19)

En la parte C, se añaden los siguientes capítulos: «C.47. Ensayo de toxicidad en las primeras fases de vida de los peces INTRODUCCIÓN 1. El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo (TG) 210 de la OCDE (2013). Los ensayos con peces en sus primeras fases de vida tienen por objeto determinar los efectos letales y subletales de los productos químicos en las fases y especies sometidas a ensayo. Proporcionan valiosa información para estimar los efectos crónicos letales y subletales que provoca el producto en otras especies de peces. 2. Las directrices de ensayo 210 se basan en una propuesta del Reino Unido que se trató en una reunión de expertos de la OCDE celebrada en Medmenham (Reino Unido) en noviembre de 1988. Dicha propuesta se actualizó en 2013 para reflejar la experiencia del uso del ensayo y las recomendaciones de un taller de la OCDE sobre ensayos de toxicidad en peces que tuvo lugar en septiembre de 2010 (1). PRINCIPIO DEL ENSAYO 3. Se exponen los peces en sus primeras fases de vida a un intervalo de concentraciones del producto problema disuelto en agua. Es preferible usar un método dinámico, aunque si no es posible se puede emplear un método semiestático. Debe consultarse el documento de orientación de la OCDE sobre los ensayos de toxicidad acuática con sustancias y mezclas difíciles (2) para obtener más información. El ensayo se inicia con la colocación de huevos fecundados en los recipientes de ensayo y continuará el periodo de tiempo, específico de cada especie, que sea necesario para que los peces testigo alcancen la etapa juvenil. Los efectos letales y subletales se evalúan y comparan con los valores de los testigos para determinar la concentración mínima con efecto observado (LOEC) y, de ahí: i) la concentración sin efecto observado (NOEC) o ii) la ECx (p. ej., EC10, EC20) mediante un modelo de regresión con el fin de estimar la concentración que produciría una variación del x % en el efecto analizado. La presentación de informes sobre las concentraciones y parámetros con efectos relevantes puede depender del marco normativo. Las concentraciones de ensayo deben englobar la ECx de forma que el valor de ECx se obtenga por interpolación y no por extrapolación (véanse las definiciones del apéndice 1). INFORMACIÓN SOBRE EL PRODUCTO PROBLEMA 4. El producto problema es el producto objeto del ensayo. Deben conocerse su hidrosolubilidad (véase el capítulo A.6 del presente anexo) y su presión de vapor (véase el capítulo A.4 del presente anexo). Para calcular la cantidad de producto en las soluciones problema debe disponerse de un método analítico fiable, cuyo límite de cuantificación y exactitud sean conocidos y notificados. Aunque no se requieran para la realización del ensayo, los resultados de un ensayo de toxicidad aguda (véanse los capítulos C.1 o C.49 del presente anexo), efectuado preferiblemente con la especie objeto del presente ensayo, pueden ofrecer información útil. 5. Si el método se utiliza para ensayar una mezcla, debe caracterizarse su composición en la medida de lo posible mediante, por ejemplo, la identidad química de sus componentes, la cantidad en que están presentes y las propiedades específicas de cada sustancia (como las mencionadas anteriormente). Antes de utilizar el método de ensayo con fines normativos en una mezcla hay que considerar si proporcionará resultados adecuados para la finalidad normativa en cuestión. 6. Entre la información útil para establecer las condiciones de ensayo se incluyen la fórmula estructural de la sustancia, su pureza, hidrosolubilidad, estabilidad en el agua y a la luz, pKa, Pow y los resultados de un ensayo de biodegradabilidad fácil (p. ej., capítulos C.4 o C.29 del presente anexo). VALIDEZ DEL ENSAYO 7. Para que el ensayo sea válido han de darse las condiciones siguientes: — la concentración de oxígeno disuelto ha de ser > 60 % del valor de saturación en el aire a lo largo de todo el ensayo; — en ningún momento del ensayo la temperatura del agua debe variar en más de ± 1,5 °C entre los recipientes de ensayo ni entre dos días sucesivos y debe mantenerse en las gamas establecidas para la especie sometida a ensayo (apéndice 2); — es obligatorio realizar mediciones analíticas de las concentraciones de ensayo; — la tasa global de supervivencia de los huevos fecundados y la tasa de supervivencia tras la eclosión testigo y, en su caso, en los testigos de disolvente han de ser superiores o iguales a los límites establecidos en el apéndice 2. 8. Si se observa una desviación mínima en los criterios de validez, deben considerarse las consecuencias en cuanto a fiabilidad de los datos del ensayo y tales consideraciones deberán recogerse en el informe. Los efectos en la supervivencia, eclosión o crecimiento en el testigo de disolvente, en comparación con el testigo negativo, deberán notificarse y analizarse en el contexto de la fiabilidad de los datos del ensayo. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Recipientes de ensayo 9. Se puede utilizar cualquier recipiente de vidrio, acero inoxidable o de otro material químicamente inerte. Como la silicona tiene una gran capacidad de absorción de sustancias lipófilas, se debe minimizar el uso de tubos de silicona en ensayos dinámicos y de juntas de silicona en contacto con el agua usando, por ejemplo, acuarios con cristal monobloque. Las dimensiones de los recipientes deben ser lo suficientemente amplias como para permitir un crecimiento adecuado en el testigo, manteniendo la concentración de oxígeno disuelto (p. ej., para especies de peces pequeños, un tanque adecuado es el de un volumen de 7 litros) y de acuerdo con los criterios de tasa de carga descritos en el punto 19. Es conveniente colocar los recipientes al azar en la zona donde se lleve a cabo el ensayo. Es preferible colocar los recipientes según un esquema de bloques aleatorizados (velando por que todos los tratamientos se apliquen en todos los bloques) que según un esquema completamente aleatorizado. Los recipientes de ensayo han de protegerse de toda perturbación indeseada. El sistema de ensayo deberá acondicionarse preferentemente con concentraciones del producto problema durante un periodo suficiente como para demostrar concentraciones de exposición estables antes de introducir los organismos de ensayo. Selección de las especies 10. Las especies de peces recomendadas figuran en el cuadro 1. Pueden utilizarse otras especies, pero entonces puede que haya que adaptar el procedimiento de ensayo para obtener condiciones experimentales convenientes. En tal caso, deben justificarse la elección de la especie y el método experimental. Preparación de los peces reproductores 11. El apéndice 3 y las referencias (3), (4) y (5) citadas recogen indicaciones detalladas sobre la preparación de peces reproductores en condiciones satisfactorias. Manipulación de los huevos fecundados, los embriones y las larvas 12. Los huevos fecundados, los embriones y las larvas pueden colocarse inicialmente en receptáculos de vidrio o acero inoxidable provistos de paredes o extremos de malla dentro del recipiente principal para permitir el flujo de la solución de ensayo por el recipiente. Puede provocarse un flujo no turbulento a través de los receptáculos suspendiéndolos de un brazo que los desplace en sentido vertical, pero de manera que los organismos permanezcan siempre sumergidos. Los huevos fecundados de salmónidos pueden depositarse en rejillas o mallas con aperturas de dimensiones suficientes para que las larvas pasen a través después de la eclosión. 13. Si se utilizan cubetas, rejillas o mallas para mantener los huevos en el recipiente principal de ensayo, deben retirarse después de la eclosión de las larvas (siguiendo las instrucciones del apéndice 3), pero deben conservarse las mallas que impidan que las larvas se escapen. Si es necesario trasladar las larvas, no deben exponerse al aire ni emplearse redes para sacar las larvas de los recipientes que contengan los huevos. El momento de dicho traslado varía según la especie y debe recogerse en el informe, aunque no siempre es necesario realizar el traslado. Agua 14. Puede utilizarse para el ensayo toda agua en la que la especie de ensayo muestre unas tasas de crecimiento y supervivencia a largo plazo adecuadas (véase el apéndice 4). Su calidad ha de ser constante a lo largo de todo el ensayo. Deben tomarse muestras periódicamente para análisis con el fin de cerciorarse de que el agua de dilución no interfiere en los resultados del ensayo (por ejemplo, por complejación del producto problema) ni altera el comportamiento de los peces reproductores. Se debe proceder a la determinación de los metales pesados (p. ej., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), de los aniones y cationes principales (p. ej., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO42-), del amoníaco, de los niveles residuales totales de plaguicidas clorados, del carbono orgánico total y de los sólidos en suspensión, por ejemplo dos veces al año cuando se sepa que un agua de dilución es de calidad relativamente constante. Si hay constancia de la variabilidad de la calidad del agua, las mediciones deberán realizarse con mayor frecuencia. Dicha frecuencia dependerá de la variabilidad de la calidad. En el apéndice 4 se recogen algunas características químicas que debe tener el agua de dilución para ser aceptada. Soluciones de ensayo 15. Para los ensayos dinámicos se requiere un sistema que aporte y diluya continuamente la solución madre del producto problema (por ejemplo, bomba dosificadora, diluidor proporcional o sistema saturador) para distribuir una serie de concentraciones en los recipientes de ensayo. Los caudales de las soluciones madre y del agua de dilución deben supervisarse con regularidad y no deberían variar en más del 10 % a lo largo del ensayo. Se considera adecuado un caudal equivalente al menos a cinco veces el volumen del recipiente de ensayo cada 24 horas (3). Sin embargo, si se respeta la tasa de carga indicada en el punto 19, se puede usar un caudal menor, p. ej. de 2-3 veces el volumen del recipiente de ensayo, para evitar una retirada rápida del alimento. 16. Las soluciones de ensayo a las concentraciones elegidas se preparan por dilución de una solución madre. La solución madre se prepara preferiblemente por simple mezcla o agitación del producto problema en el agua de dilución (por ejemplo, mediante un agitador o ultrasonidos). Pueden emplearse columnas de saturación (columnas de solubilidad) o métodos de dosificación pasiva (6) para lograr la concentración adecuada de la solución madre. No se recomienda usar un disolvente vehículo. Sin embargo, en el caso de que sea necesario usar un disolvente, debe realizarse un testigo del disolvente en paralelo y con la misma concentración de disolvente que en los tratamientos con el producto problema; es decir, es preferible que el nivel de disolvente sea igual en todos los grupos tratados y en el grupo testigo de disolvente. Esto puede ser técnicamente difícil de lograr en algunos sistemas diluidores; en este caso la concentración de disolvente en el testigo de disolvente debe ser igual a la concentración de disolvente más alta en el grupo de tratamiento. En caso de sustancias difíciles de estudiar, se debe consultar el documento de orientación número 23 de la OCDE sobre los ensayos de toxicidad acuática con sustancias y mezclas difíciles (2). En caso de utilizar un disolvente, su elección vendrá determinada por las propiedades químicas de la sustancia. El documento de orientación número 23 de la OCDE recomienda una concentración máxima de 100 μl/l. Se recomienda mantener la concentración de disolvente lo más baja posible con el fin de evitar que el disolvente pueda influir en los parámetros medidos (7). 17. En el caso de los ensayos semiestáticos, pueden aplicarse dos métodos distintos de renovación. O bien se preparan soluciones problema nuevas en recipientes limpios y se transfieren cuidadosamente los huevos y larvas supervivientes a los nuevos recipientes, o bien se dejan los organismos de ensayo en su recipiente y se cambian al menos los dos tercios del volumen de la solución de ensayo/testigo. PROCEDIMIENTO Condiciones de exposición Duración 18. Conviene iniciar el ensayo lo antes posible tras la fecundación de los huevos. Los embriones se sumergen en la solución de ensayo preferiblemente antes de que comience la fase de división del blastodisco, o lo antes posible después de esta fase. La duración del ensayo dependerá de la especie utilizada. En el apéndice 2 se recogen recomendaciones al respecto. Carga 19. El número de huevos fecundados al principio del ensayo ha de ser suficiente para responder a las necesidades estadísticas. Se reparten al azar entre los distintos tratamientos y se coloca un mínimo de 80 huevos fecundados, repartidos equitativamente entre, al menos, cuatro recipientes de ensayo en paralelo por cada concentración. La tasa de carga (biomasa por volumen de solución de ensayo) debe ser suficientemente baja para poder mantener sin aireación una concentración mínima de oxígeno disuelto del 60 % del valor de saturación en el aire durante las fases de huevo y larva. En los ensayos dinámicos, se recomienda una tasa de carga que no supere 0,5 g/l de peso húmedo en 24 horas ni 5 g/l de solución en cualquier momento (3). Luz y temperatura 20. El fotoperiodo y la temperatura del agua han de ser adecuados para la especie utilizada (apéndice 2). Alimentación 21. La alimentación es fundamental y es esencial proporcionar los alimentos adecuados a cada fase de vida en el momento apropiado y en cantidades suficientes para asegurar un crecimiento normal. La alimentación debe ser aproximadamente igual en todas las réplicas, a menos que se ajuste para tener en cuenta la mortalidad. La comida no consumida y los excrementos deben evacuarse siempre que sea necesario para evitar la acumulación de desechos. En el apéndice 3 se recogen pautas de alimentación detalladas, pero, a medida que se va adquiriendo más experiencia, estas se van corrigiendo de forma continua para mejorar la supervivencia y optimizar el crecimiento. Los alimentos vivos enriquecen el entorno, por lo que, siempre que sea adecuado para las especies y la fase de vida, debe preferirse su uso al de alimentos secos o congelados o utilizarse además de estos. Concentraciones de ensayo 22. Normalmente se requieren cinco concentraciones de producto problema, con un mínimo de cuatro réplicas por cada concentración, espaciadas por un factor constante que no supere 3,2. Se deberá tener en cuenta la información disponible sobre ensayos de toxicidad aguda, preferiblemente con las mismas especies, o considerar la realización de una prueba de determinación del intervalo (1) a la hora de seleccionar el intervalo de concentraciones de ensayo. No obstante, deben tenerse en cuenta todas las fuentes de información a la hora de seleccionar el intervalo de concentraciones de ensayo, incluidas fuentes como, p. ej., datos extrapolados de ensayos de toxicidad aguda en embriones de peces. Cuando solo se vayan a establecer concentraciones sin efecto observado (NOEC) empíricas, se podrá emplear como el ensayo definitivo un ensayo límite, o un ensayo límite ampliado, con menos de cinco concentraciones. Si se usan menos de cinco concentraciones, hay que justificarlo. No es preciso someter a ensayo concentraciones del producto problema superiores a la CL50 tras 96 horas, o a 10 mg/l si esta concentración es inferior. Testigos 23. Solo se debe utilizar un testigo de agua de dilución y, si es necesario, un testigo de disolvente que contenga el disolvente vehículo, además de la serie de concentraciones del producto problema (véase el punto 16). Frecuencia de las determinaciones analíticas y las mediciones 24. Antes de que comience el periodo de exposición, debe garantizarse el funcionamiento correcto del sistema de distribución del producto en todas las réplicas (por ejemplo, mediante la medición de las concentraciones de ensayo). Deben estar especificados todos los métodos analíticos, incluidos los límites adecuados de cuantificación (LOQ) y los conocimientos suficientes sobre la estabilidad del producto en el sistema de ensayo. Durante el ensayo, las concentraciones del producto problema se determinan periódicamente para caracterizar la exposición. Se requieren como mínimo cinco determinaciones. En sistemas dinámicos, se deberán realizar mediciones analíticas del producto problema en una réplica por concentración al menos una vez a la semana, cambiando sistemáticamente entre réplicas. Las determinaciones analíticas adicionales mejoran a menudo la calidad de los resultados del ensayo. En algunos casos puede estar indicado filtrar las muestras para eliminar partículas (por ejemplo, con un filtro de 0,45 μm de diámetro de poro) o centrifugarlas para garantizar que las determinaciones se realizan con el producto en solución verdadera. Los filtros deber saturarse antes de su uso con el fin de reducir la adsorción del producto problema. Cuando las concentraciones medidas no permanezcan en un intervalo del 80-120 % de la concentración nominal, se deberán determinar las concentraciones con efecto. Dichas concentraciones deben expresarse en relación con la media aritmética de la concentración en ensayos dinámicos [véase el apéndice 6 del método de ensayo C.20 para consultar el cálculo de la media aritmética (8)], y en relación con la media geométrica de las concentraciones medidas en ensayos semiestáticos [véase el capítulo 5 del documento de orientación de la OCDE sobre ensayos de toxicidad acuática de sustancias y mezclas difíciles (2)]. 25. Durante el ensayo deben medirse en todos los recipientes de ensayo el oxígeno disuelto, la temperatura y el pH al menos una vez por semana. Si procede, deben medirse además la salinidad y la dureza al comenzar y al finalizar el ensayo. La temperatura debe someterse preferentemente a supervisión continua al menos en un recipiente de ensayo. Observaciones 26. Fase de desarrollo embrionario : al principio de la exposición al producto problema debe comprobarse con tanta precisión como sea posible la fase embrionaria en una muestra representativa de huevos debidamente conservados y limpios. 27. Eclosión y supervivencia : al menos una vez al día deben observarse y contarse las eclosiones y los supervivientes, y anotar estos datos. Si se observan hongos en los huevos al principio de la fase de desarrollo embrionario (p. ej., en el primer o segundo día del ensayo), los huevos afectados deberán contarse y retirarse. Los embriones, las larvas y los peces juveniles muertos deben retirarse en cuanto se localicen, ya que pueden descomponerse rápidamente y pueden deshacerse con las acciones de los demás peces. Dicha retirada ha de hacerse con sumo cuidado para no dañar físicamente los huevos y larvas adyacentes. Los signos para considerar que un organismo está muerto varían según la especie y la fase del desarrollo. Por ejemplo: — para huevos fertilizados: sobre todo en la fase más temprana, disminución acusada de translucidez y cambio de la coloración, debido a la coagulación o la precipitación de las proteínas, que les dan un aspecto blanco opaco; — en embriones, larvas y peces juveniles: inmovilidad, ausencia de movimiento respiratorio, ausencia de latido cardíaco o ausencia de reacción a los estímulos mecánicos. 28. Aspecto anómalo : el número de larvas o peces juveniles que presenten anomalías corporales debe registrarse a intervalos adecuados con arreglo a la duración del ensayo y la naturaleza de la anomalía observada. Cabe señalar que la aparición de larvas y peces juveniles anómalos ocurre en condiciones normales y que su proporción puede alcanzar varias unidades por cada cien en los testigos de algunas especies. Si las deformaciones y los comportamientos anómalos asociados se consideran tan graves como para que haya un notable sufrimiento del organismo y se ha alcanzado un punto en el que la recuperación no será posible, se podrá retirar el organismo del ensayo. Se deberá practicar la eutanasia a dichos animales y se considerarán como muertes en el posterior análisis de datos. Se ha documentado un desarrollo embrionario normal para la mayoría de las especies recomendadas en este método de ensayo (9) (10) (11) (12). 29. Comportamiento anómalo : las anomalías como la hiperventilación, natación descoordinada, inactividad atípica o comportamiento alimentario atípico deben registrarse a intervalos adecuados según la duración del ensayo (p. ej., una vez al día para las especies de aguas cálidas). Pese a ser difíciles de cuantificar, estos efectos, si se observan, pueden contribuir a interpretar los datos de mortalidad. 30. Peso : al final del ensayo deben pesarse todos los peces supervivientes, al menos por réplicas (registrando el número de animales en cada réplica y el peso medio por animal); se prefiere el peso húmedo (secados con material absorbente), aunque también se podrá registrar el peso seco (13). 31. Longitud : al final del ensayo debe medirse la longitud de cada sujeto. Se recomienda medir la longitud total de los peces; no obstante, si se observa una descomposición de la aleta caudal o un desgaste de las aletas, debe emplearse la longitud estándar. Debe usarse el mismo método para medir todos los peces de un ensayo determinado. La longitud de cada sujeto puede medirse, p. ej., mediante pinzas, una cámara digital o un micrómetro ocular calibrado. En el apéndice 2 se recogen las longitudes mínimas típicas. DATOS E INFORME Tratamiento de los resultados 32. Se recomienda que el diseño del experimento y la prueba estadística seleccionada permitan una potencia adecuada (del 80 % o superior) para detectar cambios de importancia biológica en los parámetros cuando hay que informar de una NOEC. La presentación de informes sobre las concentraciones y parámetros con efectos relevantes puede depender del marco normativo. Si hay que informar de una ECx, el diseño del ensayo y el modelo de regresión elegido deben permitir la estimación de la ECx de forma que: i) el intervalo de confianza del 95 % registrado para la ECx no incluya el valor nulo (cero) y no sea demasiado amplio, ii) el intervalo de confianza del 95 % para la media esperada a ECx no contenga la media del testigo y iii) no haya un desajuste significativo del modelo de regresión respecto a los datos. En ambos enfoques hay que identificar la variación porcentual de cada parámetro que sea importante detectar o estimar. Para que esto sea posible, debe elegirse en consecuencia el diseño del ensayo. Cuando no se cumplan las condiciones indicadas anteriormente para determinar la ECx, deberá utilizarse el enfoque de la NOEC. No es probable que se aplique la misma variación porcentual a todos los parámetros, y tampoco lo es que se pueda diseñar un experimento factible que cumpla dichas condiciones para todos los parámetros. Por ello es importante centrarse en los parámetros relevantes para el experimento en cuestión a la hora de diseñarlo adecuadamente. Las directrices y los diagramas de flujo estadísticos para cada enfoque, que se recogen en los apéndices 5 y 6, pueden orientar sobre el tratamiento de los datos y la elección de la prueba o modelo estadístico más apropiado. Se podrán usar otros enfoques estadísticos, siempre que estén científicamente justificados. 33. Será preciso analizar las variaciones en cada serie de réplicas en paralelo mediante el análisis de la varianza o las tablas de contingencia y se usarán métodos de análisis estadísticos adecuados en función de los resultados obtenidos. Para realizar comparaciones múltiples entre los resultados obtenidos a cada concentración y los de los testigos, se recomienda usar la prueba de ajuste secuencial de Jonckheere-Terpstra o la prueba de Williams para respuestas continuas y la prueba de ajuste secuencial de Cochran-Armitage para respuestas cuantales que sean coherentes con una relación concentración-respuesta monónota y no presenten indicios de variación extra-binomial (14). Cuando haya evidencia de variación extra-binomial, se recomienda usar la modificación de Rao-Scott de la prueba de Cochran-Armitage (15) (16), emplear la prueba de Williams o la prueba de Dunnett (después de una transformación arcoseno de la raíz cuadrada) o usar la prueba de Jonckheere-Terpstra ajustada a las proporciones de las réplicas. Cuando los datos no sean coherentes con una relación concentración-respuesta monótona, puede resultar útil emplear los métodos de Dunnett, Dunn o Mann-Whitney para respuestas continuas y la prueba exacta de Fisher para respuestas cuantales (14) (17) (18). Durante la aplicación de cualquier método o modelo estadístico, deben cumplirse los requisitos de dicho método o modelo (p. ej., estimar la variabilidad entre recipientes y tenerla en cuenta en el diseño experimental y en el ensayo o modelo empleado). Debe evaluarse la normalidad de los datos. En el apéndice 5 se indica el procedimiento que debe seguirse con los valores residuales del ANOVA. En el apéndice 6 se recogen consideraciones adicionales sobre el enfoque de regresión. Se deben tener en cuenta las transformaciones necesarias para cumplir los requisitos de una prueba estadística. Las transformaciones necesarias para el ajuste de un modelo de regresión, no obstante, exigen una especial atención, ya que, por ejemplo, una variación del 25 % en una respuesta no transformada no corresponde a una variación del 25 % en una respuesta transformada. En todos los análisis la unidad de análisis debe ser el recipiente de ensayo, y no cada uno de los peces. La unidad experimental, los contrastes de hipótesis y la regresión deben reflejar este hecho (3) (14) (19) (20). Informe del ensayo 34. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: Producto problema: Sustancia de un solo componente: — aspecto físico, hidrosolubilidad y otras propiedades fisicoquímicas pertinentes; — identificación química, como nomenclatura IUPAC o CAS, número CAS, notación SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, identidad química de las impurezas si procede y es viable en la práctica (incluido el contenido de carbono orgánico, si procede). Sustancia de componentes múltiples, sustancias UVCB y mezclas: — deben caracterizarse en la medida de lo posible, p. ej., la identidad química (véase el párrafo anterior), la cantidad en que están presentes y las propiedades fisicoquímicas pertinentes de sus componentes. Especie de ensayo: — denominación científica, variedad, fuente y método de recogida de los huevos fecundados y manipulaciones posteriores. Condiciones del ensayo: — procedimiento de ensayo aplicado (p. ej., semiestático o dinámico, carga); — fotoperiodo(s); — diseño del ensayo [p. ej., número de recipientes de ensayo y número de réplicas, número de huevos por réplica, material y dimensiones del recipiente de ensayo (altura, anchura, volumen), volumen de agua de cada recipiente de ensayo]; — método de preparación de las soluciones madre y frecuencia de renovación (en su caso, se especificará el agente de disolución empleado y su concentración); — método de dosificación del producto problema (p. ej., bombas, sistemas de dilución); — eficiencia de recuperación del método y concentraciones nominales de ensayo, límite de detección, medias de los valores medidos en los recipientes de ensayo y sus desviaciones típicas, método de obtención y datos que muestren que las mediciones se refieren a las concentraciones del producto problema en disolución verdadera; — características del agua de dilución: pH, dureza, temperatura, concentración de oxígeno disuelto, contenido de cloro residual (si se ha medido), carbono orgánico total, sólidos en suspensión (si se ha medido), salinidad del medio de ensayo (si se ha medido) y cualquier otra medición realizada; — calidad del agua en los recipientes de ensayo, pH, dureza, temperatura y concentración de oxígeno disuelto; — información detallada de la alimentación (por ejemplo, tipo de alimento o alimentos, procedencia, cantidad proporcionada y frecuencia). Resultados registrados individualmente (o por réplica) y como media y coeficiente de variación, si procede, de los siguientes parámetros: — datos que demuestren que los testigos cumplen la norma general de aceptabilidad en materia de supervivencia de la especie sometida a ensayo (apéndice 2); — datos sobre la mortalidad en cada fase (embrionaria, larval y juvenil) y mortalidad acumulativa; — días transcurridos hasta la eclosión, número de eclosiones por día y día en que acaba la eclosión; — número de peces sanos al final del ensayo; — longitud (especifíquense si es estándar o total) y peso de los animales supervivientes; — incidencia, descripción y número de anomalías morfológicas, si las hay; — incidencia, descripción y número de efectos sobre el comportamiento, si los hay; — enfoque de análisis estadístico utilizado (análisis de regresión o análisis de la varianza) y de tratamiento de los resultados (prueba o modelo estadístico utilizado); — concentración sin efecto observado para cada respuesta evaluada (NOEC); — concentración mínima con efecto observado (para p = 0,05) para cada respuesta evaluada (LOEC); — si procede, ECx para cada respuesta evaluada e intervalos de confianza (p. ej., del 90 % o el 95 %), así como una representación gráfica del modelo ajustado usado para su cálculo, la pendiente de la curva de concentración-respuesta, la fórmula del modelo de regresión, los parámetros estimados del modelo y sus errores estándares. Cualquier desviación respecto al método de ensayo. Discusión de los resultados del ensayo, incluida la eventual influencia que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo. Cuadro 1 Especies de peces recomendadas para el ensayo DE AGUA DULCE DE ESTUARIO y MARINAS Oncorhynchus mykiss Trucha arcoiris Cyprinodon variegatus Petota Pimephales promelas Pez cabeza gorda Menidia sp. Pejerrey Danio rerio Pez cebra Oryzias latipes Medaka BIBLIOGRAFÍA (1) OCDE (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. (2) OCDE (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Capítulo C.20 del presente anexo, Ensayo de reproducción en Daphnia magna. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 — 376. (14) OCDE (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. (15) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. (17) Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. (18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Apéndice 1 DEFINICIONES Longitud furcal (FL): longitud desde la punta del hocico hasta la escotadura de la aleta caudal. Se utiliza en peces en los que es difícil apreciar dónde termina la columna vertebral (www.fishbase.org). Longitud estándar (SL) : longitud de un pez medida desde la punta del hocico hasta el extremo posterior de la última vértebra o hasta el extremo posterior de la parte mediolateral de la placa hipural. Básicamente, en esta medida se excluye la aleta caudal (www.fishbase.org). Longitud total (TL) : longitud desde la punta del hocico hasta la punta del lóbulo más largo de la aleta caudal, normalmente se mide con los lóbulos comprimidos a lo largo de la línea media. Se mide en línea recta, y no siguiendo la curvatura del cuerpo (www.fishbase.org). Figura 1 Descripción de las diferentes longitudes utilizadas Longitud estándar Longitud furcal Longitud total Producto : sustancia o mezcla. ECx : (concentración con efecto del x %); concentración que provoca el x % de un efecto sobre los organismos de ensayo dentro de un determinado periodo de exposición cuando se compara con un testigo. Por ejemplo, una EC50 es una concentración de la que se estima que causa un efecto sobre un parámetro de ensayo en el 50 % de una población a lo largo de un determinado periodo de exposición. Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : concentración más baja de producto problema con la que se observa un efecto estadístico significativo (con p < 0,05) en comparación con el testigo. Además, todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC deben ejercer un efecto nocivo igual o mayor que el observado a dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explicación completa sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por tanto, la NOEC). En los apéndices 5 y 6 se recogen las directrices pertinentes. Concentración sin efecto observado (NOEC) : concentración de ensayo inmediatamente inferior a la LOEC que, en comparación con el testigo, no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro del periodo de exposición establecido. Producto problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo. UVCB : sustancia de composición desconocida o variable, productos de reacción compleja y materiales biológicos. IUPAC : Unión Internacional de Química Pura y Aplicada. SMILES : Sistema Simplificado de Registro de Líneas Moleculares. Apéndice 2 CONDICIONES Y DURACIÓN DEL ENSAYO Y CRITERIOS DE SUPERVIVENCIA PARA LAS ESPECIES RECOMENDADAS ESPECIES CONDICIONES DEL ENSAYO DURACIÓN RECOMENDABLE DEL ENSAYO Longitud total media mínima típica de los peces testigo al final del ensayo (mm) (98) SUPERVIVENCIA EN LOS TESTIGOS (mínima) Temperatura (°C) Salinidad (0/00) Fotoperiodo (horas) Tasa de eclosiones satisfactorias Tasa de supervivencia tras la eclosión Agua dulce: Oncorhynchus mykiss Trucha arcoiris 10 ± 1,5 (99) 12 — 16 (100) Dos semanas después de que los testigos tomen el alimento del agua (o 60 días tras la eclosión) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Pez cabeza gorda 25 ± 1,5 16 32 días desde el inicio del ensayo (o 28 días tras la eclosión) 18 70 % 75 % Danio rerio Pez cebra 26 ± 1,5 12 — 16 (101) 30 días tras la eclosión 11 70 % 75 % Oryzias latipes Medaka 25 ± 2 12 — 16 (101) 30 días tras la eclosión 17 80 % 80 % De estuario y marina: Cyprinodon variegatus Petota 25 ± 1,5 15-35 (102) 12 — 16 (101) 32 días desde el inicio del ensayo (o 28 días tras la eclosión) 17 75 % 80 % Menidia sp. Pejerrey 22 — 25 15-35 (102) 13 28 días 20 80 % 60 % Apéndice 3 DIRECTRICES DE ALIMENTACIÓN Y MANIPULACIÓN DE PECES REPRODUCTORES Y ANIMALES DE ENSAYO PARA LAS ESPECIES RECOMENDADAS ESPECIES ALIMENTO (*9) MOMENTO DE TRASLADO TRAS LA ECLOSIÓN MOMENTO DE LA PRIMERA ALIMENTACIÓN Peces reproductores Larvas recién eclosionadas Juveniles Tipo Frecuencia Agua dulce: Oncorhynchus mykiss Trucha arcoiris Alimento para truchas Ninguno (1) Alimento inicial para truchas, BSN 2-4 veces al día 14-16 días tras la eclosión o en la etapa de nadar hacia arriba (no es esencial) 19 días tras la eclosión o en la etapa de nadar hacia arriba Pimephales promelas Pez cabeza gorda BSN, alimento en escamas, FBS BSN BSN48, alimento en escamas 2-3 veces al día Cuando la eclosión está al 90 % 2 días tras la eclosión Danio rerio Pez cebra BSN, alimento en escamas Alimento comercial para larvas, protozoos (2), proteína (3) BSN48, alimento en escamas, BSN, una vez al día; alimento en escamas, dos veces al día Cuando la eclosión está al 90 % 2 días tras la eclosión Oryzias latipes Medaka Alimento en escamas BSN, alimento en escamas (o protozoos o rotíferos) BSN48, alimento en escamas (o rotíferos) BSN, una vez al día; alimento en escamas dos veces al día; o alimento en escamas y rotíferos una vez al día No procede 6-7 días tras el desove De estuario y marina: Cyprinodon varieqatus Petota BSN, alimento en escamas, FBS BSN BSN48 2-3 veces al día No procede Un día tras la eclosión/etapa de nadar hacia arriba Menidia sp. Pejerrey BSN48, alimento en escamas BSN BSN48 2-3 veces al día No procede Un día tras la eclosión/etapa de nadar hacia arriba Apéndice 4 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE UN AGUA DE DILUCIÓN ADECUADA Componente Límite de concentración Partículas 5 mg/l Carbono orgánico total 2 mg/l Amoníaco no ionizado 1 μg/l Cloro residual 10 μg/l Plaguicidas organofosforados totales 50 ng/l Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlorados 50 ng/l Cloro orgánico total 25 ng/l Aluminio 1 μg/l Arsénico 1 μg/l Cromo 1 μg/l Cobalto 1 μg/l Cobre 1 μg/l Hierro 1 μg/l Plomo 1 μg/l Níquel 1 μg/l Cinc 1 μg/l Cadmio 100 ng/l Mercurio 100 ng/l Plata 100 ng/l Apéndice 5 ORIENTACIONES ESTADÍSTICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA NOEC Consideraciones generales Los recipientes replicados en paralelo (réplicas) constituyen la unidad de análisis. De este modo, para obtener mediciones continuas, como el tamaño, se deberá calcular la media o mediana de las réplicas y estos valores serán los datos que se usen para el análisis. Habrá que demostrar la potencia de los ensayos utilizados, preferiblemente a partir de una base de datos históricos de cada laboratorio. Para cada parámetro deberá indicarse el efecto sobre el tamaño que pueda detectarse con una potencia del 75-80 % junto con la prueba estadística que se usará. Las bases de datos disponibles en el momento de elaborar el presente método de ensayo indican la potencia que podrá alcanzarse con los procedimientos estadísticos recomendados. Cada laboratorio deberá demostrar su capacidad para cumplir con este requisito de potencia, bien realizando sus propios análisis de potencia o bien probando que el coeficiente de variación (CV) de cada respuesta no sobrepasa el percentil 90 de los CV utilizados para elaborar las directrices de ensayo. El cuadro 1 recoge dichos CV. Si solo se dispone de las medias o medianas de las réplicas, se podrá ignorar el CV intra-réplicas. Cuadro 1 Percentil 90 de los CV de las especies de agua dulce seleccionadas Especies Respuesta CV entre réplicas CV intra-réplicas Trucha arcoiris Longitud 17,4 9,8 Peso 10,1 28 Pez cabeza gorda Longitud 16,9 13,5 Peso 11,7 38,7 Pez cebra Longitud 43,7 11,7 Peso 11,9 32,8 En casi todas las pruebas estadísticas empleadas para evaluar los estudios de toxicología en laboratorios, las comparaciones relevantes son las que se hacen entre los grupos de tratamiento y el testigo. Por esta razón, no es apropiado exigir una prueba F de ANOVA significativa antes de usar la prueba de Dunnett o de Williams o una prueba de Kruskal-Wallis significativa antes de utilizar la prueba de Jonckheere-Terpstra, Mann-Whitney o Dunn (Hochberg y Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). La prueba de Dunnett incluye un ajuste de multiplicidad y, al emplear la prueba F como filtro, los porcentajes de falsos positivos y falsos negativos podrían verse afectados de forma negativa. Asimismo, las pruebas de ajuste secuencial de Williams y Jonckheere-Terpstra con un nivel de significación del 0,05 en cada paso conservan un porcentaje global de falsos positivos del 5 %. Este porcentaje y la potencia de las pruebas pueden verse afectadas de forma negativa si se usa la prueba F o la prueba de Kruskal-Wallis como filtro. Debe ajustare la multiplicidad de las pruebas de Mann-Whitney y de Dunn; se recomienda el ajuste de Bonferroni-Holm. En las directrices de la OCDE (2006) se recoge una exhaustiva discusión sobre la mayoría de las recomendaciones para las pruebas de hipótesis y la verificación de supuestos en las que se basan estos ensayos; además, incluyen una amplia bibliografía. Tratamiento de los testigos cuando se usa un disolvente Si se usa un disolvente, deberán incluirse un testigo de agua de dilución y un testigo de disolvente. Los dos testigos deben compararse para cada respuesta y, si no se observa una diferencia significativa entre ambos, deberán combinarse para realizar un análisis estadístico. Si se observa una diferencia significativa, el testigo de disolvente deberá utilizarse para determinar la NOEC o estimar la ECx y no se utilizará el testigo del agua. Véanse las restricciones de los criterios de validez en el punto 7. Respecto a la longitud, el peso, la tasa de eclosión de huevos, de mortalidad de larvas o de larvas anómalas y el primero o el último día de eclosión o de la etapa de nadar hacia arriba, se debe realizar una prueba T o una prueba de Mann-Whitney para comparar el testigo de agua de dilución y el testigo de disolvente al nivel de significación del 0,05, ignorando todos los grupos de tratamiento. Los resultados de estas pruebas deberán recogerse en el informe. Mediciones de tamaño (longitud y peso) Los valores de longitud y peso de cada pez pueden tener una distribución normal o una distribución logarítmica normal. En ambos casos, las medias de las réplicas tienden hacia una distribución normal debido al teorema del límite central; esto se confirma con datos de más de 100 estudios de las primeras fases de vida de tres especies de agua dulce. Por otro lado, cuando los datos o las bases de datos históricos sugieran una distribución logarítmica normal de los valores de los tamaños de cada pez, se podrá calcular el logaritmo de la media de las réplicas de los valores de cada pez y los datos del análisis podrán ser los antilogaritmos de dichos logaritmos de la media de las réplicas. Se deberán evaluar los datos en cuanto a la coherencia con una distribución normal y la homogeneidad de la varianza. Para ello, se utilizarán los valores residuales de un modelo ANOVA con la concentración como la única variable de tipo explicativa. Podrá llevarse a cabo una determinación visual a partir de diagramas de dispersión e histogramas o usarse diagramas de tallos y hojas. También se podrá emplear una prueba en regla, como la de Shapiro-Wilk o Anderson-Darling. La coherencia con la homogeneidad de la varianza puede evaluarse mediante un análisis visual del mismo diagrama de dispersión o de manera formal con la prueba de Levene. Solo habrá que evaluar la normalidad o la homogeneidad de la varianza en las pruebas paramétricas (p. ej., la de Williams o Dunnett). Se debe prestar especial atención a los posibles valores anómalos y a sus efectos sobre el análisis. Puede usarse la prueba de valores anómalos de Tukey e inspeccionar de forma visual las mismas representaciones gráficas de los valores residuales mencionados anteriormente. Cabe recordar que los objetos de observación son las réplicas enteras, por lo que solo se deberá omitir un valor anómalo del análisis tras una cuidadosa evaluación. Las pruebas estadísticas que hacen uso de las características del diseño experimental y de la expectativa biológica son las pruebas de ajuste secuencial, como las de Williams y Jonckheere-Terpstra. Estas pruebas asumen una relación concentración-respuesta monótona y deberá evaluarse la coherencia de los datos con dicho supuesto. Puede hacerse de forma visual mediante un diagrama de dispersión de la media de las réplicas frente a la concentración de ensayo. Será útil superponer el diagrama de dispersión con un diagrama lineal por tramos que una las medias de concentración ponderadas por el tamaño de las muestras de las réplicas. Una gran desviación de la monotonicidad de dicho diagrama lineal indicaría la posibilidad de tener que utilizar pruebas que no sean de tendencia. Pueden emplearse también pruebas en regla. Una sencilla prueba en regla consiste en calcular los contrastes lineales y cuadráticos de las medias de la concentración. Si el contraste cuadrático es significativo y el contraste lineal no lo es, puede haber un problema de monotonicidad que debe analizarse en profundidad mediante las representaciones gráficas. Cuando la normalidad o la homogeneidad de la varianza puedan suponer un problema, estos contrastes pueden crearse a partir de datos transformados por orden de rangos. Podrán utilizarse otros procedimientos, como la prueba de monotonicidad de Bartholomew, aunque añadirían complejidad. Figura 2 Diagrama de flujo de la NOEC de las mediciones de tamaño (longitud y peso) A menos que los datos no sean coherentes con los requisitos de estas pruebas, la NOEC se determinará con una aplicación de ajuste secuencial de la prueba de Williams o de Jonckheere-Terpstra. Las directrices de la OCDE (2006) ofrecen información sobre dichos procedimientos. Cuando los datos no sean coherentes con los requisitos de una prueba de tendencia de ajuste secuencial, se podrá utilizar la prueba de Dunnett o de Tamhane-Dunnett (T3); ambas pruebas incluyen ajustes de multiplicidad. Estas pruebas suponen que hay normalidad y, en el caso de Dunnet, homogeneidad de la varianza. Cuando no se cumplan las condiciones, se podrá utilizar la prueba no paramétrica de Dunn. En las directrices de la OCDE (2006) se incluye información sobre todas estas pruebas. La figura 2 ofrece una visión general para ayudar a elegir una prueba. Tasa de eclosión de los huevos y de supervivencia de las larvas Los datos son las proporciones de huevos que han eclosionado o de larvas que sobreviven en cada réplica. Dichas proporciones deben evaluarse en cuanto a su variación extra-binomial, que suele ser común pero no universal para tales mediciones. El diagrama de flujo de la figura 3 puede servir de orientación a la hora de seleccionar una prueba. En el texto se ofrecen descripciones detalladas. Habitualmente se usan dos pruebas; la prueba de Tarone C(α) (Tarone, 1979) y la prueba de ji cuadrado; se aplica cada una por separado a cada concentración de ensayo. Si se detecta variación extra-binomial incluso en solo una concentración de ensayo, deberán usarse métodos que se adapten a ello. Fórmula 1 Prueba C (α) de Tarone (Tarone 1979) donde ̂ es la proporción media de una concentración determinada, m es el número de recipientes en paralelo, nj es el número de sujetos en la réplica j, y xj es el número de sujetos en dicha réplica que responden al tratamiento, p. ej., que no han eclosionado o están muertos. Esta prueba se aplica a cada concentración por separado. Aunque puede verse como una prueba de ji cuadrado ajustada, las simulaciones de potencia limitadas efectuadas por Tarone demostraron que es más potente que una prueba de ji cuadrado. Figura 3 Diagrama de flujo de la NOEC de la tasa de eclosión de huevos y de mortalidad de larvas Cuando no exista un indicio significativo de variación extra-binomial, podrá usarse la prueba de ajuste secuencial de Cochran-Armitage. Esta prueba ignora las réplicas, por ello cuando existe tal indicio, se recomienda usar el ajuste de Rao-Scott de la prueba de Cochran-Armitage (RSCA), que tiene en cuenta las réplicas, los tamaños de las réplicas y la variación extra-binomial. Pueden utilizarse otras pruebas, como la prueba de ajuste secuencial de Williams y Jonckheere-Terpstra y la prueba de Dunnett, como se describe para las mediciones de los tamaños. Estas pruebas se aplican haya o no variación extra-binomial, pero a veces pueden tener una menor potencia (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao y Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). Primer o último día de eclosión o de la etapa de nadar hacia arriba La respuesta es un número entero, que da el día del ensayo en el que se detecta la observación indicada en un recipiente en paralelo determinado. Por lo general, la gama de valores es muy limitada y suele haber altas proporciones de valores vinculados, p. ej., se observa el mismo primer día de eclosión en todas las réplicas testigo y, quizás, en una o dos de las concentraciones de ensayo bajas. Las pruebas paramétricas, como las de Williams y Dunnett, no resultan adecuadas para estos datos. A menos que se disponga de indicios de una importante ausencia de monotonicidad, puede usarse la prueba de ajuste secuencial de Jonckheere-Terpstra, que es muy potente para detectar los efectos del producto problema. En caso contrario, podrá utilizarse la prueba de Dunn. Anomalías de las larvas La respuesta es el recuento de larvas en las que se ha observado algún aspecto anómalo. Con frecuencia, esta respuesta es de baja incidencia y presenta algunos de los mismos problemas que el primer día de eclosión, ya que a veces puede ser errática en cuanto a la relación concentración-respuesta. Si los datos siguen al menos una forma aproximada de concentración monótona, la prueba de ajuste secuencial de Jonckheere-Terpstra resulta eficaz para detectar los efectos. En caso contrario, podrá utilizarse la prueba de Dunn. BIBLIOGRAFÍA Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OCDE (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) — A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) — A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratology, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. Apéndice 6 ORIENTACIONES ESTADÍSTICAS PARA LAS ESTIMACIONES DE LA REGRESIÓN Consideraciones generales Las observaciones utilizadas para ajustar un modelo son las medias de las réplicas (longitud y peso) o las proporciones de las réplicas (eclosión de huevos y mortalidad de larvas) (OCDE 2006). Por lo general, se aconseja la regresión ponderada utilizando como peso el tamaño de las muestras de las réplicas. Se pueden emplear otros esquemas de ponderación, como la ponderación por respuesta media prevista o una combinación de esta ponderación y la del tamaño de las muestras de las réplicas. No se recomienda la ponderación mediante la inversa de la varianza de una misma muestra dentro de la concentración (Bunke et al. 1999, Seber y Wild, 2003, Motulsky y Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Cualquier transformación de las respuestas antes del análisis debe mantener la independencia de las observaciones y la ECx y sus límites de confianza deben expresarse en las unidades originales de medida, en lugar de en las unidades transformadas. Por ejemplo, un cambio del 20 % en el logaritmo de la longitud no equivale a un cambio del 20 % en la longitud (Lyles et al. 2008, Draper y Smith 1999). El diagrama de flujo de la figura 4 ofrece una visión general de las estimaciones de la ECx. Los detalles se describen más adelante. Figura 4 Diagrama de flujo de las estimaciones de la ECx de la longitud media por réplica del peso, o de la proporción de eclosiones de huevos o mortalidad de las larvas (véase el texto para más detalles) Consideraciones sobre la tasa de eclosión de huevos y de mortalidad de larvas Para la eclosión de huevos y la mortalidad de larvas, por lo general lo mejor es ajustar un modelo decreciente, a menos que se esté ajustando un modelo de probit, como se describe más adelante. Es decir, conviene crear un modelo para la proporción de huevos que no eclosionan o de larvas que mueren. El motivo de ello es que la ECx se refiere a una concentración a la que hay un cambio igual al x % de la respuesta media del testigo. Si el 5 % de los huevos testigo no consiguen eclosionar y se crea un modelo de la incapacidad de eclosionar, la EC20 se refiere a una concentración a la que se produce una variación del 20 % del 5 % de los huevos testigo no eclosionados, lo que supone una variación de 0,2*0,05 = 0,01 o 1 punto porcentual hasta una tasa de no eclosión de los huevos del 6 %. Una variación tan pequeña no se puede estimar de forma significativa a partir de los datos disponibles y no es biológicamente importante. Mientras que si se crea un modelo de la proporción de huevos que eclosionan, la proporción del testigo será del 95 % en este ejemplo y una reducción del 20 % con respecto a la media del testigo supondría una variación de 0,95*0,2 = 0,18, con lo que la tasa de eclosión pasaría del 95 % al 77 % (= 95-18); la concentración que produce dichos efectos puede estimarse y probablemente sea de más interés. No se trata de un problema con las mediciones de tamaño, aunque unos efectos adversos sobre el tamaño suelen traducirse en una disminución de la talla. Modelos relacionados con el tamaño (longitud o peso) y la tasa de eclosión de huevos o de supervivencia de las larvas Excepto el modelo hormético de Brain-Cousens, todos estos modelos se describen y recomiendan en las directrices de la OCDE (2006). También se discuten los experimentos de ecotoxicidad en Slob de los llamados modelos OCDE 2-5 (2002). Existen, por supuesto, muchos otros modelos que pueden resultar de utilidad. Bunke, et al. (1999) enumeran los muchos modelos que no se incluyen en el presente documento y ofrecen un gran número de referencias a otros modelos. Los modelos indicados a continuación se consideran especialmente adecuados en experimentos de ecotoxicidad y se han usado ampliamente. Con 5 concentraciones de ensayo más un testigo — Bruce-Versteeg — Exponencial simple (OCDE 2) — Exponencial con parámetro de forma (OCDE 3) — Exponencial simple con límite inferior (OCDE 4) Con 6 concentraciones de ensayo como mínimo más un testigo — Exponencial con parámetro de forma y límite inferior (OCDE 5) — Michaelis-Menten — Hill Cuando existen indicios visuales de hormesis (poco probable en caso de éxito en la eclosión de huevos o de supervivencia de las larvas, pero se observa a veces con el tamaño): — Modelo hormético de Brain-Cousens; Brain y Cousens (1989) Otros modelos relacionados con la tasa de huevos no eclosionados y de mortalidad de larvas — Si no hay indicios de variación extra-binomial, se pueden ajustar modelos de incremento de parámetros para estas respuestas mediante modelos de probit (o logísticos); la incidencia del testigo se estima en el ajuste del modelo. Este método no es el método de preferencia, ya que toma el sujeto, y no la réplica, como unidad de análisis (Morgan 1992, O'Hara Hines y Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Calidad del ajuste de un solo modelo — Comparar visualmente los porcentajes de disminución observados y previstos a cada concentración de ensayo (Motulsky y Christopoulos 2004, Draper y Smith 1999). — Comparar los cuadrados medios de los errores de regresión y los cuadrados medios de los errores puros mediante una prueba F (Draper y Smith 1999). — Verificar que cada término del modelo es significativamente diferente de cero (es decir, determinar si todos los términos del modelo son importantes) (Motulsky y Christopoulos 2004). — Gráficas de los valores residuales de la regresión frente a la concentración de ensayo, posiblemente sobre una escala logarítmica de la concentración. No debe haber ningún patrón para esta representación gráfica; los puntos deberán estar dispersos aleatoriamente sobre una línea horizontal a la altura cero. — Deben evaluarse la normalidad y la homogeneidad de la varianza de los datos, como se indica en el apéndice 5. — Además, la normalidad de los valores residuales del modelo de regresión debe evaluarse siguiendo los mismos métodos que se indican en el apéndice 5 para los valores residuales del ANOVA. Comparación de los modelos — Utilizar los criterios AICc de Akiake. Unos valores AICc más pequeños denotan un mejor ajuste y si AICc(B)-AICc(A) ≥ 10, el modelo A es casi seguramente mejor que el modelo B (Motulsky y Christopoulos 2004). — Comparar visualmente los dos modelos para ver cómo responden a los criterios de un solo modelo indicados anteriormente. — Se aconseja seguir el principio de parsimonia, según el cual se utilizará el modelo más simple que ajuste los datos razonablemente bien (Ratkowsky 1993, Lyles et al. 2008). Calidad de la estimación de ECx El intervalo de confianza (CI) de la ECx no debe ser demasiado amplio. Debe aplicarse el juicio estadístico para decidir la amplitud del intervalo de confianza y que la ECx siga siendo útil. Las simulaciones de los modelos de regresión ajustados a los datos relacionados con la eclosión de los huevos y el tamaño muestran que alrededor del 75 % de los intervalos de confianza de la ECx (x = 10, 20 o 30) no abarcan más de dos concentraciones de ensayo. Este hecho nos da una idea general de lo que es aceptable y factible. Numerosos autores han afirmado que es necesario indicar los intervalos de confianza de todos los parámetros del modelo y que, cuando dichos intervalos de confianza son amplios, los modelos son inaceptables (Ott y Longnecker 2008, Alvord y Rossio 1993, Motulsky y Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber y Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environnement Canada, 2005). El intervalo de confianza de ECx (o de cualquier otro parámetro del modelo) no debe contener el valor nulo (cero) (Motulsky y Christopoulos 2004). Se trata del equivalente en modelos de regresión a la diferencia significativa mínima que se suele citar en los enfoques de verificación de hipótesis (Wang et al. 2000, por ejemplo). Corresponde igualmente al intervalo de confianza de las respuestas medias a la LOEC que no contienen la media del testigo. Cabe preguntarse si las estimaciones de los parámetros son científicamente plausibles. Por ejemplo, si el intervalo de confianza de y0 es ± 20 %, no es plausible ninguna estimación de EC10. Si el modelo prevé un efecto del 20 % a una concentración C y si el efecto máximo observado a la concentración C y a las concentraciones inferiores es del 10 %, la EC20 no es plausible (Motulsky y Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environnement Canada, 2005). La ECx no debe extrapolarse fuera de la gama de concentraciones positivas (Draper y Smith 1999, OCDE 2006). Por ejemplo, una orientación general podría ser que la ECx no esté más de un 25 % aproximadamente por debajo de la concentración de ensayo más baja ni por encima de la concentración de ensayo más alta. BIBLIOGRAFÍA Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878-886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OCDE (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. C.48 Ensayo de reproducción de peces a corto plazo INTRODUCCIÓN 1. El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo (TG) 229 de la OCDE (2012). La necesidad de desarrollar y validar un ensayo en peces capaz de detectar productos con actividad endocrina radica en la preocupación de que los niveles medioambientales de ciertos productos puedan provocar efectos adversos tanto en los seres humanos como en la vida silvestre, debido a la interacción de dichos productos con el sistema endocrino. En 1998, la OCDE promovió una actuación de alta prioridad orientada a revisar las directrices existentes, así como a elaborar otras nuevas para el cribado y la evaluación de los alteradores endocrinos potenciales. Una faceta de esta actuación consistió en elaborar las directrices del ensayo para el cribado de productos activos sobre el sistema endocrino de especies de peces. El ensayo de reproducción de peces a corto plazo se ha sometido a un amplio programa de validación, el cual consiste en varios estudios interlaboratorios con productos seleccionados con el objeto de demostrar la pertinencia y la fiabilidad del ensayo en términos de detección de productos que afecten a la reproducción de peces mediante varios mecanismos, incluidas las modalidades endocrinas (1, 2, 3, 4, 5). Todos los parámetros de las directrices de ensayo de la OCDE se han validado en el pez cabeza gorda y se ha validado un subconjunto de parámetros en el medaka (vitelogenina y caracteres sexuales secundarios) y el pez cebra (vitelogenina). El trabajo de validación ha sido revisado en parte por un grupo de expertos designados por los Coordinadores Nacionales del Programa de Directrices de Ensayo de la OCDE (6) y por un grupo de expertos independientes encargados por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (29). El ensayo no se ha diseñado para identificar mecanismos específicos de alteración hormonal, ya que los animales del ensayo poseen un eje hipotálamo-hipófisis-gónadas (HPG) intacto, que puede responder a los productos que afectan a dicho eje en diferentes niveles. 2. El presente método describe un ensayo de cribado in vivo en el que peces macho sexualmente maduros y peces hembra que están desovando se mantienen juntos y se exponen a un producto durante una parte limitada de su ciclo de vida (veintiún días). Al término del periodo de exposición de veintiún días, se miden dos parámetros biomarcadores en machos y hembras que sirven de indicadores de la actividad endocrina del producto problema; estos parámetros son la vitelogenina y los caracteres sexuales secundarios. La vitelogenina se mide en el pez cabeza gorda, el medaka y el pez cebra, mientras que los caracteres sexuales secundarios se miden en el pez cabeza gorda y el medaka. Además, la fecundidad cuantitativa se supervisa a diario durante todo el ensayo. También se conservan las gónadas y la histopatología podrá evaluarse para valorar la capacidad de reproducción de los animales de ensayo y contribuir a la ponderación de las pruebas de otros parámetros. 3. Este bioensayo sirve de ensayo de cribado reproductivo in vivo y su aplicación debe considerarse en el contexto del «OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals» (Marco conceptual de la OCDE para el ensayo y evaluación de los alteradores endocrinos) (30). En este marco conceptual, se propone el ensayo de reproducción de peces a corto plazo en el nivel 3 como ensayo in vivo que proporciona datos sobre las rutas y mecanismos endocrinos seleccionados. CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 4. La vitelogenina (VTG) se produce normalmente en el hígado de los vertebrados ovíparos hembra como respuesta a los estrógenos endógenos circulantes. Es un precursor de las proteínas de la yema de huevo y, una vez que se produce en el hígado, viaja a través del torrente sanguíneo hasta el ovario, donde los huevos en desarrollo la absorben y modifican. La vitelogenina apenas se detecta en el plasma de los peces hembra inmaduros y de los machos porque no tienen suficientes estrógenos circulantes. No obstante, el hígado puede sintetizar y secretar vitelogenina como respuesta a la estimulación estrogénica exógena. 5. La medición de la vitelogenina sirve para detectar productos con distintos mecanismos de acción estrogénica. La detección de productos estrogénicos es posible gracias a la medición de la inducción de vitelogenina en los peces macho, lo cual ha quedado suficientemente documentado en los estudios revisados por expertos científicos [por ejemplo, (7)]. La inducción de vitelogenina también ha quedado demostrada tras la exposición a andrógenos aromatizables (8, 9). Una reducción del nivel circulante de estrógenos en las hembras, por ejemplo mediante la inhibición de la aromatasa que convierte el andrógeno endógeno en el estrógeno natural 17β-estradiol, provoca una disminución del nivel de VTG, lo cual se utiliza para detectar productos con propiedades inhibidoras de la aromatasa (10, 11). La relevancia biológica de la respuesta de vitelogenina tras la inhibición de estrógenos o de la aromatasa ha quedado establecida y se ha documentado ampliamente. Sin embargo, es posible que la producción de VTG en las hembras también pueda verse afectada por la toxicidad general y por mecanismos de acción tóxicos no endocrinos como, por ejemplo, la hepatotoxicidad. 6. Se ha logrado elaborar varios métodos de medición de manera satisfactoria al tiempo que se han armonizado para el uso rutinario. Este es el caso de los métodos de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) específicos para cada especie, que usan la inmunoquímica para la cuantificación de la VTG producida en pequeñas muestras sanguíneas o hepáticas recogidas en distintos peces (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Se recogen muestras sanguíneas de pez cabeza gorda, homogeneizados de cabeza/cola o muestras sanguíneas de pez cebra, y muestras hepáticas de medaka para medir la VTG. En el caso del medaka existe una buena correlación entre la VTG medida en la sangre y en el hígado (19). En el apéndice 6 se recogen los procedimientos recomendados para la recogida de muestras para el análisis de la VTG. Hay una gran variedad de juegos de medición de la VTG, los cuales deben basarse en un método ELISA validado específico para cada especie. 7. Los caracteres sexuales secundarios de los peces macho de determinadas especies son cuantificables y visibles externamente, además de responder a los niveles circulantes de andrógenos endógenos. Este es el caso del pez cabeza gorda y del medaka, pero no así del pez cebra, que no posee caracteres sexuales secundarios cuantificables. Las hembras conservan la capacidad de desarrollar caracteres sexuales secundarios masculinos tras su exposición a productos androgénicos en el agua. Hay varios estudios disponibles en la bibliografía científica que documentan este tipo de respuesta en el pez cabeza gorda (20) y el medaka (21). Una disminución de los caracteres sexuales secundarios en los machos debería interpretarse con cautela debido a la baja potencia estadística y debe basarse en opiniones de expertos y en la ponderación de las pruebas. Dada la ausencia de caracteres sexuales secundarios cuantificables que respondan a los productos con acción androgénica, hay limitaciones en el uso del pez cebra en este ensayo. 8. En el pez cabeza gorda, el principal indicador de exposición androgénica exógena es el número de tubérculos nupciales ubicados en el hocico del pez hembra. En el medaka, el número de tubérculos papilares constituye el principal marcador de exposición exógena a productos androgénicos en las hembras. En el apéndice 5A y el apéndice 5B se presentan los procedimientos recomendados para la evaluación de los caracteres sexuales en el pez cabeza gorda y el medaka, respectivamente. 9. El ensayo de peces de veintiún días incluye la evaluación de la producción de huevos cuantitativa y la conservación de las gónadas para realizar un examen histopatógico opcional. Algunas autoridades reguladoras pueden exigir este parámetro adicional para evaluar de forma más completa la capacidad reproductiva de los animales de ensayo, o en los casos en los que la vitelogenina y los caracteres sexuales secundarios no responden a la exposición al producto. Aunque algunos parámetros pueden tener un elevado valor diagnóstico (p. ej., la inducción de VTG en machos y la formación de tubérculos en hembras), no todos los parámetros (p. ej., fecundidad e histopatología gonadal) del ensayo tienen el objeto de identificar de forma inequívoca los mecanismos celulares de acción específicos. En cambio, todo el conjunto de parámetros permite extraer conclusiones con respecto a las posibles alteraciones endocrinas y, por tanto, proporciona una orientación para nuevos ensayos. Aunque no sea un criterio endocrino específico, la fecundidad, debido a su demostrada sensibilidad a una serie de productos activos endocrinos conocidos (5), es un importante parámetro que debe incluirse, ya que cuando este y otros parámetros no se ven afectados se tiene más certeza de que el compuesto no tiene probablemente actividad endocrina. Sin embargo, cuando la fecundidad se ve afectada, contribuirá en gran medida a la ponderación de las conclusiones deducidas de las pruebas. Más adelante en este método de ensayo se ofrecen directrices sobre la interpretación y aceptación de los resultados del ensayo. 10. Las definiciones utilizadas en el presente método se recogen en el apéndice 1. PRINCIPIO DEL ENSAYO 11. En el ensayo, se exponen juntos en recipientes de ensayo peces macho y hembra con capacidad reproductora. Su edad adulta y capacidad reproductora permite diferenciar claramente cada sexo y, por lo tanto, permite realizar un análisis de cada parámetro en relación con el sexo y garantiza su sensibilidad con respecto a los productos exógenos. Al finalizar el ensayo, el sexo se confirma con un examen macroscópico de las gónadas tras la apertura ventral del abdomen con unas tijeras. En el apéndice 2 se incluye un resumen de las condiciones relevantes del bioensayo. El ensayo comienza normalmente con muestras de peces de una población en situación de desove. No deben utilizarse animales senescentes. En la sección dedicada a la selección de los peces se incluyen pautas relativas a la edad de los peces y su capacidad reproductora. El ensayo se realiza con tres concentraciones de exposición al producto, así como con un testigo del agua y, en caso necesario, un testigo del disolvente. Se utilizan dos recipientes o réplicas por tratamiento para el pez cebra (cada recipiente contiene cinco machos y cinco hembras). Con el pez cabeza gorda se utilizan cuatro recipientes o réplicas por tratamiento (cada recipiente contiene dos machos y cuatro hembras). Esta distribución sirve para adaptarse al comportamiento territorial del pez cabeza gorda macho a la vez que para mantener una potencia suficiente del ensayo. Con el medaka se utilizan cuatro recipientes o réplicas por tratamiento (cada recipiente contiene tres machos y tres hembras). La exposición dura veintiún días y el muestreo de peces se lleva a cabo en el vigesimoprimer día de exposición. La fecundidad cuantitativa se supervisa a diario. 12. Cuando se realiza el muestreo el vigesimoprimer día, todos los animales son sacrificados de forma compasiva. Se miden los caracteres sexuales secundarios en el pez cabeza gorda y el medaka (véanse el apéndice 5A y el apéndice 5B); se recogen muestras de sangre para determinar la VTG en el pez cebra y el pez cabeza gorda; también se pueden recoger muestras de la cabeza o cola para determinar la VTG en el pez cebra (apéndice 6), se recogen muestras hepáticas para analizar la VTG en el medaka (apéndice 6); las gónadas se fijan en conjunto o se diseccionan para una posible evaluación histopatológica (22). CRITERIOS DE ACEPTACIÓN DEL ENSAYO 13. Para que los resultados del ensayo sean aceptables, deben cumplirse las condiciones siguientes: — la mortalidad en los testigos del agua (o del disolvente) no ha de superar el 10 % al final del periodo de exposición; — la concentración de oxígeno disuelto ha de ser, al menos, del 60 % del valor de saturación en el aire a lo largo de todo el periodo de exposición; — en ningún momento del periodo de exposición la temperatura del agua debe variar en más de ± 1,5 °C entre los recipientes de ensayo y debe mantenerse en un intervalo de 2 °C dentro de las gamas establecidas para la especie de ensayo (apéndice 2); — en ningún momento del periodo de exposición la temperatura del agua debe variar en más de ± 1,5 °C entre los recipientes de ensayo y debe mantenerse en un intervalo de 2 °C dentro de las gamas establecidas para la especie de ensayo (apéndice 2); — en ningún momento del periodo de exposición la temperatura del agua debe variar en más de ± 1,5 °C entre los recipientes de ensayo y debe mantenerse en un intervalo de 2 °C dentro de las gamas establecidas para la especie de ensayo (apéndice 2); DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Equipo 14. Se emplea el equipo común de laboratorio y, en particular: (a) medidores de oxígeno y pH; (b) equipo para determinar la dureza y la alcalinidad del agua; (c) dispositivo adecuado de regulación de la temperatura, con supervisión preferiblemente continua; (d) recipientes de material químicamente inerte y con una capacidad adecuada a la carga y la densidad de población recomendadas (véase el apéndice 2); (e) sustrato de desove del pez cabeza gorda y del pez cebra (en el apéndice 4 figura la información necesaria); (f) una balanza suficientemente exacta (esto es, exactitud de ± 0,5 mg). Agua 15. Puede utilizarse para el ensayo toda agua en la que la especie de ensayo muestre unas tasas de crecimiento y supervivencia a largo plazo adecuadas. Su calidad ha de ser constante a lo largo de todo el ensayo. El pH se mantendrá entre 6,5 y 8,5, si bien a lo largo de un mismo ensayo debe permanecer en un intervalo de ± 0,5 unidades de pH. Deben tomarse muestras periódicamente para análisis con el fin de cerciorarse de que el agua de dilución no interfiere en los resultados del ensayo (por ejemplo, por complejación del producto problema). Conviene proceder a la determinación de los metales pesados (por ejemplo, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd y Ni), aniones y cationes principales (por ejemplo, Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, and SO4 2-), plaguicidas (por ejemplo, organofosforados totales y organoclorados totales), carbono orgánico total y sólidos en suspensión, por ejemplo cada tres meses cuando se sepa que el agua de dilución es de calidad relativamente constante. Si se demuestra que la calidad del agua es constante al menos durante un año, los análisis pueden ser menos frecuentes y espaciarse más (por ejemplo, cada seis meses). En el apéndice 3 se recogen algunas características químicas de un agua de dilución aceptable. Soluciones de ensayo 16. Las soluciones de ensayo a las concentraciones elegidas se preparan por dilución de una solución madre. La solución madre se prepara preferiblemente por simple mezcla o agitación del producto problema en el agua de dilución con medios mecánicos (por ejemplo, mediante un agitador o ultrasonidos). Pueden emplearse columnas de saturación (columnas de solubilidad) para lograr la concentración adecuada de solución madre. No se recomienda usar un disolvente vehículo. Sin embargo, en el caso de que sea necesario usar un disolvente, debe llevarse un testigo del disolvente en paralelo y con la misma concentración de disolvente que en los tratamientos con el producto problema. Con productos difíciles, la mejor solución técnica puede ser el uso de disolvente. Debe consultarse el documento de orientación de la OCDE sobre los ensayos de toxicidad acuática con sustancias y mezclas difíciles (23). La elección del disolvente vendrá determinada por las propiedades químicas de la sustancia o mezcla. El documento de orientación de la OCDE recomienda un máximo de 100 μl/l, que debe respetarse. Sin embargo, una revisión reciente (24) puso de relieve otras cuestiones relativas al uso de disolventes para realizar ensayos sobre la actividad endocrina. Por lo tanto, se recomienda que la concentración del disolvente, en caso necesario, se reduzca al mínimo siempre que sea técnicamente posible (esto dependerá de las propiedades fisicoquímicas del producto problema). 17. Se utilizará un sistema de ensayo dinámico. Este tipo de sistemas aporta y diluye continuamente una solución madre del producto problema (por ejemplo, bomba dosificadora, diluidor proporcional o sistema saturador) para distribuir una serie de concentraciones en los recipientes de ensayo. Los caudales de las soluciones madre y del agua de dilución deben supervisarse con regularidad, preferiblemente todos los días, y no deben variar en más del 10 % a lo largo del ensayo. Debe evitarse el uso de tubos de plástico de baja calidad u otros materiales que puedan contener productos biológicamente activos. Al seleccionar el material para el sistema dinámico, debe tenerse en cuenta la posible adsorción del producto problema a este material. Preparación de los peces 18. Los peces de ensayo deben seleccionarse de una población de laboratorio, preferentemente de una sola, que se mantenga al menos en las dos semanas antes del ensayo en condiciones de calidad del agua e iluminación similares a las del ensayo. Es importante que la tasa de carga y la densidad de población (las definiciones pueden consultarse en el apéndice 1) sean las adecuadas para la especie de ensayo utilizada (véase el apéndice 2). 19. Después de un periodo de adaptación de 48 horas, se registra la mortalidad y se aplican los criterios siguientes: — si la mortalidad es superior al 10 % de la población en siete días: se rechaza todo el lote; — si la mortalidad se halla entre el 5 y el 10 % de la población, se prolonga otros siete días el periodo de aclimatación; si durante este segundo periodo la mortalidad supera el 5 %, se rechaza todo el lote; — si la mortalidad es inferior al 5 % de la población en siete días: se acepta el lote. 20. Los peces no deben recibir tratamiento terapéutico alguno durante el periodo de aclimatación, el periodo de preexposición ni el periodo de exposición. Preexposición y selección de los peces 21. Se recomienda un periodo de preexposición de una o dos semanas, en el que los animales están en recipientes similares a los utilizados en el ensayo real. Los peces deben ser alimentados ad libitum durante todo el periodo de preparación y durante la fase de exposición. La fase de exposición comienza con peces adultos sexualmente dimórficos, procedentes de un suministro para laboratorio de animales maduros para la reproducción (por ejemplo, con caracteres sexuales secundarios claramente visibles, en lo que respecta al pez cabeza gorda y al medaka) y en desove activo. Únicamente a modo de orientación general (esto es, no debe tenerse en cuenta sin atender a la situación reproductora real de un lote de peces determinado), los peces cabeza gorda deben tener aproximadamente 20 (± 2) semanas de edad, suponiendo que se hayan criado a 25 ± 2 °C durante toda su vida. Los medaka deben tener aproximadamente 16 (± 2) semanas, suponiendo que se hayan criado a 25 ± 2 °C durante toda su vida. Los peces cebra deben tener aproximadamente 16 (± 2) semanas, suponiendo que se hayan criado a 26 ± 2 °C durante toda su vida. La producción de huevos debe evaluarse cada día durante la fase de exposición. Se recomienda observar el desove en todos los recipientes en paralelo antes de incluirlos en la fase de exposición del ensayo. Por ahora no se pueden proporcionar pautas cuantitativas sobre la producción de huevos diaria conveniente, pero es relativamente común observar un desove medio de >10 huevos/hembra/día para cada especie. Se deben colocar los recipientes según un esquema de agrupamiento aleatorizado de acuerdo con los resultados de producción de huevos, para asignar las réplicas a los diferentes niveles experimentales con el fin de garantizar una distribución de las réplicas equilibrada. DISEÑO DEL ENSAYO 22. Se utilizan tres concentraciones del producto problema, un testigo (agua) y, si es necesario, un testigo de disolvente. Los datos se pueden analizar con el objeto de determinar diferencias estadísticamente significativas entre las respuestas de los grupos de tratamiento y de los testigos. Estos análisis indicarán si son necesarios otros ensayos a largo plazo para determinar efectos adversos (es decir, supervivencia, desarrollo, crecimiento y reproducción) del producto, más que para su uso en la evaluación de riesgos (25). 23. En lo que respecta al pez cebra, en el vigesimoprimer día del experimento se realiza un muestreo de machos y hembras de cada nivel de tratamiento (cinco machos y cinco hembras en cada una de las dos réplicas) y de los testigos para medir la vitelogenina. En lo que respecta al medaka, en el vigesimoprimer día del experimento se realiza un muestreo de machos y hembras de cada nivel de tratamiento (tres machos y tres hembras en cada una de las cuatro réplicas) y de los testigos para medir la vitelogenina y los caracteres sexuales secundarios. En lo que respecta al pez cabeza gorda, en el vigesimoprimer día de exposición se realiza un muestreo de machos y hembras (dos machos y cuatro hembras en cada una de las cuatro réplicas) y de los testigos para medir la vitelogenina y los caracteres sexuales secundarios. Es necesario realizar una evaluación cuantitativa de la fecundidad y los tejidos gonadales deben fijarse en conjunto o diseccionados para su posible evaluación histopatológica, si procede. Selección de las concentraciones de ensayo 24. A efectos de este ensayo, la concentración de ensayo máxima debe establecerse de acuerdo con la concentración máxima tolerada (en lo sucesivo, MTC, por sus siglas en inglés), la cual se determina mediante un ensayo de determinación de intervalo u otros datos de toxicidad, o fijarse en 10 mg/l o en la solubilidad máxima en agua, eligiéndose el valor que sea menor. La MTC se define como la concentración máxima de ensayo del producto que provoca una mortalidad inferior al 10 %. Con este planteamiento se asume que existen datos empíricos de toxicidad aguda u otros datos de toxicidad a partir de los cuales se puede estimar la MTC. La estimación de la MTC puede ser inexacta y, por lo general, debe aplicarse un juicio profesional. 25. Se requieren tres concentraciones de ensayo, separadas por un factor constante no superior a 10, así como un testigo del agua de dilución (y un testigo del disolvente si es necesario). Se recomienda emplear una gama de factores de separación entre 3,2 y 10. PROCEDIMIENTO Selección y pesada de los peces 26. Es importante que el peso de los peces varíe lo menos posible al inicio del ensayo. En el apéndice 2 figuran los intervalos de tamaño apropiados en cada una de las especies recomendadas para este ensayo. Para todo el lote de peces utilizado en el ensayo, el intervalo de pesos individuales de los peces macho y hembra al inicio del ensayo debe mantenerse, si es posible, en el ± 20 % de la media aritmética del peso del mismo sexo. Se recomienda pesar una submuestra de la población de peces antes del ensayo para calcular el peso medio. Condiciones de exposición Duración 27. La duración del ensayo es de veintiún días, tras un periodo de preexposición. El periodo de preexposición recomendado es de una o dos semanas. Alimentación 28. Los peces deben ser alimentados ad libitum con alimentos adecuados (apéndice 2) a un ritmo suficiente para mantener la condición física. Debe tenerse cuidado para evitar el crecimiento microbiano y la turbidez del agua. Como pauta general, la ración diaria puede dividirse en dos o tres porciones iguales para realizar varias tomas al día y deben transcurrir al menos tres horas entre cada toma. Una sola ración mayor resulta aceptable, especialmente los fines de semana. La alimentación de los peces debe suprimirse durante las 12 horas anteriores a la toma de muestras o la autopsia. 29. Se debe evaluar la presencia de contaminantes en la comida de los peces, como plaguicidas organoclorados, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) o bifenilos policlorados (PCB). Deben evitarse los alimentos con un alto nivel de fitoestrógenos que puedan comprometer la respuesta del ensayo a agonistas estrogénicos conocidos (por ejemplo, el 17β-estradiol). 30. La comida sobrante y la materia fecal deben retirarse de los recipientes de ensayo al menos dos veces por semana, por ejemplo limpiando bien el fondo de cada recipiente con un sifón. Luz y temperatura 31. El fotoperiodo y la temperatura del agua han de ser adecuados para la especie utilizada (apéndice 2). Frecuencia de los análisis y las mediciones 32. Antes de que comience el periodo de exposición, debe garantizarse el funcionamiento correcto del sistema de distribución del producto. Deben estar bien establecidos todos los métodos analíticos, incluidos los conocimientos suficientes sobre la estabilidad química del sistema de ensayo. Durante el ensayo, las concentraciones del producto problema se determinan a intervalos regulares, de la siguiente manera: los caudales de diluyente y de solución madre del producto tóxico deben comprobarse preferentemente todos los días, pero al menos dos veces por semana, y no deben variar en más del 10 % a lo largo del ensayo. Se recomienda que las concentraciones reales de producto problema se midan en todos los recipientes al comienzo del ensayo y, posteriormente, cada semana. 33. Se recomienda basar los resultados en las concentraciones medidas. Sin embargo, si la concentración de producto problema en la solución se ha mantenido debidamente dentro del ± 20 % de la concentración nominal durante todo el ensayo, los resultados pueden basarse en los valores nominales o en los valores medidos. 34. En algunos casos puede estar indicado filtrar (por ejemplo, con un filtro de poros de 0,45 μm) o centrifugar las muestras. En caso necesario, el procedimiento recomendado es el centrifugado. Sin embargo, si se demuestra que el material del ensayo no se adsorbe a los filtros, también puede aceptarse la filtración. 35. Durante el ensayo deben medirse el oxígeno disuelto, la temperatura y el pH en todos los recipientes de ensayo, al menos una vez por semana. La dureza total y la alcalinidad deben medirse en los testigos y en uno de los recipientes con la concentración más alta al menos una vez por semana. La temperatura debe someterse preferentemente a supervisión continua al menos en un recipiente de ensayo. Observaciones 36. En el transcurso del ensayo o al término del mismo, se evalúa una serie de respuestas generales (por ejemplo, la supervivencia) o biológicas (por ejemplo, los niveles de VTG). Se requiere una supervisión cuantitativa diaria de la fecundidad. A continuación se describen la medición y la evaluación de estos parámetros y su utilidad. Supervivencia 37. Durante el periodo del ensayo deben examinarse diariamente los peces, registrar la mortalidad y retirar los peces muertos lo antes posible. Los peces muertos no deben ser reemplazados en los recipientes testigp ni en los de tratamiento. El sexo de los peces que mueran durante el ensayo debe determinarse mediante la evaluación macroscópica de las gónadas. Comportamiento y aspecto 38. Debe anotarse todo comportamiento anómalo (con respecto a los testigos), tales como signos de toxicidad general, incluida la hiperventilación, la descoordinación al nadar, la pérdida de equilibrio o una inactividad o alimentación atípicas. También deben indicarse las anomalías externas (por ejemplo, hemorragia o decoloración). Estos signos de toxicidad deben considerarse detenidamente durante la interpretación de los datos, ya que pueden indicar concentraciones a las que los biomarcadores de la actividad endocrina no resulten fiables. Estas observaciones sobre el comportamiento también pueden proporcionar información cualitativa útil para los posibles requisitos futuros de ensayos en peces. Por ejemplo, se ha observado agresividad territorial en machos normales o hembras masculinizadas del pez cabeza gorda expuestos a andrógenos, mientras que en el pez cebra el comportamiento característico del apareamiento y desove al amanecer se ha reducido u obstaculizado debido a una exposición estrogénica o antiandrogénica. 39. Como algunos elementos del aspecto (principalmente el color) pueden cambiar rápidamente con la manipulación, es importante que las observaciones cualitativas se realicen antes de retirar los animales del sistema del ensayo. La experiencia hasta la fecha con el pez cabeza gorda sugiere que algunos productos con actividad endocrina pueden, inicialmente, inducir cambios en las siguientes características externas: color del cuerpo (claro u oscuro), patrones de coloración (presencia de franjas verticales) y forma del cuerpo (zona de la cabeza y del pecho). Por lo tanto, deben realizarse durante el ensayo y al término del estudio observaciones del aspecto físico de los peces. Fecundidad 40. Las observaciones diarias cuantitativas de desove deban registrarse por réplica. La producción de huevos debe registrarse como el número de huevos/hembra superviviente/día por réplica. Los huevos se eliminan a diario de los recipientes de ensayo. Para el pez cabeza gorda y el pez cebra, deben colocarse sustratos de desove en el recipiente de ensayo para permitir que los peces desoven en condiciones normales. En el apéndice 4 se recoge más información sobre los sustratos de desove recomendados para el pez cebra (apéndice 4A) y el pez cabeza gorda (apéndice 4B). No es necesario proporcionar sustrato de desove para el medaka. Sacrificio compasivo de los peces 41. El vigesimoprimer día, es decir, al final de la exposición, los peces deben ser sacrificados con unas cantidades adecuadas de tricaína [metanosulfonato de tricaína, metacaína, MS-222 (CAS 886-86-2)], 100-500 mg/l, amortiguados con 300 mg/l de NaHCO3 (bicarbonato sódico, CAS 144-55-8) para reducir la irritación de la membrana mucosa; a continuación se realiza un muestreo de sangre o tejido para determinar el nivel de VTG, tal y como se explica en la sección dedicada a la vitelogenina. Observación de los caracteres sexuales secundarios 42. Algunos productos con actividad endocrina pueden inducir cambios en los caracteres sexuales secundarios especializados (número de tubérculos nupciales en el pez cabeza gorda macho o tubérculos papilares en el medaka macho). En particular, los productos con determinados mecanismos de acción pueden provocar la aparición anómala de caracteres sexuales secundarios en los animales del sexo opuesto. Por ejemplo, los agonistas de los receptores de andrógenos, como la trembolona, la metiltestosterona y la dihidrotestosterona, pueden provocar que el pez cabeza gorda hembra desarrolle tubérculos nupciales pronunciados o que el medaka hembra desarrolle tubérculos papilares (11, 20, 21). También se ha observado que los agonistas de los receptores de estrógenos pueden reducir el número de tubérculos nupciales y el tamaño de la almohadilla dorsal en los machos adultos de pez cabeza gorda (26, 27). Estas observaciones morfológicas macroscópicas pueden proporcionar información cualitativa y cuantitativa útil para los posibles requisitos futuros de ensayos en peces. El número y el tamaño de los tubérculos nupciales en el pez cabeza gorda y de los tubérculos papilares en el medaka pueden cuantificarse directamente o, de manera más práctica, en especímenes conservados. Los procedimientos recomendados para la evaluación de los caracteres sexuales secundarios en el pez cabeza gorda y en el medaka se pueden consultar en el apéndice 5A y el apéndice 5B, respectivamente. Vitelogenina (VTG) 43. Se extrae sangre de la arteria o de la vena caudal con un túbulo capilar para microhematocrito heparinizado o mediante punción cardíaca con una jeringa. En función del tamaño de los peces, los volúmenes de sangre que se pueden extraer suelen oscilar entre los 5 y los 60 μl por individuo en el caso del pez cabeza gorda y entre los 5 y los 15 μl por individuo en el caso del pez cebra. El plasma se separa de la sangre mediante centrifugado y se guarda con inhibidores de la proteasa a -80 °C hasta que se analice para determinar la VTG. De manera alternativa, en el medaka se utilizará el hígado y en el pez cebra se puede usar el homogeneizado de cabeza/cola como tejido de origen para la determinación de la VTG (apéndice 6). La medición de la VTG debe basarse en un método ELISA homólogo validado con ayuda de anticuerpos homólogos y de un patrón de VTG homólogo. Se recomienda utilizar un método capaz de detectar niveles de VTG tan bajos como unos pocos ng/ml de plasma (o ng/mg de tejido), que es el nivel de base en los peces macho no expuestos. 44. El control de calidad del análisis de la VTG se realizará mediante patrones, blancos y, como mínimo, análisis duplicados. Para cada método ELISA debe realizarse una prueba del efecto de matriz (efecto de dilución de la muestra) para determinar el factor mínimo de dilución de la muestra. Cada placa ELISA utilizada en ensayos de VTG debe incluir las siguientes muestras de control de calidad: al menos 6 patrones de calibración que cubran la gama de concentraciones previstas de VTG y al menos un blanco de ensayo de fijación no específico (analizado por duplicado). La absorbancia de estos blancos debe ser inferior al 5 % de la absorbancia máxima del patrón de calibración. Se analizarán como mínimo dos partes alícuotas (duplicados de pocillos) de cada dilución de la muestra. Los duplicados de los pocillos que varíen en más del 20 % deben volver a analizarse. 45. El coeficiente de correlación (R2) de las curvas de calibración debe ser superior a 0,99. Sin embargo, una elevada correlación no es suficiente para garantizar una predicción adecuada de la concentración en todas las gamas. Además de tener una correlación suficientemente alta para la curva de calibración, la concentración de cada patrón, calculada a partir de la curva de calibración, debe encontrarse entre el 70 y 120 % de su concentración nominal. Si las concentraciones nominales presentan la tendencia de apartarse de la línea de regresión de calibración (por ejemplo, a concentraciones bajas), es posible que sea necesario dividir la curva de calibración en rangos bajos y altos o utilizar un modelo no lineal para ajustar adecuadamente los datos de absorbancia. Si la curva se divide, ambos segmentos de línea deben tener un R2 > 0,99. 46. El límite de detección (LOD) se define como la concentración más baja del patrón analítico, y el límite de cuantificación (LOQ) se define como la concentración más baja del patrón analítico multiplicada por el factor de dilución más bajo. 47. Cada día que se realicen ensayos de VTG, se analizará una muestra de enriquecimiento preparada con un patrón de referencia interensayos (apéndice 7). La relación entre la concentración prevista y la concentración medida se indicará junto con los resultados de cada conjunto de ensayos que se hayan realizado ese día. Evaluación de la histopatología gonadal 48. Las autoridades reguladoras pueden requerir la realización de un examen de la histopatología gonadal para estudiar el órgano objetivo en el eje HPG tras una exposición al producto. A este respecto, las gónadas se fijan con todo el cuerpo o se diseccionan. Cuando se requiera el examen de histopatología, en la evaluación de la actividad endocrina del producto problema se ob