ANEXO III

Muestreo y pruebas a que se refiere el artículo 4, apartado 7

1. El muestreo y las pruebas para las prospecciones de detección oficiales a que se refiere el artículo 4, apartados 1 y 2, se llevarán a cabo como sigue: el muestreo se realizará con una muestra de suelo de un porcentaje estándar de 1 500 ml de suelo/ha como mínimo, recogida a partir de 100 calas/ha al menos, preferiblemente en una malla rectangular de 5 m de ancho como mínimo y 20 m de largo como máximo entre puntos de muestreo que cubran la totalidad del sitio de producción. Para la realización de exámenes complementarios, a saber, extracción de quistes, identificación de especies y, si procede, determinación del patotipo/grupo de virulencia, se utilizará la totalidad de la muestra. Pruebas que aplican los siguientes métodos para la extracción de la plaga especificada, que se describen en los protocolos de diagnóstico validados y reconocidos internacionalmente pertinentes: a) por lo que se refiere a la extracción, métodos basados en el embudo de Fenwick, la centrífuga de Schuiling, el elutriador de Seinhorst o el elutriador de Kort; b) por lo que se refiere a la detección e identificación, uno de los siguientes: i) aislamiento de los quistes de Globodera de los restos sobre la base de la morfología del quiste, seguido de la identificación de la especie basada en la morfología de quistes y juveniles individuales, combinada con la prueba PCR convencional basada en Bulman & Marshall, 1997 (1) (en caso de duda sobre la presencia de G. tabacum, puede realizarse la prueba PCR convencional basada en Skantar et al., 2007 (2) adicionalmente), ii) aislamiento de los quistes de Globodera de los restos sobre la base de la morfología del quiste, seguido de la identificación de la especie basada en la morfología de quistes y juveniles individuales, combinada con la PCR en tiempo real basada en Gamel et al., 2017 (3), iii) aislamiento de los quistes de nematodos de los restos, seguido de la detección de la especie con PCR en tiempo real basada en Gamel et al., 2017 (3).

2. El muestreo para la prospección de seguimiento oficial a que se refiere el artículo 7 se llevará a cabo de conformidad con una de las condiciones siguientes: a) el muestreo mencionado en el punto 1, con un porcentaje mínimo para la muestra de suelo de al menos 400 ml/ha, b) un muestreo selectivo de al menos 400 ml de suelo tras el examen visual de raíces que presenten síntomas visibles, o c) un muestreo de al menos 400 ml de suelo que haya estado en contacto con las patatas, tras la cosecha, siempre que se pueda determinar el sitio de producción en que se cultivaron las patatas. Las pruebas para la prospección de seguimiento oficial a que se refiere el artículo 7 se llevarán a cabo de conformidad con el punto 1.

3. No obstante lo dispuesto en el punto 1, el índice de muestreo estándar podrá reducirse a un mínimo de 400 ml de suelo/ha en cada uno de los casos siguientes: a) cuando existan pruebas documentales de que no se han cultivado patatas o vegetales mencionados en el punto 1 del anexo I, ni se ha constatado su presencia en el sitio de producción durante los seis años anteriores a la prospección de detección oficial; b) cuando no se haya detectado ningún espécimen de la plaga especificada durante las dos últimas prospecciones de detección oficiales sucesivas en muestras de 1 500 ml de suelo/ha y no se hayan cultivado patatas o vegetales mencionados en el punto 1 del anexo I, salvo aquellos que requieran una investigación oficial con arreglo al artículo 4, apartado 1, tras la realización de la primera prospección de detección oficial; c) cuando no se hayan detectado especímenes de la plaga especificada o quistes de la plaga especificada sin contenido vivo en la última prospección de detección oficial, en la que se habrá tenido en cuenta una muestra de un tamaño mínimo de 1 500 ml de suelo/ha, y no se hayan cultivado en el sitio de producción patatas o vegetales mencionados en el punto 1 del anexo I, salvo aquellos que requieran una investigación oficial con arreglo al artículo 4, apartado 1, desde la última prospección de detección oficial.

4. El porcentaje de muestreo podrá reducirse en las parcelas de más de 8 ha y 4 ha, respectivamente, en cada uno de los casos siguientes: a) en el caso del porcentaje de muestra contemplado en el punto 1, las primeras 8 ha se seleccionarán al porcentaje especificado en el mismo, pero podrá reducirse para cada hectárea adicional hasta un mínimo de 400 ml de suelo/ha; b) en el caso del porcentaje reducido contemplado en el punto 3, las primeras 4 ha se seleccionarán al porcentaje especificado en el mismo, pero podrá reducirse para cada hectárea adicional hasta un mínimo de 200 ml de suelo/ha.

5. En las prospecciones de detección oficiales posteriores a las que se hace referencia en el artículo 3, apartado 1, podrá seguir utilizándose la muestra reducida contemplada en los puntos 3 y 4, siempre y cuando no se detecten las plagas especificadas en el sitio de producción en cuestión.

6. El tamaño estándar de la muestra de suelo podrá reducirse hasta un mínimo de 200 ml de suelo/ha siempre que el sitio de producción esté localizado en una zona declarada libre de la plaga especificada, y designada, mantenida y vigilada con arreglo a las correspondientes Normas internacionales para las medidas fitosanitarias (NIMF n.o 4) (4).

7. El tamaño mínimo de la muestra de suelo será en todos los casos de 200 ml de suelo por sitio de producción.

(1) Bulman, S.R. & Marshall, J.W. (1997). Differentiation of Australasian potato cyst nematode (PCN) populations using the Polymerase Chain Reaction (PCR). New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 25, 123-129.

(2) Skantar, A.M., Handoo, Z.A., Carta, L.K., Chitwood, D.J. (2007). Morphological and molecular identification of Globodera pallida associated with Potato in Idaho. Journal of Nematology 39(2), 133-144.

(3) Gamel, S., Letort A., Fouville D., Folcher L., Grenier E. (2017). Development and validation of real-time PCR assays based on novel molecular markers for the simultaneous detection and identification of Globodera pallida, G. rostochiensis and Heterodera schachtii. Nematology 19(7):789-804.

(4) NIMF n.o 4. 1995. Requirements for the establishment of pest free areas. Roma, CIPF, FAO. https://www.ippc.int/en/publications/614/.