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Apéndice

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE LECHE DE VACA Y DE CASEINATO DE LECHE DE VACA EN QUESOS DE LECHE DE OVEJA, LECHE DE CABRA O LECHE DE BÚFALA, O MEZCLAS DE LECHE DE OVEJA, CABRA Y BÚFALA

1. OBJETO

Detección de leche de vaca y de caseinato de leche de vaca en quesos de leche de oveja, leche de cabra o leche de búfala, o mezclas de leche de oveja, cabra y búfala, mediante isoelectroenfoque de γ-caseínas tras plasminólisis.

2. ÁMBITO DE APLICACIÓN

El método es adecuado para la detección sensible y específica de leche de vaca y de caseinato de leche de vaca, tanto crudo como con tratamiento térmico, en quesos frescos y madurados elaborados con leche de oveja, leche de cabra o leche de búfala, o mezclas de leche de oveja, cabra y búfala. No es adecuado para la detección de la adulteración de leche y queso con concentrados de proteínas de suero de leche de bovino tratados térmicamente.

3. PRINCIPIO DEL MÉTODO

3.1. Aislamiento de caseínas de queso y patrones de referencia

3.2. Disolución de las caseínas aisladas y ruptura con plasmina (EC.3.4.21.7)

3.3. Isoelectroenfoque de las caseínas tratadas con plasmina en presencia de urea y tinción de las proteínas

3.4. Evaluación de las manchas teñidas de γ3 y γ2-caseína (prueba de la presencia de leche de vaca) comparando las manchas obtenidas de la muestra con las producidas en el mismo gel por los patrones de referencia que contienen 0 % y 1 % de leche de vaca

4. REACTIVOS

A menos que se indique lo contrario, se utilizarán sustancias de grado analítico. Debe utilizarse agua bidestilada o de pureza equivalente.

Nota: los datos siguientes se refieren a geles de poliacrilamida con urea, preparados en el laboratorio, de unas dimensiones de 265 × 125 × 0,25 mm. Si se utilizan geles de otro tipo o dimensiones, es posible que deban modificarse las condiciones de separación.

Isoelectroenfoque

4.1. Reactivos para la obtención de los geles de poliacrilamida con urea

4.1.1. Solución de gel madre

Se disuelven:

4,85 g de acrilamida

0,15 g de N,N′-metilen-bis-acrilamida (BIS)

48,05 g de urea

15,00 g de glicerol (87 % p/p),

en agua; se lleva a 100 ml y se guarda en un frasco de vidrio topacio en el frigorífico.

Nota: puede utilizarse una solución de acrilamida/BIS premezcladas, presente en el comercio, en vez de los pesos fijos indicados de las acrilamidas neurotóxicas. Si una solución de este tipo contiene un 30 % p/v de acrilamida y un 0,8 % p/v de BIS, deberá utilizarse para la formulación un volumen de 16,2 ml, en lugar de los pesos fijos. El plazo de validez de la solución madre es como máximo de 10 días; si su conductividad es superior a 5 μS, debe desionizarse agitando con 2 g de amberlita MB-3 durante 30 minutos, y filtrarse después por una membrana de 0,45 μm.

4.1.2. Solución de gel

Se prepara una solución de gel mezclando aditivos y anfolitos (*) con la solución de gel madre (véase 4.1.1):

9,0 ml de solución madre

24 mg de β-alanina

500 μl de anfólito pH 3,5-9,5

250 μl de anfólito pH 5-7

250 μl de anfólito pH 6-8

Se mezcla la solución de gel y se desgasifica durante dos o tres minutos en un baño de ultrasonidos o en vacío.

Nota: la solución de gel se prepara justo antes de verterla (véase 6.2).

4.1.3. Soluciones catalizadoras

4.1.3.1. N,N,N′,N′-tetrametiletilendiamina (Temed)

4.1.3.2. Persulfato amónico al 40 % p/v (PER):

Se disuelven 800 mg de PER en agua y se completa hasta 2 ml.

Nota: debe utilizarse siempre una solución de PER recién preparada.

4.2. Líquido de contacto

Queroseno o parafina líquida

4.3. Solución anódica

Se disuelven 5,77 g de ácido fosfórico (85 % p/p) en agua y se diluye hasta 100 ml.

4.4. Solución catódica

Se disuelven 2,00 g de hidróxido sódico en agua y se diluye hasta 100 ml con agua.

Preparación de la muestra

4.5. Reactivos para el aislamiento de las proteínas

4.5.1. Ácido acético diluido (25,0 ml de ácido acético glacial llevados a 100 ml con agua)

4.5.2. Diclorometano

4.5.3. Acetona

4.6. Amortiguador de disolución de proteínas

Se disuelven:

5,75 g de glicerol (87 % p/p)

24,03 g de urea

250 mg de ditiotreitol

en agua y se completa hasta 50 ml.

Nota: se debe conservar en frigorífico durante un plazo máximo de una semana.

4.7. Reactivos para la ruptura con plasmina de las caseínas

4.7.1. Amortiguador de carbonato amónico

Se ajusta a pH 8 una solución de hidrogenocarbonato amónico 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml de agua) que contiene 0,05 mol/l de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 1,46 g/100 ml) con una solución de carbonato amónico 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml de agua) que contiene 0,05 mol/l de EDTA.

4.7.2. Plasmina bovina (EC. 3.4.21.7), con una actividad mínima de 5 U/ml

4.7.3. Solución de ácido ε-aminocaproico para inhibición enzimática

Se disuelven 2,624 g de ácido ε-aminocaproico (ácido 6-amino-n-hexanoico) en 100 ml de etanol del 40 % (v/v).

4.8. Patrones

4.8.1. En el Instituto de Medidas y Materiales de Referencia de la Comisión, B-2440 Geel, Bélgica, pueden conseguirse patrones de referencia certificados de una mezcla de leche desnatada cuajada de oveja y de cabra, con un 0 % y un 1 % de leche de vaca.

4.8.2. Preparación de patrones provisionales de laboratorio de leche cuajada de búfala con un 0 % y un 1 % de leche de vaca.

Se prepara la leche desnatada mediante centrifugación de leche cruda de vaca o de búfala a granel a 37 °C a 2 500 g durante 20 minutos. Tras enfriar el tubo y su contenido rápidamente a 6-8 °C, se elimina completamente la capa grasa superior. Para la preparación del patrón del 1 %, se añaden 5,00 ml de leche desnatada de vaca a 495 ml de leche desnatada de búfala en un vaso de 1 litro y se ajusta el pH a 6,4 mediante adición de ácido láctico diluido (10 % p/v). Se ajusta la temperatura a 35 °C y se añaden 100 μl de cuajo de ternero (actividad del cuajo 1:10 000, aprox. 3 000 U/ml), se agita durante 1 minuto y se deja el vaso en reposo, cubierto con lámina de aluminio, a 35 °C durante 1 hora, para que se pueda formar la cuajada. Una vez formada esta, se liofiliza toda la leche cuajada, sin que haya previamente homogeneización ni eliminación del suero. Tras la liofilización, se tritura bien para obtener un polvo homogéneo. Para la preparación del patrón del 0 %, se sigue el mismo procedimiento utilizando leche desnatada pura de búfala. Los patrones deben conservarse a – 20 °C.

Nota: es conveniente comprobar la pureza de la leche de búfala mediante isoelectroenfoque de las caseínas tratadas con plasmina antes de la preparación de los patrones.

Reactivos de tinción de proteínas

4.9. Fijador

Se disuelven 150 g de ácido tricloroacético en agua y se lleva a 1 000 ml.

4.10. Solución decolorante

Se diluyen 500 ml de metanol y 200 ml de ácido acético glacial hasta 2 000 ml con agua destilada.

Nota: la solución decolorante debe prepararse cada día; puede hacerse mezclando volúmenes iguales de soluciones madre de metanol del 50 % (v/v) y de ácido acético glacial del 20 % (v/v).

4.11. Soluciones colorantes

4.11.1. Solución colorante (solución madre 1)

Se disuelven 3,0 g de azul brillante Coomassie G 250 (C.I.42655) en 1 000 ml de metanol del 90 % (v/v) utilizando un agitador magnético (durante unos 45 minutos) y se filtra a través de dos filtros de pliegues de velocidad media.

4.11.2. Solución colorante (solución madre 2)

Se disuelven 5,0 g de sulfato de cobre pentahidratado en 1 000 ml de ácido acético del 20 % (v/v).

4.11.3. Solución colorante (solución de trabajo)

Se mezclan 125 ml de cada una de las soluciones madre (4.11.1, 4.11.2), justo antes de realizar la tinción.

Nota: la solución colorante solo debe utilizarse el mismo día en que se haya preparado.

5. EQUIPO

5.1. Placas de vidrio (265 × 125 × 4 mm); rodillo de caucho (15 cm de ancho); mesa de nivelación

5.2. Hoja de soporte del gel (265 × 125 mm)

5.3. Hoja de cobertura (280 × 125 mm). Se pega una tira de cinta adhesiva (280 × 6 × 0,25 mm) a cada uno de los bordes largos (véase la figura 1).

5.4. Cámara de electroenfoque con placa de refrigeración (por ejemplo, 265 × 125 mm) con fuente de alimentación adecuada (≥ 2,5 kV) o equipo automático de electroforesis

5.5. Criostato de circulación, termostatizado a 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrífuga, ajustable a 3 000 g

5.7. Tiras de electrodos (≥ 265 mm de longitud)

5.8. Frascos de plástico para el goteo de las soluciones anódica y catódica

5.9. Aplicadores de la muestra (10 × 5 mm, papel de filtro de escasa adsorción de proteínas o viscosa)

5.10. Placas de cristal o acero inoxidable para teñir y decolorar (por ejemplo, bandejas de instrumentos de 280 × 150 mm)

5.12. Homogeneizador de varilla ajustable (10 mm de diámetro del cilindro, velocidad entre 8 000 y 20 000 rpm)

5.13. Agitador magnético

5.14. Baño ultrasónico

5.15. Soldador de películas

5.16. Micropipetas de 25 μl

5.17. Concentrador a vacío o liofilizador

5.18. Baño María termostatizado a 35 y 40 ± 1 °C con agitador

5.19. Equipo de densitometría capaz de medir a λ = 634 nm

6. PROCEDIMIENTO

6.1. Preparación de la muestra

6.1.1. Aislamiento de las caseínas

Se pesa la cantidad equivalente a 5 g de peso seco de queso o de patrón de referencia en un tubo de centrífuga de 100 ml, se añaden 60 ml de agua destilada y se homogeneiza con un homogeneizador de varilla (8 000-10 000 rpm). Se ajusta el pH a 4,6 con ácido acético diluido (4.5.1) y se centrifuga (5 minutos, 3 000 g). Se decantan la grasa y el suero, se homogeneiza el residuo a 20 000 rpm en 40 ml de agua destilada [con el pH ajustado a 4,5 con ácido acético diluido (4.5.1)], se añaden 20 ml de diclorometano (4.5.2), se homogeneiza de nuevo y se centrifuga (5 minutos, 3 000 g). Con una espátula se extrae la capa de caseína que se halla entre las fases acuosa y orgánica (véase la figura 2) y se decantan ambas fases. Se vuelve a homogeneizar la caseína en 40 ml de agua destilada (véase más arriba) y 20 ml de diclorometano (4.5.2), y se centrifuga. Se repite esta operación hasta que las dos fases de extracción sean incoloras (2 o 3 veces). Se homogeneiza el residuo de proteína con 50 ml de acetona (4.5.3) y se pasa a través de un filtro de papel de pliegues de velocidad media. Se lava dos veces el residuo que queda en el filtro con 25 ml de acetona cada vez, y se deja secar al aire o en corriente de nitrógeno; después se pulveriza bien en mortero.

Nota: la caseína aislada seca debe conservarse a – 20 °C.

6.1.2. Ruptura de las β-caseínas con plasmina para intensificar las γ-caseínas

Se suspenden 25 mg de caseínas aisladas (6.1.1) en 0,5 ml de solución amortiguadora de carbonato amónico (4.7.1) y se homogeneiza durante 20 minutos, por ejemplo con ultrasonidos. Se calienta a 40 °C y se añaden 10 μl de plasmina (4.7.2), se mezcla y se incuba durante una hora a 40 °C sin dejar de agitar. Para inhibir la enzima se añaden 20 μl de solución de ácido ε-aminocaproico (4.7.3) y se añaden después 200 mg de urea sólida y 2 mg de ditiotreitol.

Nota: para obtener mayor simetría en las bandas de caseína enfocada, es conveniente liofilizar la solución tras añadir el ácido ε-aminocaproico y disolver después el residuo en 0,5 ml de solución amortiguadora de disolución de proteínas (4.6).

6.2. Preparación de los geles de poliacrilamida con urea

Con ayuda de unas cuantas gotas de agua, se extiende la hoja de soporte del gel (5.2) sobre una placa de vidrio (5.1), y se elimina el exceso de agua con toallas o pañuelos de papel. Se extiende la hoja de cobertura (5.3) con espaciadores (0,25 mm) sobre otra placa de vidrio de la misma forma. Se coloca la placa horizontalmente sobre una mesa de nivelación.

Se añaden 10 μl de Temed (4.1.3.1) a la solución de gel preparada y desgasificada (4.1.2), se agita y se añaden 10 μl de solución de PER (4.1.3.2), se mezcla bien y se vierte de inmediato y uniformemente en el centro de la hoja de cobertura. Se coloca un extremo de la placa de soporte del gel (con la cara de la hoja hacia abajo) sobre la placa de la hoja de cobertura y se baja lentamente de manera que se forme una película de gel entre las hojas, extendiéndose de forma regular y sin burbujas (figura 3). Con una fina espátula se hace bajar cuidadosa y completamente la placa de soporte del gel y se colocan otras tres placas de vidrio encima para que actúen de peso. Una vez completada la polimerización (alrededor de 60 minutos), se extrae el gel polimerizado sobre la hoja de soporte del gel junto con la hoja de cobertura, dando golpecitos en las placas de vidrio. Se limpia cuidadosamente el revés de la hoja de soporte para eliminar los residuos de gel y la urea. Se suelda el “emparedado de gel” para formar un tubo de película, y se guarda en frigorífico (durante 6 semanas como máximo).

Nota: la hoja de cobertura con los espaciadores puede volver a utilizarse. El gel de poliacrilamida puede cortarse en trozos más pequeños, lo que es recomendable cuando hay pocas muestras o si se utiliza un equipo automático de electroforesis (dos geles de 4,5 × 5 cm).

6.3. Isoelectroenfoque

Se gradúa el termostato de refrigeración a 12 °C. Se frota el revés de la hoja de soporte del gel con queroseno y después se dejan caer unas cuantas gotas de queroseno (4.2) sobre el centro del bloque de refrigeración. Se extiende encima el “emparedado de gel”, con la cara del soporte hacia abajo, con cuidado para evitar la formación de burbujas. Se enjuga el exceso de queroseno y se quita la hoja de cobertura. Se empapan las tiras de los electrodos con las soluciones electródicas (4.3 y 4.4), se cortan para ajustarlas a la longitud del gel y se colocan en los lugares previstos (a 9,5 cm de distancia de los electrodos).

Condiciones del isoelectroenfoque:

6.3.1. Tamaño del gel: 265 × 125 × 0,25 mm

Etapa Tiempo (min) Tensión (V) Intensidad de corriente (mA) Potencia (W) Voltios-hora (Vh) 1. Pre-enfoque 30 máxima 2 500 máxima 15 constante 4 aprox. 300 2. Enfoque de la muestra (7) 60 máxima 2 500 máxima 15 constante 4 aprox. 1 000 3. Enfoque final 60 máxima 2 500 máxima 5 máxima 20 aprox. 3 000 40 máxima 2 500 máxima 6 máxima 20 aprox. 3 000 30 máxima 2 500 máxima 7 máxima 25 aprox. 3 000

Nota: si se modifica el espesor o la anchura de los geles, habrá que ajustar convenientemente los valores de intensidad y potencia (por ejemplo, habrá que duplicar los valores de intensidad de corriente eléctrica y de potencia si se utiliza un gel de 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Ejemplo de programa de tensión para un equipo automático de electroforesis (2 geles de 5,0 × 4,5 cm), cuyos electrodos sin tiras se aplican directamente al gel

Etapa Tensión Intensidad de corriente Potencia Temperatura Voltios-hora 1. Pre-enfoque 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Enfoque de la muestra 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Enfoque 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Enfoque 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

El aplicador de muestra se coloca en la etapa 2 a 0 Vh.

El aplicador de muestra se retira en la etapa 2 a 30 Vh.

6.4. Tinción de las proteínas

6.4.1. Fijación de las proteínas

Se retiran las tiras de los electrodos inmediatamente después de cortar la corriente y se pone el gel inmediatamente en un recipiente de tinción/decoloración con 200 ml de fijador (4.9); se deja durante 15 minutos, agitando continuamente.

6.4.2. Lavado y tinción de la placa de gel

Se escurre totalmente el fijador y se lava la placa de gel dos veces durante 30 segundos cada vez con 100 ml de solución decolorante (4.10). Se retira la solución decolorante y se llena el recipiente con 250 ml de solución colorante (4.11.3); se tiñe durante 45 minutos con agitación suave.

6.4.3. Decoloración de la placa de gel

Se retira la solución colorante, se lava la placa de gel dos veces con 100 ml de solución decolorante (4.10) cada vez; después se agita durante 15 minutos con 200 ml de solución decolorante y se repite la etapa de decoloración al menos 2 o 3 veces hasta que el fondo se vea claro e incoloro. A continuación, se enjuaga la placa de gel con agua destilada (2 × 2 minutos) y se deja secar al aire (de 2 a 3 horas) o con un secador de pelo (de 10 a 15 minutos).

Nota 1: la fijación, el lavado, la tinción y la decoloración se deben realizar a 20 °C. No deben emplearse temperaturas elevadas.

Nota 2: si se prefiere utilizar una tinción de plata (por ejemplo, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Código n.o 17-1150-01), de mayor sensibilidad, las muestras de caseína tratadas con plasmina deben diluirse a 5 mg/ml.

7. EVALUACIÓN

La evaluación se realiza comparando las manchas de proteínas de la muestra desconocida con los patrones de referencia en el mismo gel. La detección de leche de vaca en quesos de leche de oveja, leche de cabra y leche de búfala o sus mezclas se realiza por medio de las γ3- y γ2-caseínas, cuyos puntos isoeléctricos se sitúan entre los pH 6,5 y 7,5 (figuras 4a, 4b y 5). El límite de detección es inferior al 0,5 %.

7.1. Estimación visual

Para la evaluación visual de la cantidad de leche de vaca es conveniente ajustar las concentraciones de las muestras y patrones para obtener el mismo nivel de intensidad de las γ2- y γ3-caseínas de oveja, cabra y búfala (véase “γ2 E,G,B” y “γ3 E,G,B”, en las figuras 4a, 4b y 5). A continuación podrá evaluarse directamente la cantidad de leche de vaca (menor, igual o mayor que el 1 %) en la muestra desconocida comparando la intensidad de las γ3- y γ2-caseínas de vaca (véase “γ3 C” y “γ2 C” en las figuras 4a, 4b y 5) con las de los patrones de referencia del 0 % y el 1 % (oveja, cabra) o con los patrones provisionales de laboratorio (búfala).

7.2. Estimación densitométrica

Cuando sea posible, se aplica la densitometría (5.19) para determinar la relación de las áreas de los picos de las γ2- y γ3-caseínas de vaca con respecto a las de oveja, cabra y búfala (véase la figura 5). Este valor se compara con la relación de las áreas de los picos de las γ2- y γ3-caseínas del patrón de referencia del 1 % (oveja, cabra) o del patrón provisional de laboratorio (búfala) analizados en el mismo gel.

Nota: el método funciona satisfactoriamente si se encuentra una señal positiva clara de las dos caseínas de vaca (γ2 y γ3) en el patrón de referencia del 1 % pero no en el del 0 %. En caso contrario, deberá optimizarse el procedimiento respetando los detalles del método con precisión.

Una muestra se considerará positiva cuando las dos caseínas de vaca (γ2 y γ3) o las relaciones de las áreas de los picos correspondientes sean iguales o superiores al nivel del patrón de referencia del 1 %.

8. BIBLIOGRAFÍA

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: “Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins”. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: “A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting”. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: “Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier”. En: “Electrophoresis-Forum 89” (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: “Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen”. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: “Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films”. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figura 1

Esquema de la hoja de cobertura

Figura 2

Capa de caseína flotando entre las fases acuosa y orgánica tras la centrifugación

Figura 3

Técnica de inclinación para moldear geles ultrafinos de poliacrilamida

a = cinta espaciadora (0,25 mm); b = hoja de cobertura (5.3); c, e = placas de vidrio (5.1); d = solución de gel (4.1.2); f = hoja de soporte de gel (5.2)

Figura 4a

Isoelectroenfoque de caseínas tratadas con plasmina de queso elaborado con leche de oveja y cabra con cantidades diferentes de leche de vaca

% CM = porcentaje de leche de vaca, C = vaca, E = oveja, G = cabra

Se muestra la mitad superior del gel de IEF.

Figura 4b

Isoelectroenfoque de caseínas tratadas con plasmina de queso elaborado con mezclas de leche de oveja, cabra y búfala con cantidades diferentes de leche de vaca

% CM = porcentaje de leche de vaca; 1 + = muestra que contiene un 1 % de leche de vaca en la que se ha inyectado caseína pura de vaca a mitad del recorrido; C = vaca, E = oveja, G = cabra, B = búfala.

Se muestra la distancia de separación total del gel de IEF.

Figura 5

Superposición de densitogramas de patrones (STD) y muestras de quesos elaborados con una mezcla de leche de oveja y cabra tras el isoelectroenfoque

a, b = patrones con 0 % y 1 % de leche de vaca; c-g = muestras de quesos con 0, 1, 2, 3 y 7 % de leche de vaca; C = vaca, E = oveja, G = cabra.

La mitad superior del gel de IEF se leyó a λ = 634 nm.