5)

El anexo IV se sustituye por el texto siguiente: « ANEXO IV DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA CAPILAR 1. OBJETO El presente método describe un procedimiento para la determinación del contenido de ceras en los aceites de oliva. Las ceras se separan en función del número de átomos de carbono. El método puede utilizarse, en particular, para distinguir el aceite de oliva obtenido por presión del obtenido mediante extracción (aceite de orujo de oliva). 2. PRINCIPIO La materia grasa, a la que se habrá añadido un patrón interno adecuado, se fracciona mediante cromatografía en columna de gel de sílice hidratado; se recupera la fracción eluida en primer lugar en las condiciones de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicéridos) y, a continuación, se analiza directamente mediante cromatografía de gases en columna capilar. 3. MATERIAL 3.1. Matraz Erlenmeyer de 25 ml. 3.2. Columna de vidrio para cromatografía de gases, de 15,0 mm de diámetro interior, entre 30 y 40 cm de longitud, y provista de una llave. 3.3. Cromatógrafo de gases adecuado para utilizarse con columna capilar, dotado de un sistema de introducción directa en la columna, que incluya los siguientes elementos: 3.3.1. Recinto termostático para las columnas, provisto de un programador de temperatura. 3.3.2. Inyector en frío para introducción directa en la columna. 3.3.3. Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador. 3.3.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplificador (3.3.3), con un tiempo de respuesta inferior o igual a un segundo y velocidad variable del papel. (También se pueden utilizar sistemas informatizados que contemplen la obtención de los datos de cromatografía de gases mediante un ordenador.). 3.3.5. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de 8 a 12 m de longitud y de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interior, recubierta interiormente de fase estacionaria, con un espesor uniforme que oscile entre 0,10 y 0,30 μm. (Se encuentran en el comercio fases estacionarias adecuadas listas para su empleo, del tipo de la SE-52 o SE-54.). 3.4. Microjeringa para introducción directa en columna, de 10 μl de capacidad, provista de una aguja cementada. 3.5. Vibrador eléctrico. 3.6. Rotavapor. 3.7. Horno de mufla. 3.8. Balanza analítica con una precisión de ± 0,1 mg. 3.9. Material de vidrio normal de laboratorio. 4. REACTIVOS 4.1. Gel de sílice de una granulometría comprendida entre 60 y 200 μm El gel de sílice debe mantenerse durante un mínimo de 4 horas en el horno a 500 °C. Tras su enfriamiento, se añade un 2 % de agua respecto a la cantidad de gel de sílice tomada. Se agita bien para homogeneizar la masa. Se mantiene al abrigo de la luz durante al menos 12 horas antes de su uso. 4.2. n-hexano, de calidad para cromatografía. 4.3. Éter etílico, de calidad para cromatografía. 4.4. n-heptano, de calidad para cromatografía. 4.5. Solución patrón de araquidato de laurilo al 0,1 % (m/v) en hexano (patrón interno). (También puede utilizarse palmitato de palmitilo o estearato de miristilo.). 4.5.1. Sudán 1 (1-fenil-azo-2-naftol). 4.6. Gas portador: hidrógeno o helio puro, de calidad para cromatografía de gases. 4.7. Gases auxiliares: — hidrógeno puro, de calidad para cromatografía de gases, — aire puro, de calidad para cromatografía de gases. 5. PROCEDIMIENTO 5.1. Preparación de la columna cromatográfica Suspender 15 g de gel de sílice (4.1) en n-hexano (4.2) e introducirlo en la columna (3.2). Completar la sedimentación espontánea con ayuda de un vibrador eléctrico (3.5), a fin de obtener una capa cromatográfica más homogénea. Hacer pasar 30 ml de n-hexano para eliminar las posibles impurezas. Pesar exactamente con ayuda de la balanza (3.8) 500 mg de la muestra en el matraz Erlenmeyer de 25 ml (3.1) y añadir la cantidad adecuada del patrón interno (4.5), en función del contenido previsto de ceras; por ejemplo, añadir 0,1 mg de araquidato de laurilo si se trata de aceite de oliva y de 0,25 a 0,50 mg si se trata de aceite de orujo. Transferir la muestra así preparada a la columna cromatográfica, con ayuda de dos porciones, cada una de 2 ml, de n-hexano (4.2). Dejar fluir el disolvente hasta que se sitúe a 1 mm por encima del nivel superior del absorbente, y a continuación hacer pasar 70 ml más de n-hexano para eliminar los n-alcanos presentes de forma natural. Comenzar entonces la elución cromatográfica recogiendo 180 ml de la mezcla de n-hexano/éter etílico en la proporción 99:1, manteniendo un flujo aproximado de 15 gotas cada 10 segundos. La elución de la muestra debe efectuarse a una temperatura ambiente de 22 °C ± 4 °C. Notas: — La mezcla n-hexano/éter etílico (99:1) debe prepararse cada día. — Para controlar visualmente la elución correcta de las ceras, es posible añadir a la muestra en solución 100 μl de Sudán al 1 % en la mezcla de elución. Como el colorante tiene una retención intermedia entre las ceras y los triglicéridos, cuando la coloración llega al fondo de la columna cromatográfica hay que suspender la elución por haberse eluido ya todas las ceras. Secar la fracción resultante en el rotavapor (3.6) hasta que se haya eliminado prácticamente todo el disolvente. Eliminar los dos últimos mililitros del disolvente con ayuda de una débil corriente de nitrógeno; añadir a continuación de 2 a 4 ml de n-heptano. 5.2. Cromatografía de gases 5.2.1. Operaciones preliminares Instalar la columna en el cromatógrafo de gases (3.3), conectando el terminal de entrada al sistema en columna y el terminal de salida al detector. Efectuar los controles generales del cromatógrafo de gases (funcionamiento de los circuitos de gas, eficacia del detector y del registrador, etc.). Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla. Hacer pasar a través de la columna una corriente ligera de gas y, a continuación, encender el cromatógrafo de gases. Calentar gradualmente hasta alcanzar, al cabo de unas 4 horas, la temperatura de 350 °C. Mantener esta temperatura durante al menos 2 horas y, a continuación, ajustar el aparato a las condiciones de trabajo [regulación del flujo del gas, encendido de la llama, conexión con el registrador electrónico (3.3.4), regulación de la temperatura del recinto para la columna, regulación del detector, etc.] y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para efectuar el análisis. La línea de base deberá ser lineal, sin picos de ningún tipo ni deriva. Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna no son correctas; una deriva positiva indica que la columna no ha sido acondicionada adecuadamente. 5.2.2. Elección de las condiciones de trabajo En general, las condiciones de trabajo deben ser las siguientes: — temperatura de la columna: 20 °C/minuto 5 °C/minuto 20 °C/minuto al inicio 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′) — temperatura del detector: 350 °C; — cantidad inyectada: 1 μl de la solución (2-4 ml) de n-heptano, — gas portador: helio o hidrógeno a la velocidad lineal óptima para el gas seleccionado (véase el apéndice), — sensibilidad del instrumento: capaz de responder a las condiciones siguientes: Estas condiciones pueden modificarse en función de las características de la columna y del cromatógrafo de gases, de modo que se obtenga la separación de todas las ceras, una resolución satisfactoria de los picos (véase la figura) y un tiempo de retención del patrón interno C32 de 18 ± 3 minutos. El pico más representativo de las ceras debe haber medido al menos el 60 % del fondo de la escala. Determinar los parámetros de integración de los picos de manera que se obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos considerados. Nota: Ante lo elevado de la temperatura final, se admite una deriva positiva que no debe ser superior al 10 % del fondo de la escala. 5.3. Realización del análisis Tomar 1 μl de la solución con la microjeringa de 10 μl; sacar el émbolo de la jeringa hasta que la aguja esté vacía. Introducir la aguja en el sistema de inyección e inyectar rápidamente después de 1 o 2 segundos; dejar pasar unos 5 segundos y extraer lentamente la aguja. Llevar a cabo el registro hasta que las ceras se hayan eluido completamente. La línea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas. 5.4. Identificación de los picos Identificar los distintos picos sobre la base de los tiempos de retención, comparándolos con mezclas de ceras analizadas en las mismas condiciones y cuyos tiempos de retención sean conocidos. La figura presenta un cromatograma de las ceras de un aceite de oliva virgen. 5.5. Determinación cuantitativa Calcular con ayuda del integrador las áreas de los picos correspondientes al patrón interno y a los ésteres alifáticos de C40 a C46. Determinar el contenido en ceras de cada uno de los ésteres, en mg/kg de materia grasa, aplicando la siguiente fórmula: siendo: Ax = el área del pico de cada éster, en milímetros cuadrados As = el área del pico del patrón interno, en milímetros cuadrados ms = la masa del patrón interno que se ha añadido, en miligramos m = la masa de la muestra tomada para la determinación, en gramos. 6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Indicar la suma de los contenidos de las distintas ceras de C40 a C46, en mg/kg de materia grasa (ppm). Nota: Los componentes que se deben cuantificar hacen referencia a los picos con un número par de carbonos, comprendidos entre los ésteres C40 y C46, según el ejemplo del cromatograma de las ceras del aceite de oliva indicado en la figura siguiente. Si el éster C46 aparece dos veces, para identificarlo conviene analizar la fracción de las ceras de un aceite de orujo de oliva en que el pico C46 sea fácil de identificar por ser claramente mayoritario. Los resultados deben expresarse con una cifra decimal. Figura Cromatograma de las ceras de un aceite de oliva (9) Apéndice Determinación de la velocidad lineal del gas Inyectar de 1 a 3 μl de metano (o propano) en el cromatógrafo de gases, después de haberlo ajustado a las condiciones de trabajo normales. Cronometrar el tiempo que tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de su inyección hasta la aparición del pico (tM). La velocidad lineal, en cm/s, viene dada por la fórmula L/tM, siendo L la longitud de la columna expresada en cm y tM el tiempo cronometrado en segundos.