DECISIÓN DE EJECUCIÓN (UE) 2015/1554 DE LA COMISIÓN

de 11 de septiembre de 2015

por la que se establecen disposiciones de aplicación de la Directiva 2006/88/CE en lo que respecta a los requisitos de vigilancia y los métodos de diagnóstico

[notificada con el número C(2015) 6188]

(Texto pertinente a efectos del EEE)

LA COMISIÓN EUROPEA,

Visto el Tratado de Funcionamiento de la Unión Europea,

Vista la Directiva 2006/88/CE del Consejo, de 24 de octubre de 2006, relativa a los requisitos zoosanitarios de los animales y de los productos de la acuicultura, y a la prevención y el control de determinadas enfermedades de los animales acuáticos (1), y, en particular, su artículo 49, apartado 3, su artículo 50, apartado 4, su artículo 57, letra b), y su artículo 61, apartado 3,

Considerando lo siguiente:

Para determinados Estados miembros, la obtención de la calificación de libre de una o varias enfermedades de la lista, en todo su territorio o en una zona o compartimento, puede plantear dificultades. En tales situaciones, es posible que el Estado miembro no desee obtener o recuperar la calificación de libre de dichas enfermedades. Las medidas mínimas de control que deben aplicarse en los casos en que el Estado miembro no desee obtener o recuperar la calificación de libre de enfermedades han de ser las mismas a nivel de la Unión y deben basarse en los mismos criterios. Por tanto, de conformidad con la Directiva 2006/88/CE, es necesario establecer normas detalladas para el confinamiento de las enfermedades de la lista y requisitos mínimos para levantar tales medidas de confinamiento.

HA ADOPTADO LA PRESENTE DECISIÓN:

Artículo 1

Objeto

La presente Decisión establece normas relativas a:

la vigilancia, las zonas tampón, el muestreo y los métodos de diagnóstico que deben aplicar los Estados miembros en relación con la calificación sanitaria de sus territorios, o de zonas o compartimentos de estos, con respecto a las enfermedades no exóticas de los animales acuáticos que figuran en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE («las enfermedades de la lista»);

las medidas mínimas de control que deben aplicarse en caso de sospecha o confirmación de una enfermedad de la lista en un Estado miembro, zona o compartimento que no hayan sido declarados libres de dicha enfermedad.

c)

Artículo 2

Definiciones

A efectos de la presente Decisión, se aplicarán las siguientes definiciones:

a) «septicemia hemorrágica viral» («SHV»): enfermedad causada por el virus de la septicemia hemorrágica viral (VSHV), también conocido como Egtved virus, perteneciente al género Novirhabdovirus y a la familia Rhabdoviridae;

b) «necrosis hematopoyética infecciosa» («NHI»): enfermedad causada por el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI), perteneciente al género Novirhabdovirus y a la familia Rhabdoviridae;

c) «herpesvirosis de la carpa koi» («HCK»): enfermedad causada por el herpesvirus de la carpa koi (HVK), perteneciente a la familia Alloherpesviridae, y conocido por el nombre científico de herpesvirus de los ciprínidos tipo 3 (HVCy-3);

d) «anemia infecciosa del salmón» («AIS»): enfermedad causada por la infección por el virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) con supresión en la HPR, perteneciente al género Isavirus, de la familia Orthomyxoviridae;

e) «infección por Marteilia refringens»: enfermedad causada por una infección por el protozoo Marteilia refringens, del orden Paramyxida;

f) «infección por Bonamia ostreae»: enfermedad causada por una infección por el protozoo Bonamia ostreae, del filo Haplosporidia;

g) «enfermedad de las manchas blancas» (o «EMB»): enfermedad causada por el virus del síndrome de las manchas blancas (VSMB), que es un virus con ADN bicatenario del género Whispovirus, dentro de la familia Nimaviridae.

Artículo 3

Requisitos mínimos aplicables a los programas de erradicación y vigilancia

Los Estados miembros velarán por que se cumplan las disposiciones sobre programas de vigilancia y erradicación, zonas tampón, muestreo y métodos de diagnóstico establecidos en el anexo I y los métodos específicos y procedimientos detallados establecidos en el anexo II cuando deba concederse, retirarse o devolverse a un Estado miembro, o a una zona o compartimento dentro de un Estado miembro, la calificación de libre de una o varias enfermedades de la lista.

Artículo 4

Requisitos mínimos para los métodos de diagnóstico y procedimientos específicos

Los Estados miembros velarán por que se apliquen los métodos de control establecidos en el anexo I y los métodos de diagnóstico específicos y procedimientos detallados establecidos en el anexo II cuando se efectúen exámenes de laboratorio a fin de confirmar o descartar la presencia de una enfermedad de la lista.

Artículo 5

Medidas mínimas de control del confinamiento de las enfermedades de la lista y requisitos mínimos para el levantamiento de las medidas de confinamiento establecidas en Estados miembros, zonas o compartimentos no declarados libres de enfermedades de la lista

Los Estados miembros velarán por que se apliquen las medidas mínimas de control y los requisitos mínimos para el levantamiento de las medidas de confinamiento que se establecen en el anexo I cuando lleven a cabo medidas de control o levanten las medidas de confinamiento de una o varias enfermedades de la lista en un Estado miembro o en una zona o compartimento que no estén declarados libres de tales enfermedades de la lista.

Artículo 6

Derogaciones

Quedan derogadas las Decisiones 2001/183/CE, 2002/878/CE y 2003/466/CE.

Artículo 7

Fecha de aplicación

La presente Decisión será aplicable a partir del 1 de abril de 2016.

Artículo 8

Destinatarios

Los destinatarios de la presente Decisión serán los Estados miembros.

(1) DO L 328 de 24.11.2006, p. 14.

(2) Decisión 2001/183/CE de la Comisión, de 22 de febrero de 2001, por la que se establecen los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de determinadas enfermedades de los peces y se deroga la Decisión 92/532/CEE (DO L 67 de 9.3.2001, p. 65).

(3) Decisión 2003/466/CE de la Comisión, de 13 de junio de 2003, por la que se establecen los criterios para la delimitación de zonas y la adopción de medidas oficiales de vigilancia ante la sospecha o la confirmación de anemia infecciosa del salmón (AIS) (DO L 156 de 25.6.2003, p. 61).

(4) Decisión 2002/878/CE de la Comisión, de 6 de noviembre de 2002, por la que se establecen planes de muestreo y métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de la presencia de bonamiosis (Bonamia ostreae) y marteiliosis (Marteilia refringens) en los moluscos (DO L 305 de 7.11.2002, p. 57).

(15) Esto no se aplicará a las explotaciones que críen únicamente trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), trucha común (Salmo trutta) o ambas, y cuyo suministro de agua se base exclusivamente en fuentes de agua dulce donde no vive el salmón del Atlántico (Salmo salar).

(11) Esto no se aplicará a las explotaciones que críen únicamente trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), trucha común (Salmo trutta) o ambas, y cuyo suministro de agua se base exclusivamente en fuentes de agua dulce donde no vive el salmón del Atlántico (Salmo salar).

La sospecha de EMB podrá descartarse si dichos ensayos no aportan ninguna otra prueba de la presencia de la EMB.

La investigación oficial incluirá al menos una inspección sanitaria y un muestreo de 10 crustáceos cuando se observen signos clínicos o post mortem compatibles con la EMB, o de 150 crustáceos cuando no se observen signos clínicos o post mortem. Las muestras se examinarán utilizando el método de diagnóstico establecido en el punto II.2 (PCR de dos pasos).

no se haya detectado la EMB durante el período de dos años que sigue a la finalización de las medidas mencionadas en las letras a) y b) y las sospechas durante este período hayan sido descartadas con arreglo a los procedimientos establecidos en el punto II.3.

c)

se cumplan los requisitos establecidos en el punto I.2.2.1, letras a), b) y c); en caso de que no sea técnicamente posible el barbecho, las explotaciones serán sometidas a una medida alternativa que proporcione una garantía similar de exterminio del VSMB desde el entorno de la explotación;

En los Estados miembros, zonas o compartimentos en los que el número de explotaciones sea limitado y la vigilancia específica de estas explotaciones no proporcione suficientes datos epidemiológicos, los programas de vigilancia para mantener la calificación de libre de enfermedad incluirán puntos de muestreo seleccionados con arreglo a los requisitos establecidos en el punto I.1.

La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por la EMB hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbecho con arreglo al punto I.2.2.1, letra c).

c)

una inspección sanitaria en las explotaciones en las que las pruebas del inciso i) hayan dado resultados negativos, las inspecciones sanitarias continuarán una vez al mes durante la estación en la que sea más probable que el agua alcance sus temperaturas máximas anuales, hasta que haya sido retirada la zona de protección con arreglo al punto I.2.2.1, letra c).

la toma de muestras para pruebas de 10 crustáceos cuando se observen signos clínicos o post mortem compatibles con una infección por la EMB, o de 150 crustáceos cuando no se observen signos clínicos o post mortem, y

Todas las explotaciones no oficialmente declaradas infectadas por la EMB que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de protección serán sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos los siguientes elementos:

en las aguas dulces: a toda la cuenca hidrográfica de la explotación oficialmente declarada infectada por la EMB; la autoridad competente podrá limitar la extensión de la zona de protección a partes de la cuenca hidrográfica, a condición de que no se vea comprometida la prevención de la propagación de la EMB.

Si hay crustáceos débiles o moribundos, se seleccionarán estos principalmente. Si no los hay, se seleccionarán crustáceos de distintos tamaños, es decir, juveniles y adultos de las especies sensibles seleccionadas, representadas proporcionalmente en la muestra.

En los sistemas fluviales y lagos, se seleccionarán una o varias de las siguientes especies: Pacifastacus leniusculus, Astacus leptodactylus, Austropotamobius pallipes o Orconectes limosus. Si no están presentes estas especies, la muestra será representativa de otras especies de decápodos sensibles presentes. Habida cuenta de la amplia gama de hospedadores sensibles, los hospedadores podrán ser seleccionados de entre géneros o familias de decápodos cuya sensibilidad haya sido demostrada de forma experimental o natural.

En los sistemas marinos y estuarios, se seleccionarán una o varias de las siguientes especies: Carcinus maenas, Cancer pagurus, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depurator, Liocarcinus puber, Crangon crangon, Homarus gammarus, Palaemon adspersus o gambas de la familia de los peneidos, como Penaeus japonicus, Penaeus kerathurus o Penaeus semisulcatus. Si no están presentes estas especies, la muestra será representativa de otras especies de decápodos sensibles presentes. Habida cuenta de la amplia gama de hospedadores sensibles, los hospedadores podrán ser seleccionados de entre géneros o familias de decápodos cuya sensibilidad haya sido demostrada de forma experimental o natural.

Si en las unidades de producción hay crustáceos débiles o moribundos, se seleccionarán estos principalmente. Si no los hay, se seleccionarán crustáceos de distintos tamaños, es decir, juveniles y adultos de las especies sensibles seleccionadas, representadas proporcionalmente en la muestra.

La sospecha de infección por Bonamia ostreae se descartará si dichos ensayos no aportan ninguna otra prueba de la presencia de Bonamia ostreae.

La presencia de Bonamia ostreae se considerará confirmada cuando un resultado positivo obtenido mediante histopatología, improntas tisulares o hibridación in situ se combine con un resultado positivo en la PCR completada por secuenciación, de conformidad con los métodos y procedimientos aprobados establecidos en la parte 5 del anexo II.

no se haya confirmado la infección por Bonamia ostreae durante el período de dos años que sigue a la finalización de las medidas mencionadas en las letras a), b) y c) y las sospechas durante este período hayan sido descartadas con arreglo a los procedimientos establecidos en el punto II.3.

c)

se cumplan los requisitos establecidos en el punto I.2.2, letras a), b) y c); en caso de que no sea técnicamente posible el barbecho, las explotaciones serán sometidas a una medida alternativa que proporcione una garantía similar de exterminio de Bonamia ostreae desde el entorno de la explotación;

Todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas y todas las demás explotaciones o zonas de cría de moluscos puestas en barbecho dentro de las zonas de protección y vigilancia establecidas serán repobladas con moluscos procedentes de Estados miembros, zonas o compartimentos con una calificación sanitaria de la categoría I con respecto a la infección por Bonamia ostreae. La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbecho con arreglo al punto I.2.2, letra c).

c)

Todas las explotaciones y zonas de cría de moluscos no oficialmente declaradas infectadas por Bonamia ostreae que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de protección serán sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos la recogida de muestras para pruebas de 150 moluscos después del comienzo del período de transmisión de Bonamia ostreae. Cuando se desconozca el período de transmisión, el muestreo comenzará en invierno o al principio de la primavera.

La zona de confinamiento se definirá caso por caso teniendo en cuenta los factores que influyen en los riesgos de propagación de dicha enfermedad de la lista, como son: el número de moluscos muertos, su edad y la tasa y distribución de la mortalidad de moluscos en la explotación o zona de cría de moluscos infectada por Bonamia ostreae, incluidos los moluscos salvajes; la distancia y densidad de las explotaciones o zonas de cría vecinas, incluidos los moluscos salvajes; la proximidad a centros de transformación, explotaciones en contacto o zonas de cría de moluscos; las especies presentes en las explotaciones o zonas de cría de moluscos, en particular las especies sensibles y las especies portadoras; las prácticas de cría aplicadas en las explotaciones y zonas de cría de moluscos afectadas y vecinas; las condiciones hidrodinámicas y otros factores de importancia epidemiológica.

Las medidas mínimas de control establecidas en el capítulo V, sección 3, de la Directiva 2006/88/CE habrán sido aplicadas eficazmente y, en particular, se habrá establecido una zona de confinamiento conforme al artículo 32, letra b), de dicha Directiva que incluya una zona de protección y una zona de vigilancia en las inmediaciones de las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas por Bonamia ostreae.

La erradicación de Bonamia ostreae se considera imposible en la mayoría de los casos; no obstante, cuando el Estado miembro la juzgue viable, se aplicará el siguiente modelo de programa de erradicación.

c)

c)

Si hay moluscos débiles, moribundos o recién muertos pero no descompuestos, se seleccionarán estos principalmente. Si no los hay, se seleccionarán los moluscos sanos de más edad.

Si Ostrea edulis está presente, solo se seleccionarán para muestreo las ostras de esta especie. Si Ostrea edulis no está presente, la muestra será representativa de todas las demás especies sensibles presentes.

Las inspecciones sanitarias y, en su caso, la toma de muestras en las unidades de producción se efectuarán durante el período del año en el que se sabe que la prevalencia de Bonamia ostreae en el Estado miembro, zona o compartimento es máxima. Cuando esta información no esté disponible, el muestreo se efectuará en invierno o al principio de la primavera.

La sospecha de infección por Marteilia refringens podrá descartarse si los ensayos contemplados en el inciso i) no aportan ninguna otra prueba de la presencia de Marteilia refringens.

La presencia de Marteilia refringens se considerará confirmada cuando un resultado positivo obtenido mediante histopatología, improntas tisulares o hibridación in situ se combine con un resultado positivo en la PCR completada por una secuenciación.

no se haya confirmado la infección por Marteilia refringens durante el período de dos años que sigue a la finalización de las medidas mencionadas en las letras a), b) y c) y las sospechas durante este período hayan sido descartadas con arreglo a los procedimientos establecidos en el punto II.3.

c)

se cumplan los requisitos establecidos en el punto I.2.2, letras a), b) y c); en caso de que no sea técnicamente posible el barbecho, las explotaciones serán sometidas a una medida alternativa que proporcione una garantía similar de exterminio de Marteilia refringens desde el entorno de la explotación;

La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbecho con arreglo al punto I.2.2, letra c).

catorce meses en el caso de explotaciones y zonas de cría de moluscos con comunicaciones ilimitadas con las aguas circundantes, siempre que los moluscos de especies sensibles que estén infectados o tengan lazos epidemiológicos con la explotación o zona de cría de moluscos infectada no hayan sido recolectados ni sacados antes del período del año en el que se sepa que la prevalencia de Marteilia refringens es máxima o, si no se conoce esta información, cuando los moluscos de especies sensibles no hayan sido recolectados ni sacados antes de que la temperatura del agua supere los 17 °C;

dos meses en el caso de explotaciones y zonas de cría de moluscos con comunicaciones ilimitadas con las aguas circundantes, siempre que los moluscos de especies sensibles que estén infectados o tengan lazos epidemiológicos con la explotación o zona de cría de moluscos infectada hayan sido recolectados o sacados antes del período del año en el que se sepa que la prevalencia de Marteilia refringens es máxima o, cuando dicho período no se conozca, antes de que la temperatura del agua supere los 17 °C,

c)

Todas las explotaciones y zonas de cría de moluscos no oficialmente declaradas infectadas por Marteilia refringens que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de protección serán sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos la recogida de muestras para pruebas de 150 moluscos después del comienzo del período de transmisión de Marteilia refringens. Cuando se desconozca el período de transmisión, el muestreo comenzará después de que la temperatura del agua supere los 17 °C.

La zona de confinamiento se definirá caso por caso teniendo en cuenta los factores que influyen en los riesgos de propagación de Marteilia refringens, como son: el número de moluscos muertos, su edad y la tasa y distribución de la mortalidad de moluscos en la explotación o zona de cría de moluscos infectada por Marteilia refringens, incluidos los moluscos salvajes; la distancia y densidad de las explotaciones o zonas de cría vecinas, incluidos los moluscos salvajes; la proximidad a centros de transformación, explotaciones en contacto o zonas de cría de moluscos; las especies, en particular las sensibles y portadoras, presentes en las explotaciones o zonas de cría de moluscos; las prácticas de cría aplicadas en las explotaciones y zonas de cría de moluscos afectadas y vecinas; las condiciones hidrodinámicas y otros factores de importancia epidemiológica.

Las medidas del capítulo V, sección 3, de la Directiva 2006/88/CE habrán sido aplicadas eficazmente y, en particular, se habrá establecido una zona de confinamiento conforme al artículo 32, letra b), de la Directiva 2006/88/CE, que incluya una zona de protección y una zona de vigilancia, en las inmediaciones de las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas por Marteilia refringens.

La erradicación de Marteilia refringens se considera imposible en la mayoría de los casos; no obstante, cuando el Estado miembro la juzgue viable, se aplicará el siguiente modelo de programa de erradicación.

c)

c)

Si en las unidades de producción hay moluscos débiles, moribundos o recién muertos pero no descompuestos, se seleccionarán estos principalmente. Si no los hay, se seleccionarán los moluscos sanos de más edad.

Si Ostrea spp. y Mytilus spp. están presentes en las unidades de producción o en la zona de producción, ambos géneros tendrán la misma presencia en el tamaño de la muestra. Si solo uno de ellos está presente, ese género será objeto de muestreo. Si no están presentes los géneros Ostrea ni Mytilus, la muestra será representativa de todas las demás especies sensibles presentes.

Las inspecciones sanitarias y, en su caso, la toma de muestras para exámenes de laboratorio se efectuarán durante el período del año en el que se sepa que la prevalencia del parásito en el Estado miembro, zona o compartimento es máxima. Cuando esta información no esté disponible, el muestreo se efectuará inmediatamente después de que la temperatura del agua haya superado los 17 °C.

La sospecha de AIS podrá descartarse si se constata que, a lo largo de doce meses a partir de la fecha de la sospecha, los ensayos y las inspecciones no aportan ninguna otra prueba de la presencia de AIS.

c)

detección del VAIS mediante RT-qPCR, incluida la secuenciación del gen HE para verificar la supresión en la HPR, y

detección del VAIS mediante RT-qPCR, incluida la secuenciación del gen HE para verificar la supresión en la HPR, y detección del VAIS en preparaciones tisulares mediante anticuerpos específicos contra dicho virus (a saber, IHC en cortes fijados o IFAT en improntas tisulares),

La investigación oficial, que incluirá al menos una inspección sanitaria y un muestreo de 10 peces moribundos, cuando se observen signos clínicos o post mortem compatibles con la AIS. Si no se observan signos clínicos o post mortem compatibles con la AIS, la inspección sanitaria irá seguida de un muestreo selectivo de como mínimo treinta peces moribundos o recién muertos con constitución normal, de conformidad con el punto I.1. Las muestras se someterán a ensayo de conformidad con los métodos de diagnóstico que se establecen en la letra b).

c)

cribado de las muestras mediante RT-qPCR, incluida la secuenciación del gen HE para verificar la supresión en la HPR;

c)

no se haya confirmado el VAIS con supresión en la HPR durante el período de dos años que sigue a la finalización de las medidas mencionadas en las letras a), b) y c) y las sospechas durante este período hayan sido descartadas con arreglo a los procedimientos establecidos en el punto II.3.

c)

se cumplan los requisitos establecidos en el punto I.2.2.1, letras a), b) y c); en caso de que no sea técnicamente posible el barbecho, las explotaciones se someterán a una medida alternativa que proporcione una garantía similar de exterminio del VAIS desde el entorno de la explotación;

La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbecho con arreglo al punto I.2.2.1, letra c).

c)

una inspección sanitaria en las explotaciones en las que las pruebas del inciso i) hayan dado resultados negativos, las inspecciones sanitarias continuarán una vez al mes hasta que se retire la zona de protección con arreglo al punto I.2.2.1, letra c).

la toma de muestras para pruebas de 10 peces moribundos como mínimo cuando se observen signos clínicos o post mortem compatibles con la AIS, o de 30 peces como mínimo cuando no se observen signos clínicos o post mortem;

Todas las explotaciones no oficialmente declaradas infectadas por la AIS que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de protección serán sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos los siguientes elementos:

en zonas interiores: a toda la cuenca hidrográfica de la explotación oficialmente declarada infectada por la AIS; la autoridad competente podrá limitar la extensión de la zona a partes de la cuenca hidrográfica, a condición de que no se vea comprometida la prevención de la propagación de la AIS.

Las medidas mínimas de control establecidas en el capítulo V, sección 3, de la Directiva 2006/88/CE habrán sido aplicadas eficazmente y, en particular, se ha establecido una zona de confinamiento conforme al artículo 32, letra b), de dicha Directiva que incluye una zona de protección y una zona de vigilancia en las inmediaciones de las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por el VAIS con supresión en la HPR o con AIS confirmada.

c)

c)

Si el salmón del Atlántico es una de las especies sensibles presentes en el lugar, se dará prioridad a las muestras de salmón del Atlántico. Si no hay salmón del Atlántico en la explotación piscícola, se tomarán muestras de otras especies sensibles.

Únicamente se seleccionarán peces moribundos o recién muertos, pero no descompuestos. En particular, se dará prioridad en la toma de muestras a los peces que muestren anemia, hemorragias u otros signos clínicos que indiquen trastornos circulatorios.

Sistema de vigilancia con arreglo al punto I.3 para mantener la calificación de libre de HCK en los Estados miembros, zonas o compartimentos en los que el número de explotaciones es limitado y la vigilancia específica en estas explotaciones no proporciona suficientes datos epidemiológicos

La sospecha de HCK podrá descartarse si este ensayo no aporta ninguna otra prueba de la presencia del HVK.

La investigación oficial incluirá al menos una inspección sanitaria y un muestreo de 10 peces cuando se observen signos clínicos o post mortem compatibles con una infección por el HVK, o de 30 peces cuando no se observen signos clínicos o post mortem. Las muestras se examinarán utilizando los métodos de diagnóstico que se establecen en la letra b), de acuerdo con los métodos y procedimientos detallados de diagnóstico de la parte 2, punto II, del anexo II.

c)

se cumplan los requisitos establecidos en el punto I.2.2.1, letras a), b) y c); en caso de que no sea técnicamente posible el barbecho, las explotaciones serán sometidas a una medida alternativa que proporcione una garantía similar de exterminio del HVK desde el entorno de la explotación;

En los Estados miembros, zonas o compartimentos en los que el número de explotaciones sea limitado y la vigilancia específica de estas explotaciones no proporcione suficientes datos epidemiológicos, los sistemas de vigilancia para mantener la calificación de libre de enfermedad incluirán puntos de muestreo seleccionados con arreglo a los requisitos establecidos en el punto I.1.

La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por el HVK hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbecho con arreglo al punto I.2.2.1, letra c).

c)

una inspección sanitaria en las explotaciones en las que las pruebas contempladas en el punto III.2 hayan dado resultados negativos; las inspecciones sanitarias continuarán una vez al mes en la estación en la que la temperatura del agua alcance probablemente más de 15 °C, hasta que se retire la zona de protección de conformidad con el punto I.2.2.1, letra c).

la toma de muestras para pruebas de 10 peces cuando se observen signos clínicos o post mortem compatibles con la HCK, o de 30 peces cuando no se observen signos clínicos o post mortem,

Todas las explotaciones no oficialmente declaradas infectadas por el HVK que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de protección serán sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos los siguientes elementos:

Se establecerá una zona de protección en las inmediaciones de una explotación oficialmente declarada infectada por el HVK, que corresponderá a toda la cuenca hidrográfica de la explotación oficialmente declarada infectada por el HVK; la autoridad competente podrá limitar la extensión de la zona a partes de la cuenca hidrográfica, a condición de que no se vea comprometida la prevención de la propagación de la HCK.

si hay peces débiles, con comportamiento anómalo o recién muertos pero no descompuestos, se seleccionarán,

Siempre que sea posible, serán sometidos a muestreo los peces que se hayan mantenido durante un tiempo prolongado (de dos a tres semanas) en el intervalo de temperaturas que permite el desarrollo del virus, es decir, entre 15 y 26 °C. No obstante, podrá aceptarse el siguiente enfoque:

c)

c)

c)

La sospecha de VSHV, VNHI o ambos virus podrá descartarse si el cultivo celular o la RT-qPCR no aportan ninguna otra prueba de la presencia del VSHV ni del VNHI.

c)

La SHV se considerará confirmada si uno o más de estos métodos de diagnóstico dan positivo al VSHV. La NHI se considerará confirmada si uno o más de estos métodos de diagnóstico dan positivo al VNHI. La confirmación del primer caso de SHV o NHI en Estados miembros, zonas o compartimentos no infectados previamente se basará en el aislamiento convencional del virus en cultivo celular o mediante la RT-qPCR.

La explotación sospechosa será sometida al menos a una inspección sanitaria y un muestreo de 10 peces, cuando se observen signos clínicos o post mortem compatibles con una infección por SHV, NHI o ambas, o de un mínimo de 30 peces, cuando no se observen signos clínicos o post mortem. Las muestras se examinarán con uno o varios de los métodos de diagnóstico que se establecen en los incisos i) y ii), de acuerdo con los métodos y procedimientos detallados de diagnóstico de la parte 1, punto II, del anexo II:

c)

se cumplan los requisitos establecidos en el punto I.2.2.1, letras a), b) y c); en caso de que no sea técnicamente posible el barbecho, las explotaciones serán sometidas a una medida alternativa que proporcione una garantía similar de exterminio del VNHI, del VSHV o de ambos desde el entorno de la explotación;

La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbecho con arreglo al punto I.2.2.1, letra c).

Todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por la SHV, la NHI o ambas enfermedades de la lista y todas las demás explotaciones puestas en barbecho dentro de las zonas de protección y vigilancia establecidas a las que se refiere la letra c) serán repobladas con peces procedentes de Estados miembros, zonas o compartimentos con una calificación sanitaria de libre de enfermedad (categoría I) con respecto a la SHV, la NHI o ambas.

c)

una inspección sanitaria en las explotaciones en las que las pruebas contempladas en el inciso i) hayan dado resultados negativos; las inspecciones sanitarias continuarán una vez al mes durante el período en el que la temperatura del agua es inferior a 14 °C, excepto cuando los estanques o jaulas de red estén cubiertos de hielo, hasta que se retire la zona de protección de conformidad con el punto I.2.2.1, letra c).

la toma de muestras para pruebas de 10 peces cuando se observen signos clínicos o post mortem compatibles con una infección por la SHV, la NHI o ambas, o de un mínimo de 30 peces cuando no se observen signos clínicos o post mortem;

Todas las explotaciones no oficialmente declaradas infectadas por la SHV, la NHI o ambas que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de protección serán sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos los siguientes elementos:

en zonas interiores: a toda la cuenca hidrográfica de la explotación oficialmente declarada infectada por la SHV, la NHI o ambas; la autoridad competente podrá limitar la extensión de la zona a partes de la cuenca hidrográfica o de la superficie de explotación, a condición de que no se vea comprometida la prevención de la propagación de la SHV, la NHI o ambas.

si hay peces débiles, con comportamiento anómalo o recién muertos pero no descompuestos, se seleccionarán; si se utiliza más de una fuente de agua para la producción piscícola, se incluirán en la muestra peces que representen todas las fuentes de agua,

si hay truchas arco iris, solo se seleccionarán para el muestreo los peces de esta especie, a menos que estén presentes peces de otras especies sensibles que muestren síntomas típicos de SHV o NHI; si no hay truchas arco iris, la muestra será representativa de todas las demás especies sensibles presentes,

c)

c) «zona continental»: zona geográfica precisa situada en la parte continental de uno o varios Estados miembros con un sistema hidrológico homogéneo que comprende partes de una cuenca hidrográfica desde las fuentes hasta una barrera natural o artificial que impide la migración hacia arriba de los animales acuáticos desde tramos inferiores de la cuenca hidrográfica, una cuenca hidrográfica completa desde sus fuentes hasta su estuario o más de una cuenca hidrográfica, incluidos sus estuarios, debido a la relación epidemiológica entre las cuencas hidrográficas a través del estuario;

a) «compartimento continental»: una o varias explotaciones situadas en la parte continental de uno o varios Estados miembros, sujetas a un sistema de bioseguridad común y que contienen una población de animales acuáticos con una calificación sanitaria particular con respecto a una enfermedad específica;

c)

métodos de muestreo y diagnóstico que deben utilizarse en los exámenes de laboratorio realizados en caso de sospecha y destinados a confirmar la presencia de las enfermedades no exóticas enumeradas en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE («las enfermedades de la lista»), de conformidad con lo dispuesto en el artículo 28, letra a), y el artículo 57, letra b), de la citada Directiva;

ANEXO II

MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO DETALLADOS

I. Introducción

En el presente anexo se establecen los procedimientos detallados de los métodos de diagnóstico que deben utilizarse para los exámenes de laboratorio en el marco de los programas de erradicación y vigilancia del anexo I de la presente Decisión, y para confirmar o descartar la sospecha de las siguientes enfermedades no exóticas enumeradas en la parte II del anexo IV de la Directiva 2006/88/CE (en lo sucesivo, «las enfermedades de la lista»), de conformidad con el artículo 57, letra b), de esa Directiva:

1. Septicemia hemorrágica viral (SHV) Parte 1 2. Necrosis hematopoyética infecciosa (NHI) Parte 1 3. Herpesvirosis de la carpa koi (HCK) Parte 2 4. Anemia infecciosa del salmón (AIS) Parte 3 5. Infección por Marteilia refringens Parte 4 6. Infección por Bonamia ostreae Parte 5 7. Enfermedad de las manchas blancas (EMB) Parte 6

II. Definiciones

A efectos del presente anexo, se entenderá por «medio de transporte» un medio de cultivo celular con un 10 % de suero de ternera y con 200 UI de penicilina, 200 μg de estreptomicina y 200 μg de kanamicina por mililitro, o con otros antibióticos de eficacia demostrada.

PARTE 1

MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO DETALLADOS PARA LA VIGILANCIA Y CONFIRMACIÓN DE LA NHI Y LA SHV

I. Métodos de diagnóstico y procedimientos para la vigilancia de la SHV y la NHI

Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laboratorio para obtener o mantener la calificación sanitaria de libre de NHI o SHV con arreglo a la parte 1, sección I, del anexo I utilizando los métodos de diagnóstico que se establecen en los puntos II.1 y II.2 de la parte 1 de dicho anexo se aplicarán los métodos y procedimientos de diagnóstico detallados establecidos en los siguientes puntos I.1 a I.6.

I.1. Preparación y envío de las muestras de peces

I.1.1. Tejidos para el examen virológico en cultivo celular

Antes de su embarque o traslado al laboratorio, los trozos de los órganos que vayan a examinarse se retirarán del pez con instrumental de disección estéril y se introducirán en tubos de plástico estériles que contengan medio de transporte.

La cantidad de material de peces idónea para el examen virológico en cultivo celular y mediante RT-qPCR depende del tamaño de los peces. Así, los materiales muestreados serán alevines enteros cuando la longitud del pez sea inferior a 4 cm; vísceras, incluido el riñón, cuando el pez mida entre 4 y 6 cm o, en el caso de peces de mayor tamaño, riñón, bazo, corazón o encéfalo, así como fluido ovárico de reproductores en el momento del desove.

El fluido ovárico o seminal o los trozos de órganos de un máximo de 10 peces podrán ser recogidos en un solo tubo estéril que contenga al menos 4 ml de medio de transporte y constituirán una muestra conjunta. Los tejidos de cada muestra pesarán como mínimo 0,5 g.

El examen virológico en cultivo celular se iniciará cuanto antes y, a más tardar, 48 horas después de la recogida de las muestras. En casos excepcionales, el examen virológico puede empezar a más tardar 72 horas después de la recogida, siempre que el material que vaya a examinarse esté protegido por medio de transporte y que puedan respetarse los requisitos de temperatura durante el transporte.

I.1.2. Muestras para el análisis por retrotranscripción asociada a reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR o RT-qPCR)

Las muestras de peces se tomarán con arreglo al procedimiento descrito en el punto I.1.1 utilizando un instrumento estéril y se introducirán en un tubo de plástico estéril que contenga medio de transporte. Los tejidos de diez peces podrán recogerse en un solo tubo y representarán una muestra conjunta. No obstante, en caso de que la cantidad de inóculo sea pequeña, solo podrán utilizarse tejidos de hasta cinco peces. Alternativamente, las muestras podrán mezclarse en reactivos de estabilización del ARN, a razón de 0,2 g de tejido/ml de reactivo, con arreglo a las recomendaciones de los fabricantes, si bien cada pez será tratado por separado y no se mezclará en las muestras, debido a la pequeña cantidad de material que se utilizará para la extracción.

También podrán enviarse al laboratorio peces enteros.

I.2. Envío de muestras de peces

Los tubos que contengan tejidos de los peces en medio de transporte destinados al cultivo celular o los análisis de RT-PCR/RT-qPCR se colocarán en recipientes aislados, como cajas de poliestireno de pared gruesa, junto con suficiente hielo u otro medio con efecto refrigerante similar para garantizar que las muestras se mantengan refrigeradas durante el transporte al laboratorio. No obstante, se evitará la congelación de las muestras. La temperatura de una muestra durante el transporte no superará nunca los 10 °C y quedará hielo en la caja de transporte en el momento de la recepción, o bien uno o varios bloques de hielo seguirán parcial o completamente congelados.

Podrán enviarse peces enteros al laboratorio si durante el transporte pueden respetarse los requisitos de temperatura del párrafo primero. Los peces enteros se envolverán en papel con capacidad absorbente y se enviarán en una bolsa de plástico. También podrán enviarse peces vivos.

I.3. Recogida de material de diagnóstico suplementario

Cuando lo apruebe el laboratorio de diagnóstico, otros tejidos de peces podrán ser recogidos y preparados para exámenes suplementarios.

I.4. Preparación de las muestras para examen en cultivo celular y RT-qPCR

I.4.1. Congelación en casos excepcionales

En caso de que surjan dificultades prácticas que imposibiliten el procesamiento de muestras dentro de las 48 horas siguientes a la recogida de los tejidos de peces, puede ser aceptable que se congelen las muestras de tejido en medio de transporte a una temperatura igual o inferior a – 20 °C y se realice el examen virológico en un plazo de 14 días. No obstante, los tejidos de peces solo se congelarán y descongelarán una vez antes de proceder a su examen. Se mantendrán registros detallando los motivos de cada congelación de muestras de tejidos de peces.

I.4.2. Homogeneización de órganos

En el laboratorio, los tejidos de peces de los tubos serán completamente homogeneizados en una licuadora, una mezcladora o un mortero con arena estéril y, posteriormente, suspendidos en el medio de transporte original.

Si una muestra consta de un pez entero de menos de 4 cm de longitud, se desmenuzará con unas tijeras o un escalpelo estériles tras eliminar la parte del cuerpo posterior a la cloaca. Si una muestra consta de un pez entero de una longitud comprendida entre 4 y 6 cm, se recogerán las vísceras, sin descartar los riñones. Si una muestra consta de un pez entero de más de 6 cm de longitud, las muestras de tejidos se obtendrán como se describe en el punto I.1. Las muestras de tejidos se desmenuzarán con unas tijeras o un escalpelo estériles, se homogeneizarán como se describe en el párrafo primero del presente punto y se suspenderán en medio de transporte.

La proporción final entre tejido y medio de transporte se ajustará en el laboratorio a 1:10.

I.4.3. Centrifugación del homogeneizado

El homogeneizado se centrifugará en una centrifugadora refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 y 5 °C a entre 2 000 y 4 000 × g durante 15 minutos; el sobrenadante se recogerá y podrá tratarse con antibióticos durante 4 horas a 15 °C o durante una noche a entre 4 y 8 °C. Si la muestra ha sido enviada en medio de transporte, podrá omitirse el tratamiento del sobrenadante con antibióticos.

En caso de que surjan dificultades prácticas, como la rotura de la incubadora o problemas con los cultivos celulares, que impidan inocular las células en las 48 horas siguientes a la recogida de las muestras de tejido de peces, el sobrenadante podrá congelarse a – 80 °C y el examen virológico podrá efectuarse en un plazo de 14 días.

Si el sobrenadante recogido se almacena a – 80 °C en las 48 horas siguientes al muestreo, podrá reutilizarse solo una vez para el examen virológico.

Antes de la inoculación de las células, el sobrenadante se mezclará con partes iguales de una mezcla adecuadamente diluida de antisueros contra los serotipos locales del virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI), y se incubará durante como mínimo una hora a 15 °C o como máximo 18 horas a 4 °C. El título del antisuero será de al menos 1/2 000 en una prueba de neutralización en placa al 50 %.

El tratamiento de todos los inóculos con antisuero contra el VNPI tiene por objeto evitar que se desarrolle efecto citopático (ECP) debido al VNPI en cultivos celulares inoculados. Esto reducirá la duración de los exámenes virológicos, así como el número de casos en los que el ECP tendría que considerarse potencialmente indicativo del VSHV o del VNHI.

Cuando las muestras procedan de unidades de producción que se consideran libres de NPI, podrá omitirse el tratamiento de los inóculos con antisuero contra el VNPI.

I.4.4. Preparación de las muestras para los programas de vigilancia basados en RT-PCR y RT-qPCR

Si las muestras han sido recogidas en medio de transporte, se efectuará el procedimiento establecido en los puntos I.4.2 y I.4.3. Después del centrifugado, se recogerá el sobrenadante y se extraerá el ARN. Si no ha de realizarse un nuevo examen directamente después del centrifugado, las muestras se congelarán inmediatamente a una temperatura igual o inferior a – 20 °C.

Para el análisis de los tejidos de peces conservados en reactivo de estabilización del ARN, las tareas posteriores se efectuarán dentro de los siguientes plazos respecto a las muestras almacenadas a distintas temperaturas:

muestras almacenadas a 37 °C: un día;

muestras almacenadas a 25 °C: una semana;

muestras almacenadas a 4 °C: un mes;

muestras almacenadas a – 20 °C: indefinidamente.

Las muestras conjuntas en reactivo de estabilización del ARN se tratarán como muestras individuales en reactivo de estabilización del ARN. En lo que respecta a las muestras conjuntas en reactivo de estabilización del ARN, la cantidad de muestra no excederá de lo recomendado por el fabricante para la extracción con kits de ARN, como RNeasy Mini kits (Qiagen) o similares. Si se hacen muestras conjuntas más grandes, los kits o métodos de extracción reflejarán este agrupamiento.

Las muestras recogidas en reactivos de estabilización del ARN no se utilizarán para el cultivo celular.

I.4.5. Obtención de muestras conjuntas para RT-qPCR

Dado que los protocolos de RT-qPCR dados son de sensibilidad igual o mayor que los métodos de cultivo celular, podrá utilizarse sobrenadante obtenido de material de tejidos de peces homogeneizado de órganos mezclados procedentes de hasta 10 peces en medio de cultivo celular para la PCR. Sin embargo, debido a la cantidad mucho menor de inóculo utilizada para la PCR en comparación con el cultivo celular, todos los tejidos de los peces se homogeneizarán cuidadosamente antes de obtener material para la extracción.

El mismo principio se aplicará también si las muestras se recogen en reactivos de estabilización del ARN. No obstante, en este caso, suele ser difícil obtener material representativo de un máximo de 10 peces en un tubo y, por tanto, el número de peces por muestra conjunta se reducirá a entre 2 y 5.

I.5. Examen virológico en cultivo celular

I.5.1. Cultivos celulares y medios

Se cultivarán línea celular 2 de alevín de Lepomis macrochirus (BF-2) o línea celular 2 de gónadas de trucha arco iris (RTG-2) y células de Epithelioma papulosum cyprini (EPC) o de Pimephales promelas (FHM) a entre 20 y 30 °C en medio adecuado, a saber, medio esencial mínimo de Eagle (MEM) o variantes de este, con un suplemento del 10 % de suero bovino fetal y antibióticos en concentraciones habituales.

Cuando las células se cultivan en frascos cerrados, el medio se amortiguará con bicarbonato. El medio utilizado para el cultivo de células en unidades abiertas podrá amortiguarse con tris(hidroximetil)aminometano-HCl (Tris-HCl) (23 mM) y bicarbonato sódico (6 mM). El pH será de 7,6 ± 0,2.

Los cultivos celulares que se utilicen para la inoculación con material de tejidos de peces serán cultivos monocapa jóvenes, normalmente de un día de edad, en la medida de lo posible; no obstante, podrá admitirse una franja de entre 4 y 48 horas de edad. Las células estarán en crecimiento activo en el momento de la inoculación.

I.5.2. Inoculación de los cultivos celulares

La suspensión de órganos tratada con antibióticos se inoculará en cultivos celulares en dos diluciones, a saber, la dilución primaria y, además, una dilución a 1:10, que darán lugar a diluciones finales de material tisular en el medio de cultivo celular de 1:100 y 1:1 000, respectivamente, a fin de evitar interferencias homólogas. Se inocularán al menos dos líneas celulares tal como se indica en el punto I.5.1. La relación entre la cantidad de inóculo y el volumen de medio de cultivo celular será aproximadamente 1:10.

Para cada dilución y cada línea celular se utilizará al menos un área celular de unos 2 cm2, lo que corresponde a un pocillo en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Se utilizarán placas de cultivo celular en la medida de lo posible.

I.5.3. Incubación de cultivos celulares

Los cultivos celulares inoculados se incubarán a 15 °C durante 7 a 10 días. Si el color del medio de cultivo celular pasa de rojo a amarillo, lo que indica una acidificación del medio, se ajustará el pH con una solución estéril de bicarbonato o sustancias equivalentes para garantizar la sensibilidad de las células a la infección por el virus.

Al menos cada seis meses, o si se sospecha que la sensibilidad de las células ha descendido, se efectuará la valoración de material congelado de VSHV y VNHI para comprobar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infección. Se utilizará, en la medida de lo posible, el procedimiento establecido en la sección III.

I.5.4. Microscopía

Los cultivos celulares inoculados se observarán periódicamente (al menos tres veces por semana) a 40-150 aumentos para comprobar si se ha producido ECP. Si hay signos evidentes de ECP, se iniciarán inmediatamente los procedimientos de identificación del virus de conformidad con el punto I.6.

I.5.5. Subcultivo

Si no aparece ECP tras la incubación primaria de entre 7 y 10 días, se efectuará el subcultivo con cultivos celulares nuevos utilizando un área celular similar a la del cultivo primario.

Se reunirán alícuotas del medio (sobrenadante) de todos los cultivos o pocillos que constituyen el cultivo primario, por líneas celulares, 7 a 10 días después de la inoculación. A continuación, dichas mezclas se inocularán en cultivos celulares homólogos no diluidos y diluidos a 1:10 (obteniendo diluciones finales de 1:10 y 1:100, respectivamente, del sobrenadante) según se describe en el punto I.5.2. Como alternativa, se inocularán alícuotas de un 10 % del medio que constituye el cultivo primario directamente en un pocillo con cultivo celular nuevo (subcultivo de pocillo a pocillo). La inoculación puede ir precedida de una preincubación de las diluciones con el antisuero contra el VNPI a una dilución adecuada, como se describe en el punto I.4.3.

A continuación, los cultivos inoculados se incubarán durante 7 a 10 días a 15 °C y se inspeccionarán de conformidad con el punto I.5.4.

Si se produce un ECP tóxico en los primeros tres días tras la incubación, puede realizarse un subcultivo en esa fase, pero después hay que incubar las células 7 días y realizar otro subcultivo con 7 días más de incubación. Si se desarrolla un ECP tóxico pasados tres días, las células se pasarán una vez y se incubarán para lograr el total de 14 días desde la inoculación primaria. En los últimos siete días de incubación no habrá pruebas de toxicidad.

Si a pesar del tratamiento con antibióticos se produce contaminación bacteriana, el subcultivo irá precedido de centrifugación a 2 000 a 4 000 × g durante 15 a 30 minutos a entre 2 y 5 °C, o filtración del sobrenadante por un filtro de 0,45 μm (membrana con baja fijación a las proteínas). Además, el subcultivo seguirá los mismos procedimientos descritos para el ECP tóxico en el párrafo cuarto del presente punto.

Si no se produce ECP, el ensayo podrá declararse negativo.

I.6. Identificación del virus

Si se observa ECP en un cultivo celular, se recogerá medio (sobrenadante) y se analizará mediante una o varias de las siguientes técnicas: ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), inmunofluorescencia (IF), neutralización, RT-PCR o RT-qPCR. Si estas pruebas no han permitido una identificación definitiva del virus en el plazo de una semana, el sobrenadante se enviará al laboratorio nacional de referencia o al laboratorio de referencia de la UE para las enfermedades de los peces a que se refiere el anexo VI de la Directiva 2006/88/CE para su identificación inmediata.

I.6.1. ELISA

Se efectuará una ELISA tipo sándwich con objeto de identificar la cepa vírica. Las placas de micropocillos se recubrirán con 50 μl/pocillo (0,9 pg) de inmunoglobulinas (Ig) de antisueros de conejo contra VNHI o VSHV de calidad demostrada, purificadas con proteína A, diluidas en solución amortiguadora de carbonato (pH 9,6) con 15 mM de azida de sodio, y se incubarán de 18 horas a 2 semanas a 4 °C.

En una placa de dilución, cada muestra que contenga 1 % de Tritón X-100 y los testigos positivos se diluirá con solución amortiguadora [solución salina fosfatada (PBS)-T-BSA, 1 % BSA] en cuatro grados de dilución: sin diluir, 1:4, 1:16 y 1:64. Las placas ELISA se lavarán en PBS que contenga un 0,05 % de Tween-20 (PBS-T) y 50 μl de cada dilución se transferirán de la placa de dilución a la placa ELISA lavada y recubierta.

A continuación, las placas ELISA se incubarán durante 30 minutos a 37 °C. Luego se lavarán y se incubarán durante 30 minutos a 37 °C con anticuerpos monoclonales específicos (AcM IP5B11 para la identificación del VSHV y Hyb 136-3, para la del VNHI). Se transferirán a la placa ELISA 50μl de anticuerpos antimurinos de conejo conjugados con peroxidasa de rábano, diluidos a 1:1 000 en PBS-T-BSA.

Por último, después de un nuevo lavado, se desencadenarán las reacciones añadiendo 50 μl/pocillo de ortofenilendiamina (OPD). Las placas ELISA se incubarán durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, y la reacción se detendrá añadiendo 100 μl/pocillo de H2SO4 0,5 M.

Se controlará la absorbancia a una longitud de onda de 492 y 620 nm en un lector ELISA. Las muestras se designarán positivas o negativas tras comparar los resultados de los ensayos con los valores de absorbancia de los testigos positivos y negativos. En general, las muestras con una absorbancia combinada (A) < 0,5 con material no diluido se considerarán negativas, las muestras con valores de A entre 0,5 y 1,0 se considerarán sospechosas y aquellas con A > 1,0 se considerarán positivas.

Podrán utilizarse otras versiones de ELISA con eficacia similar demostrada en lugar de las contempladas en este punto.

I.6.2. Inmunofluorescencia (IF)

La identificación de los patógenos VSHV y VNHI se efectuará infectando células en placas «Black» de 96 pocillos, placas convencionales de 24 pocillos o cubreobjetos en placas de 24 pocillos. Cuando se identifique el VNHI, el VSHV o ambos infectando células en cubreobjetos, se aplicará el siguiente protocolo:

a) los cubreobjetos se sembrarán con células a una densidad que lleve a una confluencia de entre 60 % y 90 % después de 24 horas de cultivo. Para esto se utilizarán células de EPC, en la medida de lo posible, debido a su fuerte adherencia a las superficies de vidrio, aunque también pueden usarse otras líneas celulares, como BF-2, RTG-2 o FHM. Se inocularán 150 μl de sobrenadante del cultivo celular en dos diluciones diferentes (1:10 y 1:1 000) por duplicado en monocapas de un día, y se incubará a 15 °C durante 24 horas.

b) Posteriormente, el medio de cultivo celular se retirará y las monocapas de células infectadas se fijarán con 0,5 ml de solución acuosa de acetona helada (80 % v/v). La fijación se efectuará en campana extractora durante 15 minutos a temperatura ambiente; a continuación se retirará la solución de acetona y se dejarán secar al aire los cubreobjetos durante al menos 30 minutos. En esta fase, las placas se procesarán inmediatamente o se almacenarán a – 20 °C para su uso ulterior.

c) Los anticuerpos monoclonales específicos (AcM IP5B11 para la identificación del VSHV y Hyb 136-3, para la del VNHI) se diluirán en de PBS-T 0,01 M (pH 7,2) en la dilución recomendada por el proveedor de los anticuerpos monoclonales. Se añadirán de 50 a 100 μl/pocillo a las monocapas fijadas, y las placas se incubarán durante una hora a 37 °C en una cámara húmeda.

d) Los cubreobjetos se lavarán suavemente tres veces con una PBS que contenga un 0,05 % de Tween-20 (PBS-T), y la solución amortiguadora se eliminará completamente después del último enjuague. A continuación, las células se incubarán durante una hora a 37 °C con anticuerpos contra las inmunoglobulinas de ratón conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o isotiocianato de tetrametilrodamina-5-(y 6) (TRITC), utilizados como anticuerpo primario, diluidos de acuerdo con las instrucciones del proveedor, se lavarán de nuevo con PBS-T y se secarán. Los cultivos teñidos se montarán en portaobjetos utilizando solución salina de glicerol y se examinarán con luz ultravioleta (UV) incidente, utilizando oculares de 10 o 12 aumentos y un objetivo de 25 o 40 aumentos con aperturas numéricas > 0,7 y > 1,3, respectivamente.

Podrán utilizarse, en su lugar, otras técnicas de IF con eficacia similar demostrada por lo que se refiere a los cultivos celulares, la fijación y los anticuerpos de calidad de referencia.

I.6.3. Neutralización

Las células se retirarán del sobrenadante mediante centrifugado (2 000 a 4 000 × g) o filtración por membrana (0,45 μm) de baja fijación con proteínas, y el sobrenadante se diluirá a 1:100 y 1:10 000 en medio de cultivo celular.

Se mezclarán alícuotas de un mínimo de dos diluciones de sobrenadante y se incubarán durante 60 minutos a 15 °C con partes iguales de los reactivos siguientes, por separado:

a) suero que contenga un anticuerpo específico del grupo contra el VSHV a una dilución de 1:50 (v/v);

b) suero que contenga un anticuerpo específico del grupo contra el VNHI a una dilución de 1:50 (v/v);

c) grupo de antisueros contra los serotipos locales del VNPI a una dilución de 1:50 (v/v);

d) únicamente medio (testigo positivo).

De cada mezcla de sobrenadante y suero de cada virus, al menos dos cultivos celulares se inocularán con 50 μl cada uno y, a continuación, se incubarán a 15 °C. Se observará si se produce ECP según lo descrito en el punto I.5.4.

Las cepas y aislados de VSHV que no reaccionen en pruebas de neutralización se identificarán mediante IF o ELISA.

Podrán utilizarse, en su lugar, otras pruebas de neutralización con eficacia similar demostrada.

I.6.4. RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1. Preparación de ARN vírico

Todos los trabajos con ARN se realizarán en hielo, utilizando guantes.

El ARN se extraerá utilizando el método del fenol-cloroformo o por columnas de afinidad, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pueden utilizarse los kits de extracción del ARN disponibles en el comercio, que permiten obtener ARN de alta calidad adecuado para su uso con los protocolos de RT-PCR detallados en los puntos siguientes.

El ARN se volverá a suspender en agua destilada libre de ribonucleasa (es decir, agua tratada con pirocarbonato de dietilo al 0,1 %) o un amortiguador de elución apropiado.

I.6.4.2. RT-PCR

Se utilizarán los siguientes cebadores para la detección del VNHI:

cebador directo 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

cebador inverso 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Se efectuarán los siguientes ciclos (RT-PCR de un paso): 1 ciclo a 50 °C durante 30 minutos; 1 ciclo a 95 °C durante 2 minutos; 30 ciclos a 95 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 60 segundos; 1 ciclo a 72 °C durante 7 minutos e inmersión a 4 °C.

Se utilizarán los siguientes cebadores para la detección del VSHV:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Se efectuarán los siguientes ciclos (RT-PCR de un paso): 50 °C durante 30 minutos, 95 °C durante 15 minutos, 35 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, y 68 °C durante 60 segundos. A continuación, la reacción se mantendrá a 68 °C durante 7 minutos.

La cantidad y la especificidad de las reacciones RT-PCR se evaluarán mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % con bromuro de etidio, y se observarán por transiluminación UV. Un amplicón de PCR de 693 bp podrá observarse con respecto al VNHI. En el caso del VSHV, el tamaño será de 505 bp.

Los resultados de la PCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir, puede que sea necesario optimizar los protocolos térmicos, dependiendo del termociclador que se use. Por otra parte, pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibridación del cebador o una contaminación en el laboratorio. Por tanto, se incluirán testigos positivos y negativos adecuados y amplicones de secuencia positiva y negativa, para evitar cualquier duda. En lo que respecta a los cebadores del VSHV, se prestará especial atención al utilizar células de BF-2, ya que dichos cebadores puedan reaccionar con la línea celular de ADN/ARN produciendo falsos positivos de tamaño similar. Al realizar pruebas con sobrenadante de células de BF-2, todos los fragmentos amplificados por PCR serán secuenciados.

I.6.4.3. RT-qPCR para el VSHV

En relación con el VSHV, la amplificación se efectuará utilizando los siguientes cebadores y sonda:

cebador directo: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

cebador inverso: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

sonda: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

RT-qPCR de un paso:

En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positivos. Sucesión de ciclos: 50 °C durante 30 minutos, 95 °C durante 15 minutos, 40 ciclos a 94 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 40 segundos, 72 °C durante 20 segundos; ajustar en caso necesario. Podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de RT-PCR o RT-qPCR con eficacia similar demostrada.

I.6.4.4. RT-qPCR para el VNHI

En relación con el VNHI, la amplificación se efectuará utilizando los siguientes cebadores y sonda:

cebador directo: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

cebador inverso: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;

sonda: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

RT-qPCR de dos pasos:

Dado que el siguiente ensayo depende de una amplificación en dos pasos, se pondrá especial cuidado al manipular los tubos de una reacción a otra, con el fin de evitar la contaminación.

Sucesión de ciclos (después del paso RT): 50 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 10 minutos, seguidos de 40 ciclos a 95 °C durante 15 segundos, y 60 °C durante 1 segundos; se efectuarán ajustes en caso necesario.

Podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de RT-PCR o RT-qPCR con eficacia similar demostrada.

II. Métodos y procedimientos de diagnóstico detallados para confirmar o descartar la sospecha de SHV, NHI o ambas en brotes sospechosos

Cuando se precise un examen de laboratorio para confirmar o descartar la NHI, la SHV o ambas de conformidad con el artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE utilizando los métodos de diagnóstico que se establecen en la parte 1, punto II.3, del anexo I de la presente Decisión, se aplicarán los siguientes métodos y procedimientos de diagnóstico detallados:

a) aislamiento convencional del virus seguido de seroneutralización e identificación inmunoquímica o molecular del virus;

b) detección del virus por RT-PCR o RT-qPCR;

c) otras técnicas de diagnóstico como IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

II.1. Aislamiento convencional del virus con posterior identificación del virus

II.1.1. Selección de las muestras

Se seleccionarán para las pruebas al menos diez peces que presenten signos típicos de NHI o SHV.

II.1.2. Preparación y envío de las muestras de peces

La preparación y el envío a efectos del aislamiento convencional del virus seguirán los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.2.

II.1.3. Recogida de material de diagnóstico suplementario

La recogida de material suplementario a efectos del aislamiento convencional del virus seguirá los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.3.

II.1.4. Preparación de muestras para el examen en cultivo celular

La preparación de las muestras para el examen en cultivo celular a efectos del aislamiento convencional del virus seguirá los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.4.

II.1.5. Examen virológico en cultivo celular

El examen virológico a efectos del aislamiento convencional del virus seguirá los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.5.

II.1.6. Identificación del virus

La identificación del virus a efectos del aislamiento convencional del virus seguirá los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.6.

II.2. Detección del virus por RT-qPCR

II.2.1. Selección de las muestras

La selección de las muestras a efectos de la detección del virus mediante RT-qPCR seguirá los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.1.2.

II.2.2. Preparación y envío de las muestras de peces

La preparación y el envío a efectos de la detección del virus mediante RT-qPCR seguirán los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.2.

II.2.3. Recogida de material de diagnóstico suplementario

La recogida de material de diagnóstico suplementario a efectos de la detección del virus mediante RT-qPCR seguirá los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.3.

II.2.4. Preparación de las muestras para RT-qPCR

La preparación de las muestras a efectos de la detección del virus mediante RT-qPCR seguirá los métodos y procedimientos establecidos en el punto I.6.4.1.

II.2.5. RT-qPCR

La detección de virus por RT-qPCR seguirá los métodos y procedimientos establecidos en los puntos I.6.4.1, I.6.4.3 y I.6.4.4.

II.3. Otras técnicas de diagnóstico

El sobrenadante preparado como se describe en el punto I.4.3 podrá someterse a una ELISA, una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) o una RT-PCR, de conformidad con los puntos I.6.1, I.6.2 o I.6.4, respectivamente. El material tisular podrá someterse a otras técnicas de diagnóstico, como IFAT en cortes congelados o pruebas inmunohistoquímicas con material tisular fijado en formol. Estas técnicas rápidas se completarán con un examen virológico con arreglo al punto II, letras a) o b), en el plazo de 48 horas después del muestreo, si:

a) se obtiene un resultado negativo; o bien

b) se obtiene un resultado positivo con un material que represente el primer caso de NHI o SHV.

III. Procedimiento de valoración para verificar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infección

Cuando se realice una valoración para verificar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infección como se indica en el punto I.5.3, se seguirán los procedimientos establecidos en los siguientes apartados del presente punto.

Se utilizarán al menos dos cepas aisladas del VSHV y una del VNHI. Las cepas representarán el mayor grupo de virus dentro de la Unión Europea, es decir, para el VSHV, una cepa patógena procedente de trucha arco iris en agua dulce y una cepa patógena marina de rodaballo y, para el VNHI, una cepa patógena de trucha arco iris de la Unión Europea. Se utilizarán cepas aisladas bien definidas procedentes de los Estados miembros. Los lotes de virus de un número bajo de pasadas en cultivo celular se propagarán en tubos de cultivo celular con células BF-2 o RTG-2, en el caso del VSHV, y con células de EPC o FHM, en el del VNHI. Se utilizará medio de cultivo celular con al menos un 10 % de suero. En la inoculación se utilizará una MOI baja (< 1).

En el momento del ECP total, se recogerá el virus mediante centrifugado del sobrenadante del cultivo celular a 2 000 × g durante 15 minutos, se esterilizará pasándolo por un filtro de membrana de 0,45 μm y se distribuirá en criotubos etiquetados. El virus se mantendrá a – 80 °C.

Una semana después de la congelación, se descongelarán en agua fría tres frascos replicados con cada virus, y se valorarán frente a sus líneas celulares respectivas. Cada cepa de virus será descongelada y valorada al menos cada seis meses, o cuando se sospeche que la sensibilidad de una línea celular ha disminuido.

Los procedimientos de valoración se describirán detalladamente y se seguirá el mismo procedimiento cada vez.

La valoración por dilución hasta el límite incluirá al menos seis réplicas en cada fase de dilución. Los valores se compararán con valores obtenidos con anterioridad. Si la valoración de alguna de las tres cepas víricas decrece en un factor igual o superior a 2 unidades logarítmicas en comparación con la valoración inicial, la línea celular ya no podrá ser utilizada con fines de vigilancia.

Si se guardan en el laboratorio distintas líneas celulares, cada línea se examinará por separado.

Se mantendrán registros durante al menos 10 años.

PARTE 2

MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO DETALLADOS PARA LA VIGILANCIA Y CONFIRMACIÓN DE LA HERPESVIROSIS DE LA CARPA KOI (HCK)

I. Métodos y procedimientos de diagnóstico para confirmar o descartar la sospecha de HCK

Cuando se precise un examen de laboratorio para confirmar o descartar la sospecha de HCK de conformidad con el artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE, utilizando los métodos de diagnóstico que se establecen en la parte 2, sección III, del anexo I, se aplicarán los métodos y procedimientos de diagnóstico detallados establecidos en los puntos I.1 y I.2 de la presente parte.

I.1. Preparación de las muestras de peces

Con fines de diagnóstico, para los ensayos con métodos basados en la PCR convencional o la qPCR podrán utilizarse peces (que se enviarán vivos o muertos y embalados por separado en recipientes asépticos precintados) o, alternativamente, órganos o trozos de órganos congelados conservados en etanol del 80 % a absoluto o en medio de transporte vírico (que serán procesados en las 48 horas siguientes a su recogida).

Para la detección del HVK se recogerán muestras de branquias y riñón; en una muestra separada adicional podrán incluirse bazo, encéfalo e intestinos. En caso de infección aguda, podrá mezclarse material tisular de hasta cinco peces.

Además, en determinados casos podrán utilizarse muestras no letales, como sangre, frotis o biopsias de las branquias o muestras de mucosidad (por tanto, en caso de sospecha de la infección por el HVK pueden usarse ejemplares muy valiosos).

I.1.1. Extracción del ADN

El ADN se extraerá con arreglo a procedimientos normalizados.

Pueden utilizarse los kits de extracción del ADN disponibles en el comercio, que permiten obtener ADN de alta calidad adecuado para su uso con los protocolos de PCR contemplados en el punto I.2.

I.2. Detección e identificación del agente mediante métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

I.2.1. qPCR para la detección del HVK

Para la detección del HVK se efectuará la siguiente prueba de qPCR:

Cebador directo (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Cebador inverso (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

Sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Sucesión de ciclos: un ciclo a 95 °C en 15 minutos, seguido de 40 ciclos a 94 °C en 15 segundos y 60 °C durante 60 segundos. En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positivos. No obstante, podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de qPCR con eficacia similar demostrada.

I.2.2. PCR convencional para la detección del HVK

Se utilizará la prueba descrita en el presente punto, que tiene por objeto el gen de la timina cinasa (TK) del HVK. Sin embargo, en su lugar podrán emplearse otras pruebas de PCR con sensibilidad y especificidad similares a la de la prueba descrita.

Cebador directo (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′.

Cebador inverso (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Sucesión de ciclos: Un ciclo a 95 °C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 95 °C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos, 72 °C durante un minuto y un ciclo a 72 °C durante 10 minutos. El producto debe ser de 409 bp.

Los resultados de la PCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir, puede que sea necesario optimizar los protocolos térmicos, dependiendo del termociclador que se use. Por otra parte, pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibridación del cebador o una contaminación. En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positivos. No obstante, podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de PCR con eficacia similar demostrada.

La primera detección en una zona se confirmará mediante secuenciación o se enviará para su identificación inmediata a un laboratorio nacional de referencia o al laboratorio de referencia de la UE para las enfermedades de los peces indicado en el anexo VI de la Directiva 2006/88/CE.

II. Métodos de diagnóstico y procedimientos detallados para la vigilancia de la HCK

Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laboratorio para obtener o mantener determinadas calificaciones sanitarias con respecto a la HCK con arreglo a la parte 2, sección I, del anexo I utilizando los métodos de diagnóstico que se establecen en la parte 2, secciones II o III, de dicho anexo se aplicarán los métodos y procedimientos de diagnóstico detallados establecidos en los siguientes puntos II.1 y II.2 de la presente parte.

II.1. Preparación de las muestras de peces

Si es posible, serán sometidos a muestreo los peces que se hayan mantenido durante un tiempo prolongado (de dos a tres semanas) en el intervalo de temperaturas que permite el desarrollo del virus, es decir, entre 15 y 26 °C. Si es posible, las muestras se recogerán una vez transcurridas 24 horas y a más tardar 72 horas después de prácticas de gestión que puedan reactivar el virus en peces vectores, como la captura en redes o el transporte, al fin de aumentar las posibilidades de detección del HVK.

Para la vigilancia de la HCK con métodos basados en la PCR podrán enviarse peces vivos o muertos y embalados por separado en recipientes asépticos precintados o, alternativamente, órganos o trozos de órganos congelados conservados en alcohol al 80-100 % o medio de transporte vírico (que serán procesados en las 48 horas siguientes a su recogida). Para la vigilancia de la HCK se recogerán muestras tisulares de branquias y riñón.

Para esta vigilancia se evitará mezclar muestras en la medida de lo posible. En caso de que sea necesario, podrá mezclarse material tisular de un máximo de dos peces. Las muestras más grandes se homogeneizarán en mortero o en licuadora, y se obtendrán submuestras para la extracción de ADN antes de la aclaración. Alternativamente, podrán obtenerse submuestras de cada tejido incluido en la muestra y colocarse en tubos de lisis.

II.1.1. Extracción del ADN

El ADN se extraerá con arreglo a procedimientos normalizados. Pueden utilizarse los kits de extracción del ADN disponibles en el comercio, que permiten obtener ADN de alta calidad adecuado para su uso con los protocolos de RT-PCR contemplados en el punto II.2.

La proporción aceptable entre tejido y medio será de 1:9 p/v. En los ensayos se incluirán entre 20 y 25 mg de material tisular.

II.2. Vigilancia de la HCK con métodos basados en la PCR

Para la vigilancia del HVK se utilizará la qPCR. Si aparecen muestras positivas en una zona sin resultados positivos confirmados previamente, los resultados de los ensayos se confirmarán mediante uno de los siguientes procedimientos:

a) Secuenciación de un producto de PCR o de PCR con cebadores internos obtenido a partir de las muestras. La secuencia de consenso clara obtenida debe coincidir (al menos en un 98 %) con las secuencias de referencia.

b) Alternativamente, las muestras pueden enviarse a un laboratorio nacional de referencia para confirmación.

II.2.1. qPCR para la detección del HVK

Se utilizará la siguiente qPCR:

Cebador directo (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Cebador inverso (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

Sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Sucesión de ciclos: un ciclo a 95 °C en 15 minutos, seguido de 50 ciclos a 94 °C en 15 segundos y 60 °C durante 60 segundos.

Los resultados de la qPCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir, puede que sea necesario optimizar los protocolos térmicos, dependiendo del termociclador que se use. Por otra parte, pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibridación del cebador o una contaminación en el laboratorio. En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positivos. No obstante, podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de la qPCR con eficacia similar demostrada.

II.2.2. PCR convencional para la confirmación del HVK

Para confirmar una infección por el HVK se empleará el protocolo genérico de PCR con cebadores internos descrito en el cuadro 2.1, seguido de la secuenciación del producto amplificado.

Cuadro 2.1

Cebadores y condiciones de la PCR con cebadores internos para todos los herpesvirus de los ciprínidos (CyHV-1, CyHV-2 y CyHV-3)

Nombre del cebador Secuencia Sucesión de ciclos Tamaño del producto CyHVpol-directo 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ Primera serie de PCR 1 ciclo: 95 °C durante 2 minutos 40 ciclos: 95 °C durante 30 segundos 55 °C durante 30 segundos 72 °C durante 45 segundos 1 ciclo: 72 °C durante 10 minutos 362 bp CyHVpol-inverso 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-directo interno 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ Segunda serie de RCP 1 ciclo: 95 °C durante 2 minutos 40 ciclos: 95 °C durante 30 segundos 55 °C durante 30 segundos 72 °C durante 45 segundos 1 ciclo: 72 °C durante 10 minutos 339 bp CyHVpol-inverso interno 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

Los resultados de la PCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir, puede que sea necesario optimizar los protocolos térmicos, dependiendo del termociclador que se use. Por otra parte, pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibridación del cebador o una contaminación en el laboratorio. En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positivos. Podrán utilizarse, en su lugar, versiones de PCR con eficacia similar demostrada.

La secuenciación podrá ser realizada por el laboratorio o en empresas externas especializadas. Los resultados de la secuenciación serán analizados comparando las secuencias con las secuencias de referencia conocidas del HVK (números de acceso a Gen Bank AP008984, DQ657948 y DQ177346). La secuencia de consenso clara obtenida debe coincidir al menos en un 98 % con dichas secuencias de referencia.

PARTE 3

MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO DETALLADOS PARA LA VIGILANCIA Y CONFIRMACIÓN DE LA ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMÓN (AIS)

I. Procedimientos de muestreo para la vigilancia y el control de la AIS

Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laboratorio a los efectos de los programas de vigilancia o erradicación establecidos en la parte 3 del anexo I o a fin de confirmar o descartar la AIS con arreglo al artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE, se aplicarán los métodos y procedimientos detallados establecidos en los puntos I.1, I.2 y I.3 de la presente sección.

I.1. Preparación de las muestras de peces

A efectos de los exámenes de laboratorio para detectar la AIS, se evitará mezclar muestras de peces en la medida de lo posible. Sin embargo, para la vigilancia de la AIS se aceptará la mezcla de entre dos y cinco peces.

Se tomarán muestras para pruebas de retrotranscripción asociada a PCR (RT-PCR) de todos los peces muestreados. Un trozo de riñón medio del pez se retirará utilizando un instrumento estéril y se introducirá en un tubo de microcentrifugado que contenga 1 ml de solución conservante del ARN de eficacia demostrada. Podrán recogerse tejidos de hasta cinco peces en un solo tubo de solución de transporte y representarán una muestra conjunta. El peso del tejido de una muestra será de 0,5 g. Cuando los peces sean demasiado pequeños para obtener una muestra del peso requerido, podrán tomarse trozos de riñón, corazón, bazo, hígado o ciegos pilóricos, en este orden de preferencia, para obtener 0,5 g.

Los tejidos para el estudio histológico solo se tomarán de peces recién sacrificados con una constitución normal, que presenten signos clínicos o post mortem compatibles con la AIS. Se tomarán con un escalpelo muestras de todas las lesiones externas o internas y, en todo caso, del riñón medio, el corazón, el hígado, el páncreas, el intestino, las branquias y el bazo, y se introducirán en una solución salina amortiguada con formol al 8-10 % (v/v). La proporción entre fijador y tejido será al menos de 20:1, para asegurar una conservación satisfactoria de los tejidos. Para la inmunohistoquímica (IHC) se tomarán muestras de riñón medio y corazón.

Se obtendrán tejidos para el examen virológico en cultivo celular de todos los peces muestreados. Se retirarán trozos de hígado, riñón anterior o medio, corazón y bazo utilizando un instrumento estéril y se introducirán en tubos de plástico que contengan 9 ml de medio de transporte. Podrán recogerse tejidos de hasta cinco peces en un solo tubo con solución de transporte y representarán una muestra conjunta. El peso del tejido de una muestra será de 1,0 ± 0,5 g.

I.2. Envío de las muestras de peces

Podrán transportarse al laboratorio peces enteros si durante el transporte pueden cumplirse los requisitos de temperatura del apartado 3 del presente punto. Los peces enteros se envolverán en papel absorbente y se enviarán en una bolsa de plástico, refrigerados como se describe en dicho apartado.

También podrán enviarse peces vivos, pero únicamente bajo la supervisión del laboratorio nacional de referencia para las enfermedades de los peces y teniendo en cuenta los aspectos suplementarios de desinfección y bioseguridad aplicables cuando se transportan peces vivos.

Las muestras de sangre y los tubos que contengan tejidos de peces para examen virológico o pruebas de RT-PCR se colocarán en recipientes aislados, como cajas de poliestireno de pared gruesa, junto con suficiente hielo o bloques de congelación para garantizar que las muestras se mantengan refrigeradas durante el transporte al laboratorio. Se evitará la congelación, y quedará hielo en la caja de transporte en el momento de la recepción, o bien uno o varios de los bloques de congelación deben seguir parcial o completamente congelados. En circunstancias excepcionales, las muestras para RT-PCR y las muestras para examen virológico podrán ser congeladas y transportarse al laboratorio a – 20 °C o menor temperatura.

Para el análisis por RT-PCR de los tejidos conservados en reactivo de estabilización del ARN, la extracción del ARN se efectuará dentro de los siguientes plazos en función de la temperatura a la que se almacenen las muestras:

muestras almacenadas a 37 °C: un día;

muestras almacenadas a 25 °C: una semana;

muestras almacenadas a 4 °C: un mes;

muestras almacenadas a – 20 °C: indefinidamente.

Si se transportan tejidos de peces en fijador para el estudio histológico, serán enviados en tubos a prueba de fugas dentro de recipientes resistentes a los golpes. Se evitará la congelación de estas muestras.

El examen virológico en cultivo celular se iniciará cuanto antes y, a más tardar, 48 horas después de la recogida de las muestras. En casos excepcionales, el examen virológico puede empezar a más tardar 72 horas después de la recogida, siempre que el material que vaya a examinarse esté protegido por medio de transporte y que puedan respetarse los requisitos de temperatura durante el transporte.

I.3. Recogida de material de diagnóstico suplementario

A reserva de la aprobación del laboratorio de diagnóstico, podrán extraerse y prepararse para un examen suplementario tejidos de peces distintos de los mencionados en el punto I.1.

II. Métodos y procedimientos de diagnóstico detallados para la vigilancia y para confirmar o descartar la sospecha de AIS

Cuando se efectúe un examen de laboratorio con el fin de obtener o mantener un determinado estatus sanitario con respecto a la AIS con arreglo a la parte 3, sección I, del anexo I o para confirmar o descartar una sospecha de AIS de conformidad con el artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE utilizando los métodos de diagnóstico establecidos en la parte 3, sección II, del anexo I, se aplicarán los métodos y procedimientos detallados establecidos en los siguientes puntos II.1 a II.5.

II.1. Examen de muestras por RT-PCR

El método de diagnóstico que debe utilizarse para el cribado del VAIS será la RT-qPCR. Dado que los resultados de la RT-qPCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúa, se incluirán testigos y amplicones positivos y negativos adecuados para evitar cualquier duda.

II.1.1. Extracción del ARN total

Todos los trabajos con ARN se realizarán en hielo, utilizando guantes.

El ARN total se extraerá utilizando el método del fenol-cloroformo o columnas de afinidad, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El ARN purificado se volverá a suspender en agua destilada libre de ribonucleasa (es decir, agua tratada con pirocarbonato de dietilo al 0,1 %).

La concentración y la pureza del ARN extraído se estimarán midiendo la densidad óptica a 260 nm y a 280 nm. Un enfoque alternativo podría ser incluir testigos internos dirigidos al genoma del virus, como se indica en el punto II.1.3.

II.1.2. RT-PCR para la detección del VAIS

Para la amplificación del genoma del VAIS pueden utilizarse varios métodos de RT-PCR. Puede realizarse una prueba de RT-PCR en dos pasos en la que las reacciones RT y PCR se efectúen en dos tubos separados. Sin embargo, también podrá hacerse una reacción en un solo paso, con ambas reacciones en un tubo. Se empleará, siempre que sea posible, el método en un solo paso, ya que el ensayo con un solo tubo minimiza el riesgo de contaminación cruzada, pues no precisa de ningún traslado de contenido y se considera tan sensible como el método en dos pasos.

Se utilizarán los cebadores y el ensayo descritos en el presente punto, a saber, la pareja de cebadores ILA1 o ILA2, dirigidos al segmento 8 y que se han considerado adecuados para detectar el VAIS en brotes y en peces vectores. El cebador inverso ILA2 no se une a cepas procedentes de América del Norte y en estos casos se utilizará un par de cebadores alternativo.

Cebador directo (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′.

Cebador inverso (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Sucesión de ciclos: Un ciclo a 50 °C durante 30 minutos, un ciclo a 94 °C durante 15 minutos, 40 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 60 segundos; un ciclo a 72 °C durante 5 minutos. Tamaño del producto: 155 bp.

Los resultados de la PCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir, puede que sea necesario optimizar los protocolos térmicos, dependiendo del termociclador que se use. Por otra parte, pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibridación del cebador o una contaminación en el laboratorio. En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positivos. No obstante, podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de RT-PCR con eficacia similar demostrada.

II.1.3. RT-qPCR para la detección del VAIS

El uso de la RT-qPCR puede aumentar la especificidad y probablemente también la sensibilidad. El método puede hacerse más rápidamente, ya que la fase de electroforesis en gel no es necesaria, y reduce el riesgo de contaminación cruzada, pues es posible estimar la cantidad de ARN del genoma del virus dentro del tubo de muestra. Una desventaja del ensayo de RT-qPCR es que a menudo no es posible secuenciar productos amplificados. No obstante, en caso de duda sobre la especificidad del producto amplificado, se realizará otro ensayo específico para el VAIS a fin de verificar el resultado.

Se utilizará el ensayo descrito en el presente punto, dirigido al segmento 8. Este ensayo será válido para las cepas procedentes de la Unión Europea, de países de la Asociación Europea de Libre Comercio y de América del Norte. Se empleará, siempre que sea posible, el método en un solo paso, ya que el ensayo con un solo tubo minimiza el riesgo de contaminación cruzada.

Cebador directo: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′.

Cebador inverso: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′.

Sonda: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC — MGBNFQ-3′.

En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positivos. Sucesión de ciclos: Un ciclo a 50 °C durante 30 minutos, un ciclo a 95 °C durante 15 minutos, 40 ciclos a 94 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 60 segundos. Se ajustará en caso necesario. Podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de RT-PCR o RT-qPCR con eficacia similar demostrada.

II.1.4. Secuenciación de los productos de PCR amplificados

Cebador directo (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′.

Cebador inverso (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.

En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positivos. Sucesión de ciclos (RT-PCR de dos pasos): un ciclo a 50 °C durante 30 minutos, un ciclo a 94 °C durante 15 minutos, 40 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 60 segundos, un ciclo a 72 °C durante 5 minutos; se ajustará en caso necesario. Podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de RT-PCR o RT-qPCR con eficacia similar demostrada.

Como alternativa, podrá utilizarse el siguiente método para secuenciar la HPR en el segmento 6:

Cebador directo: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′.

Cebador inverso: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.

Tamaño del producto: 304 nt si HPR0.

También podrán utilizarse ensayos RT-PCR con sensibilidades y especificidades similares a los ensayos descritos en el presente punto.

La pureza del producto de la RT-PCR amplificado se comprobará mediante electroforesis en gel antes de la secuenciación. Si aparece solo un fragmento puro, se purificará directamente a partir de la PCR. Si están presentes múltiples fragmentos amplificados, el fragmento de interés se purificará mediante electroforesis en gel. La purificación de los fragmentos amplificados a partir de soluciones o geles de agarosa se efectuará utilizando columnas de afinidad para fragmentos de PCR, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La secuenciación se realizará utilizando cebadores de amplificación en empresas externas especializadas. Los resultados se analizarán mediante la herramienta de búsqueda BLAST u las secuencias se compararán a otras secuencias conocidas de la base de datos de nucleótidos del Centro Nacional de Información Biotécnica de los Estados Unidos (NCBI).

La secuenciación eliminará cualquier duda sobre la especificidad de un producto amplificado de RT-PCR.

II.2. Aislamiento del VAIS en cultivos celulares

II.2.1. Preparación de las muestras

Los tejidos podrán mantenerse a – 80 °C. Solo podrán congelarse y descongelarse una vez antes de su examen. Con fines de vigilancia y control, el examen se llevará a cabo con la mayor rapidez posible.

Cada muestra conjunta de tejidos en solución de transporte será completamente homogeneizada con un homogeneizador validado y se centrifugará a entre 2 000 y 4 000 × g durante 15 minutos a 0-6 °C; el sobrenadante se filtrará (0,45 μm) y se incubará en un volumen igual de una mezcla adecuadamente diluida de antisueros contra los serotipos locales del VNPI. El valor del antisuero será de al menos 1:2 000 en una prueba de neutralización en placa al 50 %. La mezcla se incubará durante una hora a 15 °C. Esto representará el inóculo.

El tratamiento de todos los inóculos con antisuero contra el VNPI (que en algunas partes de Europa se encuentra en un 50 % de las muestras de peces) tiene por objeto evitar que el VNPI produzca ECP en los cultivos celulares inoculados. Este tratamiento puede realizarse para reducir la duración de los exámenes virológicos, así como el número de casos en los que el ECP tendría que considerarse potencialmente indicativo del VAIS. Cuando las muestras procedan de unidades de producción que se consideran libres de NPI, podrá omitirse el tratamiento de los inóculos con antisuero contra el VNPI.

II.2.2. Inoculación en cultivos celulares

Para el aislamiento primario del VAIS se utilizarán células de riñón de salmón del Atlántico (ASK). Podrán utilizarse otras líneas celulares de eficacia y sensibilidad demostradas para aislar el VAIS, teniendo en cuenta la variabilidad de las cepas y su capacidad de replicarse en distintas líneas celulares. Las células de ASK parecen soportar el aislamiento y el crecimiento de las cepas de virus conocidas hasta la fecha, en la medida en que se utilice un número poco elevado de pasadas. En las células de ASK puede aparecer un ECP más claro que en otras líneas celulares sensibles, como SHK-1 (riñón anterior de salmón-1).

Las células de ASK (65 pasadas o menos) se cultivarán en un medio L-15 que contenga 10 % de suero bovino fetal, 2 % (v/v) de L-glutamina 200 mM y 0,08 % (v/v) de 2-mercaptoetanol 50 mM, en placas con múltiples pocillos. Se inoculará la suspensión de órganos tratada con antisuero en cultivos celulares jóvenes en crecimiento activo hasta obtener una dilución final del material tisular en el medio de cultivo de 1:1 000. Para cada órgano, 40 μl de la suspensión de inóculo se añadirán a un pocillo que contenga 2 ml de medio de cultivo. Para minimizar el riesgo de contaminación cruzada, se utilizarán placas separadas de doce o veinticuatro pocillos para las muestras procedentes de distintos lugares de las explotaciones piscícolas.

Se dejará una placa sin inocular como testigo negativo. Otra placa se inoculará con una cepa de referencia del VAIS como testigo positivo, conforme al siguiente procedimiento. Se inoculará en el primer pocillo 100 μl de una preparación madre de VAIS (valor mínimo 107 dosis infecciosas del 50 % del cultivo tisular [DICT50 ml– 1]) y se mezclará. Un volumen de este material se trasladará del primer pocillo al segundo para hacer una dilución a 1:10 y se mezclará. Esto se repetirá en toda la placa para hacer seis diluciones a 1:10. La preparación madre de VAIS puede almacenarse a – 80 °C durante al menos dos años, pero una vez descongelada deberá utilizarse en un plazo de tres días. Se tomarán precauciones para evitar la contaminación cruzada de las placas de ensayo con material testigo positivo. Para impedir este riesgo, los testigos positivos se prepararán y manipularán por separado de las placas de ensayo. En lugar de incluir un testigo positivo en cada inoculación, puede optarse por hacer cada seis meses una prueba de sensibilidad de las células de ASK frente al VAIS.

Las muestras se incubarán a 15 ± 2 °C durante un máximo de 15 días. Para observar si se ha producido ECP, los cultivos celulares se examinarán al microscopio en dos ocasiones, entre 5 y 7 días y entre 12 y 14 días después de la inoculación. Si alguna muestra conjunta presenta ECP, se iniciarán inmediatamente los procedimientos de identificación del virus de conformidad con el punto II.2.4. Si no se observa ECP hasta el día 14, se efectuará una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT), una hemadsorción o una prueba de RT-PCR.

II.2.3. Subcultivo

El subcultivo se llevará a cabo entre los días 13 y 15. Se añadirá sobrenadante de cultivo en los pocillos que contengan células frescas en crecimiento activo en una dilución adecuada (1:10) en placas con múltiples pocillos y se incubará a 14 ± 2 °C durante un máximo de 18 días. Para observar si se ha producido ECP, los cultivos celulares se examinarán al microscopio en dos ocasiones, entre 5 y 7 días y entre 14 y 18 días después de la inoculación. Si alguna muestra conjunta presenta ECP, se iniciarán inmediatamente los procedimientos de identificación del virus de conformidad con el punto II.2.4. Si no se observa ECP entre los días 14 y 18, se efectuará una hemadsorción o una prueba de RT-PCR.

Si la citotoxicidad se produce en los primeros siete días de incubación, se realizará un subcultivo en esa fase, y las células se incubarán entre 14 y 18 días y volverán a subcultivarse durante otra período de entre 14 y 18 días. Si la citotoxicidad se produce después de siete días, se realizará un solo subcultivo y las células se incubarán hasta alcanzar el período total de 28 a 36 días de incubación de la inoculación primaria.

Si se produce contaminación bacteriana del cultivo primario, se repetirá la prueba utilizando el homogeneizado de tejidos almacenado a – 80 °C. Antes de la inoculación, el homogeneizado de tejidos se centrifugará a 4 000 × g durante 15 a 30 minutos a entre 0 y 6 °C, y el sobrenadante se filtrará a 0,22 μm. Si se produce contaminación bacteriana durante la fase de subcultivo, el sobrenadante se filtrará a 0,22 μm, se inoculará en células frescas y se incubará durante otros 14 a 18 días.

II.2.4. Pruebas de identificación del virus

Si se observa ECP en cualquier fase o si la prueba de hemadsorción es positiva, se llevará a cabo la identificación del virus. Los métodos preferibles para la identificación del VAIS serán la de RT-PCR de conformidad con el punto II.1 y la inmunofluorescencia (IF) de conformidad con el punto II.2.6. Si se considera que puede haber otros virus, se realizarán pruebas suplementarias de identificación de virus. En caso de que tales pruebas no proporcionen una identificación definitiva del virus en el plazo de una semana, el sobrenadante se enviará para su identificación inmediata:

a) al laboratorio de referencia para la AIS de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), o

b) a un laboratorio nacional de referencia o al laboratorio de referencia de la UE para las enfermedades de los peces al que se refiere el anexo VI de la Directiva 2006/88/CE.

II.2.5. Hemadsorción

Como la replicación del VAIS en cultivos celulares no siempre produce ECP, cada pocillo se someterá a una prueba de RT-PCR o de hemadsorción de conformidad con el presente punto, o a una prueba IF con arreglo al punto II.2.6.

El medio de cultivo celular se retirará de cada pocillo, incluidos los testigos positivos y negativos, y se introducirá en tubos estériles. En cada pocillo se añadirán 500 μl de una suspensión al 0,2 % (v/v) de eritrocitos lavados de conejo o de caballo, o de una suspensión a 0,05 % (v/v) de eritrocitos lavados de trucha arco iris o de salmón del Atlántico, y se incubarán a temperatura ambiente durante 45 minutos. Se retirarán los eritrocitos y los pocillos se lavarán dos veces con medio L-15. Se examinará cada pocillo al microscopio.

La presencia de aglomerados de eritrocitos adheridos a la superficie de las células de ASK se considerará un indicio de presunta infección por un ortomixovirus. Si la prueba de hemadsorción es positiva, se realizará inmediatamente una prueba de identificación del virus de conformidad con el punto II.2.4.

II.2.6. Inmunofluorescencia (IF)

Las células de ASK (65 pasadas o menos) se cultivarán en un medio L-15 que contenga 10 % de suero bovino fetal, 2 % (v/v) de L-glutamina 200 mM y 0,08 % (v/v) de 2-mercaptoetanol 50 mM en placas con múltiples pocillos y se utilizarán a más del 50 % de confluencia. También podrán utilizarse otras líneas celulares o medio de cultivo de eficacia demostrada. En cada uno de dos pocillos se añadirán 225 μl de sobrenadante de cultivo presuntamente infectado con el virus, se mezclará y se transferirán 225 μl a otros dos pocillos, alcanzando una dilución de 1:5. Otros dos pocillos se dejarán sin inocular como testigos. Las muestras de peces de cada explotación se manipularán en placas separadas, así como el testigo del virus. Se establecerá un testigo utilizando una cepa de referencia del VAIS.

Las placas se incubarán a 14 ± 2 °C y se examinarán al microscopio durante un máximo de 7 días. Cuando el ECP aparezca tempranamente, o si no se observa en 7 días, el próximo paso será la fijación. Los pocillos se lavarán con PBS y se fijarán mediante incubación con un 80 % de acetona durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las placas se secarán al aire y se teñirán inmediatamente o se almacenarán a 0-6 °C durante no más de 24 horas antes de realizar la tinción.

Los pocillos replicados se teñirán con una mezcla de anticuerpos monoclonales (AcM) 3H6F8 y 1OC9F5 contra el VAIS, u otros AcM de eficacia y especificidad demostradas, diluidos en PBS, y se incubarán a 37 ± 4 °C durante 30 minutos. Los AcM se retirarán y las placas se lavarán tres veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se añadirá en cada pocillo FITC conjugado con anti-IgG de ratón, diluido en PBS, y se incubará a 37 ± 4 °C durante 30 minutos. Las diluciones de diferentes lotes de AcM y conjugado FITC se optimizarán en cada laboratorio. El anticuerpo se retirará y las placas se lavarán tres veces con 0,05 % de Tween 20 en PBS.

Los pocillos se examinarán inmediatamente con un microscopio invertido equipado para microscopía de fluorescencia con un filtro adecuado para la excitación del FITC. La prueba se considerará positiva si se observan células fluorescentes. Para que la prueba sea válida, los testigos positivos deberán dar resultados positivos y los testigos negativos, resultados negativos.

II.3. Examen de otros tejidos

La técnica del punto II.2.6 podrá a