PRIMERA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN

de 13 de noviembre de 1979

sobre fijación de los métodos de análisis comunitarios para el control de determinados tipos de leche conservada parcial o totalmente deshidratada destinados a la alimentación humana

( 79/1067/CEE )

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva 76/118/CEE del Consejo , de 18 de diciembre de 1985 , relativa a la aproximación de las legislaciones de los Estados miembros sobre determinados tipos de leche conservada parcial o totalmente deshidratada destinados a la alimentación humana (1) , en particular , su artículo 11 ,

Considerando que el artículo 11 de la Directiva 76/118/CEE establece que la composición de determinados tipos de leche conservada parcial o totalmente deshidratada debe ser controlada por métodos de análisis comunitarios ;

Considerando que es aconsejable adoptar una primera serie de métodos cuyo estudio ha sido concluido ;

Considerando que las medidas establecidas en la presente Directiva se ajustan al dictamen emitido por el Comité permanente de productos alimenticios ,

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

Los Estados miembros tomarán todas las medidas oportunas para que los análisis necesarios para el control de los criterios que figuran en el Anexo I se lleven a cabo con arreglo a los métodos descritos en el Anexo II .

Artículo 2

En caso de que se indique la existencia de métodos alternativos para efectuar una misma determinación , el análisis de la muestra podrá realizarse mediante cualquiera de dichos métodos . En el acta de la prueba a que se refiere el Anexo II deberá señalarse el método empleado .

Artículo 3

Los Estados miembros aplicarán las disposiciones legales , reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir la presente Directiva en un plazo de dieciocho meses a partir de su notificación , e informará de ello inmediatamente a la Comisión .

Artículo 4

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros .

Hecho en Bruselas , el 13 de noviembre de 1979 .

Por la Comisión

Étienne DAVIGNON

Miembro de la Comisión

(1) DO n º L 24 de 30 . 1 . 1976 , p. 49 .

ANEXO I

ÁMBITO DE APLICACIÓN DE LOS PRIMEROS MÉTODOS DE ANÁLISIS COMUNITARIOS DE APLICACIÓN EN LA DIRECTIVA SOBRE DETERMINADOS TIPOS DE LECHE CONSERVADA PARCIAL O TOTALMENTE DESHIDRATADA

I . Disposiciones generales

II . Determinación de la cantidad de materia seca

- leche evaporada rica en materia grasa [ según el método 1 ( Anexo II ) ] ,

- leche evaporada [ según el método 1 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada evaporada [ según el método 1 ( Anexo II ) ] ,

- leche desnatada evaporada [ según el método 1 ( Anexo II ) ] ,

- leche condensada [ según el método 1 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada condensada [ según el método 1 ( Anexo II ) ] ,

- leche desnatada condensada [ según el método 1 ( Anexo II ) ] ,

III . Determinación del contenido en humedad

- leche en polvo rica en materia grasa [ según el método 2 ( Anexo II ) ] ,

- leche en polvo [ según el método 2 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada en polvo [ según el método 2 ( Anexo II ) ] ,

- leche desnatada en polvo [ según el método 2 ( Anexo II ) ] .

IV . Determinación de la materia grasa

- leche evaporada rica en materia grasa [ según el método 3 ( Anexo II ) ] ,

- leche evaporada [ según el método 3 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada evaporada [ según el método 3 ( Anexo II ) ] ,

- leche evaporada [ según el método 3 ( Anexo II ) ] ,

- leche condensada [ según el método 3 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada condensada [ según el método 3 ( Anexo II ) ] ,

- leche desnatada condensada [ según el método 3 ( Anexo II ) ] ,

- leche en polvo rica en materia grasa [ según el método 4 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada en polvo [ según el método 4 ( Anexo II ) ] ,

- leche desnatada en polvo [ según el método ( Anexo II ) ] .

V . Determinación de la sacarosa

- leche condensada [ según el método 5 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada condensada [ según el método 5 ( Anexo II ) ] ,

- leche desnatada condensada [ según el método 5 ( Anexo II ) ] .

VI . Determinación del ácido láctico y de los lactatos

- leche en polvo rica en materia grasa [ según el método 6 ( Anexo II ) ] ,

- leche en polvo [ según el método 6 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada en polvo [ según el método 6 ( Anexo II ) ] ,

- leche desnatada en polvo [ según el método 6 ( Anexo II ) ] .

VII . Determinación de la actividad de la fosfatasa

- leche en polvo rica en materia grasa [ según el método 7 u 8 ( Anexo II ) ] ,

- leche en polvo [ según el método 7 u 8 ( Anexo II ) ] ,

- leche semidesnatada en polvo [ según el método 7 u 8 ( Anexo II ) ] ,

- leche desnatada en polvo [ según el método 7 u 8 ( Anexo II ) ] .

ANEXO II

MÉTODOS DE ANÁLISIS RELATIVOS A LA COMPOSICIÓN DE DETERMINADOS TIPOS DE LECHE CONSERVADA PARCIAL O TOTALMENTE DESHIDRATADA DESTINADOS AL CONSUMO HUMANO

DISPOSICIONES GENERALES

1 . PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL ANÁLISIS QUÍMICO

1.1 Leche evaporada rica en materia grasa

Leche evaporada

Leche semidesnatada evaporada

Leche desnatada evaporada

Agitar el bote cerrado dándole la vuelta . Abrir el bote y transvasar la leche lentamente a un segundo recipiente que pueda cerrarse herméticamente , mezclándola mediante sucesivos transvases ; asegúrese de que todos los restos de grasa y de leche adheridos al caso y al fondo del bote se han mezclado con la muestra . Cierre el recipiente . Si el contenido no apareciera homogéneo , póngalo a calentar al baño maría a 40 ° C . Agitar vigorosamente cada 15 minutos . Dos horas más tarde , saque el recipiente del baño maría y deje que se enfríe a temperatura ambiente . Levante la tapa y mezcle cuidadosamente el contenido con la ayuda de una cuchara o de una espátula ( si la grasa se ha desemulsionado , no es conveniente proceder al análisis de la muestra ) . Consérvese en lugar fresco .

1.2 Leche condensada

Leche semidesnatada condensada

Leche desnatada condensada

Botes :

Caliente el bote cerrado al baño maría de 30 a 40 ° C durante unos 30 minutos . Abra el bote y mezcle cuidadosamente su contenido con una espátula o con una cuchara , efectuando movimientos ascendentes , descendentes y circulares , con el fin de obtener una íntima mezcla de las capas superiores e inferiores con el conjunto del contenido . Asegúrese de que los restos de leche adheridos al casco y al fondo del bote se han mezclado con la muestra . Siempre que sea posible , transvase el contenido a un segundo recipiente dotado de un sistema de cierre estanco . Cierre el recipiente y consérvelo en lugar fresco .

Tubos :

Corte el fondo y transvase el contenido a un recipiente dotado de un sistema de cierre estanco . Después corte el tubo en el sentido de su longitud , despegue todas las materias adheridas al interior del tubo y mézclelas cuidadosamente con el resto del contenido . Conserve el recipiente en lugar fresco .

1.3 Leche en polvo rica en materia grasa

Leche en polvo

Leche semidesnatada en polvo

Leche desnatada en polvo

Transvase la leche en polvo a un recipiente limpio y seco ( con cierre estanco ) con una capacidad equivalente al doble del volumen del polvo . Cierre inmediatamente el recipiente y mezcle íntimamente la leche en polvo agitándolo y dándole vueltas sucesivamente . Durante la preparación de la muestra se ha de evitar , siempre que sea posible , exponer la leche en polvo al aire atmosférico , para reducir al mínimo la absorción de agua .

2 . REACTIVOS

2.1 Agua

2.1.1 Cuando se utilice el agua para soluciones , disoluciones o lavados , se ha de utilizar agua destilada , agua desmineralizada o agua de una pureza al menos equivalente .

2.1.2 Cuando utilicemos el término « solución » o « disolución » sin otra indicación , nos referiremos a solución en el agua o disolución en el agua .

2.2 Productos químicos

Todos los productos químicos utilizados han de ser de calidad analítica reconocida , salvo especificaciones especiales .

3 . EQUIPO

3.1 Lista de aparatos

Las listas de aparatos sólo contienen los artículos de uso especializado y los artículos de especificación especial .

3.2 Balanza analítica

El término « balanza analítica » hace referencia a una balanza capaz de pesar con una precisión mínima de 0,1 mg .

4 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

4.1 Cálculo del porcentaje

Salvo especificación en contra , el resultado se calculará en porcentaje de la masa de la prueba analizada en el laboratorio .

4.2 Número de cifras significativas

Los resultados no contendrán un número de cifras significativas superior al justificado por la precisión del método de análisis utilizado .

5 . REDACCIÓN DEL ACTA DE LA PRUEBA

En el acta de la prueba se indicará el método de análisis utilizado así como los resultados obtenidos . Además , ha de mencionar todos los detalles del procedimiento , no especificados en el método de análisis o facultativos , así como las condiciones susceptibles de haber influenciado el resultado obtenido .

El acta de la prueba deberá suministrar todas las informaciones necesarias para la identificación completa de la muestra .

MÉTODO 1 : DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN MATERIA SECA

( Cámara calefactora a 99 ° C )

1 . ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite determinar el contenido en materia seca de los siguientes tipos de leche :

- leche evaporada rica en materia grasa ,

- leche evaporada ,

- leche semidesnatada evaporada ,

- leche desnatada evaporada ,

- leche condensada ,

- leche semidesnatada condensada ,

- leche desnatada condensada .

2 . DEFINICIÓN

Materia seca de la leche evaporada o de la leche condensada : materia seca determinada por el método especificado .

3 . PRINCIPIO DEL MÉTODO

Una cantidad conocida de la muestra se diluye con agua , luego se mezcla con arena y se deseca a una temperatura de 99 ± 1 ° C . La masa obtenida tras desecación constituye la masa de materia seca . La materia seca se expresa en porcentaje de la masa de la muestra .

4 . REACTIVOS

Arena de cuarzo o arena de mar ( tamaño de los granos : 0,18 - 05 mm , tratada con ácido clorhídrico , pasada a través de un tamiz de 500 micras y retenida por un tamiz de 180 micras ) . Ha de corresponder al test de control que se indica a continuación :

Calentar unos 25 g de arena durante 2 horas en la cámara calefactora ( punto 5.3 ) , tal como se indica en los puntos 6.1 a 6.3 . Añadir 5 ml. de agua , calentar de nuevo en la cámara calefactora durante 2 horas , enfriar y volver a pesarlos . La diferencia entre los dos pesajes no ha de ser superior a 0,5 mg .

Llegado el caso , tratar la arena durante 3 días con ácido clorhídrico al 25 % ; mezclar de vez en cuando . Lavarla con agua hasta que desaparezca la reacción ácida o hasta que el agua del lavado esté exenta de cloruro . Secarla a 160 ° C y repetir el test tal como indicado anteriormente .

5 . EQUIPO

5.1 Balanza analítica

5.2 Cápsulas metálicas , preferentemente de niquel , de aluminio o de acero inoxidable . Las cápsulas han de estar dotadas de tapaderas que se adapten perfectamente pero que puedan ser fácilmente levantadas . Las dimensiones más idóneas son : diámetro de 60 a 80 mm , profundidad de unos 25 mm .

5.3 . Cámaras calefactoras de desecación a presión atmosférica , bien ventiladas y controladas por termostato , con la temperatura regulada a 99 ± 1 ° C . Es muy importante que la temperatura del conjunto de la cámara calefactora sea uniforme .

5.4 Aparato desecador equipado de un indicador higrométrico , lleno de gel de sílice activado recientemente o de un desecante equivalente .

5.5 Cortas barritas de vidrio , una de cuyas extremidades será plana y de una longitud similar a las dimensiones interiores de las cápsulas metálicas ( punto 5.2 ) .

5.6 Baño de agua hirviendo .

6 . MODO DE OPERACIÓN

6.1 Coloque en la cápsula ( punto 5.2 ) unos 25 g. de arena ( punto 4 ) y una corta barrita de vidrio ( punto 5.5 ) .

6.2 Caliente la cápsula , la tapadera y el contenido , con la tapadera levantada , durante 2 horas en la cámara calefactora ( punto 5.3 ) .

6.3 Coloque de nuevo la tapadera en la cápsula y pase ésta al aparato desecador ( punto 5.4 ) . Deje enfriar a temperatura ambiente y pese con una precisión mínima de 0,1 mg. ( Mo ) .

6.4 Inclinando la tapadera , amontone la arena en un lado de la cápsula . Introduzca en el espacio libre que queda aproximadamente 1,5 g de la muestra si se trata de leche condensada azucarada y 3,0 g si se trata de leche condensada no azucarada . Vuelva a colocar la tapadera y pese con una precisión mínima de 0,1 mg ( M1 ) .

6.5 Retire la tapadera , añada 5 ml de agua y mezcle los líquidos con la barrita de vidrio ( punto 5.5 ) , luego la arena y la parte líquida . Deje la barrita en la mezcla .

6.6 Coloque la cápsula en el baño de agua hirviendo ( punto 5.6 ) hasta que el agua se evapore ( generalmente unos 20 minutos ) . Remueva la mezcla de vez en cuando con la barrita para que la masa se airee bien y no se aglutine tras la desecación . Coloque la barrita en el interior de la cápsula .

6.7 Coloque la cápsula y la tapadera durante 1 h 30 en la cámara calefactora .

6.8 Vuelva a poner la tapadera , transfiera la cápsula al aparato desecador y déjela que se enfríe allí hasta alcanzar la temperatura ambiente ; pese con una precisión mínima de 0,1 mg .

6.9 Destapar la cápsula y calentarla , junto con su tapadera , durante 1 hora en la cámara calefactora .

6.10 Repita la operación del punto 6.8 .

6.11 Repita las operaciones descritas en los puntos 6.9 y 6.8 hasta que entre dos pesajes sucesivos la diferencia no sea superior a 0,5 mg o que aumente la masa . En este último caso , emplee el pesaje con la masa más baja que se obtuvo en los cálculos ( punto 7.1 ) . Asegúrese de que el peso final anotado sea M2g .

7 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

7.1 . Modo de cálculo

El contenido en materia seca , expresado en porcentaje de la masa de muestra , se indica según la fórmula :

( M1 - M2 ) / ( M1 - M0 ) × 100

en donde :

M0 = masa , en gramos , de la cápsula , de su tapadera y de la arena , tras la operación del punto 6.3 .

M1 = masa , en gramos , de la tapa , de la cápsula , de la arena y de la muestra tras la operación del punto 6.4 .

M2 = masa , en gramos , de la tapadera , de la cápsula , de la arena y de la muestra desecada , tras la operación del punto 6.11 .

7.2 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas , efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de otra según el mismo análisis de la misma muestra y en las mismas condiciones , no ha de exceder 0,2 g de materia seca por 100 g de producto .

8 . CáLCULO DEL CONTENIDO EN MATERIAS SÓLIDAS TOTALES Y DEL CONTENIDO EN MATERIAS SÓLIDAS NO GRASAS EN LA LECHE

8.1 . El contenido en materia sólida total de los distintos tipos de leche condensada viene dado por :

- el contenido en materia seca total ( obtenido según el método 1 ( anexo II ) ) ,

- el contenido en sacarosa ( obtenido según el método 5 ( anexo II ) ) .

8.2 . El contenido en materia sólida no grasa de los distintos tipos de leche evaporada viene dado por :

- el contenido en materia seca total ( obtenido según el método 1 ( anexo II ) ) ,

- el contenido en sacarosa ( obtenido según el método 5 ( anexo II ) ) ,

- el contenido en materia grasa ( obtenido según el método 3 ( anexo II ) ) .

8.3 . El contenido en materia sólida no grasa de los distintos tipos de leche evaporada viene dado por :

- el contenido en materia seca total ( obtenido según el método 1 ( anexo II ) ) ,

- el contenido en materia grasa ( obtenido según el método 3 ( anexo II ) ) .

MÉTODO 2 : DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN HUMEDAD

( Cámara calefactora a 102 ° C )

1 . ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite determinar la pérdida de masa durante el proceso de desecado de los tipos de leche citados a continuación :

- leche en polvo rica en materia grasa ,

- leche en polvo ,

- leche semidesnatada en polvo ,

- leche desnatada en polvo .

2 . DEFINICIÓN

Contenido en humedad : pérdida de masa durante el proceso de desecado determinado por el método especificado .

3 . PRINCIPIO DEL MÉTODO

La masa residual de la parte de prueba se determina tras desecado a presión atmosférica en una cámara calefactora a 102 ± 1 ° C hasta obtención de una masa constante . La pérdida de masa se calcula en porcentaje de la masa de muestra .

4 . EQUIPO

4.4.1 . Balanza analítica

4.2 . Cápsulas , de preferencia de cristal , de niquel , de aluminio o de acero inoxidable . Las cápsulas han de estar dotadas de tapaderas que se adapten perfectamente pero que pueden ser fácilmente levantadas . Las dimensiones más idóneas son : diámetro de 60 a 80 mm , profundidad de unos 25 mm .

4.3 . Cámara calefactora a presión atmosférica , bien ventiladas y controladas por termostato , con la temperatura regulada a 102 ± 1 ° C . Es muy importante que la temperatura del conjunto de la cámara calefactora sea uniforme .

4.4 . Aparato desecador equipado de un indicador higrométrico , lleno de gel de sílice activado recientemente o de un desecante equivalente .

5 . MODO DE OPERACIÓN

5.1 . Quite la tapadera de la cápsula ( punto 4.2 ) y coloque tapadera y cápsula en la cámara calefactora ( punto 4.3 ) durante 1 hora .

5.2 . Vuelva a poner la tapadera , transfiera la cápsula al aparato desecador ( punto 4.4 ) y deje que se enfríe allí hasta alcanzar la temperatura ambiente ; pese con una precisión de 0,1 mg ( M0 ) .

5.3 . Coloque en la cápsula unos 2 g de muestra de leche seca , ponga la tapadera sobre la cápsula y proceda rápidamente pesar la cápsula equipada de su tapadera con una precisión de 0,1 mg ( M1 ) .

5.4 . Retire la tapadera y coloque cápsula y tapadera durante 2 horas en la cámara calefactora .

5.5 . Ponga de nuevo la tapadera , transfiera la cápsula tapada al aparato desecador y deje que se enfríe allí hasta alcanzar la temperatura ambiente ; pese rápidamente con una precisión de 0,1 mg .

5.6 . Destape la cápsula y caliéntela , junto con su tapadera , durante 1 hora en la cámara calefactora .

5.7 . Repita la operación del punto 5.5 .

5.8 . Repita las operaciones de los puntos 5.6 y 5.5 hasta que los sucesivos pesajes no difieran en más de 0,5 mg o que la masa aumente . En este último caso , emplee el pesaje con la masa más baja que obtuvo en los cálculos ( punto 6.1 ) . Asegúrese de que el peso final anotado sea M2g .

6 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

6.1 . Modo de cálculo

Calcule la pérdida de masa de la muestra durante el proceso de desecado , expresada en porcentaje de la masa , utilizando la fórmula :

( M1 - M2 ) / ( M1 - M0 ) × 100

en donde :

M0 = masa , en gramos , de la cápsula y de su tapadera , tras la operación del punto 5.2 .

M1 = masa , en gramos , de la cápsula , de su tapadera y de la muestra , tras la operación del punto 5.3 .

M2 = masa , en gramos , de la cápsula , de la tapadera y de la muestra final , tras la operación del punto 5.5 .

6.2 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas , efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de la otra según el mismo análisis de la misma muestra y en las mismas condiciones , no ha de exceder 0,1 g de agua por 100 g de producto .

MÉTODO 3 : DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN MATERIA GRASA ( MÉTODO ROESE-GOTTLIEB )

1 . ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite determinar el contenido en materia grasa de los siguientes tipos de leche :

- leche evaporada rica en materia grasa ,

- leche evaporada ,

- leche semidesnatada evaporada ,

- leche desnatada evaporada ,

- leche condensada ,

- leche semidesnatada condensada ,

- leche desnatada condensada .

2 . DEFINICIÓN

Contenido en materia grasa de los distintos tipos de leche evaporada o de leche condensada : el contenido en materia grasa determinado por el método especificado .

3 . PRINCIPIO DEL MÉTODO

El contenido en materia grasa se determina por extracción de la materia grasa de una solución amoniacal-alcohólica de la muestra con ayuda de óxido dietílico y de éter de petróleo , evaporación de los disolventes , pesaje de los residuos y cálculo en porcentaje de la muestra , según el método Roese-Gottlieb .

4 . REACTIVOS

Todos los reactivos han de conformarse con las condiciones requeridas en la prueba simulada ( punto 6.1 ) . Llegado el caso , podrá destilarse de nuevo los reactivos en presencia de 1 g de grasa de mantequilla por 100 ml de disolvente .

4.1 . Solución de amoniaco , más o menos 25 % ( m/m ) de NH3 ( densidad a 20 ° C , unos 0,91 g/ml ) o una solución más concentrada de una concentración conocida .

4.2 . Etanol a 96 ± 2 % ( v/v ) o , en su ausencia , etanol desnaturalizado con metanol , etilmetilcetona o éter de petróleo .

4.3 . Óxido dietílico , exento de peróxidos .

Nota 1

Para asegurarse de que el óxido dietílico está exento de peróxidos , añadir a 10 ml de óxido contenidos en una pequeña probeta con tapón , de vidrio , enjuagada previamente con un poco de óxido dietílico 1 ml , de una solución con un 10 % de yoduro de potasio , recientemente preparada . Agitar y dejar reposar durante 1 minuto . No ha de aparecer coloración amarilla alguna en ninguna de las dos capas .

Nota 2

El óxido dietílico puede ser mantenido exento de peróxidos adicionando una hoja de cinc húmeda previamente sumergida durante 1 minuto en una solución ácida diluida de sulfato de cobre y posteriormente lavada con agua . Para 1 litro de óxido dietílico , utilizar unos 8 000 mm² de hoja de cinc , cortada en bandas suficientemente largas para llegar a la mitad del recipiente como mínimo .

4.4 Éter de petróleo , destilante entre 30 y 60 ° C .

4.5 . Mezcla de disolventes , preparada inmediatamente antes de su empleo mediante la mezcla de igual volumen de óxido dietílico ( punto 4.3 ) y de éter de petróleo ( punto 4.4 ) . ( Se puede sustituir la mezcla de disolventes , siempre que sea indicado , por el óxido dietílico o por el éter de petróleo . ) .

5 . EQUIPO

5.1 . Balanza analítica

5.2 . Tubos o frascos de extracción apropiados , dotados de tapones de vidrio esmerilado , o de otro tipo de cierre insensible a la acción de los disolventes empleados .

5.3 . Frascos de fondo plano y pared delgada , de 150 a 250 ml de capacidad .

5.4 . Cámara calefactora de desecado a presión atmosférica , bien ventilada , controlada por termostato ( temperatura a 102 ± 1 ° C ) .

5.5 . Gránulos destinados a facilitar la ebullición , exentos de materia grasa , no porosos , no desmenuzables , como por ejemplo perlas de vidrio o trocitos de carburo de silicio ( el empleo de estos gránulos es facultativo ; ver al respecto el punto 6.2.1 ) .

5.6 . Sifón correspondiente a los tubos de extracción .

5.7 . Centrifugadora .

6 . MODO DE OPERACIÓN

6.1 . Prueba simulada

Al tiempo que efectúa la determinación de la materia grasa de la muestra , efectué una prueba simulada con 10 ml de agua utilizando el mismo tipo de aparato de etracción , los mismos reactivos en las mismas proporciones y el mismo modo de operación que el descrito a continuación , salvo el punto 6.2.2 . Si el valor de la prueba simulada es superior a 0,5 mg , habrá que verificar los reactivos y el o los reactivos impuros habrán de ser purificados o sustituidos .

6.2 . Dosificación

6.2.1 . Seque el frasco ( punto 5.3 ) ( eventualmente después de haber depositado los materiales ) ( punto 5.5 ) facilitando una ebullición moderada durate la evaporación de los disolventes ) en la cámara calefactora ( punto 5.4 ) durante una media hora a 1 hora . Deje enfriar el frasco hasta que adquiera la temperatura de la sala de las balanzas y pese el frasco ya enfriado , con una precisión de 0,1 mg .

6.2.2 . Agite la muestra preparada de 5 g y pese inmediatamente después con una precisión de 1 mg , directamente o por diferencia , 4 g de leche evaporada o 2 a 2,5 g de leche condensada en el aparato de extracción ( punto 5.2 ) . Añada agua hasta un volumen de 10,5 ml y agite suavemente calentando al mismo tiempo ligeramente ( 40 a 50 ° C ) hasta la total dispersión del producto . La muestra ha de estar totalmente dispersada ya que en caso contrario habrá que repetir la determinación .

6.2.3 . Añada 1,5 ml de la solución de amoníaco ( 25 % ) ( punto 4.1 ) o un volumen correspondiente de una solución más concentrada y mezclar convenientemente .

6.2.4 . Añada 10 ml de etanol ( punto 4.2 ) y mezcle los líquidos suavemente , pero totalmente , en el aparato de extracción que se mantuvo abierto .

6.2.5 . Añada 25 ml de óxido dietílico ( punto 4.3 ) . Enfríe si es necesario el aparato bajo el agua corriente . Cierre el aparato , agítelo enérgicamente y déle la vuelta en varias ocasiones durante 1 minuto .

6.2.6 . Retire el tapón con precaución y añada 25 ml de éter de petróleo ( punto 4.4 ) utilizando los primeros mililitros para enjuagar el tapón y el interior del cuello del aparato y dejando que se deslicen los líquidos de enjuague al interior del aparato . Cierre el aparato volviendo a colocar el tapón , agite y dé vueltas al aparato en varias ocasiones durante 30 segundos . Si no se prevé centrifugado durante la operación indicada en el punto 6.2.7 , no lo agite demasiado enérgicamente .

6.2.7 . Deje reposar el aparato hasta que la capa líquida superior se vuelva nítida y se separe claramente de la fase acuosa . Se puede realizar también la separación con ayuda de una centrifugadora adecuada . ( punto 5.7 )

Nota

Si se utiliza un centrifugadora cuyo motor no es trifásico , pueden producirse chispas y por ello habrá que estar atento para evitar una explosión o un incendio como consecuencia de la presencia de vapores de éter ( en caso de ruptura de un tubo , por ejemplo ) .

6.2.8 . Retire el tapón y enjuáguelo , así como el interior del cuello del aparato , con unos mililitros de la mezcla de disolventes ( punto 4.5 ) y deje que los líquidos del enjuague se deslicen al interior del aparato . Transvase con mucho cuidado , lo más que pueda , la capa superior al frasco ( punto 6.2.1 ) mediante decantación o con ayuda de un sifón ( punto 5.6 ) .

Nota

Si el transvase no se realiza con ayuda de un sifón , puede ser que necesitemos añadir un poco de agua para realzar la separación de las dos capas con el fin de facilitar la decantación .

6.2.9 . Enjuague el interior y el exterior del cuello del aparato o la punta y la parte inferior del sifón con unos mililitros de la mezcla de disolventes . Deje que los líquidos del enjuague del exterior del aparato se deslicen al interior del frasco y que los del interior del cuello y del sifón se deslicen al interior del aparato de extracción .

6.2.10 . Proceda a una segunda extracción repitiendo las operaciones descritas en los puntos 6.2.5 a 6.2.9 incluido , pero utilizando únicamente 15 ml de óxido dietílico y 15 ml de éter de petróleo .

6.2.11 . Efectúe una tercera extracción procediendo tal como se indica en el punto 6.2.10 , pero sin realizar el enjuague final ( punto 6.2.9 )

Nota

En el caso de la leche desnatada evaporada y de la leche desnatada condensada , no es necesario efectuar esta tercera extracción .

6.2.12 . Elimine con cuidado por evaporación o destilación el máximo de disolvente ( incluido el etanol ) . Si el frasco fuera de pequeña capacidad , habrá que eliminar un poco de disolvente de la manera anteriormente indicada tras cada extracción .

6.2.13 . Cuando ya no exista olor alguno de disolvente , caliente el frasco , acostado , durante 1 hora , en la cámara calefactora .

6.2.14 . Retire el frasco de la cámara calefactora , déjelo enfriar hasta que adquiera la temperatura de la sala de las balanzas y pese con precisión de 0,1 mg .

6.2.15 . Repita las operaciones de los puntos 6.2.13 y 6.2.14 calentando por períodos de 30 a 60 minutos hasta que dos pesajes sucesivos sólo difieran en menos de 0,5 mg o que aumente la masa . En este último caso , emplee el pesaje más bajo que obtuvo en los cálculos ( punto 7.1 ) . Asegúrese de que el peso final anotado sea M1g .

6.2.16 . Añada 15 a 25 ml de éter de petróleo para verificar si la materia extraída es totalmente soluble . Caliente ligeramente y agite el disolvente mediante un movimiento circular hasta que se disuelva toda la materia grasa .

6.2.16.1 . Si la materia extraída es totalmente soluble en éter de petróleo , la masa de materia grasa es la diferencia entre el pesaje del punto 6.2.1 y el pesaje del punto 6.2.15 .

6.2.16.2 . Si aparecieran materias insolubles o siempre en caso de duda , extraiga completamente la materia grasa contenida en los frascos mediante repetidos lavados con éter de petróleo caliente , dejando que la materia no disuelta se deposite antes de cada decantación . Enjuague tres veces el exterior del cuello del frasco . Caliente el frasco , acostado , durante 1 hora en la cámara calefactora y déjelo que se enfríe tal como se indicó anteriormente ( punto 6.2.1 ) hasta que adquiera la temperatura de la sala de las balanzas ; pese con una precisión de 0,1 mg . La masa de la materia grasa es la diferencia entre el pesaje del punto 6.2.15 y este pesaje final .

7 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

7.1 . Modo de cálculo

La masa expresada en gramos de la materia grasa extraída viene dada por la siguiente fórmula :

( M1 - M2 ) - ( B1 - B2 )

y el contenido en materia grasa de la muestra , expresado en porcentaje , por la fórmula :

( M1 - M2 ) - ( B1 - B2 ) /S × 100

en donde :

M1 = masa , en gramos , del frasco M conteniendo la materia grasa tras la operación del punto 6.2.15 .

M2 = masa , en gramos , del frasco M tras la operación del punto 6.2.1 o , en el caso de que aparezcan materias insolubles o en caso de duda , tras la operación del punto 6.2.16.2 .

B1 = masa , en gramos , del frasco B de la prueba simulada tras la operación el punto 6.2.15 .

B2 = masa , en gramos , del frasco B , tras la operación del punto 6.2.1 o , en el caso de que aparezcan materias insolubles o en caso de duda , tras la operación del punto 6.2.16.2 .

S = masa , en gramos , de la toma de prueba utilizada .

7.2 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de la otra por el mismo analista sobre la misma muestra y en las mismas condiciones , no ha de exceder 0,05 g de materia grasa por 100 g de producto .

MÉTODO 4 : DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN MATERIA GRASA ( MÉTODO ROESE-GOTTLIEB )

1 . ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite determinar el contenido en materia grasa de las siguientes leches :

- leche en polvo rica en materia grasa ,

- leche en polvo ,

- leche semidesnatada en polvo ,

- leche desnatada en polvo .

2 . DEFINICIÓN

El contenido en materia grasa de los distintos tipos de leche en polvo es el contenido en materia grasa determinado por el método especificado .

3 . PRINCIPIO DEL MÉTODO

El contenido en materia grasa se determina por extracción de la materia grasa de una solución amoniacal-alcohólica de la muestra con ayuda de óxido dietílico y de éter de petróleo , evaporación de los disolventes , pesaje de los residuos y cálculo en porcentaje de la masa de la muestra , según el principio del método de Roese-Gottlieb .

4 . REACTIVOS

Todos los reactivos han de conformarse con las condiciones requeridas en la prueba simulada ( punto 6.1 ) . Llegado el caso , podrá destilarse de nuevo los reactivos en presencia de 1 g de grasa de mantequilla por 100 ml de disolvente .

4.1 . Solución de amoníaco , más o menos 25 % ( m/m ) de NH3 ( densidad a 20 ° C , unos 0,91 g/ml ) una solución más concentrada de una concentración conocida .

4.2 . Etanol , a 96 ± 2 % ( v/v ) o , en su ausencia , etanol desnaturalizado con metanol , etilmetilcetona o éter de petróleo .

4.3 . Óxido dietílico , exento de peróxidos .

Nota 1

Para asegurarse de que el óxido dietílico está exento de peróxidos , añadir a 10 ml de óxido contenidos en una pequeña probeta con tapón , de vidrio , enjuagada previamente con un poco de óxido dietílico , 1 ml de una solución con un 10 % de yoduro de potasio , recientemente preparada . Agitar y dejar reposar durante 1 minuto . No ha de aparecer coloración amarilla alguna en ninguna de las dos capas .

Nota 2

El óxido dietílico puede , ser mantenido exento de peróxidos adicionando una hoja de cinc húmeda previamente sumergida durante 1 minuto en una solución ácida diluida de sulfato de cobre y posteriormente lavada con agua . Para 1 litro de óxido dietílico , utilizar unos 8 000 mm² de hoja de cinc , cortada en bandas suficientemente largas para llegar a la mitad del recipiente como mínimo .

4.4 . Éter de petróleo , destilante entre 30 y 60 ° C .

4.5 . Mezcla de disolventes , preparada inmediatamente antes de su empleo mediante la mezcla de igual volumen de óxido dietílico ( punto 4.3 ) y de éter de petróleo ( punto 4.4 ) . ( Se puede sustituir la mezcla de disolventes , siempre que sea indicado , por el óxido dietílico o por el éter de petróleo . )

5 . EQUIPO

5.1 . Balanza analítica

5.2 . Tubos o frascos de extracción apropiados , dotados de tapones de vidrio esmerilado , o de otro tipo de cierre insensible a la acción de los disolventes empleados .

5.3 . Frascos de fondo plano y pared delgada , de 150 a 250 ml de capacidad .

5.4 . Cámara calefactora de desecado a presión atmosférica , bien ventilada , controlada por termostato ( temperatura a 102 ± 1 ° C ) .

5.5 . Gránulos destinados a facilitar la ebullición , exentos de materia grasa , no porosos , no desmenuzables , como por ejemplo perlas de vidrio o trocitos de carburo de silicio ( el empleo de estos gránulos es facultativo ; ver al respecto el punto 6.2.1 ) .

5.6 . Baño de agua a 60 - 70 ° C .

5.7 . Sifón correspondiente a los tubos de extracción .

5.8 . Centrifugadora .

6 . MODO DE OPERACIÓN

6.1 . Prueba simulada

Al tiempo que efectúa la determinación de la materia grasa de la muestra , efectúe una prueba simulada con 10 ml de agua utilizando el mismo tipo de aparato de extracción , los mismos reactivos en las mismas proporciones y el mismo modo de operación que el descrito a continuación , salvo el punto 6.2.2 . Si el valor de la prueba simulada es superior a 0,5 mg , habrá que verificar los reactivos y el o los reactivos impuros habrán de ser purificados o sustituidos .

6.2 . Dosificación

6.2.1 . Seque el frasco ( punto 5.3 ) ( eventualmente después de haber depositado los materiales ( punto 5.5 ) facilitando una ebullición moderada durante la evaporación de los disolventes ) en la cámara calefactora ( punto 5.4 ) durante una media hora a 1 hora . Deje enfriar el frasco hasta que adquiera la temperatura de la sala de las balanzas y pese el frasco ya enfriado , con una precisión de 0,1 mg .

6.2.2 . En el aparato de extracción ( punto 5.2 ) pese con una precisión de 1 mg , bien directamente , bien por diferencia , aproximadamente 1 g de leche en polvo o 1,5 g de leche semidesnatada en polvo o de leche desnatada en polvo . Añada 10 ml de agua y agite hasta la total dispersión de la leche ( en algunas muestras habrá que proceder a calentarlas ) .

6.2.3 . Añada 1,5 ml de la solución de amoníaco ( 25 % ) ( punto 4.1 ) o un volumen correspondiente de una solución más concentrada y calentar al baño de agua ( punto 5.6 ) durante 15 minutos , de 60 a 70 ° C , agitando de vez en cuando . Posteriormente enfriarlo , por ejemplo mediante agua corriente .

6.2.4 . Añada 10 ml de etanol ( punto 4.2 ) y mezcle los líquidos suavemente , pero totalmente , en el aparato de extracción que se mantuvo abierto .

6.2.5 . Añada 25 ml de óxido dietílico ( punto 4.3 ) . Enfríe , si es necesario , el aparato bajo el agua corriente . Cierre el aparato , agítelo enérgicamente y déle la vuelta en varias ocasiones durante 1 minuto .

6.2.6 . Retire el tapón con precaución y añada 25 ml de éter de petróleo ( punto 4.4 ) utilizando los primeros mililitros para enjuagar el tapón y el interior del cuello del aparato y dejando que se deslicen los líquidos en enjuague al interior del aparato . Cierre el aparato volviendo a colocar el tapón , agite y dé vueltas al aparato en varias ocasiones durante 30 segundos . Si no se prevé centrifugado durante la operación indicada en el punto 6.2.7 , no lo agite demasiado enérgicamente .

6.2.7 . Deje reposar el aparato hasta que la capa líquida superior se vuelva nítida y se separe claramente de la fase acuosa . Se puede realizar también la separación con ayuda de una centrifugadora adecuada . ( punto 5.7 )

Nota

Si se utiliza una centrifugadora cuyo motor no es trifásico , pueden producirse chispas y por ello habrá que estar atento para evitar una explosión o un incendio como consecuencia de la presencia de vapores de éter ( en caso de ruptura de un tubo , por ejemplo ) .

6.2.8 . Retire el tapón y enjuáguelo , así como el interior del cuello del aparato , con unos mililitros de la mezcla de disolventes ( punto 4.5 ) y deje que los líquidos del enjuague se deslicen al interior del aparato . Transvase con mucho cuidado , lo más que pueda , la capa superior al Frasco ( punto 6.2.1 ) mediante decantación o con ayuda de un sifón ( punto 5.6 ) .

Nota

Si el transvase no se realiza con ayuda de un sifón , puede ser que necesitemos añadir un poco de agua para realzar la separación de las dos capas con el fin de facilitar la decantación .

6.2.9 . Enjuague el interior y el exterior del cuello del aparato o la punta y la parte inferior del Sifón con unos mililitros de la mezcla de disolventes . Deje que los líquidos del enjuague del exterior del aparato se deslicen al interior del frasco y que los del interior del cuello y del sifón se deslicen al interior del aparato de extracción .

6.2.10 . Proceda a una segunda extracción repitiendo las operaciones descritas en los puntos 6.2.5 a 6.2.9 incluido , pero utilizando únicamente 15 ml de óxido dietílico y 15 ml de éter de petróleo .

6.2.11 . Efectúe una tercera extracción procediendo tal como se indica en el punto 6.2.10 , pero sin realizar el enjuague final ( punto 6.2.9 )

Nota

En el caso de polvos de leche desnatada , no es necesario realizar la tercera extracción .

6.2.12 . Elimine con cuidado por evaporación o destilación el máximo de disolvente ( incluido el etanol ) . Si el frasco fuera de pequeña capacidad , habrá que eliminar un poco de disolvente de la manera anteriormente indicada tras cada extracción .

6.2.13 . Cuando ya no exista olor alguno de disolvente , caliente el frasco , acostado , durante 1 hora , en la cámara calefactora .

6.2.14 . Retire el frasco de la cámara calefactora , déjelo enfriar hasta que adquiera la temperatura de la sala de las balanzas y pese con precisión de 0,1 mg .

6.2.15 . Repita las operaciones de los puntos 6.2.13 y 6.2.14 calentando por períodos de 30 a 60 minutos hasta que dos pesajes sucesivos sólo difieran en menos de 0,5 mg o que aumente la masa . En este último caso emplee el pesaje más bajo que obtuvo en los cálculos ( punto 7.1 ) . M1 es la masa obtenida en g .

6.2.16 . Añada 15 a 25 ml de éter de petróleo para verificar si la matería extraída es totalmente soluble . Caliente ligeramente y agite el disolvente mediante un movimiento circular hasta que se disuelva toda la materia grasa .

6.2.16.1 . Si la materia extraída es totalmente soluble en éter de petróleo , la masa de materia grasa es la diferencia entre el pesaje del punto 6.2.1 y el pesaje del punto 6.2.15 .

6.2.16.2 . Si aparecieran materias insolubles o siempre en caso de duda , extraiga completamente la materia grasa contenida en los frascos mediante repetidos lavados con éter de petróleo caliente , dejando que la materia no disuelta se deposite antes de cada decantación . Enjuague tres veces el exterior del cuello del frasco . Caliente el frasco , acostado , durante 1 hora en la cámara calefactora y déjelo que se enfríe tal como se indicó anteriormente ( punto 6.2.1 ) hasta que adquiera la temperatura de la sala de las balanzas ; pese con una precisión de 0,1 mg . La masa de la materia grasa es la diferencia entre el pesaje del punto 6.2.15 y este pesaje final .

7 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

7.1 . Modo de cálculo

La masa expresada en gramos de la materia grasa extraída viene dada por la siguiente fórmula :

( M1 - M2 ) - ( B1 - B2 )

y el contenido en materia grasa de la muestra , expresado en porcentaje , por la fórmula :

( ( M1 - M2 ) - ( B1 - B2 ) ) /S × 100

en donde :

M1 = masa , en gramos , del frasco M conteniendo la materia grasa tras la operación del punto 6.2.15 .

M2 = masa , en gramos , del frasco M tras la operación del punto 6.2.1 o , en el caso de que aparezcan materias insolubles o en caso de duda , tras la operación del punto 6.2.16.2 .

B1 = masa , en gramos , del frasco B de la prueba simulada tras la operación del punto 6.2.15 .

B2 = masa , en gramos , del frasco B , tras la operación del punto 6.2.1 o , en el caso de que aparezcan materias insolubles o en caso de duda , tras la operación del punto 6.2.16.2 .

S = masa , en gramos , de la toma de prueba utilizada .

7.2 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de las determinaciones efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de la otra por el mismo analista sobre la misma muestra y en las mismas condiciones , no ha de exceder 0,2 g de materia grasa por 100 g de producto , salvo en el caso de la leche desnatada en polvo , en donde la diferencia no ha de exceder 0,1 g de materia grasa por 100 g de producto .

MÉTODO 4 : DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN SACAROSA ( MÉTODO POLARIMÉTRICO )

1 . ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite determinar el contenido en sacarosa de los siguientes tipos de leche :

- leche condensada ,

- leche semidesnatada condensada ,

- leche desnatada condensada .

Las muestras no han de contener azúcar modificado .

2 . DEFINICIÓN

El contenido en sacarosa de los distintos tipos de leche condensada es el contenido en sacarosa determinado por el método especificado .

3 . PRINCIPIO DEL MÉTODO

El método se basa en el principio de la inversión de Clerget : un tratamiento suave mediante un ácido hidroliza completamente la sacarosa . La lactosa y los restantes azúcares no son prácticamente hidrolizados . El contenido en sacarosa se deduce del cambio del poder rotatorio de la solución .

Para ello se prepara un líquido filtrado de la muestra , sin mutarrotación debida a la lactosa , tratando la solución con amoníaco , mediante neutralización y purificación mediante sucesivas adiciones de soluciones de acetato de cinc y de hexaferrocianuro de potasio .

En una parte del líquido filtrado , la sacarosa se hidroliza en condiciones determinadas .

Partiendo de los poderes rotatorios del líquido filtrado antes y después de la inversión , se calcula el contenido en sacarosa mediante unas fórmulas .

4 . REACTIVOS

4.1 . Solución de acetato de cinc , M : disolver 21,9 g de acetato de cinc cristalizado Zn (C2H3O2)2 · 2H2O y 3 ml de ácido acético glacial en agua y completar hasta 100 ml .

4.2 . Solución de hexaferrocianuro ( II ) de potasio , 0,25 M : disolver 10,6 g de hexaferrocianuro ( II ) de potasio K4[Fe(CN)6] · 3H2O en agua y completar hasta 100 ml .

4.3 . Solución de ácido clorhídrico 6,35 ± 0,20 M ( 20 a 22 % ) o 5,0 ± 0,2 M ( 16 a 18 % ) .

4.4 . Solución diluida de amoníaco 2,0 ± 0,2 M ( 3,5 % ) .

4.5 . Solución diluida de ácido acético 2,0 ± 0,2 M ( 12 % ) .

4.6 . Indicador azul de bromotimol , solución al 1 % ( m/v ) en el etanol .

5 . EQUIPO

5.1 . Balanza analítica , sensibilidad 10 mg .

5.2 . Tubo de polarímetro de 2 dm de longitud , calibrado exactamente .

5.3 . Polarímetro o sacarímetro :

a ) Polarímetro de luz de sodio o de luz verde de mercurio ( lámpara de vapor de mercurio con prisma o pantalla Wratten especial n º 77 A ) , que permita una lectura de una precisión como mínimo igual a 0,05 grados de ángulo .

b ) Sacarímetro con escala internacional , que utilice la luz blanca que pasa a través de un filtro de 15 mm de solución con un 6 % de bicromato de potasio o bien luz de sodio y que permita la lectura con una precisión como mínimo igual a 0,1 grados de la escala sacarímetrica internacional .

5.4 . Baño de agua a una temperatura de 60 ± 1 ° C .

6 . MODO DE OPERACIÓN

6.1 . Control de método

Con vistas a normalizar el método , los reactivos y los aparatos , se procederá a un control del método tal como indicamos a continuación mediante un doble análisis de una mezcla de 100 g de leche y 18 g de sacarosa pura o de 110 g de leche desnatada y 18 g de sacarosa pura que corresponden a 40 g de leche condensada que contenga un 45 % de sacarosa . Calcular el contenido en sacarosa con la ayuda de las fórmulas que se indican en el punto 7 utilizando la fórmula 1 , para M , F , P , ( la cantidad de leche pesada y el contenido en materia grasa y en proteínas de dicha leche ) y , en la fórmula 2 , para M , la cifra de 40 g . La media de los valores registrados no ha de diferir de dicho valor ( 45 % ) en más de 0,2 % .

6.2 . Dosificación

6.2.1 . En un recipiente cilíndrico de borde redondeado de vidrio y de 100 ml , pese exactamente , con un margen de error de 10 mg , unos 40 g de la muestra convenientemente mezclada . Añada 50 ml de agua caliente ( 80 a 90 ° C ) y mezcle cuidadosamente .

6.2.2 . Transvase cuantitativamente la mezcla a un matraz graduado de 200 ml , enjuague el recipiente cilíndrico con sucesivas cantidades de agua a 60 ° C , hasta que el volumen total sea de 120 a 150 ml . Mezcle y deje enfriar a temperatura ambiente .

6.2.3 . Añada 5 ml de la solución de amoníaco diluida ( punto 4.4 ) . Mezcle de nuevo y deje reposar durante 15 minutos .

6.2.4 . Neutralice el amoníaco añadiendo una cantidad equivalente de la solución diluida de ácido acético ( punto 4.5 ) . Determine previamente la cantidad exacta de ml mediante determinación de la graduación de la solución de amoníaco diluida utilizando el azúl de bromotimol como indicador ( punto 4.6 ) . Mezcle a continuación .

6.2.5 . Añada , mezclando suavemente por rotación del matraz inclinado , 12,5 ml de solución de acetato de cinc ( punto 4.1 ) .

6.2.6 . De la misma manera que para la solución de acetato , añada 12,5 ml de solución de hexaferrocianuro ( II ) de potasio ( punto 4.2 ) .

6.2.7 . Caliente el contenido del matraz hasta 20 ° C y añada agua ( a 20 ° C ) hasta la línea graduada de 200 ml .

Nota

Hasta el momento , todas las adiciones de agua o de reactivos se realizarán evitando se formen burbujas y , por esta misma razón , todas las mezclas se efectuarán mediante rotación del matraz en vez de por agitación violenta . Si se constata la presencia de burbujas antes de llegar a la rayita de 200 ml , podemos eliminarlas conectando el matraz con una bomba de vacío e imprimiéndole un movimiento de rotación .

6.2.8 . Tape el matraz con un tapón seco y mezcle íntimamente agitándolo enérgicamente .

6.2.9 . Déjelo reposar durante unos minutos , luego fíltrelo a través de papel filtrante seco . Tire los 25 primeros ml del líquido filtrado .

6.2.10 . Polarización directa : determinar la rotación óptica del líquido filtrado a 20 ± 1 ° C .

6.2.11 . Inversión : pipetee , en un matraz graduado de 50 ml , 40 ml del líquido filtrado obtenido de la manera indicada anteriormente . Añada 6,0 ml de ácido clorhídrico 6,35 M o 7,6 ml de ácido clorhídrico 5,00 M ( punto 4.3 ) .

Coloque el matraz en un baño de agua a 60 ° C durante 15 minutos , estando sumergido el matraz hasta donde empieza su cuello . Mezcle por rotación durante los 5 primeros minutos durante los cuales el contenido deberá haber alcanzado la temperatura del baño . Enfríe hasta 20 ° C y rellene con agua a 20 ° C ; mezcle y déjelo reposar durante 1 hora a esta temperatura .

6.2.12 . Polarización tras inversión

Determinar el poder rotatorio de la solución intervertida a 20 ± 0,2 ° C ( cuando la temperatura T del líquido contenido en el tubo de polarización difiera en más de 0,2 ° C durante la medición , se ha de aplicar la corrección de temperatura indicada en el punto 7.2 ) .

7 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

7.1 . Modo de cálculo

Calcule el contenido en sacarosa con ayuda de las siguientes fórmulas :

1 . V = M/100 ( 1,08 F + 1,55 P )

2 . S = ( D - 1,25 I ) /Q × ( V - v ) /V × V/ ( L × M ) %

S = contenido en sacarosa

M = masa de la muestra expresada en g.

F = porcentaje de materia grasa de la muestra

P = porcentaje de proteínas ( N × 6,38 ) de la muestra

V = volumen en ml en el que se diluye la muestra antes del proceso de filtrado

v = corrección expresada en ml para el volumen del precipitado formado durante el proceso de purificado

D = lectura polarimétrica directa ( polarización antes de inversión )

I = lectura polarimétrica tras inversión

L = longitud en dm del tubo del polarímetro

Q = factor de inversión cuyos valores se indican a continuación .

Notas

a ) Si pesamos exactamente 40 g de leche condensada y utilizamos un polarímetro de luz de sodio , con escala en grados de ángulo y un tubo de polarímetro de 2 dm de longitud a 20,0 ± 0,1 ° C , podemos calcular el contenido en sacarosa de las leches condensadas normales ( C = 9 ) mediante la siguiente fórmula :

S = ( D - 1,25 I ) ( 2,833 - 0,00612 F - 0,00878 P )

b ) Si efectuamos la medición de la polarización tras inversión a temperatura diferente de 20 ° C , las cifras que obtengamos habrá que multiplicarlos por :

( 1 + 0,0037 ( T - 20 ) )

7.2 . Valores del factor de inversión Q

Las fórmulas siguientes dan unos valores precisos de Q según las diversas fuentes de luz con correcciones , dado el caso , para la concentración y la temperatura :

Luz de sodio y polarímetro con escala en grados de ángulo :

Q = 0,8825 + 0,0006 ( C - 9 ) - 0,0033 ( T - 20 ) .

Luz verde de mercurio y polarímetro con escala en grados de ángulo :

Q = 1,0392 + 0,0007 ( C - 9 ) - 0,0039 ( T - 20 ) .

Luz blanca con pantalla de bicromato y sacarímetro con escala sacarimétrica internacional :

Q = 2,549 + 0,0017 ( C - 9 ) - 0,0095 ( T - 20 ) .

En las fórmulas anteriores :

C = porcentaje de azúcares totales en la solución intervertida , tras la lectura polarimétrica .

T = temperatura de la solución intervertida durante la lectura con el polarímetro .

Nota 1

El porcentaje de azúcares totales C en la solución intervertida puede calcularse a partir de la lectura directa y de la variación posterior a la inversión según el método habitual , utilizando los valores habituales de rotación específica de la sacarosa , de la lactosa y del azúcar intervertido .

La corrección 0,0006 ( C - 9 ) etc. sólo es exacta si C es aproximadamente igual a 9 ; dado que en el caso de la leche condensada normal C es aproximadamente 9 , se puede despreciar esta corrección .

Nota 2

Las variaciones de temperatura de 1 ° C respecto a 20 ° C influencian ligeramente la lectura directa . En cambio , en caso de existir variaciones de más de 0,2 ° C durante la lectura tras inversión , será necesario proceder a una corrección . La corrección - 0,0033 ( T - 20 ) , etc. sólo es exacta con temperaturas comprendidas entre 18 y 22 ° C .

7.3 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de la otra por el mismo analista y sobre la misma muestra y en las mismas condiciones no será superior a 0,3 g de sacarosa por 100 gramos de leche condensada .

MÉTODO 6 : DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ÁCIDO LÁCTICO Y EN LACTATOS

1 . OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite obtener el contenido en ácido láctico y en lactatos de los siguientes tipos de leche :

- leche en polvo rica en materia grasa ,

- leche en polvo ,

- leche parcialmente desnatada en polvo ,

- leche desnatada en polvo .

2 . DEFINICIÓN

Contenido en ácido láctico y en lactatos de los distintos tipos de leche en polvo : el contenido en ácido láctico y en lactatos determinados por el método especificado .

3 . PRINCIPIO DEL MÉTODO

La materia grasa , las proteínas y la lactosa se eliminan simultáneamente de una solución de la muestra mediante la adición de sulfato de cobre de hidróxido de calcio , y posterior filtrado .

El ácido láctico y los lactatos del líquido filtrado se transforman en acetaldehído por acción del ácido sulfúrico concentrado en presencia de sulfato de cobre ( II ) .

El contenido en ácido láctico se determina por colorimetría utilizando p-hidroxidifenilo .

El contenido en ácido láctico y en lactatos se expresa en mg de ácido láctico por 100 g de materias sólidas no lipídicas .

4 . REACTIVOS

4.1 . Solución de sulfato de cobre ( II ) : disuelva 250 g de sulfato de cobre ( II ) ( CuSO4 · 5H2O ) en agua y diluya a 1 000 ml .

4.2 . Suspensión de hidróxido de calcio .

4.2.1 . Triture 300 g de hidróxido de calcio [ CA ( OH ) 2 ] en un mortero con agua , utilizando un total de 900 ml . La suspensión ha de estar recientemente preparada antes de proceder a su utilización .

4.2.2 . Triture 300 g de hidróxido de calcio [ Ca ( OH ) 2 ] en un mortero con agua , utilizando un total de 1 400 . La suspensión ha de estar preparada recientemente antes de proceder a su utilización .

4.3 . Solución de ácido sulfúrico - sulfato de cobre ( II ) : añada a 300 ml de ácido sulfúrico 95,5 = 97,0 % ( m/m ) de H2SO4 , 0,5 ml de la solución de sulfato de cobre ( II ) ( punto 4.1 ) .

4.4 . Solución de p-hidroxidifenilo ( C6H5C6H4OH ) : disuelva agitando y calentando ligeramente 0,75 g de p-hidroxidifenilo en 5 ml de una solución acuosa de hidróxido de sodio que contenga 5 g de NaOH por 100 ml . Diluya hasta 50 ml con agua en un frasco graduado . Conserve la solución en un frasco de vidrio ahumado , al abrigo de la luz y en lugar fresco . No utilice la solución si cambiara el color o enturbiara . El período máximo de conservación es de 72 horas .

4.5 . Solución patrón de ácido láctico : disuelva un poco antes del empleo 0,1067 g de lactato de litio ( CH3CHOHCOOLi ) en agua y diluya en 1 000 ml en un frasco graduado . Un ml de esta solución corresponde a 0,1 mg de ácido láctico .

4.6 . Leche reconstituida patrón : analice previamente varias muestras de leche en polvo de alta calidad . Para la preparación de la curva de calibración , tome la muestra que tenga el menor contenido en ácido láctico , menos de 30 mg de ácido láctico por 100 g de materias sólidas no lipídicas . Siga el modo de operación descrito en el punto 6.2.1 y en el 6.2.2 indicado a continuación .

5 . EQUIPO

5.1 . Balanza analítica .

5.2 . Espectrofotómetro que permita la lectura de una longitud de onda de 570 nm .

5.3 . Baño de agua a 30 ± 2 ° C .

5.4 . Mortero y maja .

5.5 . Papel de filtro ( Schleicher y Schull 595 , Whatman 1 o similar ) .

5.6 . Tubos de análisis pírex o similares ( dimensiones 25 × 150 mm ) .

Nota

Todos los instrumentos de vidrio que se utilicen han de estar perfectamente limpios y ser utilizados sólo para esta determinación . Antes del lavado , enjuague los instrumentos de cristal que contienen el precipitado con ácido clorhídrico concentrado .

6 . MODO DE OPERACIÓN

6.1 . Prueba simulada

Efectúe una prueba simulada vertiendo 30 ml de agua en un tubo graduado de 50 ml y tratándolo tal como se indica en los puntos 6.2.4 a 6.2.11 incluído . Si los resultados de la prueba simulada respecto al agua sobrepasan el equivalente a 20 mg de ácido láctico por 100 g de materias sólidas no lipídicas , habrá que controlar los reactivos y sustituir el ( o los ) reactivo(s) impuro(s) . Trate la prueba simulada simultáneamente con las muestras .

6.2 . Dosificación

Nota : Evite la contaminación por impurezas , como por la saliva y la transpiración .

6.2.1 . Determine el contenido en materias sólidas no lipídicas ( a ) de la muestra restando de 100 el contenido en materia grasa ( según el método 4 ) y el contenido en humedad ( según el método 2 ) .

6.2.2 . Pese 1 000/ ( ( a ) - 10 ) g de la muestra con una precisión de 0,1 g . Añada esta cantidad de muestra a 100 ml de agua y mezcle cuidadosamente .

6.2.3 . Pipetee 5 ml de la solución obtenida en un tubo graduado de 50 ml y diluya con agua hasta 30 ml .

6.2.4 . Añada lentamente y agitando , 5 ml de la solución de sulfato de cobre ( punto 4 ) y déjelo reposar durante 10 minutos .

6.2.5 . Añada lentamente y agitando 5 ml de la suspensión de hidróxido de calcio ( punto 4.2.1 ) o 10 ml de la suspensión de hidróxido ( punto 4.2.2 ) .

6.2.6 . Diluya en 50 ml con agua , agite vigorosamente , déjelo reposar durante 10 minutos y fíltrelo . Tire las primeras gotas de líquido filtrado .

6.2.7 . Pipetee 1 ml del líquido filtrado en un tubo de análisis ( punto 5.6 ) .

6.2.8 . Añada al contenido del tubo , sirviéndose de una bureta o de una pipeta graduada , 6 ml de la solución de ácido sulfúrico y de sulfato de cobre ( punto 4.3 ) . Mézclelo .

6.2.9 . Caliente en el baño de agua hirviendo durante 5 minutos . Enfrie a la temperatura ambiente bajo agua corriente .

6.2.10 . Añada 2 gotas de reactivo al p-hidroxidifenilo ( punto 4.4 ) y agite vigorosamente para repartir uniformemente el reactivo en todo el líquido . Sumerja todo en el baño de agua a 30 ± 2 ° C y manténgalo allí durante 15 minutos agitando de vez en cuando .

6.2.11 . Sumerja el tubo en el baño de agua hirviendo durante 90 segundos . Enfríelo a la temperatura ambiente bajo agua corriente .

6.2.12 . Mida la densidad óptica con respecto a la prueba simulada ( punto 6.1 ) tres horas más tarde , en la longitud de onda que se indica en el punto 5.2 .

6.2.13 . Si la densidad es superior a la del punto más alto de la curva de contraste , repita la prueba utilizando una dilución conveniente del líquido filtrado obtenido en el punto 6.2.6 .

6.3 . Elaboración de la curva de contraste

6.3.1 . Pipetee 5 ml de la leche reconstituida ( punto 4.6 ) en cinco cilindros graduados de 50 ml . Pipetee en estos tubos 0 , 1 , 2 , 3 y 4 ml de la solución patrón ( punto 4.5 ) , de manera que se obtenga una gama de contraste correspondiente a 0 , 20 , 40 , 60 y 80 mg de ácido láctico añadido por 100 g de materias sólidas no lipídicas de polvos de leche .

6.3.2 . Diluya con agua hasta unos 30 ml y trátelo como se indica en los puntos 6.2.4 a 6.2.11 incluído .

6.3.3 . Mida las densidades ópticas de los elementos de la gama del contraste ( punto 6.3.1 ) con respecto a la prueba simulada ( punto 6.1 ) , en la longitud de onda que se indica en el punto 5.2 . Traslade dichas densidades ópticas a un diagrama en función de las cantidades de ácido láctico indicadas en el punto 6.3.1 : 0 mg , 20 mg , 40 mg , 60 mg y 80 mg , por 100 g de materias sólidas no lipídicas . Trace la línea recta más adecuada que pase por los puntos y prepare la curva de contraste desplazando dicha línea paralelamente a ella misma de manera que pase por el origen .

7 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

7.1 . Modo de cálculo

Convierta la densidad óptica medida según el punto 6.2.12 ó 6.2.13 en mg de ácido láctico por 100 g de materias sólidas no lipídicas de la muestra remitiéndose a la curva de contraste . Multiplique este resultado por el factor de disolución en el caso que el líquido filtrado hubiera sido diluído según el punto 6.2.13 .

7.2 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de otra por el mismo analista y en las mismas condiciones sobre la misma muestra no podrá ser superior a 8 mg de ácido láctico por 100 gramos de materias sólidas no lipídicas en muestras con un contenido en ácido láctico de hasta 80 mg . En valores superiores , dicha diferencia no podrá ser superior al 10 % del valor más bajo .

MÉTODO 7 : DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA ( MÉTODO DE SANDERS Y SAGER , MODIFICADO )

1 . ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite determinar la actividad de la fosfatasa en los siguientes tipos de leche :

- leche en polvo rica en materia grasa ,

- leche en polvo ,

- leche semidesnatadaen polvo ,

- leche desnatada en polvo .

2 . DEFINICIÓN

La actividad de la fosfatasa de la leche en polvo se mide por la cantidad de fosfatasa alcalina activa presente . Se expresa por la cantidad de fenol liberado en µg por ml de leche reconstituida , determinada por el procedimiento que se indica a continuación .

3 . PRINCIPIO DEL MÉTODO

La actividad de la fosfatasa de la leche en polvo se determina por el poder de la fosfatasa de liberar el fenol del fenilfosfato disódico . La cantidad de fenol liberado en las condiciones prescritas se determina mediante una medición espectofotométrica de la coloración desarrollada gracias al reactivo de Gibbs .

4 . REACTIVOS

4.1 . Solución A

Tampón de borato y de hidróxido de bario : pH 10,6 ± 0,1 a 20 ° C .

Disolver 25,0 g de hidróxido de bario [ BA (OH)2 · 8H2O ] en agua y diluir hasta 500 ml .

Disolver 11,0 g de ácido bórico ( H3BO3 ) en agua y diluir hasta 500 ml .

Calentar las dos soluciones a una temperatura de 50 ° C y mezclar .

Agitar y enfriar la mezcla a la temperatura ambiente .

Ajustar el pH a 10,6 ± 0,1 con la solución de hidróxido de bario y filtrar .

Conservar la solución en un recipiente bien cerrado .

Antes de utilización , diluir la solución tampón con la misma cantidad de agua .

4.2 . Solución B

Tampón para el desarrollo del color .

Disolver 6 g de metaborato de sodio ( NaBO2 ) ( o 12,6 g de NaBO2 · 4H2O ) y 20 g de cloruro de sodio ( NaCl ) en agua y diluir hasta 1 000 ml .

4.3 . Solución C

Substrato en solución tampón .

4.3.1 . Disolver 0,5 g de fenilfosfato disódico ( Na2C6H3PO4 - 2H2O ) en 4,5 ml de solución B ( punto 4.2 ) . Añadir dos gotas de solución E ( punto 4.5 ) y dejar reposar durante 30 minutos . Extraer el color formado con 2,5 ml de alcohol butílico ( punto 4.10 ) . Si fuera necesario , repetir la extracción del color . Tras separación , tirar el alcohol butílico . Esta solución se puede conservar algunos días en un refrigerador . Desarrollar y extraer el color una vez más antes de su empleo :

4.3.2 . Pipetear 1 ml de esta solución en un matraz graduado de 100 ml y añadir la solución A hasta la marca . Preparar el substrato en solución tampón inmediatamente antes de su empleo .

4.4 . Solución D

Precipitante

Disolver 3,0 g de sulfato de cinc ( ZnSO4 · 7H2O ) y 0,6 g de sulfato de cobre II ( CuSO4 · 5H2O ) en agua hasta alcanzar 100 ml .

4.5 . Solución E

Reactivo de Gibbs .

Disolver 0,040 g de dibromo-2,6 quinona cloro-1,4 ímido ( O · C6H2Br2 · NCl ) en 10 ml de etanol a 96 % . Conservar la solución en un frasco de vidrio ahumado en un refrigerador . Tirar este reactivo cuando cambie en color .

4.6 . Solución tampón de disolución de la coloración

Diluir 10 ml de la solución tampón B para el desarrollo del color ( punto 4.2 ) con agua y completar hasta 100 ml .

4.7 . Solución de sulfato de cobre

Disolver 0,05 g de sulfato de cobre ( II ) ( CuSO4 · 5H2O ) en agua y completar hasta 100 ml .

4.8 . Solución patrón de fenol

Disolver 0,200 ± 0,001 g de fenol puro en agua y llegar hasta 100 ml en un matraz graduado . Esta solución se conserva durante algunos meses en refrigerador . Diluir 10 ml de esta solución con agua hasta llegar a 100 ml . Esta solución diluída contiene 200 µg de fenol por ml y se puede utilizar para la preparación de soluciones más diluidas .

4.9 . Agua destilada , hervida .

4.10 . Alcohol n-butílico .

5 . EQUIPO

5.1 . Balanza analítica

5.2 . Baño de agua mantenido por termostato a 37 ± 1 ° C .

5.3 . Espectrofotómetro que permita la lectura en longitud de onda de 610 nm .

5.4 . Papel de filtro ( Schleicher y Schull 597 , Whatman 42 o similar ) .

5.5 . Baño de agua hirviendo .

5.6 . Hoja de aluminio .

6 . MODO DE OPERACIÓN

Precauciones a tomar

1 . Evitar la exposición directa a la luz del sol .

2 . Limpiar perfectamente todos los instrumentos de vidrio , tapones y materiales de transvase . Se recomienda enjuagarlos y hervirlos con agua o tratarlos al vapor .

3 . Evitar el empleo de materias plásticas ( tapones por ejemplo ) que pudieran contener fenol .

4 . Evitar cuidadosamente la presencia de saliva , dado que ésta contiene fosfatasa .

6.1 . Preparación de la muestra

6.1.1 . Disolver 10 g de la muestra , pesados con una precisión de 0,1 g , en 90 ml de agua . La temperatura de disolución de los polvos nunca será superior a 35 ° C .

6.2 . Determinación

6.2.1 . Introducir en cada uno de los dos tubos de análisis 1 ml de leche reconstituida preparada como se indica en el punto 6.1.1 .

6.2.2 . Calentar uno de los tubos en agua hirviendo durante 2 minutos . Cubrir el tubo y el baño de agua ( punto 5.5 ) o , por ejemplo , un recipiente cilíndrico de borde redondeado , con una hoja de aluminio ( punto 5.6 ) para que todo el tubo se caliente . Enfriar en agua fría a temperatura ambiente . Este tubo servirá para la prueba simulada . A partir de este punto , tratar los dos tubos de idéntica manera .

6.2.3 . Añadir 10 ml de la solución C ( punto 4.3.2 ) . Mezclar y colocar los tubos en el baño de agua a 37 ° C ( punto 5.2 ) .

6.2.4 . Incubar durante 60 minutos en el baño de agua , agitando de vez en cuando .

6.2.5 . Inmediatamente después , meter los tubos en el baño de agua hirviendo y calentar durante 2 minutos , enfriar a temperatura ambiente en agua fría .

6.2.6 . Añadir 1 ml de la solución D ( punto 4.4 ) , mezclar y filtrar en un papel de filtro seco ; tirar los primeros líquidos filtrados hasta obtener un líquido nítido .

6.2.7 . Introducir 5 ml de cada líquido filtrado en tubos de análisis , añadir 5 ml de solución B ( punto 4.2 ) y 0,1 ml de solución E ( punto 4.5 ) . Mezclar .

6.2.8 . Dejar que se precise el calor a temperatura ambiente y al abrigo de la luz solar durante 30 minutos .

6.2.9 . Medir la densidad óptica de la solución de la muestra con respecto a la de la prueba simulada en la longitud de onda indicada en el punto 5.3 .

6.2.10 . Repetir la determinación si la densidad óptica de la solución es superior a la de la solución patrón en 20 µg de fenol preparada según el punto 7 .

Si dicho límite es sobrepasado , diluir un volumen conveniente de leche reconstituida , según el punto 6.1.1 , con un volumen adecuado de esta leche cuidadosamente hervida , como se indica en el punto 6.2.2 , para inactivar la fosfatasa presente .

7 . PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CONTRASTE

7.1 . Pipetear en cuatro matraces de 100 ml , 1 , 3 , 5 y 10 ml de la solución patrón diluida según el punto 4.8 y completar hasta la marca con agua ; estas soluciones contienen respectivamente 2 , 6 , 10 y 20 µg de fenol por ml .

7.2 . Pipetear 1 ml de cada solución indicadora ( punto 7.1 ) en los tubos de análisis para obtener una serie de muestras conteniendo 0 ( valor cero ) , 2 , 6 , 10 y 20 µg de fenol . La simulación se obtiene pipeteando 1 ml de agua .

7.3 . Pipetear sucesivamente en cada tubo de análisis 1 ml de la solución de sulfato de cobre ( punto 4.7 ) , 5 ml de solución tampón coloreada ( punto 4.6 ) , 3 ml de agua y 0,1 ml de la solución E ( punto 4.5 ) ; mezclar .

7.4 . Dejar reposar los tubos de análisis a temperatura ambiente y al abrigo de la luz solar directa durante 30 minutos .

7.5 . Medir la densidad óptica del contenido de los tubos con respecto al valor cero , en la longitud de onda indicada en el punto 5.3 .

7.6 . Establecer la curva de contraste anotando los valores de las densidades ópticas en función de las cantidades de fenol en µg tal como están indicadas en el punto 7.2 .

8 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

8.1 . Modo de cálculo

8.1.1 . Convertir la cifra obtenida en el punto 6.2.9 en µg de fenol , basándose en la curva de contraste .

8.1.2 . Calcular la actividad de la fosfatasa expresada en µg de fenol por ml de leche reconstituida según la fórmula siguiente :

actividad de la fosfatasa = 2,4 × P

en donde P = cantidad de fenol en µg tras el punto 8.1.1 .

8.1.3 . Si hubiera sido necesario diluir como se indicó en el punto 6.2.10 , multiplíquese el resultado obtenido en el punto 8.1.2 por el factor de disolución .

8.2 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de otra por el mismo analista sobre la misma muestra y en las mismas condiciones , no podrá ser superior a 2 µg de fenol liberado por ml de leche reconstituida .

MÉTODO 8 : DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA ( MÉTODO ASCHAFFENBURG Y MULLEN )

1 . ÁMBITO DE APLICACIÓN

El presente método permite determinar la actividad de la fosfatasa en los siguientes tipos de leche :

- leche en polvo rica en materia grasa ,

- leche en polvo ,

- leche semidesnatada en polvo ,

- leche desnatada en polvo .

2 . DEFINICIÓN

La actividad de la fosfatasa de la leche deshidratada se mide por la cantidad de fosfatasa alcalina activa presente en el producto . Se expresa en cantidad de p-nitrofenol liberado en µg por ml de leche reconstituida , determinada por el procedimiento que se explica a continuación .

3 . PRINCIPIO DEL MÉTODO

La muestra de leche reconstituida se diluye en substrato en solución tampón ( pH 10,2 ) y se incuba durante 2 horas a una temperatura de 37 ° C . Toda cantidad de fosfatasa alcalina presente en la muestra liberará , en semejantes condiciones , p-nitrofenol derivado del p-nitrofenilfosfato disódico , el p-nitrofenol liberado se mide mediante comparación directa con cristales de color patrones en un calorímetro simple de luz reflejada .

4 . REACTIVOS

4.1 . Solución tampón de carbonato de sodio y de bicarbonato de sodio .

Disolver 3,5 g de carbonato de sodio anhidro y 1,5 g de bicarbonato de sodio en agua y diluir hasta 1 000 ml en un matraz graduado .

4.2 . Substrato en solución tampón

Disolver 1,5 g de p-nitrofenilfosfato disódico en la solución tampón de carbonato de sodio y de bicarbonato de sodio ( punto 4.1 ) y diluir hasta 1 000 ml en un matraz graduado .

Esta solución se mantiene estable durante un mes en el refrigerador ( * 4 ° C ) pero habrá que efectuar antes un test de control de color en las soluciones conservadas de esta forma ( ver punto 6 , nota 3 ) .

4.3 . Precipitantes .

4.3.1 . Sulfato de cinc .

Disolver 30,0 g de sulfato de cinc ( ZnSO4 ) en agua y completar hasta 100 ml en un matraz graduado .

4.3.2 . Hexacianoferrato ( II ) de potasio en solución .

Disolver 17,2 g de hexacianoferrato ( II ) de potasio trihidratado ( K4Fe(CN)6 · 3H2O ) en agua y completar hasta 100 ml en un matraz graduado .

5 . EQUIPO

5.1 . Balanza analítica .

5.2 . Baño de agua a 37 ° ± 1 ° C , controlado por termostato .

5.3 . Comparador colorimétrico , con disco especial conteniendo cristales de color patrones calibrados en µg de p-nitrofenol por ml de leche y dos células de 25 mm cada una .

6 . MODO DE OPERACIÓN

Precauciones a observar

1 . Tras su utilización , vaciar los tubos , enjuagarlos con agua , lavarlos con agua caliente con un detergente alcalino , enjuagarlos cuidadosamente luego con agua del grifo caliente y clara . Finalmente , enjuagarlos con agua ; secarlos antes de su empleo .

Las pipetas han de enjuagarse a fondo con agua del grifo clara y fría inmediatamente después de su utilización ; enjuagarlas con agua y secarlas antes de su empleo .

2 . Los tapones de los tubos de análisis han de ser enjuagados cuidadosamente con agua del grifo caliente inmediatamente después de su utilización ; posteriormente hay que hervirlos en agua durante 2 minutos .

3 . El substrato en solución tampón ( punto 4.2 ) se puede conservar estable durante 1 mes , como mínimo , en el refrigerador a una temperatura de * 4 ° C . Toda inestabilidad se traduce por una formación de un color amarillo . Dado que la prueba siempre se de con respecto a un control del producto hervido que contiene el mismo substrato en solución tampón , se recomienda se utilice únicamente este substrato cuando el color indique un exceso de 10 µg , efectuándose la lectura en una célula de 25 mm en el colorímetro y utilizando agua destilada en la otra célula de 25 mm .

4 . Utilizar una pipeta para cada muestra y evitar la contaminación por la saliva .

5 . Evitar en todo momento la exposición directa a la luz solar .

6.1 . Preparación de la muestra

Disolver 10 g de polvos en 90 ml de agua . La temperatura de disolución no ha de exceder los 35 ° C .

6.2 . Determinación

6.2.1 . Pipetear 15 ml del substrato en solución tampón ( punto 4.2 ) en un tubo de análisis limpio y seco , luego 2 ml de la muestra de leche reconstituida ( punto 6.1 ) a analizar . Cerrar el tubo con un tampón , mezclar dando vueltas al tubo y colocarlo en un baño de agua a 37 ° C ( punto 5.2 ) .

6.2.2 . Colocar simultáneamente en el baño de agua un tubo de control conteniendo 15 ml de substrato en solución tampón y 2 ml de muestra de leche reconstituida hervida del mismo tipo que la del análisis .

6.2.3 . Sacar los dos tubos del baño de agua al cabo de 2 horas , añadir 0,5 ml de precipitante de sulfato de cinc ( punto 4.3.1 ) , poner de nuevo el tapón , agitar vigorosamente y dejar reposar durante 3 minutos . Añadir 0,5 ml de precipitante de hexaferrocianuro ( II ) de potasio ( punto 4.3.2 ) ; mezclar intimamente y filtrar en papel plegado ( punto 5.4 ) ; recoger el líquido filtrado nítido en el tubo de análisis limpio .

6.2.4 . Transvasar el líquido filtrado a una célula de 25 mm y comparar con respecto al líquido filtrado de la muestra de control hervida en el colorímetro , utilizando el disco especial ( punto 5.3 ) .

7 . EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

7.1 . Modo de cálculo

La lectura directa obtenida según el punto 6.2.4 se expresa en µg de p-nitrofenol por ml de muestra o por ml de muestra de leche reconstituida .

7.2 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de otra por el mismo analista sobre la misma muestra y en las mismas condiciones , ha de ser inferior a 2 µg de p-nitrofenol liberado por ml de leche reconstituida .