REGLAMENTO ( CEE ) N º 2188/81 DE LA COMISIÓN

de 28 de julio de 1981

por el que se modifica el Reglamento ( CEE ) n º 625/78 relativo a las modalidades del almacenamiento público de la leche desnatada en polvo

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Visto el Reglamento ( CEE ) n º 804/68 del Consejo , de 27 de junio de 1968 , sobre organización común de mercado en el sector de la leche y de los productos lácteos (1) , modificado en último lugar por el Acto de adhesión de Grecia , y , en particular , el apartado 5 de su artículo 7 ,

Considerando que , en el Anexo I del Reglamento ( CEE ) n º 625/78 de la Comisión (2) , modificado en último lugar por el Reglamento ( CEE ) n º 2937/80 (3) , por el que se definen las condiciones de calidad a las que debe responder la leche desnatada en polvo para ser ofertada a la intervención , figuran en particular determinadas prescripciones relativas a los procedimientos de análisis para la detección del suero de leche mediante la determinación de determinados componentes en la leche desnatada en polvo ; que la nota 2 de dicho Anexo ha previsto la determinación de valores límites comunitarios que deben tenerse en cuenta para los mencionados componentes , después de un determinado período de experimentación en los Estados miembros ;

Considerando que en el momento presente resulta posible establecer , a nivel comunitario , un método de análisis que permita la determinación del suero de leche en polvo en la leche desnatada en polvo por medio de la determinación del ácido siálico libre ; que , sin embargo , no resulta conveniente hacer obligatorio dicho método hasta después de que transcurra un determinado período de tiempo destinado a familiarizar a los organismos de control y a los operadores con este procedimiento analítico ;

Considerando que las medidas previstas en el presente Reglamento concuerdan con el dictamen del Comité de gestión de la leche y de los productos lácteos ,

HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO :

Artículo 1

1 . El Anexo del Reglamento ( CEE ) n º 625/78 se modificará como sigue :

a ) en el punto 2 letra b ) , el texto del segundo guión se sustituirá por el texto siguiente :

« - suero de leche :

determinación del ácido siálico libre (2) y/o del complejo cisteinacistina en la medida en que una de las tres pruebas obligatorias , por lo menos , a saber , la de los glucomacropéptidos del suero de leche ( determinados por una prueba simplificada ) , la de los lactatos o las de las cenizas , sea superior al 3 % , a 150 mg/100 g y al 8 % respectivamente » ;

b ) el texto de la nota 2 se sustituirá por el texto siguiente :

« (2) En lo referente a la presencia del suero de leche en polvo mediante la determinación del ácido siálico libre , el método de análisis aplicable a partir del 1 de enero de 1982 será el que se determina en el Anexo IV . »

2 . El Anexo del presente Reglamento se añadirá como Anexo IV al Reglamento ( CEE ) n º 625/78 .

Artículo 2

El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas .

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro .

Hecho en Bruselas , el 28 de julio de 1981 .

Por la Comisión

El Presidente

Gaston THORN

(1) DO n º L 148 de 28 . 6 . 1968 , p. 13 .

(2) DO n º L 84 de 31 . 3 . 1978 , p. 19 .

(3) DO n º L 305 de 14 . 11 . 1980 , p. 13 .

ANEXO

« ANEXO IV

PRESENCIA DEL SUERO DE LECHE EN POLVO EN LA LECHE DESNATADA EN POLVO DESTINADA AL ALMACENAMIENTO PÚBLICO MEDIANTE LA DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO SIÁLICO LIBRE

1 . Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite la determinación del suero de leche en polvo en la leche desnatada en polvo destinada al almacenamiento público .

2 . Principio del método

En el momento de la coagulación de la leche bajo la acción del cuajo , son liberados glucomacropéptidos de la caseina con un alto contenido en ácido siálico . La determinación del ácido siálico ( ácido N-acetilneuramínico ) permite establecer la presencia eventual de suero de leche en polvo en la leche desnatada en polvo . Después de la reconstitución de la leche , los glucomacropéptidos que contienen el ácido siálico son precipitados por el ácido fosfotúngstico a partir de un filtrado tricloroacético al 12 % . El ácido siálico liberado por hidrólisis ácida forma , con el resorcinol , un complejo coloreado medio por espectrofotometría a 580 nm .

3 . Reactivos

Todos los reactivos deben ser de una pureza analítica . El agua debe ser destilada o desionizada .

3.1 . Solución de ácido tricloroacético ( TCA )

Disolver 240 g de ácido tricloroacético en agua y completar a 1 000 ml .

3.2 . Solución de ácido fosfotúngstico

Disolver 20 g de ácido fosfotúngstico en agua y completar a 100 ml .

3.3 . Etanol del 95 % ( v/v )

3.4 . Solución de ácido sulfúrico aproximadamente 0,1 N

Diluir 28,1 ml de ácido sulfúrico concentrado ( 95 % de H2SO4 ) en agua y completar a 1 000 ml para obtener una solución de ácido sulfúrico 1 N . Diluir 100 ml de ácido sulfúrico 1 N en agua y completar a 1 000 ml para obtener una solución de ácido sulfúrico 0,1 N .

3.5 . Tampón acetato , pH 4,8

Disolver 19,7 g de acetato de sodio anhidro en agua , añadir 9 ml de ácido acético glacial y completar a 1 000 ml con agua . Comprobar y ajustar eventualmente el pH .

3.6 . Solución de sulfato de cobre 0,1 M

Disolver 2,497 g de sulfato de cobre ( CuSO4 · 5H2O ) en agua y completar a 100 ml .

3.7 . Solución de resorcina al 2 %

Disolver 2 g de resorcina en agua y completar a 100 ml . Esta solución puede conservarse 4 meses a 5-8 ° C

3.8 . Reactivo al resorcinol

Mezclar 10 ml de solución de resorcina ( 3.7 ) , 80 ml de ácido clorhídrico concentrado ( d20 ° C = 1,19 g/l ) y 0,25 ml de solución de sulfato de cobre ( 3.6 ) y completar a 100 ml con agua . Preparar esta solución el día de su utilización .

3.9 . Alcohol isoamílico

3.10 . Solución de ácido N-acetilneuramínico ( ácido siálico )

Disolver 20 mg de ácido N-acetilneuramínico en agua y completar a 100 ml . Esta solución no puede conservarse más de una semana a + 4 ° C .

4 . Material

4.1 . Balanza analítica .

4.2 . Agitador magnético , barras magnéticas revestidas de teflón de 2 cm de largo .

4.3 . pHmetro .

4.4 . Centrifugadora que permita alcanzar una fuerza centrífuga de 3 000 g .

4.5 . Tubos para centrifugar de una capacidad aproximada de 75 ml .

4.6 . Baño de agua con termostato regulable a 80 ° C .

4.7 . Baño de agua hirviendo .

4.8 . Filtros de 125 mm de diámetro ( Schleicher y Schuell n º 589 (2) , tipo « Weissband » o de calidad equivalente ) .

4.9 . Embudos de vidrio , de un diámetro aproximado de 7 cm .

4.10 . Copas de vidrio de 100 y 150 ml .

4.11 . Matraces graduados de 50 , 100 y 1 000 ml .

4.12 . Tubos de ensayo de tapón roscado de una capacidad de 10 ml .

4.13 . Espectrofotómetro .

4.14 . Cubetas de vidrio para espectrofotómetro ( 4.13 ) , trayecto óptico 10 mm .

4.15 . Pipetas graduadas de 1 , 2 , 5 , 10 , 20 , 25 y 50 ml .

4.16 . Varillas de vidrio .

4.17 . Estufa con termostato a 35 ° C .

5 . Preparación de la muestra

La muestra , después de homogeneizada , será examinada según las indicaciones previstas en los puntos 6 y siguientes .

6 . Modo de operar

6.1 . Aislamiento del ácido siálico libre .

6.1.1 . Pesar 5 ± 0,005 g de leche desnatada en polvo en una copa de vidrio de 150 ml .

Añadir 50 ml de agua . Mezclar bien por agitación magnética ( 4.2 ) hasta la completa disolución .

Añadir lentamente , siguiendo la agitación , 50 ml de la solución de ácido tricloroacético ( 3.1 ) .

Dejar reposar 30 minutos ( a temperatura ambiente ) .

6.1.2 . Agitar y después filtrar inmediatamente ( 4.8 ) .

6.1.3 . Introducir en un tubo para centrifugar ( 4.5 ) 50 ml de filtrado tomados en los 60 minutos siguientes al comienzo de la filtración .

Añadir 1 ml de ácido fosfotúngstico ( 3.2 ) . Homogeneizar por agitación y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente . Centrifugar a 3 000 g durante 10 minutos .

6.1.4 . Eliminar el sobrenadante . Lavar 2 veces el sedimento con 5 ml de etanol ( 3.3 ) teniendo cuidado de ponerlo en suspensión con ayuda de un agitador magnético o de una varilla de vidrio ( 4.16 ) . ( En este último caso , introducir 2 ml de etanol para la puesta en suspensión y enjuagar la varilla con ayuda de los 3 ml de etanol restantes ) . Centrifugar cada vez a 3 000 g durante 10 minutos .

Dejar secar el sedimento así obtenido durante una noche a temperatura ambiente o durante 90 minutos a 35 ° C .

6.1.5 . Añadir 4 ml de ácido sulfúrico 0,1 N ( 3.4 ) al sedimento seco y agitar para ponerlo en suspensión .

Tapar los tubos para centrifugar y colocarlos durante 40 minutos en un baño de agua a 80 ° C agitándolos de vez en cuando para asegurar una buena dispersión . Enfriar a temperatura ambiente y añadir 4 ml de tampón acetato ( 3.5 ) . Mezclar cuidadosamente .

6.1.6 . Centrifugar 10 minutos a 3 000 g . La determinación del ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico se efectúa en el sobrenadante .

6.2 . Determinación espectrofotométrica del ácido siálico libre .

6.2.1 . Introducir 2 ml de sobrenadante en un tubo de ensayo ( 4.12 ) y añadir 2 ml de reactivo al resorcinol ( 3.8 ) .

6.2.2 . Tapar los tubos , mezclar cuidadosamente el contenido , colocar los tubos durante 15 minutos exactos en un baño de agua a 100 ° C ( 4.7 ) .

Enfriar a temperatura ambiente , bajo chorro de agua .

6.2.3 . Añadir 5 ml de alcohol isoamílico ( 3.9 ) , tapar y mezclar cuidadosamente el contenido agitando enérgicamente los tubos y después colocarlos 15 minutos en un baño de agua helada .

6.2.4 . Centrifugar a 1 000 g durante 2 minutos para separar debidamente las dos fases .

6.2.5 . Introducir aproximadamente 3 ml de la capa superior ( fase alcohólica ) en una cubeta de vidrio y medir la extinción a 580 mm por comparación con la prueba en blanco en los 30 minutos siguientes a la retirada de los tubos del baño de agua helada .

6.3 . Prueba en blanco .

Preparar una prueba en blanco de conformidad con los puntos 6.2.1 . a 6.2.5 . utilizando 1 ml de solución de ácido sulfúrico 0,1 N ( 3.4 ) y 1 ml de tampón acetato ( 3.5 ) en lugar de 2 ml de filtrado como se prevé en el punto 6.2.1 .

6.4 . Curva patrón .

6.4.1 . Introducir exactamente 0-2-5-10-20 y 30 ml de la solución ( 3.10 ) correspondiente a 0-0,4-1-2-4-6 mg de ácido siálico siálico , en matraces graduados de 50 ml de capacidad , completar a 50 ml con la solución de ácido sulfúrico 0,1 N ( 3.4 ) y mezclar bien .

6.4.2 . Introducir 1 ml de contenido de cada matraz graduado en un tubo de ensayo ( 4.12 ) . Añadir 1 ml de tampón acetato ( 3.5 ) , para obtener una serie de soluciones testigo conteniendo 0 ( valor cero ) , 8 , 20 , 40 , 80 , 120 microgramos de ácido siálico . Una vez bien mezclados , proceder a la determinación de conformidad con los puntos 6.2.2 a 6.2.5 .

6.4.3 . Para establecer la curva de contraste , llevar sobre un gráfico las extinciones obtenidas en el punto 6.4.2 y las cantidades de ácido siálico correspondientes en microgramos indicados en el punto 6.4.2 .

7 . Expresión de los resultados

7.1 . Modo de cálculo

Calcular el contenido en ácido siálico , expresado en microgramos por gramo , según la fórmula siguiente :

C · 8/E

en la que C representa la masa de ácido siálico en microgramos , leída en la curva de contraste correspondiente a la medida de extinción obtenida en el punto 6.2.5 y E es la masa de la toma de ensayo ( 6.1.1 ) en gramos . Expresar el resultado al microgramo .

7.2 . Fiabilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o rápidamente una después de otra por el mismo analista no debe exceder en un 5 % de la media aritmética de los resultados .

8 . Interpretación de los resultados

Este método permite cuantificar la presencia eventual de suero de leche en la leche desnatada en polvo .

8.1 . Cálculo del valor medio de ácido siálico libre en microgramos por gramo de muestra , referido a su contenido en proteínas expresado en porcentaje ( m/m )

Y = 40 + 3 (X - 34)2

siendo :

40 el contenido medio en ácido siálico en microgramos por gramo para una leche desnatada en polvo que contenga al menos un 34 % de proteínas ,

X , por acuerdo , el contenido en proteínas totales , determinado según el método Kjeldahl FIL IDF 20 : 1962 .

8.2 . Cálculo del porcentaje de suero de leche en polvo eventualmente presente

% suero de leche = Z - Y/10

siendo :

Z el contenido en ácido siálico de la muestra determinado en el punto 7.1 en microgramos por gramo ,

Y el contenido medio en ácido siálico libre de la muestra calculado en el punto 8.1 ,

10 representa , por convenio , el contenido en ácido siálico libre expresado en microgramos , de un gramo de suero de leche en polvo .

8.3 . Debido a los errores inherentes al método y a las variaciones naturales de composición de la muestra , se puede llegar a la conclusión definitiva de ausencia de suero de leche cuando el valor obtenido en el punto 8.2 sea inferior o igual a 2,0 .

En el caso de un valor superior , la conclusión sobre la presencia de suero de leche será afirmativa . La misma se cuantifica según la fórmula dada en el punto 8.2 . »