneles existentes en otros Estados miembros;

Considerando que, para garantizar el correcto funcionamiento del sistema de las exacciones reguladoras aplicables a la importación de orujo de oliva, es conveniente prever un método único para la determinación del contenido en aceite de estos productos;

Considerando que, para no perjudicar el comercio, resulta oportuno prever un período limitado para la salida al mercado del aceite que haya sido envasado antes de la entrada en vigor del presente Reglamento;

Considerando que procede derogar el Reglamento (CEE) n° 1058/77 de la Comisión (3), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CEE) n° 1858/88 (4);

Considerando que el Comité de gestión de las materias grasas no ha emitido dictamen alguno en el plazo establecido por su presidente,

HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:

Artículo 1

1. Se considerarán aceites de oliva vírgenes, a que se refieren las letras a), b), y c) del punto 1 del Anexo del Reglamento n° 136/66/CEE, los aceites cuyas características se ajusten a las indicadas, respectivamente, en los puntos 1, 2 y 3 del Anexo I del presente Reglamento.

2. Se considerará aceite de oliva virgen lampante, a que se refiere la letra d) del punto 1 del Anexo del Reglamento

n° 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 4 del Anexo I del presente Reglamento.

3. Se considerará aceite de oliva refinado, a que se refiere el punto 2 del Anexo del Reglamento n° 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 5 del Anexo I del presente Reglamento.

4. Se considerará aceite de oliva, a que se refiere el punto 3 del Anexo del Reglamento n° 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 6 del Anexo I del presente Reglamento.

5. Se considerará aceite de orujo de oliva crudo,

a que se refiere el punto 4 del Anexo del Reglamento

n° 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 7 del Anexo I del presente Reglamento.

6. Se considerará aceite de orujo de oliva refinado,

a que se refiere el punto 5 del Anexo del Reglamento

n° 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 8 del Anexo I del presente Reglamento.

7. Se considerará aceite de orujo de oliva, a que se refiere el punto 6 del Anexo del Reglamento n° 136/66/CEE, el aceite cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 9 del Anexo I del presente Reglamento.

Artículo 2

1. Las características de los aceites, previstas en el Anexo I, se determinarán empleando los métodos de análisis siguientes:

- para determinar los ácidos grasos libres, expresados en porcentaje de ácido oleico, el método recogido en el Anexo II,

- para determinar el índice de peróxidos, el método recogido en el Anexo III,

- para determinar los alcoholes alifáticos, el método recogido en el Anexo IV,

- para determinar el contenido de esteroles, el método recogido en el Anexo V,

- para determinar el eritrodiol + uvaol, el método recogido en el Anexo VI,

- para determinar los ácidos grasos saturados en la posición 2 del triglicérido, el método recogido en el Anexo VII,

- para determinar el contenido de trilinoleína, el método recogido en el Anexo VIII,

- para el análisis espectrofotométrico, el método recogido en el Anexo IX,

- para determinar la composición de ácidos grasos, el método recogido en los Anexos X «A» y X «B»,

- para determinar los solventes halogenados volátiles, el método recogido en el Anexo XI,

- para la valoración de las características organolépticas de los aceites de oliva vírgenes, el método recogido en el Anexo XII, que se aplicará de conformidad con el apartado 2,

- para la prueba de la refinación, el método recogido en el Anexo XIII.

2. El analista, asistido en su caso por expertos, llevará a cabo la valoración de las características organolépticas con arreglo al procedimiento descrito en la ficha de degustación contemplada en el Anexo XII. En caso de que el análisis determine características organolépticas distintas de las resultantes de la denominación del producto, el analista someterá la muestra al examen de un panel de catadores, con arreglo a las disposiciones del Anexo XII.

El análisis contradictorio será realizado por el panel de catadores de conformidad con las disposiciones citadas anteriormente.

Para la valoración de las características organolépticas con ocasión de operaciones relacionadas con el régimen de intervención, el panel de catadores procederá a aquella con arreglo a las disposiciones del Anexo XII.

Artículo 3

Hasta el 31 de octubre de 1992, la introducción de los métodos de análisis previstos en el artículo 2 no será óbice para que los Estados miembros empleen otros métodos comprobados y científicamente válidos, siempre que con ello no se obstaculice la libre circulación de los productos reconocidos conformes a la normativa en aplicación de los métodos comunitarios. Los Estados miembros interesados comunicarán a la Comisión dichos otros métodos antes de utilizarlos.

En caso de que alguno de estos otros métodos dé un resultado diferente del alcanzado por el método común, se considerará válido el resultado obtenido en aplicación del método común.

Artículo 4

1. A fin de apreciar las características organolépticas, los Estados miembros constituirán paneles de catadores seleccionados y entrenados de acuerdo con las normas previstas en el método descrito en el Anexo XII.

2. En caso de que un Estado miembro tenga dificultades para constituir un panel en su territorio podrá recurrir a un panel que se halle establecido en otro Estado miembro.

Artículo 5

Las notas complementarias números 2, 3 y 4 del capítulo 15 de la nomenclatura combinada se sustituirán por las que figuran en el Anexo XIV del presente Reglamento.

Artículo 6

1. El contenido en aceite de orujo de aceituna y demás residuos de la extracción del aceite de oliva (códigos NC 2306 90 11 y 2306 90 19) se determinará con arreglo al método recogido en el Anexo XV.

2. El contenido de aceite mencionado en el apartado 1 se expresará como porcentaje del extracto seco en peso.

Artículo 7

Serán aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de sustancias extrañas distintas de las mencionadas en el Anexo XI.

Artículo 8

1. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión las medidas adoptadas en aplicación del presente Reglamento.

2. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión, al inicio de cada semestre una recapitulación de los datos analíticos de las determinaciones efectuadas durante el semestre precedente.

Estos resultados serán examinados por el Comité de gestión de las materias grasas con arreglo al procedimiento previsto en el artículo 39 del Reglamento n° 136/66/CEE.

Artículo 9

Queda derogado el Reglamento (CEE) n° 1058/77.

Artículo 10

1. El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.

N° obstante, el método que figura en el Anexo XII se aplicará a partir del 1 de enero de 1992, excepto en lo que se refiere a las operaciones relacionadas con la intervención.

El presente Reglamento no se aplicará a los aceites de oliva y de orujo de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento y comercializados hasta el 31 de octubre de 1992.

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.

Hecho en Bruselas, el 11 de julio de 1991.

Por la Comisión

RAY MAC SHARRY

Miembro de la Comisión

(1) DO n° 172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.

(2) DO n° L 353 de 17. 12. 1990, p. 23.

(3) DO n° L 128 de 24. 5. 1977, p. 6.

(4) DO n° L 166 de 1. 7. 1988, p. 10.

ANEXO I

CARACTERÍSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA

>SITIO PARA UN CUADRO>

>SITIO PARA UN CUADRO>

ANEXO II

DETERMINACIÓN DEL GRADO DE ACIDEZ

1.

OBJETO

Determinar los ácidos libres en los aceites de oliva. El contenido en ácidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada según el método convencional.

1.1.

Principio

Disolución de la muestra en una mezcla de disolventes y valoración de los ácidos grasos libres mediante una solución etanólica de hidróxido potásico.

1.2.

Reactivos

Todos los reactivos deben ser de calidad analítica reconocida y el agua utilizada debe ser agua destilada o de una pureza equivalente.

1.2.1.

Mezcla de éter dietílico y etanol de 95 % (V/V), en proporción de volumen 1:1.

Nota: El éter dietílico es muy inflamable y puede formar peróxidos explosivos. Debe utilizarse tomando especiales precauciones.

Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilización con la solución de hidróxido potásico (1.2.2) en presencia de 0,3 ml de la solución de fenolftaleína (1.2.3) por cada 100 ml de mezcla.

Nota: Si no es posible utilizar éter dietílico, puede sustituirse por una mezcla de disolventes formada por etanol y tolueno. Si fuera necesario, el etanol podría sustituirse, a su vez, por 2-propanol.

1.2.2.

Solución etanólica valorada de hidróxido potásico, = 0,1 M o, en caso necesario, = 0,5 M. Nota 1.

Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilización, la concentración exacta de la solución etanólica de hidróxido potásico. Debe utilizarse una solución que haya sido preparada por lo menos cinco días antes y decantada en un frasco de vidrio marrón cerrado con tapón de goma. La solución debe ser incolora o de color amarillo paja.

Nota: Se puede preparar una solución incolora y estable de hidróxido potásico de la manera siguiente: Llevar a ebullición, y mantener ésta a reflujo durante una hora, 1 000 ml de etanol con 8 g de hidróxido potásico y 0,5 g de virutas de aluminio. Destilar inmediatamente. Disolver en el destilado la cantidad requerida de hidróxido potásico. Dejar reposar durante varios días y decantar el líquido claro sobrenadante, separándolo del precipitado de carbonato potásico.

La solución también puede prepararse de la manera siguiente sin efectuar la destilación: añadir 4 ml de butilato de aluminio a 1 000 ml de etanol y dejar reposar la mezcla durante algunos días. Decantar el líquido sobrenadante y disolver en él la cantidad necesaria de hidróxido potásico. La solución está lista para ser utilizada.

1.2.3.

Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol de 95-96 % (V/V) o solución de 20 g/l de azul alcalino (en caso de aceites de oliva muy coloreados) en etanol de 95-96 % (V/V).

1.3.

Material

Material habitual de laboratorio, y en particular:

1.3.1.

Balanza analítica

1.3.2.

Matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad

1.3.3.

Bureta de 10 ml de capacidad, con graduación de 0,05 ml

1.4.

Procedimento

1.4.1.

Preparación de la muestra para la prueba

La determinación se efectuará en una muestra filtrada. Si el contenido global de humedad e impurezas es inferior al 1 %, se utilizará la muestra tal cual.

1.4.2.

Muestra para la prueba

Tomar la muestra, según el grado de acidez previsto, de acuerdo con el cuadro siguiente:

>SITIO PARA UN CUADRO>

Pesar la muestra en el matraz erlenmeyer (1.3.2)

1.4.3

Determinación

Disolver la muestra (1.4.2) en 50 a 150 ml de la mezcla de éter dietílico y etanol (1.2.1), previamente neutralizada.

Valorar, agitando, con la solución de hidróxido potásico de 0,1 M (1.2.2) (véase nota 2) hasta el viraje del indicador (la coloración rosa de la fenolftaleína debe permanecer al menos durante 10 segundos).

Nota 1: La solución etanólica valorada de hidróxido potásico (1.2.2) puede sustituirse por una solución acuosa de hidróxido potásico o sódico siempre que el volumen de agua añadido no provoque una separación de las fases.

Nota 2:

Si la cantidad necesaria de la solución de hidróxido potásico de 0,1 M supera los 10 ml, debe utilizarse una solución de 0,5 M.

Nota 3:

Si la solución se enturbia durante la valoración, añadir una cantidad suficiente de la mezcla de disolventes (1.2.1) para que la solución se aclare.

1.5

Expresión de la acidez en porcentaje de ácido oleico

La acidez, expresada en porcentaje de ácido oleico es igual a:

V × c × 1 000 × 100 = V × c × M

V × c ×

M

1 000

×

100

P

=

V × c × M

10 × P

siendo:

V : volumen en ml de la solución valorada de hidróxido potásico utilizada.

c

:

concentración exacta, en moles por litro, de la solución de hidróxido potásico utilizada.

M

:

peso molecular del ácido en que se expresa el resultado (ácido oleico = 282).

P

:

peso en gramos de la muestra utilizada.

Se tomará como resultado la media aritmética de dos determinaciones.

ANEXO III

DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE PERÓXIDOS

1.

OBJETO

La presente norma describe un método para la determinación del índice de peróxidos de los aceites y grasas.

2.

ÁMBITO DE APLICACIÓN

La presente norma es aplicable a los aceites y grasas animales y vegetales.

3.

DEFINICIÓN

El índice de peróxidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de oxígeno activo por kg de grasa) de peróxidos en la muestra que ocasionan la oxidación del yoduro potásico en las condiciones de trabajo descritas.

4.

PRINCIPIO

La muestra problema, disuelta en ácido acético y cloroformo, se trata con solución de yoduro potásico. El yodo liberado se valora con solución valorada de tiosulfato sódico.

5.

APARATOS

Todo el material utilizado estará exento de sustancias reductoras u oxidantes.

Nota: N° engrasar las superficies esmeriladas.

5.1.

Navecilla de vidrio de 3 ml

5.2.

Matraces con cuello y tapón esmerilados, de 250 ml de capacidad aproximadamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco (nitrógeno o, preferiblemente, dióxido de carbono).

5.3.

Bureta de 25 o 50 ml, graduada en 0,1 ml.

6.

REACTIVOS

6.1.

Cloroformo para análisis, exento de oxígeno por borboteo de una corriente de gas inerte puro y seco.

6.2.

Ácido acético glacial para análisis, exento de oxígeno por borboteo de una corriente de gas inerte puro y seco.

6.3.

Solución acuosa saturada de yoduro potásico, recién preparada, exenta de yodo y yodatos.

6.4.

Solución acuosa de tiosulfato sódico 0,01 N o 0,002 N valorada exactamente; la valoración se efectuará inmediatamente antes del uso.

6.5.

Solución de almidón, en solución acuosa de 10 g/l, recién preparada con almidón soluble.

7.

MUESTRA

La muestra se tomará y almacenará al abrigo de la luz, y se mantendrá refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y herméticamente cerrados con tapones de vidrio esmerilado o de corcho.

8.

PROCEDIMIENTO

El ensayo se realizará con luz natural difusa o con luz artificial. Pesar con precisión de 0,001 g en una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un matraz (5.2) una cantidad de muestra en función del índice de peróxidos que se presuponga, con arreglo al cuadro siguiente:

>SITIO PARA UN CUADRO>

Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la muestra problema. Añadir 10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rápidamente la muestra problema mediante agitación. Añadir 15 ml de ácido acético (6.2) y, a continuación, 1 ml de solución de yoduro potásico (6.3). Cerrar rápidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscuridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida entre 15 y 25 oC.

Añadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solución de tiosulfato sódico (6.4) (solución 0,002 N si se presuponen valores inferiores a 12 y solución 0,01 N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando la solución de almidón (6.5) como indicador.

Efectuar dos determinaciones por muestra.

Realizar simultáneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solución de tiosulfato sódico 0,01 N (6.4), sustituir los reactivos.

9.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El índice de peróxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxígeno activo por kg de grasa se calcula mediante la fórmula siguiente:

IP = V × N × 1 000

IP =

V × N × 1 000

p

siendo:

V: ml de solución valorada de tiosulfato sódico (6.4) empleados en el ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo en blanco.

N:

normalidad exacta de la solución de tiosulfato sódico (6.4) empleada.

p:

peso, en gramos de la muestra problema.

El resultado será la media artimética de las dos determinaciones efectuadas.

ANEXO IV

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ALCOHOLES ALIFÁTICOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

1.

OBJETO

El presente método describe un procedimiento para la determinación del contenido de alcoholes alifáticos en las materias grasas, expresado como contenido de cada uno de los alcoholes alifáticos analizados y como contenido total.

2.

PRINCIPIO

Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadido 1-eicosanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido potásico; a continuación, extracción del insaponificable con éter etílico.

Separación de la fracción de alcoholes del insaponificable extraído mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los alcoholes recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se analizan mediante cromatografía de gases con columna capilar.

3.

MATERIAL

3.1.

Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo con juntas esmeriladas.

3.2.

Embudos de decantación de 500 ml.

3.3.

Matraces de 250 ml.

3.4.

Equipo completo de cromatografía en capa fina, utilizando placas de vidrio de 20 × 20 cm.

3.5.

Lámpara ultravioleta de una longitud de onda de 366 o 254 nm.

3.6.

Microjeringas de 100 ml y 500 ml.

3.7.

Embudo cilíndrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 mm), de 2 cm de diámetro y 5 cm de altura, aproximadamente, con un dispositivo adecuado para la filtración en vacío y una junta esmerilada macho 12/21.

3.8.

Matraz cónico para vacío de 50 ml, con junta esmerilada hembra 12/21 acoplable al embudo filtrante (3.7).

3.9.

Probeta de 10 ml de fondo cónico con tapón hermético.

3.10.

Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna capilar, provisto de un sistema de división de flujo formado por:

3.10.1.

Horno para la columna, que pueda mantener la temperatura deseada con precisión de p1 oC.

3.10.2.

Inyector con elemento vaporizador de vidrio tratado con persilano.

3.10.3.

Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.

3.10.4.

Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplificador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y con velocidad de papel variable.

3.11.

Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de 20 a 30 m de longitud y de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interno, recubierta interiormente de líquido SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile entre 0,10 y 0,30 mm.

3.12.

Microjeringa de 10 ml para cromatografía de gases, con aguja endurecida.

4.

REACTIVOS

4.1.

Hidróxido potásico en solución etanólica aproximadamente 2N: disolver, enfriando al mismo tiempo, 130 g de hiróxido potásico (valoración mínima del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio oscuro bien cerradas.

4.2.

Éter etílico de calidad para análisis.

4.3.

Sulfato sódico anhidro de calidad para análisis.

4.4.

Placas de vidrio recubiertas con gel de sílice, sin indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya preparadas para el uso).

4.5.

Hidróxido potásico en solución etanólica 2N: disolver 13 g de hidróxido potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol.

4.6.

Benceno para cromatografía.

4.7.

Acetona para cromatografía.

4.8.

Hexano para cromatografía.

4.9.

Éter etílico para cromatografía.

4.10.

Cloroformo de calidad para análisis.

4.11.

Solución patrón para cromatografía en capa fina: mezcla de alcoholes de C20 a C28, disolución al 5 % en cloroformo.

4.12.

Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol. Para hacerla ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2N de hidróxido potásico.

4.13.

Piridina anhidra para cromatografía.

4.14.

Hexametildisilazano.

4.15.

Trimetilclorosilano.

4.16.

Solución problema de trimetilsililéteres de los alcoholes alifáticos de C20 a C28: preparar en el momento del uso a partir de mezclas de alcoholes puros.

4.17.

1-eicosanol, disolución al 0,1 % (m/v) en cloroformo (patrón interno).

4.18.

Gas portador: hidrógeno o helio de calidad para cromatografía de gases.

4.19.

Gases auxiliares:

- hidrógeno de calidad para cromatografía de gases,

- aire de calidad para cromatografía de gases.

5.

PROCEDIMIENTO

5.1.

Preparación del insaponificable.

5.1.1.

Con la microjeringa de 500 ml introducir en el matraz de 250 ml un volumen de disolución de 1-eicosanol (se puede utilizar igualmente 1 eneicosanol) al 0,1 % en cloroformo (4.17) que contenga una cantidad de 1-eicosanol correspondiente al 10 % aproximadamente del contenido de alcoholes alifáticos en la alícuota de la muestra para la determinación. Por ejemplo, para 5 g de muestra añadir 250 ml de la solución de 1-eicosanol al 0,1 %, si se trata de aceite de oliva, y 1 500 ml, si se trata de aceite de orujo de oliva.

Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación, pesar con precisión, en el mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada.

5.1.2.

Añadir 50 ml de solución etanólica de hidróxido potásico 2N, adaptar el refrigerante de reflujo y calentar al baño María con ligera ebullición, agitando enérgica e ininterrumpidamente hasta que se produzca la saponificación (la solución se vuelve límpida). Calentar durante 20 minutos más y, a continuación, añadir 50 ml de agua destilada por la parte superior del refrigerante; separar el refrigerante y enfriar el matraz a 30 oC aproximadamente.

5.1.3.

Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de separación de 500 ml, mediante varios lavados con un total de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éter etílico, agitar enérgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar hasta la completa separación de las fases (nota 1).

Separar la fase acuosa inferior pasándola a un segundo embudo de separación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el mismo procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de éter etílico.

Nota 1: Las posibles emulsiones podrán eliminarse añadiendo pequeñas cantidades de alcohol etílico o metílico con un pulverizador.

5.1.4.

Reunir las fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de lavado presente reacción neutra.

Una vez eliminada el agua de lavado, secar con sulfato sódico anhidro y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml previamente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeñas cantidades de éter etílico.

5.1.5.

Destilar el éter hasta que queden unos pocos ml; a continuación, secar en un vacío ligero o en una corriente de nitrógeno, completando el secado en una estufa a 100 oC durante 15 minutos aproximadamente; dejar enfriar en un desecador y pesar.

5.2.

Separación de la fracción de alcoholes.

5.2.1.

Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2N de hidróxido potásico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana durante dos horas y, por último, mantenerlas en una estufa regulada a 100 oC durante una hora.

Sacarlas de la estufa y conservarlas en un desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas sometidas a este tratamiento deberán utilizarse en un plazo de quince días como máximo).

Nota 2: Si se utilizan placas básicas de gel de sílice para la separación de la fracción de alcoholes, ya no es necesario tratar el insaponificable con alúmina. De este modo, todos los compuestos de naturaleza ácida (ácidos grasos y otros) quedan retenidos en la línea de aplicación, y la banda de los esteroles aparece perfectamente diferenciada de la banda de los alcoholes alifáticos y terpénicos.

5.2.2.

Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de benceno y acetona 95:5 (V/V) hasta una altura de 1 cm aproximadamente. Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y éter etílico 65:35 (V/V). Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y dejar transcurrir media hora como mínimo, de forma que se alcance el equilibrio líquido-vapor. En las caras interiores de la cubeta pueden colocarse tiras de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elución más uniforme y regular de los componentes.

Nota 3: Para que las condiciones de elución sean perfectamente reproducibles, la mezcla de desarrollo deberá cambiarse en cada prueba.

5.2.3.

Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 % aproximadamente y, con la microjeringa de 100 ml, depositar 0,3 ml de dicha solución en una placa cromatográfica (5.2.1) a unos 2 cm de uno de los bordes, formando una línea lo más fina y uniforme posible. A la altura de la línea de aplicación se depositan, en un extremo de la placa, de 2 a 3 ml de la solución de referencia de alcoholes (4.11) para poder identificar la banda de alcoholes alifáticos una vez efectuado el desarrollo.

5.2.4.

Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica en el punto 5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura de entre 15 y 20 oC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximadamente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la placa bajo una campana unos minutos.

5.2.5.

Pulverizar la placa ligera y uniformemente con la solución de 2,7-diclorofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede identificarse la banda de los alcoholes alifáticos mediante comparación con la mancha obtenida con la solución de referencia; marcar con lápiz negro el conjunto de la banda de alcoholes alifáticos y de la banda inmediatamente superior correspondiente a los alcoholes triterpénicos.

Nota 4: La prescripción de considerar junto con la banda de alcoholes triterpénicos la de alcoholes alifáticos responde al hecho de que la primera, en las condiciones del presente ensayo, incluye cantidades significativas de alcoholes alifáticos.

5.2.6.

Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclar cuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo el filtrado en el matraz cónico (3.8) acoplado al embudo filtrante.

Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener una volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al tubo de ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitrógeno, recoger con algunas gotas de acetona, evaporar de nuevo hasta sequedad, introducir en una estufa a 105 oC durante unos 10 minutos, dejar enfriar en el desecador y pesar.

El residuo que queda en el tubo de ensayo está formado por la fracción de alcoholes.

5.3.

Preparación de los trimetilsililéteres.

5.3.1.

Agregar al tubo que contiene la fracción de alcoholes el reactivo de silanización formado por una mezcla de piridina, hexametildisilazano y trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 5), a razón de 50 ml por miligramo de alcoholes evitando toda absorción de humedad (nota 6).

Nota 5: Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además, también existen otros reactivos de silanización, como el bis-trimetilsililacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que se diluye en el mismo volumen de piridina anhidra.

5.3.2.

Tapar el tubo, agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la total disolución de los alcoholes. Dejar reposar un cuarto de hora, como mínimo, a temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos; la solución límpida queda lista para el análisis mediante cromatografía de gases.

Nota 6: La formación de una ligera opalescencia es normal y no ocasiona ninguna interferencia. La formación de una floculación blanca o la aparición de una coloración rosa son indicios de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este caso deberá repetirse la prueba.

5.4.

Cromatografía de gases.

5.4.1.

Operaciones preliminares: acondicionamiento de la columna.

5.4.1.1.

Colocar la columna en el cromatógrafo uniendo uno de los extremos de la columna al inyector y el otro al detector.

Efectuar los controles generales del equipo para cromatografía de gases (estanquidad de los circuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del sistema de fraccionamiento y del sistema de registro, etc.).

5.4.1.2.

Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla previamente. Hacer pasar un ligero flujo de gas a través de la columna, encender el equipo de cromatografía de gases e iniciar un calentamiento gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 oC superior a la temperatura de trabajo (nota 7). Mantener dicha temperatura durante 2 horas como mínimo; a continuación, poner el equipo completo en condiciones de funcionamiento (regulación del flujo de gases y de la relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador electrónico, regulación de la temperatura del horno, del detector y del inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de base debe ser lineal, estar exento de picos de cualquier tipo y no debe presentar deriva.

Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicionamiento de la columna es insuficiente.

Nota 7: La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre, como mínimo, 20 oC inferior a la temperatura máxima prevista para la fase estacionaria utilizada.

5.4.2.

Elección de las condiciones de trabajo.

5.4.2.1.

Las condiciones de trabajo exigidas son las siguientes:

- temperatura de la columna: inicialmente isoterma durante 8 minutos a 180 oC; a continuación, programar un incremento de 5 oC/minuto hasta alcanzar los 260 oC; después, mantener durante 15 minutos a 260 oC.

- temperatura del inyector: 280 oC,

- temperatura del detector: 290 oC,

- velocidad lineal del gas portador: helio 20 a 35 cm/s, hidrógeno 30 a 50 cm/s,

- relación de «split» de 1/50 a 1/100,

- sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima,

- sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e.,

- velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,

- cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 ml de solución de TMSE.

Estas condiciones pueden modificarse en función de las características de la columna y del cromatógrafo, de modo que se obtengan cromatogramas que cumplan los siguientes requisitos:

- el tiempo de retención del alcohol C26 debe ser de 18 p5 minutos,

- el pico del alcohol C22 debe ser: para el aceite de oliva, 80 p20 % del fondo de escala, y para el aceite de semillas, 40 p20 % del fondo de escala.

5.4.2.2.

Para comprobar los requisitos citados, efectuar varias inyecciones de mezclas problema de TMSE de alcoholes y ajustar las condiciones de trabajo para obtener los mejores resultados.

5.4.2.3.

Los parámetros de integración de los picos deberán establecerse de modo que se obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos tomados en consideración.

5.4.3.

Realización del análisis.

5.4.3.1.

Con la microjeringa de 10 ml tomar 1 ml de hexano, aspirar 0,5 ml de aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 ml de la solución problema; elevar el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la aguja a través del septum y, después de 1 o 2 segundos, inyectar rápidamente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente.

5.4.3.2.

Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los alcoholes presentes.

La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones exigidas (5.4.1.2.).

5.4.4.

Identificación de los picos.

Para la identificación de los diferentes picos se utilizan los tiempos de retención y la comparación con mezclas de TMSE de los alcoholes analizadas en las mismas condiciones.

La figura 1 muestra un cromatograma de la fracción alcohólica de un aceite de oliva virgen.

5.4.5.

Determinación cuantitativa.

5.4.5.1.

Calcular las áreas de los picos del 1-eicosanol y de los alcoholes alifáticos de C22 a C28 utilizando el integrador.

5.4.5.2.

Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los alcoholes, expresado en mg/100 g de materia grasa:

alcohol x = Ax 7 ms 7 100

alcohol x =

Ax 7 ms 7 100

As 7 m

siendo:

Ax: área del pico del alcohol x.

As:

área del pico del 1-eicosanol.

ms:

peso de 1-eicosanol añadido, en miligramos.

m:

peso de la muestra tomado para la determinación, en gramos.

6.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Se expresa el contenido de cada uno de los alcoholes alifáticos en mg/100 g de materia grasa y como «alcoholes alifáticos totales», su suma. (C22 + C24 + C26 + C28).

APÉNDICE

Determinación de la velocidad lineal del gas

Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condiciones normales, de 1 a 3 ìl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de la inyección hasta que aparece el pico (tM).

La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.

>PRINCIPIO DE GRÁFICO>

<?aeFN25,><?aePD7>Figura 1 - Cromatograma de la fracción alcohólica de un aceite de oliva virgen<?aa2A>

<?Þ><?aeBP><?aeNP><?aeTT1> 4 = Tetracosanol <?aeTT2><?aeFA2,><?aeTT3> <?aeTT4> <?aeTA5Y0>

<?aeTS>1 = Eicosanol

<?aeFN2>2 = Dicosanol

<?aeFN2>3 = Tricosanol

<?aeFN2>4 = Tetracosanol

<?aeTC><?aeTC>5 = Pentacosanol

<?aeFN2>6 = Hexacosanol

<?aeFN2>7 = Heptacosanol

<?aeFN2>8 = Octacosanol

<?aeTE><?aa4L><? ><?Þ><?aeLM38,><?aeFN8,><?aePD7>1

2

3

4

5

6

7

8

>FIN DE GRÁFICO>

ANEXO V

DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DEL CONTENIDO DE ESTEROLES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR

1.

OBJETO

El presente método describe un procedimiento para la determinación del contenido de esteroles en las materias grasas, expresado como contenido de cada uno de los esteroles analizados y como contenido total de esteroles.

2.

PRINCIPIO

Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadio a-colestanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido potásico; a continuación, extracción del insaponificable con éter etílico.

Separación de la fracción de esteroles del insaponificable extraído mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los esteroles recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se analizan mediante cromatografía de gases con columna capilar.

3.

MATERIAL

3.1.

Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo con juntas esmeriladas.

3.2.

Embudos de separación de 500 ml.

3.3.

Matraces de 250 ml.

3.4.

Equipo completo de cromatografía en capa fina, utilizando placas de vidrio de 20 × 20 cm.

3.5.

Lámpara ultravioleta de una longitud de onda de 366 o 254 nm.

3.6.

Microjeringa de 100 ml y 500 ml.

3.7.

Embudo cilíndrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 mm), de 2 cm de diámetro y 5 cm de altura, aproximadamente, con un dispositivo adecuado para la filtración en vacío y una junta esmerilada macho 12/21.

3.8.

Matraz cónico para vacío de 50 ml, con junta esmerilada hembra 12/21 acoplable al embudo filtrante (3.7).

3.9.

Probeta de 10 ml de fondo cónico con tapón hermético.

3.10.

Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna capilar, provisto de un sistema de división de flujo formado por:

3.10.1.

Horno para la columna, que pueda mantener la temperatura deseada con precisión de p1 oC.

3.10.2.

Inyector con elemento vaporizador de vidrio tratado con persilano.

3.10.3.

Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.

3.10.4.

Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplificador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y con velocidad de papel variable.

3.11.

Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de 20 a 30 m de longitud y de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interno, recubierta interiormente de líquido SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile entre 0,10 y 0,30 mm.

3.12.

Microjeringa de 10 ml para cromatografía de gases, con aguja endurecida.

4.

REACTIVOS

4.1.

Hidróxido potásico, solución etanólica 2N aproximadamente: disolver, enfriando al mismo tiempo, 130 g de hidróxido potásico (valoración mínima del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio oscuro bien cerradas.

4.2.

Éter etílico de calidad para análisis.

4.3.

Sulfato sódico anhidro de calidad para análisis.

4.4.

Placas de vidrio recubiertas con gel de sílice, sin indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya preparadas para el uso).

4.5.

Hidróxido potásico, solución etanólica 0,2N: disolver 13 g de hidróxido potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con etanol.

4.6.

Benceno para cromatografía.

4.7.

Acetona para cromatografía. (Véase 5.2.2).

4.8.

Hexano para cromatografía. (Véase 5.2.2).

4.9.

Éter etílico para cromatografía. (Véase 5.2.2).

4.10.

Cloroformo de calidad para análisis.

4.11.

Solución patrón para cromatografía en capa fina: colesterol o fitosteroles, solución al 5 % en cloroformo.

4.12.

Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol. Para hacerla ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2N de hidróxido potásico.

4.13.

Piridina anhidra para cromatografía.

4.14.

Hexametildisilazano.

4.15.

Trimetilclorosilano.

4.16.

Solución problema de trimetilsililéteres de los esteroles: preparar en el momento del uso a partir de esteroles puros o de mezclas de esteroles obtenidos de aceites que los contengan.

4.17.

a-colestanol, disolución al 0,2 % (m/V) en cloroformo (patrón interno).

4.18.

Gas portador: hidrógeno o helio de calidad para cromatografía de gases.

4.19.

Gases auxiliares:

- hidrógeno de calidad para cromatografía de gases,

- aire de calidad para cromatografía de gases.

5.

PROCEDIMIENTO

5.1.

Preparación del insaponificable.

5.1.1.

Con la microjeringa de 500 ml introducir en el matraz de 250 ml un volumen de disolución de a-colestanol al 0,2 % en cloroformo (4.17) que contenga una cantidad de a-colestanol correspondiente al 10 % aproximadamente del contenido de esteroles en la alícuota de la muestra para la determinación. Por ejemplo, para 5 g de muestra añadir 500 ml de la solución de a-colestanol al 0,2 %, si se trata de aceite de oliva, y 1 500 ml, si se trata de aceite de semillas o de aceite de orujo de oliva.

Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación, pesar con precisión, en el mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada.

En el caso de aceites y grasas animales o vegetales con un alto contenido de colesterol puede producirse oen pico cuyo tiempo de retención sea idéntico al del colestanol. En tal caso el análisis de la fracción de esteroles debe realizarse dos veces: con patrón interno y sin él.

5.1.2.

Añadir 50 ml de solución etanólica de hidróxido potásico 2N, adaptar el refrigerante de reflujo y calentar en baño María con ligera ebullición, agitando enérgica e ininterrumpidamente hasta que se produzca la saponificación (la solución se vuelve límpida). Calentar durante 20 minutos más y, a continuación, añadir 50 ml de agua destilada por la parte superior del refrigerante; separar el refrigerante y enfriar el matraz a 30 oC aproximadamente.

5.1.3.

Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de separación de 500 ml, mediante varios lavados con un total aproximado de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éter etílico, agitar enérgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar hasta la separación de las fases (nota 1).

Separar la fase acuosa inferior pasándola a un segundo embudo de separación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el mismo procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de éter etílico.

Nota 1: Las posibles emulsiones podrán eliminarse añadiendo pequeñas cantidades de alcohol etílico o metílico con un pulverizador.

5.1.4.

Reunir las fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de lavado presente reacción neutra.

Una vez eliminada el agua de lavado, secar con sulfato sódico anhidro y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml previamente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeñas cantidades de éter etílico.

5.1.5.

Destilar el éter hasta que queden unos pocos ml; a continuación, secar con un vacío ligero o en una corriente de nitrógeno, completando el secado en una estufa a 100 oC durante 15 minutos aproximadamente; dejar enfriar en un desecador y pesar.

5.2.

Separación de la fracción de esteroles.

5.2.1.

Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2N de hidróxido potásico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana durante dos horas y, por último, mantenerlas en una estufa regulada a 100 oC durante una hora. Sacarlas de la estufa y conservarlas en un desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas sometidas a este tratamiento deberán utilizarse en un plazo de quince días como máximo).

Nota 2: Si se utilizan placas básicas de gel de sílice para la separación de la fracción de esteroles, ya no es necesario tratar el insaponificable con alúmina. De este modo, todos los compuestos de naturaleza ácida (ácidos grasos y otros) quedan retenidos en la línea de aplicación, y la banda de los esteroles aparece perfectamente diferenciada de la banda de los alcoholes alifáticos y triterpénicos.

5.2.2.

Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de benceno-acetona 95:5 (v/v) hasta una altura de 1 cm aproximadamente. Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y éter etílico 65:35 (v/v). Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y dejar transcurrir media hora como mínimo, de forma que se alcance el equilibrio líquido-vapor. En las caras interiores de la cubeta pueden colocarse tiras de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elución más uniforme y regular de los componentes.

Nota 3: Para que las condiciones de elución sean perfectamente reproducibles, la mezcla de desarrollo deberá cambiarse en cada prueba.

5.2.3.

Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 % aproximadamente y, con la microjeringa de 100 ml, depositar 0,3 ml de dicha solución en una placa cromatográfica (5.2.1) a unos 2 cm de uno de los bordes, formando una línea lo más fina y uniforme posible. A la altura de la línea de aplicación se depositan, en un extremo de la placa, de 2 a 3 ml de la solución de referencia de esteroles (4.11) para poder identificar la banda de esteroles una vez efectuado el desarrollo.

5.2.4.

Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica en el punto 5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura ambiente entre 15 y 20 oC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximadamente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la placa bajo una campana unos minutos.

5.2.5.

Pulverizar la placa ligera y uniformemente con la solución de 2,7-diclorofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede identificarse la banda de los esteroles mediante comparación con la mancha obtenida a partir de la solución de referencia; marcar con lápiz negro los límites de la banda a lo largo de los márgenes de fluorescencia.

5.2.6.

Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclar cuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo el filtrado en el matraz cónico (3.8) acoplado al embudo filtrante.

Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener un volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al tubo de ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitrógeno, recoger con algunas gotas de acetona, evaporar de nuevo hasta sequedad, introducir en una estufa a 105 oC durante unos 10 minutos, dejar enfriar en el desecador y pesar.

El residuo que queda en el tubo de ensayo está formado por la fracción de esteroles.

5.3.

Preparación de los trimetilsililéteres.

5.3.1.

Agregar al tubo que contiene la fracción de esteroles el reactivo de silanización formado por una mezcla de piridina-hexametildisilazano-trimetilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 4), a razón de 50 ml por miligramo de esteroles, evitando toda absorción de humedad (nota 5).

Nota 4: Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además, también existen otros reactivos de silanización, como el bis-trimetilsililacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que se diluye en el mismo volumen de piridina anhidra.

5.3.2.

Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la completa disolución de los esteroles. Dejar reposar un cuarto de hora, como mínimo, a temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos; la solución límpida queda lista para el análisis mediante cromatografía de gases.

Nota 5: La formación de una ligera opalescencia es normal y no ocasiona ninguna interferencia. La formación de una floculación blanca o la aparición de una coloración rosa son indicios de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este caso deberá repetirse la prueba.

5.4.

Cromatografía de gases.

5.4.1.

Operaciones preliminares: acondicionamiento de la columna.

5.4.1.1.

Colocar la columna en el cromatógrafo uniendo uno de los extremos de la columna al inyector y el otro al detector.

Efectuar los controles generales del equipo para cromatografía de gases (estanquidad de los cricuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del sistema de división de flujo y del sistema de registro, etc.).

5.4.1.2.

Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla previamente. Hacer pasar un ligero flujo de gas a través de la columna, encender el equipo de cromatografía de gases e iniciar un calentamiento gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 oC superior a la temperatura de trabajo (nota 6). Mantener dicha temperatura durante 2 horas como mínimo; a continuación, poner el equipo completo en condiciones de funcionamiento (regulación del flujo de gases y de la relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador electrónico, regulación de la temperatura del horno del detector y del inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de base debe ser lineal, exento de picos de cualquier tipo y no debe presentar deriva.

Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicionamiento de la columna es insuficiente.

Nota 6: La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre, como mínimo 20 oC inferior a la temperatura máxima prevista para la fase estacionaria utilizada.

5.4.2.

Elección de las condiciones de trabajo.

5.4.2.1.

Las condiciones de trabajo exigidas son las siguientes:

- temperatura de la columna: 260 oC p5 oC,

- temperatura del evaporador: 280 oC,

- temperatura del detector: 290 oC,

- velocidad lineal del gas portador: helio 20 a 35 cm/s, hidrógeno 30 a 50 cm/s,

- relación de «split» de 1/50 a 1/100,

- sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima,

- sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e.

- velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,

- cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 ml de solución de TMSE.

Estas condiciones pueden modificarse en función de las características de la columna y del cromatógrafo, de modo que se obtengan cromatogramas que cumplan los siguientes requisitos:

- el tiempo de retención del b-sitosterol debe ser de 20 p5 minutos,

- el pico del campesterol debe ser: para el aceite de oliva (contenido medio del 3 %), 15 p5 % del fondo de escala; para el aceite de soja (contenido medio del 20 %), 80 p10 % del fondo de escala,

- se deben separar todos los esteroles presentes; es necesario que los picos no sólo se separen sino que se resuelvan completamente, es decir, que el trazo del pico llegue a la línea de base antes de que se inicie el pico siguiente. N° obstante, podrá admitirse una resolución incompleta si el pico a TRR 1,02 puede cuantificarse utilizando la perpendicular.

5.4.3.

Realización del análisis.

5.4.3.1.

Con la microjeringa de 10 ml tomar 1 ml de hexano, aspirar 0,5 ml de aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 ml de la solución problema; elevar el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la aguja a través del septum y, después de 1 o 2 segundos, inyectar rápidamente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente.

5.4.3.2.

Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los esteroles presentes.

La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones exigidas (5.4.1.2).

5.4.4.

Identificación de los picos.

Para la identificación de los diferentes picos se utilizan los tiempos de retención y la comparación con mezclas de TMSE de los esteroles analizadas en las mismas condiciones.

La elución de los esteroles se efectúa en el orden siguiente: colesterol, brasicasterol, 24-metilencolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, D-7-campesterol, D-5,23-estigmastadienol, clerosterol, b-sitosterol, sitostanol, D-5-avenasterol, D-5,24-estigmastadienol, D-7-estigmastenol, D-7-avenasterol.

En el cuadro I figuran los tiempos de retención correspondientes al b-sitosterol para las columnas SE 52 y SE 54.

Las figuras 1 y 2 ilustran los cromatogramas típicos de algunos aceites.

5.4.5.

Determinación cuantitativa.

5.4.5.1.

Calcular las áreas de los picos del a-colestanol y de los esteroles utilizando el integrador. N° se tomarán en cuenta los picos de aquellos componentes que no figuren en el cuadro I. El factor de respuesta para el a-colestanol debe considerarse como 1.

5.4.5.2.

Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los esteroles, expresado en mg/100 g de materia grasa:

esterol x = Ax 7 ms 7 100

esterol x =

Ax 7 ms 7 100

As 7 m

siendo:

Ax: área del pico del esterol x, en milímetros cuadrados,

As:

área del pico del á-colestanol,

ms:

peso de á-colestanol añadido, en miligramos,

m:

peso de la muestra tomado para la determinación, en gramos.

6.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

6.1.

Se registran el contenido de cada uno de los esteroles en mg/100 g de materia grasa y, como «esteroles totales», su suma.

6.2.

El porcentaje de cada uno de los esteroles simples es la razón entre el área del pico correspondiente y la suma de las áreas de los picos de los esteroles.

% del esterol X = ÓA × 100

% del esterol X =

Ax

ÓA

× 100

siendo:

Ax : área del pico de x,

ÓA

:

suma de las áreas de todos los picos.

APÉNDICE

Determinación de la velocidad lineal del gas

Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condiciones normales, de 1 a 3 ìl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de la inyección hasta el momento en que aparece el pico (tM).

La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.

>SITIO PARA UN CUADRO>

>PRINCIPIO DE GRÁFICO>

<?aa8H>Figura 1

<?aeFN8><?aa8K>Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva bruto

<?aeVS9><?Þ>

>FIN DE GRÁFICO>

>PRINCIPIO DE GRÁFICO>

<?aa8H>Figura 2

<?aeFN8><?aa8K>Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva refinado

<?aeVS9><?Þ><? ><?Þ"FIN DE GRÁFICO>

ANEXO VI

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ERITRODIOL Y UVAOL

INTRODUCCIÓN

El eritrodiol, entendido corrientemente como conjunto de los dioles eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, característico de algunos tipos de materias grasas. Su concentración es mucho más elevada en los aceites de oliva obtenidos mediante extracción que en los obtenidos mediante presión o en el aceite de pepita de uva y, por lo tanto, su determinación puede servir para comprobar la existencia de aceite de oliva obtenido mediante extracción.

1.

OBJETO

El presente método describe un procedimiento para determinar el eritrodiol en las materias grasas.

2.

PRINCIPIO

La materia grasa se saponifica con una solución etanólica de hidróxido potásico; a continuación se extrae el insaponificable con éter etílico y se purifica pasándolo por una columna de alúmina.

El fraccionamiento del insaponificable se realiza mediante cromatografía en capa fina en placa de gel de sílice y se aíslan la banda de la fracción esterólica y la del eritrodiol.

Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la placa se transforman en trimetilsililéteres y seguidamente se analiza la mezcla mediante cromatografía de gases.

El resultado se expresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto de eritrodiol + esteroles.

3.

MATERIAL Y APARATOS

3.1.

El mismo material que el indicado para el método del Anexo V (Determinación del contenido de esteroles).

4.

REACTIVOS

4.1.

Los mismos reactivos que los indicados para el método del Anexo V (Determinación del contenido de esteroles).

4.2.

Solución patrón de eritrodiol al 0,5 % en cloroformo.

5.

PROCEDIMIENTO

5.1.

Preparación del insaponificable

Se realiza tal como se indica en el apartado 5.1.2 del método del Anexo V

5.2.

Separación del eritrodiol y los esteroles

5.2.1.

Véase el apartado 5.2.1 del método del Anexo V.

5.2.2.

Véase el apartado 5.2.2 del método mencionado.

5.2.3.

Preparar una solución del insaponificable al 5 % en cloroformo.

Con una microjeringa de 0,1 ml depositar 0,3 ml de esta solución en una placa cromatográfica a aproximadamente 1,5 cm del borde inferior de la placa, formando una banda lo más fina y uniforme posible. Depositar en un extremo de la placa, como referencia, algunos microlitros de las soluciones de colesterol y eritrodiol.

5.2.4.

Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica en el apartado 5.2.1. La temperatura ambiente debe ser de unos 20 oC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximadamente del borde superior de la placa. Sacar ésta de la cubeta de desarrollo y evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente.

5.2.5.

Pulverizar la placa uniformemente con la solución alcohólica de 2m, 7m-diclorofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta pueden identificarse las bandas de los esteroles y del eritrodiol mediante comparación con las referencias; delimitar las bandas con una punta ligeramente por el exterior de los márgenes de fluorescencia.

5.2.6.

Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en las áreas delimitadas. Reunir el material obtenido en un matraz cónico de 50 ml; añadir 15 ml de cloroformo caliente, agitar bien y filtrar en el embudo de filtro poroso vertiendo el gel de sílice sobre el propio filtro. Lavar tres veces con 10 ml de cloroformo caliente cada vez, recogiendo el filtrado en un matraz esférico de 100 ml. Evaporar hasta obtener un volumen de 4 a 5 ml, transvasar al tubo de centrifugado de fondo cónico de 10 ml previamente tarado, evaporar hasta sequedad mediante calentamiento suave en corriente de nitrógeno y pesar.

5.3.

Preparación de los trimetilsililéteres

Se realiza tal como se indica en el apartado 5.3 del método del Anexo V.

5.4.

Cromatografía de gases

Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4 del método citado. Las condiciones operativas de la cromatografía de gases deben cumplir los requisitos necesarios para analizar los esteroles y, además, permitir la separación de los TMSE del eritrodiol y del uvaol.

Una vez inyectada la muestra, dejar que se desarrolle el proceso hasta que se produzca la elución de los esteroles presentes, el eritrodiol y el uvaol; identificar los picos (el eritrodiol y el uvaol tienen tiempos de retención relativos, respecto al b-sitosterol, de alrededor de 1,45 y 1,55, respectivamente) y calcular sus áreas de la misma forma que para los esteroles.

6.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Eritrodiol, % = A1 + A2 + Ó Aesterine × 100

Eritrodiol, % =

A1 + A2

A1 + A2 + ÓAesteroles

× 100

siendo:

A1:

área del pico del eritrodiol,

A2:

área del pico del uvaol, en milímetros cuadrados,

ÓAesteroles:

suma de las áreas de los esteroles presentes.

Los resultados deben expresarse con una cifra decimal.

ANEXO VII

DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS SITUADOS EN LA POSICIÓN 2 DE LOS TRIGLICÉRIDOS DE ACEITES Y GRASAS

1.

OBJETO

La presente norma describe un método para la determinación de la composición porcentual de ácidos grasos que se encuentran esterificados en la posición 2 (oposición interna) de los triglicéridos.

2.

CAMPO DE APLICACIÓN

La presente norma es aplicable a los aceites y grasas cuyo punto de fusión se sitúa por debajo de los 45 oC, debido a las características especiales de la acción de la lipasa pancreática.

N° es aplicable sin reservas a los aceites y grasas que contengan cantidades importantes de ácidos grasos con 12 átomos de carbono o menos (aceites de coco y de palmiste, materias grasas butíricas), de ácidos grasos altamente insaturados (con más de cuatro enlaces dobles) que tengan 20 átomos de carbono o más (aceites de pescado y de mamíferos marinos) o de ácidos grasos que tengan grupos con funciones oxigenadas, además del grupo ácido.

3.

PRINCIPIO

Neutralización de los aceites y grasas si fuera necesario. Purificación mediante tratamiento en columna de alúmina. Hidrólisis parcial de los triglicéridos bajo la acción de la lipasa pancreática durante un tiempo determinado. Separación de los monoglicéridos resultantes mediante cromatografía en capa fina y metanólisis de estos monoglicéridos. Análisis de los ésteres metílicos mediante cromatografía gas-líquido.

4.

EQUIPO

4.1.

Matraz de fondo redondo de 100 ml.

4.2.

Matraz de fondo redondo de 25 ml con boca esmerilada.

4.3.

Refrigerante de aire de 1 m de longitud, adaptable al matraz 4.2.

4.4.

Matraz erlenmeyer de 250 ml.

4.5.

Vaso de precipitados de 50 ml.

4.6.

Embudo de separación de 500 ml.

4.7.

Columna para cromatografía, de vidrio, con diámetro interior de 13 mm y longitud de 400 mm, provista de un disco de vidrio poroso y de una llave.

4.8.

Tubo de centrífuga de 10 ml con tapón de vidrio esmerilado.

4.9.

Bureta de 5 ml graduada en 0,05 ml.

4.10.

Jeringa hipodérmica de 1 ml provista de una aguja fina.

4.11.

Microjeringa que pueda dispensar gotas de 3-4 ml.

4.12.

Aplicador para cromatografía en capa fina.

4.13.

Placas de vidrio de 20 × 20 cm para cromatografía en capa fina.

4.14.

Cubeta de desarrollo para cromatografía en capa fina, de vidrio, provista de una tapa de vidrio esmerilado, adecuada para las placas de 20 × 20 cm.

4.15.

Pulverizador para cromatografía en capa fina.

4.16.

Estufa regulada a 103 p2 oC.

4.17.

Termostato regulable a una temperatura comprendida entre 30 y 45 oC con precisión de 0,5 oC.

4.18.

Evaporador rotatorio.

4.19.

Vibrador eléctrico, con el que pueda agitarse vigorosamente el tubo de centrífuga.

4.20.

Lámpara ultravioleta para examinar las placas de capa fina.

Para el control de la actividad lipásica:

4.21.

pH-metro.

4.22.

Agitador espiral.

4.23.

Bureta de 5 ml.

4.24.

Cronómetro.

Para la eventual preparación de la lipasa:

4.25.

Agitador de laboratorio, adecuado para dispersar y mezclar materiales heterogéneos.

5.

REACTIVOS

5.1.

n-Hexano o, en su defecto, éter de petróleo (punto de ebullición 30-50 oC), de calidad para cromatografía.

5.2.

2-Propanol, o etanol, 95 % (v/v) de calidad para análisis.

5.3.

2-Propanol, o etanol, solución acuosa 1/1.

5.4.

Éter dietílico, exento de peróxidos.

5.5.

Acetona.

5.6.

Ácido fórmico, al menos de 98 % (p/p).

5.7.

Solvente de desarrollo: una mezcla de n-hexano (5.1), éter dietílico (5.4) y ácido fórmico (5.6) en las proporciones 70/30/1 (v/v/v).

5.8.

Alúmina activada para cromatografía, neutra, actividad l según Brockmann.

5.9.

Gel de sílice con aglutinante, de calidad para cromatografía en capa fina.

5.10.

Lipasa pancreática de calidad adecuada (véanse las notas 1 y 2).

5.11.

Hidróxido sódico en solución acuosa de 120 g/l.

5.12.

Ácido clorhídrico, solución acuosa 6 N.

5.13.

Solución acuosa de 220 g/l de cloruro de calcio (CaCl2).

5.14.

Solución acuosa de 1 g/l de colato sódico (de calidad enzimática).

5.15.

Solución tampón: solución acuosa de tris-hidroximetil-aminometano 1 M, ajustada a pH = 8 con ácido clorhídrico (5.12) (controlar con un potenciómetro).

5.16.

Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol al 95 % (v/v).

5.17.

Solución de 2 g/l de 2m,7m-diclorofluoresceína en etanol al 95 % (v/v); alcalinizar ligeramente añadiendo 1 gota de solución de hidróxido sódico 1 N por 100 ml.

Para el control de la actividad lipásica:

5.18.

Aceite neutralizado.

5.19.

Solución acuosa de hidróxido sódico 0,1 N.

5.20.

Solución acuosa de 200 g/l de colato sódico (de calidad enzimática).

5.21.

Solución acuosa de 100 g/l de goma arábiga.

6.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al método del Anexo II es inferior al 3 %, se efectuará directamente la purificación en columna de alúmina como se describe en el punto 6.2.

Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al método del Anexo II, es superior al 3 %, se efectuará una neutralización alcalina en presencia de un solvente, como se describe en el punto 6.1, y a continuación e realizará la purificación en columna de alúmina descrita en el punto 6.2.

6.1.

Neutralización alcalina en presencia de un solvente.

Introducir en el embudo de separación (4.6) aproximadamente 10 g de aceite crudo y añadir 100 ml de hexano (5.1), 50 ml de 2-propanol (5.2), algunas gotas de solución de fenolftaleína (5.16) y el volumen de solución de hidróxido sódico (5.11) correspondiente a la acidez libre del aceite más un 0,3 % de exceso. Agitar enérgicamente durante 1 minuto, añadir 50 ml de agua destilada, agitar de nuevo y dejar reposar.

Una vez que se haya producido la separación, separar la capa inferior que contiene los jabones. Separar, asimismo, todas las capas intermedias (mucílago, materias insolubles). Lavar la solución de hexano del

aceite neutralizado con porciones sucesivas de 25-30 ml de la solución de 2-propanol (5.3), hasta que desaparezca el color rosa de la fenolftaleína.

Eliminar la mayor parte del hexano mediante destilación en vacío en el evaporador rotatorio (4.18); desecar el aceite en vacío a 30-40 oC mediante una corriente de nitrógeno puro hasta la completa eliminación del hexano.

6.2.

Purificación con alúmina.

Preparar una suspensión de 15 g de alúmina activada (5.8) en 50 ml de hexano (5.1) y verterla en la columna cromatográfica (4.7), removiendo al mismo tiempo. Dejar que la alúmina se asiente uniformemente y esperar a que el nivel del solvente descienda a 1-2 mm por encima del absorbente. Verter cuidadosamente en la columna 5 g de aceite disueltos en 25 ml de hexano (5.1); recoger todo el eluyente de la columna en un matraz de fondo redondo (4.1).

7.

PREPARACIÓN DE LAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS

Limpiar perfectamente las placas de vidrio (4.13) con etanol, éter de petróleo y acetona para eliminar cualquier rastro de materia grasa.

Introducir en un matraz erlenmeyer (4.4) 30 g de polvo de sílice (5.9). Añadir 60 ml de agua destilada. Tapar y agitar enérgicamente durante 1 minuto. Transferir inmediatamente al aplicador la mezcla semifluida (4.12) y recubrir las placas limpias con una capa de 0,25 mm de espesor.

Secar las placas al aire durante 15 minutos y a continuación en la estufa (4.16) a 103 p2 oC durante 1 hora. Antes del uso, enfriar las placas en un desecador a temperatura ambiente. En el comercio pueden adquirirse placas preparadas.

8.

PROCEDIMIENTO

8.1.

Hidrólisis con lipasa pancreática.

Pesar en el tubo de centrífuga (4.8) 0,1 g aproximadamente de la muestra preparada; si la muestra es aceite líquido, proceder como se indica a continuación; si es una grasa sólida, disolverla en 0,2 ml de hexano (5.1), aplicando, si es necesario, un ligero calentamiento.

Añadir 20 mg de lipasa (5.10) y 2 ml de solución tampón (5.15). Agitar bien, pero con cuidado, y añadir a continuación 0,5 ml de la solución de colato sódico (5.14) y 0,2 ml de la solución de cloruro de calcio (5.13). Cerrar el tubo con el tapón esmerilado, agitar cuidadosamente (evitando humedecer el tapón) e introducir el tubo inmediatamente en el termostato (4.17) a 40 p0,5 oC y agitar manualmente durante 1 minuto exacto.

Sacar el tubo del termostato y agitar enérgicamente con el vibrador eléctrico (4.19) durante 2 minutos exactos.

Enfriar de inmediato en agua corriente; añadir 1 ml de ácido clorhídrico (5.12) y 1 ml de éter dietílico (5.4). Tapar y mezclar enérgicamente con el vibrador eléctrico. Dejar en reposo y extraer la capa orgánica con la jeringa (4.10), tras centrifugar si fuese necesario.

8.2.

Separación de los monoglicéridos por cromatografía en capa fina.

Con ayuda de la microjeringa (4.11) colocar el extracto a 1,5 cm aproximadamente del borde inferior de la placa cromatográfica, depositándolo de manera que forme una línea fina, uniforme y lo más estrecha posible. Introducir la placa en una cubeta de desarrollo (4.14) bien saturada y desarrollar con el solvente de desarrollo (5.7) a unos 20 oC hasta 1 cm aproximadamente del borde superior de la placa.

Secar la placa al aire a la temperatura de la cubeta y pulverizarla con la solución de 2m,7m-diclorofluoresceína (5.17). Identificar la banda de los monoglicéridos (Rf aproximadamente 0,035) con luz ultravioleta (4.20).

8.3.

Análisis de los monoglicéridos por cromatografía gas-líquido.

Raspar con una espátula la banda citada en el punto 8.2 (procurando no raspar los componentes que permanezcan en la línea de base) y pasarla al matraz de metilación (4.2). Tratar directamente la sílice recogida como se indica en el Anexo X-B, de modo que los monoglicéridos se transformen en ésteres metílicos, y, a continuación, examinar los ésteres mediante cromatografía en fase gaseosa, como se describe en el Anexo X-A.

9.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Calcular la composición de los ácidos grasos situados en la posición y expresar el resultado con una cifra decimal (nota 3).

10.

NOTAS

Nota 1: Control de la actividad lipásica

Preparar una emulsión oleosa como sigue: agitar en un mezclador adecuado una mezcla constituida por 165 ml de solución de goma arábiga (5.21), 15 g de hielo picado y 20 ml de aceite neutralizado (5.18).

En un vaso de precipitados (4.5) introducir 10 ml de esta emulsión, 0,3 ml de solución de colato sódico (5.20) y 20 ml de agua destilada.

Colocar el vaso en un termostato a 37 oC p 0,5 oC (nota 4) e introducir los electrodos del pH-metro (4.21) y un agitador espiral (4.22); después, añadir gota a gota con una bureta (4.23) solución de hidróxido sódico (5.19) hasta obtener un pH de 8,5.

Añadir una suspensión acuosa de la lipasa (véase a continuación) en cantidad suficiente. Se mide el pH y, tan pronto como alcance el valor de 8,3, se pone en marcha un cronómetro y se va añadiendo la disolución de hidróxido sódico (5.19) gota a gota, con la velocidad necesaria para mantener constante el pH de 8,3; anotar cada minuto el volumen de solución alcalina consumido.

Llevar los datos obtenidos a un sistema de ejes de coordenadas, indicando en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros de solución alcalina necesarios para mantener constante el pH. Deberá obtenerse una gráfica lineal.

La suspensión de lipasa mencionada es una suspensión en agua al 1/1 000 (p/p). Deberá emplearse en cada ensayo una cantidad suficiente de esta suspensión, de modo que en 4 o 5 minutos se consuma 1 ml de solución alcalina aproximadamente. Normalmente se necesitan de 1 a 5 mg de polvo.

La unidad lipásica se define como la cantidad de enzima que libera 10 ìeq de ácido por minuto. La actividad A del polvo utilizado, medida en unidades lipásicas por mg, se calcula mediante esta fórmula:

Nota 1: A = V × 10

A =

V × 10

p

siendo:

V = volumen de solución de hidróxido sódico (5.19) consumido por minuto (calculado a partir de la gráfica),

p

=

peso, en mg, de la muestras problema de polvo.

Nota 2: Preparación de la lipasa

En el comercio pueden encontrarse lipasas de actividad lipásica satisfactoria. También es posible prepararlas en laboratorio de la manera siguiente: tomar 5 kg de páncreas fresco de cerdo, refrigerado a 0 oC; eliminar la grasa sólida y el tejido conjuntivo que lo rodean, y triturar en un molino de cuchillas hasta obtener una pasta fluida. Con un agitador (4.25) agitar la pasta junto con 2,5 l de acetona anhidra, durante 4-6 horas y después centrifugar. Efectuar tres extracciones más del residuo con el mismo volumen de acetona anhidra, dos extracciones con una mezcla de acetona y éter etílico 1 : 1 (V/V), y dos extracciones con éter etílico, en este orden.

Desecar el residuo al vacío durante 48 horas para obtener un polvo estable, que debe almacenarse en un refrigerador.

Nota 3: Es aconsejable en todos los casos determinar la composición de los ácidos grasos totales de la misma muestra, ya que la comparación con la de los ácidos situados en la posición 2 facilitará la interpretación de las cifras obtenidas.

Nota 4: Por tratarse de un aceite líquido, la hidrólisis se efectúa a 37 oC. N° obstante, en el caso de la muestra problema se efectuará a 40 oC a fin de que puedan examinarse las grasas con puntos de fusión de hasta 45 oC.

ANEXO VIII

DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE TRILINOLEÍNA

1.

OBJETO

Determinación de la composición de los triglicéridos de los aceites líquidos vegetales expresada en su número equivalente de carbonos mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.

La presente norma describe un método para efectuar la separación y determinación de la composición de los triglicéridos de los aceites vegetales según su peso molecular y grado de insaturación en función de su número equivalente de carbonos (véase la nota 1).

2.

CAMPO DE APLICACIÓN

La presente norma es aplicable a todos los aceites vegetales que contengan triglicéridos de ácidos grasos de cadena larga. Este método es especialmente adecuado para detectar la presencia de pequeñas cantidades de aceites semisecantes (ricos en ácido linoleico) en aceites vegetales cuyo principal ácido graso insaturado sea el ácido oleico, como es el caso de los aceites de oliva.

3.

PRINCIPIO

Separación de los triglicéridos en función de su número equivalente de carbonos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa e interpretación de los cromatogramas.

4.

APARATOS

4.1.

Cromatógrafo de líquidos de alta resolución con control termostático de la temperatura de la columna.

4.2.

Sistema de inyección con un volumen de 10 ml.

4.3.

Detector: refractómetro diferencial. La sensibilidad en toda la escala deberá ser como mínimo de 10 4unidades de índice de refracción.

4.4.

Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de diámetro interior, rellena de partículas de sílice de 5 mm de diámetro con un 22-23 % de carbono en forma de octadecilsilano

(nota 2).

4.5.

Registrador y/o integrador.

5.

REACTIVOS

Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de elución deberán desgasificarse y podrán reciclarse varias veces sin que ello afecte a las separaciones.

5.1.

Cloroformo.

5.2.

Acetona.

5.3.

Acetonitrilo.

5.4.

Fase móvil: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarán para obtener la separación deseada; comenzar con una mezcla 50:50).

5.5.

Disolvente de solubilización: acetona o mezcla de acetona-cloroformo 1:1.

5.6.

Triglicéridos de referencia: pueden utilizarse bien triglicéridos comerciales (tripalmitina, trioleína, etc.), en cuyo caso se reflejarán en un gráfico los tiempos de retención frente al número equivalente de carbonos, alternativamente un cromatograma de referencia del aceite de soja (véanse las notas 3 y 4 y las figuras 1 y 2).

6.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Preparar del siguiente modo una solución al 5 % de las muestras que vayan a analizarse: pesar 0,5 p0,001 g de la muestra en un matraz aforado de 10 ml y enrasar hasta 10 ml con el disolvente de solubilización (5.5).

7.

PROCEDIMIENTO

7.1.

Instalar el sistema cromatográfico. Bombear fase móvil (5.4) a razón de 1,5 ml/mm para purgar el sistema completo. Esperar hasta que se obtenga una línea de base estable. Inyectar 10 ml de la muestra preparada como se indica en el punto 6.

8.

CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Utilícese el método de normalización interna, es decir, considérese que la suma de las áreas de los picos de los diferentes triglicéridos es igual a 100 %. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicérido mediante esta fórmula:

% del triglicérido = suma de las áreas de los picos × 100

% del triglicérido =

área del pico

suma de las áreas de los picos

× 100

El resultado se expresa con un decimal.

Nota 1: El orden de elución puede determinarse calculando el número equivalente de carbonos, que a menudo viene dado por la relación NEC = NC 2n, siendo NC el número de carbonos y n el número de enlaces dobles; es posible calcularlo con una precisión mucho mayor tomando en consideración el origen del enlace doble. Si no, nl y nl n son el número de enlaces dobles atribuible a los ácidos oleico, linoleico y linolénico, respectivamente, el número equivalente de carbonos puede calcularse mediante la relación siguiente:

NEC = NC do no dl nl dl n nl n

Los coeficientes do, dl y dln pueden calcularse mediante los triglicéridos de referencia.

En las condiciones que se especifican en el presente método, la relación que se obtenga será similar a la siguiente:

NEC = NC [2,60 no] [2,35 nl] [2,17 nln]

Nota 2: Ejemplos: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333;

Lichrosphere (Merck) 100 CH 18 Art 50377 o similares.

Nota 3: Algunos triglicéridos de referencia también permiten calcular la resolución respecto a la trioleínai:

Nota 3: a = TRm/TRmoleína

á =

TRm/TRmoleína

utilizando el tiempo de retención corregido TRm = TR TR disolvente.

La representación gráfica del log á frente a f (número de enlaces dobles) permite determinar los valores de retención de todos los triglicéridos de los ácidos grasos contenidos en los triglicéridos de referencia (véase la figura 2).

Nota 4: La eficacia de la columna debe permitir separar claramente el pico de la LLL (trilinoleína) de los triglicéridos con tiempo de retención próximo.

>PRINCIPIO DE GRÁFICO>

Figura 1

<?aeFN8>Cromatograma de una muestra de aceite de soja

<?aeFN46,6> <?aePD8>Nota: <?aeSL1><?aeUL1>P: ácido palmítico; St: ácido esteárico; O: ácido oleico; L: ácido linoleico; Ln: ácido linolénico

<?aeIC><?aeVS1><?Þ"FIN DE GRÁFICO>

Monoglicéridos

y diglicéridos

POO

PPO

>PRINCIPIO DE GRÁFICO>

<?aePD8>Figura 2

<?aeFN8>Representación gráfica del log alfa frente a f (número de enlaces dobles)

<?aeVS1><?Þ>Nota: <?aeSL1><?aeUL1>La: ácido laúrico; My: ácido mirístico; P: ácido palmítico; St: ácido esterárico; O: ácido oleico; L: ácido <?ss> linoleico; Ln: ácido linolénico.

<?aeIC"FIN DE GRÁFICO>

ANEXO IX

PRUEBA ESPECTROFOTOMÉTRICA EN EL ULTRAVIOLETA

INTRODUCCIÓN

La prueba espectrofotométrica en el ultravioleta puede proporcionar indicaciones sobre la calidad de una materia grasa, su estado de conservación y las modificaciones inducidas por los procesos tecnológicos.

Las absorciones en las longitudes de onda indicadas en el método se deben a la presencia de sistemas diénicos y triénicos conjudagos. Los valores de estas absorciones se expresan en extinción específica E1cm; %(extinción de una solución de la materia grasa al 1 % en el disolvente determinado, en un espesor de 1 cm) que se expresará convencionalmente como K, también denominado coeficiente de extinción.

1.

OBJETO

El método describe el procedimiento de ejecución de la prueba espectrofotométrica en el ultravioleta de las materias grasas.

2.

PRINCIPIO

La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la extinción de la solución a las longitudes de onda prescritas, respecto al disolvente puro. A partir de los valores espectrofotométricos se calculan las extinciones específicas.

3.

MATERIAL Y APARATOS

3.1.

Espectrofotómetro para medidas de extinción en el ultravioleta entre 220 y 360 nm, con posibilidad de lectura para cada unidad nanométrica.

3.2.

Cubetas de cuarzo, con tapadera, con paso óptico de 1 cm. Las cubetas, llenas de agua o de otro disolvente adecuado, no deben presentar entre ellas diferencias superiores a 0,01 unidades de extinción.

3.3.

Matraces aforados de 25 ml.

3.4.

Columna de cromatografía, de 540 mm de longitud y 35 mm de diámetro, con tubo de reflujo de un diámetro aproximado de 10 mm.

4.

REACTIVOS

4.1.

Isooctano (2,2,4-trimetilpentano) de calidad para espectrofotometría: debe tener, respecto al agua destilada, una transmitancia del 60 % como mínimo a 220 nm y del 95 % como mínimo a 250 nm; o

- ciclohexano de calidad para espectrofotometría: debe tener, respecto al agua destilada, una transmitancia del 40 % como mínimo a 220 nm y del 95 % como mínimo a 250 nm; u

- otro disolvente adecuado, que permita obtener una disolución completa de la materia grasa (por ejemplo, alcohol etílico para el aceite de ricino).

4.2.

Alúmina básica para cromatografía en columna, preparada y controlada como se describe en el apéndice I.

4.3.

n-Hexano para cromatografía.

5.

PROCEDIMIENTO

5.1.

La muestra debe ser perfectamente homogénea y estar exenta de impurezas en suspensión. Los aceites líquidos a temperatura ambiente se filtran con papel de filtro a una temperatura aproximada de 30 oC, las grasas sólidas se homogeneizan y se filtran a una temperatura superior en 10 oC como máximo a su temperatura de fusión.

5.2.

Se pesan con precisión 0,25 g aproximadamente de la muestra preparada y se colocan en un matraz aforado de 25 ml, se completa con el disolvente adecuado y se homogeneiza. La solución resultante debe estar perfectamente clara. Si presenta opalescencia o turbidez, se filtrará rápidamente con papel de filtro.

5.3.

Se llena una cubeta con la solución obtenida y se miden las extinciones, usando como referencia el disolvente empleado, a las longitudes de onda comprendidas entre 232 y 276 nm. Los valores de extinción obtenidos deben estar comprendidos en el intervalo entre 0,1 y 0,8; en caso contrario es necesario repetir la medida utilizando soluciones más concentradas o más diluidas según el caso.

5.4.

Cuando se quiera determinar la extinción específica después del tratamiento con alúmina se procederá del siguiente modo: en la columna para cromatografía se introducen 30 g de alúmina básica en suspensión en hexano; después de asentarse el absorbente se elimina el exceso de hexano, hasta 1 cm aproximadamente sobre el nivel superior de la alúmina.

Se disuelven 10 g de materia grasa, homogeneizada y filtrada tal como se describe en el punto 5.1, en 100 ml de hexano y se vierte esta solución en la columna. Se recoge el líquido eluido y se evapora totalmente el disolvente en vacío a una temperatura inferior a 25 oC.

Con la materia grasa así obtenida se procede inmediatamente tal como se indica en el punto 5.2.

6.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

6.1.

Se expresan las extinciones específicas o coeficientes de extinción a las diversas longitudes de onda, calculadas como sigue:

Kl = c 7 e.

Kl =

Eë

c. e.

siendo:

Kë = extinción específica a la longitud de onda lambda,

Eë

=

extinción medida a la longitud de onda lambda,

c

=

concentración de la disolución en g por 100 ml,

e

=

espesor de la cubeta en cm.

Los resultados deben expresarse con dos cifras decimales.

6.2.

La prueba espectrofotométrica del aceite de oliva según el método oficial de los Reglamentos de la CEE requiere la determinación de la extinción específica, en solución en isooctano, a las longitudes de onda de 232 y 270 nm, y la determinación de DE definido como:

DK = Km Km 4 + Km + 4

DK = Km

Km 4 + Km + 4

2

donde Km es la extinción específica a la longitud de onda m, longitud de onda de máxima absorción alrededor de 270 nm.

APÉNDICE I Preparación de la alúmina y control de su actividad

A.1.1.

Preparación de la alúmina

En un recipiente que pueda cerrarse herméticamente se echa la alúmina previamente desecada en horno a 380-400 oC durante tres horas, se añade agua destilada en una proporción de 5 ml por 100 g de alúmina, se cierra rápidamente el recipiente, se agita repetidas veces y se deja reposar durante 12 horas como mínimo antes del uso.

A.1.2.

Control de la actividad de la alúmina

Se prepara una columna para cromatografía con 30 g de alúmina. Se opera tal como se describe en el apartado 5.4. Se hace pasar a través de la columna una mezcla formada por:

- 95 % de aceite de oliva virgen, con extinción específica a 268 nm menor que 0,18,

- 5 % de aceite de cacahuete tratado con tierras decolorantes en el proceso de refinado, con una extinción específica a 268 nm mayor o igual que 4.

Si, después del paso por la columna, la mezcla presenta una extinción específica a 268 nm mayor que 0,11, la alúmina es aceptable; en otro caso se debe aumentar el porcentaje de hidratación.

APÉNDICE II Ajuste del espectrofotómetro

A.2.

El aparato debe revisarse periódicamente (por lo menos cada seis meses) tanto en lo que se refiere a la conformidad de la longitud de onda como a la exactitud de la respuesta.

A.2.1.

El control de la respuesta de la longitud de onda puede hacerse mediante una lámpara de vapor de mercurio o mediante filtros adecuados.

A.2.2.

Para controlar la célula fotoeléctrica y el fotomultiplicador se procede como sigue: se pesan 0,2 g de cromato potásico de calidad para espectrofotometría, se disuelven, en un matraz aforado de 1 000 ml, en una solución de hidróxido potásico 0,05 N y se completa hasta el enrase. De la solución obtenida se toman exactamente 25 ml, se transvasan a un matraz aforado de 500 ml y se completa hasta el enrase con la misma solución de hidróxido potásico.

Se mide la extinción a 275 nm de la solución así obtenida, utilizando la solución de hidróxido potásico como referencia. La extinción medida en cubeta de 1 cm deberá ser de 0,200 p 0,005.

ANEXO X «A»

ANÁLISIS DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS GRASOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES

1.

OBJETO

El presente método internacional proporciona orientaciones generales para determinar, mediante cromatografía de gases con columna de relleno o capilar, la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos obtenidos con arreglo al Anexo X B.

El método no es aplicable a los ácidos grasos polimerizados.

2.

REACTIVOS

2.1.

Gas portador

Gas inerte (nitrógeno, helio, argón, hidrógeno, etc.), perfectamente desecado y que contenga menos de 10 mg/kg de oxígeno.

Nota 1: El hidrógeno, que sólo se emplea como gas portador en las columnas capilares, puede duplicar la velocidad del análisis, pero es peligroso. Existen dispositivos de seguridad.

2.2.

Gases auxiliares

2.2.1.

Hidrógeno (pureza 799,9 %) exento de impurezas orgánicas.

2.2.2.

Aire u oxígeno, exento de impurezas orgánicas.

2.3.

Patrón de referencia

Una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos puros, o los ésteres metílicos de una grasa de composición conocida y, preferentemente, similar a la de la materia grasa objeto de análisis.

Deberá evitarse la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.

3.

APARATOS

Las normas que figuran a continuación se refieren al equipo ordinario para cromatografía de gases, utilizando columnas de relleno y/o capilares y un detector de ionización de llama. Podrá utilizarse cualquier aparato cuya eficacia y resolución se ajusten a lo dispuesto en el punto 4.1.2.

3.1.

Cromatógrafo de gases

El cromatógrafo de gases constará de los siguientes elementos:

3.1.1.

Sistema de inyección

Utilizar un sistema de inyección:

a) con columnas de relleno, con un espacio muerto lo más pequeño posible (en este caso, el sistema de inyección podrá calentarse a una temperatura que sea entre 20 y 50 oC superior a la de la columna); o

b) con columnas capilares; en este caso, el sistema de inyección estará especialmente diseñado para poder operar con esa clase de columnas; podrá utilizarse un inyector con división de flujo o un inyector «on column».

Nota 2: En ausencia de ácidos grasos con menos de 16 átomos de carbono, podrá utilizarse un inyector de aguja móvil.

3.1.2.

Horno

El horno podrá calentar la columna a 260 oC como mínimo y mantener dicha temperatura con una oscilación máxima de 1 oC, si se emplea una columna de relleno, y de 0,1 oC, si se emplea una columna capilar. Este último requisito es especialmente importante si se utiliza una columna de sílice fundida.

Se recomienda emplear en todos los casos un sistema de calentamiento programado, sobre todo en el caso de ácidos grasos con menos de 16 átomos de carbono.

3.1.3.

Columna de relleno

3.1.3.1.

Columna de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse (es decir, vidrio o acero inoxidable) y de las dimensiones siguientes:

a) Longitud: de 1 a 3 m. Con ácidos grasos de cadena larga (más de C20) es conveniente utilizar una columna relativamente corta. Para el análisis de ácidos con 4 o 6 átomos de carbono se recomienda una columna de 2 m.

b) Diámetro interior: de 2 a 4 mm.

Nota 3: Si hay componentes poliinsaturados con más de tres enlaces dobles, pueden descomponerse en una columna de acero inoxidable.

Nota 4: Puede utilizarse un sistema con doble columna de relleno.

3.1.3.2.

Relleno, que incluya los siguientes elementos:

a) Soporte: tierra de diatomeas lavada con ácido y silanizada, u otro soporte inerte adecuado, con un margen estrecho de tamaño de grano (margen de 25 mm, entre 125 y 200 mm); el tamaño medio de grano estará en función del diámetro interior y de la longitud de la columna.

b) Fase estacionaria: líquido polar de tipo poliéster (por ejemplo: polisuccinato de dietilenglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato de etilenglicol, etc.), cianosiliconas o cualquier otro líquido que permita efectuar la separación cromatográfica exigida (véase el punto 4). La fase estacionalia deberá constituir del 5 % (m/m) al 20 % (m/m) del relleno. Para algunas separaciones podrá utilizarse una fase fija no polar.

3.1.3.3.

Acondicionamiento de la columna

Estando la columna desconectada del detector, si es posible, calentar el horno gradualmente hasta 185 oC y hacer pasar a través de la columna recién preparada una corriente de gas inerte a razón de 20-60 ml/min durante 16 horas como mínimo a la temparatura citada y, a continuación, a la temperatura de 195 oC durante 2 horas más.

3.1.4.

Columna capilar

3.1.4.1.

Tubo de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse (generalmente, vidrio o sílice fundida). El diámetro interior estará comprendido entre 0,2 y 0,8 mm. La superficie interior se someterá a un tratamiento adecuado (por ejemplo, preparación de la superficie, inactivación) antes de introducir el recubrimiento de fase fija. En la mayoría de casos, es suficiente una longitud de 25 mm.

3.1.4.2.

Fase estacionaria de tipo poliglicol [poli(etilenglicol) 20 000], poliéster (polisuccinato de butanodiol) o polisiloxano polar (cianosiliconas), generalmente. Son apropiadas las columnas de fase químicamente ligada.

Nota 5: Existe el riesgo de que los polisiloxanos polares dificulten la identificación y separación del ácido linolénico y de los ácidos C20.

El espesor de la fase estará comprendido entre 0,1 y 0,2 mm.

3.1.4.3.

Montaje y acondicionamiento de la columna.

Observar las precauciones normales de montaje de columnas capilares (es decir, instalación de la columna en el horno, elección y montaje de las juntas (estanqueidad), conexión de los extremos de la columna al inyector y al detector (reducción de los espacios muertos). Colocar la columna bajo un flujo de gas portador [por ejemplo, 0,3 bar (30 kPa) para una columna de 25 mm de longitud y 0,3 mm de diámetro interior].

Acondicionar la columna programando el gradiente de temperatura del horno a 3 oC/min a partir de la temperatura ambiente hasta alcanzar una temperatura 10 oC inferior al límite de descomposición de la fase estacionaria. Mantener el horno a esa temperatura durante 1 hora hasta que se estabilice la línea de base. Restablecer la temperatura de 180 oC para trabajar en condiciones isotérmicas.

Nota 6: En el comercio pueden obtenerse columnas adecuadas previamente acondicionadas.

3.1.5.

Detector que puede calentarse a una temperatura superior a la de la columna.

3.2.

Jeringa

Tendrá una capacidad máxima de 10 ml y estará graduada en 0,1 ml.

3.3.

Registrador

Si se emplea la curva del registrador para calcular la composición de la mezcla analizada, se necesita un registrador electrónico de alta precisión compatible con los aparatos utilizados. El registrador deberá tener las siguientes características:

a) tiempo de repuesta inferior a 1,5 s y, preferiblemente, inferior a 1 s (el tiempo de repuesta es el tiempo que tarda la pluma registradora en pasar de 0 a 90 % después de la introducción instantánea de una señal del 100 %);

b) ancho del papel: 20 cm como mínimo;

c) velocidad del papel: ajustable a valores comprendidos entre 0,4 cm/min y 2,5 cm/min.

3.4.

Integrador

La utilización de un integrador electrónico permite efectuar cálculos rápidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibilidad adecuada y la corrección de la desviación de la línea de base debe ser satisfactoria.

4.

PROCEDIMIENTO

Las operaciones descritas en los puntos 4.1 a 4.3 sólo son válidas si se emplea un detector de ionización de llama.

Como alternativa puede emplearse un cromatógrafo de gases con catarómetro (cuyo funcionamiento se basa en el principio de los cambios de conductividad térmica). En ese caso, las condiciones de ensayo deberán modificarse como se indica en el punto 6.

4.1.

Condiciones de ensayo

4.1.1.

Determinación de las condiciones operativas óptimas

4.1.1.1.

Columna de relleno

Al establecer las condiciones de ensayo deberán tenerse en cuenta las variables siguientes:

a) longitud y diámetro de la columna;

b)

composición y cantidad de la fase estacionaria;

c)

temperatura de la columna;

d)

flujo del gas portador;

e)

resolución exigida;

f)

tamaño de la muestra problema, determinado de modo que el conjunto del detector y el electrómetro dé una respuesta lineal;

g)

duración del análisis.

Como norma general, las cifras de las tablas 1 y 2 permitirán obtener los resultados deseados, es decir, al menos 2 000 platos teóricos por metro de longitud de columna en el caso del estearato de metilo, y su elución en 15 minutos aproximadamente.

Cuando el aparato lo permita, la temperatura del inyector deberá ser de 200 oC aproximadamente y la del detector deberá ser igual o superior a la de la columna.

Por lo general, la razón entre la velocidad de flujo del hidrógeno suministrado al detector de ionización de llama y la del gas portador oscila entre 1:2 y 1:1, en función del diámetro de la columna. El flujo del oxígeno es de 5 a 10 veces superior al del hidrógeno.

>SITIO PARA UN CUADRO>

>SITIO PARA UN CUADRO>

4.1.1.2.

Columna capilar

Las propiedades de eficacia y permeabilidad de las columnas capilares implican que la separación de los constituyentes y la duración del análisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la columna. Por lo tanto, para optimizar las condiciones operativas será necesario manipular este parámetro (o, lo que es más sencillo, la presión en cabeza de columna) según se desee mejorar las separaciones o efectuar un análisis rápido.

4.1.2.

Determinación del número de platos teóricos (eficacia) y de la resolución

(Véase la figura 1)

Efectuar el análisis de una mezcla de estearato de metilo y de oleato de metilo (por ejemplo, ésteres metílicos de manteca de cacao) en proporciones aproximadamente equivalentes.

Escoger la temperatura de la columna y el flujo del gas portador de manera que el máximo del pico del estearato de metilo se registre aproximadamente 15 minutos después del pico del disolvente. Utilizar una cantidad suficiente de la mezcla de ésteres metílicos, de manera que el pico del estearato de metilo se eleve a tres cuartos aproximadamente de la escala completa.

Calcular el número «n» de platos teóricos (eficacia) mediante la siguiente fórmula:

n = 16 [ W+W ]²

n = 16 [

dr1

a1

]²

y la resolución «R» mediante la siguiente fórmula:

R = W1 + W2

R =

2D

a1 + a2

siendo:

dr1

= distancia en mm, desde el inicio del cromatograma hasta el máximo del pico del estearato de metilo,

a1 y a2

= anchura, en mm, de los picos del estearato de metilo y del oleato de metilo, respectivamente, medida entre los puntos de intersección de las tangentes en los puntos de inflexión de la curva con la línea de base,

D

= distancia, en mm, entre los dos máximos de los picos del estearato de metilo y del oleato de metilo.

>PRINCIPIO DE GRÁFICO>

<?aePD8>Figura 1

Cromatograma para determinar el número de platos teóricos (eficacia) y la resolución

<?aeIC><?aeFN29,6"FIN DE GRÁFICO>

Se establecerán unas condiciones de análisis que permitan obtener al menos 2 000 platos teóricos por metro de longitud de columna para el estearato de metilo y una resolución de 1,25 como mínimo.

4.2.

Muestra problema

Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 ml a 2 ml de la solución de ésteres metílicos preparados con arreglo al Anexo X B e inyectarlos en la columna.

En el caso de ésteres no disueltos, preparar una solución de 100 mg/ml aproximadamente en heptano de calidad para cromatografía e inyectar de 0,1 ml a 1 ml de esta solución.

Si sólo se desean detectar los componentes presentes en cantidades muy pequeñas, se podrá aumentar el tamaño de la muestra (hasta 10 veces).

4.3.

Análisis

Como norma general, las condiciones de ensayo son las que se especifican en el punto 4.1.1.

N° obstante, cuando se determinan ácidos con menos de 12 átomos de carbono es posible operar a menor temperatura de columna, mientras que cuando se determinan ácidos grasos con más de 20 átomos de carbono es posible operar a una temperatura mayor. A veces se puede utilizar en los dos casos anteriores un sistema de programación de temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene ésteres metílicos de ácidos grasos con menos de 12 átomos de carbono, inyectar la muestra a 100 oC (o a 50 60 oC si hay ácido butírico) y elevar inmediatamente la temperatura a razón de 4 8 oC/min hasta alcanzar el nivel deseado. En algunos casos es posible combinar ambos procedimientos.

Tras el calentamiento programado, se continúa la elución a temperatura constante hasta que todos los componentes se hayen eluido. Si el instrumento no puede efectuar un calentamiento programado, se opera a dos temperaturas fijas comprendidas entre 100 y 195 oC.

Si es necesario, se recomienda que se efectúe un análisis con dos fases fijas de diferente polaridad para comprobar la ausencia de picos «ocultos», por ejemplo en caso de presencia simultánea de C18:3 y C20:0 o C18:3 y C18:2 conjugados.

dr1

a1

a2

4.4.

Preparación del cromatograma y las gráficas de referencia

Analizar la mezcla patrón de referencia (2.3) aplicando las mismas condiciones de ensayo que a la muestra y medir los tiempos o las distancias de retención de los ácidos grasos que la componen. Representar gráficamente en papel semilogarítmico, para cualquier grado de insaturación, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retención en función del número de átomos de carbono. En condiciones isotérmicas, las gráficas de los ésteres de cadena lineal con el mismo grado de insaturación deben formar líneas rectas. Dichas líneas rectas deben ser aproximadamente paralelas.

Deben evitarse las condiciones que propicien la existencia de «picos ocultos», es decir, una resolución insuficiente para separar dos componentes.

5.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

5.1.

Análisis cualitativo

Identificar l