6)

Se añaden los siguientes capítulos C.31 a C.46: « C.31. ENSAYO CON PLANTAS TERRESTRES: ENSAYO DE EMERGENCIA Y CRECIMIENTO DE PLÁNTULAS INTRODUCCIÓN 1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 208 (2006). Los métodos de ensayo se revisan periódicamente en función de los avances científicos y de su aplicabilidad con fines reglamentarios. La presente actualización del método de ensayo está diseñada para evaluar los efectos potenciales de las sustancias sobre la emergencia y el crecimiento de plántulas. Sin embargo, no cubre los efectos crónicos ni los efectos sobre la función reproductora (es decir, semillas, formación de las flores, maduración de los frutos). Deben considerarse las condiciones de exposición y las propiedades de la sustancia problema, a fin de garantizar que se utilizan los métodos de ensayo apropiados (por ejemplo, cuando se estudian metales o compuestos metálicos, deben considerarse los efectos del pH y los contra-iones asociados) (1). Este método de ensayo no se ocupa de las plantas expuestas a vapores de las sustancias. El método de ensayo es aplicable a los ensayos de sustancias y mezclas en general, biocidas y productos fitosanitarios (también conocidos como plaguicidas o pesticidas). Se ha desarrollado sobre la base de métodos existentes (2) (3) (4) (5) (6) (7). También se han tenido en cuenta otras referencias pertinentes para los ensayos con plantas (8) (9) (10). En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas. PRINCIPIO DEL ENSAYO 2. El ensayo evalúa los efectos sobre la emergencia y el crecimiento inicial de las plántulas de vegetales superiores tras su exposición a la sustancia problema en el suelo (u otra matriz de suelo adecuada). Las semillas se ponen en contacto con suelo que se ha tratado con la sustancia problema y se evalúan los efectos que presenten después de, generalmente, entre 14 y 21 días tras la emergencia del 50 % de las plántulas del grupo de control. Los parámetros medidos son la evaluación visual de la emergencia de plántulas, el peso seco de los brotes (o el peso fresco de los brotes) y, en algunos casos, la altura de los brotes, así como una evaluación de los efectos nocivos sobre diferentes partes de la planta. Estas mediciones y observaciones se comparan con las de las plantas de control sin tratar. 3. En función de la vía de exposición prevista, la sustancia problema se incorpora al suelo (o bien a una matriz de suelo artificial) o se aplica a la superficie del suelo, de forma que se represente adecuadamente la posible vía de exposición a la sustancia. La incorporación al suelo se realiza por tratamiento de suelo bruto. Después de la aplicación, el suelo se transfiere a macetas y, a continuación, se siembran en el suelo semillas de la especie vegetal seleccionada. Las aplicaciones en superficie se hacen con suelo en macetas en el que ya se han sembrado las semillas. Las unidades de ensayo (controles y suelos tratados más semillas) se colocan entonces en condiciones adecuadas que permitan la germinación o el crecimiento de las plantas. 4. El ensayo puede efectuarse con el fin de determinar la curva dosis-respuesta, o a una sola concentración/tasa como ensayo límite, en función del objetivo del estudio. Si los resultados del ensayo a concentración/tasa única superan un determinado nivel de toxicidad (por ejemplo, si se observan efectos superiores a un x %), se lleva a cabo un ensayo de determinación del intervalo para establecer los límites inferior y superior de toxicidad, seguido de un ensayo a concentración/tasa múltiple para generar una curva dosis-respuesta. Se efectúa un análisis estadístico apropiado para obtener una concentración con efecto x ECx o una tasa de aplicación con efecto x ERx (p. ej., EC25, ER25, EC50, ER50) en relación con el parámetro o parámetros de interés más sensibles. Asimismo, en esta prueba pueden calcularse la concentración sin efecto observado (NOEC) y la concentración mínima con efecto observado (LOEC). INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 5. La siguiente información es útil para la identificación de la vía prevista de exposición a la sustancia y para el diseño del ensayo: fórmula estructural, pureza, hidrosolubilidad, solubilidad en disolventes orgánicos, coeficiente de reparto 1-octanol/agua, comportamiento de sorción del suelo, presión de vapor, estabilidad de la sustancia en el agua y a la luz, y biodegradabilidad. VALIDEZ DEL ENSAYO 6. Para que el ensayo se considere válido, los controles deben cumplir los criterios de comportamiento siguientes: — la emergencia de las plántulas es de al menos un 70 %; — las plántulas no presentan efectos fitotóxicos visibles (p. ej., clorosis, necrosis, marchitamiento, deformaciones de las hojas y tallos) y las plantas presentan solo variaciones en el crecimiento y morfología que son normales para la especie concreta de que se trate; — la supervivencia media de las plántulas de control emergidas es de al menos el 90 % a lo largo de todo el estudio; — las condiciones ambientales de una determinada especie son idénticas y los medios de cultivo contienen la misma cantidad de matriz de suelo, medio de apoyo, o sustrato de la misma fuente. SUSTANCIA DE REFERENCIA 7. Puede someterse a ensayo una sustancia de referencia a intervalos regulares, con el fin de comprobar que el comportamiento del ensayo y la respuesta de las plantas concretas del ensayo, así como las condiciones de ensayo no han cambiado de forma significativa a lo largo del tiempo. Los datos anteriores de biomasa o de crecimiento de los controles pueden utilizarse también para evaluar el comportamiento del sistema de ensayo en laboratorios concretos, y pueden constituir una medida de control de la calidad intralaboratorio. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO Suelo natural — sustrato artificial 8. Se pueden cultivar las plantas en macetas con suelo de limo arenoso, de arena limosa, o de limo arenoso y arcilloso, que contenga hasta un 1,5 % de carbono orgánico (alrededor del 3 % de materia orgánica). También puede utilizarse tierra comercial para macetas o mezcla de suelo sintético que contenga hasta un 1,5 % de carbono orgánico. No deben utilizarse suelos arcillosos si se sabe que la sustancia problema tiene elevada afinidad por la arcilla. El suelo de campo debe pasarse por un tamiz de 2 mm de luz para homogeneizarlo y eliminar las partículas gruesas. Deben indicarse el tipo y la textura, el porcentaje de carbono orgánico, el pH y el contenido de sal, así como la conductividad electrónica del suelo preparado final. El suelo debe clasificarse con arreglo a un sistema de clasificación normal (11). El suelo puede pasteurizarse o someterse a tratamiento térmico para reducir el efecto de los patógenos del suelo. 9. El suelo natural puede complicar la interpretación de los resultados y aumentar la variabilidad debido a su diversidad de propiedades físicas y químicas y de poblaciones microbianas. Estas variables, a su vez, alteran la capacidad de retención de humedad, la capacidad de formar enlaces químicos, la aireación y el contenido de nutrientes y de oligoelementos. Además de las variaciones de estos factores físicos, también habrá variaciones en sus propiedades químicas, tales como el pH y el potencial redox, lo que puede afectar a la biodisponibilidad de la sustancia problema (12) (13) (14). 10. Los sustratos artificiales no se emplean normalmente para los ensayos de productos fitosanitarios, pero pueden ser de utilidad para los ensayos de sustancias o mezclas en general o cuando se desee reducir al mínimo la variabilidad de los suelos naturales y aumentar la comparabilidad de los resultados de los ensayos. Los sustratos utilizados deben estar compuestos de materiales inertes que minimicen la interacción con la sustancia problema, con el vehículo disolvente, o con ambos. Se ha visto que la arena de cuarzo lavada con ácido, la lana mineral y las perlas de vidrio (por ejemplo, de 0,35 a 0,85 mm de diámetro) son materiales inertes adecuados que absorben mínimamente la sustancia problema (15), garantizando así un máximo de disponibilidad de la sustancia para las plántulas a través de la absorción radicular. Entre los sustratos inadecuados figuran la vermiculita, la perlita y otros materiales muy absorbentes. Deben facilitarse nutrientes para el crecimiento vegetal, a fin de asegurarse de que las plantas no sufren deficiencias nutricionales, y, siempre que sea posible, este aspecto debe evaluarse mediante análisis químico o por examen visual de las plantas de control. Criterios de selección de las especies de ensayo 11. Las especies seleccionadas deben ser suficientemente amplias, p. ej., teniendo en cuenta su diversidad taxonómica en el reino vegetal, su distribución, abundancia, las características del ciclo de vida específico de la especie y la región de presencia natural, a fin de desarrollar una gama de respuestas (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Para la selección deben tenerse en cuenta las siguientes características de las posibles especies de ensayo: — las especies tienen semillas uniformes que están fácilmente disponibles a partir de fuentes normales fiables y que presentan una germinación regular, fiable y homogénea, y las plántulas tienen un crecimiento uniforme; — las plantas son aptas para el ensayo en laboratorio, y pueden dar resultados fiables y reproducibles, tanto dentro de una misma instalación como en una serie de instalaciones; — la sensibilidad de las especies sometidas a ensayo debe ser coherente con las respuestas de las plantas observadas en el medio ambiente expuestas a la sustancia; — se han utilizado en cierta medida en ensayos anteriores de toxicidad y su utilización en, por ejemplo, bioensayos de herbicidas, detección de metales pesados, pruebas de resistencia a la salinidad o a los minerales, o estudios de alelopatía indica sensibilidad a una gran variedad de factores de estrés; — son compatibles con las condiciones de cultivo del método de ensayo; — cumplen los criterios de validez del ensayo. Algunas de las especies de ensayo más utilizadas a lo largo del tiempo se recogen en el apéndice 2, y el apéndice 3 muestra posibles especies no cultivadas. 12. El número de especies que se ha de someter a ensayo depende de los requisitos normativos correspondientes, por lo que no se especifica en el presente método de ensayo. Aplicación de la sustancia problema 13. La sustancia debe aplicarse en un vehículo adecuado (por ejemplo, agua, acetona, etanol, polietilenglicol, goma arábiga, arena). También pueden someterse a ensayo las mezclas (productos formulados o formulaciones) que contienen principios activos y varios coadyuvantes. Incorporación al suelo o al sustrato artificial 14. Las sustancias que son hidrosolubles o se suspenden en agua pueden añadirse al agua y, a continuación, la solución se mezcla con el suelo, mediante un dispositivo de mezcla. Este tipo de ensayo puede ser adecuado si la exposición a la sustancia se hace a través del suelo o del agua intersticial del suelo y cuando hay riesgo de absorción radicular. La adición de la sustancia problema no debe superar la capacidad de retención de humedad del suelo. El volumen de agua añadida debe ser el mismo para cada concentración de ensayo, pero debe limitarse para evitar que el suelo se aglutine en agregados. 15. Las sustancias con poca hidrosolubilidad han de disolverse en un disolvente volátil adecuado (p. ej., acetona, etanol), y mezclarse con arena. El disolvente puede eliminarse de la arena a continuación con una corriente de aire al tiempo que se remueve continuamente la arena. La arena tratada se mezcla con el suelo experimental. Se establece un segundo control que solo recibe arena y disolvente. Se añaden a todos los niveles de tratamiento y al segundo control las mismas cantidades de arena, con disolvente mezclado y eliminado. En el caso de sustancias problema sólidas insolubles, se mezclan la sustancia y el suelo seco en un mezclador adecuado. A continuación se añade el suelo a las macetas y se siembran las semillas de forma inmediata. 16. Cuando se utiliza un sustrato artificial en lugar de suelo, las sustancias hidrosolubles pueden disolverse en la solución de nutrientes justo antes del inicio del ensayo. Las sustancias que no son hidrosolubles, pero que pueden suspenderse en agua utilizando un vehículo disolvente, deben añadirse con el vehículo a la solución de nutrientes. Las sustancias que no son hidrosolubles y para las que no se dispone de ningún vehículo hidrosoluble no tóxico han de disolverse en un disolvente volátil adecuado. La solución se mezcla con arena o perlas de vidrio, se coloca en un aparato rotativo de vacío y se somete a evaporación, para que quede en la arena o en las perlas una capa uniforme de la sustancia. Una porción pesada de perlas debe someterse a extracción con el mismo disolvente orgánico y se determina en ella la sustancia problema, antes de llenar las macetas. Aplicación en superficie 17. En el caso de los productos fitosanitarios, para la aplicación de la sustancia problema se suele rociar la superficie del suelo con la solución de ensayo. Todos los equipos utilizados para realizar los ensayos, incluidos los equipos utilizados para preparar y administrar la sustancia problema, deben ser tales en cuanto a su diseño y capacidad que los ensayos correspondientes puedan realizarse de una manera exacta y que se obtenga una cobertura reproducible. La cobertura debe ser uniforme en todas las superficies del suelo. Se debe tener cuidado para evitar la posibilidad de que las sustancias se adsorban o reaccionen con el equipo (por ejemplo, tubos de plástico y sustancias lipofílicas, o piezas y elementos de acero). Se rocía la sustancia problema en la superficie del suelo simulando las aplicaciones de un tanque de pulverización normal. Generalmente, los volúmenes rociados deben encontrarse en la banda de la práctica agrícola y volúmenes normales (cantidad de agua, etc.). El tipo de boquilla debe seleccionarse para proporcionar una cobertura uniforme de la superficie del suelo. En caso de que se apliquen disolventes y vehículos, debe establecerse un segundo grupo de plantas de control que reciban solo el disolvente o vehículo. Ello no es necesario en el caso de los productos fitosanitarios ensayados como formulaciones. Verificación de la concentración/tasa de la sustancia problema 18. Las concentraciones o tasas de aplicación deben confirmarse mediante una verificación analítica adecuada. En el caso de las sustancias solubles, la verificación de todas las concentraciones/tasas de ensayo puede confirmarse mediante el análisis de la concentración máxima de la solución de ensayo utilizada para el ensayo con documentación sobre la posterior dilución y la utilización de equipo de aplicación calibrado (por ejemplo, material analítico de vidrio, calibración del equipo rociador). En el caso de las sustancias insolubles, la verificación del material compuesto debe aportarse con los pesos de la sustancia problema añadidos al suelo. Si se requiere la demostración de la homogeneidad, puede ser necesario analizar el suelo. PROCEDIMIENTO Diseño del ensayo 19. Se plantan en macetas semillas de la misma especie. El número de semillas plantadas por maceta dependerá de la especie, del tamaño de la maceta y de la duración del ensayo. El número de plantas por maceta debe proporcionar unas condiciones de crecimiento adecuadas y evitar la superpoblación durante todo el ensayo. La densidad de plantación máxima es de unas 3-10 semillas por 100 cm2, en función del tamaño de las semillas. Como ejemplo, se recomienda de una a dos plantas de maíz, soja, tomate, pepino o remolacha azucarera por recipiente de 15 cm; tres plantas de colza o guisantes por recipiente de 15 cm; y de cinco a diez plantas de cebolla, trigo, u otras semillas pequeñas por recipiente de 15 cm. El número de semillas y el de macetas replicadas (la réplica se define como una maceta, por lo que las plantas de una misma maceta no constituyen réplicas) deben ser adecuados para optimizar el análisis estadístico (21). Debe tenerse en cuenta que la variabilidad será mayor cuando se trate de especies de ensayo con un número menor de semillas grandes por maceta (réplica), en comparación con las especies de ensayo que permitan utilizar un mayor número de pequeñas semillas por maceta. Plantando un número igual de semillas en cada maceta esta variabilidad puede reducirse al mínimo. 20. Se utilizan grupos de control para garantizar que los efectos observados están asociados con la exposición a la sustancia problema o se atribuyen solo a esta. El grupo de control adecuado debe ser idéntico al grupo de ensayo en todos los aspectos, salvo en la exposición a la sustancia problema. Todas las plantas de un mismo ensayo, incluidas las de los controles, deben proceder de la misma fuente. Para evitar que haya sesgo, es necesario que sea aleatoria la asignación de las macetas de ensayo y de control. 21. Deben evitarse las semillas revestidas de insecticida o fungicida (es decir, las semillas tratadas). Sin embargo, algunas autoridades reguladoras permiten la utilización de determinados fungicidas de contacto no sistémicos (por ejemplo, captano, tiram) (22). Si se teme la presencia de patógenos transmitidos con las semillas, estas pueden bañarse brevemente en una solución de hipoclorito al 5 %, lavarse a continuación abundantemente con agua corriente y secarse. No se autoriza ningún tratamiento curativo con otro producto fitosanitario. Condiciones del ensayo 22. Las condiciones del ensayo deben aproximarse a las condiciones necesarias para el crecimiento normal de las especies y variedades utilizadas (en el apéndice 4 figuran algunos ejemplos de condiciones de ensayo). Las plantas emergentes deben mantenerse con buenas prácticas hortícolas en cámaras de ambiente controlado, invernaderos o fitotrones. Cuando se utilizan instalaciones de cultivo, estas prácticas suelen incluir el control y el registro con una frecuencia adecuada (como, p. ej., cada día) de la temperatura, la humedad, la concentración de dióxido de carbono, la luz (intensidad, longitud de onda, radiación activa para la fotosíntesis) y el fotoperíodo, los medios de riego, etc., para garantizar un buen crecimiento de las plantas, juzgado por el crecimiento de las plantas control de las especies seleccionadas. Conviene controlar la temperatura de los invernaderos mediante sistemas de ventilación, calefacción o refrigeración. Se recomiendan en general las siguientes condiciones para los ensayos en invernaderos: — temperatura: 22 °C ± 10 °C; — humedad: 70 % ± 25 %; — fotoperíodo: mínimo de 16 horas de luz; — intensidad luminosa: 350 ± 50 μE/m2/s. Puede ser necesario aportar una iluminación adicional si la intensidad desciende por debajo de 200 μE/m2/s, longitud de onda de 400 - 700 nm, excepto en caso de determinadas especies cuyas necesidades de luz sean inferiores. Las condiciones ambientales deben ser objeto de seguimiento y notificación a lo largo de toda la duración del estudio. Las plantas deben cultivarse en macetas no porosas, de plástico o esmaltadas, con una bandeja o platillo debajo de la maceta. Es posible cambiar de posición las macetas periódicamente para minimizar la variabilidad en el crecimiento de las plantas (debida a las diferencias en las condiciones de ensayo en las instalaciones de cultivo). Las macetas deben ser bastante grandes para permitir un crecimiento normal. 23. Pueden añadirse suplementos de nutrientes del suelo según sea necesario para mantener el vigor de las plantas. La necesidad y el calendario de la adición de nutrientes pueden evaluarse mediante la observación de las plantas de control. Se recomienda regar los recipientes de ensayo por el fondo (p. ej., mediante la utilización de mechas de fibra de vidrio). Sin embargo, puede utilizarse el riego superior al principio para estimular la germinación de las semillas y, en caso de aplicación de la sustancia en la superficie del suelo, para facilitar la introducción de la sustancia en el suelo. 24. Las condiciones específicas de cultivo han de ser adecuadas para las especies ensayadas y la sustancia problema estudiada. Las plantas de control y las tratadas deben mantenerse en las mismas condiciones ambientales; no obstante, han de adoptarse medidas adecuadas para impedir la exposición cruzada (p. ej., de sustancias volátiles) entre los distintos grupos de tratamiento, así como la exposición de los controles a la sustancia problema. Ensayo a concentración/tasa única 25. A la hora de determinar la concentración/tasa adecuada de una sustancia para la realización de un ensayo a una concentración/tasa única (ensayo de tolerancia o límite), debe tenerse en cuenta una serie de factores. En relación con las sustancias en general, entre estos factores figuran las propiedades fisicoquímicas de la sustancia. En el caso de los productos fitosanitarios, hay que considerar las propiedades fisicoquímicas y el régimen de utilización de la sustancia problema, su concentración o tasa de aplicación máxima, el número de aplicaciones por temporada y/o la persistencia de la sustancia problema. Para determinar si una sustancia en general posee propiedades fitotóxicas, puede ser adecuado realizar un ensayo al nivel máximo de 1 000 mg/kg de suelo seco. Ensayo de determinación del intervalo 26. En caso necesario, puede realizarse un ensayo de determinación del intervalo para obtener información sobre las concentraciones o tasas que hayan de someterse a ensayo en el estudio definitivo de la relación dosis-respuesta. Para el ensayo de determinación del intervalo, las concentraciones o tasas de ensayo deben estar muy separadas entre sí (p. ej., 0,1, 1,0, 10, 100 y 1 000 mg/kg de suelo seco). En el caso de los productos fitosanitarios, las concentraciones o tasas podrían basarse en la concentración o tasa de aplicación recomendada o máxima; p, ej., 1/100, 1/10, 1/1 de ese valor. Ensayo a concentración/tasa múltiple 27. El objetivo del ensayo a concentración/tasa múltiple consiste en establecer la relación dosis-respuesta y determinar un valor de ECx o ERx relacionada con la emergencia, la biomasa y/o los efectos visibles frente a los controles sin exposición, según exijan las autoridades reguladoras. 28. El número y el espaciado de las concentraciones o tasas deben ser suficientes para generar una relación dosis-respuesta y una ecuación de regresión fiables, y dar una estimación de los valores de ECx o ERx. Las concentraciones/tasas seleccionadas deben englobar los valores de ECx o ERx que haya que determinar. Por ejemplo, si se requiere un valor de EC50 sería aconsejable realizar el ensayo a tasas que produzcan un efecto de entre el 20 y el 80 %. El número recomendado de concentraciones/tasas de ensayo para conseguirlo es como mínimo de cinco en una serie geométrica más un control sin tratar, y espaciadas por un factor que no exceda de tres. Respecto a cada grupo de tratamiento y de control el número de réplicas debe ser como mínimo de cuatro y el número total de semillas, al menos de veinte. Puede ser necesario recurrir a más réplicas de determinadas plantas con un índice de germinación bajo o con hábitos de crecimiento variables, para aumentar la potencia estadística del ensayo. Si se utiliza un número mayor de concentraciones/tasas de ensayo, podrá reducirse el número de réplicas. Si ha de estimarse la NOEC, puede ser necesario utilizar más réplicas para obtener la potencia estadística deseada (23). Observaciones 29. Durante el período de observación, es decir, de 14 a 21 días desde el momento en que haya emergido el 50 % de las plantas de control (también del control de disolvente, en su caso), las plantas se examinan con frecuencia (al menos una vez por semana y, en la medida de lo posible, diariamente) para observar la emergencia, así como la fitotoxicidad visible y la mortalidad. Al final del ensayo, deben registrarse la medida del porcentaje de emergencia y la biomasa de las plantas supervivientes, así como los efectos nocivos visibles en diferentes partes de las plantas. Entre estos se incluyen las anomalías del aspecto de las plántulas emergidas, retraso en el crecimiento, clorosis, decoloración, mortalidad y efectos en el desarrollo de las plantas. La biomasa final puede medirse con la media del peso seco final de los brotes de las plantas supervivientes, obtenido recogiendo los brotes desde la superficie del suelo y secándolos, hasta llegar a peso constante, a 60 °C. Otra posibilidad es medir la biomasa final utilizando el peso fresco de los brotes. La altura de los brotes puede ser otro parámetro, si así lo requieren las autoridades reguladoras. Para evaluar las respuestas tóxicas observables, debe utilizarse un sistema uniforme de puntuación de las lesiones visibles. En las referencias (23) y (24) se dan ejemplos para la realización de las evaluaciones visuales cualitativas y cuantitativas. DATOS E INFORME Análisis estadístico Ensayo a concentración/tasa única 30. Los datos correspondientes a cada especie vegetal deben analizarse mediante un método estadístico adecuado (21). Debe registrarse el nivel del efecto a la concentración/tasa de ensayo, o bien la incapacidad de alcanzar un determinado efecto a la concentración/tasa de ensayo (por ejemplo, < x % de efecto observado a la concentración o tasa y). Ensayo a concentración/tasa múltiple 31. Se ha establecido una relación dosis-respuesta en términos de una ecuación de regresión. Pueden utilizarse modelos diferentes: por ejemplo, para estimar la ECx o ERx (p. ej., EC25, ER25, EC50, ER50) y sus límites de confianza en cuanto a la emergencia, pueden ser apropiados los métodos de datos cuánticos, de logit, de probit, de Weibull, de Spearman-Karber, de Spearman-Karber recortado, etc. En cuanto al crecimiento de las plántulas (peso y altura) como parámetros continuos, pueden estimarse los valores de ECx o ERx y sus límites de confianza utilizando un análisis de regresión adecuado [p. ej., el análisis de regresión no lineal de Bruce-Versteeg (25)]. Siempre que sea posible, el valor de R2 debe ser superior o igual a 0,7 para las especies más sensibles, y las concentraciones/tasas de ensayo utilizadas deben englobar los efectos del 20 % al 80 %. Si ha de estimarse la NOEC, debe preferirse la aplicación de ensayos estadísticos potentes y estos deben seleccionarse sobre la base de la distribución de los datos (21) (26). Informe del ensayo 32. El informe del ensayo debe presentar los resultados de los estudios, así como una descripción detallada de las condiciones de ensayo, una discusión exhaustiva de los resultados, el análisis de los datos y las conclusiones extraídas del análisis. Deben presentarse un cuadro sinóptico y un resumen de los resultados. El informe deberá incluir lo siguiente: Sustancia problema: — datos de identificación de la sustancia, propiedades pertinentes de la sustancia estudiada (p. ej., log Pow, hidrosolubilidad, presión de vapor e información sobre el destino y el comportamiento en el medio ambiente, si se conocen); — datos sobre la preparación de la solución de ensayo y verificación de las concentraciones de ensayo según se especifica en el punto 18. Especies de ensayo: — datos sobre el organismo de ensayo: especie/variedad, familia botánica, nombres científico y común, fuente y antecedentes de la semilla lo más detallados posible (es decir, nombre del proveedor, porcentaje de germinación, clase de tamaño de la semilla, número de lote, año o estación de recogida de la semilla, fecha de la determinación del índice de germinación, etc.); — número de especies de mono y dicotiledóneas utilizadas; — justificación de la selección de las especies; — descripción del almacenamiento, tratamiento y conservación de las semillas. Condiciones de ensayo: — instalaciones de ensayo (por ejemplo, cámara de cultivo, fitotrón e invernadero); — descripción del sistema de ensayo (por ejemplo, dimensiones y material de las macetas, y cantidades de suelo); — características del suelo (o el tipo de textura del suelo: granulometría y clasificación del suelo, propiedades físicas y químicas, como el porcentaje de materia orgánica, porcentaje de carbono orgánico y pH); — preparación del suelo o sustrato (p. ej., suelo, suelo artificial, arena y otros) antes del ensayo; — descripción del medio nutritivo, en caso de utilizarse; — aplicación de la sustancia problema: descripción del método de aplicación, descripción del equipo, tasas de exposición y volúmenes, incluida la verificación química, descripción del método de calibración y descripción de las condiciones ambientales durante la aplicación; — condiciones de cultivo: intensidad luminosa (p. ej., radiación correspondiente a la fotosíntesis), fotoperíodo, temperaturas máxima y mínima, régimen y método de riego, fertilización; — número de semillas por maceta, número de plantas por dosis, número de réplicas (macetas) por tasa de exposición; — tipo y número de controles (controles positivos y/o negativos, control de disolvente en su caso); — duración del ensayo. Resultados: — cuadro de todos los parámetros correspondientes a cada réplica, concentración/tasa de ensayo y especie; — número y porcentaje de emergencias en comparación con los controles; — mediciones de la biomasa (peso seco o peso fresco de los brotes) de las plantas como porcentaje de la de los controles; — altura de los brotes como porcentaje de la de los controles, si se ha medido; — porcentaje de las lesiones visibles y descripción cuali y cuantitativa de las lesiones visibles (clorosis, necrosis, marchitamiento, deformación de hojas y tallos, así como eventual ausencia de efectos) causadas por la sustancia problema en comparación con las plantas de control; — descripción de la escala de clasificación utilizada para evaluar las lesiones visibles, si se facilita una clasificación visual; — en caso de estudios a tasa única, debe indicarse el porcentaje de lesiones; — valores de ECx o ERx (p. ej., EC50, ER50, EC25, ER25) y límites de confianza correspondientes; cuando se hace un análisis de regresión, debe aportarse el error típico de la ecuación de regresión, y el error típico de la estimación de los parámetros individuales (p. ej., pendiente, ordenada en el origen); — valores de LOEC y NOEC si se calculan; — descripción de los procedimientos estadísticos y de las hipótesis utilizadas; — representación gráfica de dichos datos y de la relación dosis-respuesta de las especies estudiadas; desviaciones de los procedimientos descritos en el presente método de ensayo y de cualquier acontecimiento inusual ocurrido en el ensayo. 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Productos fitosanitarios (PFS) o plaguicidas : materiales con una determinada actividad biológica que se utilizan intencionadamente para proteger los cultivos contra las plagas (p. ej., contra enfermedades fúngicas, insectos, y plantas competitivas). ECx, concentración con efecto al x %, o ERx, tasa con efecto al x % : concentración o tasa que provoca un cambio o alteración indeseable del x % en el parámetro de ensayo que se mide, en relación con el control (p. ej., una reducción del 25 % o 50 % en la emergencia de las plántulas, en el peso de los brotes, en el número final de plantas presentes, o un aumento de las lesiones visibles en esos porcentajes se corresponderían con una EC25/ER25 o EC50/ER50 respectivamente). Emergencia : aparición del coleóptilo o cotiledón por encima de la superficie del suelo. Formulación : producto formulado comercial que contiene la sustancia activa (principio activo), también conocido como preparado final (8) o producto típico de uso final. Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : concentración más baja de la sustancia problema a la que se observa un efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la LOEC tiene un efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control, y es superior al valor de NOEC. Plantas no diana : plantas que se encuentran fuera de la zona de las plantas diana. En el caso de los productos fitosanitarios, esta denominación se refiere en general a las plantas que se encuentran fuera de la zona de tratamiento. Concentración sin efecto observado (NOEC) : concentración más elevada de la sustancia problema a la que no se observa ningún efecto. En este ensayo, la concentración correspondiente a la NOEC no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro de un determinado período de exposición en comparación con el control. Fitotoxicidad : desviaciones perjudiciales (detectadas por medición y por evaluación visual) respecto al modelo normal de aspecto y de crecimiento de las plantas, en respuesta a una sustancia determinada. Réplica : unidad experimental que representa al grupo de control o al grupo de tratamiento. En estos estudios, la maceta se define como la réplica. Evaluación visual : calificación de las lesiones visibles según las observaciones del porte, vigor, malformaciones, clorosis, necrosis y aspecto general de las plantas, en comparación con un control. Sustancia problema : sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo. Apéndice 2 Lista de especies utilizadas tradicionalmente en el ensayo de plantas Familia Especie Denominación común DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Zanahoria Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Girasol Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Lechuga Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Mostaza blanca Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris, var. chinensis Col de China Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Colza Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Col Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Nabo Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Mastuerzo Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Rábano Chenopodiaceae Beta vulgaris Remolacha azucarera Cucurbitaceae Cucumis sativus Pepino Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Soja Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Judía mung Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Judía enana, alubia, habichuela Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Guisante Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Fenogreco Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Loto de los prados Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Trébol violeta Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Veza Linaceae Linum usitatissimum Lino Polygonaceae Fagopyrum esculentum Alforfón Solanaceae Solanum lycopersicum Tomate MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Cebolla Poaceae (Gramineae) Avena sativa Avena Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Cebada Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Ballico Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Arroz Poaceae (Gramineae) Secale cereale Centeno Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Sorgo de grano, caña dulce Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Trigo Poaceae (Gramineae) Zea mays Maíz Apéndice 3 Lista de posibles especies no cultivadas Posibles especies según la OCDE para los ensayos de toxicidad con plantas Nota: El cuadro siguiente ofrece información sobre 52 especies no cultivadas (las referencias para cada entrada figuran entre paréntesis). Las tasas de emergencia indicadas son datos publicados en la bibliografía, y solo tienen valor orientativo general. La experiencia individual puede variar en función del origen de las semillas y de otros factores. FAMILIA Nombre botánico de la especie (nombre común en español) Duración de vida (9) y hábitat Peso de la semilla (mg) Fotoperíodo para la germinación o el crecimiento (10) Profundidad de la plantación (mm) (11) Tiempo para la germinación (días) (12) Tratamientos especiales (13) Ensayo de toxicidad (14) Proveedores de las semillas (15) Otras referencias (16) APIACEAE Torilis japonica (cachurro) А, В Zonas alteradas, setos, pastizales (16, 19) 1,7 - 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) Estratificación en frío (7, 14, 18, 19) Puede ser necesaria una fase de maduración (19) Germinación inhibida por la oscuridad (1, 19) Sin tratamientos especiales (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (margarita) Ρ Pastos, tierras de labor, turba (16, 19) 0,09 - 0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (18, 19) Sin tratamientos especiales (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (aciano) A Campos, cunetas, hábitats abiertos (16) 4,1 - 4,9 (4, 14) L = D (14) 0 - 3 (2, 4, 14) 14 - 21 (100 %) (14) Sin tratamientos especiales (2, 4) POST (2, 4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (aciano negro) Ρ Campos, cunetas, hábitats abiertos (16, 19) 2,4 - 2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) Puede ser necesaria una fase de maduración (18, 19) Germinación inhibida por la oscuridad (19) Sin tratamientos especiales (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (helenio) Ρ Lugares húmedos, alterados (16) 1 - 1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) Sin tratamientos especiales (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (diente de león hirsuto) Ρ Campos, cunetas, zonas alteradas (16, 19) 0,85 - 1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) Germinación inhibida por la oscuridad (17, 18, 19) Sin tratamientos especiales (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (rudbeckia velluda) Β, Ρ Zonas alteradas (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) Sin tratamientos especiales (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (vara de oro canadiense) Ρ Pastizales, zonas abiertas (16) 0,06 -0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14 - 21 (11) Mezclar con la misma cantidad de arena y empapar en GA de 500 ppm durante 24 horas (11) Sin tratamientos especiales (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum (abrojo) A Campos, hábitats abiertos (16) 25 - 61 (14, 29) 0 (1) 5 (29) La germinación puede verse inhibida por la oscuridad (1) Bañar en agua caliente durante 12 horas (29) PRE Y POST (31) A Xanthium spinosum (abrojillo) A Hábitats abiertos (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) Escarificación (14) Sin tratamientos especiales (6) PRE Y POST (6) A Xanthium strumarium (bardana) A Campos, hábitats abiertos (16) 67,4 (14) L = D (14) 10 - 20 (6, 21) Sin tratamientos especiales (6, 14, 21) PRE Y POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (berro de prado) Ρ Campos, cunetas, turba (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) Germinación inhibida por la oscuridad (8, 19) Sin tratamientos especiales (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (flor de cuclillo) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) Puede ser necesaria una fase de maduración (18) Sin tratamientos especiales (5, 14, 15, 22 - 26) POST (5, 15, 22 - 26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (cenizo) A Lindes de campos, zonas alteradas (16, 19) 0,7 - 1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) El tratamiento depende del color de la semilla (19) Dormancia en almacenamiento seco (19) Germinación inhibida por la oscuridad (1, 18, 19) Estratificación en frío (18) Sin tratamiento especial (14, 34) PRE Y POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (hipérico) Ρ Campos, tierras de labor, hábitats abiertos (16, 19) 0,1 - 0,23 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) Germinación inhibida por la oscuridad (1, 18, 19) Sin tratamientos especiales (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (trompillo) A Cunetas, hábitats abiertos, campos de maíz (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10 - 20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) Sin tratamientos especiales (6, 21) PRE Y POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (coquito) Ρ Tierras de labor, pastizales, cunetas (16, 30) 0,2 (14) L = D (14) 0 (1) 10 - 20 (6, 10) 12 (91 %) (10) Germinación inhibida por la oscuridad (1) Sin tratamientos especiales (6, 10, 14) PRE Y POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (cuernecillo) Ρ Herbazales, cunetas, hábitats abiertos (16, 19) 1 - 1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) Escarificación (14, 19) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (18, 19) Sin tratamientos especiales (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (hediondillo) A Bosques húmedos (16) 23 - 28 (9) L = D (14) L > D (9) 10 - 20 (6, 9) Bañar las semillas en agua durante 24 horas (9) Escarificación (14) La viabilidad de las semillas depende del color (1) Sin tratamientos especiales (6) POST (6, 9) A Sesbania exaltata (cáñamo) A Suelos aluviales (16) 11 - 13 (9, 14) L > D (9) 10 - 20 (9, 21) Bañar las semillas en agua durante 24 horas (9) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (18, 1) Sin tratamientos especiales (21) PRE Y POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (trébol rojo) Ρ Campos, cunetas, tierras de labor (16, 19) 1,4 - 1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) Escarificación (14, 18) Puede ser necesaria una fase de maduración (19) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1, 19) Sin tratamientos especiales (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (agripalma) Ρ Zonas abiertas (16) 0,75 - 1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) Sin tratamientos especiales (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (hierbabuena) Ρ Zonas húmedas (16) 2,21 (4) 0 (4) Sin tratamientos especiales (4) POST (4) F Nepeta cataria (hierba gatera) Ρ Zonas alteradas (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) Sin tratamientos especiales (2, 4, 14) POST (2, 4) F Prunella vulgaris (consuelda menor) Ρ Tierras de labor, herbazales, lugares alterados (16, 19) 0,58 -1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) Germinación inhibida por la oscuridad (18, 19) Germinación mejor con semillas mayores (1) Sin tratamientos especiales (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (betónica) Ρ Prados, lindes de campos (19) 14 - 18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) Sin tratamientos especiales (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilon theophrasti (abutilón) A Campos, hábitats abiertos (16) 8,8 (14) L = D (14) 10 - 20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) Escarificación (14) Sin tratamientos especiales (5, 10, 21) PRE Y POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (malva de caballo) A Campos, cunetas (16) 3,8 (14) L = D (14) 10 - 20 (6, 21) Escarificación (14) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) Sin tratamientos especiales (6, 21) PRE Y POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (amapola) A Campos, tierras de labor, lugares alterados (16, 19) 0,1 - 0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) Estratificación en frío y escarificación (1, 19, 32) Sin tratamientos especiales (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (agróstide común) Céspedes, pastizales (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) Germinación inhibida por la oscuridad (1, 17 - 19) Sin tratamientos especiales (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (cola de zorra) A Campos, hábitats abiertos (16) 0,9 - 1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) Escarificación (14) Tratar con 101 mg/l KNO3 (14) Estratificación en caliente (1) Germinación inhibida por la oscuridad (1) Sin tratamientos especiales (34) PRE Y POST (28, 34) A 32 Avena fatua (ballueca) A Zonas cultivadas, hábitats abiertos (16) 7 - 37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10 - 20 (6, 10) 3 (70 %) (18) Escarificación (7, 32) Germinación inhibida por la oscuridad (1) Estratificación en frío (1, 18) Sin tratamientos especiales (6, 10, 14) PRE Y POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (espiguilla colgante) A Campos, cunetas, tierras de labor (16) 0,45 - 2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) Período de maduración (1, 7, 32) Germinación inhibida por la oscuridad (1) Sin tratamientos especiales (14) PRE Y POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (cola de perro) P Campos, cunetas, hábitats abiertos (16, 19) 0,5 - 0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (19) Sin tratamientos especiales (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (garranchuela) A Campos, turba, hábitats abiertos (16) 0,52 - 0,6 (14, 30) L = D (14) 10 - 20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) Escarificación, estratificación en frío y maduración (1, 7, 14, 32) Tratar con 101 mg/l KNO3 (14) Germinación inhibida por la oscuridad (1) Sin tratamientos especiales (21) PRE Y POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (mijera) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10 - 20 (7, 21) Escarificación (7, 32) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) Sin tratamientos especiales (3, 14, 21) PRE Y POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (zacate silvestre de Canadá) P Lugares ribereños, alterados (16) 4 - 5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14 - 28 (11) Sin tratamientos especiales (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (cañuela) P Campos, zonas húmedas (16, 19) 1,53 - 2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) Sin tratamientos especiales (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (cola de zorro) A Pastizales, cunetas, hábitats abiertos (16) 3,28 (14) Estratificación en caliente (1) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) PRE (31) 7 Phleum pratense (fleo de los prados) P Pastizales, tierras de labor, lugares alterados (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0 - 10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) Germinación inhibida por la oscuridad (19) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (17) Sin tratamientos especiales (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (polígono trepador) A Hábitats abiertos, cunetas (16) 5 - 8 (4, 14, 29) L = D (20) 0 - 2 (4, 29) Estratificación en frío durante 4-8 semanas (1, 2, 4, 20, 29) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) PRE Y POST (1, 2, 20, 28, 31) A 32 Polygonum lapathifolium (hierba pejiguera) A Suelos húmedos (16) 1,8 - 2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (1) Germinación inhibida por la oscuridad (18) Estratificación en frío (1) Sin tratamientos especiales (5) PRE Y POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (polígono de Pennsylvania) A Campos, hábitats abiertos (16) 3,6 - 7 (14, 29) 2 (29) Estratificación en frío durante 4 semanas a 0 - 5 °C (1, 29) Germinación inhibida por la oscuridad (1) PRE (31) A, E Polygonum persicaria (persicaria) A Zonas alteradas, tierras de labor (16, 19) 2,1 - 2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) Escarificación, estratificación en frío, tratamiento con GA (14) Estratificación en frío, maduración (17 - 19) Germinación inhibida por la oscuridad (19) Sin tratamientos especiales (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (acedera) P Tierras de labor, cunetas, zonas abiertas (16, 19) 1,3 - 1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) Germinación inhibida por la oscuridad (18, 19) Puede ser necesaria una fase de maduración (18) Sin tratamientos especiales (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (anagálide) A Tierras de labor, herbazales, lugares alterados (16, 19) 0,4 - 0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) Estratificación en frío, tratamiento con GA (1,14, 18, 19, 32) Luz necesaria para la germinación (1) Sin tratamientos especiales (2, 4) POST (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (botón de oro) Ρ Tierras de labor, cunetas, zonas abiertas (16, 19) 1,5 - 2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 - 56 (19, 29) Sin tratamientos especiales (5, 14, 22, 24 - 26) POST (5, 22, 24 - 26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (hierba de San Benito) Ρ Setos, zonas húmedas (16, 19) 0,8 - 1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) Germinación inhibida por la oscuridad (18, 19) Estratificación en caliente (1) Sin tratamientos especiales (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (amor de hortelano) A Tierras de labor, zonas húmedas, lugares alterados (16, 19) 7 - 9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) Estratificación en frío (1, 18, 19) Germinación no afectada por la intensidad de la radiación (18, 19) La luz inhibe la germinación (1) Sin tratamientos especiales (6, 14) PRE Y POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (galio blanco) Ρ Setos en taludes, zonas abiertas (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) Sin tratamientos especiales (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (digital) Ρ, Β Setos, zonas abiertas (16, 19) 0,1 - 0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) Germinación inhibida por la oscuridad (1, 17, – 19) Sin tratamientos especiales (4, 22 - 26) POST (4, 22 - 26) D, G, F Veronica persica (verónica) A Tierras de labor, zonas abiertas, lugares alterados (16, 19) 0,5 - 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) Germinación inhibida por la oscuridad (18, 19) Estratificación en frío (18) Sin tratamientos especiales (14) PRE Y POST (28) A 32 Proveedores de semillas citados Identidad del proveedor Información del proveedor A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ Reino Unido + 44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 Estados Unidos (727) 344 - 4050 www.tropilab.com C Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 Canadá (519) 586 — 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 Estados Unidos (303) 431 - 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 Estados Unidos (800) 873 - 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB Reino Unido + 44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 Canadá (800) 274 - 7333 www.thompson-morgan.com REFERENCIAS CITADAS: (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto. (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. 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Apéndice 4 Ejemplos de condiciones adecuadas de cultivo para determinadas especies cultivadas Las siguientes condiciones se han considerado idóneas para diez especies cultivadas, y pueden utilizarse como orientación para los ensayos en cámaras de cultivo también con otras especies determinadas: Concentración de dióxido de carbono: 350 ± 50 ppm; Humedad relativa: 70 ± 5 % durante los períodos de luz y 90 ± 5 % durante los períodos de oscuridad; Temperatura: 25 ± 3 °C por el día, 20 ± 3 °C por la noche; Fotoperíodo: 16 horas de luz / 8 horas de oscuridad, partiendo de una media de longitud de onda de 400 a 700 nm; Luz: luminancia de 350 ± 50 μE/m2/s, medida en lo más alto del follaje. Las especies cultivadas son las siguientes: — tomate (Solanum lycopersicum); — pepino (Cucumis sativus); — lechuga (Lactuca sativa); — soja (Glycine max); — col (Brassica oleracea var. capitata) — zanahoria (Daucus carota); — avena (Avena sativa); — ballico (Lolium perenne); — maíz (Zea mays); — cebolla (Allium cepa). C.32. ENSAYO DE REPRODUCCIÓN DE ENQUITREIDOS INTRODUCCIÓN 1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 220 (2004). Está diseñado para utilizarse en la evaluación de los efectos de las sustancias sobre el resultado reproductor del gusano enquitreido, Enchytraeus albidus, Henle 1873, en el suelo. Se basa principalmente en un método desarrollado por el Umweltbundesamt de Alemania (1), que ha sido objeto de un ensayo interlaboratorios (2). También se han considerado otros métodos de ensayo de la toxicidad de las sustancias para los enquitreidos y las lombrices de tierra (3) (4) (5) (6) (7) (8). CONSIDERACIONES INICIALES 2. Los anélidos que viven en el suelo del género Enchytraeus son, desde el punto de vista ecológico, especies pertinentes para ensayos ecotoxicológicos. Si bien los enquitreidos se encuentran a menudo en los suelos que contienen lombrices de tierra, también es cierto que suelen abundar en muchos suelos de los que están ausentes las lombrices de tierra. Los enquitreidos puede utilizarse en pruebas de laboratorio, así como en estudios de semicampo y de campo. Desde un punto de vista práctico, muchas especies de Enchytraeus son fáciles de manejar y criar, y su tiempo de generación es considerablemente menor que el de las lombrices de tierra. La duración de un ensayo de reproducción con enquitreidos es, por tanto, de solo 4 - 6 semanas, mientras que con lombrices de tierra (Eisenia fetida) es de 8 semanas. 3. Puede encontrarse información básica sobre la ecología y la ecotoxicología de los enquitreidos en el medio ambiente terrestre en las referencias (9) (10) (11) (12). PRINCIPIO DEL ENSAYO 4. Se exponen enquitreidos adultos a un intervalo de concentraciones de la sustancia problema mezclada con un suelo artificial. El ensayo puede dividirse en dos fases: a) un ensayo de determinación del intervalo, en caso de que no se disponga de suficiente información, en el que la mortalidad es el principal parámetro evaluado tras dos semanas de exposición, y b) un ensayo definitivo de reproducción, en el que se evalúan el número total de juveniles producidos por un animal padre y la supervivencia de los animales padres. La duración del ensayo definitivo es de seis semanas. Tras las tres primeras semanas se extraen las lombrices adultas y se registran los cambios morfológicos. Después de un período adicional de tres semanas, se cuenta el número de descendientes, nacidos de los capullos producidos por los adultos. El resultado reproductor de los animales expuestos a la sustancia problema se compara con el del control o controles a fin de determinar i) la concentración sin efecto observado (NOEC) y/o ii) una ECx (p. ej., EC10, EC50) aplicando un modelo de regresión para estimar la concentración que causaría una reducción del x % del resultado reproductor. Las concentraciones de ensayo deben englobar la ECx (p. ej., EC10, EC50) de forma que el valor de ECx se obtenga por interpolación y no por extrapolación. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 5. Es preferible conocer la hidrosolubilidad, el log Kow, el coeficiente de reparto agua/suelo (véase, por ejemplo, el capítulo C.18 o C.19 del presente anexo) y la presión de vapor de la sustancia problema. Es conveniente disponer de información adicional sobre el destino de la sustancia problema en el suelo, tal como las velocidades de hidrólisis y de fotólisis. 6. Este método de ensayo puede utilizarse para sustancias tanto solubles como insolubles en agua. Sin embargo, el modo de aplicación de la sustancia problema variará en consecuencia. El método de ensayo no es aplicable a las sustancias volátiles, es decir, sustancias cuya constante de Henry o cuyo coeficiente de reparto aire/agua sea superior a uno, o sustancias cuya presión de vapor a 25 °C supere los 0,0133 Pa. VALIDEZ DEL ENSAYO 7. Para que el ensayo sea válido, los controles deben cumplir los criterios de comportamiento siguientes: — la mortalidad de adultos no debe ser superior al 20 % al final del ensayo de determinación del intervalo y después de las tres primeras semanas del ensayo de reproducción; — en el supuesto de que se utilicen diez adultos por recipiente en el diseño del ensayo, debe haberse producido al final del ensayo una media de al menos veinticinco juveniles por recipiente; — el coeficiente de variación alrededor del número medio de juveniles no debe ser superior al 50 % al final del ensayo de reproducción. Cuando un ensayo no cumpla los criterios de validez arriba indicados, el ensayo debe interrumpirse, salvo que pueda aportarse una justificación para continuar con él. La justificación deberá incluirse en el informe. SUSTANCIA DE REFERENCIA 8. Es necesario someter a ensayo una sustancia de referencia a intervalos regulares, o bien incluirla en cada ensayo, para verificar que la respuesta de los organismos de ensayo no ha cambiado de forma significativa a lo largo del tiempo. La carbendazima es una sustancia de referencia adecuada de la que se ha visto que afecta a la supervivencia y reproducción de los enquitreidos (13) (14), pero pueden utilizarse otras sustancias cuyos datos de toxicidad sean bien conocidos. En un ensayo interlaboratorios se utilizó una formulación de carbendazima conocida por el nombre comercial de Derosal™, suministrada por AgrEvo Company (Francfort, Alemania) y que contiene 360 g/l de principio activo (32,18 %) (2). La EC50 para la reproducción determinada en la prueba interlaboratorios era del orden de 1,2 ± 0,8 mg de principio activo (p. a.) por kg de masa seca (2). Si se incluye un patrón tóxico positivo en la serie de ensayo, se utiliza una sola concentración y el número de réplicas debe ser el mismo que el de los controles. Por lo que respecta a la carbendazima, se recomienda el ensayo de 1,2 mg p. a./kg de peso seco (ensayo con la formulación líquida). DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO Equipo 9. Los recipientes de ensayo serán de vidrio o de otro material químicamente inerte. Son adecuados los frascos de vidrio (por ejemplo, volumen: 0,20 - 0,25 litros; diámetro: ≈ 6 cm). Deben disponer de tapas transparentes (por ejemplo, de vidrio o de polietileno) diseñadas de forma que se reduzca la evaporación, pero permitiendo al mismo tiempo el intercambio de gases entre el suelo y la atmósfera. Las tapas deben ser transparentes para permitir la transmisión de la luz. 10. Se precisa el equipo normal de laboratorio y, en particular, el siguiente: — estufa secadora; — microscopio estereoscópico; — pH-metro y fotómetro; — balanzas exactas adecuadas; — equipo adecuado para el control de la temperatura; — equipo adecuado para el control de la humedad (no esencial si los recipientes de exposición tienen tapa); — incubadora o pequeña sala con aire acondicionado; — pinzas, ganchos o asas; — cubeta de revelado fotográfico. Preparación del suelo artificial 11. En este ensayo se utiliza un suelo artificial (5) (7) con la siguiente composición (en peso seco, secado hasta peso constante a 105 °C): — 10 % de turba esfágnea, secada al aire y finamente molida (es aceptable un tamaño de partícula de 2 ± 1 mm); antes de su utilización en un ensayo, es recomendable comprobar que un suelo elaborado con un nuevo lote de turba es adecuado para el cultivo de lombrices; — 20 % de caolín, con un contenido de caolinita preferentemente superior al 30 %; — aproximadamente entre 0,3 y 1,0 % de carbonato de calcio (CaCO3, pulverizado, de pureza analítica) para obtener un pH de 6,0 ± 0,5; la cantidad de carbonato de calcio añadido puede depender principalmente de la calidad o naturaleza de la turba; — alrededor del 70 % de arena de cuarzo secada al aire (dependiendo de la cantidad necesaria de CaCO3), en su mayor parte en forma de arena fina, con más del 50 % de las partículas de un tamaño entre 50 y 200 μm. Es aconsejable demostrar la aptitud de un suelo artificial para el cultivo de los gusanos y el cumplimiento de los criterios de validez del ensayo antes de utilizar el suelo en un ensayo definitivo. En particular, se recomienda hacer un control de ese tipo para garantizar que los resultados del ensayo no se vean comprometidos si el contenido de carbono orgánico del suelo artificial se reduce, por ejemplo rebajando el contenido de turba al 4-5 % y aumentando análogamente el contenido de arena. Con esta reducción del contenido de carbono orgánico, es posible que disminuyan las posibilidades de adsorción de la sustancia problema al suelo (carbono orgánico) y que aumente la disponibilidad de la sustancia problema para los gusanos. Se ha demostrado que Enchytraeus albidus puede ajustarse a los criterios de validez sobre la reproducción cuando se somete a ensayo en suelos de campo con un contenido de carbono orgánico menor que el mencionado más arriba (p. ej., del 2,7 %) (15), y la experiencia (si bien es limitada) demuestra que esto también puede conseguirse en suelo artificial con un 5 % de turba. Nota: Cuando se utiliza suelo natural en ensayos adicionales (por ejemplo, de nivel superior), deben demostrarse también la idoneidad del suelo y el respeto de los criterios de validez del ensayo. 12. Los componentes secos del suelo se mezclan a fondo (por ejemplo, en un mezclador de laboratorio de gran escala). Esta operación debe efectuarse al menos una semana antes de que se inicie el ensayo. El suelo mezclado debe mantenerse durante dos días con el fin de equilibrar o estabilizar la acidez. Para la determinación del pH se utiliza una mezcla de suelo y solución de cloruro de potasio 1 M (KCl) o de cloruro de calcio 0,01 M (CaCl2) en una proporción de 1:5 (véase la referencia (16) y el apéndice 3). Si el suelo es más ácido que la banda exigida (véase el punto 11), puede ajustarse añadiendo una cantidad adecuada de CaCO3. Si el suelo es demasiado alcalino, puede ajustarse mediante la adición de más cantidad de la mezcla, mencionada en el punto 11, pero excluyendo el CaCO3. 13. La capacidad máxima de retención de agua del suelo artificial se determina de acuerdo con los procedimientos descritos en el apéndice 2. Uno o dos días antes del inicio del ensayo, el suelo artificial seco se prehumedece, añadiéndole una cantidad suficiente de agua desionizada para obtener aproximadamente la mitad del contenido final de agua, que supone de un 40 a un 60 % de la capacidad máxima de retención de agua. Al inicio del ensayo, el suelo prehumedecido se divide en las partes correspondientes al número de concentraciones de ensayo (y de sustancias de referencia en su caso) y de controles utilizados en el ensayo. El contenido de humedad se ajusta al 40 - 60 % de la capacidad máxima de retención de agua mediante la adición de la solución de la sustancia problema y/o añadiendo agua desionizada o destilada (véanse los puntos 19 a 21). Se determina el contenido de humedad al inicio y al final del ensayo (por secado hasta la obtención de un peso constante a 105 °C); dicho contenido debe estar en la banda óptima para la supervivencia de las lombrices. Una estimación general del contenido de humedad del suelo puede obtenerse apretando el suelo suavemente con la mano; si el contenido de humedad es correcto, deben aparecer gotitas de agua entre los dedos. Selección y preparación de los animales de ensayo 14. La especie recomendada es Enchytraeus albidus Henle 1837 (gusano blanco), miembro de la familia Enchytraeidae (orden Oligochaeta, filum Annelida). E. albidus es una de las mayores especies de enquitreidos, y se han observado especímenes de hasta 35 mm de longitud (17) (18). E. albidus tiene distribución mundial y se encuentra en hábitats marinos, de agua dulce y terrestres, sobre todo en materia orgánica en descomposición (algas, compost) y raramente en praderas (9). Su amplia tolerancia ecológica y algunas variaciones morfológicas podrían indicar que existen diferentes razas. 15. E. albidus se encuentra en el comercio, como alimento para peces. Ha de comprobarse si el cultivo está contaminado con otras especies, generalmente más pequeñas (1) (19). Si hay contaminación, se deben lavar todos los gusanos con agua en una placa Petri. Se seleccionan a continuación los ejemplares adultos grandes de E. albidus (empleando un microscopio estereoscópico) para iniciar un nuevo cultivo y se desechan todos los demás gusanos. E. albidus pueden criarse en una amplia gama de materiales orgánicos (véase el apéndice 4). El ciclo de vida de E. albidus es corto, ya que se alcanza la madurez entre los 33 días (a 18 °C) y los 74 días (a 12 °C) (1). Se utilizarán para el ensayo solo los cultivos que hayan permanecido sin problemas en el laboratorio al menos cinco semanas (una generación). 16. Son también adecuadas otras especies del género Enchytraeus, por ejemplo E. buchholzi Vejdovsky 1879 o E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (véase el apéndice 5). Si se utilizan otras especies de Enchytraeus, deben identificarse claramente y hay que indicar los motivos por los que se han seleccionado. 17. Los animales utilizados en los ensayos son gusanos adultos. Deben tener huevos (puntos blancos) en la región del clitelo, y ser aproximadamente del mismo tamaño (de aproximadamente 1 cm de longitud). No es necesario sincronizar el cultivo de cría. 18. Si los enquitreidos no se crían en el mismo tipo de suelo y en las mismas condiciones (incluida la alimentación) que se utilizan para el ensayo final, deben aclimatarse durante al menos 24 horas y hasta tres días. Conviene, en un primer momento, aclimatar un número de adultos mayor que el necesario para realizar el ensayo, a fin de dejar margen suficiente para el rechazo de especímenes dañados o inadecuados por cualquier otro concepto. Al final de la fase de aclimatación, se seleccionan para el ensayo solo los gusanos que contengan huevos y no presenten anomalías de comportamiento (por ejemplo, que traten de escapar del suelo). Los gusanos se retiran cuidadosamente utilizando pinzas de joyero, ganchos o asas y se colocan en una placa Petri que contenga una pequeña cantidad de agua dulce. Con este objeto es preferible utilizar agua dulce reconstituida según lo propuesto en el capítulo C.20 del presente anexo (ensayo de reproducción en Daphnia magna), ya que el agua desionizada, desmineralizada o del grifo puede ser nociva para los gusanos. Los gusanos se inspeccionan con un microscopio estereoscópico y se eliminan los que no contengan huevos. Se ha de tener cuidado para retirar y desechar los ácaros o colémbolos que puedan haber infectado los cultivos. Los gusanos sanos no utilizados para el ensayo se devuelven al cultivo madre. Preparación de las concentraciones de ensayo Sustancia problema hidrosoluble 19. Se prepara una solución de la sustancia problema en agua desionizada en una cantidad suficiente para todas las réplicas de una sola concentración de ensayo. Se recomienda utilizar una cantidad apropiada de agua para conseguir el contenido necesario de humedad, es decir, entre el 40 y el 60 % de la capacidad máxima de retención de agua (véase el punto 13). Cada una de las soluciones de la sustancia problema se mezcla a fondo con un lote de suelo prehumedecido antes de introducirla en el recipiente de ensayo. Sustancia problema no hidrosoluble 20. En el caso de las sustancias no solubles en el agua, pero solubles en disolventes orgánicos, la sustancia problema puede disolverse en el volumen mínimo posible de un vehículo adecuado (por ejemplo, acetona). Solo deben utilizarse disolventes volátiles. El vehículo se rocía sobre una pequeña cantidad, como, por ejemplo, 2,5 g de arena de cuarzo fina, o se mezcla con ella. El vehículo se elimina por evaporación bajo una campana extractora durante al menos una hora. Esta mezcla de arena de cuarzo y sustancia problema se añade al suelo prehumedecido y se mezcla completamente después de añadir la cantidad adecuada de agua desionizada para obtener la humedad necesaria. La mezcla final se introduce en los recipientes de ensayo. 21. En el caso de sustancias poco solubles en agua y en disolventes orgánicos, se mezcla el equivalente de 2,5 g de arena de cuarzo finamente molida por recipiente de ensayo con la cantidad de sustancia problema necesaria para obtener la concentración de ensayo deseada. Esta mezcla de arena de cuarzo y sustancia problema se añade al suelo prehumedecido y se mezcla completamente después de añadir la cantidad adecuada de agua desionizada para obtener el contenido necesario de humedad. La mezcla final se divide entre los recipientes de ensayo. Se repite el procedimiento para cada concentración de ensayo, y se prepara asimismo un control adecuado. 22. Normalmente, las sustancias no deben someterse a ensayo a concentraciones superiores a 1 000 mg/kg de masa seca de suelo. Sin embargo, puede ser necesario efectuar ensayos a concentraciones más elevadas, de conformidad con los objetivos de un ensayo específico. REALIZACIÓN DE LOS ENSAYOS Grupos de ensayo y controles 23. Respecto a cada concentración de ensayo, se coloca en el recipiente de ensayo una cantidad de suelo de ensayo correspondiente a 20 g de peso seco, (véanse los puntos 19 - 21). Se preparan también controles, sin la sustancia problema. A cada recipiente se añaden alimentos con arreglo a los procedimientos descritos en el punto 29. Se asignan aleatoriamente diez gusanos a cada recipiente de ensayo. Los gusanos se transfieren con cuidado a cada recipiente de ensayo y se colocan en la superficie del suelo, por ejemplo utilizando pinzas de joyero, ganchos o asas. El número de réplicas para las concentraciones de ensayo y para los controles dependerá del diseño del ensayo (véase el punto 34). Los recipientes de ensayo se colocan en la incubadora de ensayo de forma aleatoria, y estas posiciones se vuelven a aleatorizar cada semana. 24. Si se utiliza un vehículo para la aplicación de la sustancia problema, debe someterse a ensayo, además de la serie con la sustancia problema, una serie de control con arena de cuarzo rociada o mezclada con el disolvente. La concentración de disolvente o dispersante ha de ser igual a la usada en los recipientes de ensayo que contienen la sustancia problema. Debe realizarse el ensayo de una serie de control con arena de cuarzo adicional (2,5 g por recipiente) en caso de sustancias que requieran añadirse de conformidad con los procedimientos descritos en el punto 21. Condiciones del ensayo 25. La temperatura de ensayo es de 20 ± 2 °C. Para disuadir a los gusanos de escaparse del suelo, se efectúa el ensayo en ciclos controlados de luz y oscuridad (preferentemente de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) con una iluminación de 400 a 800 lux en la zona de los recipientes de ensayo. 26. Con el fin de controlar la humedad del suelo, los recipientes se pesan al principio del ensayo y, posteriormente, una vez por semana. La pérdida de peso se compensa con la adición de una cantidad adecuada de agua desionizada. Cabe señalar que la pérdida de agua puede reducirse mediante el mantenimiento de una alta humedad ambiental (> 80 %) en la incubadora de ensayo. 27. El contenido de humedad y el pH han de medirse al principio y al final tanto de la prueba de determinación del intervalo como del ensayo definitivo. Deben efectuarse mediciones en muestras del suelo control y tratado (todas las concentraciones) que se habrán preparado y mantenido en las mismas condiciones que los cultivos de ensayo, pero sin adición de gusanos. Solo deben añadirse alimentos a estas muestras de suelo al comienzo del ensayo para facilitar la actividad microbiana. La cantidad de alimentos que se añade debe ser la misma que se añade a los cultivos de ensayo. No es necesario añadir más alimentos a estos recipientes durante el ensayo. Alimentación 28. Pueden utilizarse alimentos capaces de mantener la población de enquitreidos. Se ha visto que los copos de avena, preferiblemente tratados en el autoclave antes de su utilización para evitar la contaminación microbiana (el calentamiento también es adecuado), constituyen un alimento adecuado. 29. Los alimentos se añaden, al inicio, mezclando 50 mg de copos de avena molidos con el suelo de cada recipiente antes de introducir los gusanos. Después, los alimentos se suministran una vez por semana hasta el día 21. No se añaden alimentos el día 28, puesto que los adultos se han retirado en esta fase y los gusanos juveniles necesitan relativamente poca comida adicional más allá de este punto. Durante el ensayo, la alimentación se compone de 25 mg de copos de avena molidos por recipiente colocados cuidadosamente en la superficie del suelo para evitar dañar a los gusanos. Con el fin de reducir el crecimiento de hongos, los copos de avena deben enterrarse en el suelo cubriéndolos con pequeñas cantidades de este. Si queda comida sin consumir, la ración alimentaria debe reducirse. Diseño para el ensayo de determinación del intervalo 30. Cuando sea necesario, se llevará a cabo un ensayo de determinación del intervalo con, por ejemplo, cinco concentraciones de la sustancia problema, de 0,1, 1,0, 10, 100 y 1 000 mg/kg (peso seco de suelo). Es suficiente con una sola réplica para cada tratamiento y control. 31. La duración del ensayo de determinación del intervalo es de seis semanas. Al final del ensayo se determina la mortalidad de los gusanos. Se considera que un gusano está muerto si no reacciona ante un estímulo mecánico en el extremo anterior. Puede ser útil disponer de otros datos además de la mortalidad a la hora de decidir sobre el intervalo de concentraciones que debe usarse en el ensayo definitivo. Por tanto, también deben registrarse los cambios en el comportamiento de los adultos (por ejemplo, si se vuelven incapaces de excavar en el suelo o si se quedan inmóviles junto a la pared de vidrio del recipiente de ensayo) y en su morfología (p. ej., si tienen heridas abiertas), además de la eventual presencia de juveniles. Esta última puede determinarse con el método de tinción descrito en el apéndice 6. 32. La LC50 puede determinarse aproximadamente calculando la media geométrica de los datos de mortalidad. Al determinar el intervalo de concentraciones para el ensayo definitivo, se supone que la concentración con efecto sobre la reproducción es hasta diez veces inferior a la LC50. No obstante, se trata de una relación empírica y en algún caso específico podría ser diferente. Las observaciones adicionales realizadas en el ensayo de determinación del intervalo de concentraciones, tales como la presencia de juveniles, pueden contribuir a afinar el intervalo de concentraciones de la sustancia problema que debe utilizarse en el ensayo definitivo. 33. Con el fin de determinar de forma exacta la LC50, se recomienda realizar el ensayo utilizando un mínimo de cuatro réplicas de cada concentración de la sustancia problema y un número adecuado de concentraciones que causen al menos cuatro respuestas medias con diferencias estadísticamente significativas a estas concentraciones. Para los controles se utiliza un número similar de concentraciones y de réplicas, en su caso. Diseño para el ensayo definitivo de reproducción 34. Se proponen tres diseños sobre la base de las recomendaciones derivadas de una prueba interlaboratorios (2). — Para la determinación de la NOEC deben someterse a ensayo al menos cinco concentraciones en serie geométrica. Se recomienda utilizar cuatro réplicas de cada concentración de ensayo más ocho controles. Las concentraciones deben estar separadas por un factor que no exceda de 1,8. — Para la determinación de una ECx (p. ej., EC10, EC50), deben someterse a ensayo al menos cinco concentraciones, entre las que debe quedar englobada la ECx a fin de obtenerla mediante interpolación y no extrapolación. Se recomienda utilizar al menos cuatro réplicas de cada concentración de ensayo y cuatro réplicas de control. El factor de espaciado puede variar, es decir, ser igual o inferior a 1,8 en el intervalo de efecto previsto y superior a 1,8 a concentraciones superiores e inferiores. — Un enfoque combinado permite la determinación tanto de la NOEC como de la ECx. Deben utilizarse ocho concentraciones de tratamiento en progresión geométrica. Se recomienda utilizar cuatro réplicas de cada tratamiento más ocho controles. Las concentraciones deben estar separadas por un factor que no exceda de 1,8. 35. Se deben utilizar diez gusanos adultos por recipiente de ensayo (véase el punto 23). Se añaden alimentos a los recipientes de ensayo al inicio del ensayo y, a continuación, una vez por semana (véase el punto 29) hasta el día 21, incluido. El día 21 se toman a mano muestras de suelo y se observan y recuentan los gusanos adultos vivos, y se registran los cambios en el comportamiento (por ejemplo, si se vuelven incapaces de excavar en el suelo o si se quedan inmóviles junto a la pared de vidrio del recipiente de ensayo) y en la morfología (p. ej., si tienen heridas abiertas). A continuación, se retiran todos los gusanos adultos de los recipientes de ensayo y del suelo de ensayo. El suelo de ensayo que contiene los capullos que se hayan producido se incuba durante tres semanas adicionales en las mismas condiciones de ensayo, salvo que solo se añaden alimentos el día 35 (es decir, 25 mg de copos de avena molidos por recipiente). 36. Después de seis semanas, se efectúa el recuento de los gusanos recién nacidos. Se recomienda el método basado en la tinción con rojo de Bengala (véase el apéndice 6), aunque también se ha comprobado que son adecuadas otras técnicas de extracción y flotación por vía húmeda (pero sin calentamiento) (véase el apéndice 6) (4) (10) (11) (20). Se recomienda la tinción con rojo de Bengala porque la extracción por vía húmeda a partir de un sustrato de suelo puede verse obstaculizada por la turbidez causada por partículas de arcilla en suspensión. Ensayo límite 37. Si no se observan efectos a la concentración máxima en el ensayo de determinación del intervalo (es decir, 1 000 mg/kg), el ensayo de reproducción puede realizarse como un ensayo límite con 1 000 mg/kg, con el fin de demostrar que la NOEC para la reproducción es superior a ese valor. Resumen y calendario del ensayo 38. Las etapas del ensayo pueden resumirse como sigue: Día Ensayo de determinación del intervalo Ensayo definitivo Día –7 o antes — Preparación del suelo artificial (mezcla de los componentes secos) — Preparación del suelo artificial (mezcla de los componentes secos) Día –5 — Verificación del pH del suelo artificial — Medición de la capacidad máxima de retención de agua del suelo — Verificación del pH del suelo artificial — Medición de la capacidad máxima de retención de agua del suelo Días –5 a –3 — Clasificación de las lombrices para su aclimatación — Clasificación de las lombrices para su aclimatación Días –3 a 0 — Aclimatación de las lombrices durante al menos 24 horas — Aclimatación de las lombrices durante al menos 24 horas Día –1 — Prehumidificación del suelo artificial y distribución en lotes — Prehumidificación del suelo artificial y distribución en lotes Día 0 — Preparación de las soluciones madre — Aplicación de la sustancia problema — Pesada del sustrato problema en los recipientes de ensayo — Adición de los alimentos — Introducción de las lombrices — Medición del pH y del contenido de humedad del suelo — Preparación de las soluciones madre — Aplicación de la sustancia problema — Pesada del sustrato problema en los recipientes de ensayo — Adición de los alimentos — Introducción de las lombrices — Medición del pH y del contenido de humedad del suelo Día 7 — Comprobación del contenido de humedad del suelo — Comprobación del contenido de humedad del suelo — Adición de alimentos Día 14 — Determinación de la mortalidad de los adultos — Estimación del número de juveniles — Medición del pH y del contenido de humedad del suelo — Comprobación del contenido de humedad del suelo — Adición de alimentos Día 21 — Observación del comportamiento de los adultos — Retirada de los adultos — Determinación de la mortalidad de los adultos — Comprobación del contenido de humedad del suelo — Adición de alimentos Día 28 — Comprobación del contenido de humedad del suelo — Sin adición de alimentos Día 35 — Comprobación del contenido de humedad del suelo — Adición de alimentos Día 42 — Recuento de los gusanos juveniles — Medición del pH y del contenido de humedad del suelo DATOS E INFORME Tratamiento de los resultados 39. A pesar de que se da una visión de conjunto en el apéndice 7, en este método de ensayo no se incluye ninguna orientación estadística definitiva para el análisis de los resultados del ensayo. 40. En la prueba de determinación del intervalo, el parámetro principal es la mortalidad. Sin embargo, también deben registrarse los cambios en el comportamiento (por ejemplo, si se vuelven incapaces de excavar en el suelo o si se quedan inmóviles junto a la pared de vidrio del recipiente de ensayo) y en la morfología (p. ej., si tienen heridas abiertas) de los gusanos adultos, además de la eventual presencia de juveniles. Para determinar la LC50 debe aplicarse en principio el análisis de probit (21) o la regresión logística. No obstante, en aquellos casos en que este método de análisis no sea adecuado (por ejemplo, si se dispone de menos de tres concentraciones con mortalidades parciales) pueden utilizarse métodos alternativos. Entre estos métodos pueden figurar el de medias móviles (22), el método de Spearman-Karber recortado (23) o una interpolación simple (p. ej., media geométrica de LC0 y LC100, calculada multiplicando la raíz cuadrada de LC0 por LC100). 41. En el ensayo definitivo, el parámetro del ensayo es la fecundidad (es decir, el número de juveniles producidos). Sin embargo, como en el ensayo de determinación del intervalo, deben registrarse en el informe final todos los demás signos de naturaleza nociva. El análisis estadístico requiere que se calculen la media aritmética y la desviación típica por grupo de tratamiento y por grupo de control en cuanto a la reproducción. 42. Si se ha realizado el análisis de la varianza, la desviación típica, s, y los grados de libertad, df, pueden sustituirse respectivamente por la estimación de la varianza “agrupada” obtenida del ANOVA y por sus grados de libertad, siempre que la varianza no dependa de la concentración. En este caso, se utilizarán las distintas varianzas de los controles y de los grupos tratados. Estos valores son calculados en general por programas estadísticos comerciales utilizando los resultados de cada recipiente como réplicas. Si la “agrupación” de datos de los controles negativo y de disolvente parece más razonable que hacer las pruebas respecto a uno solo de estos conjuntos, debe comprobarse que no son significativamente diferentes (sobre pruebas apropiadas, véanse el punto 45 y el apéndice 7). 43. La realización de más pruebas estadísticas y de deducciones depende de si los valores de las réplicas se distribuyen normalmente y son homogéneas en lo que respecta a su varianza. Estimación de la NOEC 44. Es preferible la aplicación de ensayos potentes. Se debería utilizar la información previa obtenida, por ejemplo a partir de la experiencia con ensayos interlaboratorios u otros datos históricos, sobre si los datos presentan una distribución aproximadamente normal. Es más crítica la homogeneidad de la varianza (homoscedasticidad). La experiencia indica que la varianza suele aumentar cuando sube la media. En estos supuestos, una transformación de los datos podría llevar a la homoscedasticidad. Sin embargo, esta transformación debe basarse en la experiencia con datos históricos, más que en los datos objeto de la investigación. Con datos homogéneos, deben llevarse a cabo pruebas t de comparación múltiple, como la prueba de Williams (α = 0,05, unilateral) (24) (25) o, en algunos casos, la prueba de Dunnett (26) (27). Cabe señalar que, en caso de replicación desigual, los valores t del cuadro deberán corregirse según lo sugerido por Dunnett y Williams. En ocasiones, debido a una gran variación, las respuestas no aumentan o disminuyen regularmente. En este caso de fuerte desviación respecto a la monotonicidad, es más conveniente la prueba de Dunnett. En caso de que haya desviaciones con respecto a la homoscedasticidad, puede resultar razonable analizar más estrechamente los posibles efectos sobre las varianzas, a fin de decidir si las pruebas t pueden aplicarse sin perder mucha potencia (28). De forma alternativa, puede aplicarse una prueba U de comparación múltiple, por ejemplo la prueba U de Bonferroni según Holm (29), o, cuando estos datos presenten heteroscedasticidad pero por lo demás sean coherentes con una relación dosis-respuesta monótona subyacente, otra prueba no paramétrica [por ejemplo, una prueba de Jonckheere-Terpstra (30) (31) o Shirley (32) (33)] y, en general, se dará preferencia a estas pruebas frente a las pruebas t de varianza desigual (véase también el esquema del apéndice 7). 45. En caso de que se haya realizado un ensayo límite y se cumplan los requisitos previos de procedimientos de ensayos paramétricos (normalidad, homogeneidad), puede utilizarse la prueba t de Student pareada o, si no, el procedimiento de la prueba U de Mann-Whitney (29). Estimación de ECx 46. Para calcular cualquier valor de ECx se utilizan las medias por tratamiento para el análisis de regresión (lineal o no lineal), tras haber obtenido una función dosis-respuesta adecuada. En relación con el crecimiento de los gusanos como respuesta continua, pueden calcularse los valores de ECx utilizando el análisis de regresión adecuado (35). Entre las funciones adecuadas para los datos cuánticos (mortalidad/supervivencia y número de descendientes producidos) están las funciones sigmoideas normales, logísticas o de Weibull, con entre dos y cuatro parámetros, algunas de las cuales pueden modelizar también respuestas horméticas. Si la función dosis-respuesta se ha ajustado mediante análisis de regresión lineal, debe determinarse con el análisis de regresión un r2 (coeficiente de determinación) y/o una pendiente significativos antes de estimar la ECx mediante la inserción de un valor correspondiente a x % de la media del control en la ecuación encontrada con el análisis de regresión. Se calculan límites de confianza del 95 % con arreglo al método de Fieller [citado en Finney (21)] u otros métodos adecuados modernos. 47. Otra posibilidad consiste en modelizar la respuesta como porcentaje o proporción del parámetro del modelo que se interpreta como la respuesta media del control. En estos casos, la curva sigmoidea normal (logística, Weibull) puede ajustarse a menudo fácilmente a los resultados utilizando el método de regresión de probit (21). En estos casos, la función de ponderación ha de ajustarse para respuestas métricas según indica Christensen (36). No obstante, si se ha observado hormesis, el análisis de probit debe ser sustituido por una función logística o de Weibull de cuatro parámetros, ajustada por un método de regresión no lineal (36). Si no puede ajustarse a los datos una función dosis-respuesta adecuada, podrán utilizarse métodos alternativos para calcular el valor de ECx y sus límites de confianza, tales como el método de medias móviles de Thompson (22) y el de Spearman-Karber recortado (23). INFORME DEL ENSAYO 48. El informe del ensayo deberá incluir la información siguiente: Sustancia problema: — naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes (p, ej., hidrosolubilidad, presión de vapor, etc.), — identificación química de la sustancia problema según la nomenclatura de la IUPAC, número CAS, lote de fabricación, lote de acondicionamiento, fórmula estructural y pureza, — fecha de expiración de la muestra. Especies de ensayo: — animales utilizados en el ensayo: especie, nombre científico, origen de los organismos y condiciones de cría. Condiciones de ensayo: — ingredientes y preparación del suelo artificial, — método de aplicación de la sustancia problema, — descripción de las condiciones de ensayo, como la temperatura, la humedad, el pH, etc., — descripción completa del diseño experimental y procedimientos. Resultados del ensayo: — mortalidad de los gusanos adultos tras dos semanas y número de juveniles al final del ensayo de determinación del intervalo, — mortalidad de los gusanos adultos tras una exposición de tres semanas y registro completo de los juveniles al final del ensayo de determinación del intervalo, — cualquier síntoma físico o patológico y cambio en el comportamiento de los organismos de ensayo que se haya observado, — la LC50, la NOEC y/o ECx (p. ej., EC50, EC10) para la reproducción si algunas de ellas son aplicables con intervalos de confianza, y un gráfico del modelo ajustado utilizado para su cálculo, todas las informaciones y observaciones útiles para la interpretación de los resultados. Las eventuales desviaciones respecto a los procedimientos descritos en el presente método de ensayo y cualquier acontecimiento inusual ocurrido en el ensayo. BIBLIOGRAFÍA (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt Berlin, FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. (3) Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Olig