ANEXO I

Régimen de las pruebas que deben realizarse de conformidad con los artículos 3, 4, 5, 7 y 8

1. PRINCIPIOS GENERALES SOBRE LA PRESENCIA DE LA PLAGA ESPECIFICADA

1.1. Se sospechará la presencia de la plaga especificada cuando se obtenga un resultado positivo en la primera prueba de detección realizada en el vegetal especificado. En el caso del material vegetal sintomático, la primera prueba de detección puede ser un aislamiento selectivo.

1.2. Se confirma la presencia de la plaga especificada en muestras sintomáticas de los vegetales especificados en los siguientes casos: a) cuando la primera prueba de detección sea un aislamiento selectivo que haya dado lugar a colonias con morfología típica: si se obtienen resultados positivos en dos pruebas de identificación; b) cuando la primera prueba de detección sea distinta de la prueba de aislamiento selectivo: i) si se obtienen resultados positivos en dos pruebas de identificación después de que la muestra haya sido sometida a aislamiento selectivo; ii) si se obtienen resultados positivos en una segunda prueba de detección distinta de un aislamiento selectivo.

1.3. Se confirma la presencia de la plaga especificada en muestras asintomáticas de los vegetales especificados en los siguientes casos: a) cuando se obtenga un resultado positivo en la segunda prueba de detección, siempre que la primera o la segunda prueba de detección sea una prueba molecular (basada en el ADN) (PCR TaqMan® en tiempo real o PCR convencional); b) en el caso de las muestras tomadas en un Estado miembro o en una zona de un Estado miembro en que no se tiene constancia de la presencia de la plaga especificada, y en el caso de las muestras procedentes de otro Estado miembro: cuando se obtenga un resultado positivo en la segunda prueba de detección de conformidad con la letra a) y se obtengan resultados positivos en dos pruebas de identificación realizadas después de que la muestra haya sido sometida a aislamiento selectivo.

2. PRUEBAS

2.1. Pruebas de detección

Las pruebas de detección deberán permitir detectar sistemáticamente al menos 104 células por ml de precipitado resuspendido.

La segunda prueba de detección se basará en principios biológicos o regiones de nucleótidos distintos de los de la primera prueba de detección.

Las pruebas de detección son las siguientes:

a) pruebas de inmunofluorescencia, según se describen en las normas internacionales de diagnóstico;

b) una prueba FISH [van Beuningen et al. (1995) (1)], según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

c) aislamiento, según se describe en las normas internacionales de diagnóstico. Se llevará a cabo una de las dos opciones siguientes: i) el aislamiento directo en medios de crecimiento semiselectivos (o no selectivos), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico; ii) tras el enriquecimiento a través del bioensayo, el aislamiento, según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

d) prueba PCR convencional, utilizando los cebadores de Pastrik (2000) (2), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

e) pruebas PCR TaqMan® en tiempo real, utilizando los cebadores y las sondas de: i) Schaad et al. (1999) (3), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (la prueba conocida como «NYtor test»), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico; iii) Gudmestad et al. (2009), como adaptaron Vreeburg et al. (2018)4, según se describen en las normas internacionales de diagnóstico; iv) Massart et al. (2014) (5), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico.

2.2. Pruebas de identificación

Las pruebas de identificación son las siguientes:

a) una prueba de inmunofluorescencia, según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

b) una prueba PCR convencional [Pastrik (2000)], según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

c) pruebas PCR TaqMan® en tiempo real, utilizando los cebadores y las sondas de: i) Schaad et al. (1999), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico; ii) Vreeburg et al. (2018) (la prueba conocida como «NYtor test»), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico; iii) Gudmestad et al. (2009), como adaptaron Vreeburg et al. (2018), según se describe en las normas internacionales de diagnóstico; iv) Massart et al. (2014), según se describen en las normas internacionales de diagnóstico;

d) código de barras del ADN, según se describe en las normas internacionales de diagnóstico;

e) espectrometría de masas MALDI-TOF [Zaluga et al. (2011) (6)], según se describe en las normas internacionales de diagnóstico.

3. DIAGRAMAS DE FLUJO DE LOS PROCEDIMIENTOS

Diagrama de flujo n.o 1: Procedimiento para diagnosticar la presencia de la plaga especificada en muestras sintomáticas del vegetal especificado.

a El aislamiento puede utilizarse como primera o segunda prueba de detección. Si se sospecha la presencia de la plaga especificada en el medio de crecimiento, se purificarán las colonias para obtener cultivos puros en los que se realizarán dos pruebas de identificación. Para confirmar la presencia de la plaga, se requieren resultados positivos en las dos pruebas de identificación.

b La tercera prueba de detección se basará en principios biológicos diferentes o regiones de nucleótidos diferentes.

Diagrama de flujo n.o 2: Procedimiento para diagnosticar la plaga especificada en muestras asintomáticas del vegetal especificado.

a No se utilizará el aislamiento.

b La tercera prueba de detección se basará en principios biológicos diferentes o regiones de nucleótidos diferentes. No se utilizará el aislamiento.

c En el caso de las muestras mencionadas en el punto 1.3, letra b), la confirmación de la presencia de la plaga especificada tras la segunda prueba de detección positiva requiere el aislamiento de la plaga especificada de la muestra, seguido de dos pruebas de identificación positivas.

4. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

4.1. Muestras de tubérculos asintomáticos

La muestra tipo contendrá 200 tubérculos por prueba. El procedimiento de laboratorio adecuado para procesar las cuñas de la parte basal a fin de obtener el extracto para la detección de la plaga especificada se describe en las normas internacionales de diagnóstico.

4.2. Muestras de material vegetal asintomático distinto de los tubérculos

La detección de infecciones latentes se llevará a cabo en muestras globales de segmentos de los tallos. El procedimiento puede aplicarse a un máximo de 200 segmentos de los tallos de distintos vegetales en una sola muestra. El procedimiento de laboratorio adecuado para desinfectar y procesar los segmentos de los tallos a fin de obtener el extracto para la detección de la plaga especificada se describe en las normas internacionales de diagnóstico.

4.3. Muestras de los vegetales especificados sintomáticos

Las secciones de tejido se retirarán asépticamente del anillo vascular de un tubérculo o de los haces vasculares de los tallos de los vegetales especificados que presenten síntomas de marchitez. El procedimiento de laboratorio adecuado para procesar estos tejidos a fin de obtener el extracto para la detección de la plaga especificada se describe detalladamente en las normas internacionales de diagnóstico.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266-269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detección de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en tubérculos de patata mediante PCR multiplex con coamplificación del ADN huésped. European Journal of Plant Pathology 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D. (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validación de cuatro PCR TaqMan© en tiempo real para la detección de Ralstonia solanacearum y/o Ralstonia pseudosolanacearum y/o Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en tubérculos de patata mediante un enfoque de regresión estadística. EPPO Bulletin 48, 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Desarrollo de la detección simultánea de Ralstonia solanacearum, raza 3, y Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en tubérculos de patata mediante una prueba PCR multiplex en tiempo real. European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400-407. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.