QUINTA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN

de 25 de marzo de 1974

por la que se determinan los métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales

( 74/203/CEE )

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 , relativa a la introducción de métodos de toma de muestras de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales (1) , modificada en último lugar por el Acta (2) adjunta al Tratado relativo a la adhesión de nuevos Estados miembros a la Comunidad Económica Europea y a la Comunidad Europea de la Energía Atómica (3) firmada en Bruselas el 22 de enero de 1972 , y , en particular , su artículo 2 ,

Considerando que la Directiva antes citada prevé los controles oficiales de los alimentos para animales dirigidos a comprobar si se respetan las condiciones establecidas en virtud de las disposiciones legales , reglamentarias o administrativas sobre la calidad y composición de dichos alimentos se efectuarán según los métodos de toma de muestras y de análisis comunitarios ;

Considerando que las Directivas 71/250/CEE , 71/393/CEE , 72/199/CEE y 73/46/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 (4) , 18 de noviembre de 1971 (5) , 27 de abril de 1972 (6) y 5 de diciembre de 1972 (7) respectivamente , ya han establecido métodos de análisis comunitarios ; que , habida cuenta del grado de avance de los trabajos efectuados desde entonces es conveniente establecer una quinta seria de métodos ;

Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente de la alimentación animal ,

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

Los Estados miembros dispondrán los análisis para los controles oficiales de los alimentos para animales , en lo que se refiere al contenido en almidón y en productos de degradación de alto peso molecular de almidón de los alimentos que contengan peladuras , pulpas , hojas o cuellos secos de remolachas , pulpas de patatas , levaduras deshidratadas , productos ricos en inulina o chicharrones se efectúen según el meétodo descrito en el Anexo I de la presente Directiva .

Serán aplicables al método descrito en el Anexo I de la presente Directiva las disposiciones generales que figuren en la Parte I ( Introducción ) del Anexo de la primera Directiva 71/250/CEE de la Comisión de 15 de junio de 1971 .

Artículo 2

Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles oficiales de los alimentos para animales , en lo que se refiere a sus contenidos en amprolio , etopabato , dinitolmida ( DOT ) , nicarbacina y menadiona ( vitamina K3 ) , se efectúen según los métodos descritos en el Anexo II de la presente Directiva .

Serán aplicables a los métodos descritos en el Anexo II de la presente Directiva las disposiciones generales que figuran en la Parte I ( Introducción ) del Anexo de la Directiva 71/250/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 , con excepción de la parte relativa a la preparación de la muestra para análisis .

Artículo 3

Los Estados miembros aplicarán , a más tardar el 1 de noviembre de 1974 , las disposiciones legales , reglamentarias o administrativas necesarias para cumplir las disposiciones de la presente Directiva . Informarán de ello inmediatamente a la Comisión .

Artículo 4

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros .

Hecho en Bruselas , el 25 de marzo de 1974 .

Por la Comisión

El Presidente

François-Xavier ORTOLI

(1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .

(2) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 14 .

(3) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 5 .

(4) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .

(5) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .

(6) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .

(7) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .

ANEXO I

DETERMINACIÓN DEL ALMIDÓN

- Método de la pancreatina -

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar el contenido en almidón y en productos de degradación de alto peso molecular en almidón de los alimentos que contienen peladuras , pulpas , hojas o cuellos desecados de remolacha , pulpas de patata , levaduras deshidratadas , productos ricos en inulina ( por ejemplo , peladura y harina de patata ) o chicharrones . La determinación sólo se habrá de efectuar cuando el examen microscópico muestre la presencia de cantidades no despreciables de almidón en la muestra .

2 . Principio

Los azúcares presentes en la mezcla se eliminan mediante extracción por etanol . El almidón del residuo de extracción se sacarifica mediante la pancreatina . Los azúcares se hidrolizan mediante el ácido clorhídrico y la glucosa se forma y se determina mediante el método de Luff-Schoorl . La cantidad de glucosa obtenida de esta forma multiplicado por un factor constante , da el contenido en almidón de la muestra .

3 . Reactivos

3.1 . Etanol al 90 % ( v/v ) , neutro a la fenolftaleina .

3.2 . Alcohol n-amílico p.a.

3.3 . Tolueno p.a.

3.4 . Solución tampón : Disolver en el agua 9,078 g de fosfato monopotásico KH2 PO4 y 11,876 g de fosfato disódico Na2 HPO4 · 2H2O . Completar a 1 l mediante agua .

3.5 . Solución de cloruro de sodio 0,2 N .

3.6 . Solución de Carrez I : Disolver en el agua 21,9 g de acetato de zinc Zn (CH3COO)2 · 2H2O y 3 g de ácido acético glacial . Completar a 100 ml mediante agua .

3.7 . Solución de Carrez II : Disolver en el agua 10,6 g de ferrocianura de potasio

K4 [ Fe(CN6) ] · 3H2O . Completar a 100 ml mediante agua .

3.8 . Ácido clorhídrico N .

3.9 . Ácido clorhídrico p.a. , 8 N aproximadamente , d : 1,125 .

3.10 . Solución de hidróxido de sodio p.a. , 10 N aproximadamente , d : 1,33 .

3.11 . Indicador : solución al 0,1 % ( p/v ) de metilorangina .

3.12 . Pancreatina , pulverulento , que responda a las disposiciones dadas en el punto B : conservar en frascos tapados , a resguardo de la luz y de la humedad .

3.13 . Reactivo según Luff-Schoorl : verter , agitando con prudencia , la solución de ácido cítrico ( 3.1.3.2 ) en la solución de carbonato de sodio ( 3.1.3.3 ) . Añadir a continuación sulfato de cobre ( 3.1.3.1 ) y completar a 1 l mediante agua . Dejar reposar una noche y filtrar . Controlar la normalidad del reactivo así obtenido ( Cu 0,1 N ; Na2 CO3 2 N ) . El pH de la solución debe ser de 9,4 aproximadamente .

3.1.3.1 . Solución de sulfato de cobre : disolver 25 g de sulfato de cobre p.a. Cu SO4 · 5H2O en 100 ml de agua .

3.1.3.2 . Solución de ácido cítrico : disolver 50 g de ácido cítrico p.a. C6H8O7 · H2O en 50 ml de agua .

3.1.3.3 . Solución de carbonato de sodio : disolver 143,8 g de carbonato de sodio anhidro p.a. en 300 ml aproximadamente de agua caliente . Dejar refrigerar .

3.14 . Granulados de piedra pómez hervidas en el ácido clorhídrico , lavados en el agua y secados .

3.15 . Solución al 30 % ( p/v ) de yoduro de potasio p.a.

3.16 . Ácido sulfurico , 6 N aproximadamente , d : 1,18 .

3.17 . Solución de tiosulfato de sodio 0,1 N .

3.18 . Solución de almidón : añadir una mezcla de 5 g de almidón soluble en 30 ml de agua a 1 l de agua hirviendo . Hacer hervir durante 3 minutos , después dejar reposar . Preparar justo antes de su empleo .

4 . Equipo

4.1 . Extractor ( ver esquema de la página 12 ) , que incluirá :

4.1.1 . Un erlenmeyer de 500 ml , de cuello largo ,

4.1.2 . Un refrigerante de reflujo ajustado al erlenmeyer por medio de un tapón ,

4.1.3 . Una varilla corrediza en el tubo central del refrigerante , provista de un gancho en su extremidad inferior , una pinza para fijar la varilla ,

4.1.4 . Una cesta metálica destinada a ser suspendida al gancho de la varilla ( 4.1.3 ) y a llevar el crisol filtrante ( 4.1.5 ) ,

4.1.5 . Un crisol filtrante para filtración rápida , dimensión máxima de los poros : 90 a 150 mm ( por ejemplo G1 ) , 30 ml aproximadamente ,

4.1.6 . Papeles-filtro , de formato apropiado al crisol filtrante ( 4.1.5 ) .

4.2 . Estufa de incubación , regulada a 38 ° C .

4.3 . Matraces aforados de 200 ml , de esmerilado normalizado , con refrigerante de reflujo .

4.4 . Matraces aforados de 100 ml , de esmerilado normalizado , con refrigerante de reflujo .

5 . Método operatorio

5.1 . Preparación de la muestra

Triturar la muestra de forma que pase en su totalidad a través de un tamiz de mallas de 0,5 mm .

5.2 . Extracción

Pesar , con precisión de 1 mg , 2 g de la muestra e introducirlos en un crisol filtrante ( 4.1.5 ) cuyo fondo se ha recubierto previamente con un papel de filtro ( 4.1.6 ) mojado por el etanol ( 3.1 ) . Introducir en el erlenmeyer ( 4.1.1 ) 55 ml de etanol ( 3.1 ) y algunos granulados de piedra pómez ( 3.14 ) . Colocar el crisol filtrante en la cesta metálica ( 4.1.4 ) y colgar a éste del gancho de la varilla ( 4.1.3 ) . Colocar el refrigerante sobre el erlenmeyer y bajar la varilla de forma que el fondo del crisol sobresalga en la superficie del etanol . Fijar la varilla a esta altura con ayuda de la pinza . Llevar el etanol a ebullición y mantenerla durante 3 horas . Dejar refrigerar a continuación y levantar la varilla ( 4.1.3 ) de forma que se coloque el crisol lo más alto que sea posible dentro del erlenmeyer . Destapar prudentemente el erlenmeyer y dejar deslizar 45 ml de agua a lo largo de las paredes del frasco . Colocar de nuevo el refrigerante sobre el erlenmeyer y mantener el crisol filtrante a 10 cm por encima del nivel del líquido . Llevar el líquido a ebullición y mantenerla durante 3 horas . Dejar refrigerar , destapar el erlenmeyer y retirar el crisol de la cesta .

5.3 . Sacarificación e hidrólisis

Colocar el crisol sobre un matraz de vacío y secar por aspiración . Llevar el residuo de extracción a un mortero y triturar finamente . Transvasar cuantitativamente el polvo con ayuda de 60 ml de agua aproximadamente en un matraz aforado de 200 ml de esmerilado normalizado y añadir algunas gotas de alcohol amílico ( 3.2 ) . Ajustar al balón un refrigerante de reflujo . Calentar a ebullición y mantener durante 1 hora . Dejar después refrigerar y separar el refrigerante .

Añadir 25 ml de solución tampón ( 3.4 ) , 250 mg de pancreatina ( 3.12 ) , 2,5 ml de solución de cloruro de sodio ( 3.5 ) y 10 gotas de tolueno ( 3.3 ) . Agitar durante 2 minutos , colocar el matraz en una estufa de incubación ( 4.2 ) y mantenerlo allí durante 21 h , agitando de vez en cuando . Dejar refrigerar a continuación hasta la temperatura ambiente .

Añadir 5 ml de solución de Carrez I ( 3.6 ) y agitar durante un minuto . Añadir a continuación 5 ml de solución de Carrez II ( 3.7 ) y agitar de nuevo durante un minuto . Completar al volumen mediante agua , homogeneizar y filtrar . Tomar con la pipeta 50 ml de filtrado y llevarlos al matraz aforado de 100 ml ( se puede trabajar también sobre 100 ml de filtrado en un matraz aforado de 200 ml ) . Añadir algunas gotas de indicador ( 3.11 ) y acidificar mediante el ácido clorhídrico 8 N ( 3.9 ) hasta el viraje al rojo . Añadir a continuación un exceso de 6,25 ml de ácido clorhídrico 8 N ( 3.9 ) ( 12,50 ml si se trabaja sobre 100 ml de filtrado ) . Añadir al matraz a ebullición y mantenerla durante 1 h . Dejar refrigerar , neutralizar por la solución de hidróxido de sodio 10 N ( 3.10 ) hasta viraje al amarillo del indicador . Acidificar a continuación ligeramente añadiendo un poco de ácido clorhídrico N ( 3.8 ) , completar el volumen mediante agua y homogeneizar . Determinar el contenido en glucosa según el método de Luff-Schoorl como se indica en 5.4 .

5.4 . Titulación según Luff-Schoorl

Tomar con la pipeta 25 ml del reactivo según Luff-Schoorl ( 3.13 ) y llevarlos a un erlenmeyer de 300 ml ; añadir 25 ml , medidos con exactitud , de la solución obtenida en 5.3 que contiene como máximo 60 mg de glucosa . Añadir dos granulados de piedra pómez ( 3.14 ) , calentar , agitando manualmente , sobre una llama libre de altura media y llevar el líquido a ebullición en 2 minutos aproximadamente . Colocar inmediatamente el erlenmeyer sobre una tela metálica provista de una pantalla de amianto con un agujero de 6 cm aproximadamente de diámetro , bajo la que se ha encendido previamente una llama . Ésta se regula de forma que sólo se calienta el fondo del erlenmeyer . Adaptar a continuación un refrigerante de reflujo sobre el erlenmeyer . A partir de este momento hacer hervir durante 10 minutos exactamente . Refrigerar inmediatamente en el agua fría y después de 5 minutos aproximadamente , titular como sigue .

Añadir 10 ml de solución de yoduro de potasio ( 3.15 ) y , inmediatamente después y con prudencia ( en razón del riesgo de formación de espuma abundante ) , 25 ml de ácido sulfúrico 6 N ( 3.16 ) . Titular a continuación por la solución de tiosulfato de sodio 0,1 N ( 3.17 ) hasta la aparición de una coloración amarilla clara , añadir el indicador del almidón ( 3.18 ) y acabar la titulación .

Efectuar la misma titulación sobre una mezcla medida con exactitud de 25 ml de reactivo según Luff-Schoorl ( 3.13 ) y 25 ml de agua , después de haber añadido 10 ml de solución de yoduro de potasio ( 3.15 ) y 25 ml de ácido sulfúrico 6 N ( 3.16 ) , sin llevar a ebullición .

5.5 . Prueba en blanco

Efectuar una prueba en blanco aplicando el método operatorio descrito en 5.3 y 5.4 , a falta de muestra .

6 . Cálculo de los resultados

Establecer con ayuda de la tabla adjunta la cantidad de glucosa en mg correspondiente a la diferencia entre los resultados de dos titulaciones ( expresados en ml de tiosulfato de sodio 0,1 N ) y que se refieren por un lado , al análisis de la muestra y , por otro lado , al ensayo en blanco .

El contenido en almidón en porcentaje de la muestra está dado por la fórmula :

0,72 ( a - b )

en la que

a = mg de glucosa referidos a la muestra ,

b = mg de glucosa referidos a la prueba en blanco ( ver observación 7.2 ) .

7 . Observaciones

7.1 . La presencia simultánea en la muestra de almidón parcial o totalmente dextrinizado y de lactosa puede dar lugar a un resultado por exceso del 0,5 al 3 % de almidón . En dicho caso , el contenido real en almidón se obtiene como sigue :

a ) determinar el contenido en azúcares reductores del extracto etanólico obtenido en 5.2 y expresar el resultado en porcentaje de glucosa ;

b ) determinar el contenido de la muestra en azúcares reductores solubles en el agua , y expresar el resultado en porcentaje de glucosa ;

c ) deducir el resultado obtenido en c ) del obtenido en b ) y multiplicar la diferencia por 0,9 ;

d ) deducir el valor obtenido en c ) del contenido en almidón obtenido por aplicación del método y calculado como se indica en 6 .

7.2 . La cantidad de glucosa que se refiere a la prueba en blanco es normalmente de 0,25 mg . No puede ser superior a 0,50 mg .

8 . Disposiciones referidas a la pancreatina

Aspecto físico : polvo blanco-amarillento , amorfo .

Contenido en glucosa : la cantidad de glucosa de la prueba en blanco ( ver 5.5 ) es normalmente de 0,25 mg . Un resultado superior a 0,50 mg indica que la pancreatina ya no es utilizable .

Control del consumo de yodo : poner en suspensión 62,5 mg de pancreatina en 50 ml de agua aproximadamente llevados a 25-30 ° C . Añadir 1 ml de solución de yodo 0,1 N . Remover durante 2 minutos . Titular por una solución de tiosulfato de sodio 0,1 N en presencia de indicador de almidón . El consumo de solución de yodo por la pancreatina no debe exceder de 0,5 ml .

Control de la actividad amilolítica : mezclar 100 ml de solución de almidón ( 3.18 ) , 5 ml de solución tampón ( 3.4 ) , 0,5 ml de solución del cloruro de sodio ( 3.5 ) y 62,5 mg de pancreatina . Llevar la mezcla a 25-30 ° C , remover durante 2 minutos . Añadir 1 ml de solución de yodo 0,1 N . La coloración azul debe haber desaparecido en los 15 minutos que siguen a la adición de la solución de yodo .

Tabla de valores para 25 ml de reactivo según Luff-Schoorl

ml de Na2S2O3 0,1 N , 2 minutos de calentamiento , 10 minutos de ebullición

Na2S2O3 0,1 N * Glucosa , fructosa , azúcares invertidos C6H12O6 * Lactosa C12H22O11 * Maltosa C12H22O11 * Na2S2O3 0,1 N *

ml * mg * diferencia * mg * diferencia * mg * diferencia * ml *

1 * 2,4 * * 3,6 * * 3,9 * * 1 *

* * 2,4 * * 3,7 * * 3,9 * *

2 * 4,8 * * 7,3 * * 7,8 * * 2 *

* * 2,4 * * 3,7 * * 3,9 * *

3 * 7,2 * * 11,0 * * 11,7 * * 3 *

* * 2,5 * * 3,7 * * 3,9 * *

4 * 9,7 * * 14,7 * * 15,6 * * 4 *

* * 2,5 * * 3,7 * * 4,0 * *

5 * 12,2 * * 18,4 * * 19,6 * * 5 *

* * 2,5 * * 3,7 * * 3,9 * *

6 * 14,7 * * 22,1 * * 23,5 * * 6 *

* * 2,5 * * 3,7 * * 4,0 * *

7 * 17,2 * * 25,8 * * 27,5 * * 7 *

* * 2,6 * * 3,7 * * 4,0 * *

8 * 19,8 * * 29,5 * * 31,5 * * 8 *

* * 2,6 * * 3,7 * * 4,0 * *

9 * 22,4 * * 33,2 * * 35,5 * * 9 *

* * 2,6 * * 3,8 * * 4,0 * *

10 * 25,0 * * 37,0 * * 39,5 * * 10 *

* * 2,6 * * 3,8 * * 4,0 * *

11 * 27,6 * * 40,8 * * 43,5 * * 11 *

* * 2,7 * * 3,8 * * 4,0 * *

12 * 30,3 * * 44,6 * * 47,5 * * 12 *

* * 2,7 * * 3,8 * * 4,1 * *

13 * 33,0 * * 48,4 * * 51,6 * * 13 *

* 2,7 * * 3,8 * * 4,1 * *

14 * 35,7 * * 52,2 * * 55,7 * * 14 *

* * 2,8 * * 3,8 * * 4,1 * *

15 * 38,5 * * 56,0 * * 59,8 * * 15 *

* * 2,8 * * 3,9 * * 4,1 * *

16 * 41,3 * * 59,9 * * 63,9 * * 16 *

* * 2,9 * * 3,9 * * 4,1 * *

17 * 44,2 * * 63,8 * * 68,0 * * 17 *

* * 2,9 * * 3,9 * * 4,2 * *

18 * 47,1 * * 67,7 * * 72,2 * * 18 *

* * 2,9 * * 4,0 * * 4,3 * *

19 * 50,0 * * 71,7 * * 76,5 * * 19 *

* * 3,0 * * 4,0 * * 4,4 * *

20 * 53,0 * * 75,7 * * 80,9 * * 20 *

* * 3,0 * * 4,1 * * 4,5 * *

21 * 56,0 * * 79,8 * * 85,4 * * 21 *

* * 3,1 * * 4,1 * * 4,6 * *

22 * 59,1 * * 83,9 * * 90,0 * * 22 *

* * 3,1 * * 4,1 * * 4,6 * *

23 * 62,2 * * 88,0 * * 94,6 * * 23 *

Figura : ver D.O.

ANEXO II

1 . DETERMINACIÓN DEL AMPROLIO

[ Clorhidrato de cloruro 1-(4-amino-2-propil-5-pirimidilmetil)-2-picolinio ]

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar el amprolio en los alimentos , los concentrados y en las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 40 ppm .

2 . Principio

La muestra se somete a la extracción mediante metanol diluido . El extracto se purifica sobre columna de óxido de aluminio y se trata mediante una solución metanólica de 2,7-dihidroxinaftaleno , ferricianuro de potasio , cianuro de potasio e hidróxido de sodio . Se desarrolla una coloración púrpura . El amprolio determina por expectrofotometría a 530 nm .

3 . Reactivos

3.1 . Metano p.a .

3.2 . Metanol diluido : mezclar 2 volúmenes de metanol ( 3.1 ) y 1 volumen de agua .

3.3 . Solución al 0,2 % ( p/v ) de ferricianuro de potasio K3Fe-(CN)6 p.a . Dicha solución se mantiene estable durante dos semanas .

3.4 . Solución al 1 % ( p/v ) de cianuro de potasio p.a . Dicha solución se mantiene estable durante dos semanas .

3.5 . Solución al 1,125 % ( p/v ) de hidróxido de sodio p.a .

3.6 . Solución metanólica de hidróxido de sodio : tomar 15 ml de la solución ( 3.5 ) y completar a 200 ml mediante metanol ( 3.1 ) .

3.7 . Solución al 0,0025 % ( p/v ) de 2,7-dihidroxinaftaleno : disolver 25 mg de 2,7-dihidroxinaftaleno p.a. en el metanol ( 3.1 ) y completar a 1 000 ml mediante metano ( 3.1 ) .

3.8 . Reactivo de coloración : introducir 90 ml de solución de 2,7-dihidroxinaftaleno ( 3.7 ) en un pequeño matraz cónico de 250 ml ( 4.1 ) , añadir 5 ml de solución de ferricianuro de potasio ( 3.3 ) y homogeneizar . Añadir a continuación 5 ml de solución de cianuro de potasio ( 3.4 ) , tapar el matraz y homogeneizar . Dejar réposar durante 30 a 35 minutos , añadir 100 ml de solución metanólica de hidróxido de sodio ( 3.6 ) , homogeneizar y filtrar sobre un crisol filtrante ( 4.3 ) . Utilizar dicho reactivo en los 75 minutos que siguen a la filtración .

3.9 . Óxido de aluminio para cromatografía sobre columna . Antes de la utilización , agitar durante 30 minutos 100 g de óxido de aluminio con 500 ml de agua , filtrar , lavar tres veces el sedimento sobre el filtro con 50 ml de metanol ( 3.1 ) cada vez , secar por aspiración , dejar reposar una noche y secar durante 2 h a 100 ° C en una estufa de vacío . Dejar refrigerar en desecador . Controlar la actividad sometiendo el análisis , a partir del punto 5.2 , una cantidad determinada de solución de patrón ( 3.11 ) . El índice de recuperación del amprolio debe ser del 100 % mas o menos 4 % .

3.10 . Substancia de calibrado : aprolio puro que responda a las características definidas a continuación .

Punto de fusión ( descomposición ) : 248 ° C .

Coeficiente de extinción molecular a 265 y a 235 nm en el agua destilada : 11,0 por 10 3 .

3.11 . Solución patrón : pesar , con precisión de 0,1 mg , 50 mg de substancia patrón ( 3.10 ) . Disolver por el metanol diluido ( 3.2 ) en un matraz aforado de 500 ml , completar al volumen por el mismo disolvente y homogeneizar . Tomar 100 ml , completar 50 ml mediante metanol diluido ( 3.2 ) en un matraz aforado y homogeneizar , 1 ml de dicha solución contiene 20 mg de amprolio .

4 . Equipo

4.1 . Pequeños matraces cónicos de 50 , 250 y 500 ml , de tapón esmerilado .

4.2 . Agitador .

4.3 . Crisol filtrante , porosidad G 3 , diámetro : 60 mm .

4.4 . Tubo para cromatografía , de cristal ( díametro interior : 9 mm longitud : 400 a 500 mm ) .

4.5 . Centrifugadora , con tubos de 25 ml de tapón esmerilado .

4.6 . Espectrofotometría , con cubetas de 10 mm de espesor .

5 . Método operatorio

5.1 . Extracción y purificación

5.1.1 . Alimentos y premezclas

Pesar , con precisión de 1 mg , 10 g de la muestra finamente dividida y homogeneizada . Para las premezclas , pesar de 3 a 6 g , con precisión de 1 g . Introducir la toma de muestra en un erlenmeyer de 250 ml ( 4.1 ) y añadir 100 ml exactamente de metanol diluido ( 3.2 ) . Agitar durante 60 minutos y filtrar . Diluir , si fuera necesario mediante el metanol diluido ( 3.2 ) para obtener una solución que contenga de 5 a 15 mg de amprolio por ml . Introducir en un tubo para cromatografía ( 4.4 ) , previamente provisto en su extremidad inferior de un tapón de algodón , 5 g de óxido de aluminio ( 3.9 ) y a continuación 25,0 ml del extracto . Dejar correr el líquido , eliminar los 5 primeros ml y recoger los 12 ml siguientes en una probeta graduada .

5.1.2 . Concentrados

Pesar , con precisión de 1 mg , 0,5 g de la muestra finamente dividida y homogeneizada , introducirlos en un pequeño matraz cónico de 500 ml ( 4.1 ) , añadir 250 ml de metanol diluido ( 3.2 ) , agitar durante 60 minutos y filtrar . Tomar 5,0 ml del filtrado y completar a 200 ml mediante el metanol diluido ( 3.2 ) en un matraz aforado .

5.2 . Desarrollo de la coloración y medición de la densidad óptica

Tomar 5,0 ml de la solución obtenida en 5.1.1 o 5.1.2 e introducirlos en un tubo de centrifugación A ( 4.5 ) . Introducir 5,0 ml de metanol diluido ( 3.2 ) en un tubo de centrifugación B ( 4.5 ) . Añadir en cada tubo 10,0 ml del reactivo de coloración ( 3.8 ) , tapar los tubos , homogeneizar y dejar reposar durante 18 minutos . Centrifugar a continuación durante 3 minutos para obtener soluciones límpidas y decanter las soluciones A y B en los pequeños matraces cónicos de 50 ml ( 4.1 ) .

Medir inmediatamente mediante el espectrofotómetro a 530 nm la densidad óptica de la solución A , utilizando como blanco la solución B . Determinar la cantidad de amprolio refiríendose a la curva de muestrar ( 5.3 ) .

5.3 . Curva de muestras

Introducir en los tubos de centrifugación ( 4.5 ) volúmenes respectivos de 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 y 5,0 ml de solución patrón ( 3.11 ) . Completar el volumen de los cuatro primeros tubos hasta 5,0 ml con metanol diluido ( 3.2 ) . Añadir en los anco tubos 10,0 ml de reactivo de coloración ( 3.8 ) , tapar los tubos , homogeneizar y dejar reposar durante 18 minutos . Centrifugar a continuación durante 3 minutos y decantar las soluciones en matraces cónicos de 50 ml ( 4.1 ) .

Medir inmediatamente mediante el espectrofotómetro a 530 nm la densidad óptica de las soluciones , utilizando como blanco una mezcla de 5 ml de metanol diluido ( 3.2 ) y 10 ml del reactivo de coloración ( 3.8 ) . Trazar la curva de muestras llevando a la ordenada los valores de la densidad óptica y a la abscisa las cantidades correspondientes de amprolio en mg .

6 . Cálculo y premezclas

6.1 . Alimentos y premezclas

El contenido en mg de amprolio por kg de muestra está dado por la fórmula

A/P · F · 20 000

en la que :

A = cantidad en mg de amprolio determinada mediante la medición fotométrica ,

P = peso en g de la toma de muestras ,

F = coeficiente de dilución ( efectuado si se diera el caso en 5.1.1 ) .

6.2 . Concentrados

El contenido en amprolio en porcentaje de muestra está dado por la fórmula

A/P · 200

en la que :

A = cantidad en mg de amprolio determinada por la medición fotométrica ,

P = peso en g de la toma de muestras .

7 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder de 10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos en amprolio inferiores a 100 ppm ; del 10 % , en valor relativo , para los contenidos comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ; de 500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ; del 5 % , en valor relativo , para los contenidos superiores a 10 000 ppm .

2 . DETERMINACIÓN DEL ETOPABATO

( metil-4-acetamida-2-etoxibenzoato )

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar el etopabato en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 2 ppm .

2 . Principio

La muestra está sometida a la extracción por metanol diluido . La solución se acidificará y se extraerá por el cloroformo . El extracto clorofórmico se lava primero con una solución alcalina y después con agua . El extracto purificado se concentra , el etopabato se hidroliza mediante el ácido clorhídrico diluido . El derivado aminado así formado se diazotea y se acopla con la N-(1-nafti) etilenodiamina . El complejo coloreado se extrae mediante el butanol y la densidad óptica de la solución se mide a 555 nm .

3 . Reactivos

3.1 . Metanol p.a .

3.2 . Metanol al 50 % ( v/v ) : mezclar los volúmenes iguales de metanol ( 3.1 ) y de agua .

3.3 . Ácido clorhídrico p.a. , d : 1,19 .

3.4 . Ácido clorhídrico diluido a 1/10 : tomar 10,0 ml de ácido clorhídrico ( 3.3 ) , completar a 100 ml con agua .

3.5 . Ácido clorhídrico 0,3 N aproximadamente : tomar 25,0 ml de ácido clorhídrico ( 3.3 ) , completar a 1 000 ml con agua .

3.6 . Cloroformo p.a .

3.7 . Solución al 4 % ( p/v ) de carbonato de sodio : disolver 40,0 g de carbonato de sodio anhídro p.a. en el agua y completar a 1 000 ml con agua .

3.8 . Solución al 0,2 % ( p/v ) de nitrito de sodio : disolver en el agua 100 mg de nitrito de sodio p.a. y completar a 50 ml con agua en un matraz aforado . Preparar inmediatamente antes del empleo .

3.9 . Solución al 1,0 % ( p/v ) de sulfanato de amonio : disolver en el agua 500 mg de sulfanato de amonio p.a. y completar a 50 ml con agua en un matraz aforado . Preparar inmediatamente antes de su empleo .

3.10 . Solución al 0,2 % ( p/v ) de N-(1-nafti) etilenodiamina : disolver en el agua 100 mg de N-(1-nafti) etilenodiamina p.a. y completar a 50 ml mediante agua en un matraz aforado . Preparar inmediatamente antes del empleo .

3.11 . Cloruro de sodio anhidro , p.a .

3.12 . Butanol-n , p.a .

3.13 . Substancia patrón : etopabato puro .

3.14 . Soluciones de calibrado :

3.14.1 . Solución a 0,040 mg de etopabato por ml : pesar , con precisión de 0,1 mg , 40 g de substancia patrón ( 3.13 ) . Disolver mediante metanol diluido ( 3.2 ) en un matraz aforado de 100 ml , completar al volumen mediante el mismo disolvente y homogeneizar . Tomar 10,0 ml , completar a 100 ml mediante el metanol ( 3.2 ) en un matraz aforado y homogeneizar . Dicha solución se mantiene estable durante un mes .

3.14.2 . Solución a 0,016 mg de etopabato por 20 ml : tomar 5,0 ml de la solución ( 3.14.1 ) , completar a 250 ml por el metanol diluido ( 3.2 ) en un matraz aforado y homogeneizar . Preparar antes de su empleo .

4 . Equipo

4.1 . Matraces cónicos de 250 ml , de tapón esmerilado .

4.2 . Ampollas de decantar de 100 ml , de tapón esmerilado .

4.3 . Agitador .

4.4 . Aparato rotativo de evaporación en vacío , con matraces de 250 ml .

4.5 . Baño de agua .

4.6 . Centrifugadora , con tubos de 15 y 50 ml , de esmerilado normalizado .

4.7 . Refrigerante de aire , de esmerilado normalizado .

4.8 . Espectrofotómetro , con cubetas de 10 mm de espesor .

5 . Método operatorio

5.1 . Extracción

Pesar , con precisión de 1 mg , una cantidad de muestra finamente divida y homogeneizada que contenga 80 mg aproximadamente de etopabato . Introducir la toma de muestras en un matraz cónico de 250 ml ( 4.1 ) y añadir 100,0 ml de metanol diluido ( 3.2 ) . Mezclar , tapar el matraz y agitar durante 1 hora con la ayuda de un agitador ( 4.3 ) . Dejar decantar , filtrar y eliminar los primeros ml del filtrado .

5.2 . Purificación

NB : Todas las operaciones descritas en este punto deben efectuarse rápidamente .

Introducir 20,0 ml del extracto límpido en una ampolla de decantación de 100 ml ( 4.2 ) , añadir 5,0 ml de ácido clorhídrico diluido a 1/10 ( 3.4 ) y 20,0 ml de cloroformo ( 3.6 ) . Agitar primero con prudencia y después vigorosamente durante 3 minutos . Dejar reposar hasta la separación de las fases y recoger la fase clorofórmica en una segunda ampolla de decantación de 100 ml ( 4.2 ) .

Extraer la fase ácida dos veces sucesivas mediante 20,0 ml de cloroformo ( 3.6 ) cada vez . Reunir los extractos clorofórmicos en la segunda ampolla de decantar y eliminar la fase ácida . Añadir a la solución clorofórmica 10 ml de solución de carbonato de sodio ( 3.7 ) , agitar durante 3 minutos y dejar reposar hasta la separación de las fases . Recoger la fase clorofórmica en una tercera ampolla de decantación de 100 ml ( 4.2 ) y eliminar la fase acuosa . Añadir a la solución clorofórmica 10 ml de solución de carbonato de sodio ( 3.7 ) , agitar durante 3 minutos y dejar reposar hasta la separación de las fases .

Recoger la fase clorofórmica en una cuarta ampolla de decantación de 100 ml ( 4.2 ) , lavar dos veces sucesivamente con 25 ml de agua cada vez , separar las fases acuosas y recoger cuantitativamente el extracto clorofórmico en un matraz de 250 ml ( 4.4 ) . Reunir las fases acuosas , lavar las ampollas de decantación vaciadas mediante algunos ml de cloroformo ( 3.6 ) , lavar a continuación la fase acuosa mediante dicho cloroformo . Separar la fase clorofórmica y añadirla al extracto recogido en un matraz .

5.3 . Hidrólisis

Evaporar el extracto clorofórmico hasta 2 ml aproximadamente sobre un baño de agua a 50 ° C con la ayuda del aparato rotativo de evaporación en vacio ( 4.4 ) . Disolver el residuo mediante 2 a 3 ml de metanol ( 3.1 ) transvasar cuantitativamente la solución a un tubo de centrifugación de 50 ml ( 4.6 ) con ayuda de dos porciones de 10 ml y una porción de 5 ml de ácido clorhídrico 0,3 N aproximadamente ( 3.5 ) . Añadir algunos fragmentos de piedra porosa , homogeneizar y armar al tubo de un refrigerante de aire ( 4.7 ) . Sumergir el tubo en un baño de agua hirviendo y mantenerlo durante 45 minutos . Dejar refrigerar a continuación bajo una corriente de agua fría .

5.4 . Desarrollo de la coloración y medición de la densidad óptica

Añadir 1,0 ml de solución de nitrito de sodio ( 3.8 ) , agitar y dejar reposar 2 minutos . Añadir 1,0 ml de solución de sulfanato de amonio ( 3.9 ) , agitar y dejar reposar 2 minutos . Añadir 1,0 ml de solución de N-(1-naftil) etilenodiamina ( 3.10 ) , agitar y dejar reposar 10 minutos . Añadir 5,0 g de cloruro de sodio ( 3.11 ) y 10,0 ml de butanol-n ( 3.12 ) agitar vigorosamente hasta la disolución completa del cloruro de sodio .

Prepara la solución butanólica sobrecadente con ayuda de una pipeta , introducirla en un tubo de centrifugación de 15 ml ( 4.6 ) y centrifugar . Medir a continuación la densidad óptica E A con el espectrómetro a 555 nm por comparación con el butanol-n ( 3.12 ) .

5.5 . Prueba en blanco

Efectuar una prueba en blanco aplicando el método operatorio , a partir del punto 5.2 , a 20,0 ml de metanol diluido ( 3.2 ) . Medir la densidad óptica E B a 555 nm por comparación con el butanol-n ( 3.12 ) .

5.6 . Prueba patrón

Efectuar una prueba aplicando el mismo método operatorio , a partir del punto 5.2 , a 20,0 ml de solución patrón ( 3.14.2 ) . Medir la densidad óptica E C a 555 nm por comparación con el butanol-n ( 3.12 ) .

6 . Cálculo de los resultados

El contenido en mg de etopabato por kg de la muestra está dado por la fórmula

( E A - E B ) / ( E C - E B ) · 80/P

en la que

E A = densidad óptica de la solución procedente de la muestra ,

E B = densidad óptica de la solución resultante de la prueba en blanco ,

E C = densidad óptica de la solución resultante de la prueba patrón ,

P = peso en gramos de la toma de muestras .

5 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder :

del 20 % , en valor relativo , para los contenidos en etopabato inferior a 7,5 ppm ,

de 1,5 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 7,5 y 10 ppm ,

del 15 % , en valor relativo , para los contenidos superiores a 10 ppm .

3 . DETERMINACIÓN DE LA DINITOLMIDA ( DOT )

( 3,5-dinitro-o-toluamida )

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar la dinitolmida ( DOT ) en los alimentos , los concentrados y las premezclas . Los derivados del nitroturano interfieren . El límite inferior de la determinación es de 40 ppm .

2 . Principio

La muestra está sometida a la extracción por acetonitrilo . El extracto se purifica sobre óxido de aluminio y se filtra . Una parte alícuota del filtrado se evapora en seco . El residuo se recoge mediante la dimetilformamida y se trata mediante la etilenodiamina . Se desarrolla una coloración púrpura . La dinitolmida se determina por espectrofometría a 560 nm .

3 . Reactivos

3.1 . Acetonitrilo al 85 % ( v/v ) : mezclar 850 ml de acetonitrilo puro y 150 ml de agua ; destilar la mezcla antes de su empleo ; recoger la fracción destilando entre 75 y 77 ° C .

3.2 . Óxido de aluminio para cromatografía sobre columna . Calcinar durante 2 h al menos a 750 ° C , refrigerar en desecador y conservar en frasco de cristal marrón , de tapón esmerilado . Antes de su utilización , humedecer tal como se indica : introducir en un frasco de cristal marrón 10 g de óxido de aluminio y 0,7 ml de agua , tapar herméticamente , volver a calentar durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo agitando durante todo el tiempo con energía . Dejar refrigerar agitándolo . Controlar la actividad sometiendo al análisis , a partir del punto 5.1 , una cantidad determinada de solución de muestra ( 3.6 ) . El índice determinado de recuperación de la dinitolmida debe ser del 100 % más o menos 2 % .

3.3 . N,N-dimetilformamida al 95 % ( v/v ) : mezclar 95,0 ml de N,N-dimetilformamida p.a. y 5,0 ml de agua .

3.4 . Etilenodiamina p.a. , contenido máximo en agua : 2,0 % .

3.5 . Substancia patrón : 3,5 dinitro-o-toluamida pura que responda a las siguientes características :

Punto de fusión : 177 ° C .

Coeficiente de extinción molecular a 248 nm en el acetonitrilo . 13,1 por 10 3 .

Coeficiente de extinción molecular a 266 um en la N,N-dimetilformamida : 10,1 por 10 3 .

3.6 . Solución patrón : pesar , precisión de 0,1 mg , 40 mg de substancia patrón ( 3.5 ) . Disolver por acetonitrilo ( 3.1 ) en un matraz aforado de 200 ml , completar el volumen por el mismo disolvente y homogeneizar . Tomar 20,0 ml , completar a 100 ml por el acetonitrilo ( 3.1 ) en un matraz aforado y homogeneizar . 1 ml de dicha solución contiene 40 mg de dinitolmida .

4 . Equipo

4.1 . Matraz cónico de 250 ml , de esmerilado normalizado .

4.2 . Refrigerante de reflujo , de esmerilado normalizado .

4.3 . Crisol filtrante , porosidad G 3 , diámetro 60 mm .

4.4 . Aparato de filtración sobre vacío ( por ejemplo aparato de Witt ) .

4.5 . Baño de agua , regulado a 50 ° C .

4.6 . Espectrofotómetro , con cubetas de 10 mm de espesor .

5 . Método operativo

5.1 . Extracción y purificación

Pesar , con precisión de 1 mg , 10 g de la muestra finamente dividida y homogeneizada . Para los concentrados y las premezclas , pesar con precisión de 1 mg , 1 g . Introducir la toma de muestras en un matraz cónico de 250 ml ( 4.1 ) y añadir 65 ml de acetonitrilo ( 3.1 ) . Mezclar , dotar el matraz cónico de un refrigerante de reflujo ( 4.2 ) y calentar sobre el baño de agua ( 4.5 ) durante 30 minutos agitándolo continuamente . Dejar refrigerar bajo una corriente de agua fría . Añadir 20 g de óxido de aluminio ( 3.2 ) , agitar durante 3 minutos y dejar decantar .

Situar un matraz aforado de 100 ml en el aparato de filtrar ( 4.4 ) , ajustar el crisol filtrante ( 4.3 ) y filtrar el líquido aspirando . Transvasar a continuación el sedimento al crisol con la ayuda de algunos ml de acetonitrilo ( 3.1 ) y aspirar . Cortar el vacío , volver a poner el sedimento en suspensión en algunos ml de acetonitrilo ( 3.1 ) y aspirar de nuevo . Repetir estas últimas operaciones hasta que el volumen del filtrado alcance 95 ml aproximadamente . Completar el volumen a 100 ml mediante el acetonitrilo ( 3.1 ) y homogeneizar .

Si fuera necesario , tomar una parte alícuota y diluir mediante acetonitrilo ( 3.1 ) para obtener una solución que contenga de 5 a 15 mg de dinitolmida por ml .

5.2 . Desarrollo de la coloración y medición de la densidad óptica

Introducir respectivamente en tres vasos de 50 ml A , B y C , 4,0 ml de la solución obtenida en 5.1 . Añadir , además , en el vaso C solamente , 1,0 ml de solución patrón ( 3.6 ) . Llevar los tres vasos sobre el baño de agua ( 4.5 ) situado bajo una campana de gases bien ventilada y evaporar en seco , bajo corriente de aire . Dejar refrigerar hasta la temperatura ambiente .

Añadir 10,0 ml de N,N-dimentilformamida ( 3.3 ) en el vaso A y 2,0 ml respectivamente en los vasos B y C . Dejar en contacto durante algunos minutos agitando ligeramente hasta la completa disolución del residuo . Añadir a continuación 8,0 ml de etilenodiamina ( 3.4 ) en los vasos B y C y homogeneizar . Medir , cinco minutos exactamente después de la adición de etilenodiamina , la densidad óptica de las tres soluciones mediante el espectrofotómetro ( 4.6 ) a 560 nm , empleando como blanco la N,N-dimentilformamida ( 3.3 ) .

6 . Cálculo de los resultados

El contenido en mg de dinitolmida por kg de muestra está dado por la fórmula

( E B - E A ) / ( E C - E B ) · F/P · 1 000

en la que :

E A = densidad óptica de la solución A ( testigo ) ,

E B = densidad óptica de la solución B ( muestra ) ,

E C = densidad óptica de la solución C ( patrón interno ) ,

P = peso en g de la toma de muestras ,

F = coeficiente de dilución ( efectuado si se diera el caso 5.1 ) .

7 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de las determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder :

de 10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos en dinitolmida inferiores a 100 ppm ,

del 10 % , en valor relativo , para los contenidos comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ,

de 500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ,

del 5 % , en valor relativo , para los contenidos superiores a 10 000 ppm .

4 . DETERMINACIÓN DE LA NICARBACINA

( mezcla equimolecular de 4,4-dinitrocarbanilida y 2-hidroxi-4,6-dimetilpirimidina )

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar la nicarbacina en los alimentos , los concentrados y las premezclas que no contienen más del 5 % de harinas de hierbas . Los derivados del nitrofurano , el acetilenheptino y el carbodox interferente . El límite inferior de la determinación es de 20 ppm .

2 . Principio

La mezcla está sometida a la extracción por la N,N-dimetilformamida . El extracto se purifica por cromatografía sobre columna de óxido de aluminio ; la nicarbacina es eluida por el etanol . El eluido se trata por una solución etanólica de hidróxido de sodio ; se desarrolla una coloración amarilla . La nicarbacina se determina mediante la espectrofotometría a 430 mm .

3 . Reactivos

3.1 . N,N-dimetilformamida p.a.

3.2 . Óxido de aluminio para cromatografía sobre columna .

Calcinar durante 2 h al menos a 750 ° C , refrigerar en el desecador y conservar en frasco de cristal marrón de tapón esmerilado . Antes de su empleo , controlar la actividad sometiendo al análisis , a partir del punto 5.2 , una cantidad determinada de solución patrón ( 3.8.3 ) .

El índice de recuperación de la nicarbacina debe ser del 100 % más o menos 2 % .

3.3 . Etanol al 95 % ( v/v ) .

3.4 . Etanol al 80 % ( v/v ) .

3.5 . Solución al 50 % ( p/v ) de hidróxido de sodio p.a.

3.6 . Solución etanólica al 1 % ( p/v ) de hidróxido de sodio :

Llevar 1 ml de solución de hidróxido de sodio ( 3.5 ) a un matraz aforado de 50 ml , completar al volumen por el etanol al 80 % ( 3.4 ) . Preparar en el momento de su empleo .

3.7 . Substancia de patrón : nicarbacina pura , coeficiente de extinción molecular a 362 nm en la N,N-dimetilformamida : 37,8 por 10 3 .

3.8 . Soluciones patrón :

3.8.1 . Solución a 1,25 mg de nicarbacina por ml : pesar , con precisión de 0,1 mg , 125 mg de substancia patrón ( 3.7 ) . Disolver mediante 75 ml de N,N-dimetilformamida ( 3.1 ) en un matraz aforado de 100 ml , calentando ligeramente . Dejar refrigerar , completar al volumen mediante el mismo disolvente y homogeneizar . Conservar a resguardo de la luz .

3.8.2 . Solución a 0,125 mg de nicarbacina por ml : tomar 10,0 ml de la solución ( 3.8.1 ) , completar a 100 ml por la N,N-dimetilformamida ( 3.1 ) en un matraz aforado y homogeneizar .

3.8.3 . Solución a 0,025 mg de nicarbacina por ml : tomar 20,0 ml de la solución ( 3.8.2 ) , completar a 100 ml por la N,N-dimetilformamida ( 3.1 ) en un matraz aforado y homogeneizar .

4 . Equipo

4.1 . Matraz cónico de 250 ml , de esmerilado normalizado .

4.2 . Refrigerante de reflujo , de esmerilado normalizado .

4.3 . Baño de agua hirviendo .

4.4 . Centrifugadora , con tubos de 120 ml .

4.5 . Tubo para cromatografía de cristal ( diámetro interior ; 25 mm , longitud : 30 mm ) .

4.6 . Espectrofotómetro , con cubetas de 10 mm de espesor .

4.7 . Bureta graduada a 1/10 ml .

5 . Método operativo

5.1 . Extracción

Pesar , con precisión de 1 mg , 10 g de la muestra finamente dividida y homogeneizada . Para los concentrados y las premezclas , pesar con precisión de 1 mg , 1 g . Introducir la toma de muestras en un matraz cónico de 250 ml ( 4.1 ) y añadir 100 ml exactamente de N,N-dimetil-formamida ( 3.1 ) . Mezclar , dotar al matraz de un refrigerante de reflujo ( 4.2 ) y calentar sobre baño de agua ( 4.3 ) durante 15 minutos agitando de vez en cuando . Dejar refrigerar bajo una corriente de agua fría .

Transvasar a continuación el líquido sobrenadante a un tubo de centrifugación ( 4.4 ) y centrifugar durante aproximadamente 3 minutos .

Si fuera necesario , tomar 25,0 ml del líquido sobrenadante y diluir mediante la N,N-dimetilformamida ( 3.1 ) para obtener una solución que contenga de 2,0 a 10,0 mg de nicarbacina por ml .

5.2 . Cromatografía

Introducir en un tubo para cromatografía ( 4.5 ) 30 g de aluminio ( 3.2 ) en suspensión en la N,N-dimetilformamida ( 3.1 ) . Dejar descender el líquido hasta 1 cm por encima de la columna de óxido de aluminio e introducir a continuación en la columna 25,0 ml del extracto obtenido en 5.1 . Dejar fluir el líquido evitando dejar la columna seca y lavar tres veces la columna mediante 10 ml de N,N-dimetilformamida ( 3.1 ) cada vez . Eluir a continuación mediante 70 ml etanol al 95 % ( 3.3 ) . Eliminar los 10 primeros ml del eluido y recoger el resto dividiendo de la siguiente forma :

una fracción a ) de 5 ml ,

una fracción b ) de 50 ml en un matraz aforado ,

una fracción c ) de 5 ml .

Controlar que las fracciones a ) y c ) no den una coloración amarilla por adición de solución etanólica de hidróxido de sodio ( 3.6 ) . Continuar las operaciones sobre la fracción b ) tal como se indica en 5.3 .

5.3 . Desarrollo de la coloración y medición de la densidad óptica

Introducir respectivamente 20,0 ml de la fracción b ) del eluido en dos matraces aforados A y B de 25 ml . Añadir en el matraz A 5,0 ml de solución etanólica de hidróxido de sodio ( 3.6 ) y 5,0 ml de etanol al 95 % ( 3.3 ) en el matraz B . Homogeneizar .

Medir , en los cinco minutos siguientes , la densidad óptica de las dos soluciones a 430 nm , utilizando como blanco una mezcla de 20,0 ml de etanol al 95 % ( 3.3 ) y 5,0 ml de solución etanólica de hidróxido de sodio ( 3.6 ) .

Restar el valor de la densidad óptica de la solución B del de la solución A . Determinar , a partir de dicho valor , la cantidad de nicarbacina que se refiera a la curva de calibrado ( 5.4 ) .

5.4 . Curva de calibrado

Someter 25,0 ml de la solución de patrón ( 3.8.3 ) a la cromatografía tal como se indica en 5.2 . Transvasar mediante la bureta graduada ( 4.7 ) la fracción b ) del eluido y hacer fluir a matraces aforados de 25 ml unos volúmenes respectivos de 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 y 10,0 ml ( correspondientes respectivamente a 0,025 , 0,050 , 0,075 , 0,100 y 0,125 mg de nicarbacina ) . Añadir a cada matraz 5,0 ml de solución etanólica de hidróxido de sodio ( 3.6 ) , completar el volumen mediante el etanol al 95 % ( 3.3 ) y homogeneizar .

Medir en los 5 minutos que siguen la densidad óptica de las soluciones a 430 nm , empleando como blanco una mezcla de 20 ml de etanol al 95 % ( 3.3 ) y 5,0 ml de solución etanólica de hidróxido de sodio ( 3.6 ) .

Trazar la curva de calibrado llevando a las ordenadas los valores de la densidad óptica y a las abscisas las cantidades correspondientes de nicarbacina en mg .

6 . Cálculo de los resultados

El contenido en mg de nicarbacina por kg de muestra está dado por la fórmula

A/P · F · 10 000

en la que :

A = cantidad en mg de nicarbacina determinada por la medición fotométrica ,

P = peso en g de la toma de muestras ,

F = coeficiente de dilución ( efectuada si se diera el caso en 5.1 ) .

7 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe rebasar :

10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos en nicarbacina inferiores a 100 ppm ,

el 10 % , en valor relativo , para los contenidos comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ,

500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ,

el 5 % , en valor relativo , para los contenidos superiores a 10 000 ppm .

5 . DETERMINACIÓN DE LA MENADIONA ( VITAMINA K3 )

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar la menadiona ( vitamina K3 ) en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 1 ppm .

2 . Principio

La muestra se somete a la extracción mediante el metano diluido . La mezcla se defeca con ayuda de una solución de tanino y se centrifuga . El extracto se trata mediante una solución de carbonato de sodio , la menadiona se libera y extrae mediante el 1,2-dicloretano . El extracto dicloretánico se trata según su contenido en menadiona , ya sea directamente , ya sea previa evaporación , por la 2,4-dinotrofenilhidracina en solución en el etanol acidificado por el ácido clorhídrico . El hidrazono obtenido , añadiéndole un exceso de amoníaco , da lugar a un complejo de color azul verdoso cuya densidad óptica se mide a 635 nm .

3 . Reactivos

3.1 . Etanol al 96 % ( v/v ) .

3.2 . Etanol ( 3.1 ) diluido al 40 % mediante agua .

3.3 . Solución al 10 % ( v/v ) de tanino , a partir de tanino puro , en polvo .

3.4 . 1,2-dicloretano p.a.

3.5 . Solución al 10 % ( p/v ) de carbonato de sodio anhidro p.a.

3.6 . Ácido clorhídrico al 37 % ( p/v ) , d : 1,19 .

3.7 . Etanol absoluto p.a.

3.8 . Reactivo por la 2,5-dinitrofenilhidracina : disolver 40 mg de 2,4-dinitrofenilhidracina p.a. en 40 ml aproximadamente de etanol absoluto ( 3.7 ) hirviendo , dejar refrigerar y transvasar a un matraz aforado de 50 ml . Añadir 1 ml de ácido clorhídrico ( 3.6 ) y completar al volumen mediante el etanol absoluto ( 3.7 ) . Preparar inmediatamente antes de su empleo .

3.9 . Amoníaco al 25 % ( p/p ) , d = 0,91 .

3.10 . Solución amoniacal de etanol : mezclar un volumen de etanol ( 3.7 ) y un volumen de amoníaco ( 3.9 ) .

3.11 . Soluciones de patrón de menadiona ( vitamina K3 ) en el 1,2-dicloretano ( 3.4 ) y completar a 200 ml . Diluir unas partes alícuotas de dicha solución mediante el 1,2-dicloretano ( 3.4 ) para obtener una serie de soluciones cuyas contracciones en menadiona estén comprendidas entre 2 y 10 mg por ml . Debe estar recién preparado antes de su empleo .

4 . Equipo

4.1 . Agitador mecánico .

4.2 . Centrifugadora ( de 3 000 a 5 000 t/minuto ) .

4.3 . Ampollas de decantación de 100 y 250 ml , de tapón esmerilado .

4.4 . Aparato rotativo de evaporación en vacio , con matraces de 250 ml .

4.5 . Baño de agua .

4.6 . Espectrofotómetro , con cubetas de 10 mm de espesor .

5 . Método operatorio

N. B. Todas las manipulaciones deben hacerse al resguardo de la luz directa , en su caso en un equipo de vidrio marrón .

5.1 . Toma de muestras

Realizar una toma de muestras de la muestra finamente dividida , proporcional al contenido supuesto en menadiona , o sea :

de 0,1 a 5,0 g para los concentrados y premezclas ,

de 20 a 30 g para los alimentos .

Introducir inmediatamente la toma de muestras en el frasco de 250 ml de tapón esmerilado .

5.2 . Extracción

Añadir 96 ml exactamente de etanol diluido ( 3.2 ) y agitar mecánicamente durante 15 minutos a la temperatura ambiente .

Añadir a continuación 4,0 ml de solución de tanino ( 3.3 ) , mezclar , transvasar el extracto a un tubo de centrifugar , centrifugar ( 3 000 a 5 000 t/minuto ) y decantar .

Introducir 20 a 40 ml medidos con exactitud del extracto en una ampolla de decantación de 250 ml , añadir mediante la pipeta 50 ml de 1,2-dicloretano ( 3.4 ) , mezclar y añadir mediante la pipeta 20 ml de solución de carbonato de sodio ( 3.5 ) . Agitar enérgicamente durante 30 segundos y recoger a continuación la fase dicloretánica en una ampolla de decantación de 100 ml . Añadir 20 ml de agua , agitar de nuevo durante 15 segundos , recoger la fase dicloretánica y eliminar los restos de agua con la ayuda de bandas de papel de filtro .

Para los concentrados y premezclas , tomar una parte alícuota del extracto y diluir mediante 1,2-dicloretano ( 3.4 ) para obtener una concentración en menadiona de 2 a 10 mg por ml . Para los alimentos , evaporar en seco una parte alícuota del extracto , bajo presión reducida y en atmósfera de nitrógeno , en el baño de agua a 40 ° C . Recoger rápidamente el residuo mediante 1,2-dicloretano ( 3.4 ) para obtener una solución que contenga de 2 a 10 mg de mendiona por ml .

5.3 . Formación de la hidrazona

Llevar 2,0 ml del extracto dicloretánico obtenido en 5.2 al matraz aforado de 10 ml y añadir 3,0 ml del reactivo por el 2,4-dinitrofenilhidroziona ( 3.8 ) , tapar el matraz con la ayuda de un tapón de corcho o de teflón de forma que se evite cualquier evaporación y calentar durante 2 horas a 70 ° C sobre baño de agua . Dejar refrigerar , añadir 3,0 ml de solución amoniacal de etanol ( 3.10 ) , mezclar , completar al volumen mediante etanol absoluto ( 3.7 ) y mezclar de nuevo .

5.4 . Medición de la densidad óptica

Medir la densidad óptica del complejo coloreado en azulverdoso mediante el espectrofotómetro a 635 nm por comparación con un blanco de reactivos obtenidos tratando 2,0 ml de 1,2-dicloretano ( 3.4 ) como se indica en 5.3 . Determinar la cantidad de menadiona refiriéndose a una curva de muestras establecida para cada serie de análisis .

5.5 . Curva de muestras

Tratar 2,0 ml de las soluciones de calibrado de menadiona ( 3.11 ) tal como se indica 5.3 . Medir la densidad óptica como se indica en 5.4 . Trazar la curva de muestras llevando a las ordenadas los valores de la densidad óptica y a las abscisas las cantidades correspondientes de menadiona en mg .

6 . Cálculo de resultados

Calcular el contenido en menadiona de la muestra teniendo en cuenta el peso de la toma de muestras y de las diluciones efectuadas a lo largo del análisis . Expresar el resultado en mg de menadiona por kg .

7 . Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder :

- del 20 % , en valor relativo , para los contenidos en menadiona inferiores a 10 ppm ,

- de 2 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 10 y 14 ppm ,

- del 15 % , en valor relativo , para los contenidos comprendidos entre 14 y 100 ppm ,

- de 15 ppm , en valor absoluto , para los contenidos comprendidos entre 100 y 150 ppm ,

- del 10 % , en valor relativo , para los contenidos superiores a 150 ppm .