NOVENA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN

de 31 de julio de 1981

por la que se establecen métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales

( 81/715/CEE )

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo , de 20 de julio de 1970 , relativa a la introducción de métodos de toma de muestras y de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales (1) , modificada en último lugar por el Acta de adhesión de Grecia , y , en particular , su artículo 2 ,

Considerando que la Directiva mencionada prevé que los controles oficiales de los alimentos para animales destinados a comprobar que se cumplen las condiciones establecidas en virtud de las disposiciones legales , reglamentarias o administrativas relativas a la calidad y composición de los alimentos para animales se efectuarán de acuerdo con métodos de toma de muestras y métodos de análisis comunitarios ;

Considerando que las Directivas de la Comisión 71/250/CEE (2) , 71/393/CEE (3) , 72/199/CEE (4) , 73/46/CEE (5) , 74/203/CEE (6) , 75/84/CEE (7) , 76/372/CEE (8) y 78/633/CEE (9) , modificadas en último lugar por la Directiva de 30 de julio de 1981 , han establecido ya determinados métodos de análisis comunitario ; que , habida cuenta del estado de los trabajos efectuados desde entonces , es conveniente adoptar una novena serie de métodos ;

Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente de la alimentación animal ,

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

Los Estados miembros dispondrán que los análisis previstos para los controles oficiales de los alimentos para animales , en lo que se refiere a su contenido en avoparcina y en monensina sódica , se efectúen de acuerdo con los métodos descritos en el Anexo .

Artículo 2

Los Estados miembros aplicarán las disposiciones legales , reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir las disposiciones de la presente Directiva el 1 de diciembre de 1981 e informarán de ello a la Comisión .

Artículo 3

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros .

Hecho en Bruselas , el 31 de julio de 1981 .

Por la Comisión

El Presidente

Gaston THORN

(1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .

(2) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .

(3) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .

(4) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .

(5) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .

(6) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .

(7) DO n º L 32 de 5 . 2 . 1975 , p. 26 .

(8) DO n º L 102 de 15 . 4 . 1976 , p. 8 .

(9) DO n º L 206 de 29 . 7 . 1978 , p. 43 .

ANEXO

1 . DETERMINACIÓN DE AVOPARCINA POR DIFUSIÓN DE GELOSA

1 . OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

El método permite determinar la avoparcina en los alimentos y en las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 2 mg/kg ( 2ppm ) . La presencia de antibióticos polietéreos puede interferir en la determinación .

2 . PRINCIPIO

La muestra se somete a una extracción con una mezcla de acetona/agua/ácido clorhídrico . La actividad antibiótica del extracto se determina midiendo la difusión de la avoparcina en un medio gelosado , sembrado con Bacillus subtilis . La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición del microorganismo . El diámetro de estas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas .

3 . MICROORGANISMO : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 ( NCIB 8054 )

3.1 . Mantenimiento de la cepa

Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) en tubos inclinados , con Bacillus subtilis . Incubar durante una noche a 30 ° C , conservar en un refrigerador a 4 ° C aproximadamente y renovar la siembra todos los meses .

3.2 . Preparación de la suspensión de esporas (1)

Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa ( 3.1 ) , de preparación reciente , con ayuda de 2 a 3 ml de agua esterilizada . Sembrar con esta suspensión 300 ml del medio de cultivo ( 4.1 ) en un frasco de Roux e incubar durante tres a cinco días a 30 ° C . Después de controlar la esporulación al microscopio , recoger las esporas en 15 ml de etanol ( 4.2 ) y homogeneizar . Esta suspensión puede conservarse por lo menos cinco meses a 4 ° C aproximadamente .

4 . MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS

4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa (2)

Peptona 6,0 g

Triptona 4,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa 15,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6,5 ( después de la esterilización )

4.2 . Etanol al 20 % ( v/v ) : diluir 200 ml de etanol en 800 ml de agua .

4.3 . Acido clorhídrico , d : 1,18-1,19 .

4.4 . Solución 2 M de hidrócido de sodio .

4.5 . Tampón fosfato 0,1 M :

dihidrógenofosfato de potasio , KH2PO4 : 13,6 g

agua hasta 1 000 ml

ajustar el pH a 4,5 .

4.6 . Mezcla acetona/agua/ácido clorhídrico ( 4.3 ) : 65/32,5/2,5 ( v/v/v ) .

4.7 . Sustancia patrón : sulfato de avoparcina de actividad conocida .

5 . SOLUCIONES PATRÓN

Disolver una cantidad exactamente pesada de 10 mg aproximadamente de sustancia patrón ( 4,7 ) en el tampón fosfato ( 4.5 ) y diluirla con dicho tampón para obtener una solución madre de avoparcina en 100 µg/ml . Conservada en un frasco cerrado a 4 ° C , esta solución es estable durante siete días .

5.1 . Para las premezclas

Preparar a partir de dicha solución y mediante diluciones consecutivas con el tampón fosfato ( 4,5 ) la soluciones siguientes :

S8 4 µg/ml

S4 2 µg/ml

S2 1 µg/ml

S1 0,5 µg/ml .

5.2 . Para los alimentos

Preparar a partir de dicha solución y mediante diluciones consecutivas con el tampón fosfato ( 4.5 ) las soluciones siguientes :

S8 2 µg/ml

S4 1,00 µg/ml

S2 0,50 µg/ml

S1 0,25 µg/ml .

6 . PREPARACIÓN DEL EXTRACTO Y DE LAS SOLUCIONES

6.1 . Premezclas

Pesar , con una precisión de 10 mg , una cantidad de muestra que contenga de 10 a 100 mg de avoparcina aproximadamente , transvasarla a un matraz aforado de 100 ml , añadir 60 ml de la mezcla ( 4.6 ) y agitar durante 15 minutos en un agitador mecánico . Verificar el pH y ajustarlo a 2 , si fuere necesario , con ácido clorhídrico ( 4.3 ) . Completar hasta el volumen con la mezcla ( 4.6 ) y homogeneizar . Filtrar una parte en un papel filtro adecuado ( por ej. Whatman n º 1 ) y eliminar los primeros 5 ml del filtrado . Tomar una parte alícuota y ajustar el pH a 4,5 con la solución de hidróxido de sodio ( 4.4 ) . Diluir esta solución con el tampón de fosfato ( 4.5 ) para obtener una concentración supuesta en avoparcina de 4 µg/ml ) ( = U8 ) .

Preparar a partir de dicha solución y mediante diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con el tampón fosfato ( 4.5 ) las soluciones U4 ( concentración supuesta : 2 µg/ml ) , U2 ( concentración supuesta : 1 µg/ml ) y U1 ( concentración supuesta : 0,5 µg/ml ) .

6.2 . Alimentos

Pesar una cantidad de muestra de 50,0 g , añadir 100 ml de la mezcla ( 4.6 ) y agitar durante 30 minutos en un agitador mecánico . Clarificar el extracto mediante centrifugación ( en tubos cerrados ) , tomar una parte alícuota del extracto limpido ( véase el cuadro que sigue ) y ajustar el pH a 4,5 con la solución de hidróxido de sodio ( 4.4 ) . Diluir esta solución con el tampón fosfato ( 4.5 ) para obtener la solución U8 ( véase el cuadro que sigue ) .

Preparar a partir de dicha solución y mediante diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con el tampón fosfato ( 4.5 ) las soluciones U4 ( concentración supuesta : 1,0 µg/ml ) , U2 ( concentración supuesta : 9,5 µg/ml ) y U1 ( concentración supuesta : 0,25 µg/ml ) .

Contenido supuesto en avoparcina ( mg/kg ) * 5 * 7,5 * 10 * 15 * 20 * 40 *

Peso de la muestra en g ( ± 0,1 g ) * 50 * 50 * 50 * 50 * 50 * 50 *

Volumen de la mezcla ( 4,6 ) ( ml ) * 100 * 100 * 100 * 100 * 100 * 100 *

Volumen del extracto límpido ( ml ) * 20 * 15 * 20 * 15 * 20 * 10 *

Volumen final ( ml ) : U8 * 25 * 25 * 50 * 50 * 100 * 100 *

Concentración supuesta U8 en µg/ml * 2 * env. 2 * 2 * env. 2 * 2 * 2 *

7 . MODALIDADES DE DETERMINACIÓN

7.1 . Inoculación del medio de cultivo

Sembrar a 50-60 ° C el medio de base de la determinación ( 4.1 ) con la suspensión de esporar ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares en placas con el medio ( 4.1 ) , determinar la cantidad de inóculo que permita obtener , para las distintas concentraciones en avoparcina , zonas de inhibición lo más extensas posibles y que además sean nítidas .

7.2 . Preparación de las cajas

La difusión en gelosa se efectúa en cajas con las cuatro concentraciones de la solución patrón ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones del patrón y del extracto . A tal fin , elegir la dimensión de las cajas de forma que se puedan practicar en el medio gelosado por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro , cuyos centros no disten entre sí menos de 30 mm . Se pueden utilizar como cajas placas de vidrio planas , coronadas con un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura .

Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.1 ) , sembrado como se indica en 7.1 , que permita obtener una capa de 2 mm de grosor aproximadamente ( 60 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar , practicar las cavidades y depositar en las mismas los volúmenes exactamente medidos de la solución patrón y del extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad , según el diómetro ) . Hacer por lo menos cuatro repeticiones de cada concentración , de forma que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición .

7.3 . Incubación

Incubar las cajas durante 16 a 18 horas a 30 ° C .

8 . EVALUACIÓN

Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una precisión de 0,1 mm . Para cada concentración , registrar las medidas medias en papel semilogarítmico trazando el logaritmo de las concentraciones frente a los diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las rectas más ajustadas para la solución patrón y para el extracto procedente de la misma , por ejemplo de la forma siguiente :

Determinar el punto más adecuado del nivel más bajo de la solución patrón ( SL ) mediante la fórmula :

( a ) SL = 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8/10

Determinar el punto más adecuado del nivel más alto de la solución patrón ( SH ) mediante la fórmula :

( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10

Determinar de la misma forma los puntos más adecuados del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el nivel más alto ( UH ) sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en las fórmulas anteriormente mencionadas por U1 , U2 , U4 y U8 .

Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico . Uniendo los dos puntos se obtiene la recta más ajustada para la solución patrón . Procediendo de la misma forma para UL y UH se obtiene la recta más ajustada para el extracto .

A falta de toda interferencia , las rectas deben ser paralelas . En la práctica , se consideran paralelas cuando ( SH-SL ) y ( UH-UL ) no difieren en más de 10 % de su media .

Si las rectas no fueren paralelas , pueden eliminarse o bien U1 y S1 , o bien U8 y S8 . Los valores SL , SH , UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se calculan entonces las fórmulas siguientes :

( a ) SL = ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 o ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6

( b ) SH = ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 o ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6

y fórmulas análogas para UL y UH . La utilización de esta alternativa debe ser objeto asimismo de verificación en lo que se refiere al paralelismo de las rectas , tal como se ha indicado . En el boletín de análisis deberá mencionarse la obtención de un resultado procedente de tres niveles .

Cuando las rectas se consideren paralelas , calcular el logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) mediante una de las fórmulas siguientes .

Para cuatro niveles

( c ) Log. A = ( ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) × 0,602 ) / ( U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 )

Para tres niveles

( d ) Log. A = ( ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) × 0,401 ) / ( U4 + S4 - U1 - S1 )

o

( d' ) Log. A = ( ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) × 0,401 ) / ( U8 + S8 - U2 - S2 )

Actividad real = actividad supuesta × actividad supuesta × actividad relativa .

Si la actividad relativa se encuentra fuera de la gama de valores comprendida entre 0,5 y 2,0 , repetir la determinación procediendo a los ajustes adecuados de las concentraciones de extracto o , en su caso , de las soluciones patrón . Cuando dicha actividad no pueda restablecerse en la gama de valores requeridos , el resultado se considerará aproximado y esta indicación deberá anotarse en el boletín de análisis .

Cuando las rectas no se consideren paralelas , repetir la determinación . Si no se lograse todavía el paralelismo , la determinación deberá considerarse no satisfactoria .

9 . REPETIBILIDAD

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas en la misma muestra por el mismo analista no deberá exceder de :

- 2 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos en avoparcina de 2 a 10 mg/kg ,

- un 20 % del resultado más alto para los contenidos de 10 a 25 mg/kg ,

- 5 mg , en valor absoluto , para los contenidos de 25 a 50 mg/kg ,

- un 10 % del resultado más alto para los contenidos superiores a 50 mg/kg .

2 . DETERMINACIÓN DE LA MONENSINA SÓDICA - POR DIFUSIÓN DE GELOSA

1 . OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

El método permite determinar la monensina sódica en los alimentos y las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 10 mg/kg ( 10 ppm ) (1) .

2 . PRINCIPIO

La muestra se somete a extracción con metanol al 90 % . El extracto se somete a tratamientos adecuados según el contenido en monensina sódica de la muestra . Su actividad antibiótica se determina midiendo la difusión de la monensina sódica en un medio gelosado , sembrado con Bacillus subtilis . La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición del microorganismo . El diámetro de estas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas . La sensibilidad de este proceso se reduce en presencia de iones sodio .

3 . MICROORGANISMO : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 ( NCIB 8054 )

3.1 . Mantenimiento de la cepa

Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos inclinados , con Bacillus subtilis . Incubar durante una noche a 30 ° C , conservar en un refrigerador a 4 ° C aproximadamente y renovar la siembra todos los meses .

3.2 . Preparación de la suspensión de esporas (2)

Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa ( 3.1 ) , de preparación reciente , con ayuda de 2 a 3 ml de agua esterilizada . Sembrar con esta suspensión 300 ml del medio de cultivo ( 4.1 ) en un frasco de Roux e incubar durante tres a cinco días a 30 ° C . Después de controlar la esporulación al microscopio , recoger las esporas en 15 ml de etanol ( 4.3 ) y homogeneizar . Esta suspensión puede conservarse por lo menos cinco meses a 4 ° C aproximadamente .

4 . MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS

4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa (3)

Triptona 10,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Extracto de carne 1,5 g

Glucosa 1,0 g

Gelosa ( según la calidad ) 10,0 a 20,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6,5 ( después de la esterilización )

4.2 . Medio de base de la determinación

Glucosa 10,0 g

Extracto de levadura 2,5 g

Hidrogenofosfato de potasio , K2HPO4 0,69 g

Dihidrogenofosfato de potasio , KH2PO4 0,45 g

Gelosa ( según la calidad ) 10,0 a 20,0 g

Agua 1 000 ml

pH 6,0 ( después de la esterilización ) .

4.3 . Etanol al 20 % ( v/v ) : diluir 200 ml de etanol en 800 ml de agua .

4.4 . Metanol , anhidro .

4.5 . Metanol al 90 % ( v/v ) : diluir 900 ml de metanol ( 4.4 ) en 100 ml de agua .

4.6 . Metanol al 50 % ( v/v ) : diluir 500 ml de metanol ( 4.4 ) en 500 ml de agua .

4.7 . Oxido de aluminio granulado ( Alcoa F , 20 mesh : Activated Alumina UG1 : F. Lancester and Co. , o equivalente ) .

4.8 . Sustancia patrón : monensina sódica de actividad conocida ( disponible en particular en el Internacional Laboratory for Biological Standards , Central Veterinary Laboratory , Weybridge , Surrey KT15 3NB , Gran Bretaña ) .

5 . EQUIPO

5.1 . Aparato rotatorio de evaporación al vacío , con matraz de fondo redondo de 250 ml .

5.2 . Tubo para cromatografía , de vidrio , diámetro interior : 25 mm , longitud : 400 mm , con una abertura aguzada de 2 mm de diámetro en un extremo .

5.3 . Tubo para cromatografía , de vidrio , diámetro interior : 11 mm , longitud : 300 mm aproximadamente , con una abertura aguzada de 2 mm de diámetro en un extremo .

6 . SOLUCIONES PATRÓN

Disolver una cantidad exactamente pesada de sustancia patrón ( 4.8 ) en metanol ( 4.4 ) y diluir para obtener una solución madre de monensina sódica a 800 µg . Conservada en un frasco cerrado a 4 ° C , esta solución es estable durante dos semanas .

Preparar , a partir de dicha solución y mediante diluciones sucesivas con metanol al 50 % ( 4.6 ) , las soluciones siguientes :

S8 8 µ/ml

S4 4 µ/ml

S2 2 µ/ml

S1 1 µ/ml .

7 . PREPARACIÓN DEL EXTRACTO

7.1 . Extracción

7.1.1 . Premezclas

Pesar una cantidad de muestra de 2,0 g , añadir 100 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) , homogeneizar y a continuación centrifugar durante algunos minutos . Diluir la solución sobrenadante con metanol al 50 % ( 4.6 ) para obtener una concentración supuesta en monensina sódica de 8 µ/ml ( = U8 ) .

7.1.2 . Alimentos cuyo contenido en monensina sódica no sea inferior a 50 ppm

Pesar una cantidad de muestra de 10,0 a 20,0 g , añadir 100 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) , homogeneizar durante 15 minutos y dejar reposar .

Introducir una torunda de algodón en la abertura aguzada del tubo de vidrio ( 5.2 ) , añadir óxido de aluminio ( 4.7 ) , sacudiendo ligeramente el tubo , hasta que la columna alcance 75 a 80 mm de altura .

Decantar el extracto de la columna de óxido de aluminio y recoger el filtrado . Diluir 30 ml del filtrado en 50 ml de agua . A continuación diluir con metanol al 50 % ( 4.6 ) para obtener una concentración supuesta en monensina sódica de 8 µ/ml ( = U8 ) .

7.1.3 . Alimentos cuyo contenido en monensina sódica sea inferior a 50 ppm ( hasta el límite de 10 ppm )

Pesar una cantidad de muestra de 10,0 a 20,0 g , añadir 100 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) y homogeneizar durante 15 minutos . Centrifugar para obtener un extracto límpido .

Tomar 40 ml del líquido sobrenadante para una muestra cuyo contenido en monensina sea de 20 ppm ; 80 ml para una muestra cuyo contenido sea de 10 ppm . Evaporar en seco al vacío en un aparato rotatorio ( 5.1 ) a una temperatura que no exceda de 40 ° C . Disolver el residuo en 10 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) .

Introducir una torunda de algodón en la abertura aguzada de un tubo de vidrio ( 5.3 ) , añadir óxido de aluminio ( 4.7 ) , sacudiendo ligeramente el tubo , hasta que la columna alcance 75 a 80 mm de altura .

Decantar la solución metanólica del residuo de la columna de óxido de aluminio y recoger el filtrado . Lavar la columna con 10 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) y añadir el agua del aclarado al filtrado .

Evaporar la solución en seco al vacío en el aparato rotatorio ( 5.1 ) a una temperatura inferior a 40 ° C . Disolver el residuo en 10 ml de metanol anhidro ( 4.4 ) y completar hasta 20 ml con agua . Centrifugar a 4 000 rpm por lo menos durante 5 minutos . A continuación diluir con metanol al 50 % ( 4.6 ) para obtener una concentración supuesta en monensina sódica de 8 µ/ml ( = U8 ) .

7.2 . Soluciones del extracto

Preparar , a partir de la solución U8 y mediante diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con metanol al 50 % ( 4.6 ) , las soluciones U4 ( concentración supuesta : 4 µ/ml ) , U2 ( concentración supuesta : 2 µ/ml ) y U1 ( concentración supuesta : 1 µ/ml ) .

8 . MODALIDADES DE DETERMINACIÓN

8.1 . Inoculación del medio de cultivo

Sembrar a 50-60 ° C el medio de base de la determinación ( 4.2 ) con la suspensión de esporas ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares en placas con el medio ( 4.2 ) , determinar la cantidad de inóculo que permita obtener , para las distintas concentraciones en monensina sódica , zonas de inhibición lo más extensas posible y que además sean nítidas .

8.2 . Preparación de las cajas

La difusión se efectúa en cajas con las cuatro concentraciones de la solución patrón ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones del patrón y del extracto . A tal fin , elegir la dimensión de las cajas de tal forma que se puedan practicar en el medio gelosado por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro , cuyos centros no disten entre sí menos de 30 mm . Se pueden utilizar como cajas placas de vidrio planas , coronadas con un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura .

Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.2 ) , sembrado como se indica en 8.1 , que permita obtener una capa de 2 mm de grosor aproximadamente ( 60 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar solidificar , practicar las cavidades y depositar en las mismas los volúmenes exactamente medidos de la solución patrón y del extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad , según el diámetro ) . Hacer por lo menos cuatro repeticiones de cada concentración , de forma que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición .

8.3 . Incubación

Incubar las cajas durante 18 horas aproximadamente a 35-37 ° C .

9 . EVALUACIÓN

Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una precisión de 0,1 mm . Para cada concentración , registrar las medidas medias en papel semilogarítmico trazando el logaritmo de las concentraciones frente a los diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las rectas más ajustadas para la solución patrón y para el extracto procedente de la misma , por ejemplo , de la forma siguiente .

Determinar el punto más adecuado del nivel más bajo de la solución patrón ( SL ) mediante la fórmula :

( a ) SL = ( 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8 ) /10

Determinar el punto más adecuado del nivel más alto de la solución patrón ( SH ) mediante la fórmula :

( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10

Determinar de la misma forma los puntos más adecuados del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el nivel más alto ( UH ) , sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en las fórmulas anteriormente mencionadas por U1 , U2 , U4 y U8 .

Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico . Uniendo los dos puntos se obtiene la recta más ajustada para la solución patrón . Procediendo de la misma forma para UL y UH se obtiene la recta más ajustada para el extracto .

A falta de toda interferencia , las rectas deben ser paralelas . En la práctica , se consideran paralelas cuando ( SH - SL ) y ( UH - UL ) no difieren en más del 10 % de su media .

Si las rectas no fueren paralelas , puede eliminarse o bien U1 y S1 , o bien U8 y S8 . Los valores SL , SH , UL y UH que permitan obtener las rectas más ajustadas se calculan entonces mediante las fórmulas siguientes :

( a ) SL = ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 o ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6

( b ) SH = ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 o ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6

y fórmulas análogas para UL y UH . La utilización de esta alternativa debe ser objeto asimismo de una verificación en lo que se refiere al paralelismo de las rectas , tal como se ha indicado . En el boletín de análisis debe mencionarse la obtención de un resultado procedente de tres niveles .

Cuando las rectas se consideren paralelas , calcular el logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) con una de las fórmulas siguientes .

Para cuatro niveles

( c ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) × 0,602 ) / ( U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 )

Para tres niveles

( d ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) × 0,401 ) / ( U4 + S4 - U1 - S1 ) , o

( d ) log. A = ( ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) × 0,401 ) / ( U8 + S8 - U2 - S2 )

Actividad real = actividad supuesta × actividad relativa .

Si la actividad relativa se encuentra fuera de la gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0 , repetir la determinación precediendo a los ajustes adecuados de las concentraciones de extracto o , en su caso , de las soluciones patrón . Cuando dicha actividad no pueda restablecerse en la gama de valores requeridos , el resultado se considerará aproximado y esta indicación deberá anotarse en el boletín de análisis .

Cuando las rectas no se consideren paralelas , repetir la determinación . Si no se lograse todavía el paralelismo , la determinación deberá considerarse no satisfactoria .

10 . REPETIBILIDAD

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas en la misma muestra por el mismo analista no deberá exceder de :

- un 20 % del resultado más alto para los contenidos en monensina sódica de 10 a 25 mg/kg ,

- 5 mg/kg en valor absoluto , para los contenidos de 25 a 50 mg/kg ,

- un 10 % del resultado más alto para los contenidos superiores a 50 mg/kg .

(1) Pueden utilizarse otros métodos en la medida en que esté probado que producen suspensiones de esporas análogas .

(2) Puede utilizarse cualquier medio comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados .

(3) 1 mg de monensina sódica equivale a 1 000 unidades « UK » .

(4) Pueden utilizarse otros métodos en la medida en que esté probado que producen suspensiones de esporas análogas .

(5) Puede utilizarse cualquier medio comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados .