ANEXO VI

1. MÉTODO

El presente método es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 221 (2006) (1). Se ha llegado a un amplio acuerdo entre las autoridades de la UE en el sentido de que el ensayo con Lemna consituye una alternativa adecuada a un ensayo con algas en caso de sustancias fuertemente coloreadas (2) (3).

1.1. INTRODUCCIÓN

El objetivo del presente método de ensayo es evaluar la toxicidad de las sustancias para las plantas de agua dulce del género Lemna (lenteja de agua). Se basa en directrices anteriores (4) (5) (6) (7) (8) (9), pero incluye modificaciones encaminadas a tener en cuenta los resultados de recientes investigaciones y consultas sobre diversos aspectos fundamentales. El método propuesto se ha validado mediante un ensayo de intercalibración internacional (10).

El presente método describe el ensayo de toxicidad con Lemna gibba y Lemna minor, dos especies que han sido estudiadas ampliamente y son objeto de las normas arriba citadas. La taxonomía de Lemna spp. es difícil y se ve complicada por la existencia de una amplia gama de fenotipos. Aunque puede aparecer variabilidad genética en la respuesta de Lemna a los agentes tóxicos, actualmente no se tienen datos suficientes sobre esta fuente de variabilidad como para recomendar el uso de un clon determinado en el presente método. Ha de señalarse que el ensayo no se realiza en condiciones axénicas, pero se toman medidas en distintas fases del ensayo para reducir al mínimo la contaminación por otros organismos.

Se incluyen pormenores sobre los ensayos con renovación (semiestáticos y dinámicos) y sin renovación (estáticos) de la solución de ensayo. En función de los objetivos del ensayo y de las imposiciones normativas, se recomienda considerar la aplicación de métodos semiestáticos y dinámicos, por ejemplo en caso de sustancias que desparezcan rápidamente de la solución por volatilización, fotodegradación, precipitación o biodegradación. En la referencia (11) se dan más orientaciones.

1.2. DEFINICIONES

En relación con el presente método de ensayo se entenderá por:

Biomasa: el peso seco de materia viva presente en una población. En este ensayo, lo que se mide normalmente son indicadores de la biomasa, como el número de frondas o la superficie de las frondas, por lo que el término de «biomasa» se refiere también a estos indicadores.

Clorosis: el amarilleamiento del tejido de la fronda.

Clon: el conjunto de organismos o células procedentes de un solo individuo por reproducción asexual. Los individuos del mismo clon son, por tanto, genéticamente idénticos.

Colonia: el conjunto de frondas madre e hijas (generalmente de 2 a 4) unidas entre sí. A veces se le da el nombre de planta.

ECx : la concentración de la sustancia problema disuelta en el medio de ensayo que produce una reducción del x % (por ejemplo, del 50 %) en el crecimiento de Lemna dentro de un plazo de exposición definido (que debe indicarse explícitamente si es distinto de la duración completa o normal del ensayo). Para expresar de forma inequívoca el valor de EC obtenido a partir de la tasa de crecimiento o del rendimiento, se usan respectivamente los símbolos «ECt» y «ECr», seguidos de la variable de medición que se ha utilizado, por ejemplo ECt (número de frondas).

Ensayo dinámico: el ensayo en que las soluciones de ensayo se renuevan continuamente.

Fronda: cada una de las estructuras «foliáceas» simples de una planta de lenteja de agua. Es la unidad mínima, es decir, individuo, capaz de reproducirse.

Deformación: la presencia de frondas con protuberancias o aspecto hinchado.

Crecimiento: el aumento de la variable de medición, por ejemplo el número de frondas, el peso seco, el peso húmedo o la superficie de las frondas, a lo largo de la duración del ensayo.

Tasa de crecimiento (tasa media de crecimiento específico): el aumento logarítmico de la biomasa durante el período de exposición.

Concentración mínima con efecto observado (LOEC): la concentración estudiada mínima a la que se observa que la sustancia ejerce un efecto estadísticamente significativo de reducción del crecimiento (con p < 0,05) cuando se compara con el control, dentro de un tiempo de exposición dado. Sin embargo, es necesario también que todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC ejerzan un efecto nocivo superior o igual al que se observa con dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explicación completa sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por tanto, la NOEC).

Variables de medición: las variables de cualquier tipo que se miden para expresar el criterio del ensayo utilizando una o más variables de respuesta diferentes. En este método se consideran variables de medición el número de frondas, la superficie de las frondas, el peso fresco y el peso seco.

Monocultivo: el cultivo con una sola especie vegetal.

Necrosis: el tejido de fronda muerto (es decir, blanco o saturado de agua).

Concentración sin efecto observado (NOEC): la concentración estudiada que se encuentra inmediatamente por debajo de la LOEC.

Fenotipo: las características observables de un organismo determinadas por la interacción de sus genes con su entorno.

Variables de respuesta: las variables para la estimación de la toxicidad derivadas de cualquier variable de medición que describa la biomasa por distintos métodos de cálculo. A efectos del presente método, las tasas de crecimiento y el rendimiento son variables de respuesta derivadas de variables de medición como el número de frondas, la superficie de las frondas, el peso fresco y el peso seco.

Ensayo semiestático (de renovación): el ensayo en que, a lo largo de su duración, la solución de ensayo se sustituye periódicamente, a intervalos específicos.

Ensayo estático: el ensayo en que, a lo largo de su duración, no hay renovación de la solución de ensayo.

Criterio del ensayo: el factor general que, como objetivo del ensayo, es modificado por la sustancia problema respecto al control. En este método el criterio del ensayo es la inhibición del crecimiento, que se puede expresar mediante diferentes variables de respuesta, basadas en una o más variables de medición.

Medio de ensayo: el medio de cultivo sintético y completo en que crecen las plantas del ensayo cuando se exponen a la sustancia problema. Esta se disuelve en principio en el medio de ensayo.

Rendimiento: el valor de una variable de medición para expresar la biomasa al final del período de exposición menos el valor de la variable de medición al inicio del período de exposición.

1.3. PRINCIPIO DEL ENSAYO

Se cultivan plantas del género Lemna en fase de crecimiento exponencial como monocultivos expuestos a diferentes concentraciones de la sustancia problema durante un plazo de siete días. El objetivo del ensayo es cuantificar el efecto producido por la sustancia sobre el crecimiento vegetativo a lo largo de este plazo, a partir de la evaluación de unas variables de medición seleccionadas. La variable de medición primaria es el número de frondas. Se mide también al menos otra variable de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), ya que algunas sustancias pueden afectar a otras variables de medición mucho más que al número de frondas. Para cuantificar los efectos debidos a la sustancia, se compara el crecimiento en las soluciones de ensayo con el de los controles y se determina la concentración que ocasiona una inhibición del crecimiento de un porcentaje especificado (por ejemplo, 50 %), la cual se expresa como ECx (por ejemplo, EC50).

El criterio final es la inhibición del crecimiento, expresado como incremento logarítmico de la variable de medición (tasa media de crecimiento específico) durante el tiempo de exposición. A partir de las tasas medias de crecimiento específico registradas en una serie de soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % de la tasa de crecimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como ECtx (por ejemplo, ECt50).

Otra variable de respuesta utilizada en este método de ensayo es el rendimiento, lo que puede ser necesario en algunos países para cumplir obligaciones específicas derivadas de la normativa. Se define como las variables de medición al final del tiempo de exposición menos las variables de medición al inicio de este tiempo. A partir del rendimiento registrado en una serie de soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % del rendimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como ECrx (por ejemplo, ECr50).

Además, pueden determinarse estadísticamente la concentración mínima con efecto observado (LOEC) y la concentración sin efecto observado (NOEC).

1.4. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA

Debe contarse con un método analítico que tenga la sensibilidad adecuada para cuantificar la sustancia en el medio de ensayo.

Entre la información sobre la sustancia problema que puede ser útil para establecer las condiciones del ensayo está lo siguiente: fórmula estructural, pureza, hidrosolubilidad, estabilidad en el agua, pKa, Kow, presión de vapor y biodegradabilidad. La hidrosolubilidad y la presión de vapor pueden utilizarse para calcular la constante de la ley de Henry, que indicará la probabilidad de la pérdida de cantidades significativas de sustancia problema durante el tiempo del ensayo. Esto contribuirá a indicar si deben tomarse medidas particulares para limitar tal pérdida. Cuando sea incierta la información sobre la solubilidad y estabilidad de la sustancia problema, se recomienda que se evalúen dichos aspectos en las condiciones del ensayo, es decir, con el medio de cultivo, la temperatura y el régimen de iluminación que se vayan a utilizar en el ensayo.

Cuando sea particularmente importante el control del pH del medio de ensayo, por ejemplo cuando se estudien metales o sustancias hidrolíticamente inestables, se recomienda añadir un tampón al medio de cultivo (véase el párrafo primero del punto 1.7.4). En la referencia (11) se ofrece más orientación sobre los ensayos de sustancias con propiedades fisicoquímicas que dificultan estos ensayos.

1.5. SUSTANCIA DE REFERENCIA

Para comprobar el procedimiento del ensayo pueden someterse al mismo sustancias de referencia, como el 3,5-diclorofenol utilizado en el ensayo de intercalibración internacional (10). Se recomienda efectuar un ensayo con una sustancia de referencia al menos dos veces al año o, si la frecuencia de los ensayos es menor, en paralelo con la determinación de la toxicidad de una sustancia problema.

1.6. VALIDEZ DEL ENSAYO

Para que el ensayo sea válido, el tiempo de duplicación del número de frondas en el control debe ser inferior a 2,5 días (60 h), lo que corresponde a una multiplicación por siete en el plazo de siete días y a una tasa media de crecimiento específico de 0,275 d–1. Con los medios y condiciones de ensayo descritos en el presente método, este criterio puede cumplirse utilizando un régimen estático (8). También se prevé que este criterio se pueda cumplir en condiciones semiestáticas y dinámicas. En el punto 2.1 se muestra cómo calcular el tiempo de duplicación.

1.7. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

1.7.1. Equipo

Todo el equipo que entre en contacto con los medios de ensayo será de vidrio o de otro material químicamente inerte. El material de vidrio utilizado para el cultivo y el ensayo estará limpio de contaminantes químicos que puedan pasar al medio de ensayo y además será estéril. Los recipientes de ensayo tendrán la anchura suficiente para que las frondas de las diferentes colonias de los recipientes de control puedan crecer sin solaparse al final del ensayo. No importa si las raíces tocan el fondo de los recipientes de ensayo, pero se recomienda una profundidad mínima de 20 mm y un volumen mínimo de 100 ml en cada recipiente de ensayo. Siempre que se respeten estas normas, no es fundamental el tipo de recipiente de ensayo: se ha visto que son adecuados tanto los vasos de precipitados como los cristalizadores o las placas Petri de vidrio de dimensiones adecuadas. Los recipientes de ensayo estarán cubiertos para minimizar la evaporación y la contaminación accidental, pero sin impedir el necesario intercambio de gases. Los recipientes de ensayo y, en particular, las tapas serán tales que eviten la formación de sombras o la modificación de las características espectrales de la luz.

No se tendrán juntos los cultivos y los recipientes de ensayo, y la mejor forma de conseguirlo es utilizar distintas cámaras, incubadoras o recintos de cultivo ambientales. Debe ser posible regular la iluminación y la temperatura, y mantenerlas a nivel constante (véase el punto 1.7.8).

1.7.2. Organismo de ensayo

El organismo utilizado para este ensayo es L. gibba o L. minor. En el apéndice 1 se recogen breves descripciones de especies de lenteja de agua que se han utilizado en ensayos de toxicidad. El material vegetal puede obtenerse de una colección de cultivos, de otro laboratorio o del campo. Si se recogen del campo, las plantas deben mantenerse cultivadas en el mismo medio que se vaya a utilizar para el ensayo al menos en las ocho semanas anteriores a esta utilización. Los lugares del campo utilizados para recoger los cultivos iniciales deben estar libres de fuentes de contaminación evidentes. Si se obtienen de otro laboratorio o de una colección de cultivos, deben mantenerse similarmente durante un mínimo de tres semanas. En el informe han de indicarse siempre el origen, la especie y el clon (si se conoce) del material vegetal utilizado para el ensayo.

Deben utilizarse monocultivos que estén claramente exentos de contaminación con otros organismos, como algas o protozoos. Las plantas sanas de L. minor consisten en colonias formadas por entre dos y cinco frondas, mientras que las colonias sanas de L. gibba pueden tener hasta siete frondas.

La calidad y la uniformidad de las plantas empleadas en el ensayo tendrán una influencia significativa sobre el resultado del mismo, por lo que deben seleccionarse con cuidado. Han de utilizarse plantas jóvenes, en fase de crecimiento rápido, que no presenten lesiones visibles ni cambios de color (clorosis). La buena calidad de un cultivo viene indicada por una elevada frecuencia de colonias con un mínimo de dos frondas. Un gran número de frondas aisladas indica problema ambiental, por ejemplo por limitación de nutrientes, y el material de estos cultivos no debe utilizarse en los ensayos.

1.7.3. Cultivo

Para reducir la frecuencia del mantenimiento del cultivo (por ejemplo, cuando no esté previsto efectuar ensayos con Lemna durante cierto tiempo), es posible mantener los cultivos en condiciones de iluminación y temperatura reducidas (4 a 10 °C). En el apéndice 2 se recoge información sobre el mantenimiento de los cultivos. Si se observan signos evidentes de contaminación por algas u otros organismos, habrá que proceder a la esterilización superficial de una submuestra de frondas de Lemna, seguida por su transferencia a medio fresco (véase el apéndice 2). En tal caso, se desechará el resto del cultivo contaminado.

Al menos siete días antes del ensayo, debe transferirse asépticamente a medio estéril fresco un número suficiente de colonias, que se cultivarán durante 7 a 10 días en las condiciones del ensayo.

1.7.4. Medio de ensayo

Se recomienda el uso de diferentes medios para L. minor y L. gibba, como se describe más abajo. Debe estudiarse cuidadosamente la inclusión de un tampón de pH en el medio de ensayo [ácido 4-morfolinopropano-sulfónico (MOPS), no CAS: 1132-61-2; no EINECS: 214-478-5) en medio de L. minor, y NaHCO3 en medio de L. gibba] si se sospecha que puede reaccionar con la sustancia problema e influir en la expresión de su toxicidad. También es aceptable el medio de Steinberg (12), siempre que se cumplan los criterios de validez.

Para el cultivo de L. minor y los ensayos con ella, se recomienda una modificación del medio de cultivo normal de Suecia (SIS) para Lemna, cuya composición figura en el apéndice 3.

Para el cultivo de L. gibba y los ensayos con ella, se recomienda el medio de cultivo 20X-AAP, tal como se describe en el apéndice 3.

El medio de Steinberg, como se describe en el apéndice 3, es también adecuado para L. minor, aunque puede utilizarse asimismo con L. gibba siempre que se cumplan los criterios de validez.

1.7.5. Soluciones de ensayo

Las soluciones de ensayo se preparan normalmente diluyendo una solución madre. En principio, las soluciones madre de la sustancia problema se preparan disolviendo la sustancia en medio de cultivo.

La mayor concentración estudiada de la sustancia problema no debe superar como norma su hidrosolubilidad en las condiciones de ensayo. No obstante, ha de señalarse que Lemna spp. flotan en la superficie y pueden exponerse a sustancias que se acumulan en la interfase agua-aire (por ejemplo, sustancias hidrofóbicas o poco hidrosolubles, o sustancias tensoactivas). En tales circunstancias, la exposición se deberá a material que no está disuelto y las concentraciones de ensayo podrán superar la hidrosolubilidad, según las características de la sustancia problema. En caso de sustancias problema de escasa hidrosolubilidad, puede ser necesario preparar una dispersión o solución madre concentrada de la sustancia con un dispersante o disolvente orgánico para facilitar la adición de cantidades exactas de la sustancia problema al medio de ensayo y ayudar a su dispersión y disolución. No obstante, debe evitarse en la mayor medida posible el empleo de tales materiales. El uso de disolventes o dispersantes auxiliares no debe provocar fitotoxicidad. Por ejemplo, entre los disolventes utilizados frecuentemente que no causan fitotoxicidad a concentraciones de hasta 100 μl·l–1 figuran la acetona y la dimetilformamida. Si se utiliza un disolvente o dispersante, su concentración final se indicará en el informe y se mantendrá a un nivel mínimo (≤ 100 μl·l–1), y todos los recipientes de tratamiento y de control contendrán la misma concentración de disolvente o dispersante. En la referencia (11) se da más información sobre el uso de dispersantes.

1.7.6. Grupos de ensayo y controles

Para seleccionar las concentraciones de ensayo adecuadas es útil disponer de datos anteriores sobre la toxicidad de la sustancia problema para Lemna, como, por ejemplo, datos procedentes de un ensayo preliminar. En el ensayo definitivo de toxicidad, deben emplearse al menos cinco concentraciones de ensayo dispuestas en progresión geométrica. Lo mejor es que la razón entre las concentraciones de ensayo no sea superior a 3,2, pero puede utilizarse un valor superior si la curva concentración-respuesta es plana. Si se usan menos de cinco concentraciones, hay que justificarlo. De cada concentración de ensayo se utilizarán al menos tres réplicas en paralelo.

Al fijar el abanico de concentraciones de ensayo (para el ensayo de tanteo o para el ensayo definitivo de toxicidad), debe tenerse en cuenta lo siguiente:

Si el objetivo es estimar la LOEC/NOEC, la menor concentración de ensayo debe ser tan baja que el crecimiento correspondiente no sea significativamente inferior al del control. Por otra parte, la mayor concentración de ensayo debe ser tan alta que el crecimiento correspondiente sea significativamente inferior al del control. Si no es así, habrá que repetir el ensayo utilizando un abanico diferente de concentraciones (salvo que la mayor concentración sea el límite de solubilidad o la concentración límite requerida máxima, por ejemplo 100 mg·l–1).

Cada ensayo debe incluir controles con un medio nutritivo, número de frondas y colonias, condiciones ambientales y procedimientos iguales que los recipientes de ensayo, pero sin la sustancia problema. Si se utiliza un disolvente o dispersante auxiliar, se incluirá un control adicional con el disolvente o dispersante presente en la misma concentración que en los recipientes con la sustancia problema. El número de réplicas de los recipientes de control (y recipientes de disolventes, en su caso) será al menos igual al número de recipientes utilizados con cada concentración de ensayo, y preferentemente el doble de este número.

Si no es necesario determinar la NOEC, el diseño de la prueba puede modificarse para aumentar el número de concentraciones y reducir el número de réplicas por concentración. Sin embargo, el número de réplicas de los controles será al menos de tres.

1.7.7. Exposición

Se transfieren desde el cultivo de inóculo colonias formadas por entre 2 y 4 frondas visibles, repartiéndose aleatoriamente entre los recipientes de ensayo en condiciones asépticas. Cada recipiente de ensayo debe contar con un total de 9 a 12 frondas. En cada uno de ellos habrá el mismo número de frondas y colonias. La experiencia obtenida con este método y los datos del ensayo de intercalibración indican que el uso de tres réplicas por tratamiento, contando cada una de ellas inicialmente con entre 9 y 12 frondas, es suficiente para detectar diferencias en el crecimiento del orden del 4 al 7 % de la inhibición calculada en tasa de crecimiento (del 10 al 15 % calculada en rendimiento) entre tratamientos (10).

Es necesario un diseño aleatorio de la distribución de los recipientes de ensayo en la incubadora para minimizar la influencia de las diferencias espaciales de intensidad luminosa o temperatura. También es necesario un diseño por bloq ues o una redistribución aleatoria de los recipientes cuando se hacen observaciones (o una redistribución más frecuente).

Si un ensayo previo de estabilidad indica que la concentración de sustancia problema no puede mantenerse (es decir, que la concentración medida cae por debajo del 80 % de la concentración medida inicialmente) a lo largo de la duración del ensayo (7 días), se recomienda un régimen de ensayo semiestático. En tal caso, las colonias deben exponerse a soluciones de ensayo y control recién preparadas en al menos dos ocasiones durante el ensayo (por ejemplo, en los días 3 y 5). La frecuencia de la exposición al medio fresco dependerá de la estabilidad de la sustancia problema; puede ser necesaria una frecuencia mayor para mantener concentraciones cuasi constantes de sustancias muy inestables o volátiles. En ciertas circunstancias puede hacer falta un procedimiento dinámico (11) (13).

La posibilidad de exposición mediante aplicación foliar (aerosol) no se contempla en el presente método de ensayo; véase en cambio la referencia (14).

1.7.8. Condiciones de incubación

Debe utilizarse continuamente una luz fluorescente blanca fría o cálida que dé una intensidad luminosa seleccionada en el intervalo de 85 a 135 μE·m–2·s–1 cuando se mide en una radiación activa para la fotosíntesis (400 a 700 nm) en puntos situados a la misma distancia de la fuente luminosa que las frondas de Lemna (equivalente a 6 500 a 10 000 lux). Las diferencias respecto a la intensidad luminosa seleccionada no deben superar el ± 15 % en toda la superficie de ensayo. El método de detección y medición de la luz, en particular el tipo de sensor, influye en el valor medido. La utilización de sensores esféricos (que responden a la luz desde todos los ángulos por encima y por debajo del plano de medición) y de sensores de «coseno» (que responden a la luz desde todos los ángulos por encima del plano de medición) es mejor que la de sensores unidireccionales, y proporciona lecturas más elevadas con una fuente luminosa multipuntual del tipo que se describe aquí.

La temperatura de los recipientes de ensayo debe ser de 24 ± 2 °C. El pH del medio de control no debe subir más de 1,5 unidades durante el ensayo. Sin embargo, una desviación superior a 1,5 unidades no invalidaría el ensayo si puede demostrarse que se cumplen los criterios de validez. Es necesario prestar especial atención a la deriva del pH en casos especiales, como cuando se estudian metales o sustancias inestables. En la referencia (11) puede encontrarse más información al respecto.

1.7.9. Duración

El ensayo termina a los siete días de la transferencia de las plantas a los recipientes de ensayo.

1.7.10. Mediciones y determinaciones analíticas

Al inicio del ensayo, se cuenta y registra el número de frondas de los recipientes de ensayo, velando por tener en cuenta las frondas prominentes y claramente visibles. Es necesario determinar el número de frondas de aspecto normal o anormal al inicio del ensayo, al menos una vez cada tres días durante el plazo de exposición (es decir, al menos dos veces durante el período de 7 días) y al final del ensayo. Deben anotarse los cambios observados en el desarrollo de las plantas como, por ejemplo, en el tamaño, aspecto, indicación de necrosis, clorosis o protuberancias, rotura de colonias o pérdida de flotabilidad de las frondas, así como en la longitud y aspecto de las raíces. Deben registrarse también las características significativas del medio de ensayo (por ejemplo, presencia de material sin disolver o crecimiento de algas en el recipiente de ensayo).

Además del recuento del número de frondas durante el ensayo, hay que evaluar los efectos de la sustancia problema sobre una o más de las siguientes variables de medición:

La superficie total de las frondas tiene la ventaja de que puede determinarse en cada recipiente de ensayo y de control al principio y al final del ensayo, así como durante el mismo. El peso seco o fresco debe determinarse al principio del ensayo a partir de una muestra de cultivo del inóculo representativa del utilizado para empezar el ensayo, y al final de este con el material vegetal de cada recipiente de ensayo y de control. Si no se mide la superficie de las frondas, es mejor determinar el peso seco que el peso fresco.

La superficie total de las frondas, el peso seco y el peso fresco pueden determinarse de la forma siguiente:

1.7.10.1. Frecuencia de las mediciones y determinaciones analíticas

Si se utiliza un ensayo estático, debe medirse el pH de cada tratamiento al inicio y al final del ensayo. Si el ensayo es semiestático, el pH debe medirse en cada lote de solución de ensayo «fresca» antes de cada renovación y también en las correspondientes soluciones «viejas».

Debe medirse la intensidad luminosa en la cámara de crecimiento, incubadora o recinto de cultivo, en puntos situados a la misma distancia de la fuente luminosa que las frondas de Lemna. Esta medición debe efectuarse al menos una vez durante el ensayo. Debe registrarse al menos una vez al día la temperatura del medio en un recipiente indicador mantenido en las mismas condiciones en la cámara, incubadora o recinto de cultivo.

Las concentraciones de la sustancia problema se determinarán durante el ensayo a intervalos adecuados. Con ensayos estáticos, el requisito mínimo es determinar las concentraciones al inicio y al final del ensayo.

Con ensayos semiestáticos en que no se prevea que la concentración de sustancia problema permanezca en el intervalo del ± 20 % de la concentración nominal, habrá que analizar todas las soluciones de ensayo recién preparadas y las mismas soluciones en cada renovación (véase el párrafo tercero del punto 1.7.7). No obstante, en los ensayos en los que la concentración inicial medida de la sustancia problema no esté dentro del intervalo del ± 20 % de la concentración nominal, pero en los que puedan aportarse pruebas suficientes de que las concentraciones iniciales son repetibles y estables (es decir, que están dentro del intervalo del 80 a 120 % de la concentración inicial), las determinaciones químicas podrían limitarse a las concentraciones de ensayo máxima y mínima. En todos los casos, la determinación de las concentraciones de la sustancia problema antes de la renovación solo tendrá que efectuarse en uno de los recipientes replicados de cada concentración de ensayo (o en los contenidos reunidos de los recipientes replicados).

Si se utiliza un ensayo dinámico, será adecuado un régimen de muestreo similar al descrito para los ensayos semiestáticos, incluido el análisis al inicio, a la mitad y al final del ensayo, pero en este caso no será apropiado efectuar mediciones de las soluciones «gastadas». En este tipo de ensayo habrá que comprobar diariamente el caudal de solución madre de sustancia problema o de diluyente y sustancia problema.

Si está demostrado que la concentración de la sustancia problema se ha mantenido satisfactoriamente a lo largo de todo el ensayo dentro del intervalo del ± 20 % de la concentración nominal o medida inicialmente, el análisis de los resultados puede basarse en los valores nominales o medidos inicialmente. Si la desviación respecto a la concentración nominal o medida inicialmente es superior al ± 20 %, el análisis de los resultados deberá basarse en la media geométrica de la concentración durante la exposición o en modelos que describan el descenso de la concentración de la sustancia problema (11).

1.7.11. Ensayo límite

Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando un ensayo preliminar indica que la sustancia problema no tiene efectos tóxicos a concentraciones de hasta 100 mg·l–1, o hasta su límite de solubilidad en el medio de ensayo si este valor es más bajo, puede efectuarse un ensayo límite comparando las respuestas de un grupo de control y de un único grupo de tratamiento (100 mg·l–1 o una concentración igual al límite de solubilidad). Se recomienda vivamente que esto se apoye en un análisis de la concentración de exposición. Todas las condiciones de ensayo y criterios de validez antes descritos son aplicables al ensayo límite, con la excepción de que el número de réplicas de tratamiento ha de duplicarse. El crecimiento en el grupo de control y en el de tratamiento pueden analizarse mediante un método estadístico para comparar las medias como, por ejemplo, una prueba t de Student.

2. DATOS E INFORME

2.1. TIEMPO DE DUPLICACIÓN

Para determinar el tiempo de duplicación (Td) del número de frondas y el cumplimiento de este criterio de validez por el estudio (punto 1.6), se aplicará la fórmula siguiente con datos obtenidos de los recipientes de control:

Td = ln 2/μ

donde μ es la tasa media de crecimiento específico determinada como se describe en los párrafos primero y segundo del punto 2.2.1.

2.2. VARIABLES DE RESPUESTA

El objetivo del ensayo es determinar los efectos de la sustancia problema sobre el crecimiento vegetativo de Lemna. El presente método de ensayo describe dos variables de respuesta, ya que los Estados miembros tienen distintas preferencias y necesidades normativas. Para que los resultados del ensayo sean aceptables en todos los Estados miembros, los efectos deben evaluarse utilizando las dos variables de respuesta a) y b) que se describen a continuación:

Ha de señalarse que los valores de toxicidad calculados a partir de estas dos variables de respuesta no son comparables y es necesario tener en cuenta esta diferencia cuando se utilicen los resultados del ensayo. Los valores de ECx basados en la tasa media de crecimiento específico (ECtx) son normalmente más elevados que los basados en el rendimiento (ECrx) si se respetan las condiciones del presente método de ensayo, debido al fundamento matemático de los planteamientos respectivos. Esto no debe interpretarse como una diferencia en la sensibilidad de las dos variables de respuesta, sino como una diferencia puramente matemática entre los valores. El concepto de tasa media de crecimiento específico se basa en el modelo general de crecimiento exponencial de la lenteja de agua en cultivos no limitados, en que la toxicidad se estima en función de los efectos sobre la tasa de crecimiento, sin depender del nivel absoluto de la tasa de crecimiento específico del control, de la pendiente de la curva concentración-respuesta ni de la duración del ensayo. Por el contrario, los resultados basados en la variable de respuesta «rendimiento» dependen de todas estas otras variables. La ECrx depende de la tasa de crecimiento específico de la especie de lenteja de agua utilizada en cada ensayo y de la tasa máxima de crecimiento específico, que puede variar de una especie a otra e incluso de un clon a otro. Esta variable de respuesta no debe utilizarse para comparar la sensibilidad de distintas especies, o incluso distintos clones, de lenteja de agua ante un agente tóxico. Aunque científicamente se prefiere el uso de la tasa media de crecimiento específico para estimar la toxicidad, en el presente método de ensayo se incluye también la estimación a partir del rendimiento para cumplir los requisitos normativos vigentes en ciertos países.

Las estimaciones de la toxicidad deben basarse en el número de frondas y en otra variable de medición más (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), porque ciertas sustancias pueden afectar a otras variables de medición mucho más que al número de frondas. Este efecto no se detectaría si solo se calculará el número de frondas.

El número de frondas y las otras variables de medición registradas (es decir, la superficie total de las frondas, el peso seco o el peso fresco), se tabulan junto con las concentraciones de esa sustancia problema correspondientes a cada punto de medición. Todo análisis posterior de los datos, por ejemplo para estimar la LOEC, NOEC o ECx, se basará en los valores de las distintas réplicas y no en los promedios calculados de cada grupo de tratamiento.

2.2.1. Tasa media de crecimiento específico

La tasa media de crecimiento específico correspondiente a un período específico se calcula como el incremento logarítmico de las variables de crecimiento, es decir, número de frondas y otra variable de medición (área total de las frondas, peso seco o peso fresco), aplicando la fórmula siguiente a cada réplica de control y de tratamiento:

donde:

Respecto a cada grupo de tratamiento y de control ha de calcularse un valor promedio de la tasa de crecimiento con una estimación de la varianza.

Debe calcularse la tasa media de crecimiento específico correspondiente a toda la duración del ensayo (el tiempo i en la fórmula anterior es el principio del ensayo y el tiempo j es el final del mismo). Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio de la tasa media de crecimiento específico con una estimación de la varianza. Por otra parte, debe considerarse la tasa de crecimiento de cada sección para evaluar el efecto de la sustancia problema presente durante el período de exposición (por ejemplo, examinando curvas logarítmicas de crecimiento). Una diferencia importante entre la tasa de crecimiento de cada sección y la tasa media de crecimiento indica una desviación respecto al crecimiento exponencial constante e impone el examen en detalle de las curvas de crecimiento. En este caso, un enfoque prudente sería comparar las tasas de crecimiento específico de cultivos tratados durante el tiempo de inhibición máxima con las correspondientes a los controles durante el mismo tiempo.

Después puede calcularse el porcentaje de inhibición en tasa de crecimiento (It) correspondiente a cada concentración de ensayo (grupo de tratamiento) aplicando la fórmula siguiente:

donde:

2.2.2. Rendimiento

Los efectos sobre el rendimiento se determinan a partir de dos variables de medición, el número de frondas y otra variable de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) observadas en cada recipiente de ensayo al inicio y al final del ensayo. En el caso del peso seco o del peso fresco, la biomasa inicial se determina a partir una muestra de frondas tomada del mismo lote utilizado para inocular los recipientes de ensayo (véase el párrafo segundo del punto 1.7.3). Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio del rendimiento con una estimación de la varianza. El porcentaje promedio de inhibición en rendimiento (% Iy) puede calcularse de la manera siguiente con cada grupo de tratamiento:

donde:

2.2.3. Trazado de las curvas concentración-respuesta

Se trazarán las curvas concentración-respuesta que relacionan el porcentaje promedio de inhibición de la variable de respuesta (Ir o Iy, calculado como se indica en el último párrafo del punto 2.2.1 o en el punto 2.2.2) con el logaritmo de la concentración de la sustancia problema

2.2.4. Estimación de ECx

Las estimaciones de ECx (por ejemplo, EC50) deben basarse tanto en la tasa media de crecimiento específico (ECtx) como en el rendimiento (ECrx), cada uno de los cuales debe basarse, a su vez, en el número de frondas y en una variable de medición más (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco). El motivo es que ciertas sustancias problema influyen de forma diferente en el número de frondas y en otras variables de medición. Por tanto, los parámetros buscados de la toxicidad son cuatro valores de ECx por cada nivel de inhibición x calculado: ECtx (número de frondas); ECtx (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco); ECrx (número de frondas); y ECrx (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco).

2.3. PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS

El objetivo es obtener una relación cuantitativa concentración-respuesta mediante análisis de regresión. Es posible utilizar una regresión lineal ponderada después de haber efectuado una linealización de los datos de respuesta como, por ejemplo, en probit o logit o unidades Weibull (16), pero son preferibles los procedimientos de regresión no lineal porque con ellos se tratan mejor las inevitables irregularidades de los datos y las desviaciones respecto a distribuciones suaves. Si la inhibición está próxima al 0 o al 100 %, la transformación puede magnificar tales irregularidades, interfiriendo así con el análisis (16). Debe señalarse que los métodos normales de análisis que utilizan las transformaciones en probit, logit o de Weibull están previstos para aplicarse a datos cuantales (por ejemplo, mortalidad o supervivencia), y que es necesario modificarlos para aplicarlos a datos de tasas de crecimiento o rendimiento. En las referencias (17), (18) y (19) pueden encontrarse métodos específicos de determinación de los valores de ECx a partir de datos continuos.

Respecto a cada variable de respuesta que haya de analizarse, se utilizará la relación concentración-respuesta para calcular estimaciones puntuales de los valores de ECx. Cuando sea posible, se determinarán los límites de confianza del 95 % de cada estimación. La bondad del ajuste de los datos de respuesta al modelo de regresión se evaluará de forma gráfica o estadística. El análisis de regresión se efectuará utilizando las respuestas de las distintas réplicas y no los promedios de los grupos de tratamiento.

Las estimaciones de la EC50 y los límites de confianza pueden obtenerse también utilizando la interpolación lineal con remuestreo (bootstrapping) (20) si los métodos o modelos de regresión disponibles no son adecuados para los datos.

Para la estimación de los valores de LOEC y, por tanto, de NOEC, es necesario comparar los promedios de tratamiento utilizando técnicas de análisis de la varianza (ANOVA). A continuación se ha de comparar el promedio obtenido a cada concentración con el del control, aplicando un método apropiado de comparación múltiple o de prueba de tendencia. Las pruebas de Dunnett o Williams pueden ser útiles (21) (22) (23) (24). Hay que comprobar si se sostiene la hipótesis del ANOVA de homogeneidad de la varianza. Esta comprobación puede realizarse gráficamente o mediante una prueba en regla (25). Son adecuadas las pruebas de Levene o Bartlett. El incumplimiento de la hipótesis de homogeneidad de las varianzas puede corregirse a veces mediante la transformación logarítmica de los datos. Si la heterogeneidad de la varianza es extrema y no puede corregirse mediante transformación, ha de considerarse la posibilidad de efectuar un análisis por métodos como las pruebas de tendencia de Jonkheere de ajuste secuencial de residuos. En la referencia (19) puede encontrarse más información sobre la determinación de la NOEC.

Los recientes avances científicos han llevado a recomendar el abandono del concepto de NOEC para sustituirlo por el de estimaciones puntuales de ECx basadas en la regresión. Aún no se ha determinado un valor adecuado de x para esta prueba con Lemna. Sin embargo, parece que es apropiado el intervalo del 10 al 20 % (según la variable de respuesta elegida) y lo mejor es indicar tanto la EC10 como la EC20.

3. INFORMES

3.1. INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

Sustancia problema:

Especie de ensayo:

Condiciones de ensayo:

Resultados:

4. BIBLIOGRAFÍA

Guidance on information requirements and chemical safety assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3, Summary of difficult substance testing issues, disponible en:

ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998), pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

Environment Canada (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37, 120 pp.

Environment Canada (1993). Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

Sims, I., Whitehouse, P., y Lacey, R. (1999). The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.

ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test.

Walbridge, C.T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

Lockhart, W.L., Billeck, B.N., y Baron, C.L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353-359.

Huebert, D.B., y Shay, J.M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

Nyholm, N., Sørensen, P.S., Kusk, K.O., y Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

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Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.

Brain, P., y Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Apéndice 1

Descripción de Lemna spp.

La planta acuática denominada vulgarmente lenteja de agua, Lemna spp., pertenece a la familia Lemnaceae, que tiene varias especies de distribución mundial recogidas en cuatro géneros. Se han descrito exhaustivamente sus diferencias de aspecto y taxonomía (1) (2). L. gibba y L. minor son especies representativas de las zonas templadas y se utilizan frecuentemente en estudios de toxicidad. Ambas especies tienen un tallo discoidal (fronda) flotante o sumergido y una raíz muy fina que sale del centro de la superficie inferior de cada fronda. Las especies de Lemna no suelen echar flores, y las plantas se reproducen vegetativamente haciendo nuevas frondas (3). En comparación con las plantas viejas, las jóvenes tienden a ser más pálidas, tener raíces más cortas y consistir en dos o tres frondas de distintos tamaños. El pequeño tamaño, la sencillez de la estructura, la reproducción asexual y el breve tiempo de generación de Lemna son características que convierten a las plantas de este género en idóneas para los ensayos de laboratorio (4) (5).

Debido a la probabilidad de que haya diferencias de sensibilidad entre las especies, solo son válidas las comparaciones de sensibilidad dentro de una misma especie.

Ejemplos de especies de Lemna que se utilizan en los ensayos: Referencias sobre las especies

L. aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

L. major: Clark, N.A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

L. minor: United States Environmental Protection Agency (USEPA) (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., «Public draft». EPA 712-C-96-156, 8 pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l’inhibition de la croissance de Lemna minor, 10 pp.

Swedish Standards Institute (SIS) (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) L. minor, duckweed. SS 02 82 13, 15 pp. (en sueco).

L. gibba: ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With L. gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998), pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (USEPA) (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., «Public draft». EPA 712-C-96-156, 8 pp.

L. paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

L. perpusilla: Clark, J.R., et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

L. trisulca: Huebert, D.B., Shay, J.M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.

L. valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Fuentes de especies de Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria Department of Botany, University of Toronto, Toronto, Ontario CANADÁ, M5S 3 B2 Tel. (1-416) 978 36 41 Fax (1-416) 978 58 78 Dirección electrónica: jacreman@botany.utoronto.ca http://www.botany.utoronto.ca/utcc

North Carolina State University Forestry Dept Duckweed Culture Collection Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695-8002 ESTADOS UNIDOS Tel. (001-919) 515 75 72 Dirección electrónica: astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University SE-106 91 Estocolmo SUECIA Tel. (46-8) 674 72 40 Fax (46-8) 674 76 36

Umweltbundesamt (UBA) FG III 3.4 Schichauweg 58 12307 Berlín ALEMANIA Dirección electrónica: lemna@uba.de http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm

Bibliografía

(1) Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae), vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zúrich, Suiza.

(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.