ANEXO I

Régimen de las pruebas que deben realizarse de conformidad con los artículos 3, 4, 5 y 7

1. PRINCIPIOS GENERALES SOBRE LA PRESENCIA DE LA PLAGA ESPECIFICADA

1.1. Se sospechará la presencia de la plaga especificada cuando se obtenga un resultado positivo en la primera prueba de detección realizada en el vegetal especificado o en las muestras de agua.

1.2. Se confirmará la presencia de la plaga especificada en los siguientes casos: a) cuando la primera o la segunda prueba de detección sea un aislamiento selectivo que dé lugar a colonias con morfología típica y se obtengan resultados positivos en dos pruebas de identificación realizadas en las colonias; b) cuando la primera y la segunda pruebas sean pruebas distintas de un aislamiento selectivo y se obtengan resultados positivos en dos pruebas de identificación después de que la muestra haya sido sometida a un aislamiento selectivo que haya dado lugar a colonias con morfología típica. Una de estas dos pruebas de identificación será una prueba mencionada en el punto 2.2, letras e), f) y g).

2. PRUEBAS

2.1. Pruebas de detección

Las pruebas de detección deberán permitir detectar sistemáticamente al menos 104 células por ml de precipitado resuspendido extraídas de muestras asintomáticas.

La segunda prueba de detección se basará en principios biológicos o regiones de nucleótidos distintos de los de la primera prueba de detección.

Las pruebas de detección son las siguientes:

a) pruebas de inmunofluorescencia, según se describen en las normas internacionales de diagnóstico;

b) aislamiento de la plaga especificada en el medio de crecimiento semiselectivo mSMSA, según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

c) prueba PCR convencional, utilizando los cebadores de Pastrik et al. (2002) (1), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

d) pruebas PCR TaqMan® en tiempo real, utilizando los cebadores y las sondas de: i) Weller et al. (2000) (2), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) [utilizando una sonda TaqMan® modificada a partir de la sonda original descrita por Weller et al. (2000)], según se describe en las normas internacionales de diagnóstico; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (la prueba conocida como «NYtor test»), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico; iv) Massart et al. (2014) (5), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

e) Prueba LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucle), usando los cebadores de Lenarčič et al. (2014) (6) (solamente para material vegetal sintomático), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico.

2.2. Pruebas de identificación

Las pruebas de identificación son las siguientes:

a) pruebas de inmunofluorescencia, según se describen en las normas internacionales de diagnóstico;

b) pruebas PCR convencionales, utilizando los cebadores de Pastrik et al. (2002), según se describen detalladamente en las normas internacionales de diagnóstico;

c) pruebas PCR TaqMan® en tiempo real, utilizando los cebadores y las sondas de: i) Weller et al. (2000), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico; ii) Vreeburg et al. (2016) [utilizando una sonda TaqMan® modificada a partir de la sonda original descrita por Weller et al. (2000)], según se describen detalladamente en las normas internacionales de diagnóstico; iii) Vreeburg et al. (2018) (la prueba conocida como «NYtor test»), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico; iv) Massart et al. (2014), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico;

d) prueba LAMP (amplificación isotérmica mediada por bucle) usando los cebadores de Lenarčič et al. (2014), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

e) prueba PCR convencional multiplex de filotipo específico [Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)], según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

f) Código de barras del ADN [Wicker et al. (2007) (9)], según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

g) espectrometría de masas MALDI-TOF [van de Bilt et al. (2018) (10)], según se describe en las normas internacionales de diagnóstico.

3. DIAGRAMAS DE FLUJO DE LOS PROCEDIMIENTOS

Diagrama de flujo n.o 1: Procedimiento para diagnosticar la presencia de la plaga especificada en muestras del vegetal especificado.

a El aislamiento puede utilizarse como primera o segunda prueba de detección. Si se sospecha la presencia de la plaga especificada en el medio de crecimiento, se purificarán las colonias para obtener cultivos puros en los que se realizarán dos pruebas de identificación.

b Una de estas dos pruebas de identificación será una prueba mencionada en el punto 2.2, letras e), f) y g). Para confirmar la presencia de la plaga, se requieren resultados positivos en las dos pruebas de identificación.

c La tercera prueba de detección se basará en principios biológicos diferentes o regiones de nucleótidos diferentes.

Diagrama de flujo n.o 2: Procedimiento para diagnosticar la plaga especificada en muestras de agua.

a Una de estas dos pruebas de identificación será una prueba mencionada en el punto 2.2, letras e), f) y g). Para confirmar la presencia de la plaga, se requieren resultados positivos en las dos pruebas de identificación.

4. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

4.1. Muestras de tubérculos asintomáticos

La muestra tipo contendrá 200 tubérculos por prueba. El procedimiento de laboratorio adecuado para procesar las cuñas de la parte basal a fin de obtener el extracto para la detección de la plaga especificada se describe en las normas internacionales de diagnóstico.

4.2. Muestras de los vegetales especificados asintomáticos

La detección de infecciones latentes se llevará a cabo en muestras globales de segmentos de los tallos o pecíolos de las hojas. El procedimiento puede aplicarse a un máximo de 200 segmentos de los tallos o a 200 pecíolos de las hojas de distintos vegetales en una sola muestra. El procedimiento de laboratorio adecuado para desinfectar y procesar los segmentos de los tallos o los pecíolos de las hojas a fin de obtener el extracto para la detección de la plaga especificada se describe en las normas internacionales de diagnóstico.

4.3. Muestras de material sintomático de los vegetales especificados

Las secciones de tejido se retirarán asépticamente del anillo vascular de un tubérculo de patata o de los haces vasculares de los tallos de los vegetales especificados que presenten síntomas de marchitez. El procedimiento de laboratorio adecuado para procesar estos tejidos a fin de obtener el extracto para la detección de la plaga especificada se describe detalladamente en las normas internacionales de diagnóstico.

4.4. Muestras de aguas de superficie o de recirculación (también las derivadas de la transformación de la patata o los efluentes de aguas usadas)

La prueba principal para la detección de la plaga especificada en muestras de aguas de superficie, agua procedente de sistemas de recirculación y muestras de efluentes (industria transformadora de la patata) es el aislamiento selectivo. El procedimiento de laboratorio adecuado para procesar las muestras de agua se describe en las normas internacionales de diagnóstico.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

(2) Weller, SA, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detección de cepas de Ralstonia solanacearum con una prueba PCR (TaqMan) cuantitativa, multiplex, en tiempo real y flourogénica. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853-2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Realización de una PCR en tiempo real e inmunofluorescencia para la detección de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus y Ralstonia solanacearum en tubérculos de patata en pruebas rutinarias. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112-121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validación de cuatro PCR TaqMan en tiempo real para la detección de Ralstonia solanacearum y/o Ralstonia pseudosolanacearum y/o Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en tubérculos de patata mediante un enfoque de regresión estadística. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 48, 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Desarrollo de la detección simultánea de Ralstonia solanacearum, raza 3, y Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en tubérculos de patata mediante una prueba PCR multiplex en tiempo real. European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Amplificación isotérmica mediada por bucle de una secuencia génica de una endoglucanasa específica para la detección del patógeno de la marchitez bacteriana Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19-30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the «Ralstonia solanacearum species complex». En Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds. Allen, C., Hayward, A. C. & Prior, P.), pp. 449-461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (Estados Unidos).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, 6790-6801.

(10) Van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.