ANEXO

El anexo del Reglamento (CE) no 440/2008 queda modificado como sigue:

Se introducen los capítulos B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 y B.58:

«B.53. ESTUDIO DE NEUROTOXICIDAD PARA EL DESARROLLO

INTRODUCCIÓN

1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 426 (2007). En Copenhague, en junio de 1995, un grupo de trabajo de la OCDE sobre toxicidad para la reproducción y el desarrollo debatió la necesidad de actualizar las vigentes directrices de ensayo de la OCDE sobre la toxicidad para la reproducción y el desarrollo, así como de elaborar nuevas directrices sobre parámetros aún no incluidos (1). El grupo de trabajo recomendó que se escribieran unas directrices de ensayo sobre la neurotoxicidad para el desarrollo, sobre la base de unas directrices de la Agencia de Protección del Medio Ambiente estadounidense (EPA), que después han sido revisadas (2). En junio de 1996 se celebró en Copenhague una segunda reunión de consulta para facilitar a la Secretaría orientaciones para el esbozo de unas nuevas directrices de ensayo sobre la neurotoxicidad para el desarrollo, incluidos los principales elementos como, por ejemplo, los datos sobre la elección de la especie animal, el período de administración, el período de las pruebas, los parámetros que deben evaluarse, y los criterios para la evaluación de los resultados. En 1998 se publicaron unas directrices de evaluación del riesgo de neurotoxicidad de EE. UU. (3). En octubre de 2000 se celebraron consecutivamente una reunión de consulta de expertos de la OCDE y un taller del Instituto de Ciencias del Riesgo del ILSI, y en 2005 tuvo lugar en Tokio una reunión de consulta de expertos. Estas reuniones se celebraron para debatir las cuestiones científicas y técnicas relacionadas con las vigentes directrices de ensayo, y en ellas se elaboraron recomendaciones (4)(5)(6)(7) que se tuvieron en cuenta para desarrollar el presente método de ensayo. En los documentos de orientación de la OCDE no 43 sobre “Reproductive Toxicity Testing and Assessment” (Ensayo y evaluación de la toxicidad para la reproducción) (8) y no 20 sobre “Neurotoxicity Testing” (Ensayo de la neurotoxicidad) (9) se encuentra información adicional sobre la realización, interpretación y terminología correspondientes al presente método de ensayo.

CONSIDERACIONES INICIALES

2. Se sabe que una serie de sustancias produce efectos neurotóxicos en el desarrollo de los seres humanos y de otras especies (10)(11)(12)(13). Con el fin de valorar y evaluar las características tóxicas de una sustancia puede ser necesario determinar su posible neurotoxicidad para el desarrollo. Se han diseñado estudios de neurotoxicidad para el desarrollo con el fin de ofrecer datos, incluida la caracterización de la relación dosis-respuesta, en relación con los posibles efectos funcionales y morfológicos sobre el sistema nervioso en desarrollo de la descendencia que puedan derivarse de la exposición durante la gestación y durante las primeras fases de la vida.

3. El estudio de la neurotoxicidad para el desarrollo puede llevarse a cabo como estudio aparte, incorporarse en un estudio de la toxicidad para la reproducción o de la neurotoxicidad para los adultos [por ejemplo, métodos de ensayo B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)], o añadirse a un estudio de toxicidad para el desarrollo prenatal [por ejemplo, método de ensayo B.31 (17)]. Cuando el estudio de neurotoxicidad para el desarrollo está incorporado o añadido a otro estudio, es imperativo preservar la integridad de los dos tipos de estudios. Todos los ensayos deben cumplir la legislación aplicable o las directrices gubernamentales o institucionales para el uso de animales de laboratorio en la investigación (por ejemplo, 18).

4. Antes de efectuar el estudio, el laboratorio de ensayo debe considerar toda la información disponible sobre la sustancia problema. Tal información ha de incluir la identidad y la estructura de la sustancia, sus propiedades fisicoquímicas, los resultados de otros eventuales ensayos de toxicidad in vitro o in vivo efectuados con ella, los datos toxicológicos disponibles sobre sustancias relacionadas estructuralmente, y el uso o usos previstos de la sustancia. Esta información es necesaria para que todos los interesados puedan estar seguros de que el ensayo es pertinente para la protección de la salud humana, y ayudará a la selección de una dosis inicial adecuada.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

5. La sustancia problema se administra a los animales durante la gestación y lactancia. Se someten a ensayo animales madres para evaluar los efectos en las hembras gestantes y lactantes y también para obtener información comparativa (madres/descendientes). Se seleccionan aleatoriamente descendientes dentro de las camadas para realizar la evaluación de la neurotoxicidad. Esta evaluación consiste en realizar observaciones para detectar anomalías conductuales y neurológicas macroscópicas, incluida la evaluación del desarrollo físico, la ontogenia del comportamiento, la actividad motriz, las funciones motrices y sensitivas, y el aprendizaje y la memoria, así como la evaluación del peso del encéfalo y de la neuropatología durante el período de desarrollo postnatal y la edad adulta.

6. Cuando el método de ensayo se lleva a cabo como estudio aparte, pueden utilizarse animales disponibles adicionales de cada grupo para aplicarles procedimientos específicos neuroconductuales, neuropatológicos, neuroquímicos o electrofisiológicos, con el fin de completar los datos obtenidos a partir de los exámenes recomendados por este método de ensayo (16)(19)(20)(21). Los procedimientos complementarios pueden ser especialmente útiles cuando la observación empírica, los efectos previstos o el mecanismo o modo de acción indiquen un tipo determinado de neurotoxicidad. Estos procedimientos complementarios pueden utilizarse con las madres y también con las crías. Además, pueden utilizarse también procedimientos ex vivo o in vitro, en la medida en que dichos procedimientos no alteren la integridad de los procedimientos in vivo.

PREPARACIÓN DEL ENSAYO

Selección de la especie animal

7. La especie de ensayo preferida es la rata, pero pueden utilizarse otras especies cuando sea pertinente. Téngase en cuenta, no obstante, que los días de gestación y postnatales especificados en este método de ensayo son específicos de las cepas de ratas utilizadas habitualmente, y deben seleccionarse días comparables si se utiliza una especie diferente o una cepa poco usual. La utilización de otra especie debe justificarse con datos toxicológicos, farmacocinéticos o de otro tipo. La justificación debe incluir la disponibilidad de evaluaciones neuroconductuales y neuropatológicas postnatales propias de la especie. Si existe un ensayo anterior que haya suscitado inquietud, debe considerarse utilizar la especie o cepa que haya suscitado tal inquietud. Debido a las diferencias de comportamiento que presentan las diferentes cepas de rata, debe demostrarse que la cepa seleccionada para su uso presenta una fecundidad y una capacidad de respuesta adecuadas. Deben estar documentadas la fiabilidad y la sensibilidad de otras especies para detectar la neurotoxicidad para el desarrollo.

Condiciones de alojamiento y alimentación

8. El local de los animales de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 ± 3 °C. Aunque la humedad relativa ha de ser, como mínimo, del 30 % y preferentemente sin superar el 70 %, salvo durante la limpieza del local, lo ideal es que esté comprendida entre el 50 y el 60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. También es posible invertir el ciclo de luz antes del apareamiento y en toda la duración del estudio, a fin de efectuar las evaluaciones de los parámetros funcionales y de comportamiento durante el período de oscuridad (con luz roja), es decir, durante el tiempo en que los animales están normalmente activos (22). Los eventuales cambios en el ciclo de luz-oscuridad deben incluir un tiempo adecuado de aclimatación para que los animales puedan adaptarse al nuevo ciclo. Puede proporcionarse una dieta alimentaria corriente para animales de laboratorio y agua a voluntad. Los tipos de alimentos y de agua deben notificarse y ambos elementos deben analizarse para la detección de eventuales contaminantes.

9. Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del mismo sexo. El apareamiento debe llevarse a cabo en jaulas adecuadas al efecto. Una vez comprobado el apareamiento o como tarde el día 15 de la gestación, los animales que se hayan apareado deben colocarse por separado en jaulas preparadas para el parto y la maternidad. Las jaulas se colocan de manera que los posibles efectos debidos a la puesta de los animales en las mismas sean mínimos. Cuando se acerque la fecha del parto, a las hembras apareadas se les proporcionará material adecuado y determinado de nidificación. Se sabe que el estrés o la manipulación indebida durante la gestación pueden ocasionar resultados adversos, como muerte fetal y alteraciones del desarrollo fetal y postnatal. Para prevenir las muertes fetales debidas a factores ajenos al tratamiento, los animales deben tratarse con precaución durante la gestación, y debe evitarse el estrés debido a factores externos como el ruido excesivo.

Preparación de los animales

10. Deben emplearse animales sanos, que estén aclimatados a las condiciones del laboratorio y que no se hayan sometido a experimentos previos, a menos que el estudio esté incorporado a otro estudio (véase el punto 3). Deben caracterizarse los animales de experimentación en cuanto a su especie, cepa, procedencia, sexo, peso y edad. A cada animal se le debe asignar un número de identificación único, con el que estará marcado. Los animales de todos los grupos de ensayo han de ser tan homogéneos como resulte posible en cuanto a su peso y edad, y deben estar en el intervalo normal de la especie y cepa en estudio. Deben emplearse hembras adultas jóvenes y nulíparas para cada dosis. Los hermanos no deben aparearse, y debe prestarse atención para garantizar este extremo. El día de gestación (DG) 0 es el día en el que se observa la presencia de un tapón vaginal o de semen. Debe dejarse un tiempo adecuado de aclimatación (por ejemplo, de 2 o 3 días), al comprar a un proveedor animales con un tiempo conocido de gestación. Las hembras apareadas se deben repartir sin sesgos entre los grupos tratados y los de control, y en la medida de lo posible deben distribuirse de manera equilibrada entre los grupos (por ejemplo, se recomienda un procedimiento aleatorio estratificado para conseguir una distribución equilibrada entre todos los grupos, tal como el basado en el peso corporal). Las hembras inseminadas por un mismo macho deben repartirse de forma igualitaria entre los grupos.

PROCEDIMIENTO

Número y sexo de los animales

11. Cada grupo tratado y de control debe incluir un número suficiente de hembras grávidas que se expondrán a la sustancia problema a fin de conseguir un número adecuado de descendientes para la evaluación de la neurotoxicidad. Se recomienda un total de 20 camadas para cada nivel de dosis. Se permiten diseños de la administración en grupos duplicados y en grupos escalonados siempre que se consiga el número total de camadas por grupo y se utilicen modelos estadísticos adecuados para tener en cuenta las duplicaciones.

12. En el día postnatal (DPN) 4 (el DPN 0 es el del parto) o antes del mismo, se debe ajustar el tamaño de cada camada mediante la eliminación de las crías sobrantes por selección aleatoria para obtener un tamaño uniforme de todas las camadas (23). El tamaño de la camada no debe superar el tamaño medio de las camadas de la cepa de roedores utilizados (8-12). Las camadas deben tener, en la medida de lo posible, un número igual de crías machos y hembras. No es apropiada la eliminación selectiva de las crías, por ejemplo en función del peso corporal. Tras la normalización de las camadas (sacrificio de las crías sobrantes) y antes de realizar las pruebas de los parámetros funcionales, las crías concretas que se asignen a los ensayos anteriores o posteriores al destete deben identificarse de manera inequívoca, utilizando cualquier método no cruel adecuado a tal fin (por ejemplo, 24).

Asignación de los animales a los ensayos funcionales y de comportamiento, pesajes del encéfalo y evaluaciones neuropatológicas

13. El método de ensayo permite diferentes enfoques con respecto a la asignación de animales expuestos en el útero y a través de la lactancia a ensayos funcionales y de comportamiento, determinación de la maduración sexual, pesaje del encéfalo, y evaluación neuropatológica (25). Se pueden añadir otros ensayos de la función neuroconductual (por ejemplo, el comportamiento social), de neuroquímica o de neuropatología según cada caso, siempre que no se vea comprometida la integridad de los ensayos originales requeridos.

14. Se seleccionan las crías de cada grupo de dosis y se asignan para la evaluación de los parámetros el DPN 4 o después. Deben seleccionarse las crías de tal modo que, en la medida de lo posible, estén representados igualmente en todas las pruebas los dos sexos de cada camada en cada grupo de dosis. Para el ensayo de la actividad motriz, debe someterse a ensayo el mismo par de crías machos y hembras a todas las edades antes del destete (véase el punto 35). Para todos los demás ensayos, es posible asignar a las diferentes pruebas de comportamiento el mismo par de animales machos y hembras u otros distintos. Puede ser necesario asignar crías diferentes a los ensayos de la función cognitiva de animales destetados frente a los de animales adultos con el fin de evitar la confusión entre los efectos de la edad y los del entrenamiento previo sobre estas mediciones (26)(27). En el momento del destete (DPN 21), las crías que no se hayan seleccionado para algún ensayo pueden desecharse de forma compasiva. Todas las eventuales alteraciones de las asignaciones de las crías deben recogerse en el informe. La unidad estadística de medida debe ser la camada (o la madre) y no la cría.

15. Existen diversas maneras de asignar las crías a los exámenes anteriores y posteriores al destete, ensayos cognitivos, exámenes patológicos, etc. (véase la figura 1 en cuanto al diseño general y el apéndice 1 en cuanto a ejemplos de asignación). Los números mínimos recomendados de animales en cada grupo tratado para los exámenes anteriores y posteriores al destete son los siguientes:

Observaciones clínicas y de peso corporal Todos los animales Observaciones clínicas detalladas 20/sexo (1/sexo/camada) Peso del encéfalo (tras la fijación) DPN 11-22 10/sexo (1/camada) Peso del encéfalo (sin fijar) ~ DPN 70 10/sexo (1/camada) Neuropatología (fijación por inmersión o perfusión) DPN 11-22 10/sexo (1/camada) Neuropatología (fijación por perfusión) ~ DPN 70 10/sexo (1/camada) Maduración sexual 20/sexo (1/sexo/camada) Otros parámetros del desarrollo (optativos) Todos los animales Ontogenia del comportamiento 20/sexo (1/sexo/camada) Actividad motriz 20/sexo (1/sexo/camada) Funciones motrices y sensitivas 20/sexo (1/sexo/camada) Aprendizaje y memoria 10/sexo (1) (1/camada)

Posología

16. Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un grupo de control en paralelo. Las dosis han de ser espaciadas para obtener una gradación de efectos tóxicos. Salvo cuando esté limitada por la naturaleza fisicoquímica o las propiedades biológicas de la sustancia, la dosis más elevada debe elegirse de forma que induzca cierta toxicidad para la madre (por ejemplo, signos clínicos, descenso del aumento de peso corporal (en no más del 10 %), o pruebas de toxicidad limitante de la dosis en un órgano diana). La dosis más alta puede limitarse a 1 000 mg/kg/día de peso corporal, con algunas excepciones; por ejemplo, la exposición humana prevista puede indicar la necesidad de utilizar una dosis superior. Otra posibilidad consiste en realizar estudios piloto o estudios preliminares para determinar el intervalo de concentraciones, a fin de establecer la dosis máxima utilizable que debe producir un grado mínimo de toxicidad para la madre. Si se ha comprobado que la sustancia problema es tóxica para el desarrollo, ya sea en un estudio normal de toxicidad para el desarrollo o en un estudio piloto, la dosis más alta debe ser la dosis máxima que no induce toxicidad excesiva para los descendientes ni muerte fetal o neonatal ni malformaciones, lo que sería suficiente para no permitir una evaluación significativa de la neurotoxicidad. La dosis más baja debe aspirar a no provocar ningún signo de toxicidad para la madre ni para el desarrollo, incluida la neurotoxicidad. Debe seleccionarse una secuencia decreciente de dosis con vistas a demostrar la eventual relación dosis-respuesta y la existencia de un nivel sin efectos adversos observados (NOAEL), o dosis cerca del límite de detección que permitan la determinación de una dosis de referencia. Los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer las dosis decrecientes y a menudo es preferible añadir un cuarto grupo de ensayo en lugar de utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo, con un factor superior a 10) entre dosis.

17. Las dosis deben establecerse tomando en consideración todos los datos disponibles sobre la toxicidad y la información complementaria relativa al metabolismo y la toxicocinética de la sustancia problema o productos afines. Dicha información puede ayudar asimismo a justificar la pertinencia de la posología. Debe considerarse la administración directa de dosis a las crías en función de la información sobre la exposición y la farmacocinética (28)(29). Antes de realizar estudios de administración directa de dosis deben considerarse cuidadosamente sus ventajas e inconvenientes (30).

18. El grupo de control en paralelo debe ser un grupo de control que no recibe tratamiento, o un grupo de control del vehículo si se utiliza este para administrar la sustancia problema. En principio, todos los animales deben recibir el mismo volumen de sustancia problema o de vehículo por unidad de peso corporal. Si se utiliza un vehículo u otro aditivo para facilitar la administración, debe atenderse a las siguientes características: efectos sobre la absorción, distribución, metabolismo o retención de la sustancia problema; efectos sobre las propiedades químicas de la sustancia problema que puedan modificar sus características de toxicidad; y efectos sobre el consumo de alimentos y agua o sobre el estado nutricional de los animales. El vehículo no debe provocar efectos que puedan interferir con la interpretación del estudio y tampoco debe ser tóxico neuroconductual ni afectar a la reproducción o al desarrollo. En caso de nuevos vehículos, debe incluirse un grupo de control que no reciba tratamiento, además de un grupo de control del vehículo. Los animales del grupo o grupos de control deben tratarse de la misma manera que los de los grupos de ensayo.

Administración de las dosis

19. La sustancia problema o el vehículo deben administrarse por la vía más pertinente para la posible exposición humana, y sobre la base de la información disponible relativa al metabolismo y distribución en los animales de ensayo. La vía de administración será generalmente oral (por ejemplo, vía oral forzada, con la alimentación, con el agua de bebida), pero pueden utilizarse otras vías (por ejemplo, cutánea, por inhalación), en función de las características y de las vías de exposición humana previstas o conocidas (se dan más orientaciones en el documento de orientación 43 (8). Debe facilitarse una justificación de la vía de administración elegida. La sustancia problema debe administrarse todos los días a la misma hora más o menos.

20. La dosis administrada a cada animal debe basarse normalmente en la última determinación del peso corporal. No obstante, hay que ser prudente al adaptar la dosis en el último tercio de la gestación. Si se observa una toxicidad excesiva en las madres tratadas, estas deberán sacrificarse por métodos compasivos.

21. La sustancia problema o el vehículo deben administrarse como mínimo una vez al día a las hembras apareadas desde el momento de la implantación (DG 6) hasta el final de la lactancia (DPN 21), de forma que las crías estén expuestas a la sustancia durante su desarrollo neurológico, tanto pre como postnatal. La edad a la que se inicia la administración, así como la duración y la frecuencia de esta, podrán ajustarse en caso de que haya pruebas que apoyen otro diseño experimental más pertinente para la exposición humana. La duración de la administración debe ajustarse en caso de que se utilicen otras especies, para garantizar la exposición durante todas las fases tempranas del desarrollo del encéfalo (es decir, las equivalentes al crecimiento del encéfalo humano en los períodos prenatal y postnatal temprano). La administración puede comenzar desde el inicio de la gestación (DG 0), aunque debe prestarse atención al potencial de la sustancia problema para causar la muerte del embrión antes de la implantación. Si la administración comenzara el DG 6 se evitaría este riesgo, pero no se tratarían las fases de desarrollo entre los DG 0 y 6. Cuando un laboratorio compra animales ya apareados, es imposible comenzar la administración el DG 0, por lo que el DG 6 sería una buena opción para empezarla. El laboratorio de ensayo debe fijar la posología según la información pertinente disponible sobre los efectos de la sustancia problema, la experiencia previa y las consideraciones logísticas; puede incluirse la continuación de la administración pasado el destete. No debe administrarse la sustancia problema el día del parto a los animales que no hayan terminado de parir completamente. En general, se acepta que la exposición de las crías tiene lugar a través de la leche materna; sin embargo, debe considerarse la administración directa de la sustancia a las crías en los casos en que falten pruebas de la continuidad de la exposición de la descendencia. Pueden obtenerse estas pruebas de que la exposición continúa a partir de, por ejemplo, la información farmacocinética, la toxicidad para la descendencia o cambios en biomarcadores (28).

OBSERVACIONES

Observaciones sobre las madres

22. Todas las madres deben observarse cuidadosamente al menos una vez al día para comprobar su estado de salud, incluida la morbimortalidad.

23. Durante los períodos de tratamiento y de observación, deben realizarse periódicamente (al menos dos veces durante el período de administración en la gestación y dos veces durante el período de administración en la lactancia) observaciones clínicas más detalladas, utilizando al menos diez madres por nivel de dosis. Los animales serán observados, fuera de su jaula de alojamiento, por técnicos especializados que no estén advertidos del tratamiento de los animales, utilizando procedimientos normalizados para minimizar el estrés de los animales y los sesgos de los observadores, y maximizar la fiabilidad entre los observadores. Cuando sea posible, se recomienda que todas las observaciones de un determinado estudio sean hechas por el mismo técnico.

24. La presencia de signos observados debe consignarse. Siempre que sea factible, se registrará también la magnitud de los signos observados. Las observaciones clínicas deben incluir, entre otras cosas, los cambios de la piel, pelo, ojos, mucosas, la presencia de secreciones y la actividad neurovegetativa (por ejemplo, lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila, pauta inusual de respiración y/o respiración por la boca, y cualquier signo anómalo de micción o defecación).

25. También habrá de anotarse cualquier respuesta no habitual en lo que se refiere a la posición del cuerpo, el nivel de actividad (por ejemplo, aumento o disminución de la exploración de la zona normal) y la coordinación de los movimientos. Deben registrarse también los cambios observados en la marcha (por ejemplo, contoneo o ataxia), postura (por ejemplo, espalda encorvada) y respuesta a la manipulación, a la colocación o a otros estímulos ambientales, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, convulsiones, temblores, estereotipias (por ejemplo, realización excesiva de movimientos de limpieza, movimientos anómalos de la cabeza, recorridos repetitivos en círculo) o comportamientos anómalos (por ejemplo, lamido excesivo o mordiscos, automutilación, marcha hacia atrás, vocalización) o de agresión.

26. Los signos de toxicidad han de anotarse, incluidos el día de inicio, la hora del día, el grado y la duración.

27. Los animales deben pesarse en el momento en que se les administra la sustancia, al menos una vez por semana a lo largo de todo el estudio, el día del parto o cerca de este, y el día DPN 21 (destete). En los ensayos en que se emplee la vía oral forzada, las madres deben pesarse como mínimo dos veces por semana. Las dosis deben adaptarse en el momento de cada determinación del peso corporal, según proceda. El consumo de alimentos debe medirse al menos una vez por semana durante la gestación y lactancia. Debe medirse el consumo de agua al menos semanalmente, si la exposición es a través del suministro de agua.

Observaciones sobre los descendientes

28. Todos los descendientes deben observarse cuidadosamente al menos una vez al día para detectar los signos de toxicidad y la morbimortalidad.

29. Durante los períodos de tratamiento y de observación, deben llevarse a cabo observaciones clínicas más detalladas de los descendientes. Los descendientes (al menos una cría/sexo/camada) serán observados por técnicos especializados que no estén advertidos del tratamiento de los animales, utilizando procedimientos normalizados para minimizar los sesgos y maximizar la fiabilidad entre los observadores. Cuando sea posible, se recomienda que las observaciones sean hechas por el mismo técnico. Como mínimo, deben supervisarse los parámetros descritos en los puntos 24 y 25 en la medida adecuada para la fase de desarrollo que se esté observando.

30. Han de anotarse todos los signos de toxicidad observados en los descendientes, incluidos el día de inicio, la hora del día, el grado y la duración.

Parámetros físicos y del desarrollo

31. Los cambios en los parámetros del desarrollo previos al destete (por ejemplo, despliegue de las orejas, apertura de los ojos, erupción de los incisivos) están muy correlacionados con el peso corporal (30)(31). El peso corporal puede ser el mejor indicador del desarrollo físico. La medición de parámetros del desarrollo se recomienda, por lo tanto, solo en el caso de que haya pruebas de que estos parámetros van a aportar información adicional. El calendario para la evaluación de estos parámetros se indica en el cuadro 1. En función de los efectos previstos y de los resultados de las mediciones iniciales, puede ser recomendable añadir puntos de medición adicionales o realizar las mediciones en otras fases del desarrollo.

32. Es recomendable utilizar la edad post-coital en lugar de la edad postnatal al evaluar el desarrollo físico (33). Si se someten a ensayo las crías el día del destete, se recomienda hacerlo antes del destete en sí, para evitar un efecto de confusión debido al estrés asociado con el destete. Además, debe evitarse realizar cualquier ensayo con las crías durante los dos días siguientes al destete.

Cuadro 1

Calendario de la evaluación de los parámetros físicos y del desarrollo, y de los parámetros funcionales/de comportamiento (2) .

Períodos de edad Parámetros Antes del destete (3) Antes de la madurez (3) Adultos jóvenes (3) Parámetros físicos y del desarrollo Peso corporal y observaciones clínicas Semanalmente (4) Al menos cada dos semanas Al menos cada dos semanas Peso del encéfalo DPN 22 (5) En el momento del sacrifico Neuropatología DPN 22 (5) En el momento del sacrifico Maduración sexual — Cuando corresponda — Otros parámetros del desarrollo (6) Cuando corresponda — — Parámetros funcionales y de comportamiento Ontogenia del comportamiento Al menos dos mediciones Actividad motriz (incluida la habituación) 1–3 veces (7) — Una vez Funciones motrices y sensitivas — Una vez Una vez Aprendizaje y memoria — Una vez Una vez

33. Debe procederse al recuento de las crías vivas y a su asignación de sexo, por ejemplo por inspección visual o medición de la distancia anogenital (34)(35), y debe pesarse individualmente cada cría de una camada, al nacer o poco después, al menos una vez por semana a lo largo del período de lactancia, y posteriormente al menos una vez cada dos semanas. Al evaluar la madurez sexual, debe determinarse, al menos en un macho y una hembra por camada, la edad y el peso corporal del animal cuando se observe la permeabilidad vaginal (36) o la separación del prepucio (37).

Ontogenia del comportamiento

34. La ontogenia de determinados comportamientos debe medirse al menos en una cría/sexo/camada durante el período de edad apropiado, utilizándose las mismas crías en todos los días de ensayo en relación con todos los comportamientos evaluados. Los días de medición debe estar espaciados uniformemente a lo largo de dicho período para determinar si el cambio en la ontogenia del comportamiento es normal o si está relacionado con el tratamiento (38). A continuación se indican ejemplos de comportamientos cuya ontogenia puede evaluarse: reflejo de enderezamiento, geotaxia negativa y actividad motriz (38)(39)(40).

Actividad motriz

35. La actividad motriz debe supervisarse (41)(42)(43)(44)(45) durante el período de edad anterior al destete y en la edad adulta. Sobre los ensayos en el momento del destete, véase el punto 32. La sesión de ensayo debe ser lo suficientemente larga para demostrar la habituación dentro de la sesión de los controles no tratados. Se recomienda encarecidamente utilizar la actividad motriz para evaluar la ontogenia del comportamiento. Si se utiliza como ensayo de la ontogenia del comportamiento, deben utilizarse los mismos animales en todas las sesiones de ensayo previas al destete. Las observaciones deben hacerse con la frecuencia suficiente para evaluar la ontogenia de la habituación dentro de cada sesión (44). De esta manera, puede ser necesario recurrir a tres o más momentos de observación hasta el día del destete, este incluido (por ejemplo, DPN 13, 17, 21). También deben examinarse los mismos animales, o los compañeros de camada, en la edad adulta, casi al final del estudio (por ejemplo, DPN 60-70). Podrán realizarse ensayos en días adicionales en caso necesario. La actividad motriz debe supervisarse con un aparato de registro automático de la actividad, que debe ser capaz de detectar tanto los aumentos como los descensos de esta (es decir, la actividad de referencia medida por el dispositivo no debe ser tan baja que no se puedan detectar los eventuales descensos, ni tan elevada que no se puedan detectar los eventuales aumentos de la actividad). Cada dispositivo debe comprobarse mediante procedimientos estándar para garantizar, en la medida de lo posible, la fiabilidad del funcionamiento con diferentes dispositivos y en diferentes días. En la medida de lo posible, los grupos tratados deben repartirse de forma equilibrada entre los distintos dispositivos. Cada animal debe ser objeto de ensayo por separado. Los grupos tratados deben equilibrarse en cuanto a los momentos del ensayo a fin de evitar confusiones debidas a los ritmos circadianos de actividad. Debe procurarse que las variaciones en las condiciones de ensayo sean mínimas y no estén relacionadas sistemáticamente con el tratamiento. Entre las variables que pueden afectar a muchas mediciones del comportamiento, incluida la actividad motriz, están el nivel sonoro, el tamaño y la forma de las jaulas de ensayo, la temperatura, la humedad relativa, las condiciones de iluminación, los olores, el uso de las jaulas de alojamiento o de jaulas de ensayo distintas y las distracciones del entorno.

Funciones motrices y sensitivas

36. Las funciones motrices y sensitivas deben estudiarse detalladamente al menos una vez en el período previo a la madurez y una vez a lo largo del período de adultos jóvenes (por ejemplo, DPN 60-70). Sobre los ensayos en el momento del destete, véase el punto 32. Debe realizarse un número suficiente de ensayos a fin de garantizar un muestreo cuantitativo adecuado de modalidades sensitivas (por ejemplo, somatosensitiva, vestibular) y de funciones motrices (por ejemplo, fuerza, coordinación). Pueden citarse como ejemplos de ensayos de las funciones motrices y sensitivas los siguientes: reflejo de empuje extensor (46), reflejo de enderezamiento (47)(48), habituación al sobresalto acústico (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54), y potenciales provocados (55).

Ensayos de aprendizaje y memoria

37. Debe realizarse un ensayo de aprendizaje asociativo y memoria tras el destete (por ejemplo, 25 ± 2 días) y en el período de adultos jóvenes (DPN 60 y después). Sobre los ensayos en el momento del destete, véase el punto 32. En estas dos fases de desarrollo, pueden utilizarse los mismos ensayos u otros distintos. Se permite cierta flexibilidad en la elección de los ensayos de aprendizaje y memoria con ratas destetadas y adultas. Sin embargo, los ensayos deben concebirse de forma que cumplan dos criterios. En primer lugar, el aprendizaje debe evaluarse bien como un cambio en varias pruebas o sesiones de aprendizaje repetidas, o bien, en caso de ensayos que supongan una única prueba, con referencia a una condición de control de los efectos no asociativos de la experiencia de formación. En segundo lugar, los ensayos deben incluir alguna medida de la memoria (a corto o a largo plazo) además del aprendizaje original (adquisición), pero esta medida de la memoria no puede notificarse si se carece de una medida de la adquisición obtenida en el mismo ensayo. Si los ensayos de aprendizaje y memoria ponen de manifiesto la existencia de un efecto de la sustancia problema, puede considerarse la realización de ensayos adicionales para descartar las interpretaciones alternativas basadas en alteraciones de las capacidades sensitivas, motivacionales o motrices. Además de los dos criterios anteriores, se recomienda que el ensayo de aprendizaje y memoria se elija sobre la base de su sensibilidad probada para la clase de la sustancia problema, si se dispone de dicha información en la bibliografía. A falta de tal información, los siguientes son ejemplos de ensayos que podrían hacerse para cumplir los criterios citados: evitación pasiva (43)(56)(57), ajuste retrasado para la posición de las ratas adultas (58) y de las ratas lactantes (59), condicionamiento olfativo (43)(60), laberinto de agua de Morris (61)(62)(63), laberinto de Biel o Cincinnati (64)(65), laberinto de brazos radiales (66), laberinto en T (43), y adquisición y retención de comportamientos programados (26)(67)(68). En la bibliografía se encuentran descripciones de ensayos adicionales para ratas destetadas (26)(27) y ratas adultas (19)(20).

Autopsia

38. Los animales madre pueden sacrificarse después del destete de su descendencia.

39. La evaluación neuropatológica de la descendencia se efectuará utilizando los tejidos de los animales sacrificados de forma compasiva el DPN 22 o en un momento anterior, entre el DPN 11 y el DPN 22, así como al final del estudio. En el caso de los descendientes sacrificados hasta el DPN 22, deben evaluarse los tejidos del encéfalo; en el caso de los animales sacrificados al final del estudio, deben evaluarse los tejidos tanto del sistema nervioso central (SNC) como del sistema nervioso periférico (SNP). Los tejidos de los animales sacrificados el DPN 22 o antes pueden fijarse por inmersión o por perfusión; los de los animales sacrificados al final del estudio deben fijarse por perfusión. Todos los aspectos de la preparación de las muestras de tejido, desde la perfusión de los animales hasta la disección de las muestras de tejido, el tratamiento de los tejidos y la tinción de las preparaciones microscópicas, deben seguir un diseño equilibrado de forma que cada lote contenga muestras representativas de cada grupo de dosis. En el documento de orientación no 20 de la OCDE (9) se encuentran orientaciones adicionales; véase también (103).

Tratamiento de las muestras de tejido

40. Deben registrarse todas las anomalías macroscópicas visibles en el momento de la autopsia. Las muestras de tejidos tomadas deben representar todas las regiones principales del sistema nervioso. Las muestras de tejidos deben conservarse en un fijador adecuado y tratarse de acuerdo con protocolos histológicos publicados y normalizados (69)(70)(71)(103). La inclusión en parafina es aceptable para los tejidos del SNC y del SNP, pero puede ser apropiada la utilización de osmio tras la fijación, junto con la inclusión en epoxirresina, cuando se necesite un mayor grado de resolución (por ejemplo, para los nervios periféricos cuando se sospeche una neuropatía periférica, o para el análisis morfométrico de los nervios periféricos). Los tejidos del encéfalo recogidos para el análisis morfométrico deben incluirse en los medios apropiados al mismo tiempo para todos los niveles de dosis, a fin de evitar artefactos por retracción que pueden asociarse con una conservación prolongada en el fijador (6).

Examen neuropatológico

41. Los objetivos del examen cualitativo son los siguientes:

i) detectar las regiones del sistema nervioso que presentan indicios de alteraciones neuropatológicas;

ii) identificar los tipos de alteraciones neuropatológicas resultantes de la exposición a la sustancia problema; así como

iii) determinar el grado de gravedad de las alteraciones neuropatológicas.

Un anatomopatólogo con formación adecuada debe examinar al microscopio secciones histológicas representativas de las muestras de tejido para detectar los eventuales indicios de alteraciones neuropatológicas. A todas las alteraciones neuropatológicas se les debe asignar un grado subjetivo de gravedad. Una tinción con hematoxilina y eosina puede ser suficiente para evaluar las secciones del encéfalo de los animales sacrificados de forma compasiva el DPN 22 o antes. Sin embargo, se recomienda realizar una tinción de mielina (por ejemplo, azul de luxol rápido/violeta de cresilo) y una tinción de plata (por ejemplo, tinciones de Bielschowsky o de Bodian) para las secciones de tejidos del SNC y del SNP de los animales sacrificados al final del estudio. Según la opinión profesional del anatomopatólogo y el tipo de alteraciones observadas, pueden resultar adecuadas otras tinciones para identificar y caracterizar tipos concretos de alteraciones [por ejemplo, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) o histoquímica de lectinas para evaluar las alteraciones de la glía y de la microglía (72), fluoro-jade para detectar necrosis (73)(74), o tinciones de plata específicas de la degeneración neuronal (75)].

42. Ha de efectuarse una evaluación morfométrica (cuantitativa), ya que estos datos pueden ayudar a la detección de un efecto relacionado con el tratamiento y son valiosos para la interpretación de las diferencias de peso o morfología del encéfalo relacionadas con el tratamiento (76)(77). Deben tomarse muestras de tejido nervioso, que han de prepararse para permitir las evaluaciones morfométricas. Entre estas se pueden incluir, por ejemplo, las mediciones lineales o superficiales de regiones específicas del encéfalo (78). Tales mediciones exigen la utilización de secciones homólogas, cuidadosamente seleccionadas en función de referencias microscópicas fiables (6). Puede utilizarse la estereología para identificar efectos relacionados con el tratamiento sobre parámetros tales como el volumen o el número de células de determinadas regiones neuroanatómicas (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. Debe examinarse el encéfalo para detectar los eventuales indicios de alteraciones neuropatológicas relacionadas con el tratamiento y deben tomarse muestras adecuadas de todas sus regiones principales (por ejemplo, bulbos olfativos, corteza cerebral, hipocampo, ganglios basales, tálamo, hipotálamo, mesencéfalo (techo, tegmento y pedúnculos cerebrales), protuberancia, bulbo raquídeo, cerebelo) para garantizar un examen exhaustivo. Es importante que se tomen las secciones de todos los animales en el mismo plano. En el caso de los adultos sacrificados de forma compasiva al final del estudio, deben tomarse muestras de las secciones representativas de la médula espinal y del SNP. Las zonas examinadas deben incluir el ojo con el nervio óptico y la retina, la médula espinal en los engrosamientos cervical y lumbar, las fibras de las raíces anteriores y posteriores, el nervio ciático mayor proximal, el nervio ciático poplíteo interno proximal (en la rodilla) y las ramas del nervio ciático poplíteo interno que inervan los músculos de la pantorrilla. Las secciones de la médula espinal y de los nervios periféricos tienen que incluir tanto una sección transversal como una longitudinal.

44. La evaluación neuropatológica debe incluir un examen para detectar eventuales signos de alteraciones del desarrollo del sistema nervioso (6)(85)(86)(87)(88)(89), además de alteraciones celulares (por ejemplo, vacuolización, degeneración o necrosis neuronal) y cambios histológicos (por ejemplo, gliosis, infiltración de leucocitos, formación de quistes). A este respecto, es importante que se distingan los efectos relacionados con el tratamiento de los acontecimientos normales del desarrollo que se sepa que se producen en una fase del desarrollo correspondiente al momento del sacrificio (90). Pueden citarse como ejemplos de alteraciones significativas que indican daño para el desarrollo las siguientes, sin ánimo de exhaustividad:

— alteraciones en el tamaño o la forma macroscópicos de los bulbos olfativos, el cerebro o el cerebelo;

— alteraciones en el tamaño relativo de las diversas regiones del encéfalo, como las disminuciones o aumentos del tamaño de regiones derivados de la pérdida o persistencia de poblaciones de células o proyecciones axónicas de carácter normalmente pasajero (por ejemplo, capa germinal externa del cerebelo, cuerpo calloso);

— alteraciones de la proliferación, migración y diferenciación, indicadas por zonas de necrosis o apoptosis excesivas, poblaciones agrupadas o dispersas de neuronas ectópicas, desorientadas o deformes, o alteraciones del tamaño relativo de diversos estratos de las estructuras corticales;

— alteraciones de las pautas de mielinización, como la reducción global del tamaño o la alteración de la tinción de las estructuras mielinizadas;

— signos de hidrocefalia, en particular la dilatación de los ventrículos, la estenosis del acueducto de Silvio y el adelgazamiento de los hemisferios cerebrales.

Análisis de la relación dosis-respuesta de las alteraciones neuropatológicas

45. Se recomienda seguir el siguiente procedimiento por fases para los análisis neuropatológicos cualitativos y cuantitativos. En primer lugar, se comparan las secciones del grupo de dosis alta con las del grupo de control. En caso de que no se detecten alteraciones neuropatológicas en los animales del grupo de dosis alta, no se requiere continuar el análisis. Si se encuentran indicios de alteraciones neuropatológicas en el grupo de dosis alta, se examinan los animales de los grupos de dosis intermedia y baja. Si el grupo de dosis alta se termina por causa de muerte o de otro tipo de toxicidad que implique confusión, deben analizarse los grupos de dosis alta e intermedia para detectar las eventuales alteraciones neuropatológicas. Si hay alguna indicación de neurotoxicidad en los grupos de la dosis inferior, debe realizarse con esos grupos el análisis neuropatológico. En caso de que en el examen cualitativo o cuantitativo se observen alteraciones neuropatológicas relacionadas con el tratamiento, deben determinarse la relación entre la dosis y la incidencia, y la frecuencia y el grado de gravedad de las lesiones o de las alteraciones morfométricas, sobre la base de una evaluación de todos los animales de todos los grupos de dosis. Deben incluirse en esta evaluación todas las regiones del encéfalo que presenten algún signo de alteración neuropatológica. Para cada tipo de lesión, deben describirse los criterios utilizados para definir los distintos grados de gravedad, indicando las características utilizadas para distinguir cada grado. Deben registrarse la frecuencia de cada tipo de lesión y su grado de gravedad, y debe realizarse un análisis estadístico para evaluar la naturaleza de la relación dosis-respuesta. Se recomienda el uso de preparaciones codificadas (91).

DATOS E INFORME

Datos

46. Los datos deben notificarse individualmente y resumirse en forma de cuadro, mostrándose para cada grupo de ensayo los tipos de cambio y el número de madres, de descendientes por sexo, y de camadas en las que se haya observado cada tipo de cambio. Si se ha utilizado la exposición postnatal directa de la descendencia, han de notificarse la vía, la duración y el período de la exposición.

Evaluación e interpretación de los resultados

47. Un estudio de neurotoxicidad para el desarrollo debe proporcionar información sobre los efectos de la exposición continuada a una sustancia durante la vida intrauterina y en las primeras fases del desarrollo postnatal. Dado que el estudio se centra en parámetros tanto de toxicidad general como de neurotoxicidad para el desarrollo, los resultados deben permitir distinguir los efectos sobre el desarrollo neurológico que se producen en ausencia de toxicidad general para la madre frente a los que se manifiestan únicamente a dosis que también son tóxicas para la madre. Debido a la compleja interrelación entre el diseño del estudio, el análisis estadístico y la significación biológica de los datos, la interpretación adecuada de los datos de neurotoxicidad para el desarrollo implica el juicio de expertos (107)(109). Para la interpretación de los resultados del ensayo debe aplicarse un enfoque de ponderación de las pruebas (20)(92)(93)(94). Deben ser objeto de discusión las pautas de las eventuales observaciones conductuales o morfológicas, así como los datos sobre la relación dosis-respuesta. Deben incluirse en esta caracterización los datos de todos los estudios pertinentes para la evaluación de la neurotoxicidad para el desarrollo, incluidos los estudios epidemiológicos o los informes de casos humanos, y los estudios con animales de experimentación (por ejemplo, datos de toxicocinética, información sobre la relación estructura-actividad, datos de otros estudios de toxicidad). Esto incluye la relación entre las dosis de la sustancia problema y la presencia o ausencia, la incidencia y el alcance de cualesquiera efectos neurotóxicos para cada sexo (20)(95).

48. La evaluación de los datos debe incluir una discusión de la significación tanto biológica como estadística. El análisis estadístico debe considerarse como una herramienta que orienta para la interpretación de los datos, más que determinarla. La falta de significación estadística no debe ser el único motivo para concluir que no hay ningún efecto relacionado con el tratamiento, al igual que la presencia de significación estadística no puede ser la única justificación para concluir que se da algún efecto relacionado con el tratamiento. Para evitar posibles resultados negativos falsos y las dificultades inherentes a “comprobar un resultado negativo”, deben discutirse los datos sobre los controles positivos e históricos disponibles, especialmente cuando no se observen efectos relacionados con el tratamiento (102)(106). La probabilidad de encontrar positivos falsos debe discutirse a la luz de la evaluación estadística total de los datos (96). La evaluación debe incluir la posible relación existente entre las alteraciones neuropatológicas y conductuales observadas.

49. Todos los resultados deben analizarse utilizando modelos estadísticos adecuados para el diseño experimental (108). La elección de un análisis paramétrico o no paramétrico debe justificarse teniendo en cuenta factores tales como la naturaleza de los datos (transformados o no) y su distribución, así como la relativa solidez de los análisis estadísticos seleccionados. El objetivo y el diseño del estudio deben guiar la elección del análisis estadístico para minimizar los errores de tipo I (positivos falsos) y de tipo II (negativos falsos) (96)(97)(104)(105). Los estudios sobre el desarrollo con especies multíparas en los que se estudian varias crías por camada deben incluir la camada en el modelo estadístico para evitar un aumento de los índices de errores de tipo I (98)(99)(100)(101). La unidad estadística de medida debe ser la camada y no la cría. Los experimentos deben diseñarse de manera que las crías de una misma camada no se traten como observaciones independientes. Cualquier parámetro medido varias veces en el mismo sujeto se analizará utilizando modelos estadísticos que tengan en cuenta el carácter no independiente de dichas medidas.

Informe del ensayo

50. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

Sustancia problema:

— naturaleza física y, si procede, propiedades fisicoquímicas;

— datos de identificación, incluido el origen;

— pureza del preparado, e impurezas conocidas o previstas.

Vehículo (si procede):

— justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua o de la solución salina fisiológica.

Animales de experimentación:

— especie y cepa empleada, y justificación en caso de que sea distinta de la rata;

— proveedor de los animales de experimentación;

— número, edad al inicio del ensayo, y sexo de los animales;

— origen, condiciones de alojamiento, dieta, agua, etc.;

— peso de cada animal al inicio del ensayo.

Condiciones del ensayo:

— justificación de la selección de las dosis;

— justificación de la vía y del período de administración;

— especificación de las dosis administradas, con datos sobre el vehículo, el volumen y la forma física del material administrado;

— datos sobre la formulación de la sustancia problema o su preparación con los alimentos, concentración obtenida, estabilidad y homogeneidad del preparado;

— método utilizado para la identificación inequívoca de las madres y de su descendencia;

— descripción detallada del procedimiento o procedimientos de aleatorización utilizados para asignar las madres a los grupos de tratamiento, para seleccionar las crías sobrantes que deben sacrificarse, y para asignar las crías a los grupos de ensayo;

— datos sobre la administración de la sustancia problema;

— conversión de la concentración (ppm) de la sustancia problema en los alimentos, en el agua de bebida o en el dispositivo de inhalación a dosis reales (mg/kg peso corporal/día), en su caso;

— condiciones ambientales;

— datos de la calidad de los alimentos y del agua (por ejemplo, si es agua del grifo o destilada);

— fechas de inicio y terminación del estudio.

Procedimientos de observación y ensayo:

— descripción detallada de los procedimientos utilizados para normalizar las observaciones y procedimientos, así como definiciones operativas para asignar puntuación a las observaciones;

— lista de todos los procedimientos de ensayo utilizados y justificación de su empleo;

— datos de los procedimientos utilizados para los estudios conductuales/funcionales, anatomopatológicos, neuroquímicos o electrofisiológicos, con información y detalles sobre los dispositivos automáticos;

— procedimientos para calibrar y garantizar la equivalencia de los dispositivos y el equilibrio de los grupos de tratamiento en los procedimientos de ensayo;

— breve justificación de todas las decisiones que impliquen una opinión profesional.

Resultados (por separado y en resumen, incluidas la media y la varianza cuando proceda):

— número de animales al comienzo del estudio y número al final del mismo;

— número de animales y de camadas utilizadas para cada ensayo;

— número de identificación de cada animal y camada de la que procede;

— tamaño de las camadas y peso medio al nacer por sexo;

— datos del peso corporal y de los cambios de este, incluido el peso corporal final de las madres y de su descendencia;

— datos sobre consumo de alimentos, y de agua si procede (por ejemplo, si la sustancia problema se administra con el agua);

— datos de reacciones tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos de toxicidad o mortalidad, con el momento y la causa de la muerte, si procede;

— naturaleza, gravedad, duración, día de inicio, hora del día, y evolución posterior de las observaciones clínicas detalladas;

— puntuación de cada parámetro del desarrollo (peso, maduración sexual y ontogenia del comportamiento) en cada momento de observación;

— descripción detallada de todas las observaciones conductuales, funcionales, neuropatológicas, neuroquímicas y electrofisiológicas por sexo, incluidos tanto los aumentos como los descensos respecto a los controles;

— observaciones de la autopsia;

— peso del encéfalo;

— eventuales diagnósticos derivados de lesiones y signos neurológicos, incluidas las enfermedades o procesos naturales;

— imágenes de observaciones modelo;

— imágenes de baja resolución para evaluar la homología de las secciones empleadas en relación con la morfometría;

— datos sobre la absorción y el metabolismo, incluidos los datos complementarios de un estudio toxicocinético aparte, si se dispone de ellos;

— tratamiento estadístico de los resultados, incluidos los modelos estadísticos utilizados para analizar los datos, y los resultados, con independencia de que sean significativos o no;

— lista del personal del estudio, incluida su formación profesional.

Discusión de los resultados:

— información sobre la relación dosis-respuesta, por sexo y grupo;

— relación de otros eventuales efectos tóxicos con la conclusión acerca del potencial neurotóxico de la sustancia problema, por sexo y grupo;

— impacto de cualquier información toxicocinética sobre las conclusiones;

— semejanzas con los efectos de cualquier neurotóxico conocido;

— datos en apoyo de la fiabilidad y sensibilidad del método de ensayo (es decir, datos sobre controles positivos e históricos);

— eventual relación entre efectos neuropatológicos y funcionales;

— NOAEL o dosis de referencia para las madres y los descendientes, por sexo y grupo.

Conclusiones:

— discusión de la interpretación global de los datos sobre la base de los resultados, incluida la conclusión de si la sustancia problema ha provocado neurotoxicidad para el desarrollo y el NOAEL.

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(14) Capítulo B.34 del presente anexo, Ensayo de reproducción en una generación.

(15) Capítulo B.35 del presente anexo, Estudio de toxicidad para la reproducción en dos generaciones.

(16) Capítulo B.43 del presente anexo, Estudio de neurotoxicidad en roedores.

(17) Capítulo B.31 del presente anexo, Estudio de toxicidad para el desarrollo prenatal.

(18) Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos, DO L 276 de 20.10.2010, p. 33.

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Figura 1

Esquema general de los ensayos funcionales/conductuales, de evaluación neuropatológica y de pesaje del encéfalo. Este diagrama se basa en la descripción recogida en los puntos 13-15 (DPN = día postnatal). En el apéndice 1 se recogen ejemplos de asignación de los animales

Apéndice 1 1. A continuación se describen ejemplos de posibles asignaciones y se recogen en cuadros. Estos ejemplos se adjuntan para ilustrar que la asignación de los animales de experimentación a los distintos paradigmas de ensayo puede llevarse a cabo de varias maneras. Ejemplo 1 2. Para los ensayos de ontogenia del comportamiento anteriores al destete se utiliza un conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De estos animales, 10 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se sacrifican de forma compasiva el día DPN 22. Se retira el encéfalo, se pesa y se prepara para su evaluación histopatológica. Por otra parte, se recogen los datos del peso de los encéfalos sin fijar de los 10 machos y 10 hembras restantes por dosis. 3. Para los ensayos funcionales/conductuales posteriores al destete (observaciones clínicas detalladas, actividad motriz, sobresalto acústico y ensayo de la función cognitiva en el período previo a la madurez) y para evaluar la edad de la maduración sexual, se utiliza otro conjunto de 20 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, 10 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se anestesian y se fijan por perfusión al finalizar el estudio (alrededor del día DPN 70). Previa fijación adicional in situ, se retira el encéfalo y se prepara para su evaluación neuropatológica. 4. Para el ensayo de la función cognitiva en adultos jóvenes (por ejemplo, DPN 60-70), se utiliza un tercer conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, se sacrifican al final del estudio 10 animales/sexo/grupo (1 macho o 1 hembra por camada), y se retira y pesa su encéfalo. 5. Los restantes 20 animales/sexo/grupo se reservan para eventuales ensayos adicionales. Cuadro 1 Cría no (8) No de crías asignado al ensayo Examen/ensayo m h 1 5 20 m + 20 h Ontogenia del comportamiento 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatología/morfometría DPN 22 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo DPN 22 2 6 20 m + 20 h Observaciones clínicas detalladas 20 m + 20 h Actividad motriz 20 m + 20 h Maduración sexual 20 m + 20 h Funciones motrices y sensitivas 20 m + 20 h Aprendizaje y memoria (DPN 25) 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatología/morfometría de adultos jóvenes ~DPN 70 3 7 20 m + 20 h Aprendizaje y memoria (adultos jóvenes) 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo de adultos jóvenes ~DPN 70 4 8 — Animales de reserva para sustituciones o ensayos adicionales Ejemplo 2 6. Para los ensayos de ontogenia del comportamiento anteriores al destete se utiliza un conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De estos animales, 10 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se sacrifican de forma compasiva el día DPN 11. Se retira el encéfalo, se pesa y se prepara para su evaluación histopatológica. 7. Para los ensayos posteriores al destete (observaciones clínicas detalladas, actividad motriz, evaluación de la edad de la maduración sexual y funciones motrices y sensitivas) se utiliza otro conjunto de 20 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, 10 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se anestesian y se fijan por perfusión al finalizar el estudio (alrededor del día DPN 70). Previa fijación adicional in situ, se retira el encéfalo, se pesa y se prepara para su evaluación neuropatológica. 8. Para el ensayo de la función cognitiva en el período previo a la madurez y en adultos jóvenes, se utilizan 10 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada). Se utilizan animales distintos para los ensayos de la función cognitiva realizados el día DPN 23 y para los realizados con adultos jóvenes. Al finalizar el estudio, se sacrifican 10 animales/sexo/grupo de entre los utilizados para el ensayo con adultos, se retira el encéfalo y se pesa. 9. Los 20 animales/sexo/grupo restantes que no se han seleccionado para los ensayos se eliminan al destete. Cuadro 2 Cría no (9) No de crías asignado al ensayo Examen/ensayo m h 1 5 20 m + 20 h Ontogenia del comportamiento 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatología/morfometría DPN 11 2 6 20 m + 20 h Observaciones clínicas detalladas 20 m + 20 h Actividad motriz 20 m + 20 h Maduración sexual 20 m + 20 h Funciones motrices y sensitivas 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatología/morfometría de adultos jóvenes ~DPN 70 3 7 10 m + 10 h (10) Aprendizaje y memoria (DPN 23) 3 7 10 m + 10 h (10) Aprendizaje y memoria (adultos jóvenes) Pesaje del encéfalo de adultos jóvenes 4 8 — Animales sacrificados y desechados el día DPN 21 Ejemplo 3 10. Para el pesaje del encéfalo y la evaluación de la neuropatología del día DPN 11 se utiliza un conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De estos animales, 10 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se sacrifican de forma compasiva el día DPN 11, y se les retira el encéfalo, que se pesa y se prepara para su evaluación histopatológica. Por otra parte, se recogen los datos del peso de los encéfalos sin fijarde los 10 machos y 10 hembras restantes por cada dosis. 11. Para los ensayos de ontogenia del comportamiento (actividad motriz), los exámenes posteriores al destete (actividad motriz y evaluación de la edad de la maduración sexual), y el ensayo de la función cognitiva en el período previo a la madurez, se utiliza otro conjunto de 20 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). 12. Para los ensayos de las funciones motrices y sensitivas (sobresalto acústico) y las observaciones clínicas detalladas, se utiliza otro conjunto de 20 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, 10 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se anestesian y se fijan por perfusión al finalizar el estudio (alrededor del día DPN 70). Previa fijación adicional in situ, se retira el encéfalo, se pesa y se prepara para su evaluación neuropatológica. 13. Para el ensayo de la función cognitiva en adultos jóvenes, se utiliza otro conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, se sacrifican al final del estudio 10 animales/sexo/grupo (1 macho o 1 hembra por camada), y se retira y pesa su encéfalo. Cuadro 3 Cría no (11) No de crías asignado al ensayo Examen/ensayo m h 1 5 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatología/morfometría DPN 11 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo DPN 11 2 6 20 m + 20 h Ontogenia del comportamiento (actividad motriz) 20 m + 20 h Actividad motriz 20 m + 20 h Maduración sexual 20 m + 20 h Aprendizaje y memoria (DPN 27) 3 7 20 m + 20 h Sobresalto acústico (período previo a la madurez y adultos jóvenes) 20 m + 20 h Observaciones clínicas detalladas 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatología/morfometría de adultos jóvenes ~DPN 70 4 8 20 m + 20 h Aprendizaje y memoria (adultos jóvenes) 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo de adultos jóvenes

Apéndice 2 Definiciones Sustancia: Sustancia o mezcla Sustancia problema: Toda sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.

B.54. BIOENSAYO UTEROTRÓFICO CON ROEDORES: ENSAYO DE CRIBADO A CORTO PLAZO DE LAS PROPIEDADES ESTROGÉNICAS

INTRODUCCIÓN

1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 440 (2007). La OCDE lanzó en 1998 una actividad muy prioritaria para revisar las directrices existentes y elaborar nuevas directrices sobre los ensayos de cribado y finales de posibles alteradores endocrinos (1). Uno de los elementos de la actividad consistía en elaborar unas directrices para el bioensayo uterotrófico con roedores. El bioensayo uterotrófico con roedores se sometió entonces a un completo programa de validación, con la recopilación de un detallado documento de referencia (2)(3) y la realización de unos amplios estudios intra e interlaboratorios para demostrar la pertinencia y la reproducibilidad del bioensayo con un potente estrógeno de referencia, con agonistas débiles de los receptores estrogénicos, con un antagonista fuerte de los receptores estrogénicos, y con una sustancia de referencia negativa (4)(5)(6)(7)(8)(9). El presente método B.54 se basa en la experiencia obtenida con el programa de validación del ensayo y en los resultados conseguidos de esta manera con agonistas estrogénicos.

2. El bioensayo uterotrófico es un ensayo de cribado a corto plazo cuyo origen data de la década de 1930 (27)(28) y fue normalizado por primera vez con este carácter por un comité de expertos en 1962 (32)(35). Se basa en el aumento del peso del útero o respuesta uterotrófica (véase una revisión en la referencia 29). Evalúa la posibilidad de que una sustancia provoque actividades biológicas que concuerden con las de agonistas o antagonistas de los estrógenos naturales (por ejemplo, el 17ß-estradiol); sin embargo, su uso para detectar efectos antagonistas es mucho menos frecuente que para detectar efectos agonistas. El útero responde a los estrógenos de dos maneras. Una primera respuesta es el aumento de peso debido a la imbibición de agua. Esta respuesta va seguida de un aumento de peso debido al crecimiento tisular (30). Las respuestas del útero en ratas y ratonas son comparables cualitativamente.

3. Este bioensayo sirve de ensayo de cribado in vivo y su aplicación debe considerarse en el contexto del “OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (Marco conceptual de la OCDE para el ensayo y evaluación de los alteradores endocrinos) (apéndice 2). En este marco conceptual el bioensayo uterotrófico figura en el nivel 3 como ensayo in vivo que proporciona datos sobre un solo mecanismo endocrino, a saber, la estrogenicidad.

4. Se pretende incluir el bioensayo uterotrófico en una batería de ensayos in vitro e in vivo para identificar las sustancias con potencial para interactuar con el sistema endocrino, lo que desembocará finalmente en evaluaciones del riesgo para la salud humana o el medio ambiente. El programa de validación de la OCDE ha utilizado agonistas estrogénicos tanto fuertes como débiles, a fin de evaluar el comportamiento del ensayo en cuanto a la detección de sustancias estrogénicas (4)(5)(6)(7)(8). De este modo, se ha demostrado bien la sensibilidad del procedimiento de ensayo para los agonistas estrogénicos, además de una buena reproducibilidad intra e interlaboratorios.

5. Por lo que se refiere a sustancias negativas, se incluyó en el programa de validación una única sustancia “negativa” de referencia que ya se había considerado negativa en el ensayo uterotrófico, así como en ensayos in vitro de receptores y de unión a receptores, pero se han evaluado datos adicionales del ensayo, no relacionados con el programa de validación de la OCDE, que refuerzan el apoyo a la especificidad del bioensayo uterotrófico para el cribado de agonistas estrogénicos (16).

CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

6. Los agonistas y antagonistas estrogénicos actúan como ligandos de los receptores estrogénicos α y b, y pueden activar o inhibir, respectivamente, la acción transcripcional de los receptores. Esto podría provocar peligros para la salud, incluidos ciertos efectos sobre la reproducción y el desarrollo. Por lo tanto, es necesario evaluar con rapidez las sustancias como posibles agonistas o antagonistas estrogénicos. Aunque de carácter informativo, la afinidad de un ligando por un receptor estrogénico o la activación transcripcional de genes marcadores in vitro son solo uno de los varios factores determinantes de un posible peligro. Otros factores determinantes pueden ser la activación y la desactivación metabólica de la sustancia al entrar en el organismo, su distribución en los tejidos diana, y la eliminación del organismo, que dependen, al menos en parte, de la vía de administración y de la sustancia estudiada. Esto conduce a la necesidad de detectar la posible actividad de una sustancia in vivo en condiciones pertinentes, salvo que las características de la sustancia en relación con su absorción, distribución, metabolismo y eliminación (ADME) ya aporten la información adecuada. Los tejidos uterinos responden con un crecimiento rápido y vigoroso al estímulo de los estrógenos, especialmente en el caso de los roedores de laboratorio, en los que el ciclo estral dura unos 4 días. Diversas especies de roedores, en particular la rata, se utilizan también ampliamente en estudios de toxicidad para la caracterización de los peligros. Por lo tanto, el útero de los roedores es un órgano diana adecuado para el ensayo de cribado in vivo de los agonistas y antagonistas estrogénicos.

7. El presente método de ensayo se basa en los protocolos empleados en el estudio de validación de la OCDE que han demostrado ser fiables y repetibles en estudios intra e interlaboratorios (5)(7). Actualmente se dispone de dos métodos, a saber, el de hembras adultas ovariectomizadas (método de las adultas ovx) y el de hembras inmaduras no ovariectomizadas (método de las inmaduras). En el programa de validación de ensayos de la OCDE se ha demostrado que estos métodos presentan una sensibilidad y una reproducibilidad comparables. Sin embargo, el método de las hembras inmaduras, por tener estas intacto el eje hipotálamo-hipófisis-gónadas (HPG), es en cierto modo menos específico, pero abarca un ámbito de investigación más amplio que el método de las hembras ovariectomizadas, ya que puede responder a las sustancias que interactúan con el eje HPG y no tan solo con el receptor estrogénico. El eje HPG de la rata es funcional a los 15 días de edad, aproximadamente. Antes de ese momento, no es posible acelerar la pubertad con tratamientos tales como la administración de la hormona liberadora de gonadotropina (Gn-RH). Cuando las hembras comienzan a alcanzar la pubertad, antes de la apertura vaginal, la hembra tiene varios ciclos silenciosos que no dan lugar a la apertura de la vagina ni a la ovulación, pero sí a algunas fluctuaciones hormonales. Si una sustancia estimula entonces directa o indirectamente el eje HPG, puede provocar una pubertad precoz, una ovulación precoz y una apertura vaginal acelerada. No solo las sustancias que actúan sobre el eje HPG tienen este efecto, sino que algunas dietas con niveles de energía metabolizable más altos que otras pueden estimular el crecimiento y acelerar la apertura de la vagina sin ser de efecto estrogénico. Tales sustancias no inducen una respuesta uterotrófica en animales adultos ovx ya que el eje HPG de estos no funciona.

8. Por razones de bienestar de los animales debe darse preferencia al método que utiliza ratas inmaduras, evitando así el pretratamiento quirúrgico de los animales y también el riesgo de no poder utilizar los animales que muestren algún signo de inicio del ciclo estral (véase el punto 30).

9. La respuesta uterotrófica no es totalmente de origen estrogénico, es decir, es posible que la produzcan otras sustancias, distintas de los agonistas o antagonistas estrogénicos. Por ejemplo, pueden dar lugar a esta respuesta dosis relativamente altas de progesterona, de testosterona, o de diversas progestinas sintéticas (30). Las eventuales respuestas pueden analizarse histológicamente para detectar la posible queratinización de la vagina (30). Independientemente del posible origen de la respuesta, un resultado positivo en un bioensayo uterotrófico debería lanzar en principio el procedimiento para aclarar la situación. Pueden obtenerse pruebas adicionales de estrogenicidad mediante ensayos in vitro, tales como el ensayo de unión a receptores estrogénicos y el ensayo de activación transcripcional, o mediante otros ensayos in vivo tales como el ensayo sobre la pubertad con hembras.

10. Teniendo en cuenta que el bioensayo uterotrófico sirve de ensayo de cribado in vivo, el enfoque de validación adoptado ha tenido en cuenta tanto el bienestar de los animales como la configuración de una estrategia de ensayos secuencial. Con este fin, el esfuerzo se ha dirigido a la validación rigurosa de la reproducibilidad y de la sensibilidad en cuanto a la estrogenicidad, que es la principal preocupación relativa a muchas sustancias, pero se ha insistido poco en cuanto al componente antiestrogénico del ensayo. Solo se ha sometido a ensayo un antiestrógeno con actividad fuerte, ya que es muy limitado el número de sustancias con un perfil antiestrogénico claro (sin interferencias por alguna actividad estrogénica). Por lo tanto, el presente método de ensayo está dedicado al protocolo estrogénico, mientras que el protocolo que describe el modo del ensayo de antagonistas se incluye en un documento de orientación (37). La reproducibilidad y la sensibilidad del ensayo para sustancias con actividad puramente antiestrogénica se definirán después de manera más clara, un vez que se haya utilizado sistemáticamente el procedimiento de ensayo durante algún tiempo y se hayan detectado más sustancias con esta modalidad de acción.

11. Se acepta que todos los procedimientos en los que se utilicen animales se atendrán a las normas locales de tratamiento de animales; las descripciones de tratamiento y atención de animales recogidas más adelante constituyen los requisitos mínimos de comportamiento, y quedarán anuladas por las normas locales, tales como la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (38). La OCDE proporciona más orientaciones sobre el tratamiento compasivo de los animales (25).

12. Como con todos los ensayos en que se utilicen animales vivos, es esencial asegurarse de que los datos son realmente necesarios antes del inicio del ensayo. Por ejemplo, dos situaciones en que puede cumplirse esta condición son las siguientes:

— una elevada exposición potencial (nivel 1 del marco conceptual, apéndice 2) o indicios de estrogenicidad (nivel 2), a fin de analizar si estos efectos pueden producirse in vivo;

— efectos indicadores de estrogenicidad en ensayos in vivo de nivel 4 o 5, para justificar que los efectos se referían a un mecanismo estrogénico que no puede dilucidarse utilizando un ensayo in vitro.

13. Las definiciones utilizadas en el presente método de ensayo se recogen en el apéndice 1.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

14. El bioensayo uterotrófico basa su sensibilidad en un sistema de ensayo con animales en los que el eje hipotálamo-hipófisis-ovarios no está funcional, lo que provoca que los niveles endógenos de estrógenos circulantes sean bajos. De esta manera se garantiza que el peso uterino de referencia sea bajo y que se obtenga una banda máxima de respuesta a los estrógenos administrados. En las hembras de los roedores se dan dos situaciones de sensibilidad a los estrógenos que cumplen este requisito:

i) hembras inmaduras tras el destete y antes de la pubertad, y

ii) hembras adultas jóvenes después de la ovariectomía, con tiempo suficiente para que retrocedan los tejidos uterinos.

15. La sustancia problema se administra diariamente por vía oral forzada o inyección subcutánea. Se administran dosis graduadas de la sustancia problema a un mínimo de dos grupos de tratamiento (véase el punto 33 al respecto) de animales de experimentación, utilizando un solo nivel de dosis por grupo, con un período de administración de tres días consecutivos en el método de hembras inmaduras y un período mínimo de administración de tres días consecutivos en el método de las hembras adultas ovx. Tras unas 24 h después de la administración de la última dosis se procede a realizar la autopsia de los animales. Para detectar los agonistas estrogénicos, se evalúa la media del peso del útero de los grupos de animales tratados con la sustancia problema, comparando con el grupo al que se ha administrado solo el vehículo, atendiendo a un posible aumento estadísticamente significativo. Un aumento estadísticamente significativo de la media del peso del útero de un grupo de ensayo indica una respuesta positiva en este bioensayo.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Selección de la especie animal

16. Pueden utilizarse cepas de roedores de uso común en laboratorios. A modo de ejemplo, durante la validación se han utilizado las cepas de ratas Sprague-Dawley y Wistar. No deben utilizarse cepas de cuyos úteros se sepa o se sospeche que son menos sensibles. El laboratorio debe demostrar la sensibilidad de la cepa utilizada, según se describe en los puntos 26 y 27.

17. Las ratas y los ratones son especies utilizadas sistemáticamente en el bioensayo uterotrófico desde la década de 1930. Los estudios de validación de la OCDE solo se han realizado con ratas, ya que se piensa que estas especies son equivalentes y, por lo tanto, debe ser suficiente una sola especie para la validación a escala mundial, con el fin de ahorrar recursos y animales. La rata es la especie elegida en la mayoría de los estudios de toxicidad para la reproducción y el desarrollo. Teniendo en cuenta que existe una gran base de datos históricos sobre los ratones y para ampliar el ámbito de aplicación del método del bioensayo uterotrófico en roedores al uso de ratones como especie de ensayo, se ha realizado un estudio limitado de validación complementaria con ratones (16). Se ha seleccionado un enfoque comparativo con un número limitado de sustancias problema y de laboratorios participantes, y sin muestras codificadas, de acuerdo con la intención original de ahorrar recursos y animales. Este estudio de validación comparativo para el bioensayo uterotrófico en ratonas adultas jóvenes ovariectomizadas muestra que los datos obtenidos en ratas y ratones se corresponden bien, tanto cualitativa como cuantitativamente. Cuando el resultado del bioensayo uterotrófico pueda ser un dato preliminar para un estudio a largo plazo, se permitirá que se utilicen en ambos estudios los animales de la misma cepa y del mismo origen. El enfoque comparativo se limita a las ratonas ovx y el informe no aporta un conjunto sólido de datos para validar el modelo con hembras inmaduras, por lo que no se considera que el modelo con animales inmaduros quede incluido, en el caso de los ratones, en el ámbito de aplicación del presente método de ensayo.

18. Por lo tanto, en algunos casos es posible utilizar ratones en lugar de ratas. Debe darse una justificación si se usa esta especie, basada en estudios toxicológicos o farmacocinéticos o en otros criterios. Es posible que resulte necesario modificar el protocolo en el caso de los ratones. Por ejemplo, el consumo de alimentos de los ratones por unidad de peso corporal es más elevado que el de las ratas y, por lo tanto, el contenido de fitoestrógenos en los alimentos deberá ser menor en el caso de los ratones que en el de las ratas (9)(20)(22).

Condiciones de alojamiento y alimentación

19. Todos los procedimientos deben atenerse a las normas locales de tratamiento de animales de laboratorio. Estas descripciones de tratamiento y atención de animales constituyen los requisitos mínimos, y quedarán anuladas por las normas locales, tales como la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (38). El local de los animales de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (con una oscilación máxima aproximada de ± 3 °C). La humedad relativa debe ser como mínimo del 30 % y de preferencia no exceder del 70 %, salvo durante la limpieza del local. El objetivo debe ser conseguir una humedad relativa del 50-60 %. La iluminación debe ser artificial. La secuencia diaria de iluminación debe ser de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

20. Debe darse una dieta de laboratorio y agua de bebida ad libitum. Los animales adultos jóvenes pueden estar en jaulas individuales o bien en grupos de hasta tres animales. Debido a la corta edad de los animales inmaduros, se recomi