3)

Se añaden los siguientes capítulos: «B.49. ENSAYO DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULAS DE MAMÍFERO IN VITRO INTRODUCCIÓN 1. El ensayo de micronúcleos in vitro (MNvit) es un ensayo de genotoxicidad para la detección de micronúcleos (MN) en el citoplasma de células en interfase. Los micronúcleos pueden proceder de fragmentos cromosómicos acéntricos (es decir, que carecen de centrómero) o de cromosomas completos que no pueden migrar a los polos durante la anafase de la división celular. El ensayo detecta la actividad de productos químicos clastogénicos y aneugénicos (sustancias y mezclas) (1) (2) en células que han sufrido la división celular durante la exposición a la sustancia problema o después de la misma. El presente método de ensayo (ME) permite el uso de protocolos con y sin citocalasina B (citoB), que es un inhibidor de la polimerización de la actina. La adición de citoB antes de la mitosis diana permite la identificación y el análisis selectivo de la frecuencia de micronúcleos en las células que han completado una sola mitosis porque dichas células son binucleadas (3) (4). Este ME permite también el uso de protocolos sin bloqueo de la citocinesis, siempre que haya pruebas de que la población celular analizada ha experimentado la mitosis. 2. Además de utilizar el ensayo de MNvit para identificar productos químicos (sustancias y mezclas) que inducen micronúcleos, el uso del bloqueo de la citocinesis, del etiquetado inmunoquímico de cinetocoros, o de la hibridación con sondas centroméricas o teloméricas [hibridación fluorescente in situ (FISH)] puede aportar también información sobre los mecanismos del daño cromosómico y de la formación de micronúcleos (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Los procedimientos de etiquetado e hibridación pueden utilizarse cuando hay un aumento en la formación de micronúcleos y el investigador desea determinar si el aumento es consecuencia de sucesos clastogénicos o aneugénicos. 3. Los micronúcleos representan un daño que se ha transmitido a las células hijas, mientras que las aberraciones cromosómicas registradas en las células en metafase pueden no transmitirse. Debido a que los micronúcleos de las células en interfase pueden evaluarse de forma relativamente objetiva, el personal de laboratorio solamente tiene que determinar si las células han sufrido o no la división y cuántas células contienen un micronúcleo. Como resultado, las preparaciones pueden evaluarse de forma relativamente rápida y el análisis puede automatizarse. Esto hace que sea factible evaluar miles en lugar de cientos de células por tratamiento, lo que aumenta el poder del ensayo. Finalmente, como los micronúcleos pueden derivarse de cromosomas retardados, existe la posibilidad de detectar agentes inductores de aneuploidía que son difíciles de estudiar en ensayos convencionales de aberraciones cromosómicas como, por ejemplo, la TG 473 de la OCDE (capítulo B.10 del presente anexo) (17). Sin embargo, el ensayo de MNvit no permite diferenciar las sustancias que inducen poliploidía de las que inducen efectos clastogénicos sin recurrir a técnicas especiales como la FISH mencionada en el punto 2. 4. El ensayo de MNvit es un método in vitro que utiliza normalmente células cultivadas de roedor o humanas. Proporciona una base general para investigar el potencial de causar daño cromosómicoin vitro porque permite detectar tanto anéugenos como clastógenos. 5. El ensayo de MNvit es sólido y efectivo con una diversidad de tipos celulares, y tanto en presencia como en ausencia de citoB. Hay muchos datos que apoyan la validez del ensayo de MNvit con diversas líneas celulares de roedor (CHO, V79, CHL/IU y L5178Y) y con linfocitos humanos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Aquí se incluyen, en particular, los estudios internacionales de validación coordinados por la Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) y los informes del International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Los datos disponibles también se han vuelto a evaluar en un estudio de validación retrospectiva con ponderación de los datos, por parte del Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (CEVMA) de la Comisión Europea, y el método de ensayo ha sido avalado en cuanto a su validez científica por el Comité científico consultivo del CEVMA (ESAC) (32) (33) (34). Se ha descrito el uso de la línea celular linfoblastoide humana TK6 (35), de células HepG2 (36) (37) y de células primarias de embrión de hámster sirio (38), aunque no se han utilizado en los estudios de validación. DEFINICIONES 6. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas. CONSIDERACIONES INICIALES 7. Los ensayos realizados in vitro suelen exigir la utilización de una fuente exógena de activación metabólica, salvo que las células sean competentes metabólicamente respecto a las sustancias que se ensayan. El sistema exógeno de activación metabólica no reproduce completamente las condiciones in vivo. Debe procurarse también evitar las circunstancias que puedan conducir a resultados falsos positivos que no reflejen la mutagenicidad intrínseca y que puedan deberse a factores tales como cambios en el pH o en la osmolalidad, o a altos niveles de citotoxicidad (39) (40) (41). Si la sustancia problema provoca un cambio en el pH del medio en el momento de su incorporación, hay que ajustar el pH, preferentemente amortiguando la solución madre de forma que todos los volúmenes en todas las concentraciones de ensayo, y respecto a todos los controles, se mantengan iguales. 8. Para analizar la inducción de la formación de micronúcleos, es fundamental que haya habido mitosis en los cultivos tanto tratados como sin tratar. La fase que proporciona más información para evaluar la formación de micronúcleos es la de las células que han completado una sola mitosis durante el tratamiento con la sustancia problema, o después de este tratamiento. PRINCIPIO DEL ENSAYO 9. Los cultivos celulares de origen humano o de mamífero se exponen a la sustancia problema tanto con una fuente exógena de activación metabólica como sin ella, salvo que se utilicen células con una capacidad adecuada de metabolización. En todos los ensayos se incluyen un control positivo (CP) y un control del disolvente o vehículo (CV) en paralelo. 10. Durante la exposición a la sustancia problema, o después de la misma, las células se cultivan durante un tiempo suficiente para que el daño cromosómico o del huso acromático provoquen la formación de micronúcleos en las células en interfase. Para la inducción de aneuploidía, es necesario normalmente que la sustancia problema esté presente durante la mitosis. Las células en interfase se recogen, se tiñen y se analizan para detectar la presencia de micronúcleos. Lo ideal es que los micronúcleos se evalúen solamente en las células que hayan completado la mitosis durante la exposición a la sustancia problema o durante el período tras la exposición, en su caso. En los cultivos que se hayan tratado con un bloqueante de la citocinesis, esto se consigue evaluando únicamente las células binucleadas. En ausencia de bloqueante de la citocinesis es importante demostrar la probabilidad de que las células analizadas hayan experimentado la división celular durante la exposición a la sustancia problema o después de dicha exposición. En relación con todos los protocolos, es importante demostrar que ha habido proliferación celular en los cultivos tanto tratados como de control, y el grado de citotoxicidad o citostasis inducido por la sustancia problema debe estimarse en los cultivos (o en cultivos paralelos) que se examinan para evaluar la presencia de micronúcleos en ellos. DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO Preparativos 11. Pueden utilizarse cultivos primarios de linfocitos de sangre periférica humana (5) (19) (42) (43) y una serie de líneas celulares de roedor, tales como CHO, V79, CHL/IU, y L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). El uso de otros tipos y líneas celulares debe justificarse por la demostración de su comportamiento en el ensayo, como se describe en la sección de criterios de aceptabilidad. Como la frecuencia espontánea de la formación de micronúcleos influye en la sensibilidad del ensayo, se recomienda la utilización de tipos celulares con una frecuencia espontánea de micronúcleos que sea baja y estable. 12. Los linfocitos de sangre periférica humana deben obtenerse de individuos no fumadores, sanos, jóvenes (de entre 18 y 35 años de edad, aproximadamente), que no hayan estado expuestos recientemente a radiaciones ni a sustancias genotóxicas conocidas. Si se combinan las células procedentes de más de un donante, debe especificarse el número de donantes. La frecuencia de micronúcleos aumenta con la edad y esta tendencia es más pronunciada en las mujeres que en los varones (44), lo que debe tenerse en cuenta al efectuar la selección de las células de los donantes para su combinación. Medios y condiciones de cultivo 13. Para el mantenimiento de los cultivos deben utilizarse medios de cultivo y condiciones de incubación (recipientes de cultivo, concentración de CO2, temperatura y humedad) adecuados. Las cepas y líneas celulares establecidas deben examinarse sistemáticamente para comprobar la estabilidad del número modal de cromosomas y la ausencia de contaminación por micoplasmas, y deben dejar de utilizarse si se contaminan o si hay un cambio en el número modal de cromosomas. Debe conocerse la duración del ciclo celular normal en las condiciones de cultivo aplicadas en el laboratorio de ensayo. Si se utiliza el método de bloqueo de la citocinesis, la concentración del inhibidor de la citocinesis debe optimizarse para el tipo de células específico que se utilice y debe demostrarse que proporciona un buen rendimiento de células binucleadas para la evaluación. Preparación de los cultivos 14. Cepas y líneas celulares establecidas: las células se propagan a partir de cultivos madre, se siembran en medio de cultivo a una densidad tal que los cultivos no lleguen a confluir en monocapas, y los cultivos en suspensión no alcancen una densidad excesiva antes del momento de la recogida, y se incuban a 37 °C. 15. Linfocitos: se cultiva sangre completa tratada con un anticoagulante (por ejemplo, heparina), o bien linfocitos aislados, en presencia de un mitógeno [por ejemplo, fitohemaglutinina (PHA)] antes de la exposición a la sustancia problema y a la citoB. Activación metabólica 16. Se debe recurrir a sistemas de metabolización exógenos cuando se utilizan células con una capacidad metabólica endógena inadecuada. El sistema más comúnmente empleado es una fracción postmitocondrial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene a partir del hígado de roedores tratados con inductores enzimáticos como el aroclor 1254 (45) (46) o una combinación de fenobarbital y β-naftoflavona (46) (47) (48) (49). Esta última combinación no infringe el Convenio de Estocolmo sobre contaminantes orgánicos persistentes (50) ni el Reglamento (CE) no 850/2004, sobre contaminantes orgánicos persistentes (66), y se ha visto que es tan efectiva como el aroclor 1254 para inducir las oxidasas de función mixta (46) (47) (48) (49). La fracción S9 se utiliza normalmente a concentraciones que varían entre el 1 y el 10 % (v/v) en el medio de ensayo final. La elección de un sistema de activación metabólica puede depender de la clase de sustancia que se estudia y, en algunos casos, puede ser adecuado utilizar más de una concentración de S9. 17. Las líneas celulares genéticamente modificadas que expresan enzimas de activación, humanas o de roedores, pueden suprimir la necesidad de utilizar un sistema de activación metabólica exógeno, y pueden utilizarse como células de ensayo. En estos casos, la elección de las líneas celulares utilizadas debe justificarse científicamente, por ejemplo, por la pertinencia de las oxidasas de función mixta para el metabolismo de la sustancia problema (51), y por su capacidad de respuesta a clastógenos y anéugenos conocidos (véase la sección sobre criterios de aceptabilidad). Debe reconocerse que la sustancia estudiada puede no ser metabolizada por la oxidasa u oxidasas de función mixta expresadas; en este caso, los resultados negativos no indicarían que la sustancia problema no puede inducir micronúcleos. Preparación de la sustancia problema 18. Las sustancias sólidas deben disolverse en disolventes o vehículos adecuados y, si es conveniente, diluirse antes de tratar las células. Las sustancias líquidas pueden añadirse directamente al sistema de ensayo o diluirse antes del tratamiento. Las sustancias gaseosas o volátiles deben ensayarse aplicando modificaciones adecuadas a los protocolos normales, tales como el tratamiento en recipientes sellados (52) (53). Han de emplearse soluciones de la sustancia problema recién preparadas, salvo que los datos relativos a la estabilidad demuestren que es posible su conservación. Condiciones del ensayo Disolvente o vehículo 19. El disolvente o vehículo no debe reaccionar con la sustancia problema ni ser incompatible con la supervivencia de las células ni con el mantenimiento de la actividad de la fracción S9 a la concentración utilizada. Para utilizar algún disolvente o vehículo distinto de los bien establecidos (por ejemplo, agua, medio de cultivo celular, dimetilsulfóxido), debe disponerse de datos justificativos que indiquen su compatibilidad con la sustancia problema y su ausencia de toxicidad genética. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso. Utilización de citoB como bloqueante de la citocinesis 20. Una de las consideraciones más importantes en la realización del ensayo de MNvit es la de velar por que las células que se examinen hayan completado la mitosis durante el tratamiento o en el período de incubación tras el mismo, en su caso. La citoB es el agente más ampliamente utilizado para bloquear la citocinesis, ya que inhibe el ensamblaje de la actina, con lo que impide la separación de las células hijas tras la mitosis, y así se forman células binucleadas (5) (54) (55). Así pues, el recuento de micronúcleos puede limitarse a las células que han experimentado la mitosis durante el tratamiento o después de este. El efecto de la sustancia problema sobre la cinética de la proliferación celular puede medirse simultáneamente. La citoB debe utilizarse como bloqueante de la citocinesis cuando se utilizan linfocitos humanos, ya que la duración de los ciclos celulares es variable dentro de los cultivos y entre los donantes, y debido a que no todos los linfocitos responden a la PHA. Al examinar líneas celulares, se han utilizado otros métodos para determinar si las células que se evalúan han experimentado la división; estos métodos se consideran más abajo (véase el punto 26). 21. El laboratorio debe determinar la concentración adecuada de citoB para cada tipo de células con el fin de conseguir la frecuencia óptima de células binucleadas en los cultivos de control del disolvente o vehículo. La concentración adecuada de citoB está generalmente entre 3 y 6 μg/ml. Medición de la proliferación celular y de la citotoxicidad, y selección de las concentraciones de exposición 22. Cuando se determina la concentración máxima de sustancia problema que se va a estudiar, debe evitarse llegar a concentraciones que puedan producir respuestas positivas falsas, tales como las provocadas por una citotoxicidad excesiva, precipitación en el medio de cultivo, y cambios fuertes del pH o de la osmolalidad (39) (40) (41). 23. Se mide la proliferación celular para asegurarse de que las células tratadas han efectuado una mitosis durante el ensayo y de que los tratamientos se efectúan a los niveles adecuados de citotoxicidad (véase el punto 29). La citotoxicidad debe determinarse con y sin activación metabólica en las células que requieren activación metabólica, utilizando el aumento relativo del recuento de células (ARRC) o la duplicación relativa de la población (DRP) (véanse las fórmulas en el apéndice 2), salvo que se emplee la citoB. Cuando se emplea esta sustancia, es posible determinar la citotoxicidad utilizando el índice de replicación (IR) (véase la fórmula en el apéndice 2). 24. El tratamiento de los cultivos con citoB, junto con la medición de las frecuencias relativas de células mononucleadas, binucleadas y multinucleadas en el cultivo, constituye un método exacto de cuantificación del efecto sobre la proliferación celular y de la actividad citotóxica o citostática de un tratamiento (5), y garantiza que solamente se evalúan las células que se han dividido durante el tratamiento o después de este. 25. En los estudios con citoB, la citostasis o la citotoxicidad pueden cuantificarse mediante el índice de proliferación con bloqueo de la citocinesis (IPBC) (5) (26) (56), o pueden derivarse del IR de, al menos, 500 células por cultivo (véanse las fórmulas en el apéndice 2). Cuando se utiliza la citoB para evaluar la proliferación celular, hay que determinar el IPBC o el IR basándose en un mínimo de 500 células por cultivo. Estas mediciones, entre otras, pueden utilizarse para estimar la citotoxicidad comparando los valores obtenidos con los cultivos tratados y con los controles. La evaluación de otros indicadores de citotoxicidad (por ejemplo, confluencia, número de células, apoptosis, necrosis, recuento de las células en metafase) puede aportar información útil. 26. En los estudios sin citoB, es necesario demostrar que las células evaluadas en el cultivo se han dividido durante el tratamiento con la sustancia problema o tras este tratamiento; en caso contrario, pueden obtenerse respuestas negativas falsas. Entre los métodos que se han utilizado para garantizar que las células objeto de evaluación se han dividido figuran los siguientes: la incorporación y posterior detección de bromodesoxiuridina (BrdU) para identificar las células que se han replicado (57), la formación de clones cuando se tratan células de líneas celulares permanentes y se evalúan in situ en el portaobjetos de un microscopio [índice de proliferación (IP)] (25) (26) (27) (28), o la medición de la duplicación relativa de la población (DRP) o del aumento relativo del recuento de células (ARRC) u otros métodos comprobados (16) (56) (58) (59) (véanse las fórmulas en el apéndice 2). La evaluación de otros indicadores de citotoxicidad o de la citostasis (por ejemplo, confluencia, número de células, apoptosis, necrosis, recuento de las células en metafase) puede aportar información útil. 27. Deben evaluarse al menos tres concentraciones de ensayo analizables. Con este fin, puede ser necesario realizar el experimento utilizando un número mayor de concentraciones próximas entre sí y analizar la formación de micronúcleos en las concentraciones que aporten el rango apropiado de citotoxicidades. Otra estrategia posible consiste en efectuar un ensayo preliminar de citotoxicidad a fin de estrechar el rango para el ensayo definitivo. 28. El objetivo es que la concentración máxima provoque una citotoxicidad del 55 ± 5 %. Unos niveles más elevados podrían inducir daño cromosómico como efecto secundario de la citotoxicidad (60). Cuando se produce citotoxicidad, las concentraciones de ensayo seleccionadas deben cubrir un rango que vaya desde la que provoca una citotoxicidad del 55 ± 5 % hasta la que no provoca citotoxicidad o solo débilmente. 29. Si no se observa citotoxicidad ni precipitado, la concentración de ensayo máxima debe corresponder a la más baja del grupo siguiente: 0,01 M, 5 mg/mL o 5 μl/mL. Las concentraciones seleccionadas para el análisis no deben estar separadas, en general, por un factor de más de 10. En el caso de sustancias problema que muestran una curva de concentración-respuesta de gran pendiente, puede ser necesario reducir más la separación entre las concentraciones de la sustancia problema, de forma que se evalúen cultivos en los rangos de toxicidad moderada y baja. 30. En caso de que la solubilidad constituya un factor limitante, la concentración máxima, si no está limitada por la citotoxicidad, debe ser la concentración más baja a la que un precipitado mínimo es visible en los cultivos, siempre que esto no interfiera con el recuento. La valoración de la precipitación debe realizarse con métodos como la microscopia óptica, anotando el precipitado que persiste, o el que aparece durante el cultivo (hacia el final del tratamiento). Controles 31. En todos los experimentos deben incluirse controles positivos (CP) y del disolvente o vehículo en paralelo, con y sin activación metabólica. 32. Los CP son necesarios para demostrar la capacidad de las células utilizadas y del protocolo de ensayo para identificar clastógenos y anéugenos, y confirmar la actividad metabólica del preparado de S9. Los CP deben emplear inductores conocidos de la formación de micronúcleos a concentraciones a las que se prevea que se van a obtener aumentos pequeños, pero reproducibles, sobre la frecuencia espontánea, y demostrar la sensibilidad del sistema de ensayo. Las concentraciones de los CP deben ser tales que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados. 33. Debe utilizarse un clastógeno que requiera activación metabólica (por ejemplo, ciclofosfamida, benzo[a]pireno) para demostrar tanto la competencia metabólica como la capacidad del sistema de ensayo para detectar clastógenos. Si está justificado, pueden utilizarse otros CP. Debido a que algunos CP que necesitan activación metabólica pueden ser activos sin activación metabólica exógena en ciertas condiciones de tratamiento o en ciertas líneas celulares, la necesidad de activación metabólica y la actividad de la preparación de S9 deben probarse en la línea celular seleccionada y a las concentraciones seleccionadas. 34. Por el momento, no se conoce ningún anéugeno que necesite activación metabólica para su actividad genotóxica (16). Como ejemplos de CP aceptados actualmente para la actividad aneugénica pueden citarse la colchicina y la vimblastina. Pueden utilizarse otras sustancias si inducen micronúcleos solamente, o principalmente, a través de su actividad aneugénica. Para evitar tener que recurrir a dos CP (para la clastogenicidad y para la aneugenicidad) sin activación metabólica, el control de aneugenicidad puede servir como CP sin S9, y el control de clastogenicidad puede utilizarse para comprobar la idoneidad del sistema de activación metabólica utilizado. En células que no requieren S9 deben utilizarse CP tanto para la clastogenicidad como para la aneugenicidad. En el apéndice 3 se recogen los CP sugeridos. 35. Puede considerarse la utilización de un CP en función de las clases químicas, si se dispone de sustancias adecuadas. Todos los CP utilizados deben ser adecuados para el tipo de células y para las condiciones de activación. 36. Deben incluirse controles del disolvente o vehículo para cada tiempo de recogida. Se realizarán asimismo controles negativos (CN) sin tratar (sin disolvente ni vehículo), salvo que exista información publicada o datos de los controles históricos del laboratorio que demuestre que, a las concentraciones utilizadas, el disolvente elegido no provoca efectos genotóxicos ni otro tipo de efectos nocivos. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Pauta de tratamiento 37. Para maximizar la probabilidad de detectar un anéugeno o un clastógeno que actúe en una fase específica del ciclo celular, es importante que se trate con la sustancia problema un número suficiente de células en todas las fases de su ciclo celular. Por tanto, es posible que la pauta de tratamiento de líneas celulares y de cultivos celulares primarios difiera en algunos aspectos de la aplicada a los linfocitos, que requieren estimulación mitogénica para empezar su ciclo celular; este tema se trata en los puntos 41 a 43 (16). 38. Una serie de consideraciones teóricas, junto con datos publicados (18), indica que la mayoría de los anéugenos y clastógenos se detectan con un corto período de tratamiento, de entre 3 y 6 horas en presencia y ausencia de S9, seguido de la eliminación de la sustancia problema y de un período de crecimiento de entre 1,5 y 2,0 ciclos celulares (6). Las células se recogen a un tiempo equivalente a unas 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal (es decir, sin tratamiento), bien tras el inicio o bien al final del tratamiento (véase el cuadro 1). Los tiempos de la toma de muestras o los de recuperación pueden ampliarse si se sabe o se sospecha que la sustancia problema afecta a la duración del ciclo celular (por ejemplo, cuando se someten a ensayo análogos de nucleósidos). 39. Debido a la posible citotoxicidad de las preparaciones de S9 para las células de mamífero cultivadas, se aplica un tratamiento con exposición prolongada de 1,5-2,0 ciclos celulares normales solamente en ausencia de S9. En el tratamiento prolongado, se ofrecen opciones que permiten el tratamiento de las células con la sustancia problema en ausencia y en presencia de citoB. Estas opciones se refieren a situaciones en que puede haber preocupación respecto a posibles interacciones entre la sustancia problema y la citoB. 40. Las pautas sugeridas de tratamiento de las células se presentan en el cuadro 1. Estas pautas generales de tratamiento pueden modificarse en función de la estabilidad o reactividad de la sustancia problema o de las características particulares de crecimiento de las células utilizadas. Todos los tratamientos deben iniciarse y terminarse mientras las células están en la fase de crecimiento exponencial. Estas pautas se presentan con más detalle en los puntos 41 a 47 siguientes. Cuadro 1 Tratamiento de las células y tiempos de recogida para el ensayo de MNvit Linfocitos, células primarias y líneas celulares tratadas con citoB + S9 Tratar durante 3-6 horas en presencia de S9; retirar la fracción S9 y el medio de tratamiento; añadir medio fresco y citoB; recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos celulares normales. – S9 Exposición corta Tratar durante 3-6 horas; retirar el medio de tratamiento; añadir medio fresco y citoB; recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos celulares normales. – S9 Exposición prolongada Opción A: Tratar durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales en presencia de citoB; recoger al final del período de exposición. Opción B: Tratar durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales; retirar la sustancia problema; añadir medio fresco y citoB; recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos celulares normales. Líneas celulares tratadas sin citoB (Igual que las pautas de tratamiento indicadas más arriba, salvo que no se añade citoB) Linfocitos, células primarias y líneas celulares tratadas con citoB 41. En el caso de los linfocitos, el enfoque más eficiente es iniciar la exposición a la sustancia problema a las 44-48 horas de la estimulación con PHA, cuando la sincronización del ciclo habrá desaparecido (5). En el ensayo inicial, se tratan las células durante 3 a 6 horas con la sustancia problema en ausencia y en presencia de S9. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco que contiene citoB, y las células se recogen cuando ha pasado un tiempo equivalente a 1,5-2,0 ciclos celulares normales. 42. Si ambos ensayos iniciales de tratamiento corto (3-6 horas) son negativos o dudosos, se aplica un tratamiento posterior con exposición prolongada sin S9. Se dispone de dos opciones de tratamiento, que son igualmente aceptables. Sin embargo, podría ser más adecuado seguir la opción A en caso de linfocitos estimulados en que el crecimiento exponencial podría declinar a las 96 horas de la estimulación. Asimismo, los cultivos de células no deben haber alcanzado la confluencia en el momento del muestreo final en la opción B. — Opción A: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales, y se recogen al final del período de tratamiento. — Opción B: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco, y las células se recogen cuando han pasado otros 1,5-2,0 ciclos celulares normales. 43. Las células primarias y las líneas celulares deben tratarse de forma similar a los linfocitos, salvo que no es necesario estimularlas con PHA durante 44-48 horas. Las células distintas de los linfocitos deben exponerse de forma tal que, al final del estudio, las células estén aún en fase de crecimiento logarítmico. Líneas celulares tratadas sin citoB 44. Las células deben tratarse durante 3-6 horas en presencia y en ausencia de S9. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco, y las células se recogen al cabo de un tiempo equivalente a 1,5-2,0 ciclos celulares normales. 45. Si ambos ensayos iniciales de tratamiento corto (3-6 horas) son negativos o dudosos, se aplica un tratamiento posterior con exposición prolongada (sin S9). Se dispone de dos opciones de tratamiento, que son igualmente aceptables. — Opción A: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales, y se recogen al final del período de tratamiento. — Opción B: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco, y las células se recogen cuando han pasado otros 1,5-2,0 ciclos celulares normales. 46. En las monocapas, es posible que haya células mitóticas (identificables por su forma redondeada y por despegarse de la superficie) al final del tratamiento de 3-6 horas. Como las células mitóticas se despegan con facilidad, pueden perderse cuando se retira el medio que contiene la sustancia problema. Debe procurarse recogerlas cuando se lavan los cultivos, y devolverlas a estos, para evitar la pérdida de células en mitosis, y que podrían presentar micronúcleos, en el momento de la recogida final. Número de cultivos 47. Los cultivos deben hacerse por duplicado con cada concentración de la sustancia problema y en el caso de los cultivos del vehículo o disolvente y del CN. Si se puede demostrar, sobre la base de datos históricos del laboratorio, que la diferencia entre los cultivos duplicados es mínima, cabe la posibilidad de que resulte aceptable un cultivo único. Si se utilizan cultivos únicos, se recomienda que se analice un número mayor de concentraciones. Recogida de las células y preparación de los portaobjetos 48. Cada cultivo se recoge y se manipula por separado. La preparación de las células puede implicar un tratamiento hipotónico, pero esta fase no es necesaria si se consigue de otra manera una extensión adecuada de las células. Pueden usarse distintas técnicas para la preparación de los portaobjetos, siempre que lleven a la obtención de preparaciones celulares de buena calidad para su evaluación. Debe conservarse el citoplasma celular para poder detectar los micronúcleos y también (si se aplica el método de bloqueo de la citocinesis) identificar de forma fiable las células binucleadas. 49. Las preparaciones pueden teñirse siguiendo varios métodos, tales como la tinción de Giemsa o la aplicación de colorantes fluorescentes específicos del ADN (59). Si se emplea un colorante específico del ADN [por ejemplo, naranja de acridina (61) o Hoechst 33258 más pironina-Y (62)] pueden evitarse algunos de los artefactos que aparecen cuando se utiliza un colorante que no es específico del ADN. Si resulta interesante obtener información sobre los mecanismos implicados en su formación, para identificar el contenido (cromosoma o fragmento cromosómico) de los micronúcleos pueden utilizarse anticuerpos anti-cinetocoro, la técnica FISH con sondas pancentroméricas de ADN o el etiquetado in situ del cebado con cebadores pancentroméricos específicos, junto con una tinción de contraste adecuada del ADN (15) (16). Pueden utilizarse otros métodos para diferenciar entre clastógenos y anéugenos, siempre que se haya comprobado que son eficaces. Análisis 50. Antes de analizarlos al microscopio, se asigna un código independiente a todos los portaobjetos, incluidos los del disolvente o vehículo y los de los controles. Otra posibilidad es analizar las muestras codificadas utilizando un sistema automático de análisis de imágenes o citometría de flujo que esté validado. 51. En los cultivos tratados con citoB, deben analizarse las frecuencias de los micronúcleos en al menos 2 000 células binucleadas por cada concentración (al menos 1 000 células binucleadas por cultivo y dos cultivos por concentración). Si se utilizan cultivos únicos, deben evaluarse al menos 2 000 células binucleadas por concentración de cada cultivo. Si para la evaluación a cada concentración se dispone de un número sustancialmente inferior a 1 000 de células binucleadas por cultivo, o a 2 000 si se utiliza un cultivo único, y si no se detecta un aumento significativo de micronúcleos, debe repetirse el ensayo utilizando más células, o a concentraciones menos tóxicas, según sea más conveniente. Ha de procurarse no tener en cuenta para la evaluación las células binucleadas con formas irregulares o en las que los dos núcleos difieran mucho por su tamaño; tampoco deben confundirse las células binucleadas con células multinucleadas mal extendidas. Las células que contengan más de dos núcleos principales no deben tenerse en cuenta para el análisis de micronúcleos, ya que la frecuencia espontánea de micronúcleos puede ser más elevada en estas células (63) (64). Puede aceptarse incluir en la evaluación las células mononucleadas si se demuestra que la sustancia problema interfiere con la actividad de la citoB. 52. En las líneas celulares sometidas a ensayo sin tratamiento con citoB, debe evaluarse la presencia de micronúcleos en al menos 2 000 células por concentración (al menos 1 000 células por cultivo y dos cultivos por concentración). Cuando se utilice un cultivo único por concentración, se evaluarán al menos 2 000 células de cada cultivo. 53. Cuando se utiliza la citoB, para evaluar la proliferación celular hay que determinar el IPBC o el IR (véase el apéndice 2) basándose en un mínimo de 500 células por cultivo. Cuando se hacen los tratamientos en ausencia de citoB, es fundamental aportar pruebas de que las células que se están considerando han proliferado, como se indica en los puntos 24 a 27. Criterios de aceptabilidad 54. Los laboratorios que se propongan utilizar el ensayo de MNvit descrito en el presente ME deben demostrar su capacidad de detectar de forma fiable y exacta las sustancias de actividad aneugénica y clastogénica conocida, con y sin activación metabólica, así como las que se sabe que son negativas, utilizando las sustancias de referencia del apéndice 3. Para demostrar su capacidad de aplicar el presente ME correctamente, el laboratorio debe aportar pruebas de que las células que se evalúan para la formación de micronúcleos han completado una sola división nuclear si el ensayo se lleva a cabo sin utilizar citoB. 55. Se recomienda utilizar las sustancias del apéndice 3·como sustancias de referencia. Pueden incluirse otras sustancias en lugar de las de la lista, o además de ellas, si se conoce su actividad y si inducen la formación de micronúcleos por los mismos mecanismos de acción, y si se demuestra que son pertinentes para las sustancias que se van a ensayar con el procedimiento de MNvit. La justificación podría incluir un estudio de validación en que se haya utilizado una amplia variedad de sustancias o que se haya centrado en un espectro más reducido basado en la clase química de la sustancia problema o en el mecanismo del daño que se estudie. 56. El control del disolvente o vehículo y los cultivos sin tratar deben mostrar de forma reproducible unas frecuencias bajas y consistentes de micronúcleos (normalmente, 5-25 micronúcleos/1 000 células para los tipos de células señalados en el punto 11). Es posible que otros tipos de células tengan diferentes rangos de respuestas, las cuales deben determinarse cuando se validen para su utilización en el ensayo de MNvit. Deben utilizarse los datos del CN, del disolvente y del CP para establecer los rangos de los controles históricos. Estos valores deben utilizarse en la toma de decisiones sobre la idoneidad de los CN o CP en paralelo para un experimento. 57. Si se proponen para el ensayo cambios en el protocolo que sean de poca importancia (por ejemplo, uso de técnicas de recuento automáticas en vez de manuales, uso de un nuevo tipo de células), será necesario demostrar la efectividad del cambio antes de que se pueda considerar que es aceptable la utilización del protocolo modificado. La demostración de la efectividad incluye la demostración de que pueden detectarse los principales mecanismos de rotura cromosómica y ganancia o pérdida de cromosomas, y de que pueden obtenerse resultados positivos y negativos apropiados para la clase de cada sustancia, o para la amplia gama de sustancias, que se van a ensayar. DATOS E INFORME Tratamiento de los resultados 58. Si se utiliza la técnica de bloqueo de la citocinesis, para la evaluación de la inducción de micronúcleos se emplearán solo las frecuencias de las células binucleadas con micronúcleos (independientemente del número de micronúcleos por célula). El tener en cuenta para la evaluación cuántas células tienen uno, dos o más micronúcleos puede aportar información útil, pero no es obligatorio. 59. También deben medirse en paralelo la citotoxicidad o la citostasis para todos los cultivos tratados y los de control del disolvente o vehículo (58). Los valores del IPBC y del IR deben calcularse para todos los cultivos tratados y de control, como medidas de retraso del ciclo celular cuando se utiliza el método de bloqueo de la citocinesis. En ausencia de citoB, debe utilizarse la DRP o el ARRC o el IP (véase el apéndice 2). 60. Deben proporcionarse datos de cada cultivo. Además, se resumirán todos los datos en forma de cuadro. 61. Las sustancias que inducen micronúcleos en el ensayo de MNvit pueden deber esta propiedad a su capacidad de inducir rotura cromosómica, pérdida de cromosomas, o una combinación de ambas. Para determinar si el mecanismo de inducción de micronúcleos se debe a actividad clastogénica y/o aneugénica, pueden realizarse análisis más detallados utilizando anticuerpos anti-cinetocoro, sondas in situ específicas del centrómero, u otros métodos. Evaluación e interpretación de los resultados 62. No se requiere ninguna verificación mediante ensayos adicionales en caso de una respuesta positiva o negativa clara. Los resultados dudosos pueden aclararse mediante el análisis de otras 1 000 células procedentes de todos los cultivos, para mantener el carácter ciego del ensayo. Si con este enfoque no se resuelve el resultado, deben efectuarse más ensayos. En los siguientes experimentos se considerará la posibilidad de modificar los parámetros del estudio en una gama de condiciones ampliada o restringida, según proceda. Entre los parámetros del estudio que podrían modificarse figuran el espaciado entre las concentraciones del ensayo, los períodos de tratamiento y de recogida de las células, o las condiciones de activación metabólica. 63. Son varios los criterios para determinar un resultado positivo, tales como un aumento relacionado con la concentración o un aumento estadísticamente significativo del número de células que presentan micronúcleos. Debe considerarse en primer lugar la importancia biológica de los resultados. Para la evaluación de la significación biológica de la respuesta puede servir de orientación considerar si los valores observados se encuentran dentro o fuera del rango del control histórico. Pueden emplearse métodos estadísticos adecuados como apoyo para evaluar los resultados del ensayo (65). Sin embargo, los resultados de las pruebas estadísticas deben evaluarse respecto a la relación dosis-respuesta. También deben tenerse en cuenta la reproducibilidad y los datos históricos. 64. Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán claramente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos no permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia problema. Estas respuestas dudosas o cuestionables pueden darse con independencia del número de veces que se repita el experimento. 65. Un resultado positivo en el ensayo de MNvit indica que la sustancia problema induce roturas cromosómicas o pérdida de cromosomas en células de mamífero cultivadas. Un resultado negativo indica que, en las condiciones en que se realiza el ensayo, la sustancia problema no induce roturas cromosómicas ni pérdida o ganancia de cromosomas en las células de mamífero cultivadas. Informe del ensayo 66. El informe del ensayo debe incluir como mínimo la siguiente información, si es importante para la realización del estudio: Sustancia problema: — datos de identificación y número de registro del Chemical Abstracts Service y número CE, — naturaleza física y pureza, — propiedades físico-químicas importantes para la realización del estudio, — reactividad de la sustancia problema con el disolvente o vehículo o con el medio de cultivo de las células. Disolvente o vehículo: — justificación de la elección del disolvente o vehículo, — solubilidad y estabilidad de la sustancia problema en el disolvente o vehículo. Células: — tipo y procedencia de las células utilizadas, — idoneidad del tipo de células utilizado, — ausencia de micoplasmas, si procede, — información sobre la duración del ciclo celular, tiempo de duplicación o índice de proliferación, — en caso de que se utilicen linfocitos, indicación del sexo, edad, y número de los donantes de sangre, si procede, — en caso de que se utilicen linfocitos, si lo que se expone a la sustancia es la sangre completa o son los linfocitos aislados, — número de pases, si procede, — métodos de mantenimiento de los cultivos celulares, si procede, — número modal de cromosomas, — duración del ciclo celular normal (control negativo). Condiciones del ensayo: — identidad de la sustancia de bloqueo de la citocinesis (por ejemplo, citoB), si se utiliza, y su concentración, junto con la duración de la exposición de las células, — justificación de la selección de las concentraciones y del número de cultivos, incluidos los datos de citotoxicidad y los límites de solubilidad, si se dispone de ellos, — composición del medio, concentración de CO2, si procede, — concentraciones de la sustancia problema, — concentración (y volumen) del vehículo y de la sustancia problema añadidos, — temperatura y duración de la incubación, — duración del tratamiento, — momento de la recogida tras el tratamiento, — densidad celular en el momento de la siembra, si procede, — tipo y composición del sistema de activación metabólica, incluidos los criterios de aceptabilidad, — sustancias de control positivo y controles negativos, — métodos de preparación de los portaobjetos y técnica de tinción utilizados, — criterios para la identificación de micronúcleos, — números de células analizadas, — métodos de determinación de la citotoxicidad, — cualquier información adicional relativa a la citotoxicidad, — criterios empleados para considerar si los resultados de los estudios son positivos, negativos o dudosos, — métodos utilizados de análisis estadístico, — métodos, como la utilización de anticuerpos anti-cinetocoro, para caracterizar si los micronúcleos contienen cromosomas completos o fragmentos, en su caso. Resultados: — parámetro utilizado para medir la citotoxicidad como, por ejemplo, IPBC o IR en caso de aplicación de bloqueo de la citocinesis, o ARRC, DRP o IP cuando no se aplica este bloqueo; otras observaciones pertinentes como, por ejemplo, confluencia celular, apoptosis, necrosis, recuento de metafases, frecuencia de células binucleadas, — signos de precipitación, — datos sobre el pH y la osmolalidad del medio de tratamiento, si se han determinado, — definición de células aceptables para el análisis, — distribución de las células mono, bi y multinucleadas si se utiliza un método de bloqueo de la citocinesis, — número de células con micronúcleos, indicado por separado para cada cultivo tratado y de control, precisándose si corresponden a células binucleadas o mononucleadas, en su caso, — relación concentración-respuesta, cuando sea posible, — datos del control negativo (disolvente o vehículo) y de la sustancia de control positivo (concentraciones y disolventes) en paralelo, — datos históricos del control negativo (disolvente o vehículo) y de las sustancias utilizadas como control positivo, con los rangos, las medias y la desviación típica e intervalo de confianza (por ejemplo, 95 %), — análisis estadístico; valores p, si se dispone de ellos. 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(66) Reglamento (CE) no 850/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 29 de abril de 2004, sobre contaminantes orgánicos persistentes y por el que se modifica la Directiva 79/117/CE, DO L 229 de 30.4.2004, p. 5. Apéndice 1 Definiciones Anéugeno: Sustancia o proceso que, por interacción con los componentes del ciclo de división celular mitótica y meiótica, produce aneuploidía en células u organismos. Aneuploidía: Desviación respecto al número diploide (o haploide) normal de cromosomas en relación con uno o varios cromosomas, pero no con dotaciones completas de cromosomas (poliploidía). Apoptosis: Muerte celular programada, caracterizada por una serie de fases que llevan a la desintegración de las células para formar partículas limitadas por membranas que se eliminan a continuación por fagocitosis o por liberación. Proliferación celular: Aumento del número de células como resultado de divisiones celulares mitóticas. Centrómero: Región del ADN de un cromosoma en la que se mantienen juntas las dos cromátidas y a la que se unen lateralmente los dos cinetocoros. Clastógeno: Sustancia o proceso que provoca aberraciones cromosómicas estructurales en poblaciones de células u organismos. Citocinesis: Proceso de división celular que sigue inmediatamente a la mitosis para formar dos células hijas, cada una de las cuales contiene un solo núcleo. Índice de proliferación con bloqueo de la citocinesis (IPBC, o CBPI, por su nombre en inglés): Proporción de células de segunda división en la población tratada con respecto al control sin tratar (véase la fórmula en el apéndice 2). Citostasis: Inhibición del crecimiento celular (véase la fórmula en el apéndice 2). Citotoxicidad: Efecto nocivo para la función o la estructura celular, que provoca finalmente la muerte de la célula. Genotoxicidad: Término general que engloba todos los tipos de daño al ADN o al cromosoma, incluidas roturas, reorganizaciones de aductos, mutaciones, aberraciones cromosómicas, y aneuploidía. No todos los tipos de efectos genotóxicos resultan en mutaciones o en daño cromosómico estable. Células en interfase: Células que no se encuentran en fase mitótica. Cinetocoro: Estructura proteínica que se encuentra en el centrómero de un cromosoma y a la cual se asocian las fibras del huso acromático durante la división celular para permitir el movimiento ordenado de los cromosomas hijos hacia los polos de las células hijas. Micronúcleos: Núcleos pequeños, adicionales a los núcleos principales de las células y separados de ellos, y producidos durante la telofase de la mitosis o de la meiosis por fragmentos cromosómicos o por cromosomas enteros retardados. Mitosis: División del núcleo de la célula, generalmente formada por profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. Índice mitótico: Relación entre el número de células en metafase y el número total de células observadas en una población celular; indica el grado de proliferación celular de dicha población. Mutágeno: Agente que provoca un cambio, en una o varias de las secuencias de pares de bases del ADN o en la estructura de los cromosomas (aberraciones cromosómicas), que es hereditario. No disyunción: Caso en que las cromátidas emparejadas no se separan ni se segregan adecuadamente para repartirse entre las células hijas en formación, lo que provoca que las células hijas presenten un número anormal de cromosomas. Poliploidía: Aberraciones cromosómicas numéricas en células u organismos que afectan a dotaciones completas de cromosomas, en contraste con las aberraciones que afectan solo a cromosomas individuales (aneuploidía). Índice de proliferación (IP): Método de medición de la citotoxicidad cuando no se utiliza la citoB (véase la fórmula en el apéndice 2). Aumento relativo del recuento de células (ARRC, o RICC por su nombre en inglés): Método de medición de la citotoxicidad cuando no se utiliza la citoB (véase la fórmula en el apéndice 2). Duplicación relativa de la población (DRP, o RPD por su nombre en inglés): Método de medición de la citotoxicidad cuando no se utiliza la citoB (véase la fórmula en el apéndice 2). Índice de replicación (IR): Proporción de ciclos de división celular completados en un cultivo tratado con respecto al control sin tratar, durante el período de exposición y de recuperación (véase la fórmula en el apéndice 2). Sustancia problema (o producto químico problema): Toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este ME. Apéndice 2 Fórmulas para la evaluación de la citotoxicidad 1. Cuando se utiliza citoB, la evaluación de la citotoxicidad debe basarse en el índice de proliferación con bloqueo de la citocinesis (IPBC) o en el índice de replicación (IR) (16) (58). El IPBC indica el número medio de ciclos celulares por célula durante el período de exposición a la citoB, y puede utilizarse para calcular la proliferación celular. El IR indica el número de núcleos presentes en los cultivos tratados respecto al de los cultivos de control y puede utilizarse para calcular el porcentaje de citostasis: % citostasis = 100 – 100{(IPBCT – 1) ÷ (IPBCC – 1)} donde: T = cultivo de tratamiento de la sustancia problema C = cultivo de control del vehículo y: Así pues, un IPBC de 1 (todas las células son mononucleadas) es equivalente al 100 % de citostasis. Citostasis = 100 – IR donde: T = cultivos tratados C = cultivos de control 2. Así pues, un IR del 53 % significa que, respecto al número de células que se han dividido para formar células binucleadas y multinucleadas en el cultivo de control, solo el 53 % de este número se ha dividido en el cultivo tratado, es decir, hay un 47 % de citostasis. 3. Cuando no se utiliza citoB, se recomienda evaluar la citotoxicidad sobre la base del aumento relativo del recuento celular (ARRC) o de la duplicación relativa de la población (DRP) (58), ya que ambos parámetros tienen en cuenta la proporción de la población celular que se ha dividido. donde: Duplicación de la población = [log (no células tras el tratamiento ÷ no células iniciales)] ÷ log 2 4. Así pues, un ARRC o una DRP del 53 % indica un 47 % de citotoxicidad o citostasis. 5. Si se utiliza el índice de proliferación (IP), es posible evaluar la citotoxicidad mediante el recuento de los clones formados por una célula (cl1), dos células (cl2), de tres a cuatro células (cl4) y de cinco a ocho células (cl8): 6. El IP se ha utilizado como un parámetro válido y fiable de citotoxicidad también para líneas celulares cultivadas in situ en ausencia de citoB (25) (26) (27) (28). Apéndice 3 Sustancias de referencia recomendadas para evaluar el comportamiento (16) Categoría Sustancia No CAS No CE 1. Clastógenos activos sin activación metabólica Arabinósido de citosina 147-94-4 205-705-9 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 2. Clastógenos que necesitan activación metabólica Benzo(a)pireno 50-32-8 200-028-5 Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 3. Anéugenos Colchicina 64-86-8 200-598-5 Vimblastina 143-67-9 205-606-0 4. Sustancias negativas Ftalato de di-(2-etilhexilo) 117-81-7 204-211-0 Ácido nalidíxico 389-08-2 206-864-7 Pireno 129-00-0 204-927-3 Cloruro sódico 7647-14-5 231-598-3 B.50. SENSIBILIZACIÓN CUTÁNEA: ENSAYO CON GANGLIOS LINFÁTICOS LOCALES: DA INTRODUCCIÓN 1. Las directrices de ensayo de productos químicos de la OCDE (TG, por su nombre en inglés) y los métodos de ensayo de la UE se revisan periódicamente en función de los avances científicos, los cambios en las necesidades normativas y las consideraciones de bienestar de los animales. Se ha revisado el primer método de ensayo (ME) para la determinación de la sensibilización cutánea con ratones, la prueba con ganglios linfáticos locales (LLNA, de su nombre en inglés, que corresponde a la TG 429 de la OCDE, capítulo B.42 del presente anexo) (1). Se han publicado los datos de la validación del LLNA, así como una revisión de los trabajos asociados (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). En el LLNA, para medir la proliferación de linfocitos se utilizan timidina o yodo radioisotópicos, por lo que el ensayo tiene una utilidad limitada, dados los problemas que implica la adquisición, utilización y eliminación de sustancias radiactivas. El LLNA: DA (desarrollado por Daicel Chemical Industries, Ltd.) es una modificación no radiactiva del LLNA, en la que se cuantifica mediante bioluminiscencia el contenido de trifosfato de adenosina (ATP) como indicador de la proliferación de los linfocitos. El método de ensayo LLNA: DA ha sido validado y examinado, y recomendado por un grupo internacional de examen por pares, que lo ha considerado útil para identificar tanto sustancias que son sensibilizantes cutáneos como sustancias que no lo son, con ciertas limitaciones (10) (11) (12) (13). Este ME está diseñado para evaluar el potencial de sensibilización cutánea de los productos químicos (sustancias y mezclas) en animales. En el capítulo B.6 del presente anexo y en la TG 406 de la OCDE se utilizan ensayos con cobayas, en concreto el ensayo de maximización en cobaya y el ensayo de Buehler (14). Tanto el LLNA (capítulo B.42 del presente anexo, TG 429 de la OCDE) como sus dos modificaciones no radiactivas, el LLNA: DA (capítulo B.50 del presente anexo, TG 442 A de la OCDE) y el LLNA: BrdU-ELISA (capítulo B.51 del presente anexo, TG 422 B de la OCDE), suponen una ventaja respecto a los ensayos con cobayas del capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE (14) en cuanto a la reducción y refinamiento del uso de animales. 2. El LLNA: DA, de forma similar al LLNA, estudia la fase de inducción de la sensibilización cutánea y proporciona datos cuantitativos adecuados para la evaluación de la relación dosis-respuesta. Además, su capacidad de detectar sensibilizantes cutáneos sin necesidad de utilizar el marcado radiactivo del ADN suprime la posibilidad de que haya exposición ocupacional a la radiactividad y problemas de eliminación de residuos. Esto, a su vez, permitiría un mayor uso de los ratones para detectar sensibilizantes cutáneos, lo que podría reducir aún más la utilización de cobayas en ensayos que determinen el potencial de sensibilización cutánea (es decir, el capítulo B.6; TG 406 de la OCDE) (14). DEFINICIONES 3. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas. CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 4. El LLNA: DA es un método LLNA modificado para identificar posibles sensibilizantes cutáneos, con limitaciones específicas. Esto no implica necesariamente que deba utilizarse en todos los casos el LLNA: DA en lugar del LLNA o de los ensayos con cobayas (es decir, el ME B.6, TG 406 de la OCDE) (14) sino que, como su valor es equivalente, el LLNA: DA puede emplearse como alternativa en la que, generalmente, los resultados positivos y negativos ya no necesitan una confirmación posterior (10) (11). Antes de efectuar el estudio, el laboratorio de ensayo debe considerar toda la información disponible sobre la sustancia problema. Tal información ha de incluir la identidad y la estructura química de esta sustancia, sus propiedades fisicoquímicas, los resultados de cualquier otro ensayo de toxicidad in vitro o in vivo efectuado con ella, y los datos toxicológicos disponibles sobre sustancias relacionadas estructuralmente. Es necesario sopesar esta información a fin de determinar si el LLNA: DA es apropiado para la sustancia problema [dada la incompatibilidad de ciertos tipos de productos químicos con el LLNA: DA (véase el punto 5)] y para ayudar en la selección de las dosis. 5. El LLNA: DA es un método in vivo, por lo que no elimina el uso de animales para la evaluación de la sensibilización alérgica por contacto. Sin embargo, ofrece la posibilidad de reducir el uso de animales con este objetivo, respecto al nivel exigido por los ensayos con cobayas (capítulo B.6; TG 406 de la OCDE) (14). Además, el LLNA: DA supone un refinamiento sustancial (menos dolor y molestias) de la forma de utilizar animales en los ensayos de sensibilización alérgica por contacto, ya que, al contrario que los ensayos del capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE, no necesita que se provoquen reacciones cutáneas de hipersensibilidad. A pesar de las ventajas que supone el LLNA: DA con respecto al capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE (14), tiene ciertas limitaciones que pueden obligar a utilizar estos métodos (capítulo B.6 y TG 406 de la OCDE), como, por ejemplo, los ensayos de ciertos metales, los resultados falsos positivos que se producen con determinados irritantes cutáneos (como algunas sustancias de tipo tensioactivo) (6) (1 y capítulo B.42 del presente anexo) o la solubilidad de la sustancia problema. Además, las sustancias o clases químicas que contienen grupos funcionales de los que se haya visto que actúan como posibles factores de confusión (16) pueden hacer necesario el uso de ensayos con cobayas (es decir, el ME B.6 o la TG 406 de la OCDE) (14). Se ha recomendado que las limitaciones señaladas para el LLNA (1 y capítulo B.42 del presente anexo) se apliquen también al LLNA: DA (10). Además, puede que no sea apropiado recurrir al LLNA: DA para ensayar sustancias que afectan a los niveles de ATP (por ejemplo, sustancias que actúan como inhibidores del ATP) o en aquellos casos en que se vea afectada la medición exacta del contenido de ATP intracelular (por ejemplo, presencia de enzimas que degradan el ATP, presencia de ATP extracelular en el ganglio linfático). Dejando aparte estas limitaciones identificadas, el LLNA: DA debe ser aplicable para el ensayo de cualquier sustancia, salvo que esta tenga propiedades asociadas que puedan interferir con la exactitud del LLNA: DA. Por otra parte, debe contemplarse la posibilidad de resultados positivos dudosos cuando se obtienen valores del índice de estimulación (IE) entre 1,8 y 2,5 (véanse los puntos 31 y 32). Esto se justifica por la base de datos de validación de 44 sustancias utilizando un IE ≥ 1,8 (véase el punto 6) de las que el LLNA: DA identificó correctamente la totalidad de los 32 sensibilizantes del LLNA, pero identificó incorrectamente tres de los doce productos no sensibilizantes con valores del IE entre 1,8 y 2,5 (es decir, positivos dudosos) (10). Sin embargo, como se ha utilizado el mismo conjunto de datos para establecer los valores del IE y para calcular las propiedades de predicción del ensayo, los resultados indicados pueden suponer una sobreestimación de las propiedades de predicción reales. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 6. El principio básico del LLNA: DA es el de que los sensibilizantes inducen una proliferación de linfocitos en los ganglios linfáticos que drenan la zona de aplicación de la sustancia problema. Esta proliferación es proporcional a la dosis y a la potencia del alérgeno aplicado y proporciona un método sencillo para obtener una medida cuantitativa de la sensibilización. La proliferación se mide comparando la proliferación media de cada grupo de ensayo con la proliferación media del grupo de control tratado con el vehículo (CV). Se determina la relación entre la proliferación media observada en cada grupo tratado y la del grupo de CV paralelo, denominada índice de estimulación (IE), y que debe ser ≥ 1,8 para que se pueda justificar el seguir con la evaluación de la sustancia problema como posible sensibilizante cutáneo. Los procedimientos descritos aquí se basan en el uso del contenido de ATP, medido por bioluminiscencia y del que se sabe que se corresponde con el número de células vivas (17), para indicar un aumento del número de células en proliferación en los ganglios linfáticos auriculares (18) (19). El método de bioluminiscencia utiliza la enzima luciferasa para catalizar la formación de luz a partir de ATP y luciferina de acuerdo con la siguiente reacción: ATP + Luciferina + O 2 Oxiluciferina + AMP + PPi + CO 2 + Luz La intensidad de la luz emitida está relacionada linealmente con la concentración de ATP y se mide con un luminómetro. El ensayo con luciferina-luciferasa es un método sensible para cuantificar el ATP, utilizado en una amplia variedad de aplicaciones (20). DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO Selección de la especie animal 7. El ratón es la especie elegida para este ensayo. Los estudios de validación del LLNA: DA se han efectuado exclusivamente con la cepa CBA/J, por lo que se considera que esta es la cepa preferida (12) (13). Se utilizan hembras jóvenes adultas, nulíparas y no preñadas. Al comienzo del estudio los animales deben tener una edad de 8 a 12 semanas; la variación del peso de los animales debe ser mínima, sin superar el 20 % del peso medio. También se podrán utilizar otras cepas y machos, si se aportan datos suficientes para demostrar que en la respuesta del LLNA: DA no existen diferencias significativas relacionadas con la cepa o el sexo. Alojamiento y alimentación 8. Los ratones deben alojarse en grupos (21), salvo que se aporten pruebas científicas adecuadas que avalen su alojamiento individual. La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. Preparación de los animales 9. Se eligen los animales al azar, se marcan para su identificación individual (pero no en las orejas) y se mantienen en sus jaulas al menos cinco días hasta el inicio de la administración de la sustancia, para que se aclimaten a las condiciones del laboratorio. Antes de iniciar el tratamiento, todos los animales serán examinados para comprobar que no presentan lesiones cutáneas observables. Preparación de las soluciones administradas 10. Las sustancias sólidas deben disolverse o suspenderse en disolventes o vehículos y diluirse, cuando proceda, antes de aplicarse a la oreja del ratón. Las sustancias líquidas pueden aplicarse puras o diluidas antes de su administración. Las sustancias insolubles, como las que se ven generalmente en los productos sanitarios, deben someterse a extracción forzada en un disolvente apropiado con el fin de recoger todos los componentes extraíbles para el ensayo antes de efectuar la aplicación a la oreja del ratón. Las soluciones problema deben prepararse cada día, salvo que mediante datos de estabilidad se demuestre que es posible conservarlas. Verificación de la fiabilidad 11. Se utilizan sustancias de control positivo (CP) para demostrar que el ensayo funciona apropiadamente, respondiendo con la sensibilidad adecuada y reproducible cuando se aplica una sustancia problema sensibilizante de la que se ha caracterizado bien la magnitud de la respuesta. Se recomienda la inclusión de un CP en paralelo porque demuestra la competencia del laboratorio para efectuar con éxito cada ensayo y permite la evaluación de la reproducibilidad y comparabilidad intra e interlaboratorios. Por otra parte, ciertas autoridades normativas requieren la utilización de un CP en cada estudio, por lo que se aconseja a los usuarios que consulten con las autoridades competentes antes de efectuar el LLNA: DA. En consecuencia, se recomienda el uso sistemático de un CP en paralelo para evitar la necesidad, que podría surgir del uso de un CP periódico, de tener que efectuar ensayos adicionales con animales para cumplir los requisitos (véase el punto 12). El CP debe dar una respuesta positiva en el LLNA: DA con un nivel de exposición calculado para producir un aumento del IE ≥ 1,8 con respecto al grupo de control negativo (CN). La dosis del control positivo debe ser tal que no provoque un exceso de irritación cutánea ni toxicidad sistémica, y que la inducción sea reproducible pero no excesiva (por ejemplo, un IE > 10 se consideraría excesivo). Los CP preferidos son aldehído hexilcinámico (no del Chemical Abstracts Service [CAS] 101-86-0) y eugenol (no CAS 97-53-0), ambos al 25 % en acetona: aceite de oliva (4:1, v/v). Puede haber circunstancias en que sea posible utilizar otros controles positivos, mediante una justificación adecuada y siempre que se cumplan los criterios antes mencionados. 12. Aunque se recomienda la inclusión de un grupo de CP en paralelo, puede haber situaciones en que sea adecuado hacer ensayos periódicos (es decir, a intervalos ≤ 6 meses) del control positivo en caso de laboratorios que efectúan regularmente el LLNA: DA (es decir, lo efectúan con una frecuencia no inferior a una vez al mes) y tienen una base de datos de CP históricos que demuestra la capacidad del laboratorio para obtener resultados reproducibles y exactos con dichos controles. El laboratorio puede demostrar que tiene la competencia adecuada para realizar el LLNA: DA mediante la obtención constante de resultados positivos con los CP en al menos diez ensayos independientes llevados a cabo en un plazo razonable (es decir, de menos de un año). 13. Debe incluirse un grupo de CP en paralelo siempre que haya un cambio de procedimiento del LLNA: DA (por ejemplo, cambio del personal cualificado, cambio de los materiales o reactivos utilizados en el método de ensayo, cambio en el equipo analítico, cambio en el origen de los animales), y tales cambios deben documentarse en los informes del laboratorio. Debe prestarse atención al efecto de estos cambios sobre la idoneidad de la base de datos históricos previamente establecida cuando se deba decidir si es necesario establecer una nueva base de datos históricos para documentar la constancia de los resultados sobre los controles positivos. 14. Los investigadores no deben olvidar que la decisión de realizar un estudio con controles positivos de forma periódica en lugar de en paralelo tiene consecuencias sobre la idoneidad y aceptabilidad de los resultados negativos obtenidos en ensayos efectuados sin control positivo en paralelo en el intervalo entre dos estudios periódicos con control positivo. Por ejemplo, si se obtiene un resultado falso negativo en un estudio con control positivo periódico, es posible dudar de los resultados negativos obtenidos con las sustancias problema en el intervalo transcurrido entre el último estudio con control positivo periódico aceptable y el estudio con control positivo periódico inaceptable. Las consecuencias de estos resultados deben sopesarse cuidadosamente a la hora de decidir si se incluye un control positivo en paralelo o si solo se hace de forma periódica. Debe considerarse igualmente el uso de menos animales en el grupo de control positivo en paralelo cuando esté justificado científicamente y si el laboratorio demuestra, sobre la base de datos históricos propios del laboratorio, que es posible utilizar menos ratones (22). 15. Aunque el producto utilizado como CP debe someterse al ensayo en un vehículo conocido por provocar una respuesta uniforme (por ejemplo, acetona: aceite de oliva; 4:1, v/v), puede haber ciertas situaciones legales en las que también sea necesario utilizar un vehículo no estándar (formulación relevante desde el punto de vista clínico o químico) (23). Si para el CP en paralelo se utiliza un vehículo diferente del de la sustancia problema, debe incluirse un CV aparte para el CP en paralelo. 16. En los casos en que se evalúen sustancias de una clase química o gama de respuestas específica, puede ser útil también emplear sustancias de evaluación comparativa para demostrar que el método de ensayo funciona adecuadamente en cuanto a la detección del potencial de sensibilización cutánea de estos tipos de sustancias. Para ser adecuadas, las sustancias de evaluación comparativa deben presentar las siguientes propiedades: — similitud estructural y funcional con la clase de la sustancia problema que se está evaluando, — características físicas y químicas conocidas, — datos de apoyo procedentes del LLNA: DA, — datos de apoyo procedentes de otros modelos animales o de seres humanos. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Número de animales y niveles de dosis 17. Se utilizará un mínimo de cuatro animales por grupo de dosis, con un mínimo de tres concentraciones de la sustancia problema, más un grupo de control negativo (CN) en paralelo tratado solo con el vehículo utilizado para la sustancia problema y un control positivo (CP) (en paralelo o reciente, según la estrategia del laboratorio en relación con los puntos 11 a 15). Debe estudiarse la posibilidad de utilizar varias dosis del CP, sobre todo cuando este se someta a ensayo de forma intermitente. Excepto por la ausencia de tratamiento con la sustancia problema, los animales de los grupos de control deben ser manejados y tratados de manera idéntica a la utilizada con los animales de los grupos tratados. 18. La elección de las dosis y del vehículo debe basarse en las recomendaciones que se recogen en las referencias (2) y (24). Normalmente se eligen dosis consecutivas a partir de una serie adecuada de concentraciones, como 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. La elección de la serie de concentraciones utilizada debe justificarse científicamente. Para seleccionar las tres concentraciones consecutivas, ha de tenerse en cuenta toda la información toxicológica (por ejemplo, sobre toxicidad aguda e irritación cutánea) y la información estructural y fisicoquímica existente de que se pueda disponer respecto a la sustancia problema (o sustancias relacionadas estructuralmente con ella), de forma que la concentración más alta logre la máxima exposición evitando a la vez la toxicidad sistémica y la excesiva irritación cutánea local (24) (25). A falta de tal información, puede ser necesario realizar un ensayo inicial de cribado previo (véanse los puntos 21 a 24). 19. El vehículo no debe interferir con el resultado del ensayo ni sesgarlo, y debe seleccionarse con el propósito de maximizar la solubilidad para conseguir la mayor concentración posible y de obtener a la vez una solución o suspensión que sea adecuada para la aplicación de la sustancia problema. Los vehículos recomendados son acetona: aceite de oliva (4:1, v/v), N,N-dimetilformamida, metil-etil-cetona, propilenglicol y dimetilsulfóxido (6), pero se pueden utilizar otros si se aporta una justificación científica suficiente. En determinadas situaciones, puede ser necesario utilizar un disolvente relevante desde el punto de vista clínico o la formulación comercial en que se vende la sustancia analizada, como control adicional. Se tendrá especial cuidado en velar por que las sustancias hidrófilas se incorporen a un sistema de vehículo que humedezca la piel y no se escurra inmediatamente, mediante la incorporación de los solubilizadores adecuados (por ejemplo, Pluronic® L92 al 1 %). Por tanto, se evitarán los vehículos totalmente acuosos. 20. El estudio de los ganglios linfáticos de cada uno de los ratones permite evaluar la variabilidad interanimales y comparar estadísticamente la diferencia entre las mediciones efectuadas en el grupo de la sustancia problema y las efectuadas en el grupo de CV (véase el punto 33). Además, se puede evaluar la posibilidad de reducir el número de ratones del grupo de CP solamente cuando se toman datos de los distintos animales (22). Por otra parte, ciertas autoridades normativas exigen la recogida de datos de cada animal. La recogida periódica de datos de cada animal aporta una ventaja en cuanto al bienestar de los animales al evitar la duplicación de ensayos, que podrían ser necesarios si los resultados sobre la sustancia problema recogidos inicialmente de una manera (por ejemplo, por datos de conjuntos de animales) tuvieran que ser considerados posteriormente por las autoridades normativas con otros requisitos (por ejemplo, de datos de cada animal). Ensayo de cribado previo 21. A falta de información para determinar la dosis máxima que se debe utilizar en el ensayo (véase el punto 18), hay que efectuar un ensayo de cribado previo a fin de definir el nivel adecuado de dosis para el LLNA: DA. La finalidad del ensayo de cribado previo es orientar para la selección del nivel máximo de dosis que debe utilizarse en el estudio LLNA: DA principal, en caso de que no se disponga de información sobre la concentración que induce toxicidad sistémica (véase el punto 24) o excesiva irritación cutánea local (véase el punto 23). El nivel máximo de dosis para este ensayo debe ser del 100 % de la sustancia problema en caso de líquidos, o la mayor concentración posible en caso de sólidos o suspensiones. 22. El ensayo de cribado previo se realiza bajo las mismas condiciones que el estudio LLNA: DA principal, con la diferencia de que no hay evaluación de la proliferación en los ganglios linfáticos y de que pueden utilizarse menos animales por grupo de dosis. Se sugiere emplear uno o dos animales por grupo de dosis. Todos los ratones deben observarse diariamente para detectar posibles signos de toxicidad sistémica o irritación local en el punto de aplicación. Los pesos corporales se registran al inicio del ensayo y antes de que termine (día 8). Se observan ambas orejas de cada ratón, para detectar eventuales eritemas, y se puntúan según el cuadro 1 (25). Se mide el espesor de la oreja con un calibrador de espesores (por ejemplo, de micrómetro digital o calibrador de espesores de escala circular de Peacock) el día 1 (antes de la administración), el día 3 (unas 48 horas tras la administración de la primera dosis), el día 7 (24 horas antes del final) y el día 8. Además, el día 8 se puede medir el espesor de la oreja determinando el peso de un bocado de la misma, obtenido con un sacabocados después del sacrificio compasivo de los animales. La excesiva irritación local viene indicada por una puntuación de eritema ≥ 3 o por un aumento del espesor de la oreja ≥ 25 % cualquiera de los días de medición (26) (27). La dosis máxima seleccionada para el estudio LLNA: DA principal será la dosis inmediatamente inferior a la que, dentro de la serie de concentraciones del ensayo de cribado previo (véase el punto 18), induce toxicidad sistémica o excesiva irritación cutánea local. Cuadro 1 Puntuación del eritema Observación Puntuación Sin eritema 0 Eritema muy leve (apenas perceptible) 1 Eritema bien definido 2 Eritema de moderado a intenso 3 Eritema intenso (rojo de remolacha) o formación de escaras que impide la clasificación del eritema 4 23. Además de un aumento del 25 % del espesor de la oreja (26) (27), también se ha utilizado para señalar irritantes en el LLNA un aumento estadísticamente significativo del espesor de la oreja de los ratones tratados respecto a los ratones de control (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Sin embargo, aunque puede haber aumentos del espesor de la oreja inferiores al 25 % que sean estadísticamente significativos, estos no se han asociado específicamente con una irritación excesiva (30) (31) (32) (33) (34). 24. Las siguientes observaciones clínicas pueden indicar toxicidad sistémica (35) cuando forman parte de una evaluación integrada y, por tanto, pueden indicar el nivel máximo de dosis que debe utilizarse en el LLNA: DA principal: cambios en la función del sistema nervioso (por ejemplo, piloerección, ataxia, temblores y convulsiones), cambios en el comportamiento (por ejemplo, agresividad, cambios en las actividades de limpieza, cambio marcado en el nivel de actividad), cambios en las pautas respiratorias (es decir, cambios en la frecuencia e intensidad de la respiración, tales como disnea, jadeos y estertores), y cambios en el consumo de agua y comida. También deben tenerse en cuenta en la evaluación los eventuales signos de letargo o ausencia de respuesta a estímulos, los signos clínicos de dolor o sufrimiento que no sean ligeros o momentáneos, y la reducción > 5 % del peso corporal desde el día 1 al día 8, así como la mortalidad. Los animales moribundos o que presenten signos de dolor o de sufrimiento intenso deben sacrificarse de forma compasiva (36). Calendario experimental del estudio principal 25. El calendario experimental del ensayo es el siguiente: — Día 1: Se identifica cada animal y se toma nota de su peso, así como de las eventuales observaciones clínicas. Se aplica al dorso de cada oreja una solución acuosa de laurilsulfato de sodio (LSS) al 1 %, utilizando un pincel impregnado con la solución de LSS de modo que con cuatro o cinco pinceladas se cubra todo el dorso de cada oreja. Una hora tras la aplicación del LSS, se aplican en el dorso de cada oreja 25 μL de la dilución apropiada de la sustancia problema, del vehículo solo o del control positivo (en paralelo o reciente, según la estrategia del laboratorio en relación con los puntos 11 a 15). — Días 2, 3 y 7: Se repite el procedimiento de aplicación efectuado el día 1, con aplicación previa de la solución acuosa de LSS al 1 %, seguida de la aplicación de la sustancia problema. — Días 4, 5 y 6: Sin tratamiento. — Día 8: Se toma nota del peso de cada animal, así como de las eventuales observaciones clínicas. Unas 24 o 30 horas tras el inicio de la aplicación del día 7, se sacrifican los animales de forma compasiva. Se extirpan los ganglios linfáticos auriculares de cada oreja de los ratones y se ponen en solución amortiguadora de fosfato (PBS), separando los de cada animal. En la referencia (22) se recogen los detalles y diagramas de la identificación y disección de los ganglios linfáticos. Para seguir mejor la respuesta cutánea local en el estudio principal, pueden incluirse en el protocolo del estudio parámetros adicionales, tales como la puntuación del eritema auricular o las medidas del espesor de la oreja (obtenidas con un calibrador de espesor, o determinando el peso de un bocado de la oreja, en la autopsia). Preparación de las suspensiones celulares 26. De cada ratón se prepara una suspensión de células sueltas de los ganglios linfáticos extirpados bilateralmente colocando los ganglios linfáticos entre dos portaobjetos de vidrio y aplicando una presión ligera, para aplastarlos. Tras confirmar que el tejido se ha extendido finamente, se separan los dos portaobjetos. Se suspende en LSS el tejido presente en ambos portaobjetos, poniéndolos en ángulo sobre una placa Petri y lavando con PBS, separando a la vez el tejido del portaobjetos con un raspador celular. Por otra parte, como los ganglios linfáticos de los animales del CN son pequeños, es importante extremar el cuidado para evitar la aparición de efectos artificiales en los valores del IE. Para el lavado de ambos portaobjetos debe utilizarse un volumen total de 1 mL de PBS. La suspensión de células de los ganglios linfáticos en la placa Petri debe homogeneizarse ligeramente con el raspador celular. Se toma a continuación con una micropipeta una alícuota de 20 μL de esta suspensión, procurando no incluir la membrana, visible a simple vista, y se mezcla después con 1,98 mL de PBS para obtener una muestra de 2 mL. Después se prepara otra muestra de 2 mL siguiendo el mismo procedimiento, de forma que de cada animal se obtienen dos muestras. Determinación de la proliferación celular (medición del contenido de ATP de los linfocitos) 27. Los aumentos del contenido de ATP en los ganglios linfáticos se miden con el método de la luciferina/luciferasa, utilizando un juego de medición de ATP, que mide la bioluminiscencia en unidades relativas de luminiscencia (URL). El tiempo transcurrido entre el momento del sacrificio de los animales y la medición del contenido de ATP de cada animal deber ser uniforme, y no sobrepasar aproximadamente los 30 minutos, porque se considera que el contenido de ATP va disminuyendo gradualmente según transcurre el tiempo a partir del sacrificio de los animales (12). Así pues, la serie de operaciones desde la extracción de los ganglios linfáticos auriculares hasta la medición del ATP debe efectuarse en el plazo de 20 minutos, siguiendo una pauta temporal preestablecida, que será la misma con todos los animales. Se debe medir la luminiscencia del ATP en cada muestra de 2 mL, de forma que de cada animal se efectúan dos mediciones del ATP. A continuación se determina la luminiscencia media del ATP, que es el valor utilizado para los cálculos posteriores (véase el punto 30). OBSERVACIONES Observaciones clínicas 28. Al menos una vez al día se realizará una observación minuciosa de cada animal en busca de signos clínicos, bien de irritación local en el punto de aplicación o bien de toxicidad sistémica. Todas las observaciones se registrarán sistemáticamente en fichas individuales de cada animal. Los planes de seguimiento deben incluir criterios para detectar rápidamente a los ratones que presenten toxicidad sistémica, excesiva irritación cutánea local o corrosión cutánea, a fin de someterlos a sacrificio compasivo (36). Pesos corporales 29. Como se indica en el punto 25, hay que medir el peso corporal de cada animal al empezar el ensayo y en la fecha prevista para el sacrificio compasivo. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS 30. Los resultados de cada grupo de tratamiento se expresan como IE medio. El IE se obtiene dividiendo la media de los valores de URL de los ratones dentro de cada grupo tratado con la sustancia problema y la del grupo de control positivo (CP), por la media de los valores de URL de los ratones del grupo de control del vehículo (CV) o disolvente. El IE medio del CV es entonces la unidad. 31. En el proceso de toma de decisiones se considera que un resultado es positivo si el IE es ≥ 1,8 (10). Sin embargo, la fuerza de la relación dosis-respuesta, la significación estadística y la coherencia de las respuestas de los grupos de disolvente o vehículo y CP pueden utilizarse también a la hora de determinar si un resultado dudoso (es decir, con un valor del IE entre 1,8 y 2,5) se declara positivo (2) (3) (37). 32. En caso de una respuesta positiva dudosa, con un IE entre 1,8 y 2,5, es posible que los usuarios deseen considerar información adicional, tal como la relación dosis-respuesta, las pruebas de toxicidad sistémica o de irritación excesiva, y, en su caso, la significación estadística, junto con los valores del IE para confirmar si tales resultados son positivos (10). Deben tenerse también en cuenta diversas propiedades de la sustancia problema, por ejemplo si está relacionada estructuralmente con sensibilizantes cutáneos conocidos, si produce excesiva irritación cutánea en el ratón, y la naturaleza de la relación dosis-respuesta observada. Estas y otras consideraciones se comentan con detalle en otro lugar (4). 33. La recogida de datos de cada ratón permite el análisis estadístico de los datos para la presencia y grado de la relación dosis-respuesta. Toda valoración estadística puede incluir una evaluación de la relación dosis-respuesta, así como comparaciones adecuadamente ajustadas de los grupos de ensayo (por ejemplo, comparaciones por parejas entre grupos tratados y grupos paralelos de control de disolvente o vehículo). Los análisis estadísticos pueden incluir, por ejemplo, la regresión lineal o la prueba de William para evaluar las tendencias de la relación dosis-respuesta, y la prueba de Dunnett para hacer comparaciones por parejas. Para elegir el método de análisis estadístico adecuado, el investigador debe conocer las posibles desigualdades de las varianzas y otros problemas asociados, que pueden exigir una transformación de los datos o el uso de un análisis estadístico no paramétrico. En cualquier caso, es posible que el investigador tenga que efectuar cálculos del IE y análisis estadísticos con y sin algunos puntos de datos (a veces llamados “valores atípicos”). DATOS E INFORME Datos 34. Los datos deben resumirse en forma de cuadro, con indicación de los valores de URL de cad