OCTAVA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN

de 15 de junio de 1978

por la que se fijan los métodos de análisis comunitario para el control oficial de los alimentos para animales

( 78/633/CEE )

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo , de 20 de julio de 1970 , referente a la introducción de modos de toma de muestras y de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales (1) , modificado en último lugar por el Acta de adhesión , y en particular su artículo 2 ,

Considerando que la Directiva anteriormente contemplada prevé que los controles oficiales de los alimentos para animales dirigidos a comprobar que las condiciones prescritas en virtud de las disposiciones legales , reglamentarias o administrativas referentes a la calidad y a la composición de los animales se respetan y se realizan según modos de toma de muestras y de métodos de análisis comunitarios ;

Considerando que las Directivas de la Comisión 71/250/CEE , de 15 de junio de 1971 (2) , 71/393/CEE de 18 de noviembre de 1971 (3) , 72/199/CEE de 27 de abril de 1972 (4) , 73/46/CEE de 5 de diciembre de 1972 (5) , 74/203/CEE de 25 de marzo de 1974 (6) , 75/84/CEE de 20 de diciembre de 1974 (7) y 76/372/CEE de 1 de marzo de 1976 (8) han fijado ya un determinado número de métodos de análisis comunitarios ; que , teniendo en cuenta el grado de desarrollo de los trabajos realizados desde entonces , procede establecer una octava serie de métodos ;

Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva concuerdan con el dictamen del Comité permanente de alimentación animal ,

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

1 . Los Estados miembros prescribirán que los análisis para los controles oficiales de los alimentos para animales , en lo referente a su contenido en bacitracina-cinc , flavofosfolipol , hierro , cobre , manganeso y cinc , se realizarán según los métodos descritos en el anexo de la presente Directiva .

2 . Las disposiciones generales que figuren en el punto 1 « Introducción » del anexo de la primera Directiva 71/250/CEE , excepto la parte referente a la preparación de la muestra por analizar , se podrán aplicar a los métodos descritos en el anexo de la presente Directiva .

Artículo 2

Los Estados miembros aplicarán , el 1 de enero de 1979 , las disposiciones legales , reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir las disposiciones de la presente Directiva e informarán de ello inmediatamente a la Comisión .

Artículo 3

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros .

Hecho en Bruselas , el 15 de junio de 1978 .

Por la Comisión

Finn GUNDELACH

Vicepresidente

(1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .

(2) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .

(3) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .

(4) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .

(5) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .

(6) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .

(7) DO n º L 32 de 5 . 2 . 1975 , p. 26 .

(8) DO n º L 102 de 15 . 4 . 1976 , p. 8 .

ANEXO

1 . DOSIFICACIÓN DE LA BACITRACINA-CINC POR DIFUSIÓN EN GELOSA

1 . OBJETO Y DOMINIO DE APLICACIÓN

El método permitirá dosificar la bacitracina-cinc en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite inferior de dosificación será de 5 mg/kg ( 5 ppm ) (*) . El método no será valedero en presencia de sustancias perturbadoras , en particular de fuertes cantidades de cobre o de ácido ascórbico .

2 . PRINCIPIO

Se someterá la muestra a una extracción a pH 2 por una mezcla de metanol/agua/ácido clorhídrico . Se llevará el extracto a pH 6,5 , concentrado si fuere necesario y diluido . Se determinará su actividad antibiótica por medida de la difusión de la bacitracina-cinc en un medio de gelosa , sembrado con « Micrococcus luteus » ( sinónimo : « M. flavus » ) . Se revelará la difusión por la formación de zonas de inhibición del microorganismo . Se considerará el diámetro de dichas zonas como directamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibiótico para la gama de las concentraciones utilizadas .

3 . MICROORGANISMO : MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240

3.1 . Mantenimiento del extracto base

Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos inclinados , con « Micrococcus luteus » . Incubar 24 h a 30-37 ° C , conservar en refrigerador a 4 ° C aproximadamente y renovar la siembra cada dos semanas .

3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (a)

Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa ( 3.1 ) , de preparación reciente , mediante 2 a 3 ml de solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) . Sembrar en superficie con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo ( 4.1 ) en un frasco de Roux e incubar de 18 a 20 h a 30-37 ° C . Recoger los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) y homogeneizar . Diluir la suspensión a 1/10 mediante la solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) . La transmisión luminosa de la suspensión , medida a 650 nm bajo un espesor de 1 cm en comparación con la solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) , deberá ser de 75 % aproximadamente .

4 . MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

4.1 . Medio de mantenimiento del extracto base (b)

Peptona de carne 6,0 g

Triptona 4,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa 15,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6,5-6,6 ( después de esterilizar ) 1 000 ml

4.2 . Medio de base de la dosificación (b)

Triptona 10,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa 20,0 g

Tween 80 1 ml

Agua 1 000 ml

pH 6,5 ( después de esterilizado )

4.3 . Solución a 0,8 % ( p/v ) de cloruro de sodio : disolver en agua 8 g de cloruro sodio p.a. ; diluir a 1 000 ml y esterilizar .

4.4 . Mezcla de metanol puro/agua/ácido clorhídrico p.a. ( d : 1,18-1,19 ) : 80/17,5/2,5 ( v/v/v ) .

4.5 . Tapón fosfato , pH 6,5 :

Fosfato bipotásico K2HPO4 p.a. 22,15 g

Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. 27,85 g

Agua hasta 1 000 ml

4.6 . Ácido clorhídrico p.a. , d : 1,18-1,19

4.7 . Ácido clorhídrico p.a. 0,1 N

4.8 . Solución 1 N de hidróxido de sodio p.a.

4.9 . Solución a 0,04 % ( p/v ) de púrpura de bromocresol :

Disolver 0,1 g de púrpura de bromocresol en 18,5 ml de solución 0,01 N de hidróxido de sodio . Completar hasta 250 ml con agua y homogeneizar .

4.10 . Sustancia patrón : bacitracina-cinc de actividad conocida ( en UI ) .

5 . SOLUCIONES PATRÓN

Pesar una cantidad de bacitracina-cinc patrón ( 4.10 ) correspondiente a 1 050 UI ( según la dosificación indicada ) . Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 0,1 N ( 4.7 ) y dejar reposar 15 minutos . Añadir 30 ml de agua , ajustar el pH a 4,5 mediante el tapón fosfato pH 6,5 ( 4.5 ) ( alrededor de 4 ml ) , completar con agua hasta 50 ml y homogeneizar ( 1 ml = 21 UI ) .

Preparar a partir de dicha solución y por diluciones sucesivas mediante el tapón fosfato pH 6,5 ( 4.5 ) las siguientes soluciones :

S8 0,42 UI/ml

S4 0,21 UI/ml

S2 0,105 UI/ml

S1 0,0525 UI/ml

6 . PREPARACIÓN DEL EXTRACTO

6.1 . Extracción

6.1.1 . Concentrados , premezclas y alimentos minerales

Pesar una cantidad de muestra de 2 a 5 g , añadir 30 ml de la mezcla ( 4.4 ) y agitar brevemente . Comprobar que el pH es de 2 aproximadamente . Agitar durante 10 minutos , añadir 30 ml de tapón fosfato pH 6,5 ( 4.5 ) y agitar durante 15 minutos . Diluir mediante el tapón fosfato ( 4.5 ) para obtener una concentración presunta en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .

6.1.2 . Concentrados proteínicos

Pesar una cantidad de muestra de 10 g , añadir 50 ml de la mezcla ( 4.4 ) y agitar brevemente . Comprobar que el pH es de 2 aproximadamente . Agitar durante 10 minutos , añadir 50 ml de tapón fosfato pH 6,5 ( 4.5 ) y agitar durante 15 minutos . Diluir mediante el tapón fosfato ( 4.5 ) para obtener una concentración presunta en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .

6.1.3 . Otros alimentos

Pesar una cantidad de muestra de 10 g ( 20 g para una presunta concentración en bacitracina-cinc de 5 mg/kg ) , añadir 25 ml de la mezcla ( 4.4 ) y homogeneizar durante 10 minutos aproximadamente . Añadir 25 ml de tapón fosfato pH 6,5 ( 4.5 ) , agitar durante 15 minutos y centrifugar . Sacar 20 ml de la solución que sobrenade y ajustar el pH a 6,5 mediante la solución 1 N de hidróxido de sodio ( 4.8 ) utilizando como indicador la solución de púrpura de bromocresol ( 4.9 ) . Evaporar hasta 4 ml aproximadamente en un evaporador rotativo a una temperatura que no sobrepase . 35 ° C . Diluir el residuo con agua para obtener una presunta concentración en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .

6.2 . Soluciones del extracto

Preparar a partir de la solución U8 y por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) mediante el tapón fosfato ( 4.5 ) las soluciones U4 ( presunta concentración 0,21 UI/ml ) , U2 ( presunta concentración : 0,105 UI/ml ) y U1 ( presunta concentración : 0,0525 UI/ml ) .

7 . MODALIDADES DE DOSIFICACIÓN

7.1 . Inoculación del medio de cultivo

Sembrar a 50 ° C aproximadamente el medio de base de dosificación ( 4.2 ) por la suspensión bacteriana ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares sobre placas con el medio ( 4.2 ) , determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permita obtener para las distintas concentraciones en bacitracina-cinc zonas de inhibición tan extensas como sea posible y que permanezcan aún nítidas .

7.2 . Preparación de las cajas

La difusión en gelosa se realizará en cajas con las cuatro concentraciones de la solución patrón ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja deberá recibir necesariamente las cuatro concentraciones del patrón y del extracto . A tal fin , escoger la dimensión de las cajas de modo que se pueda ahuecar en el medio de gelosa al menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro , cuyos centros no estén a menos de 30 mm de distancia . Se podrán utilizar como cajas placas de vidrio planas , coronadas por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura .

Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.2 ) , sembrado como se indica en 7.1 , que permita obtener una capa de unos 2 mm de espesor ( 50 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar , ahuecar las cavidades y depositar en ellas volúmenes exactamente medidos de las soluciones del patrón y del extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad , según el diámetro ) .

Hacer al menos cuatro repeticiones de cada concentración de modo que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición .

7.3 . Incubación

Incubar las cajas de 16 a 18 horas a 30 ° C aproximadamente .

8 . EVALUACIÓN

Medir el diámetro de las zonas de inhibición con 0,1 mm de tolerancia . Para cada concentración , registrar las medidas medias en papel semi-logarítmico anotando el logaritmo de las concentraciones en frente de los diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las rectas más ajustadas para la solución patrón y para el extracto procediendo , por ejemplo , de la siguiente manera .

Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución patrón ( SL ) mediante la fórmula :

( a ) SL = ( 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8 ) /10

Determinar el punto más apropiado del nivel más elevado de la solución patrón ( SH ) mediante la fórmula :

( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10

Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el nivel más elevado ( UH ) sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en las fórmulas antes citadas por U1 , U2 , U4 y U8 .

Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico . Juntando los dos puntos , se obtendrá la recta más ajustada para la solución patrón . Procediendo del mismo modo para UL y UH , se obtendrá la recta más ajustada para el extracto .

En ausencia de cualquier interferencia , las rectas deberían ser paralelas . En la práctica , se las considerará como paralelas cuando ( SH - SL ) y ( UH - UL ) no difieren de más de 10 % de su media .

Si las rectas no son paralelas , se podrán eliminar o bien U1 y S1 , o bien U8 y S8 . Los valores SL , SH , UL y UH que permiten conseguir las rectas más ajustadas se calcularán entonces mediante las fórmulas siguientes :

( a' ) ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 o ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6

( b' ) ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 o ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6

y fórmulas análogas para UL y UH . Al utilizar dicha alternativa se deberá igualmente proceder a una comprobación en cuanto al paralelismo de las rectas , como indicado más arriba . Se deberá mencionar en el boletín de análisis la obtención de un resultado procedente de los tres niveles .

Cuando las rectas se consideren como paralelas , se calculará el logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) de acuerdo con una de las fórmulas siguientes .

Para 4 niveles

( c ) log. A = ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) × 0,602/U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2

Para 3 niveles

( d ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) × 0,401 ) / ( U4 + S4 - U1 - S1 )

( d' ) log. A = ( ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) × 0,401 ) / ( U8 + S8 - U2 - S2 )

Actividad real = presunta actividad × actividad relativa .

Cuando se consideren las rectas como no paralelas , se repetirá la determinación . Si la misma continuara sin permitir alcanzar el paralelismo , se calculará el logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) mediante la fórmula ( c ) . No obstante se deberá considerar el resultado conseguido como una aproximación y procederá mencionarlo así en el boletín de análisis .

9 . REPETIBILIDAD

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas con una misma muestra por un mismo analista no debería pasar de :

20 % del resultado más elevado para contenidos de baciatracina-cinc de 5 a 25 mg/kg ,

5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos superiores a 25 mg/kg y hasta 50 mg/kg ,

10 % del resultado más elevado para contenidos superiores a 50 mg/kg .

2 . DOSIFICACIÓN DEL FLAVOFOSFOLIPOL POR DIFUSIÓN EN GELOSA

1 . OBJETO Y DOMINIO DE APLICACIÓN

El método permitirá dosificar el flavofosfolipol en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite inferior de dosificación será de 1 mg/kg ( 1 ppm ) .

2 . PRINCIPIO

Se someterá la muestra a una extracción por metanol diluido mediante calentamiento por reflujo . El extracto será centrifugado , purificado si fuere necesario en resinas intercambiadoras de iones y diluido . Se determinará su actividad antibiótica por medida de la difusión del flavofosfolipol en un medio de gelosa , sembrado con Staphylococcus aureus . El diámetro de dichas zonas se considerará como si fuera directamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibiótico para la gama de las concentraciones utilizadas .

3 . MICROORGANISMO : STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1 . Mantenimiento del extracto base

Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos inclinados , con Staphylococcus aureus . Incubar 24 horas a 37 ° C , conservar en refrigerador a 4 ° C aproximadamente y renovar la siembra cada mes .

3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (c)

Extraer dos tubos que contengan el cultivo-madre ( 3.1 ) y renovar la siembra cada semana . Incubar 24 horas a 37 ° C y conservar en refrigerador a 4 ° C aproximadamente .

24 horas antes de la dosificación , sembrar mediante dichos cultivos dos a cuatro tubos inclinados que contengan el medio de cultivo ( 4.1 ) .

Incubar de 16 a 18 horas a 37 ° C . Poner luego los gérmenes en suspensión en la solución de cloruro de sodio ( 4.3 ) . La transmisión luminosa de la suspensión , medida a 578 nm bajo un espesor de 1 cm por comparación con la solución de cloruro de sodio , deberá ser de 40 % aproximadamente .

4 . MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

4.1 . Medio de mantenimiento del extracto base (d)

Peptona de carne 6,0 g

Triptona 4,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa 15,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6,5 ( después esterilización )

4.2 . Medio de base de la dosificación

4.2.1 . Capa inferior (e)

Peptona de carne 6,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Gelosa 10,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6,5 ( después esterilización )

4.2.2 . Capa por sembrar

Medio ( 4.1 ) sumado a 2 g de emulsión antiespumante de silicona (f)

4.3 . Solución a 0,4 % ( p/v ) de cloruro de sodio : disolver en agua 4 g de cloruro de sodio p.a. , diluir hasta 1 000 ml y esterilizar .

4.4 . Metanol puro .

4.5 . Metanol a 50 % ( v/v ) : diluir 500 ml de metanol por 500 ml de agua .

4.6 . Metanol a 80 % ( v/v ) : diluir 800 ml de metanol ( 4.4 ) por 200 ml de agua .

4.7 . Tris ( hidroximetil ) aminometano p.a.

4.8 . Solución metanólica a 1,5 % ( p/v ) de cloruro de potasio : disolver 1,5 g de cloruro de potasio p.a. en 20 ml de agua , completar hasta 100 ml con metanol ( 4.4 ) .

4.9 . Intercambiador de cationes : Dowex 50 WX8 , 20-50 mesh , forma Na ( cat. Serva n º 41600 ) o equivalente .

4.10 . Intercambiador de aniones : Dowex 1X2 , 50-100 mesh , forma Cl ( cat. Serva n º 41010 ) o equivalente . Antes de utilizarlo , mantener el producto durante 12 a 14 horas en metanol a 80 % ( 4.6 ) .

4.11 . Lana de vidrio .

4.12 . Papel indicador de pH ( pH 6,6-8,1 )

4.13 . Ácido ascórbico .

4.14 . Sustancia patrón : flavofosfolipol de actividad conocida .

5 . EQUIPO

5.1 . Tubo para cromatografía , de vidrio , diámetro interior : 9 mm , longitud : 150 a 200 mm , provisto de un grifo en la parte afilada de la extremidad inferior y de un esmerilado normalizado ( para empalme del embudo ) en la parte superior .

5.2 . Embudo con depósito de 250 ml , con grifo y esmerilado normalizado .

5.3 . Frasco cónico de 250 ml , de esmerilado normalizado .

5.4 . Refrigerante de reflujo , de esmerilado normalizado .

6 . SOLUCIONES PATRÓN

Disolver una cantidad exactamente pesada de sustancia patrón ( 4.14 ) en metanol a 50 % ( 4.5 ) y diluir para obtener una solución madre de flavofosfolipol a 100 µg/ml . Conservada en frasco tapado a 4 ° C , dicha solución será estable durante dos meses .

Preparar a partir de dicha solución y por diluciones sucesivas mediante metanol a 50 % ( 4.5 ) las soluciones siguientes :

S8 0,2 µg/ml

S4 0,1 µg/ml

S2 0,05 µg/ml

S1 0,025 µg/ml

7 . PREPARACIÓN DEL EXTRACTO

7.1 . Extracción

7.1.1 . Concentrados , premezclas y alimentos minerales

Pesar una cantidad de muestra de 2 a 5 g y añadirle unos 150 mg de ácido ascórbico ( 4.13 ) . Mezclar a 150 mg de metanol a 50 % ( 4.5 ) en un frasco ( 5.3 ) y ajustar el pH a 8,1-8,2 mediante unos 400 mg de tris ( hidroximetil ) aminometano ( 4.7 ) . Controlar el pH mediante papel indicador ( 4.12 ) . Dejar macerar 15 minutos , ajustar de nuevo el pH a 8,1-8,2 mediante tris ( hidroximetil ) aminometano ( 4.7 ) y luego hacer hervir durante 10 minutos con refrigerante de reflujo ( 5.4 ) agitando constantemente . Dejar enfriar , luego centrifugar y decantar el extracto .

7.1.2 . Otros alimentos

Pesar una cantidad de muestra de 5 a 30 g que contenga al menos 30 µg de flavofosfolipol . Mezclar a 150 ml de metanol a 50 % ( 4.5 ) en un frasco ( 5.3 ) y ajustar el pH a 8,1-8,2 mediante unos 400 mg de tris ( hidroximetil ) aminometano ( 4.7 ) . Controlar el pH mediante el papel indicador ( 4.12 ) . Dejar macerar 15 minutos , ajustar de nuevo el pH a 8,1-8,2 mediante tris(hidroximetil) aminometano ( 4.7 ) y luego hacer hervir durante 10 minutos con refrigerante de reflujo ( 5.4 ) agitando constantemente . Dejar enfriar , luego centrifugar y decantar el extracto .

7.2 . Purificación ( se podrá omitir dicha modalidad para los concentrados , las premezclas y los alimentos minerales )

Mezclar 110 ml del extracto a 11 g de intercambiador de cationes ( 4.9 ) , hacer hervir durante un minuto con refrigerante de reflujo ( 5.4 ) agitando constantemente . Separar el intercambiador de cationes por centrifugación o filtración . Mezclar 100 ml del extracto a 150 ml de metanol ( 4.4 ) y dejar reposar la solución de 12 a 15 horas a 4 ° C . Eliminar la materia floculante por filtración en frío .

Poner en el extremo inferior de un tubo ( 5.1 ) un tapón de lana de vidrio ( 4.11 ) , verter en el tubo 5 ml de intercambiador de aniones ( 4.10 ) y lavar la columna con 100 ml de metanol a 80 % ( 4.6 ) . Luego trasvasar en la columna mediante el embudo ( 5.2 ) un volumen de filtrado de 100 ml que se supondrá contiene al menos 16 µg de flavofosfolipol ( 200 ml para una muestra de 30 g de alimento a 1 ppm ) . Si fuere necesario , diluir el filtrado antes de trasvasarlo en la columna mediante metanol a 80 % ( 4.6 ) para obtener una presunta concentración en flavofosfolipol de 16 µg por 100 ml . Regular el caudal de salida del líquido a 2 ml aproximadamente por minuto . Eliminar la totalidad del filtrado . Lavar luego la columna mediante 50 ml de metanol a 80 % ( 4.6 ) y eliminar el filtrado .

Diluir el flavofosfolipol mediante la solución metanólica de cloruro de potasio ( 4.8 ) manteniendo el caudal de goteo alrededor de 2 ml por minuto . Recoger 50 ml de la disolución en un matraz aforado , añadir 30 ml de agua y homogeneizar . Esta disolución debería tener un contenido en flavofosfolipol de 0,2 µg/ml ( = U8 ) .

7.3 . Soluciones del extracto

Si fuere necesario ( en particular en los casos en que se hubiere omitido la purificación ) , diluir el extracto obtenido en 7.1.1 con metanol a 50 % ( 4.5 ) para obtener una presunta concentración en flavofosfolipol de 0,2 µg/ml ( = U8 ) .

Preparar a partir de la solución U8 por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) mediante metanol a 50 % ( 4.5 ) las soluciones U4 ( presunta concentración ) : 0,1 µg/ml ) , U2 ( presunta concentración : 0,05 µg/ml ) y U1 ( presunta concentración : 0,025 µg/ml ) .

8 . MODALIDADES DE LA DOSIFICACIÓN

8.1 . Inoculación del medio de cultivo

Sembrar a 50 ° C aproximadamente el medio de base de la dosificación ( 4.2.2 ) a través de la suspensión bacteriana ( 3.2 ) . Gracias a ensayos preliminares en placas con el medio ( 4.2.2 ) , determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permita obtener para las distintas concentraciones en flavofosfolipol zonas de inhibición tan extensas como sea posible y que permanezcan aún nítidas ( unos 30 ml por litro ) .

8.2 . Preparación de las cajas

La difusión en gelosa se realizará en cajas con las cuatro concentraciones de la solución patrón ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja deberá necesariamente recibir las cuatro concentraciones del patrón y del extracto . A tal fin , escoger la dimensión de las cajas de forma tal que se pueda ahuecar en el medio de gelosa al menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro , cuyos centros no estén separados por menos de 30 mm . Se podrá utilizar como cajas placas de vidrio planas , coronadas por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura .

Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.2.1 ) que permita obtener una capa de 1,5 mm aproximadamente de espesor ( 45 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar y añadir una cantidad del medio ( 4.2.2 ) , sembrado como indicado en el punto 8.1 , que permita obtener una capa de 1 mm de espesor ( 30 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar , ahuecar las cavidades y depositar en las mismas volúmenes exactamente medidos de las soluciones del patrón y del extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad , según el diámetro ) .

Hacer al menos cuatro repeticiones de cada concentración de modo que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición .

8.3 . Incubación

Incubar las cajas de 16 a 18 horas a 28-30 ° C .

9 . EVALUACIÓN

Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una tolerancia de 0,1 mm . Para cada concentración , registrar las medidas en papel semi-logarítmico anotando el logaritmo de las concentraciones frente a los diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las rectas mejor ajustadas para la solución patrón y para el extracto procediendo , por ejemplo , de la siguiente manera .

Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución patrón ( SL ) mediante la fórmula :

( a ) SL = ( 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8 ) /10

Determinar el punto más apropiado del nivel más elevado de la solución patrón ( SH ) mediante la fórmula :

( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10

Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el nivel más elevado ( UH ) sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en las fórmulas arriba mencionadas por U1 , U2 , U4 y U8 .

Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico . Uniendo los dos puntos , se obtendrá la recta mejor ajustada para la solución patrón . Procediendo del mismo modo para UL y UH , se conseguirá la recta mejor ajustada para el extracto .

En ausencia de cualquier interferencia , las rectas deberían ser paralelas . En la práctica , se las considerará como si fueren paralelas cuando ( SH-SL ) y ( UH-UL ) no diferieren de más del 10 % de su media .

Si las rectas no fueren paralelas , se podrá eliminar o bien U1 y S1 o bien U8 y S8 . Los valores SL , SH , UL y UH que permitan obtener las rectas mejor ajustadas se calcularán entonces mediante las fórmulas siguientes :

( a' ) SL = ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 o ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6

( b' ) SH = ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 o ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6

y fórmulas análogas para UL y UH . La utilización de dicha alternativa deberá igualmente ser objeto de una verificación en cuanto al paralelismo de las rectas como indicado más arriba . Se deberá mencionar en el boletín de análisis la obtención de un resultado procedente de tres niveles .

Cuando se consideren las rectas como paralelas , se calculará el logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) mediante alguna de las fórmulas siguientes .

Para 4 niveles

( c ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) × 0,602 ) / ( U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 )

Para 3 niveles

( d ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) × 0,401 ) / ( U4 + S4 - U1 - S1 )

( d' ) log. A = ( ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) × 0,401 ) / ( U8 + S8 - U2 - S2 )

Actividad real = actividad presunta × actividad relativa .

Cuando las rectas se consideren como no paralelas , repetir la determinación . Si la misma continuara sin permitir alcanzar el paralelismo , calcular el logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) mediante la fórmula ( c ) . Sin embargo , se deberá considerar el resultado obtenido como aproximativo y será procedente mencionarlo en el boletín de análisis .

10 . REPETIBILIDAD

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas en la misma muestra por el mismo analista no debería sobrepasar :

0,5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos en flavofosfolipol de 1 a 2 mg/kg ,

25 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 2 mg/kg y hasta 10 mg/kg ,

20 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 10 mg/kg y hasta 25 mg/kg ,

5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos superiores a 25 mg/kg y hasta 50 mg/kg ,

10 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 50 mg/kg .

3 . DOSIFICACIÓN DE LOS OLIGOELEMENTOS HIERRO , COBRE , MANGANESO Y CINC

1 . OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

El método permitirá dosificar los oligoelementos hierro , cobre , manganeso y cinc en los alimentos de los animales . Los límites inferiores de determinación serán los siguientes :

Hierro ( Fe ) 20 mg/kg ,

Cobre ( Cu ) 10 mg/kg

Manganeso ( Mn ) 20 mg/kg

Cinc ( Zn ) 20 mg/kg

2 . PRINCIPIO

Se meterá en solución la muestra en el ácido clorhídrido después de la eventual destrucción de las materias orgánicas . Se determinarán los elementos hierro , cobre , manganeso y cinc , después de dilución apropiada , por espectrometría de absorción atómica .

3 . REACTIVOS

Observaciones preliminares

El agua utilizada para la preparación de los reactivos y de las soluciones requeridas en el transcurso del análisis deberán estar exentos de los cationes por determinar . Se obtendrá bien por doble destilación en un aparato de borosilicato o de cuarzo , bien por doble permutación en resina intercambiadora de iones .

Los reactivos deberán ser al menos de la calidad « para análisis » ( p.a. ) . La ausencia del elemento por determinar deberá ser controlada por un ensayo en blanco . Si fuere necesario , se someterán los reactivos a una purificación más profunda .

Se podrán sustituir las soluciones patrón descritas a continuación por soluciones patrón comerciales con tal que las mismas sean garantizadas y controladas antes de su empleo .

3.1 . Ácido clorhídrico p.a. , d : 1,19 .

3.2 . Ácido clorhídrico p.a. , 6 N .

3.3 . Ácido clorhídrico p.a. , 0,5 N .

3.4 . Ácido fluorhídrico a 38-40 % ( v/v ) , con un contenido de hierro inferior a 1 mg/l y cuyo residuo de evaporación sea inferior a 10 mg ( expresados en sulfatos )/l .

3.5 . Ácido sulfúrico p.a. , d : 1,84 .

3.6 . Agua oxigenada p.a. , a 100 vol. aproximadamente de oxígeno ( 30 % en peso ) .

3.7 . Solución patrón de hierro ( 1 000 mg Fe/ml ) : disolver 1 g de hierro de hilo p.a. en 200 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3,2 ) , añadir 16 ml de agua oxigenada ( 3.6 ) y completar con agua hasta 1 l .

3.7.1 . Solución patrón de trabajo ( 100 mg Fe/ml ) : diluir la solución patrón ( 3.7 ) con agua a 1 + 9 .

3.8 . Solución patrón de cobre ( 100 mg Cu/ml ) : disolver 1 g de cobre en polvo pa en 25 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) , añadir 5 ml de agua oxigenada ( 3.6 ) y completar con agua hasta 1 l .

3.8.1 . Solución patrón de trabajo ( 10 mg Cu/ml ) : diluir la solución patrón ( 3.8 ) a 1 + 9 con agua ; diluir luego con agua la solución obtenida a 1 + 9 .

3.9 . Solución patrón de manganeso ( 1 000 mg Mn/ml ) : disolver 1 g de manganeso en polvo p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) y completar con agua hasta 1 l .

3.9.1 . Solución patrón de trabajo ( 10 mg Mn/ml ) : diluir la solución patrón ( 3.9 ) con agua a 1 + 9 ; diluir luego con agua la solución obtenida a 1 + 9 .

3.10 . Solución patrón de cinc ( 1 000 mg Zn/ml ) : disolver 1 g de cinc en cinta o en placa p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) y completar con agua hasta 1 l .

3.10.1 . Solución patrón de trabajo ( 10 mg Zn/ml ) : diluir la solución patrón ( 3.10 ) con agua a 1 + 9 ; diluir luego la solución obtenida con agua a 1 + 9 .

3.11 . Solución de cloruro de lantano : disolver 12 g de óxido de lantano en 150 ml de agua , añadir 100 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) y completar con agua hasta 1 l .

4 . EQUIPO

4.1 . Horno de mufla , de temperatura regulable y controlada .

4.2 . Material de vidrio de borosilicato , resistente . Se recomendará utilizar un material que sirva exclusivamente para las dosificaciones de los oligoelementos .

4.3 . Cápsulas de platino y , eventualmente , de cuarzo .

4.4 . Espectrofotómetro de absorción atómico , que responda a las exigencias del método en cuanto a la sensibilidad y a la precisión en la gama de las medidas útiles .

5 . MODO OPERATIVO

5.1 . Muestra que contenga compuestos orgánicos

5.1.1 . Incineración y preparación de la solución por analizar (**)

i ) Colocar de 5 a 10 g de la muestra , pesados con 0,2 mg de tolerancia , en una cápsula de cuarzo o de platino ( 4.3 ) ( ver nota b ) , secar en la estufa a 105 ° C e introducir la cápsula en el horno de mufla ( 4.1 ) frío . Cerrar el horno ( ver nota c ) y elevar progresivamente su temperatura para alcanzar de 450 a 475 ° C en 90 minutos aproximadamente . Mantener dicha temperatura durante 4 a 16 horas ( por ejemplo , durante la noche ) de forma a eliminar la materia carbonosa , abrir luego el horno y dejar enfriar ( ver nota d ) .

Humectar las cenizas con agua , luego trasvasarlas a un vaso precipitado de 250 ml . Enjuagar la cápsula con 5 ml de ácido clorhídrico ( 3.1 ) y trasvasar lentamente y con precaución la solución de enjuague en el vaso precipitado ( se podrá producir una reacción violenta por formación de CO2 . Añadir luego gota a gota ácido clorhídrico ( 3.1 ) , agitando al mismo tiempo el contenido del vaso precipitado , hasta el cese de la efervescencia . Evaporar en seco agitando periódicamente con una varilla de vidrio .

Añadir al residuo 15 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) y luego unos 120 ml de agua . Mezclar con la ayuda de una varilla de vidrio , dejar la misma en el vaso precipitado y recubrir con un vidrio de reloj . Poner el líquido en ebullición suave y mantener la ebullición hasta que aparentemente ya no se disuelvan las cenizas . Filtrar en un papel filtro sin cenizas y recoger el filtrado en un matraz aforado de 250 ml . Lavar el vaso precipitado y el filtro con 5 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) caliente y por dos veces con agua hirviente . Completar con agua hasta su volumen ( la concentración en hl será de 0,5 N aproximadamente ) .

ii ) Si el residuo que se encuentre en el filtro apareciere negro ( carbonoso ) , colocarlo de nuevo en el horno e incinerar a 450-475 ° C . Dicha incineración , que requerirá únicamente algunas horas ( 3 a 5 horas aproximadamente ) se completará cuando las cenizas aparezcan blancas o casi blancas . Disolver el residuo en unos 2 ml de ácido clorhídrico ( 3.1 ) , evaporar en seco y añadir 5 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) . Calentar , filtrar la solución en el matraz aforado y completar con agua hasta su volumen ( la concentración en hl será de 0,5 N aproximadamente ) .

Observaciones :

a ) Al dosificar los oligoelementos , será oportuno llamar la atención en cuanto a los riesgos de contaminación , en particular por el cinc , el cobre y el hierro . Por ello los instrumentos utilizados para la preparación de las muestras deberán ser exentos de dichos metales .

Para reducir los riesgos de contaminación , convendrá trabajar en atmósfera exenta de polvo , con un material rigurosamente limpio y aparatos de vidrio cuidadosamente lavados . La dosificación del cinc será especialmente sensible a las contaminaciones procedentes en particular de los aparatos de vidrio , de los reactivos , del polvo , etc .

b ) Calcular el peso de la muestra por incinerar en función del contenido aproximativo del alimento en oligoelementos por dosificar y de la sensibilidad del espectrofotómetro utilizado . Para determinados alimentos pobres en oligoelementos , podrá ser necesario extraer una muestra de 10 a 20 g y de limitar el volumen de la solución final a 100 ml .

c ) Incinerar en un horno cerrado sin inyección de aire o de oxígeno .

d ) La temperatura indicada por el pirómetro no deberá sobrepasar los 475 ° C .

5.1.2 . Determinación espectrofotométrica .

5.1.2.1 . Preparación de las soluciones patrón

Preparar para cada oligoelemento por dosificar una gama de soluciones patrón a partir de las soluciones patrón de trabajo 3.7.1 , 3.8.1 , 3.9.1 y 3.10.1 , de forma que cada solución patrón tuviere una concentración en HCl de 0,5 N aproximadamente y , en el caso del hierro , del manganeso y del cinc , una concentración en cloruro de lantano que corresponda a 0,1 % de lantano ( p/v ) . Las concentraciones escogidas en oligoelementos deberán encontrarse en la zona de sensibilidad del espectrofotómetro utilizado . Los cuadros siguientes darán , a título de ejemplo , tipos de composición de solución patrón ; según el tipo y la sensibilidad del espectrofotómetro utilizado , podrá ser necesario escoger otras concentraciones .

Hierro

µg Fe/ml * 0 * 0,5 * 1 * 2 * 3 * 4 * 5 *

ml de solución patrón de trabajo ( 3.7.1 ) ( 1 ml = 100 µg Fe ) + ml hl 6 N ( 3.2 ) * 0 * 0,5 * 1 * 2 * 3 * 4 * 5 *

7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 *

+ 10 ml de solución de cloruro de lantano ( 3.11 ) ; completar con agua hasta 100 ml .

Cobre

µg Cu/ml * 0 * 0,1 * 0,2 * 0,4 * 0,6 * 0,8 * 1,0 *

ml de solución patrón de trabajo ( 3.8.1 ) ( 1 ml = 10 µg CU ) + ml hl 6 N ( 3.2 ) * 0 * 1 * 2 * 4 * 6 * 8 * 10 *

* 8 * 8 * 8 * 8 * 8 * 8 * 8 *

Completar con agua hasta 100 ml .

Manganeso

g Mn/ml * 0 * 0,1 * 0,2 * 0,4 * 0,6 * 0,8 * 1,0 *

ml de solución patrón de trabajo ( 3.9.1 ) ( 1 ml = 10 µg Mn ) + ml hl 6 N ( 3.2 ) * 0 * 1 * 2 * 4 * 6 * 8 * 10 *

* 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 *

+ 10 ml de solución de cloruro de lantano ( 3.11 ) ; completar con agua hasta 100 ml .

Cinc

g Zn/ml * 0 * 0,05 * 0,1 * 0,2 * 0,4 * 0,6 * 0,8 *

ml de solución patrón de trabajo ( 3.10.1 ) ( 1 ml = 10 µ Zn ) + ml hl 6 N ( 3.2 ) * 0 * 0,5 * 1 * 2 * 4 * 6 * 8 *

* 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 * 7 *

+ 10 ml de solución de cloruro de lantano ( 3.11 ) ; completar con agua hasta 100 ml

5.1.2.2 . Preparación de la solución por analizar

Para la dosificación del cobre , la solución preparada según 5.1.1 podrá , como regla general , utilizarse directamente . Si fuere necesario llevar su concentración a la gama de las concentraciones de las soluciones patrón , se podrá introducir con una pipeta una parte alícuota en un matraz aforado de 100 ml y completar con ácido clorhídrico 0,5 N ( 3.3 ) hasta su volumen .

Para la dosificación del hierro , del manganeso y del cinc , introducir con la pipeta una porción alícuota de la solución preparada según 5.1.1 en un matraz aforado de 100 ml ; añadir 10 ml de solución de cloruro de lantano ( 3.11 ) y completar con ácido clorhídrico 0,5 N ( 3.3 ) ( ver también punto 8 « Observación » ) hasta su volumen .

5.1.2.3 . Prueba en blanco

Realizar una prueba en blanco que comprenda todas las etapas prescritas del modo operatorio , con exclusión de la presencia de la muestra .

No se deberá utilizar la solución patrón « O » para la prueba en blanco .

5.1.2.4 . Medida de la absorción atómica

Medir la absorción de las soluciones patrón y de la solución por analizar , utilizando una llama oxidante aire-acetileno , con las siguientes longitudes de onda :

Fe 248,3 nm

Cu 324,8 nm

Mn 279,5 nm

Zn 213,8 nm .

Realizar cuatro veces cada medida .

5.2 . Compuestos minerales

En ausencia de materia orgánica , será inútil la incineración previa . Aplicar el modo operatorio a partir del punto 5.5.1 i ) del segundo apartado . Se podrá omitir la evaporación en presencia de ácido fluorhídrico .

6 . CÁLCULO DE LOS RESULTADOS

Calcular la concentración en oligoelementos en la solución por analizar mediante una curva de contraste y expresar el resultado en mg de oligoelemento por kg de muestra ( ppm ) .

7 . REPETIBILIDAD

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra por el mismo analista no debiere sobrepasar :

- 5 mg/kg en valor absoluto , para los contenidos respectivos en oligoelementos hasta 50 mg/kg ,

- 10 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 50 y hasta 100 mg/kg ,

- 10 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos superiores a 100 y hasta 200 mg/kg ,

- 5 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 200 mg/kg .

8 . OBSERVACIÓN

La presencia de grandes cantidades de fosfatos podrá interferir en la dosificación del hierro , del manganeso y del cinc . Se deberá corregir dicha interferencia por adición de solución de cloruro de lantano ( 3.11 ) . Sin embargo , si la muestra tuviere una relación ponderal ( Ca + Mg ) /p > 2 se podrá omitir la adición de solución de cloruro de lantano ( 3.11 ) a la solución por analizar y a las soluciones patrón .

(**) Los forrajes verdes ( frescos o deshidratados ) podrán contener grandes cantidades de sílice vegetal que puedan retener oligoelementos y que se deberán eliminar . Se deberán someter las muestras de dichos alimentos al siguiente tratamiento . Efectuar la operación ( 5.1.1 i ) hasta la fase de la filtración . Lavar el papel filtro que contenga el residuo insoluble por dos veces con agua hirviente y colocarlo en una cápsula de platino ( 4.3 ) . Incinerar en el horno de mufla ( 4.1 ) a una temperatura inferior a 550 ° C hasta que toda la materia carbonosa hubiere desaparecido por completo . Dejar enfriar , añadir algunas gotas de agua , luego de 10 a 15 ml de ácido fluorhídrico ( 3.4 ) y evaporar en seco a 150 ° C aproximadamente . Si el residuo conteniere aún sílice , disolver la misma en algunos ml de ácido fluorhídrico ( 3.4 ) y evaporar en seco . Añadir 5 gotas de ácido sulfúrico ( 3.5 ) y calentar hasta desaparición de los humos blancos . Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 6 N ( 3.2 ) y 30 ml aproximadamente de agua , calentar , filtrar la solución en un matraz aforado de 250 ml y completar hasta su volumen con agua ( la concentración de hl será de 0,5 N aproximadamente ) . Proseguir el procedimiento a partir del punto 5.1.3 .