Reglamento (CE) no 213/2001 de la Comisión

de 9 de enero de 2001

por el que se establecen las disposiciones de aplicación del Reglamento (CE) n° 1255/1999, en lo que atañe a los métodos que deben utilizarse para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos, y se modifican los Reglamentos (CE) n° 2771/1999 y (CE) n° 2799/1999

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea,

Visto el Reglamento (CE) n° 1255/1999 del Consejo, de 17 de mayo de 1999, por el que se establece la organización común de mercados en el sector de la leche y de los productos lácteos(1), y, en particular, sus artículos 10 y 15, el apartado 3 de su artículo 26, el apartado 1 de su artículo 29 y el apartado 14 de su artículo 31,

Considerando lo siguiente:

(1) Los Reglamentos (CEE) n° 1216/68, (CEE) n° 3942/92, (CE) n° 86/94, (CE) n° 2721/95, (CE) n° 1080/96, (CE) n° 1081/96, (CE) n° 1082/96, (CE) n° 1854/96, (CE) n° 880/98 y (CE) n° 1459/98 de la Comisión, cuyas referencias completas figuran en el anexo XXVI del presente Reglamento, establecen los métodos de referencia y de rutina para el análisis y la evaluación de la calidad de la leche y de los productos lácteos, así como el ámbito y las normas de aplicación de los citados métodos. En aras de una mayor claridad y a fin de ofrecer a los agentes económicos del sector un corpus único de los citados métodos y sus normas de aplicación, es conveniente proceder a la refundición de los Reglamentos antes citados, reuniéndolos en un solo texto. Con ese mismo fin, es conveniente modificar los Reglamentos de la Comisión (CE) n° 2771/1999, de 16 de diciembre de 1999, por el que se establecen las disposiciones de aplicación del Reglamento (CE) n° 1255/1999 del Consejo en lo que respecta a las medidas de intervención en el mercado de la mantequilla y la nata(2) y (CE) n° 2799/1999, de 17 de diciembre de 1999, por el que se establecen las disposiciones de aplicación del Reglamento (CE) n° 1255/1999 en relación con la concesión de una ayuda a la leche desnatada y a la leche desnatada en polvo destinadas a la alimentación animal y con la venta de dicha leche desnatada en polvo(3), con el fin de incorporar al presente Reglamento sus anexos relativos a los métodos de análisis.

(2) Las características de la composición y de la calidad de la leche y de los productos lácteos fijadas en el marco de los regímenes establecidos en el Reglamento (CE) n° 1255/1999 deben comprobarse a fin de garantizar que se ajusten estrictamente a los requisitos establecidos.

(3) Se dispone con frecuencia que los métodos de referencia que deben utilizarse para tales comprobaciones son los publicados por organizaciones internacionales tales como CEN, FIL, ISO y AOAC International, los cuales son actualizados periódicamente por dichas organizaciones. En determinados casos, se establece un método de referencia comunitario. En otros casos, la normativa comunitaria no especifica ningún método de referencia. A fin de garantizar la uniformidad de la aplicación de los métodos de referencia, es conveniente establecer anualmente una lista de los métodos de referencia y especificar que el método aplicable debe figurar en tal lista.

(4) No debe excluirse la utilización de métodos de rutina, por lo que deben especificarse las condiciones de su aplicación.

(5) A fin de establecer una práctica uniforme en materia de evaluación de los resultados de análisis, es conveniente fijar también una serie de métodos comunes. Lo mismo se aplica a la evaluación organoléptica de los productos en cuestión y al reexamen de los resultados que hayan sido impugnados.

(6) En el caso de determinados análisis no existen actualmente métodos de referencia aceptados a escala internacional que hayan sido validados. Por consiguiente, no se dispone de información relativa a las variaciones de los resultados de análisis entre los distintos laboratorios. Es conveniente por lo tanto fijar determinados métodos a escala comunitaria, que hayan sido validados de conformidad con las normas establecidas a escala internacional y que se apliquen como métodos de referencia.

(7) El Reglamento (CE) n° 2571/97 de la Comisión, de 15 de diciembre de 1997, relativo a la venta de mantequilla a precio reducido y a la concesión de una ayuda para la nata, la mantequilla y la mantequilla concentrada destinadas a la fabricación de productos de pastelería, helados y otros productos alimenticios(4), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CE) n° 635/2000(5), establece la adición de marcadores a la nata, la mantequilla y la mantequilla concentrada en determinadas circunstancias, con objeto de garantizar la correcta utilización final de esos productos. Teniendo en cuenta la importancia que la adición de marcadores reviste para la adecuada aplicación del régimen y a fin de garantizar un trato equitativo a los agentes económicos partícipes en el mismo, es conveniente establecer, en la medida de lo posible, unos métodos comunes para la determinación de algunos de esos marcadores.

(8) A la mantequilla concentrada deben añadírsele marcadores bajo control, de conformidad con el Reglamento (CEE) n° 3143/85 de la Comisión, de 11 de noviembre de 1985, relativo a la comercialización a precio reducido de mantequilla de intervención destinada al consumo inmediato en forma de mantequilla concentrada(6), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CE) n° 101/1999(7), y el Reglamento (CEE) n° 429/90 de la Comisión, de 20 de febrero de 1990, relativo a la concesión mediante licitación de una ayuda para la mantequilla concentrada destinada al consumo inmediato en la Comunidad(8), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CE) n° 124/1999(9), y el Reglamento (CE) n° 2571/97. El estricto cumplimiento de los requisitos relativos a la adición de marcadores a la mantequilla concentrada es indispensable para prevenir el riesgo de desviación. Es conveniente por lo tanto definir un método común de detección de esos marcadores.

(9) Puede concederse una ayuda al almacenamiento privado de quesos a base de leche de oveja en virtud del artículo 9 del Reglamento (CE) n° 1255/1999. Puede concederse una restitución especial en el caso de esos mismos productos en virtud del artículo 31 del citado Reglamento. Está prevista la importación en la Comunidad de quesos a base de leche de ovej a, leche de cabra y leche de búfala, o sus mezclas, procedentes de determinados terceros países en condiciones preferentes. Teniendo en cuenta las disposiciones antes citadas, es necesario comprobar mediante controles adecuados que no se ha incorporado leche de vaca a los productos en cuestión. Por consiguiente, es conveniente establecer un método de referencia comunitario para la detección de la leche de vaca, sin perjuicio de la utilización de métodos de rutina, siempre que éstos se ajusten a determinados criterios.

(10) Según el Reglamento (CEE) n° 2921/90 de la Comisión, de 10 de octubre de 1990, referente a la concesión de ayudas para la leche desnatada con vistas a la fabricación de caseína y de caseinatos(10), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CE) n° 2654/1999(11), debe comprobarse la ausencia de coliformes. El método de referencia aceptado a escala internacional para la detección de coliformes en la leche y los productos lácteos es la norma internacional FIL73A: 1985. No obstante, esta norma sólo es aplicable en forma modificada a la detección de coliformes en una cantidad determinada de producto. Se ha establecido por lo tanto un método comunitario de referencia para la detección de coliformes basado en la norma anteriormente mencionada.

(11) El Reglamento (CEE) n° 2658/87 del Consejo, de 23 de julio de 1987, relativo a la nomenclatura arancelaria y estadística y al arancel aduanero común(12), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CE) n° 254/2000(13), establece distintos tipos de derechos de aduana en el caso de los piensos compuestos de la partida arancelaria 2309, en función de su contenido de productos lácteos. Con objeto de garantizar una aplicación uniforme de las disposiciones consideradas, es conveniente establecer un método de análisis del contenido de lactosa obligatorio para todos los Estados miembros, eligiendo a tal fin un método que goce de reconocimiento general.

(12) Según el Reglamento (CE) n° 1255/1999, deben cumplirse determinadas condiciones relativas a la calidad de la mantequilla y la leche desnatada en polvo destinadas a la intervención o, en el caso de la leche desnatada en polvo, destinada a la alimentación animal. Es conveniente por lo tanto establecer determinados métodos de referencia que permitan comprobar si se cumplen dichas condiciones.

(13) La utilización de algunos de los métodos implantados por primera vez a través del presente Reglamento requiere un período de adaptación, por lo que es conveniente aplazar su aplicación.

(14) El Comité de gestión de la leche y los productos lácteos no ha emitido ningún dictamen en el plazo establecido por su presidente.

HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:

CAPÍTULO I

DISPOSICIONES GENERALES

Artículo 1

Objeto y ámbito de aplicación

El presente Reglamento establece las disposiciones de aplicación de los métodos de análisis químico, físico y microbiológico y la evaluación organoléptica de la leche y los productos lácteos en el marco de los regímenes previstos en la organización común de mercados en el sector de la leche y de los productos lácteos establecida en el Reglamento (CE) n° 1255/1999, así como algunos de esos métodos.

Artículo 2

Lista de métodos

1. Se establece en el anexo I la lista de los métodos de referencia aplicables a los análisis a que se refiere el artículo 1.

2. La Comisión actualizará la citada lista al menos una vez al año, de conformidad con el procedimiento establecido en el artículo 42 del Reglamento (CE) n° 1255/1999.

Artículo 3

Métodos de rutina

Podrán utilizarse métodos de rutina para los análisis previstos en la normativa comunitaria siempre que dichos métodos sean correctamente calibrados y periódicamente controlados con respecto al método de referencia.

El procedimiento indicado en el anexo II podrá aplicarse a la comprobación de los resultados, obtenidos por medio de métodos de rutina, próximos de los límites establecidos en los Reglamentos correspondientes.

En caso de litigio, los resultados obtenidos con el método de referencia serán determinantes.

Artículo 4

Validación de los métodos de referencia

1. Los métodos de referencia serán validados si se ajustan a determinados criterios previamente establecidos, relativos a la precisión, en lo que atañe al límite de repetibilidad y reproducibilidad.

2. En caso de que no se haya validado un método de referencia establecido en los Reglamentos correspondientes, los Estados miembros establecerán un límite de reproducibilidad provisional.

Este límite se obtendrá mediante la aplicación del procedimiento establecido en la letra b) del anexo III. No obstante, los Estados miembros podrán utilizar un procedimiento equivalente durante los dieciocho meses siguientes a la entrada en vigor del presente Reglamento.

La observancia del límite establecido se comprobará al menos una vez al año.

3. En caso de que los resultados de la aplicación de métodos de referencia validados o de métodos con cifras provisionales relativas a la precisión indiquen que se ha rebasado un límite determinado, se aplicará el método de evaluación de los resultados de análisis descrito en el anexo IV para la determinación de la diferencia crítica con respecto a tal límite.

Artículo 5

Admisibilidad de los resultados de análisis

1. Los análisis se efectuarán en laboratorios que apliquen un método interno de control de calidad conforme al método descrito en la letra a) del anexo V, o un método de nivel equivalente.

Deberá disponerse en el laboratorio de una descripción detallada del método aplicado.

2. Los laboratorios establecerán sus propias normas internas de precisión, dentro de una serie válida para todos los métodos, de acuerdo con:

a) el método definido en la letra b) del anexo V, o

b) un método validado y publicado, con una repetibilidad establecida.

La observancia del límite de reproducibilidad deberá comprobarse al menos una vez al año, de conformidad con el procedimiento establecido en la letra a) del anexo III.

Las disposiciones del párrafo segundo no se aplicarán si el laboratorio ha participado en un programa de pruebas de capacidad durante el año en cuestión.

3. El informe de laboratorio sobre los resultados de un análisis deberá incluir datos suficientes para proceder a una evaluación de los resultados de acuerdo con los anexos IV y VIII.

4. Los resultados de un análisis se considerarán admisibles si se han obtenido de conformidad con los criterios de aceptabilidad especificados en el método interno de control de calidad a que se refiere el apartado 1 y las normas internas de precisión contempladas en el apartado 2.

Artículo 6

Evaluación organoléptica

1. Por lo que se refiere a la mantequilla, la labor de los evaluadores y la fiabilidad de los resultados se comprobarán mediante la aplicación de los métodos establecidos en el anexo VI. El método descrito en el anexo VII se aplicará como método de referencia para la evaluación organoléptica.

2. En lo que atañe a la leche y los productos lácteos distintos de la mantequilla, los Estados miembros utilizarán como método de referencia para la evaluación organoléptica bien la norma FIL99C/1997, bien otros métodos equivalentes que comunicarán a la Comisión.

La labor de los evaluadores y la fiabilidad de los resultados podrán evaluarse mediante la aplicación de los métodos establecidos en el anexo VI.

Artículo 7

Muestreo e impugnación de los resultados de análisis

1. Se tomarán muestras por duplicado para la realización de los análisis previstos en la normativa comunitaria.

2. En caso de que el agente económico no acepte los resultados de un análisis determinado, se aplicará el procedimiento establecido en el anexo VIII.

CAPÍTULO II

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Artículo 8

Contenido de agua/extracto seco/materias grasas de la mantequilla

1. El método de análisis que figura en el anexo IX se aplicará como método de referencia para la determinación del contenido de agua de la mantequilla.

2. El método de análisis establecido en el anexo X se aplicará como método de referencia para la determinación del extracto seco magro de la mantequilla.

3. El método de análisis que figura en el anexo XI se aplicará como método de referencia para la determinación del contenido de materias grasas de la mantequilla.

Artículo 9

Marcadores

1. El método de análisis que figura en el anexo XII se aplicará como método de referencia para la determinación de la vainillina en la mantequilla concentrada, la mantequilla y la nata.

2. El método de análisis establecido en el anexo XIII se aplicará como método de referencia para la determinación de la cantidad de éster etílico del ácido β-apo-8'-caroténico en la mantequilla y la mantequilla concentrada.

3. El método de análisis que figura en el anexo XIV se aplicará como método de referencia para la determinación del contenido de estigmasterol y β-sitosterol en la mantequilla y la mantequilla concentrada.

4. La adición de marcadores a la mantequilla concentrada, la mantequilla y la nata se habrá efectuado de conformidad con la normativa comunitaria pertinente si los resultados obtenidos corresponden a las especificaciones del punto 8 de los anexos a que se refieren los apartados 1, 2 y 3.

Artículo 10

Detección de la caseína de la leche de vaca

1. El método de análisis de referencia que figura en el anexo XV se aplicará para garantizar que los quesos que han de elaborarse exclusivamente con leche de oveja, leche de cabra o leche de búfala, o sus mezclas, no contienen caseína de leche de vaca.

Si el contenido aparente de caseína de leche de vaca de la muestra analizada es igual o superior al contenido de la muestra de referencia con un 1 % de leche de vaca que se describe en el anexo XV, se considerará que el producto contiene caseína de leche de vaca.

2. Los métodos de rutina utilizados para la detección de caseína de leche de vaca en los quesos mencionados en el apartado 1 podrán emplearse en las siguientes condiciones:

a) su límite de detección deberá ser igual o inferior al 0,5 %;

b) no se deberán producir falsos positivos;

c) la caseína de leche de vaca deberá poder detectarse con la sensibilidad necesaria incluso tras largos períodos de maduración, como puede suceder en las condiciones comerciales habituales.

En caso de no cumplirse la condición señalada en la letra b), toda muestra que dé resultado positivo deberá analizarse mediante la aplicación del método de referencia.

En caso de no cumplirse la condición señalada en la letra c) respecto a un determinado tipo de queso mencionado en el artículo 1, ese queso deberá analizarse mediante la aplicación del método de referencia.

Artículo 11

Detección de coliformes

1. El método de análisis de referencia que figura en el anexo XVI se utilizará para la detección de coliformes en la mantequilla, la leche desnatada en polvo, la caseína y los caseinatos.

2. Podrán utilizarse métodos de rutina para la detección de coliformes a condición de que los resultados conseguidos sean comparables a los obtenidos con el método de referencia que figura en dicho anexo. Los métodos de rutina tendrán que contar con un límite de detección suficiente. No se deberán producir falsos negativos. Si no puede descartarse la aparición de falsos positivos, todos los resultados positivos deberán confirmarse mediante la aplicación del método de referencia.

Artículo 12

Contenido de lactosa

El método de determinación del contenido de lactosa de los productos de la partida 2309 de la nomenclatura combinada es el que establece el anexo XVII.

Artículo 13

Detección del suero de cuajo

1. El método de detección del suero de cuajo en la leche desnatada en polvo destinada al almacenamiento público es el que figura en el anexo XVIII.

2. El método de detección del suero de cuajo en la leche desnatada en polvo y en las mezclas destinadas a la alimentación animal es el que establece el anexo XIX.

Artículo 14

Detección del suero de mantequilla

El método de detección del suero de mantequilla en la leche desnatada en polvo es el que figura en el anexo XX.

Artículo 15

Residuos de antimicrobianos

El método de detección de los residuos de antibióticos y de sulfonamidas/dapsona en la leche desnatada en polvo es el que se establece en el anexo XXI.

Artículo 16

Contenido de leche desnatada en polvo

El método de determinación del contenido de leche desnatada en polvo de los piensos compuestos es el que figura en el anexo XXII.

Artículo 17

Detección del almidón

El método de detección del almidón en la leche desnatada en polvo, la leche en polvo desnaturalizada y los piensos compuestos es el que se establece en el anexo XXIII.

Artículo 18

Contenido de humedad del suero de mantequilla ácido en polvo

El método de determinación del contenido de humedad del suero de mantequilla ácido en polvo que vaya a utilizarse en los piensos es el que figura en el anexo XXIV.

Artículo 19

Detección de grasas extrañas

El método de detección de grasas extrañas en la grasa de la leche es el que se establece en el anexo XXV.

CAPÍTULO III

DISPOSICIONES FINALES

Artículo 20

Modificación del Reglamento (CE) n° 2771/1999

El Reglamento (CE) n° 2771/1999 queda modificado como sigue:

1) En el apartado 1 del artículo 4, la primera frase se sustituye por el texto siguiente: "Las autoridades competentes controlarán la calidad de la mantequilla de acuerdo con los métodos contemplados en el anexo I y sobre la base de las muestras tomadas con arreglo a lo dispuesto en el anexo IV.".

2) En el anexo I, el texto de la nota a pie de página n° 2 se sustituye por el siguiente: "Véase el anexo I del Reglamento (CE) n° 213/2001 (el presente Reglamento).".

3) Se suprimen los anexos II y III.

4) En el penúltimo renglón del punto 2 del anexo IV, los términos "al anexo III" se sustituyen por "al anexo VII del Reglamento (CE) 213/2001 (el presente Reglamento)".

Artículo 21

Modificación del Reglamento (CE) n° 2799/1999

El Reglamento (CE) n° 2799/1999 queda modificado como sigue:

1) En el artículo 20, el texto de los apartados 1, 2, 3 y 4 se sustituye por el siguiente: "1. El contenido de leche desnatada en polvo de las mezclas y piensos compuestos se comprobará por medio de un análisis, efectuado al menos por duplicado, de acuerdo con el método que se indica en el anexo XXII del Reglamento (CE) 213/2001 (el presente Reglamento), completado por las medidas de control mencionadas en el apartado 3 del artículo 17 del presente Reglamento. En caso de discordancia entre los resultados de estas comprobaciones, el resultado de los controles realizados in situ será determinante.

2. La ausencia de suero de cuajo se determinará según el método especificado en el anexo XIX del Reglamento (CE) 213/2001 (el presente Reglamento).

3. El contenido de almidón de los piensos compuestos se determinará mediante la aplicación de las medidas de control mencionadas en el apartado 3 del artículo 17 del presente Reglamento, que deberán completarse con el método de análisis que figura en el anexo XXIII del Reglamento (CE) 213/2001 (el presente Reglamento).

4. El contenido de humedad del suero de mantequilla ácido en polvo se determinará según el método que figura en el anexo XXIV del Reglamento (CE) 213/2001 (el presente Reglamento).".

2) Se suprimen los anexos III, IV, V y VI.

Artículo 22

Derogaciones

Quedan derogados los Reglamentos (CEE) n° 1216/68, (CEE) n° 3942/92, (CEE) n° 86/94, (CE) n° 2721/95, (CE) n° 1854/96, (CE) n° 1080/96, (CE) n° 1081/96, (CE) n° 1082/96, (CE) n° 880/98 y (CEE) n° 1459/98.

Las referencias a dichos Reglamentos derogados se entenderán como referencias al presente Reglamento.

Artículo 23

Entrada en vigor

El presente Reglamento entrará en vigor el séptimo día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.

No obstante, los métodos establecidos en el anexo III, el punto 4 del anexo IV y los anexos V, VI y VIII serán aplicables a los dieciocho meses de la entrada en vigor del presente Reglamento.

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.

Hecho en Bruselas, el 9 de enero de 2001.

Por la Comisión

Franz Fischler

Miembro de la Comisión

(1) DO L 160 de 26.6.1999, p. 48.

(2) DO L 333 de 24.12.1999, p. 11.

(3) DO L 340 de 31.12.1999, p. 3.

(4) DO L 350 de 20.12.1997, p. 3.

(5) DO L 76 de 25.3.2000, p. 9.

(6) DO L 298 de 12.11.1985, p. 9.

(7) DO L 11 de 16.1.1999, p. 14.

(8) DO L 45 de 21.2.1990, p. 8.

(9) DO L 16 de 21.1.1999, p. 19.

(10) DO L 279 de 11.10.1990, p. 22.

(11) DO L 325 de 17.12.1999, p. 10.

(12) DO L 256 de 7.9.1987, p. 1.

(13) DO L 28 de 3.2.2000, p. 16.

ANEXO I

(Artículo 2)

LISTA DE LOS MÉTODOS DE REFERENCIANotas relativas a la lista de métodos de referencia de la Unión Europea.

Nota 1: aislamiento de la materia grasa láctea según se describe en la norma FIL 6B:1989 (protección de la luz).

Nota 2: no se ha establecido ningún método de referencia.

Nota 3: la preparación de la muestra debe efectuarse con arreglo a la norma FIL 122C:1996 o FIL 73A:1985.

Nota 4: incubación durante das 48 horas a una temperatura de 55 °C; deben tomarse precauciones para evitar la desecación de los medios de cultivo.

Nota 5: % e.s.m. = % extraco seco - % materia grasa.

Nota 6: la mantequilla debe corresponder a la clase nacional de calidad del Estado de producción a que se refiere el anexo V del Reglamento (CE) n° 2771/99 de la Comisión.

Nota 7: Directiva (CEE) n° 4/84 de la Comisión.

Nota 8: Reglamento (CE) n° 1758/94 de la Comisión (DO L 183 de 19.7.1994, p. 14).

Nota 9: Directiva 78/633/CEE de la Comisión.

>SITIO PARA UN CUADRO>

>SITIO PARA UN CUADRO>

ANEXO II

(Artículo 3)

COMPROBACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS POR MEDIO DE MÉTODOS DE RUTINA, PRÓXIMOS A LOS LÍMITES RELATIVOS A LAS CARACTERÍSTICAS DE COMPOSICIÓN Y CALIDAD ESTABLECIDOS EN LOS REGLAMENTOS

Si m0 constituye un límite relativo a las características de composición y calidad establecidas en un Reglamento, el límite de decisión (L) será

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

si RRut/RRef <= 1RRut: límite de reproducibilidad del método de rutina;

RRef: límite de reproducibilidad del método de referencia.

Si mo constituye un límite superior y RRut/RRef > 1, el límite de decisión se obtendrá mediante la fórmula:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

Si, en las mismas condiciones, m0 constituye un límite inferior, el límite de decisión se obtendrá mediante:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

donde

CrD95: es la diferencia crítica del método de referencia (véase el anexo IV).

En caso de que mo constituya un límite superior, el resultado final obtenido por medio de un método de rutina, superior al límite de decisión, deberá ser sustituido por el resultado final obtenido por medio del método de referencia. Este resultado final deberá basarse al menos en el mismo número de análisis y de muestras que el resultado final del método de rutina.

En caso de que mo constituya un límite inferior, deberá aplicarse el mismo procedimiento en caso de que el resultado final obtenido por medio de un método de rutina sea inferior al límite de decisión.

Nota

El procedimiento descrito anteriormente podrá aplicarse cuando no haya efectos matriciales detectables.

Estos efectos pueden detectarse del siguiente modo: para cada una de las muestras utilizadas para el calibrado, se calcula la diferencia (wi) entre los resultados obtenidos mediante el método de referencia y mediante el método de rutina.

La desviación típica calculada por medio de la fórmula siguiente:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

m: número de muestras utilizadas para el calibrado

se compara con la media aritmética de la desviación típica de repetibilidad del método de referencia y del método de rutina:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

No puede excluirse un efecto matricial si

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siendo

f= m (f: número de grados de libertad)

α= probabilidad de error; α = 0,05.

En tal caso, serán necesarias investigaciones posteriores para poder fijar un límite de decisión.

ANEXO III

(Artículos 4 y 5)

a) Procedimiento de determinación de la conformidad con un límite de reproductibilidad establecido (análisis químico)

La conformidad con el límite de reproducibilidad se comprobará comparando los resultados del laboratorio con los de un laboratorio experimentado(1), obtenidos con una muestra idéntica. Se efectuará una doble determinación en ambos laboratorios y se evaluarán los resultados mediante la siguiente fórmula:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo:

CrD95: diferencia crítica (P = 0,95)

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>: media aritmética de dos resultados obtenidos en el laboratorio 1

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>: media aritmética de dos resultados obtenidos en el laboratorio 2

R: límite de reproducibilidad: deberá establecerse mediante interpolación

r: límite de repetibilidad: en caso de que la precisión varíe en función de la concentración.

Si se rebasa la diferencia crítica, deberá realizarse otra experiencia en un plazo de dos meses. En caso de que los resultados de esta segunda experiencia no se ajusten al límite de reproducibilidad, las autoridades competentes deberán adoptar todas las medidas necesarias.

b) Procedimiento aplicable a la obtención de un límite de reproducibilidad provisional (análisis químico)

Se obtendrá un límite de reproducibilidad provisional (Rprov) por medio de la siguiente ecuación:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>: media de los resultados obtenidos en el laboratorio 1

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>: media de dos resultados obtenidos en el laboratorio 2 [véase la letra a) del anexo III]

r: límite de repetibilidad o límite de repetibilidad provisional.

Notas:

1. Rprov podrá utilizarse para calcular las diferencias críticas (véase el anexo VI).

2. Rprov se establecerá en 2r en caso de que el valor calculado para Rprov sea inferior a 2r.

3. En caso de que el valor calculado sea superior a 3r o a dos veces el valor de R obtenido mediante la ecuación de Horwitz(2), Rprov resultará demasiado elevado y no podrá utilizarse para el cálculo de la diferencia crítica.

4. Rprov deberá calcularse al menos una vez al año sobre la base de los resultados obtenidos en dos laboratorios (véase el anexo IV).

5. El valor medio de Rprov deberá utilizarse para el cálculo de la diferencia crítica. Las normas recogidas en los puntos 2 y 3 se aplicarán al valor medio de Rprov.

El límite de reproducibilidad (valor R) se obtendrá a partir del valor de RSDR del siguiente modo:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

(>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

= media aritmética de los resultados obtenidos).

Exemplos de valores de RSDR calculados:

>SITIO PARA UN CUADRO>

Para una concentración del analito de 1 g/100 g se obtiene:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>.

(1) En términos generales, el laboratorio experimentado deberá ser un laboratorio que haya participado con resultados satisfactorios bien en la validación del método de prueba, bien en una prueba de capacidad.

(2) Ecuación de Horwitz:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo:

RSDR: desviación típica de la reproducibilidad

c: concentración expresada como fracción decimal (por ejemplo: 10 g/100 g = 0,1).

Referencia:

Peeler, J.T., Horwitz, W. y Albert, R.:

J. Ass. Off. Anal. Chem.

72 (5), 784-806 (1989).

ANEXO IV

(Artículo 4)

EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS DE ANÁLISIS OBTENIDOS DE ACUERDO CON MÉTODOS VALIDADOS

En caso de que el resultado de un análisis indique que se ha superado un determinado límite, se calculará la media aritmética de dos resultados o más. Se aplicará el procedimiento siguiente:

1) En caso de que el resultado del análisis consista en un resultado único, deberá procederse a un segundo análisis en condiciones de repetibilidad. En caso de que los dos análisis no puedan llevarse a cabo en esas condiciones, deberá procederse a un nuevo análisis por duplicado en condiciones de repetibilidad y utilizarse esos resultados para la evaluación de la conformidad con la diferencia crítica.

2) Se calculará el valor absoluto de la diferencia entre la media aritmética de los resultados obtenidos en condiciones de repetibilidad y el límite. En caso de que el valor absoluto de esta diferencia resulte superior a la diferencia crítica, ello significa que la muestra analizada no se ajusta a los requisitos.

La diferencia crítica se calculará por medio de la siguiente fórmula:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>: media aritmética de los resultados obtenidos;

mo: límite;

n: número de análisis/muestra.

En caso de que la precisión varíe en función de la concentración, posiblemente sea necesario determinar r y R mediante interpolación.

Normalmente, el resultado final registrado para una muestra determinada deberá indicar que se ha respetado un determinado límite.

Por consiguiente, sólo en casos excepcionales deberían registrarse unos resultados finales

- comprendidos entre

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

y

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>, en caso de que el límite constituya un valor máximo,

- o comprendidos entre

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

y

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>, en caso de que el límite constituya un valor mínimo.

Los resultados finales situados en los intervalos antes mencionados sólo serán aceptables si se producen como máximo una vez por cada cinco muestras analizadas por lote. En caso de analizarse menos de cinco muestras por lote, será aceptable un resultado situado en el intervalo mencionado. No obstante, si se trata de envíos que proceden repetidamente de un determinado productor, deberá aplicarse la norma según la cual se obtendrá un solo resultado dentro de los intervalos citados por cada cinco muestras analizadas.

3) En caso de que el resultado final x se calcule por medio de una fórmula de tipo x = y1 +- y2 (por ejemplo: agua + contenido de extracto seco magro de la mantequilla para calcular el contenido de materia grasa), en la que y1 e y2 representan los resultados finales de un solo tipo de análisis, los límites generales de repetibilidad y reproducibilidad rx y Rx de los resultados finales x se calcularán del siguiente modo:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

representando r1 y r2 los límites de repetibilidad y R1 y R2 los límites de reproducibilidad de y1 e y2,, respectivamente.

x se compará con el límite mo,, de acuerdo con las normas especificadas en los puntos 1 y 2. La diferencia crítica se calculará mediante la fórmula siguiente:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

representando x la media aritmética de los resultados x1 obtenidos.

4) En caso de que el resultado final se calcule mediante una fórmula de tipo

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

(por ejemplo, contenido de grasa del extracto seco del queso)

representando y1 e y2 los resultados finales de un solo tipo de análisis, los límites generales de repetibilidad y reproducibilidad rx y Rx se calcularán del siguiente modo:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

μ1: valor límite u objetivo para y1 (por ejemplo, materia grasa);

μ2: valor límite u objetivo para y2 (por ejemplo, extracto seco);

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo

r1: límite de repetibilidad y1

r2: límite de repetibilidad y2

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo

R1: límite de reproducibilidad y1

R2: límite de reproducibilidad y2

Los procedimientos de cálculo de rx y Rx sólo serán aplicables si los límites relativos de repetibilidad y reproducibilidad (r*1, r*2, R*1 y R*2) son inferiores o iguales a 0,15.

x se compará con el límite μx de acuerdo con las normas establecidas en los puntos 1 y 2. La diferencia crítica se calculará por medio de la fórmula siguiente:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

en la que

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

representa la media aritmética de los resultados x obtenidos por orden cronológico(1).

(1) Nota:

Por ejemplo, si se obtienen los resultados y11, y12, y21 e y22, deberá calcularse la media aritmética de y11/y21 e y12/y22.

ANEXO V

CONTROL INTERNO

(Artículo 5)

a) Método de control interno de calidad (CIC) (análisis químico)

Definición del material de control

El material utilizado a efectos del CIC se someterá al mismo procedimiento, o parte del mismo procedimiento, que el que se aplica a los materiales sometidos a prueba.

El material de control podrá ser, por ejemplo:

- un material de referencia certificado,

- un material de referencia interno,

- un material aprobado mediante pruebas interlaboratorios,

- un material enriquecido.

Procedimiento que deberá aplicarse para establecer el CIC

El laboratorio deberá establecer el CIC de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento de la UIQPA titulado "Directrices Armonizadas Relativas al Control Interno de Calidad en los Laboratorios de Análisis"(1).

El CIC deberá realizarse mediante la inclusión de materiales de control en la secuencia analítica o mediante la replicación del análisis de la muestra problema. El material de control deberá ser similar a las muestras sometidas a prueba desde el punto de vista de la composición química y poseer una estabilidad adecuada a lo largo del período en cuestión. Deberá demostrarse que puede dividirse de forma adecuada en porciones idénticas para su análisis y que presenta una concentración del analito apropiada para la zona de interés.

Al menos una vez en cada serie de análisis, deberá insertarse material de control y el valor obtenido deberá señalarse en un gráfico de control con el fin de medir los errores a largo plazo. Además, el laboratorio deberá demostrar periódicamente que cumple las condiciones de repetibilidad durante la serie de análisis, lo cual podrá efectuarse mediante la repetición del análisis de los materiales de control o de los materiales que vayan a someterse a prueba. Los resultados de estos análisis deberán compararse con los límites de repetibilidad publicados y con los datos ya existentes relativos a la precisión interna.

En caso de que se utilicen materiales de control, los valores obtenidos para el análisis del material de control entre una serie y otra se indicarán en un gráfico de Shewhart [ISO 8258 (1991)] con límites adecuados de control. Los límites de actuación se establecerán en:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>,

representando st la desviación típica total,

y los límites de aviso en:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

Desviación típica total:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo

sb: desviación típica entre series

sw: desvíación típica dentro de una serie

n: número de determinaciones.

En los casos en los que no se utilicen materiales de control (por ejemplo, por falta de estabilidad), al menos uno de los materiales sometidos a prueba deberá analizarse por duplicado en cada serie.

Se indicarán en un gráfico las diferencias absolutas obtenidas a partir de los análisis por duplicado efectuados dentro de una serie (véase el anexo III). La línea central representa 1,128 sw, el límite inferior es igual a 0 y el límite superior (límite de actuación) es de 3,686 sw, representando sw la desviación típica dentro de la serie.

El procedimiento de control deberá incluir materiales de niveles alto y bajo cuando exista una amplia gama de concentraciones.

En caso de que los materiales sometidos a prueba cubran una amplia gama de concentraciones de analito, el laboratorio deberá establecer la relación entre precisión y nivel de concentración. En caso de que la precisión sea proporcional al nivel de concentración, el control siguiente deberá efectuarse sobre la base de la precisión relativa (es decir, la diferencia absoluta expresada en porcentaje del valor medio).

El sistema analítico deja de ser fiable en caso de darse una de las situaciones siguientes:

A. el valor actual de la representación gráfica se sitúa fuera de los límites de actuación;

B. el valor actual y el valor anterior se sitúan fuera de los límites de aviso, aunque dentro de los límites de actuación;

C. en caso de utilizarse materiales de control, nueve valores sucesivos caen a un mismo lado de la línea mediana.

En estas situaciones, el laboratorio deberá:

A. suspender el análisis en espera de los resultados de las pruebas de diagnóstico y de las medidas destinadas a paliar la situación y

B. rechazar la serie de resultados y hacer un nuevo análisis de los materiales sometidos a prueba.

b) Procedimiento de selección del material de control interno y de determinación de los límites internos de precisión (análisis químico)

Los datos relativos a la precisión interna de las pruebas de laboratorio podrán obtenerse mediante la replicación de los análisis de materiales de control o de los análisis de las muestras que vayan a someterse a prueba.

El siguiente enfoque podrá ser aplicado por los laboratorios como línea directriz para la determinación de los parámetros de precisión relativos a las variaciones dentro de una misma serie y entre distintas series y utilizarlos posteriormente para la elaboración de gráficos de control. Los laboratorios podrán utilizar procedimientos alternativos siempre que puedan demostrar de forma fehaciente que han obtenido datos fidedignos en materia de precisión.

1. Selección de los materiales de control

En caso de que resulte oportuno que el laboratorio utilice un material de control determinado, ante todo deberán recopilarse datos con el fin de establecer límites. Si es posible, deberán utilizarse materiales de referencia certificados (MRC). Los materiales de control propuestos deberán ser analizados en condiciones de repetibilidad dentro de una misma serie que incluya unos MRC adecuados y ser objeto de repetición y de pruebas al azar. En caso de que no sea posible aplicar este enfoque, los laboratorios deberán intentar participar en pruebas de capacidad y establecer medios consensuados (valores asignados) que puedan considerarse como un auténtico medio convencional al que se le pueda atribuir una incertidumbre significativa. Otros procedimientos consisten en asignar un valor real mediante la formulación o utilización de materiales de control a los que se haya añadido un marcador.

Además, en caso de que el laboratorio efectúe regularmente este tipo de análisis y haya establecido ya un control estadístico, todo material nuevo de control (por ejemplo, en caso de agotamiento de las existencias) deberá obtenerse mediante referencia a los análisis en relación con los cuales esté en marcha un control con materiales existentes.

2. Determinación de límites

Después de seleccionar un material de control, el laboratorio deberá establecer valores relativos a la precisión dentro de una misma serie y entre distintas series por medio de este material.

Como requisito mínimo para la determinación de la precisión dentro de una misma serie, el material de control deberá ser analizado por duplicado en doce ocasiones. Los análisis por duplicado deberán llevarse a cabo en condiciones de repetibilidad, es decir que deberá efectuarlos el mismo analista, con los mismos reactivos, etc. El análisis por duplicado del material de control deberá efectuarse al azar dentro de una serie de análisis. Cada análisis por duplicado deberá efectuarse un día distinto a lo largo de un determinado período con el fin de reflejar una variación razonable entre las distintas series, habida cuenta de las variaciones normales relativas, por ejemplo, a los reactivos, a la recalibración de los instrumentos y, en su caso, a distintos analistas.

Nota:

Cabe subrayar que la utilización de datos que no sean plenamente representativos de las variaciones entre distintas series puede dar lugar a una repetición innecesaria de los análisis debido a la determinación de límites demasiado estrechos. Al contrario, en caso de que un laboratorio presente datos relativos a la precisión demasiado imprecisos, es posible que no esté en condiciones de respetar los límites establecidos en los métodos de referencia, obteniendo probablemente resultados menos satisfactorios que otros laboratorios comparables y, además, posiblemente no consiga facilitar los datos adecuados al objetivo establecido.

2.1. Determinación de la precisión dentro de una misma serie

2.1.1. Precisión dentro de una misma serie en caso de estar disponible el material de control

Los datos duplicados (al menos 12 duplicados) deberán someterse en primer lugar a la prueba de varianza máxima de Cochran, lo que supone la comparación del cuadrado del valor máximo de la gama de duplicados con la suma del valor de las gamas al cuadrado.

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

en la que

di= diferencia entre duplicados.

El valor del criterio de Cochran, es decir C, se comparará con los valores recogidos en los cuadros [ISO 5725 (1994)]. En caso de que un valor pueda clasificarse como sospechoso o errático, el resultado deberá analizarse a fin de encontrar una explicación, como por ejemplo, error técnico o informático, error en la realización de la prueba o análisis de una muestra inadecuada. En caso de que la explicación del error técnico sea tal que resulte imposible sustituir el resultado dudoso, éste deberá descartarse como auténtico valor errático. En caso de que subsistan valores sospechosos o erráticos que no puedan ser explicados, los valores sospechosos se conservarán como correctos y los valores estadísticos erráticos se descartarán. El laboratorio deberá intentar obtener valores substitutivos.

Cuando el laboratorio tenga garantías de que los datos ya no contienen valores erráticos, la desviación típica dentro de una serie sw se obtendrá del siguiente modo:

para cada par xi1, xi2 de los datos p por duplicado, se calculará la suma de los duplicados

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

y la diferencia de los duplicados

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

y se suman para dar:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

El cálculo de la desviación típica dentro de una misma serie es el siguiente:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

El límite de precisión interna es igual a 2,8 sw.

En caso de utilizarse un método de referencia, el límite interno de precisión deberá compararse con el límite de repetibilidad publicado. El laboratorio deberá ajustarse a los requisitos establecidos en el método de referencia; de lo contrario, deberá procederse a la correspondiente investigación.

Los límites fijados deberán considerarse provisionales y sujetos a revisión.

2.1.2. Precisión dentro de una misma serie en caso de no estar disponible un material de control

El laboratorio podrá optar por establecer la precisión dentro de una misma serie mediante el análisis por duplicado de muestras representativas (con un mínimo de 12 análisis por duplicado). En caso de que no sea posible utilizar materiales de control, por ejemplo debido a su inestabilidad, deberán recogerse datos por duplicado con este método.

Nota:

Se supone que los análisis cubren una gama de valores relativamente estrecha y que, por lo tanto, puede aplicarse un valor único a todas las muestras. En caso de que la serie de resultados sea más amplia, superando por ejemplo un orden de magnitud, y la precisión dependa del nivel de concentración, los laboratorios deberán procurar utilizar desviaciones típicas relativas.

Los datos deberán someterse a la prueba de Cochran, al igual que en el punto 2.1.1. Cuando el laboratorio haya establecido que los datos no contienen valores erráticos podrán calcularse la desviación típica dentro de una misma serie y el límite interno de precisión, tal como indica el punto 2.1.1.

La desviación típica dentro de una serie sw podrá utilizarse para la elaboración de gráficos de control (véase el anexo II). Los límites establecidos deberán considerarse provisionales y sujetos a revisión.

2.2. Determinación de la precisión entre distintas series

Deberá calcularse el valor medio (s1/2) para cada par y someterse dichos valores a la prueba de Grubbs [ISO 5725 (1994)]. Los criterios de rechazo o aceptación de los valores erráticos o sospechosos serán los descritos en el punto 2.1.1. El laboratorio deberá intentar obtener un valor de sustitución para cada uno de los resultados descartados. Una vez que el laboratorio se haya cerciorado de que los datos no contienen valores erráticos, se calculará la desviación típica sb entre distintas series.

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

o se supone igual a 0 en caso de que la indicación debajo del signo de la raíz cuadrada sea negativa.

La desviación típica total st se utilizará para la elaboración de gráficos de control para la media de n determinaciones (véase el anexo II). Los límites establecidos deberán considerarse provisionales y sujetos a revisión.

3. Revisión de los límites iniciales

Los límites de control establecidos de la forma antes descrita deberán considerarse como cálculos preliminares.

A fin de actualizar los límites establecidos sobre la base de una precisión aceptable dentro de una misma serie (punto 2.1.2), deberán recogerse datos suplementarios por duplicado, relativos a las muestras sometidas a prueba. La frecuencia de la revisión de datos dependerá de la frecuencia de los análisis. A título indicativo, los datos se revisarán después de obtenerse diez valores suplementarios por duplicado. A continuación se someterán todos los datos a la prueba de Cochran y se volverán a establecer los límites sobre la base del nuevo valor de la desviación típica. Las decisiones posteriores relativas a la validez de los límites de control se adoptarán sobre la base de los datos suplementarios.

La revisión de los datos iniciales obtenidos para la precisión dentro de una misma serie dependerá también de la frecuencia del análisis. A título indicativo, los valores inicialmente establecidos, relativos a la desviación típica y a la media, deberán revisarse después de obtenerse otros diez datos a partir del análisis del material de control, con una frecuencia de un análisis por lote.

Todos los datos deberán someterse a la prueba de Grubbs a fin de detectar los valores extremos erráticos. La media y la desviación típica se calcularán otra vez sobre la base de los nuevos datos.

Además, en esta fase el laboratorio deberá utilizar un gráfico Cusum [BS 5700: (1984) y modificación 5480 (1987)], con el fin de analizar todos los problemas que puedan plantearse como, por ejemplo, en relación con el envejecimiento de los reactivos. Deberá analizarse cualquier resultado al margen de los límites de la "máscara V" del citado gráfico.

Los nuevos límites (desviación media y desviación típica) deberán someterse a controles periódicos por medio de la técnica Cusum. Deberá examinarse detenidamente cualquier posible duda acerca de la validez del material de control.

4. Comunicación de los datos relativos a la precisión

El laboratorio deberá facilitar a las autoridades nacionales competentes los datos siguientes:

- método utilizado,

- desviación típica dentro de una serie sw y límite interno de precisión,

- desviación típica entre distintas series sb,

- desviación típica total st,

- número de análisis necesarios para la obtención de los datos relativos a la precisión.

(1) M Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

ANEXO VI

(Artículo 6)

EVALUACIÓN DE LOS EVALUADORES Y FIABILIDAD DE LOS RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS

Los procedimientos que se exponen a continuación serán aplicables en caso de utilizarse métodos de puntuación (norma FIL 99C/1997).

a) Determinación del índice de repetibilidad

Un evaluador deberá analizar como duplicados ciegos un mínimo de diez muestras a lo largo de un período de doce meses, habitualmente en distintas sesiones. Los resultados de las caracterísitcas de los distintos productos se evaluarán por medio de la fórmula siguiente:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo

wI: índice de repetibilidad;

xi1: puntuación de la primera evaluación de la muestra xi;

xi2: puntuación de la segunda evaluación de la muestra xi;

n: número de muestras.

Las muestras sometidas a evaluación deberán reflejar una amplia gama de calidades. wI no deberá sobrepasar 1,5 (escala de 5 puntos).

b) Determinación del "índice de desviación"

Este índice deberá utilizarse para controlar si un evaluador determinado utiliza la misma escala de evaluación cualitativa que un grupo experimentado de evaluadores. Las puntuaciones obtenidas por el evaluador se compararán con la media de las puntuaciones obtenidas por el grupo.

Se utilizará la siguiente fórmula para la evaluación de los resultados:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo

xi1; xi2: véase la letra a);

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>: puntuación media del grupo de evaluadores para la primera y la segunda evaluación de la muestra xi, respectivamente;

n: número de muestras (al menos 10 cada 12 meses).

Las muestras que vayan a evaluarse deberán reflejar una amplia gama de calidades. DI no deberá superar 1,5 (escala de 5 puntos).

Los Estados miembros deberán indicar las posibles dificultades que plantee la aplicación de este procedimiento.

c) Comparación de los resultados obtenidos en distintas regiones de un Estado miembro y en distintos Estados miembros

Deberá organizarse al menos una vez al año, cuando corresponda, una prueba que permita comparar los resultados obtenidos por evaluadores de distintas regiones. En caso de que se detecten diferencias notables, deberán adoptarse las medidas necesarias con el fin de determinar el motivo y conseguir resultados comparables.

Los Estados miembros podrán organizar pruebas que permitan la comparación de los resultados obtenidos por sus propios evaluadores y por los evaluadores de Estados miembros vecinos. En caso de detectarse diferencias notables, deberá procederse a un estudio detenido con el fin de conseguir resultados comparables.

Los Estados miembros deberán notificar a la Comisión los resultados de estas comparaciones.

ANEXO VII

(Artículo 6)

EVALUACIÓN ORGANOLÉPTICA DE LA MANTEQUILLA

1. Ámbito

El objetivo de este método de evaluación organoléptica de la mantequilla consiste en proporcionar un método uniforme aplicable en todos los Estados miembros.

2. Definiciones

Se entenderá por:

Evaluación organoléptica: el examen de los atributos de un producto mediante los órganos sensoriales.

Comisión: un grupo de catadores seleccionados que trabajen durante la prueba sin comunicarse entre sí y sin influirse mutuamente.

Puntuación: la evaluación organoléptica realizada por una comisión utilizando una escala numérica. Debe utilizarse una nomenclatura de los defectos.

Clasificación: una clasificación cualitativa realizada a partir de la puntuación obtenida.

Documentos de control: los documentos utilizados para registrar las puntuaciones obtenidas respecto a cada atributo y la clasificación final del producto. (Este documento puede utilizarse también para registrar la composición química).

3. Sala de prueba

3.1. Deben tomarse precauciones a fin de que los catadores situados en la sala de prueba no se vean influidos por factores externos.

3.2. La sala de prueba debe estar libre de olores extraños y ser de fácil limpieza. Las paredes deben ser de color claro.

3.3. La sala de prueba y su iluminación deben ser tales que no se vean afectadas las propiedades de los productos examinados. La sala debe estar provista de un control adecuado de la temperatura.

4. Selección de los catadores

El catador debe conocer los productos de la mantequilla y ser competente para realizar la clasificación organoléptica. Su competencia debe evaluarse de forma periódica (al menos una vez al año) por las autoridades competentes.

5. Requisitos de la comisión

El número de catadores de la comisión debe ser impar, con un mínimo de tres. En su mayoría serán funcionarios de la autoridad competente o personas autorizadas que no estén empleadas en la industria láctea.

Deberán tenerse en cuenta varios factores antes de la evaluación, con el fin de obtener resultados óptimos por parte de los integrantes del panel,

- éstos no deberán padecer ninguna enfermedad que pueda afectar a los resultados. En caso de darse tal circunstancia, será conveniente integrar a otra persona en el panel,

- los integrantes del panel deberán llegar puntualmente a la evaluación y asegurarse de que disponen de tiempo suficiente para efectuar dicha evaluación.

- deberán abstenerse de utilizar productos muy odoríferos tales como perfumes, lociones para después del afeitado y desodorantes, y de ingerir alimentos fuertemente aromatizados (picantes), etc,

- tampoco podrán fumar, comer ni beber, excepto agua, durante la media hora anterior a la evaluación.

6. Evaluación de cada atributo

6.1. La evaluación organoléptica debe realizarse con relación a los tres siguientes atributos: aspecto, consistencia y aroma.

El aspecto implica los siguientes caracteres: color, pureza visible, crecimiento de mohos y dispersión de agua. La dispersión de agua se evalúa de acuerdo con la Norma FIL 112A/1989.

La consistencia implica los siguientes caracteres: firmeza y untabilidad.

Pueden aplicarse métodos físicos para la evaluación de la consistencia de la mantequilla. La Comisión prevé armonizar estos métodos en el futuro.

El aroma supone los siguientes caracteres: sabor y olor.

Una desviación significativa respecto a la temperatura recomendada impide que se realice una evaluación fiable de la consistencia y del aroma. La temperatura tiene una importancia capital.

6.2. Cada atributo debe evaluarse organolépticamente por separado. Debe darse una puntuación con arreglo al cuadro 1.

6.3. Puede ser conveniente que los catadores puntúen conjuntamente, antes de iniciar la evaluación, una o más muestras de referencia en cuanto a su aspecto, consistencia y aroma, a fin de aplicar criterios uniformes.

6.4. La puntuación para la aceptación es de la forma siguiente:

>SITIO PARA UN CUADRO>

Cuando no se obtenga la puntuación necesaria, deberá describirse el defecto. La puntuación dada por cada evaluador para cada atributo debe registrarse en el documento de control. El producto se acepta o rechaza a partir de una decisión de la mayoría. No deben darse frecuentemente (no más de una vez cada 20 muestras) casos en que las diferencias entre la puntuación individual de cada atributo sea mayor que la distancia entre puntos adyacentes. En caso contrario, el presidente de la comisión deberá comprobar la competencia de dicha comisión.

7. Supervisión

Será responsable generalmente de todo el procedimiento un presidente de la comisión, que debe ser funcionario de la autoridad competente y puede ser miembro de la comisión. Debe registrar las puntuaciones individuales de cada atributo en el documento de control y certificar si el producto es aceptado o rechazado.

8. Toma y preparación de las muestras

8.1. - Es conveniente que se oculte la identidad de las muestras durante la evaluación, para evitar cualquier posible desviación.

- Este aspecto debe ser organizado por el presidente de la comisión antes de la evaluación y sin que estén presentes los otros miembros de la comisión.

8.2. Cuando la evaluación organoléptica se realice en el almacén frigorífico, se tomará la muestra utilizando una sonda para mantequilla. Si la evaluación organoléptica se realiza en un lugar distinto del almacén frigorífico, se tomará como mínimo una muestra de 500 g.

8.3. Durante la evaluación, la mantequilla deberá estar a la temperatura de 10 o 12 °C. Deberán evitarse a toda costa las desviaciones importantes de esta temperatura.

9. Nomenclatura

Véase el cuadro 2 adjunto.

Cuadro 1: puntuación de la mantequilla

>SITIO PARA UN CUADRO>

>SITIO PARA UN CUADRO>

>SITIO PARA UN CUADRO>

Cuadro 2: nomenclatura de defectos de la mantequilla

I. Aspecto

1. Humedad libre

2. No uniforme, bicolor

3. Entreverado

4. Veteado, jaspeado

5. Manchado

6. Separación de aceite

7. Exceso de color

8. Textura porosa

9. Granuloso

10. Materia extraña

11. Enmohecido

12. Sal sin disolver

II. Consistencia

14. Corta, frágil, grumosa

15. Pastosa, grasienta

16. Untuosa

17. Dura

18. Blanda

III. Aroma

20. Sin aroma

21. Impuro(1)

22. Aroma extraño

23. Aroma a viejo

24. Caseoso, aroma a queso ácido

25. Ácido

26. Aroma de levadura

27. a) Aroma de cocido

b) Aroma de quemado

28. Aroma de moho

29. Rancio

30. Aceitoso, aroma de pescado

31. Aroma de sebo

32. a) Aroma de óxido

b) Aroma metálico

33. Aroma de pienso

34. Acre, amargo

35. Demasiado salado

36. Mohoso, soso, corrompido

37. Aroma de malta

38. Aroma químico.

(1) Esta designación debe utilizarse lo menos posible y sólo cuando el defecto no pueda describirse de forma más precisa.

ANEXO VIII

(Artículo 7)

PROCEDIMIENTO APLICABLE EN CASO DE IMPUGNACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS (ANÁLISIS QUÍMICO)

1. Podrá procederse a un nuevo análisis a petición del agente económico en los siete días hábiles siguientes a la comunicación de los resultados del primer análisis, siempre que los organismos competentes dispongan de muestras precintadas del producto, tomadas por duplicado y almacenadas adecuadamente.

2. El organismo competente enviará dichas muestras a un segundo laboratorio, a petición del agente económico y por cuenta de éste. Dicho laboratorio deberá estar autorizado para llevar a cabo análisis oficiales y su cualificación en los análisis en cuestión estará demostrada. Dicha cualificación deberá basarse en la participación en estudios de colaboración, con resultados satisfactorios, pruebas de capacidad o comparaciones entre distintos laboratorios. El segundo laboratorio deberá utilizar el método de referencia. Los resultados obtenidos por ambos laboratorios se evaluarán del siguiente modo:

a) En caso de que ambos laboratorios se ajusten al requisito de repetibilidad y al de reproducibilidad

Se registrará como resultado final la media aritmética de los resultados de las pruebas, obtenidos por ambos laboratorios. Dicho resultado final será evaluado sobre la base de la diferencia crítica, por medio de la siguiente fórmula:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>: media aritmética de todos los resultados obtenidos por ambos laboratorios

m0: límite

R: reproducibilidad

r: repetibilidad

n1: número de resultados obtenidos por el laboratorio 1

n2: número de resultados obtenidos por el laboratorio 2.

*

En caso de que el resultado final se calcule por medio de la fórmula

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

o

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

(véanse los puntos 3 y 4 del anexo IV respectivamente), R2x y r2x deberán sustituir a R2 y r2 en la fórmula.

b) En caso de que ambos laboratorios se ajusten al requisito de repetibilidad, aunque no al de reproducibilidad

En caso de que el segundo análisis confirme el primero, la cantidad sometida a análisis será rechazada por considerarse no conforme. En caso contrario, la cantidad será aceptada.

c) En caso de que sólo uno de los laboratorios se ajuste al requisito de repetibilidad

La decisión relativa a la admisibilidad de la cantidad sometida a análisis se basará en el resultado final del laboratorio que se ajuste al requisito de repetibilidad.

d) En caso de que ninguno de los laboratorios se ajuste al requisito de repetibilidad, aunque sí el de reproducibilidad

Será aplicable la letra a).

e) En caso de que ninguno de los dos laboratorios se ajuste al requisito de repetibilidad, ni al de reproducibilidad

La cantidad sometida a análisis se admitirá si los resultados obtenidos por uno de los laboratorios llevan a esa conclusión.

f) En caso de que los resultados se hayan obtenido mediante métodos no validados

La cantidad sometida a análisis se admitirá si los resultados obtenidos por uno de los laboratorios llevan a esa conclusión.

3. Las autoridades competentes notificarán al agente económico los resultados del segundo análisis con la mayor brevedad. El agente económico deberá sufragar los gastos del segundo análisis en caso de que la cantidad sometida a análisis quede rechazada.

4. En caso de que el agente económico presente la prueba de que el procedimiento de muestreo no es correcto, deberá procederse, si es posible, a un nuevo muestreo, en los cinco días hábiles siguientes al muestreo. Si no es posible un nuevo muestreo, se admitirá la cantidad sometida a análisis.

ANEXO IX

(Artículo 8)

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE AGUA DE LA MANTEQUILLA

1. Objetivo y ámbito de aplicación

El presente método de referencia específica un método para la determinación del contenido de agua de la mantequilla.

2. Referencia

Norma IDF Standard 50 C: 1995. "Leche y productos lácteos". Métodos de muestreo.

3. Definición

Contenido de agua de la mantequilla: pérdida de masa tras la realización del proceso de calentamiento especificado en la presente norma. Se expresa en gramos por 100 gramos.

4. Principio

Evaporación del agua de una porción de la muestra en presencia de piedra pómez a la temperatura de 102 °C en una estufa de secado.

5. Materiales y equipo

Equipo normal de laboratorio y, en particular:

5.1. Balanza analítica, de 1 mg de sensibilidad.

5.2. Desecador provisto de un deshidratante eficaz (por ejemplo, gel de sílice recién deshidratado con indicador higroscópico).

5.3. Estufa de secado, ventilada, termostática, que se mantenga a 102 ± 2 °C en todo el espacio de trabajo.

5.4. Cápsulas de vidrio, porcelana o metal no corrosivo, de unos 20 mm de altura y 60 a 80 mm de diámetro.

5.5. Piedra pómez, granulada y lavada, con diámetro de 0,8-10 mm.

6. Muestreo

Véase la norma IDF 50 C: 1995

7. Procedimiento

7.1. Preparación de la muestra problema

Calentar la muestra de laboratorio en el recipiente cerrado de vidrio o de plástico adecuado, que debe estar lleno hasta la mitad o los dos tercios, hasta una temperatura a la cual la muestra esté bastante blanda como para conseguir su homogeneización total (con un agitador mecánico o a mano). Normalmente, la temperatura de homogeneización no debe superar los 35 °C. Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente. Lo antes posible tras el enfriamiento, abrir el recipiente de la muestra y agitar brevemente (durante no más de 10 s) con un instrumento adecuado, como puede ser una cuchara o una espátula, antes de pesar.

7.2. Determinación del contenido de agua

7.2.1. Poner unos 10 g de piedra pómez en la cápsula (5.4).

7.2.2. Secar la cápsula con la piedra pómez en la estufa (5.3) a 102 ± 2 °C durante al menos 1 h.

Nota:

los períodos de secado mencionados en 7.2.2, 7.2.5 y 7.2.7 empiezan a partir del momento en que la temperatura de la estufa alcanza los 102 ± 2 °C.

7.2.3. Dejar enfriar la cápsula en el desecador (5.2) hasta alcanzar la temperatura de la sala de balanzas y pesar con precisión de 1 mg.

7.2.4. Poner en la cápsula, pesando con precisión de 1 mg, una porción de unos 5 g de la muestra problema.

7.2.5. Poner la cápsula en la estufa a 102 ± 2 °C y dejarla allí durante 3 h.

7.2.6. Dejar enfriar la cápsula en el desecador hasta alcanzar la temperatura de la sala de balanzas y pesar con precisión de 1 mg.

7.2.7. Repetir el proceso de secado durante períodos adicionales de 1 h, dejando enfriar y pesando cada vez según se indica en 7.2.6 hasta llegar a masa constante (cuando el cambio de masa no supere 1 mg).

En caso de que haya aumento de masa, tomar para los cálculos la masa más baja que se haya encontrado.

8. Expresión de los resultados

8.1. Método de cálculo y fórmula

Calcular el contenido de agua, W, como porcentaje en masa utilizando la fórmula siguiente:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

donde

>SITIO PARA UN CUADRO>

El resultado se redondea a una cifra decimal.

8.2. Repetibilidad

La diferencia absoluta entre los resultados de dos determinaciones simples, realizadas simultáneamente o en rápida sucesión por el mismo operario en las mismas condiciones con un material problema idéntico, no superará el 0,2 %.

8.3. Repetibilidad

La diferencia absoluta entre dos resultados simples e independientes, obtenidos por dos operarios en laboratorios diferentes con un material problema identico, no superará el 0,3 %.

9. Informe de la prueba

El informe de la prueba debe especificar el método utilizado y los resultados obtenidos. Debe mencionar asimismo todos los datos del procedimiento que no se especifiquen en esta norma internacional o se consideren optativos, junto con los datos de cualquier incidente que pueda haber influido en los resultados. El informe de la prueba debe incluir toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra.

ANEXO X

(Artículo 8)

DETERMINACIÓN DEL EXTRACTO SECO MAGRO DE LA MANTEQUILLA

1. Objetivo y ámbito de aplicación

La presente norma especifica un método para la determinación del extracto seco magro de la mantequilla.

2. Referencia

Norma IDF Standard 50 C: 1995. "Leche y productos lácteos". Métodos de muestreo.

3. Definición

Extracto seco magro de la mantequilla: porcentaje en masa de las sustancias determinadas por el procedimiento especificado. Se expresa en gramos por 100 gramos.

4. Principio

Evaporación del agua de una masa conocida de mantequilla, extracción de la materia grasa con éter de petróleo y pesada del residuo.

5. Reactivo

Éter de petróleo con un intervalo de ebullición entre 30 y 60 °C. El reactivo no debe dejar más de 1 mg de residuo tras la evaporación de 100 ml.

6. Materiales y equipo

6.1. Balanza analítica, de 1 mg de sensibilidad.

6.2. Desecador provisto de un deshidratante eficaz (por ejemplo, gel del sílice recién deshidratado con indicador higroscópico).

6.3. Estufa de secado, ventilada, termostática, que se mantenga a 102 +- 2 °C en todo el espacio de trabajo.

6.4. Cápsulas de vidrio, porcelana o metal no corrosivo, de unos 20 mm de altura del pico y 60 a 80 mm de diámetro, con varilla agitadora de vidrio.

6.5. Filtro de vidrio fritado, con poros de 16 a 40 μm de diámetro y con frasco de succión.

7. Muestreo

Véase la norma IDF Standard 50 C: 1995.

8. Procedimiento

8.1. Preparación de la muestra problema

Calentar la muestra de laboratorio en el recipiente cerrado de vidrio o de plástico adecuado, que debe estar lleno hasta la mitad o los dos tercios, hasta una temperatura a la cual la muestra esté bastante blanda como para conseguir su homogeneización total (con un agitador mecánico o a mano). Normalmente, la temperatura de homogeneización no debe superar los 35 °C. Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente. Lo antes posible tras el enfriamiento, abrir el recipiente de la muestra y agitar brevemente (durante no más de 10 s) con un instrumento adecuado, como puede ser una cuchara o una espátula, antes de pesar.

8.2. Determinación

8.2.1. Secar la cápsula con la varilla (6.4) y el filtro (6.5) en la estufa (6.3) durante 1 h. Dejar enfriar estos objetos en el desecador y pesarlos todos juntos (es decir, cápsula, varilla y filtro) con precisión de 1 mg (m0).

Notas:

- Como norma, es suficiente un tiempo de enfriamiento de 45 min.

- Es importante que se utilice el mismo conjunto de cápsula, varilla y filtro con cada una de las porciones de muestra si son más de una las analizadas en el lote.

8.2.2. Quitar el filtro y anotar el peso de la cápsula junto con la varilla, con precisión de 1 mg (m1).

8.2.3. Poner en la cápsula, pesando con precisión de 1 mg, una porción de la muestra problema (8.1) de unos 5 g (m2).

8.2.4. Poner la cápsula (con la varilla y la mantequilla) en la estufa a 102 +- 2 °C y dejarla hasta el día siguiente.

8.2.5. Dejar enfriar la cápsula (8.2.3) hasta alcanzar la temperatura ambiente.

8.2.6. Añadir a la cápsula 15 ml de éter de petróleo caliente (a unos 25 °C) y despegar todo lo que se pueda del sedimento adherido a la cápsula, utilizando la varilla de vidrio. Pasar el disolvente al filtro y hacer que pase filtrándose al frasco de succión.

8.2.7. Realizar la operación 8.2.6 otras cuatro veces. Si no quedan trazas de grasa en la superficie de la cápsula, pasar cuantitativamente al filtro, durante el cuarto lavado, todo lo que se pueda del sedimento. En caso contrario, repetir la operación 8.2.6 hasta la eliminación completa de todas las trazas de grasa.

8.2.8. Lavar el sedimento en el filtro con 25 ml de éter de petróleo caliente.

8.2.9. Secar la cápsula y la varilla de vidrio, junto con el filtro, en la estufa a 102 +- 2 °C durante 30 minutos.

8.2.10. Dejar enfriar en el desecador hasta temperatura ambiente y pesar con precisión de 1 mg.

8.2.11. Repetir las operaciones 8.2.9 y 8.2.10 hasta llegar a masa constante (cuando el cambio de masa no supere 1 mg) de la cápsula, la varilla y filtro conjuntamente (m3).

9. Expresión de los resultados

9.1. Cálculo del extracto seco magro

Calcular el extracto seco magro, ESM, como porcentaje en masa utilizando la fórmula siguiente:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

donde

m0 es la masa en gramos de la cápsula vacía con la varilla de vidrio y el filtro (8.2.1)

m1 es la masa en gramos de la cápsula vacía con la varilla de vidrio (8.2.2)

m2 es la masa en gramos de la porción de muestra y la cápsula con la varilla de vidrio (8.2.3)

m3 es la masa final en gramos de la cápsula con la varilla y el filtro con el sedimento (8.2.11)

El resultado se redondea a una cifra decimal.

9.2. Repetibilidad

La diferencia absoluta entre los resultados de dos determinaciones simples, realizadas simultáneamente o en rápida sucesión por el mismo operario en las mismas condiciones con un material problema idéntico, no superará el 0,1 %.

9.3. Reproducibilidad

La diferencia absoluta entre dos resultados simples e independientes, obtenidos por dos operarios en laboratorios diferentes con un material problema idéntico, no superará el 0,2 %.

10. Informe de la prueba

El informe de la prueba debe especificar el método utilizado y los resultados obtenidos. Debe mencionar asimismo todos los datos del procedimiento que no se especifiquen en esta norma internacional o se consideren optativos, junto con los datos de cualquier incidente que pueda haber influido en los resultados. El informe de la prueba debe incluir toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra.

Nota:

>SITIO PARA UN CUADRO>

Puede aceptarse que las cifras de precisión obtenidas para la determinación del extracto seco magro son válidas para la determinación del extracto seco magro lácteo.

ANEXO XI

(Artículo 8)

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE MATERIA GRASA DE LA MANTEQUILLA

El contenido de materia grasa se obtiene indirectamente mediante determinación del contenido de agua y del extracto seco magro con arreglo a los anexos IX y X, respectivamente. El porcentaje, en masa, de materia grasa es igual a:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

>SITIO PARA UN CUADRO>.

>SITIO PARA UN CUADRO>

ANEXO XII

(Artículo 9)

DETERMINACÍON DEL CONTENIDO DE VAINILLINA DE LA MANTEQUILLA CONCENTRADA, LA MANTEQUILLA O LA NATA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTO RENDIMIENTO

1. Objeto y ámbito de aplicación

El presente método describe un procedimiento para la determinación de la cantidad de vainillina existente en la mantequilla concentrada, la mantequilla o la nata.

2. Principio

Extracción de una cantidad conocida de muestra mediante una mezcla de isopropanol/etanol/acetonitrilo (1:1:2); precipitación de la mayor parte de la grasa mediante enfriamiento a una temperatura que oscile entre - 15 y - 20 °C, seguida de centrifugación.

Previa dilución en agua, determinación del contenido de vainillina mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR).

3. Aparatos

Se trata del instrumental habitual de laboratorio y, en particular, el siguiente:

3.1. un congelador, que pueda funcionar a una temperatura comprendida entre - 15 y - 20 °C;

3.2. jeringas desechables de 2 ml de capacidad;

3.3. microfiltros de membrana de 0,45 μm de tamaño de poro, resistentes a una solución que contenga un 5 % de la solución de extracción (4.4);

3.4. un cromatógrafo de líquidos provisto de una bomba (flujo de 1,0 ml/min), un inyector (inyección automática o manual de 20 μl), un detector de UV (regulado a 306 nm, escala completa de 0,01 AU), un registrador o integrador y un programador de la temperatura de columna regulado a 25 °C;

3.5. una columna analítica (250 mm x 4,6 mm de diámetro interior), rellenada con LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm), o equivalente;

3.6. una precolumna (aproximadamente 20 mm x 3 mm de diámetro interior) con un relleno seco de Perisorb RP 18 (30-40 μm), o equivalente.

4. Reactivos

Todos los reactivos utilizados deberán ser de pureza para análisis.

4.1. Isopropanol

4.2. Etanol 96 % (v/v)

4.3. Acetonitrilo

4.4. Solución de extracción

Mezclar isopropanol (4.1), etanol (4.2) y acetonitrilo (4.3) en la proporción de 1:1:2 (v/v).

4.5. Vainillina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldehído)

4.5.1. Solución madre de vainillina (= 500 μg/ml)

En un matraz aforado de 100 ml, pesar, con una precisión de 0,1 mg, unos 50 mg (CM mg) de vainillina (4.5), añadir 25 ml de solución de extracción (4.4) y enrasar con agua.

4.5.2. Solución patrón de vainillina (= 10 μg/ml)

En un matraz aforado de 250 ml introducir con una pipeta 5 ml de solución madre de vainillina (4.5.1 ) y enrasar con agua.

4.6. Metanol de calidad para CLAR

4.7. Ácido acético glacial

4.8. Agua de calidad para CLAR

4.9. Fase móvil para la CLAR

En un matraz aforado de 1000 ml mezclar 300 ml de metanol (4.6), 500 ml aproximadamente de agua (4.8) y 20 ml de ácido acético (4.7) y enrasar con agua (4.8). Filtrar utilizando un filtro de 0,45 μm de tamaño de poro (3.3).

5. Procedimiento

5.1. Preparación de la muestra problema

5.1.1. Mantequilla

Calentar la muestra hasta que comience a derretirse. Evitar un calentamiento local excesivo por encima de 40 °C. Cuando la muestra alcance una plasticidad suficiente, agitar para homogeneizarla. Remover la mantequilla durante 15 segundos antes de tomar la muestra. En un matraz aforado de 100 ml, pesar, con precisión de 1 mg, aproximadamente 5 g (SM g) de mantequilla.

5.1.2. Mantequilla concentrada

Inmediatamente antes de tomar la muestra, introducir el recipiente con la mantequilla concentrada en una estufa regulada a 40-50 °C hasta que se encuentre totalmente derretida. Agitar o remover la muestra, aunque no enérgicamente para evitar la formación de burbujas. En un matraz aforado de 100 ml, pesar, con precisión de 1 mg, aproximadamente 4 g (SM g) de mantequilla concentrada.

5.1.3. Nata

Calentar la muestra en un baño María o en una incubadora a 35-40 °C. Agitar para obtener una distribución homogénea de la grasa y, en caso necesario, remover. Enfriar rápidamente la muestra a una temperatura de 20 +- 2 °C. Si la muestra no presenta un aspecto homogéneo, debe repetirse el procedimiento. En un matraz aforado de 100 ml, pesar, con precísión de 1 mg, aproximadamente 10 g (SM g) de nata.

5.2. Preparación de la solución problema

Añadir unos 75 ml de la solución de extracción (4.4) a la muestra problema (5.1.1, 5.1.2 o 5.1.3), remover o agitar enérgicamente durante 15 minutos aproximadamente y enrasar con la solución de extracción (4.4). Transferir unos 10 ml de esta solución a un tubo de ensayo provisto de un tapón. Colocar el tubo de ensayo en el congelador (3.1) y mantenerlo allí durante 30 minutos aproximadamente. Centrifugar la solución fría durante 5 minutos a 2000 rpm aproximadamente y decantar de inmediato. Esperar a que la solución decantada alcance la temperatura ambiente. En un matraz aforado de 100 ml, introducir con una pipeta 5 ml de la solución decantada y enrasar con agua. Filtrar una alícuota utilizando un microfiltro de membrana (3.3). El filtrado obtenido ya está listo para efectuar la determinación mediante CLAR.

5.3. Calibrado

En un matraz aforado de 100 ml, introducir con una pipeta 5 ml de solución patrón de vainillina (4.5.2), añadir 5 ml de la solución de extracción (4.4) y enrasar con agua. Esta solución contiene 0,5 μg/ml de vainillina.

5.4. Determinación mediante CLAR

Esperar unos 30 minutos a que el sistema cromatográfico se estabilice. Inyectar la solución patrón (5.3). Repetir la operación hasta que la diferencia de superficie de los picos o de altura de los picos entre dos inyecciones sucesivas sea inferior al 2 %. En las condiciones descritas, el tiempo de retención de la vainillina es de 9 minutos aproximadamente. Analizar la solución patrón (5.3) por duplicado inyectando 20 μl. Inyectar 20 μl de las soluciones problema (5.2). Determinar la superficie o la altura del pico obtenido para la vainillina. Repetir por duplicado la inyección de la solución patrón (5.3) después de efectuar 10 inyecciones de las muestras problema (5.2).

6. Cálculo de los resultados

Calcular la superficie (o la altura) media (AC) de los picos de vainillina asociados a las inyecciones efectuadas por duplicado con cada lote de soluciones problema (4 superficies o alturas).

Calcular el factor de respuesta (R):

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo CM la masa de vainillina expresada en mg (4.5.1).

El contenido (mg/kg) de vainillina (C) en la muestra problema viene dado por la fórmula:

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

siendo

AS= superficie del pico de vainillina de la muestra problema;

SM= masa de la muestra problema en g (5.1.1, 5.1.2 o 5.1.3);

Cuando se analiza la nata para determinar la vainillina, la concentración de marcador debe expresarse en mg de marcador/kg de grasa láctea. Esto se calcula multiplicando C por 100/f, siendo f el contenido de grasa de la nata en porcentaje (m/m).

20= factor que tiene en cuenta las diluciones del patrón y de la muestra problema;

0,96= factor de corrección del contenido de grasa en la primera dilución de la muestra problema.

Nota:

En lugar de la superficie del pico puede utilizarse la altura del pico (véase el punto 8.3).

7. Precisión del método

7.1. Repetibilidad (r)

La diferencia entre los resultados obtenidos en dos determinaciones efectuadas con el menor intervalo de tiempo posible por el mismo analista, utilizando los mismos aparatos y el mismo material problema, no debe ser superior a 16 mg/kg.

7.2. Reproducibilidad (R)

La diferencia ente los resultados obtenidos en dos determinaciones efectuadas por analistas de distintos laboratorios, utilizando diferentes aparatos pero el mismo material problema, no debe ser superior a 27 mg/kg.

8. Límites de tolerancia

8.1. Deben tomarse tres muestras del producto marcado para comprobar su homogeneidad.

8.2. Marcador obtenido a partir de vainilla o de vainillina sintética

8.2.1. La proporción de incorporación de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído es de 250 g por tonelada de mantequilla concentrada o mantequilla. En caso de añadirse marcadores a la nata, la proporción de incorporación es de 250 g por tonelada de grasa láctea.

8.2.2. Los resultados de las tres muestras obtenidos del análisis del producto se utilizarán para comprobar la proporción y la homogeneidad de la incorporación del marcador y el resultado más bajo se comparará con los límites siguientes [teniendo en cuenta la diferencia crítica con un nivel de probabilidad del 95 % (CrD95)]:

- 221,0 mg/kg (el 95 % de la proporción de incorporación mínima),

- 159,0 mg/kg (el 70 % de Ia proporción de incorporación mínima).

La concentración de marcador de la muestra que proporcione el resultado más bajo se utilizará por interpolación entre 221,0 mg/kg y 159,0 mg/kg.

8.3. Marcador obtenido exclusivamente a partir de vainas de vainilla o de sus extractos integrales

8.3.1. La proporción de incorporación de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído es de 100 gramos por tonelada de mantequilla concentrada o mantequilla. En caso de añadirse marcadores a la nata, la proporción de incorporación es de 100 g por tonelada de grasa láctea.

8.3.2. Los resultados de las tres muestras obtenidos del análisis del producto se utilizarán para comprobar la proporción y la homogeneidad de la incorporación del marcador y el resultado más bajo se comparará con los límites siguientes [teniendo en cuenta la diferencia crítica con un nivel de probabilidad del 95 % (CrD95)]:

- 79,0 mg/kg (el 95 % de la proporción de incorporación mínima),

- 54,0 mg/kg (el 70 % de la proporción de incorporación mínima).

La concentración de marcador de la muestra que proporcione el resultado más bajo se utilizará por interpolación entre 79,0 mg/kg y 54,0 mg/kg.

9. Notas

9.1. La repetibilidad (r) es el valor por debajo del cual puede esperarse que se sitúe, con una probabilidad determinada, la diferencia absoluta entre los resultados de dos ensayos individuales realizados con el mismo método e idéntico material problema y en las mismas condiciones (los mismos aparatos y el mismo laboratorio, en un intervalo breve de tiempo); salvo si se indica lo contrario, la probabilidad es del 95 %.

9.2. La reproducibilidad (R) es el valor por debajo del cual puede esperarse que se sitúe, con una probabilidad determinada, la diferencia absoluta entre los resultados de dos ensayos individuales realizados con el mismo método e idéntico material problema pero en condiciones diferentes (distintos analistas, distintos aparatos, distintos laboratorios o momentos distintos); salvo si se indica lo contrario, la probabilidad es del 95 %.

9.3. La recuperación de la vainillina añadida a un nivel de 250 mg/kg de butteroil oscila entre 97,0 y 103,8. El contenido medio hallado es del 99,9 %, con una desviación típica del 2,7 %.

9.4. La solución patrón contiene un 5 % de la solución de extracción para compensar el ensanchamiento de los picos provocado por la presencia de un 5 % de solución de extracción de las muestras problema. Ello permite efectuar la cuantificación a través de la altura de los picos.

9.5. El análisis se basa en una curva de calibrado lineal con una ordenada en el origen igual a cero.

La linealidad debe ser comprobada, utilizando diluciones apropiadas de la solución patrón (4.5.2), la primera vez que se realice el análisis y, además, a intervalos regulares y cada vez que se altere o renueve el equipo de CLAR.

ANEXO XIII

(Artículo 9)

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL ÉSTER ETÍLICO DEL ÁCIDO β-APO-8'-CAROTÉNICO EN LA MANTEQUILLA Y LA MANTEQUILLA CONCENTRADA MEDIANTE ESPECTROMETRÍA

1. Objetivos y ámbito de aplicación

El método describe un procedimiento de determinación cuantitativa del éster etílico del ácido β-apo-8'-caroténico (éster apocaroténico) en la mantequilla y la mantequilla concentrada. El éster apocaroténico es la suma de todas las sustancias presentes en un concentrado de muestras obtenido en las condiciones descritas en el método y que absorben la radiación a 440 nm.

2. Principio

La grasa láctea se disuelve en éter de petróleo y se mide la absorbancia a 440 nm. El contenido de éster apocaroténico se determina en relación con un patrón externo.

3. Aparatos

3.1. Pipetas graduadas de 0,25, 0,50, 0,75 y 1,0 ml de capacidad.

3.2. Espectrofotómetro apto para utilizarlo a 440 nm (y 447-449 nm) y equipado con cubetas de 1 cm de espesor óptico.

3.3. Matraces aforados de 20 ml y 100 ml de capacidad.

3.4. Balanza analítica con una sensibilidad de 0,1 mg.

4. Reactivos

Todos los reactivos deberán ser de pureza analítica reconocida.

4.1. Suspensión de éster apocaroténico (aproximadamente un 20 %).

4.1.1. Establecer el contenido de la suspensión como sigue:

Pesar con precisión aproximadamente 400 g en un matraz aforado de 100 ml, disolver en 20 ml de cloroformo (4.4) y enrasar con ciclohexano (4.5). Diluir 5 ml de esta solución hasta 100 ml con ciclohexano (solución A). Diluir 5 ml de la solución A hasta 100 ml con ciclohexano. Medir la absorbancia a 447-449 nm (medir el máximo frente al ciclohexano como blanco utilizando cubetas de 1 cm de espesor óptico).

>REFERENCIA A UN GRÁFICO>

Amax= absorbancia máxima de la solución

A= peso de la muestra (g)

2550= valor de referencia A (1 %, 1 cm)

La pureza de la suspensión es P ( %).

Nota:

La suspensión de éster apocaroténico es sensible al aire, al calor y a la luz. Puede conservarse durante unos 12 meses en su envase original (sellado con nitrógeno) sin abrir, en un lugar fresco. Una vez abierto el envase, es conveniente utilizar el contenido dentro de un breve periodo.

4.1.2. Solución patrón de éster apocaroténico, aproximadamente 0,2 mg/ml

Pesar con aproximación de 0,1 mg unos 0,100 g de suspensión de éster apocaroténico (4.1.1 ) (Wg), disolver en éter de petróleo (4.2), trasladar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml de capacidad y enrasar con éter de petróleo.

Esta solución contiene (W.P) 10 mg/ml de éster apocaroténico.

Nota:

Esta solución deberá conservarse en un lugar fresco y a oscuras. La solución que no se haya utilizado al cabo de un mes deberá eliminarse.

4.2. Éter de petróleo (40-60 °C).

4.3. Sulfato sódico anhidro cristalizado, desecado previamente a 102 °C durante dos horas.

4.4. Cloroformo

4.5. Ciclohexano

5. Procedimiento

5.1. Preparación de la muestra

5.1.1. Mantequilla concentrada

Derretir la muestra en un horno a unos 45 °C.

5.1.2. Mantequilla

Derretir la muestra en un horno a unos 45 °C y filtrar una parte con un filtro que contenga unos 10 g de sulfato sódico anhidro (4.3) en un medio que se halle al abrigo de la luz natural o artificial fuerte y se mantenga a 45 °C. Recoger una cantidad adecuada de grasa láctea.

5.2. Determinación

Pesar con una aproximación de 1 mg alrededor de 1 g de mantequilla concentrada o grasa láctea (Mg). Trasladar cuantitativamente a un matraz aforado de 20 ml (Vml) de capacidad, enrasar con éter de petróleo (4.2) y mezclar a fondo.

Trasladar una pequeña parte de esta mezcla a una cubeta de 1 cm y medir la absorbancia a 440 nm, frente a un blanco de éter de petróleo. Obtener la concentración de éster apocaroténico en la solución en relación con el gráfico de calibración (C μg/ml).

5.3. Gráfico de calibración

Llevar con una pipeta 0, 0,25, 0,5, 0,75 y 1,0 ml de solución patrón de éster apocaroténico (4.1.2) a cinco matraces aforados de 100 ml de capacidad. Diluir enrasando con éter de petróleo (4.2) y mezclar.

La concentración de las soluciones oscilará entre 0 y 2 μg/ml y se calculará de manera precisa en relación con la concentración de la solución patrón (4.1.2) (W.P) 10 mg/ml. Medir la absorbancia a 440 nm, frente a un blanco de éter de petróleo (4.2).

Colocar los valores de la absorbancia en el eje de ordenadas y la concentración del éster apocaroténico en el de abscisas.

6. Cálculo de los resultados

6.1. El contenido de éster apocaroténico, expresado en mg/kg de producto, se indica del modo siguiente:

Mantequilla concentrada: (C.V)/M

Mantequilla: 0,82 (C.V)/M

siendo

C= contenido de éster apocaroténico, en μg/ml, indicado en el gráfico de calibración (5.3)

V= volumen (ml) de la solución problema (5.2)

M= masa (g) de la porción de prueba (5.2)

0,82= factor de corrección del contenido de grasa láctea de la mantequilla.

7. Precisión del método

7.1. Repetibilidad

7.1.1. Análisis de la mantequilla

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas en el intervalo de tiempo más breve posible por un mismo analista que utilice el mismo equipo con idéntico material problema no deberá exceder de 1,4 mg/kg.

7.1.2. Análisis de la mantequilla concentrada

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas en el intervalo de tiempo más breve posible por un mismo analista que utilice el mismo equipo con idéntico material problema no deberá exceder de 1,6 mg/kg.

7.2. Reproducibilidad

7.2.1. Análisis de la mantequilla

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas por analistas de diferentes laboratorios que utilicen distinto equipo con idéntico material problema no deberá exceder de 4,7 mg/kg.

7.2.2. Análisis de la mantequilla concentrada

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas por analistas de diferentes laboratorios que utilicen distinto equipo con idéntico material problema no deberá exceder de 5,3 mg/kg.

7.3. Fuente de los datos técnicos

Los datos técnicos se obtuvieron en un experimento realizado en 1995 en el que participaron 11 laboratorios y en el que se utilizaron 12 muestras con adición de marcadores (seis duplicados a ciegas) en el caso de la mantequilla y otras tantas (seis duplicados a ciegas) en el de la mantequilla concentrada.

8. Límites de tolerancia

8.1. Deberán tomarse tres muestras del producto para comprobar si la adición de marcadores se ha efectuado correctamente.

8.2. Mantequilla

8.2.1. Teniendo en cuenta la absorbancia de fondo, la proporción de incorporación de la mantequilla es de 22 mg/kg.

8.2.2. Los resultados de las tres muestras obtenidos del análisis del producto se utilizarán para comprobar la proporción y la homogeneidad de la incorporación del marcador y el resultado más bajo se comparará con los límites siguientes [teniendo en cuenta la diferencia crítica con un nivel de probabilidad del 95 % (CrD95)]:

- 18,0 mg/kg (el 95 % de la proporción de incorporación mínima),

- 13,0 mg/kg (el 70 % de la proporción de incorporación mínima).

Se utilizará la concentración de marcador de la muestra que proporcione el resultado más bajo por interpolación entre 18,0 mg/kg y 13,0 mg/kg.

8.3. Mantequilla concentrada

8.3.1. Teniendo en cuenta la absorbancia de fondo, la tasa de incorporación de la mantequilla concentrada es de 24 mg/kg.

8.3.2. Los resultados de las tres muestras obtenidos del análisis del producto se utilizarán para comprobar la proporción y la homogeneidad de la incorporación del marcador y el resultado más bajo se comparará con los límites siguientes [teniendo en cuenta la diferencia crítica con un nivel de probabilidad del 95 % (CrD95)]:

- 20,0 mg/kg (el 95 % de la proporción de incorporación mínima),

- 14,0 mg/kg (el 70 % de la proporción de incorporación mínima).

Se utilizará la concentración de marcador de la muestra que proporcione el resultado más bajo por interpolación entre 20,0 mg/kg y 14,0 mg/kg.

ANEXO XIV

(Artículo 9)

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE SITOSTEROL Y ESTIGMASTEROL EN LA MANTEQUILLA Y LA MANTEQUILLA CONCENTRADA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA CAPILAR

1. Objeto y ámbito de aplicación

El presente método describe un procedimiento para la determinación del contenido de sitosterol y estigmasterol en la mantequilla y la mantequilla concentrada. Se considera sitosterol la suma de β-sitosterol y 22-dihidro-β-sitosterol; los demás sitosteroles se consideran sin importancia.

2. Principio

Saponificación de la mantequilla y de la mantequilla concentrada con una solución etanólica de hidróxido de potasio y extracción de los insaponificables con éter.

Los esteroles se transforman en trimetilsililéteres y se analizan mediante cromatografía de gases en columna capilar con referencia a un patrón interno de betulina.

3. Aparatos

3.1. Matraz de saponificación de 150 ml provisto de refrigerante de reflujo con juntas esmeriladas

3.2. Ampollas de decantación de 500 ml

3.3. Matraces de 250 ml

3.4. Embudos compensadores de presión, de 250 ml o similares, para recoger el sobrante de éter

3.5. Columna de vidrio de 350 mm x 20 mm provista de una junta de vidrio sinterizado

3.6. Baño maría o manguito termostatizado

3.7. Viales para reacción de 2 ml

3.8. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna capilar, provisto de un sistema de funcionamiento formado por:

3.8.1. una cámara termostática para columnas, capaz de mantener la temperatura deseada con una precisión de +- 1 °C;

3.8.2. un inyector de temperatura ajustable;

3.8.3. un detector de ionización de llama y convertidor-amplificador;

3.8.4. un integrador-registrador que pueda funcionar con el convertidor-amplificador (3.8.3);

3.9. una columna capilar de vidrio de sílice, recubierta completamente de BP1 o material equivalente, con un espesor uniforme de 0,25 μm; la columna debe ser capaz de separar los trimetilsilil derivados del lanosterol y del sitosterol; es adecuada una columna con BP1, de 12 m de longitud y 0,2 mm de diámetro interior.

3.10. Microjeringa de 1 μl para cromatografía de gases, con aguja de acero templado.

4. Reactivos

Todos los reactivos deberán ser de grado analítico reconocido. El agua utilizada deberá ser agua destilada o de pureza al menos equivalente.

4.1. Etanol de una pureza mínima del 95 %.

4.2. Solución de hidróxido de potasio al 60 %: disolver 600 g de hidróxido de potasio (del 85 % como mínimo) en agua y completar hasta un litro con agua.

4.3. Betulina de una pureza mínima del 99 %

4.3.1. Soluciones de betulina en éter dietílico (4.4)

4.3.1.1. La concentración de la solución de betulina usada para la determinación del contenido de sitosterol será de 1,0 mg/ml.

4.3.1.2. La concentración de la solución de betulina usada para la determinación del contenido de estigmasterol será de 0,4 mg/ml.

4.4. Éter dietílico de calidad para análisis (sin peróxidos ni residuos)

4.5. Sulfato sódico anhidro granulado, secado previamente a 102 °C durante dos horas

4.6. Reactivo de sililación, por ejemplo TRI-SIL (distribuido por Pierce Chemical Co, número de catálogo 49001) o equivalente (Atención: el TRI-SIL es inflamable, tóxico, corrosivo y posiblemente cancerígeno. El personal de laboratorio deberá tener un conocimiento adecuado de las medidas de seguridad aplicables a este producto y adoptar las debidas precauciones).

4.7. Lanosterol

4.8. Sitosterol de una pureza conocida del 90 % como mínimo (P)

Nota 1:

La pureza de los materiales patrón utilizados para el calibrado deberá determinarse usando el método de normalización. Considérese que todos los esteroles presentes en la muestra están representados en el cromatograma, que el área total de los picos representa el 100 % de los componentes esterólicos y que los esteroles dan la misma respuesta en la detección. La linealidad del sistema deberá comprobarse en la zona de concentraciones de interés.

4.8.1. Solución patrón de sitosterol: preparar una solución que contenga aproximadamente 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) en éter dietílico (4.4), con una precisión de 0,001 mg/ml.

4.9. Estigmaterol, de una pureza conocida del 90 % como mínimo (P).

4.9.1. Solución patrón de estigmasterol: preparar una solución que contenga aproximadamente 0,2 mg/ml (W1) de estigmasterol (4.9) en éter dietílico (4.4), con una precisión de 0,001 mg/ml.

4.10. Mezcla para la prueba de resolución: preparar una solución que contenga 0,05 mg/ml de lanosterol (4.7) y 0,5 mg/ml de sitosterol (4.8) en éter dietílico (4.4).

5. Procedimiento

5.1. Preparación de las soluciones patrón para cromatografía. La solución de patrón interno (4.3.1) deberá añadirse a la solución patrón de esterol correspondiente a la vez que se añade a la muestra saponificada (véase 5.2.2).

5.1.1. Solución cromatográfica patrón de sitosterol; pasar 1 ml de solución patrón de sitosterol (4.8.1) a dos viales de reacción (3.7) y eliminar el éter con una corriente de nitrógeno. Añadir 1 ml de solución de patrón interno (4.3.1.1) y eliminar el éter con una corriente de nitrógeno.

5.1.2. Solución cromatográfica patrón de estigmasterol; pasar 1 ml de solución patrón de estigmasterol (4.9.1) a 2 viales de reacción (3.7) y eliminar el éter con una corriente de nitrógeno. Añadir 1 ml de solución de patrón interno (4.3.1.2) y eliminar el éter con una corriente de nitrógeno.

5.2. Preparación de los insaponificables

5.2.1. Derretir la muestra de mantequilla a una temperatura de 35 °C como máximo; mezclar perfectamente la muestra removiéndola.

Pesar en un matraz de 150 ml (3.1), con precisión de 1 mg, aproximadamente 1 g de mantequilla (W2) o de mantequilla concentrada (W2). Añadir 50 ml de etanol (4.1) y 10 ml de solución de hidróxido de potasio (4.2). Colocar el refrigerante de reflujo y calentar a unos 75 °C durante 30 minutos. Desmontar el refrigerante y enfriar el matraz hasta la temperatura ambiente.

5.2.2. Añadir al matraz 1,0 ml de solución de patrón interno (4.3.1.1 si va a determinarse el sitosterol, o bien 4.3.1.2 si se va a determinar el estigmasterol). Homogeneizar completamente. Pasar cuantitativamente el contenido del matraz a una ampolla de decantación de 500 ml (3.2) y lavar el matraz con 50 ml de agua y después con 250 ml de éter dietílico (4.4). Agitar enérgicamente la ampolla de decantación durante dos minutos y dejar que se separen las fases. Eliminar la capa acuosa inferior y lavar la capa etérea agitándola sucesivamente con 4 partes alícuotas sucesivas de 100 ml de agua.

Nota 2:

Para evitar que se forme una emulsión, es fundamental que los dos primeros lavados con agua se realicen suavemente (diez inversiones). El tercer lavado podrá hacerse agitando enérgicamente durante 30 segundos. Si se forma una emulsión, podrá deshacerse añadiendo de 5 a 10 ml de etanol. Si se añade etanol, es necesario realizar otros dos lavados enérgicos con agua.

5.2.3. Pasar la capa etérea transparente y exenta de jabones a través de una columna de vidrio (3.5) que contenga 30 g de sulfato sódico anhidro (4.5). Recoger el éter en un matraz de 250 ml (3.3). Añadir perlas para regular la ebullición y evaporar casi hasta sequedad con baño maría o manguito termostatizado, recogiendo los disolventes residuales.

Nota 3:

Si los extractos de la muestra se llevan a sequedad completa a una temperatura demasiado elevada, pueden darse pérdidas de esteroles.

5.3. Preparación de los trimetilsililéteres

5.3.1. Pasar la solución etérea restante en el matraz a un vial de reacción de 2 ml (3.7) con 2 ml de éter y eliminar el éter con una corriente de nitrógeno. Lavar el matraz dos veces con sendas partes alícuotas suplementarias de 2 ml de éter, pasando el líquido al vial y eliminando el éter con nitrógeno cada vez.

5.3.2. Sililar la muestra añadiendo 1 ml de TRI-SIL (4.6). Cerrar el vial y agitar